TW202208622A - 用於治療克拉培氏病之組成物 - Google Patents

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Abstract

提供一種被調配用於遞送重組腺相關病毒(rAAV)載體之醫藥組成物，該載體包含AAV衣殼及具有人類半乳糖基神經醯胺酶(GALC)編碼序列的載體基因體。亦提供用於治療克拉培氏病(Krabbe disease)之包含rAAV的醫藥組成物之方法及用途。

Description

用於治療克拉培氏病之組成物
本發明係關於一種被調配用於遞送重組腺相關病毒(rAAV)載體之醫藥組成物；用於治療克拉培氏病(Krabbe disease)之包含rAAV的醫藥組成物之方法及用途。
腺相關病毒(Adeno-associated virus(AAV))，小病毒科(Parvovirus family)之一員，為具有約4.7千鹼基對(kb)長之單股線狀DNA(ssDNA)基因體的小的無套膜的二十面體病毒。野生型基因體包含在DNA股兩端的反向末端重複(ITR)和兩個開讀框(ORF)：rep及cap。Rep由編碼AAV生命週期所需之rep蛋白的四個重疊基因組成，且cap包含衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的重疊核苷酸序列，VP1、VP2和VP3自組裝形成二十面對稱體的衣殼。
已將衍生自複製缺陷型人類小病毒的重組腺相關病毒(rAAV)載體描述為用於基因遞送的適當媒介。通常，從載體中除去功能性rep基因和cap基因，產生無複製能力的載體。這些功能在載體生產系統中提供，但在最終載體中不存在。
至今為止，已有從人類或非人類靈長類(NHP)分離的多種不同的充分表徵的AAV。已經發現，不同血清型的AAV呈現出不同的轉染效率，且呈現出對不同細胞或組織的向性。WO 2005/033321中已描述許多不同的AAV演化支，包括演化支F，其在其中被鑒定為僅具有AAV9、AAVhu31和AAVhu32三個成員。AAV9的結構分析被提供於M. A. DiMattia et al, J. Virol.( 2012年6月) vol. 86 no. 12 6947-6958。此文獻報導AAV9具有三種可變蛋白(vp)的60個拷貝(總共)，該可變蛋白(vp)由cap基因編碼並具有重疊序列。此等包括VP1(87 kDa)、VP2(73 kDa)、及VP3(62 kDa)，其分別以1：1：10的預測比率存在。VP3的整體序列在VP2內，且VP2整個在VP1內。VP1具有獨特的N端域。精細坐標(refined coordinate)和結構因子可在RCSB PDB資料庫中以登錄號3UX1獲得。
多種不同的AAV9變體已被工程化以便脫靶(detarget)或靶向不同的組織。參見，例如，N. Pulicheria, “Engineering Liver-detargeted AAV9 Vectors for Cardiac and Musculoskeletal Gene Transfer”, Molecular Therapy, Vol, 19, no. 6, p. 1070-1078(2011年6月)。亦報導了遞送基因穿過血腦屏障的AAV9變體的開發。參見，例如B.E.Deverman et al, Nature Biotech, Vol. 34, No. 2, p 204- 211(2016年2月1日線上公開)及Caltech press release, A. Wetherston, www.neurology-central.com/2016/02/10/successful-delivery-of-genes-through-the-blood-brain-barrier/, accessed 10/05/2016。亦可參見WO 2016/0492301及US 8,734,809。
最近，從天然來源擴增衣殼基因後所鑑定出的AAVhu68被鑑定為新的AAV衣殼。參見，例如WO 2018/160582。此AAV係與AAV9一樣，皆於演化支F內。
克拉培氏病(球狀細胞白血質障礙(globoid cell leukodystrophy；GLD))為一種體染色體隱性遺傳型溶酶體貯積病(LSD)，由編碼水解酵素半乳糖基神經醯胺酶(半乳糖基神經醯胺酶；GALC)的基因突變引起(Wenger D.A., et al.(2000) Mol Genet Metab.70(1)：1-9)。此酵素負責某些半乳糖脂類的降解，包括半乳糖基神經醯胺(腦醯胺(ceramide))及半乳糖基神經鞘胺醇(galactosylsphingosine)(鞘胺醇半乳糖苷(psychosine))，其等幾乎僅存在於髓鞘(myelin sheath)中。在克拉培氏病中，GALC缺乏會導致溶酶體中的鞘胺醇半乳糖苷(而非半乳糖基神經醯胺)發生毒性積累(Svennerholm et al., 1980)。鞘胺醇半乳糖苷的積累對CNS中產生髓磷脂(myelin)的寡樹突神經膠質細胞(oligodendrocyte)及PNS中的許旺氏細胞(Schwann cell)特別具有毒性，導致這些細胞類型迅速廣泛的死亡。CNS及PNS兩者中的髓磷脂分解均伴隨反應性星狀神經膠質細胞增殖(astroytic gliosis)及巨大多核巨噬細胞(「球狀細胞」)的浸潤(Suzuki K.(2003) J Child Neurol.18(9)：595-603)。在缺乏GALC活性的情況下，半乳糖基神經醯胺並不會積聚，其主要是由於另一種酶，GM1神經節苷脂β-半乳糖苷酶(GM1 ganglioside β-galactosidase)的水解(Kobayashi T., et al.(1985) J Biol Chem.260(28)：14982-7)及寡樹突神經膠質細胞的死亡導致半乳糖基神經醯胺合成的停止(Svennerholm L., et al.(1980) J Lipid Res.21(1)：53-64)。
目前可用於克拉培氏病的唯一改變病程治療為造血幹細胞移植(HSCT)，通常由臍帶血移植(UCBT)、同種異體周圍血液幹細胞或同種異體骨髓所提供。使用HSCT來治療嬰兒克拉培氏病(infantile Krabbe disease)的患者僅取得不太多的成功，這些患者通常在他們的第一個生日之前就出現症狀。當在嬰兒克拉培氏病的明顯症狀發作後進行HSCT時，其僅提供最小的神經系統改善，並不能顯著改善存活率(Escolar M.L., et al.(2005) N Engl J Med.352(20)：2069-81)。在有症狀前之患者中進行HSCT是有效的，但即使這樣，運動成效仍然很差(Escolar M.L., et al.(2005) N Engl J Med.352(20)：2069-81; Wright M.D., et al.(2017) Neurology.89(13)：1365-1372; van den Broek B.T.A., et al.(2018) Blood Adv.2(1)：49-60)。與後來移植的嬰兒相比，在30天之前移植的嬰兒具有更佳的存活率和功能性功效(Allewelt H., et al.(2018) Biol Blood Marrow Transplant.24(11)：2233-2238)。與症狀發作後未經治療或經治療的嬰兒克拉培氏病患者相比，症狀發生前的移植在改善進行性中央髓鞘化、正常的接受語言、減輕症狀的嚴重程度及較長的存活期上產生顯著較佳的功效(Escolar M.L., et al.(2005) N Engl J Med.352(20)：2069-81; Duffner P.K., et al.(2009) Genet Med.11(6):450-4; Wright M.D., et al.(2017) Neurology.89(13)：1365-1372)。即便如此，大多數在症狀出現之前接受治療的兒童在身高和體重仍遠低於平均水平，且具有進行性總體動作遲緩從輕度痙攣到無法獨立行走(Escolar M.L., et al.(2005) N Engl J Med.352(20)：2069-81; Duffner P.K., et al.(2009) Genet Med.11(6)：450-4)。一些兒童還具有殘留損傷，包括後天性小頭畸形、需要進行胃造口術及發音困難(Duffner P.K., et al.(2009) Genet Med.11(6)：450-4)。此外，HSCT似乎僅影響CNS特異性疾病病理。與例如周圍神經病變之PNS病理相關的臨床特徵仍不受HSCT的影響。此等結果突顯了HSCT的局限性，尤其是在疾病的快速發展超過了造血幹細胞植入、遷移至CNS、分化並通過GALC分泌和交叉校正(即，校正細胞所分泌之酵素被GALC缺陷型細胞吸收的過程)所提供治療效果所需的時間的早期發作形式中。
在本技術領域中仍有需要針對克拉培氏病患者的改善治療方法。
[發明摘述]
由下列本發明的詳細說明，本發明之此等及其它態樣將為顯而易見。
於一態樣中，提供一種醫藥組成物，其包含具有AAV衣殼及包裝於其中的載體基因體之重組AAV(rAAV)之種系(stock)。此載體基因體包含：(a)5’反向末端重複(ITR)；(b)CB7啟動子；(c)內含子；(d)半乳糖基神經醯胺酶(galactosylceramidase(GALC))編碼序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸1至2055，或與編碼SEQ ID NO：10之胺基酸1至685具有至少95%同一性的序列；(e)polyA；及(f)3’ ITR。於某些具體實施例中，此組成物被調配用於投予劑量約1.7x1010 基因體拷貝(GC)/g腦質量至約5.0x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例中，此AAV衣殼為AAVhu68衣殼。於另外的具體實施例中，此載體基因體包含SEQ ID NO：19之核苷酸198至4168。
於一態樣中，提供一種於需要治療的患者中治療克拉培氏病之方法，其中該方法包含本文所述的醫藥組成物之腦大池內(intracisternal magna(ICM))投予。於某些具體實施例中，該方法包含於投予醫藥組成物之前或之後進行造血幹細胞移植。此造血幹細胞移植可允許將減少劑量的rAAV投予至患者。
於一態樣中，提供一種用以增加患有克拉培氏病的患者的血清及/或腦脊髓液(CSF)中GALC表現及酶活性之方法，其中該方法包含投予本文所述的醫藥組成物至患者。
於一態樣中，提供一種用以降低患有克拉培氏病的患者的周圍神經中的神經發炎之方法，其中該方法包含投予本文所述的醫藥組成物至患者。
於一態樣中，提供一種用以增加患有克拉培氏病的患者的皮質及/或海馬迴的神經元中的GALC表現及活性之方法，其中該方法包含投予本文所述的醫藥組成物至患者。
於一態樣中，提供一種於患有克拉培氏病的患者之治療中使用的醫藥組成物。於某些具體實施例中，該治療i)增加血清及/或腦脊髓液(CSF)中GALC表現及酶活性，ii)增加皮質及/或海馬迴的神經元中的GALC表現及活性，及/或iii)增加血清及/或腦脊髓液(CSF)中的鞘胺醇半乳糖苷(psychosine)。
於一態樣中，提供一種本文所述之醫藥組成物之用途，其用於需要治療之患者中治療克拉培氏病，可選擇地隨後進行骨髓移植。 【圖式簡單説明】
圖1提供AAV9(SEQ ID NO：4)及AAVhu68(SEQ ID NO：2)衣殼序列之比對。在AAV9和AAVhu68衣殼之間不同的兩個胺基酸位於衣殼的VP1(67、157)和VP2(157)區域。縮寫：AAV9，腺相關病毒血清型9；AAVhu68；腺相關病毒血清型hu68；VP1，病毒蛋白質1；VP2，病毒蛋白質。 圖2顯示CB7.CI.hGALC.rBG載體基因體之示意圖。線性圖譜描繪載體基因體，其被設計成在普遍存在的CB7啟動子控制下表現人類GALC。CB7由CMV IE增強子和雞β-肌動蛋白(CB)啟動子之間混雜構成。縮寫：CMV IE，細胞巨大病毒立即早期(cytomegalovirus immediate-early)；GALC，半乳糖基神經醯胺酶；ITR，反向末端重複；PolyA，多腺核苷酸化；rBG，兔β-球蛋白。 圖3顯示以工程化cGALC基因(cGALCco)插入之pENN.AAV.CB7.CI.RBG(p1044)載體圖譜。 圖4顯示反式質體pAAV2/hu68.KanR(p0068)之線性載體圖譜。縮寫：AAV2，腺相關病毒血清型2；AAVhu68，腺相關病毒血清型hu68；bp，鹼基對；Cap，衣殼；KanR，康黴素(kanamycin)抗性；Ori，複製起始；Rep，複製酶。 圖5A及圖5B顯示腺病毒輔助質體pAdDeltaF6(KanR)。(圖5A)通過中間體pAd∆F1及pAd∆F5由親源質體pBHG10之輔助質體pAd∆F6的衍生。(圖5B)以康黴素抗性基因替代pAd∆F6中的安比西林(ampicillin)抗性基因以生產pAd∆F6(Kan)。 圖6A顯示特威徹小鼠(Twitcher mouse)(twi/twi )之神經病理學及行為表現型的進展。小鼠展現細胞毒性鞘胺醇半乳糖苷的累積，隨後吞噬細胞的球狀細胞於PNS及CNS白質的浸潤。在髓鞘化最初的期間後，分別由於髓鞘形成許旺氏細胞及寡樹突神經膠質細胞形成的死亡，於PNS中觀察到脫髓鞘化隨後於CNS中觀察到脫髓鞘化的程度較小。行為表現型顯現於PND 20附近，行為表現型由震顫、抽搐、後肢無力、隨後出現麻痺及體重減輕所組成，因此需要於PND 40附近實施安樂死。修正來自(Nicaise A.M., et al.(2016) J Neurosci Res.94(11)：1049-61)。縮寫：中樞神經系統；PND，出生後日數；PNS，周圍神經系統；twi ，特威徹失去功能的對偶基因。 圖6B顯示使用特威徹小鼠模型評估AAV.CB7.cGALCco.rBG基因療法之研究設計。 圖7顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之存活。於PND 0，twi/twi 小鼠以1.0x1011 GC之劑量經IV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠IV投予PBS作為對照。監測存活。P=p=0.0006，係基於每組與接受媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用對數秩(Mantel-Cox)檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖8顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦中轉基因表現(GALC活性)。於PND 0，twi/twi 小鼠以1.0x1011 GC之劑量經IV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠IV投予PBS作為對照。測量腦GALC酶活性。單因子ANOVA事後多重比較Tukey’s比較對twi/twi PBS的每一組。虛線表示野生型PBS組的平均值。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖9顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之存活。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。監測存活。p=0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用對數秩(Mantel-Cox)檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖10顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之體重。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。離乳後每週對動物稱重3次。誤差棒代表標準偏差。p=0.0001，基於縱向數據的統計分析，使用線性混合效應模型將各組與經PBS治療的twi/twi 對照組進行比較。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖11顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之神經運動功能。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於PND 35，藉由在加速桿上跑步的小鼠的落下時間(秒)來評估神經運動功能，該加速桿最初以5 RPM旋轉並在120秒內增加到40 RPM。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.007，****p＜0.0001，係基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖12顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集腦進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。虛線表示平均野生型經PBS治療組。****p＜0.0001，係基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖13顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之肝臟中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集肝臟進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖14顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之血清中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於PND28，收集血液進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖15顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦髓鞘化。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並以LFB/PAS染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片係在低倍率下拍攝。箭頭顯示胼胝體。比例尺2 mm。縮寫 ：GC，基因體拷貝；LFB，勒克司堅牢藍(Luxol Fast Blue)；PAS，過碘酸希夫；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖16顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠中的腦髓鞘化–高倍率。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體解剖時，收集、處理腦，並以LFB/PAS染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片以高倍率(20x)拍攝。黃色箭頭指向球狀細胞。星形：中央白質小腦。比例尺100 um。縮寫： GC，基因體拷貝；LFB，勒克司堅牢藍；PAS，過碘酸希夫；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖17顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠中的坐骨神經髓鞘化。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理坐骨神經，並以甲苯胺藍(Toluidine blue)染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片係在40x倍率下拍攝。箭頭表示髓鞘化的神經纖維。縮寫： GC，基因體拷貝；磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖18顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠的腦中神經炎症(neuroinflammation)(IBA1)。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對神經炎症進行染色(IBA1染色)。深色染色表明活化的小神經膠質細胞及球狀細胞(箭頭)。黑色星號表示中央小腦白質，且沒有球狀細胞。在經rAAVhu68.hGALC治療的小鼠的小腦葉和腦幹中存在球狀細胞。比例尺為100 µm。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖19顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠的腦中的hGALC表現。於PND 0，twi/twi 小鼠以三種劑量之一者(2.0x1010 、5.0x1010 、1.0x1011 GC)ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對hGALC偵測進行染色。比例尺為200 µm。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖20A及圖20B顯示twi/twi 小鼠的存活。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAVhu68.hGALC、AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠 。監測存活。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖21顯示twi/twi 小鼠的體重。於PND 0，以2.0x1010 GC之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠GC。離乳後每週對動物稱重3次。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖22顯示twi/twi 小鼠的神經運動功能。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠。於PND 35，藉由在加速桿上跑步的小鼠的落下時間(秒)來評估神經運動功能，該加速桿最初以5 RPM旋轉並在120秒內增加到40 RPM。誤差棒代表標準偏差。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖23顯示twi/twi 小鼠之腦中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠。於屍體剖檢時，收集腦進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。虛線表示平均野生型經PBS治療組。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖24顯示twi/twi 小鼠之肝臟中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠。於屍體剖檢時，收集肝臟進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖25顯示twi/twi 小鼠之血清中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠。於PND28，收集血液進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖26顯示twi/twi 小鼠中坐骨神經髓鞘化。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠。於屍體剖檢時，收集、處理坐骨神經，並以甲苯胺藍染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片係在40x倍率下拍攝。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖27顯示twi/twi 小鼠之腦中神經炎症(IBA1)。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對神經炎症進行染色(IBA1染色)。深色染色表明活化的小神經膠質細胞及球狀細胞。比例尺為100 µm。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖28顯示twi/twi 小鼠之腦中hGALC表現。於PND 0，以2.0x1010 之劑量之AAV1.hGALC、AAV3B.hGALC、或AAV5.hGALC，經ICV投予twi/twi 小鼠。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對hGALC偵測進行染色。比例尺為200 µm。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖29A及圖29B顯示於PND 12或PND 21於PND 12或PND 21，以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠的存活。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。監測存活。基於每組與經媒液治療的twi/twi 對照組的比較，使用對數秩(Mantel-Cox)檢定，於PND12組之rAAVhu68.hGALC與PBS比較，p＜0.0001，及於PND21組與PBS比較，p=0.0008。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖30顯示於PND12或PND21以2.0x1011 GC之劑量投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠之存活。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠 以1.0x1011 GC或2.0 x 1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。監測存活。p＜0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用對數秩(Mantel-Cox)檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成； 圖31顯示於PND12投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之體重。於PND12，twi/twi 小鼠 以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。每週對動物稱重3次。誤差棒代表標準偏差。p=0.0001，係基於每組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖32顯示於PND21投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之體重。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠 以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。每週對動物稱重3次。誤差棒代表標準偏差。p=0.0001，係基於每組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖33顯示於PND12投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之神經運動功能。於PND12，twi/twi 小鼠 以1.0 x 1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於PND 35，藉由在加速棒上跑步的小鼠的落下時間(秒)來評估神經運動功能，該加速棒最初以5 RPM旋轉並在120秒內增加到40 RPM。誤差棒代表標準偏差。**p=0.0004，於低劑量，及***p=0.0006，於高劑量，基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖34顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之神經運動功能。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠 以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於PND 35，藉由在加速棒上跑步的小鼠的落下時間(秒)來評估神經運動功能，該加速棒最初以5 RPM旋轉並在120秒內增加到40 RPM。誤差棒代表標準偏差。縮寫： GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖35顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦中的轉基因表現(GALC活性)。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集腦進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。虛線表示來自經PBS治療的野生型小鼠的平均值。**=0.002，係基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。 圖36顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之肝臟中的轉基因表現(GALC活性)。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠 以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集肝臟進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。虛線表示來自經PBS治療的野生型小鼠的平均值。****p＜0.0001，係基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。 圖37顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之血清中的轉基因表現(GALC活性)。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於PND18，收集血液進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。虛線表示來自經PBS治療的野生型小鼠的平均值。**p＜0.01，****p＜0.0001，係基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。 圖38顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦髓鞘化。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠 以1.0x1011 GC或2.0 x 1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並以LFB/PAS染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片以高倍率拍攝。箭頭指向小腦葉中的球狀細胞，星號顯示胼胝體。比例尺100 um。 圖39顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠之坐骨神經髓鞘化。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠 以1.0x1011 GC或2.0 x 1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理坐骨神經，並以甲苯胺藍染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。存活時間最長的小鼠中可見更多的髓鞘化纖維(中間圖)。照片係在40x倍率下拍攝。箭頭表示髓鞘化的神經纖維。 圖40顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠的腦中神經炎症(IBA1)。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠以1.0 x 1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對神經炎症進行染色(IBA1染色)。深色染色表明活化的小神經膠質細胞及球狀細胞(箭頭)。黑色星號表示中央小腦白質，且沒有球狀細胞。在經rAAVhu68.hGALC治療的小鼠的小腦葉和腦幹中存在球狀細胞。比例尺為100 µm。 圖41顯示於PND12或PND21，投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠的腦中的hGALC表現。於PND12或PND 21，twi/twi 小鼠以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC之兩劑量之一者ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對hGALC偵測進行染色。比例尺為200 µm。 圖42顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之體重。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。每週對動物稱重3次。誤差棒代表標準偏差。由於每組雄性和雌性小鼠數量有限，因此將雄性和雌性體重數據合併。 圖43顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之神經運動功能。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於PND 35，藉由在加速棒上跑步的小鼠的落下時間(秒)來評估神經運動功能，該加速棒最初以5 RPM旋轉並在120秒內增加到40 RPM。誤差棒代表標準偏差。**=0.0001，係基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。 圖44顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠的臨床評分評估。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。每週進行三次標準臨床評估。誤差棒代表標準偏差。 圖45顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集腦進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。 圖46顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之肝臟中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集肝臟進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。 圖47A及圖47B顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之血清中的轉基因表現(GALC活性)。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照。於PND28(圖47A)及於屍體剖檢(PND40)時(圖47B)，收集血液進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，係基於每組與經PBS治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。 圖48A-圖48C顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦髓鞘化。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC(結果示於圖48C)。將年齡匹配的twi/twi 小鼠(圖48B)及WT小鼠(圖48A)ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並以LFB/PAS染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片係在低倍率下拍攝。染色強度代表髓鞘化程度。於twi/twi PBS小鼠之胼胝體中可見較蒼白的髓磷脂。經rAAVhu68.hGALC治療的組顯示正常的類WT的胼胝體髓磷脂強度。比例尺2mm。縮寫如上定義。LFB，勒克司堅牢藍；PAS，過碘酸希夫。 圖49為一系列的9張照片，以較高放大倍數顯示投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠(結果在第三欄)或媒液(結果在第二欄)的腦髓鞘化。於PND 40，twi/twi小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠(結果在第一欄)ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並以LFB/PAS染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片以高倍率(20X)拍攝。箭號指出球狀細胞。比例尺100 um。第1列來自腦幹。第2列來自小腦。第3列來自胼胝體。 圖50為一系列的12張照片，其顯示投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠(結果在第3欄)或媒液(結果在第2欄)的周圍神經髓鞘化。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠(結果在第1欄)ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理神經，並以LFB/PAS或甲苯胺藍染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。第1及2列分別提供以LBS染色坐骨神經及腋神經的結果。第3列為以甲苯胺藍染色坐骨神經的高倍率。第4列為以IBA1 IHC染色坐骨神經的高倍率。比例尺為100 nm。 圖51為一系列的9張照片，其顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi小鼠中的脊髓髓鞘化。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC(結果於第3欄)。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予PBS作為對照(結果分別示於第2欄及第1欄)。於屍體剖檢時，收集、處理脊髓，並以LFB/PAS染色，以評估髓鞘化及球狀細胞浸潤。照片係在低倍率下拍攝。由箭頭指示球狀細胞。比例尺100 nm。第1列提供來自頸椎(C)脊柱的樣本，第2行提供來自胸椎(T)脊柱的樣本，第3行提供來自腰椎(L)脊柱的結果。 圖52A-圖52C顯示投予rAAVhu68.hGALC(圖52C)或媒液(圖52B)的twi/twi 小鼠的腦中神經炎症(IBA1)。於PND 40，twi/tw i小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠(圖52A)ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對神經炎症進行染色(IBA1染色)。棕色染色表明活化的小神經膠質細胞及球狀細胞。小神經膠質細胞為大的，並且會出現斑點狀的粗糙染色，特別是在皮質皮質、胼胝體、腦幹、小腦中。於經rAAVhu68.hGALC治療的twi/twi 小鼠，IBA1的斑塊狀染色在皮質皮質、胼胝體中被清除，但仍保留在小腦和腦幹中。照片係在低倍率下拍攝。比例尺2mm。 圖53為一系列的15張照片，顯示投予rAAVhu68.hGALC(第3欄)或媒液(第2欄)的twi/twi 小鼠的大腦中的神經炎症(IBA1)-高放大倍率。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠(第1欄)ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對神經炎症進行染色(IBA1染色)。深色染色表明活化的小神經膠質細胞及球狀細胞。照片以高倍率拍攝。第1列來自皮質皮質。第2列來自海馬迴。第3列來自胼胝體。第4列來自小腦。第5列來自腦幹。比例尺300 μm。 圖54為一系列的9張照片，顯示投予rAAVhu68.hGALC(第3欄)或媒液(第2欄)的twi/twi 小鼠的脊髓中的神經炎症(IBA1)。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠(第1欄)ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對神經炎症進行染色(IBA1染色)。深色染色表明活化的小神經膠質細胞及球狀細胞。照片以高倍率拍攝)。第1列為C-脊柱。第2列為T-脊柱。第3列為L-脊柱。比例尺200 μm。縮寫 ：C-脊柱，頸椎脊髓；GC，基因體拷貝；L-脊柱，腰椎脊髓；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；T-脊柱，腰椎脊髓；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中失去功能的突變所組成)。 圖55為一系列的12張照片，顯示投予rAAVhu68.hGALC(第3欄)或媒液(第2欄)的twi/twi 小鼠的腦中的hGALC 表現。於PND 40，twi/twi 小鼠以2.0x1011 GC之劑量經ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠(第1欄)ICV投予PBS作為對照。於屍體剖檢時，收集、處理腦，並對hGALC表現進行染色。深色染色表明活化的小神經膠質細胞及球狀細胞。照片以高倍率拍攝。比例尺300 μm。第1列來自皮質，第2列來自海馬迴。第3列來自小腦。第4列來自腦幹。 圖56A-圖56C顯示rAAVhu68.hGALC和骨髓移植組合療法後的結果。特威徹小鼠(twi/twi )僅以BMT治療(N=13，PND 10)、僅以rAAVhu68.hGALC治療(N=12，PND 0或N=13，PND 12；ICV；1.00x1011 GC)，以rAAVhu68.hGALC之後以BMT治療(分別為N=7；PND 0及PND 10)，或以BMT之後以rAAVhu68.hGALC治療(分別為N=7；PND 10及PND 12)。僅投予PBS的特威徹小鼠(twi/twi )作為歷史對照(N=8，研究1，PND 0；N=4，研究2，PND 12)。顯示中期生存結果，且實驗仍在進行中。縮寫： BMT，骨髓移植；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；N，動物數；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；PND，出生後日數。圖56C顯示在HSCT後8週，GFP+供體細胞在野生型和特威徹(克拉培氏病)小鼠小腦中的腦植入(brain engraftment)。 圖57顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之存活。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8 x 109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。監測存活。PND 40屍體剖檢群(PND 40 necropsy cohort)及存活群(survival cohort)的數據均按治療和基因型合併。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，基於每組與接受媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用對數秩(Mantel-Cox)檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液(intrathecal final formulation buffer)；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖58A-圖58B顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的雄性或雌性twi/twi 小鼠的體重。圖58A提供雄性的結果及圖58B提供雌性的結果。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。每週對動物稱重3次。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型進行組合，顯示從斷奶到PND 40組之屍體剖檢的平均體重。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，基於縱向數據的統計分析，使用線性混合效應模型將各組與經媒液治療的twi/twi 對照組進行比較。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖59A及圖59B顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的雄性或雌性twi/twi 小鼠的體重。圖59A提供雄性的結果及圖59B提供雌性的結果。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠以6.8 x 109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。離乳後每週對動物稱重3次。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型進行組合，顯示從斷奶到最後存活的twi/twi 小鼠 的屍體剖檢的平均體重。誤差棒代表標準偏差。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖60顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的twi/twi 小鼠的臨床評分評估。於PND 12-14，twi/twi 小鼠 以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在指定的出生後日子進行標準化的臨床評估。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型進行組合，顯示從斷奶到PND 40組之屍體剖檢的平均總臨床分數。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，基於縱向數據的統計分析，使用線性混合效應模型將各組與經媒液治療的twi/twi 對照組進行比較。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖61顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的twi/twi 小鼠的臨床評分評估。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在指定的出生後日子進行標準化的臨床評估。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型進行組合，顯示從斷奶到最後存活的twi/twi 小鼠的屍體剖檢的平均總臨床分數。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，基於縱向數據的統計分析，使用線性混合效應模型將各組與經媒液治療的twi/twi 對照組進行比較。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖62顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的twi/twi 小鼠的神經運動功能。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 35-37，藉由在加速桿上跑步的小鼠的落下時間(秒)來評估神經運動功能，該加速桿最初以5 RPM旋轉並在120秒內增加到40 RPM。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型合併。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖63顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的twi/twi 小鼠的血清中轉基因表現。於PND 12–14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8 x 1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 35-37，收集血清進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型合併。y軸被分割以說明0-1000 RFU範圍內的數據點之間的差異。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；G ALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；RFU，相對螢光單位；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖64顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的twi/twi 小鼠的腦中的轉基因表現。於PND 12–14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8 x 1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於屍體剖檢時，收集腦進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型合併。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；RFU，相對螢光單位；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖65A-圖65D顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的twi/twi 小鼠的心臟、腎臟、肝臟及脾臟中的轉基因表現。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於屍體剖檢，收集心臟(圖65A)、腎臟(圖65B)、肝臟(圖65C)、及脾臟(圖65D)進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型合併。誤差棒代表標準偏差。*p＜0.05，****p＜0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；RFU，相對螢光單位；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖66A–圖66C顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液(PND 40及存活群)的twi/twi 小鼠的肺臟、四頭肌及橫膈膜中的轉基因表現。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8 x 109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於屍體剖檢，收集肺臟(圖66A)、四頭肌(圖66B)、及橫膈膜(圖66C)進行GALC酶活性分析以評估轉基因表現。PND 40屍體剖檢群及存活群的數據均按治療和基因型合併。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；RFU，相對螢光單位；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖67A及圖67B顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之淋巴細胞計數。於PND 12-14，twi/twi 小鼠 以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0 x 1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 40-42的屍體剖檢(圖67A)及於存活群的人道安樂死(圖67B)，收集血液以定量淋巴細胞。在投予當天由未治療的twi/twi 和WT小鼠收集的血液用作基線對照。誤差棒代表標準偏差。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，係基於每組與經媒劑治療的WT對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖68A-圖68D顯示於投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠中的天門冬胺酸轉胺酶水平(圖68A及圖68B)及膽紅素水平(圖68C及圖68D)。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 40-42屍體剖檢及於存活群的人道安樂死，作為血清化學組的一部分，收集血清以評估AST及膽紅素水平。圖68A及圖68B分別顯示PND組及存活群的AST水平。圖68C及圖68D分別顯示PND組及存活群的總膽紅素水平。在投劑當天自未治療的twi/twi 和WT小鼠收集血清用作基線對照。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，***p＜0.001，係基於每組與經媒劑治療的WT對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。由於樣品數量不足，自統計數據排除未治療的WT小鼠(基線組，第2組)及以6.8x109 GC之劑量投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠(PND 40組，第8a組)。縮寫： AST，天門冬胺酸轉胺酶；Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖69A及圖69B顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之丙胺酸轉胺酶水平。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 40-42的屍體解剖(圖69A)及於存活群的人道安樂死(圖69B)，收集血清以評估ALT水平，作為血清化學組的一部分。在投予當天由未治療的twi/twi 和WT小鼠收集的血液用作基線對照。誤差棒代表標準偏差。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，係基於每組與經媒劑治療的WT對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。由於樣品數量不足，自統計數據排除未治療的WT小鼠(基線組，第2組)及以6.8x109 GC之劑量投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠(PND 40組，第8a組)。縮寫： ALT，丙胺酸轉胺酶；Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Gala 基因中喪失功能的突變所組成)；WT，野生型。 圖70A-圖70D顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠中葡萄糖(圖70A及圖70B)及澱粉酶水平(圖70C及圖70D)。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8 x 109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 40-42屍體剖檢及於存活群的人道安樂死，作為血清化學組的一部分，收集血清以評估葡萄糖及澱粉酶水平。在投予當天由未治療的twi/twi 和WT小鼠收集的血液用作基線對照。誤差棒代表標準偏差。*＜0.05，**p＜0.01，係基於每組與經媒劑治療的WT對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。由於樣品數量不足，自統計數據排除未治療的WT小鼠(基線組，第2組)及以6.8x109 GC之劑量投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠(PND 40組，第8a組)。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖71顯示於投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠中的肝臟微空泡化的半定量計分。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在人道安樂死的時點對存活群進行屍體剖檢，並收集肝臟用於組織病理學檢查。肝細胞空泡化的半定量計分如下：0級，無空泡；1級，最小空泡；2級，輕度空泡；3級，中度空泡。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖72A-圖72F顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之皮質及小腦中的IBA1-陽性細胞大小的定量。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0 x 1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 40-42進行屍體剖檢，並對存活群進行人道安樂死時收集腦。在投予當天由未治療的twi/twi 和WT小鼠收集的腦用作基線對照。對來自皮質的組織切片進行IBA1免疫組織化學-圖72A(基線)、圖72B(PND 40組)、圖72C(存活)及小腦-(圖72D(基線)、圖72E(PND 40組)、圖72F(存活)。使用影像分析軟體量化個別IBA1陽性球狀細胞的大小(平均目標面積)。誤差棒代表標準偏差。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；IBA1，離子鈣結合銜接子分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1)；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖73A-圖73F顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦幹及脊髓中的IBA1-陽性細胞大小的定量。圖73A、圖73B、及圖73C分別提供腦幹的基線、PND40組及存活群。圖73D、圖73E、及圖73F分別提供脊髓的基線、PND40組及存活群。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 40-42進行屍體剖檢，並對存活群進行人道安樂死時收集腦及脊髓。在投予當天由未治療的twi/twi 和WT小鼠收集的腦及脊髓用作基線對照。對來自腦幹及脊髓(頸、腰、胸)的組織切片進行IBA1免疫組織化學。使用影像分析軟體量化個別IBA1陽性球狀細胞的大小(平均目標面積)。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；IBA1，離子鈣結合銜接子分子1；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖74A-圖74C顯示投予rAAVhu68.hGALC或媒液的twi/twi 小鼠之腦幹及脊髓中的IBA1-陽性細胞大小的定量。圖74A提供基線結果。圖74B提供來自PND40組的結果。圖74C提供來自存活群的結果。於PND 12-14，twi/twi 小鼠以6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC之劑量，ICV投予rAAVhu68.hGALC。將年齡匹配的twi/twi 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。於PND 40-42及於存活群的人道安樂死進行屍體剖檢，並收集坐骨神經。在投予當天由未治療的twi/twi 和WT小鼠收集的坐骨神經用作基線對照。對來自坐骨神經的組織切片進行IBA1免疫組織化學。使用影像分析軟體量化個別IBA1陽性球狀細胞的大小(平均目標面積)。誤差棒代表標準偏差。**p＜0.01，****p＜0.0001，係基於每組與經媒劑治療的twi/twi 對照組的比較，使用單因子ANOVA及事後鄧恩多重比較檢定。縮寫： Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；IBA1，離子鈣結合銜接子分子1；ICV，腦室內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PND，出生後日數；twi ，特威徹對偶基因(由Galc 基因中的功能喪失的突變所組成)；WT，野生型。 圖75顯示投予具有工程化GALC(cGALCco)或天然犬GALC(cGALnat)序列的rAAVhu68的特威徹小鼠中血清GALC活性的比較。與具有天然序列的rAAVhu68相比，在投予rAAVhu.cGALCco的特威徹小鼠中觀察到提高存活。 圖76顯示提出的克拉培氏病犬的神經病理學和行為表型的進展(Wenger D.A., et al.(1999) J Hered.90(1)：138-42；Bradbury A., et al.(2016) Neuroradiol J. 29(6)：417-424；Bradbury A.M., et al.(2016b) 94(11)：1007-17；Bradbury A.M., et al.(2018) Hum Gene Ther.29(7)：785-801)。虛線表示尚未描述指定表型的較早時間點的數據。*星號指藉由組織學觀察到的脫髓鞘化。縮寫：BAER，腦幹聽覺誘發反應；CNS，中樞神經系統；MRI，磁振造影；NCV，神經傳導速度；PNS，周圍神經系統。 圖77顯示於克拉培氏病犬評估AAV.CB7.cGALCco.rBG基因療法的研究設計。 圖78顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後的克拉培氏病犬的體重。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)一劑3.0x1013 GC(N=4)或媒液(ITFFB；N=2)。健康的野生型同窩狗投予媒液作為對照(N=1)。每周秤重動物。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NCV，神經傳導速度。 圖79A-圖79D顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後的克拉培氏病犬的體重。圖79A及圖79B提供橈骨感覺NSV及坐骨運動NCV。圖79C及圖79D提供尺骨運動NCV及脛骨運動NCV。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco (AAV)一劑3.0x1013 GC (N=4)或媒液(ITFFB；N=2)。健康的野生型同窩狗投予媒液作為對照(N=1)。在指定的年齡進行神經傳導研究。呈現橈神經(感覺神經)及坐骨神經、尺神經和脛神經(運動神經)的NCV。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NCV，神經傳導速度。 圖80顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後的克拉培氏病犬的波間潛期(interpeak latency)。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco (AAV)一劑3.0 x 1013 GC (N=4)或媒液(ITFFB；N=2)。健康的野生型同窩狗投予媒液作為對照(N=1)。在指定年齡進行BAER。中心傳導時間定義為第一個峰與第五個峰之間的時間。值為0表示未測量到反應。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68. CB7. CI. cGALCco. rBG；BAER，腦幹聽覺誘發反應；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數。 圖81顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後，ICM投予rAAVhu68.cGALCco克拉培氏病犬後的BAER聽覺閾值。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)一劑3.0x1013 GC(N=4)或媒液(ITFFB；N=2)。健康的野生型同窩狗投予媒液作為對照(N=1)。評估在指定年齡進行的BAER聽力。聽力閾值定義為首次看到誘發波形時的聲音強度。值為0表示未測量到反應。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；BAER，腦幹聽覺誘發反應；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數。 圖82A-圖82D顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後，對克拉培氏病犬進行腦MRI研究的結果。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)一劑3.0x1013 GC(N=4)或媒液(ITFFB；N=2)。健康的野生型同窩狗投予媒液作為對照(N=1)。在長期組中(K933和K928)，當所有動物均為8-10週齡和61週齡時，進行腦部MRI檢查。將半定量腦白質強度評分分配給內囊、放射冠、胼胝體以及枕和小腦白質，如下所示：0=正常髓鞘化(低強度訊號)，1=次優髓鞘化(同強度訊號)，2=脫髓鞘化(高強度訊號)。圖82A提供腦MRI分數-個別治療的動物及媒液對照的白質高強度。圖82B提供用經媒液治療的克拉培氏病動物的MRI影像，顯示出高強度的白質。圖82C提供經rAAVhu68.cGalCco治療克拉培氏病動物的MRI影像，顯示出同強度的白質。顯示每隻動物在所有腦區域的累積白質強度分數。圖82D提供中間塊(mass intermedia)直徑的測量值。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；MRI，磁振造影；N，動物數。 圖83顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後克拉培氏犬之CSF中鞘胺醇半乳糖苷水平。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)一劑3.0x1013 GC(N=4)或媒液(ITFFB；N=2)。健康的野生型同窩狗投予媒液作為對照(N=1)。在整個研究中收集CSF樣品用於醣神經鞘脂質定量。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；MRI，磁振造影；N，動物數。 圖84顯示12個來自克拉培氏病犬ICM投予rAAVhu68.cGALCco後的腦及周圍神經中髓鞘化及球狀細胞的染色影像。第1欄係來自2個月時經媒液治療的克拉培氏病犬。第2欄係來自9個月時經治療的克拉培氏病犬。第3欄係來自6個月時經治療的克拉培氏病犬。第1列來自胼胝體。第2列來自小腦。第3列來自脊髓。第4列來自周圍神經。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予AAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0x1013 GC(動物K937、K938)或媒液(ITFFB；動物K930)。屍體剖檢時，收集CNS和PNS組織用於LFB/PAS染色以顯現髓磷脂(藍色染色)和球狀細胞。呈現來自經媒液處理的動物(動物K930，第35日屍體剖檢)及經AAV處理的動物(動物K938，第181日屍體剖檢；動物K937，於第261日屍體剖檢)之腦(胼胝體)、小腦葉、脊髓、及坐骨神經的代表性影像。縮寫：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；CNS，中樞神經系統；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PAS，過碘酸希夫；PNS，周圍神經系統。 圖85A-圖85F顯示克拉培氏病犬於ICM投予rAAVhu68.cGALCco後於神經系統中的半定量計分。圖85A、圖85B及圖85C分別顯示於腦、脊髓及周圍神經的脫髓鞘化。圖85D、圖85E、及圖85F分別顯示於腦、脊髓及周圍神經的球狀細胞浸潤。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0x1013 GC(動物K937、K938、K939)或媒液(ITFFB；動物K930、K948)。在第35日(動物K930)及第66日(動物K948)進行媒液處理動物的屍體剖檢。在第180±3日(動物K938、K939)及第261日(動物K937)進行經AAV處理的動物的屍體剖檢。屍體剖檢時，收集腦、脊髓(頸椎、腰椎、胸椎)及周圍神經(視神經、坐骨神經、腓神經、橈神經、脛神經、尺神經)進行LFB/PAS染色。對組織進行4點分級嚴重程度量表，評分範圍為1(正常髓鞘化及沒有球狀細胞)到4(最小至無髓鞘化及和瀰漫性球狀細胞浸潤)。縮寫：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PAS，過碘酸希夫。 圖86A及圖86B顯示克拉培氏病犬於ICM投予rAAVhu68.cGALCco後於神經系統中的神經發炎及球狀細胞貯積。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予AAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0x1013 GC(動物K937、K938、K939)或媒液(ITFFB；動物K930、K948)。在第35日(動物K930)及第66日(動物K948)進行媒液處理動物的屍體剖檢。在第180±3日(動物K938、K939)及第261日(動物K937)進行經AAV處理的動物的屍體剖檢。屍體剖檢時，收集腦進行IBA1免疫組織化學法。使用影像分析軟體測量球狀細胞的大小。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68. CB7. CI. cGALCco.rBG；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PAS，過碘酸希夫。 圖87A及圖87B顯示克拉培氏病犬於ICM投予rAAVhu68.cGALCco後於脊髓中的神經發炎及球狀細胞貯積。在2-3周齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0x1013 GC(動物K937、K938、K939)或媒液(ITFFB；動物K930、K948)。在第35日(動物K930)及第66日(動物K948)進行媒液處理動物的屍體剖檢。在第180±3日(動物K938、K939)及第261日(動物K937)進行經AAV處理的動物的屍體剖檢。屍體剖檢時，收集脊髓(頸椎、腰椎、胸椎)用於LFB/PAS染色。使用影像分析軟體測量球狀細胞的大小。縮寫： AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；PAS，過碘酸希夫。 圖88A-圖88D顯示ICM投予 rAAVhu68.cGALCco後克拉培氏病犬之CSF及血清中GALC活性。圖88A及圖88B分別顯示經AAV處理或經媒液處理的動物的CSF中GALC活性。圖88C及圖88D分別顯示經AAV處理或經媒液處理的動物的血清中GALC活性。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)一劑3.0x1013 GC(N=4)或媒液(ITFFB；N=2)。健康的野生型同窩狗投予媒液作為對照(N=1)。在治療後的指定時間點，收集所有動物的CSF和血清，並進行基於螢光的GALC活性測定以評估轉基因產物的表現。每個圖中的虛線表示CSF中的平均野生型GALC活性水平(上圖表–圖88A及圖88B)或血清(下圖表–圖88C及圖88D)，於動物K928追蹤18個月。縮寫 ：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68. CB7. CI. cGALCco. rBG；CSF，腦脊髓液；FU，螢光單位；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數。 圖89A-圖89G顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後克拉培氏病犬之中樞神經系統中GALC活性。圖89A-圖89D提供腦中GALC活性的結果：小腦(圖89A)、額葉皮質(圖89B)、延髓(圖89C)或枕葉皮質(圖89D)。圖89E-圖89G提供脊髓中GALC活性：頸椎(圖89E)、胸椎(圖89F)或腰椎(圖89G)。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0x1013 GC(動物K937、K938、K939)或媒液(ITFFB；動物K930、K948)。在第35日(動物K930)及第66日(動物K948)進行媒液處理動物的屍體剖檢。在第180±3日(動物K938、K939)及第261日(動物K937)進行經AAV處理的動物的屍體剖檢。屍體剖檢時，收集指定的腦和脊髓組織用於基於螢光的GALC活性測定，以評估轉基因產物的表現。縮寫 ：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；FU，螢光單位；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數。 圖90A-圖90D顯示克拉培氏病犬於ICM投予rAAVhu68.cGALCco後，藉由螢光單位(FU)/50 µg測量周圍神經系統中的GALC活性。圖90A顯示於背根神經節(DRG)-頸脊椎中的GALC活性。圖90B顯示於DRG-腰椎中GALC活性。圖90C提供於坐骨神經中GALC活性。圖90D提供於正中神經中GALC活性。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0x1013 GC(動物K937、K938、K939)或媒液(ITFFB；動物K930、K948)。在第35日(動物K930)及第66日(動物K948)進行媒液處理動物的屍體剖檢。在第180±3日(動物K938、K939)及第261日(動物K937)進行經AAV處理的動物的屍體剖檢。屍體剖檢時，收集指定的周圍神經組織用於基於螢光的GALC活性測定，以評估轉基因產物的表現。縮寫 ：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；DRG，背根神經節；FU，螢光單位；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數。 圖91A-圖91E顯示克拉培氏病犬於ICM投予rAAVhu68.cGALCco後，藉由螢光單位(FU)/50 µg測量周圍器官中的GALC活性。圖91A提供於心臟的結果。圖91B提供於腎臟的結果。圖91C提供於肝臟的結果。圖91D提供於橫膈膜的結果。圖91E提供於骨骼肌(股四頭肌)的結果。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0 x 1013 GC(動物K937、K938、K939)或媒液(ITFFB；動物K930、K948)。在第35日(動物K930)及第66日(動物K948)進行媒液處理動物的屍體剖檢。在第180±3日(動物K938、K939)及第261日(動物K937)進行經AAV處理的動物的屍體剖檢。屍體剖檢時，收集指定的周圍神經組織用於基於螢光的GALC活性測定，以評估轉基因產物的表現。縮寫 ：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；DRG，背根神經節；FU，螢光單位；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數。 圖92顯示ICM投予rAAVhu68.cGALCco後的克拉培氏病犬的組織生物分布。在2-3週齡時，克拉培氏病犬接受單一次ICM投予rAAVhu68.cGALCco(AAV)，以一劑3.0x1013 GC(動物K937、K938、K939)或媒液(ITFFB；動物K930、K948)。在第35日(動物K930)及第66日(動物K948)進行媒液處理動物的屍體剖檢。在第180±3日(動物K938、K939)及第261日(動物K937)進行經AAV處理的動物的屍體剖檢。屍體剖檢時，收集組織用於生物分布。縮寫 ：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；DRG，背根神經節；FU，螢光單位；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數。 圖93顯示從健康NHP的數字II所記錄的典型正中神經SNAP。藉由將刺激陰極與第II位記錄部位之間的物理距離除以發病潛伏期(即，刺激和SNAP發作之間的時間)來計算感覺神經傳導速度。SNAP振幅被計算為SNAP開始時的電壓與SNAP峰值的差。縮寫 ：NHP，非人類靈長類；SNAP，感覺神經動作電位。 圖94A及圖94B顯示ICM投予rAAVhu68.hGALC於NHP(第90天組)後，SNAP振幅和神經傳導速度，其結果以μV對研究日數的圖表顯示。圖94A提供SNAP振幅結果，並帶有由右正中神經(左)及左正中神經(右)的圖形。圖94B提供神經傳導速度，左側顯示的是右正中神經的圖形，右側顯示的是來自左正中神經的圖形。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在BL和第28±3、60±3、及90±4日進行感覺神經傳導測試。展示右及左正中神經的SNAP振幅及傳導速度。對於SNAP振幅，陰影區域(17.1–92.3 µV)表示該研究中所有動物的基線平均值的兩個標準偏差之內的值。縮寫 ：BL，基線；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；SNAP，感覺神經動作電位。 圖95A及圖95B顯示ICM投予rAAVhu68.hGALC於NHP(第180天組)後，SNAP振幅和神經傳導速度，其結果以μV對研究日數的圖表顯示。圖95A提供SNAP振幅結果，並帶有由右正中神經(左)及左正中神經(右)的圖形。圖95B提供神經傳導速度，左側顯示的是右正中神經的圖形，右側顯示的是來自左正中神經的圖形。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在BL和第28±3、60±3、90±4、120±4、150±4、及180±5日進行感覺神經傳導測試。展示右及左正中神經的SNAP振幅及傳導速度。對於SNAP振幅，陰影區域(17.1-92.3 µV) 表示該研究中所有動物的基線平均值的兩個標準偏差之內的值。縮寫 ：BL，基線；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；SNAP，感覺神經動作電位。 圖96A及圖96B顯示ICM投予rAAVhu68.hGALC或媒液後，NHPs之腦脊髓液中白血球計數。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1/組)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。於第0、7±1、14±2、28±3、60±3、90±4、120±4、150±4、及180±5日收集CSF。白血球定量為每微升CSF中的WBC數量。縮寫 ：CSF，腦脊髓液；GC，基因體拷貝；ID，識別數；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類；WBCs，白血球。 圖96C及圖96D顯示於假處理的克拉培氏病及野生型犬及克拉培氏病犬投予AAVhu68.cGALC的CSF及感覺神經元安全性監測。(圖96C) CSF胞吞(pleocytosis)。(圖96D)來自經AAVhu68.cGALC處理的克拉培氏病犬的背根神經節。 圖97A及圖97B顯示於第90日ICM投予rAAVhu68.hGALC至NHPs後(圖97A)或第180日(圖97B)的體重。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1/組)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。於BL及第0、7±1、14±2、28±3、60±3、90±4、120±4、150±4、及180±5日監測體重。縮寫 ：BL，基線；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；SNAP，感覺神經動作電位。 圖98A-圖98C顯示ICM投予rAAVhu68.hGALC至NHPs後之DRG神經元變性嚴重性分數，於第90日(圖98A)、第180日(圖98B)、或兩者合併(圖98C)。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1/組)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在第90日和第180日天屍體剖檢的所有經ITFFB和rAAVhu68.hGALC處理的動物的嚴重度等級分數顯示在每個DRG段(頸椎、胸椎和腰椎)中，以發現具有單核細胞浸潤的神經元細胞體變性。對於每個DRG段，分派下列分數：嚴重度等級1=最小，嚴重度等級2=輕微，嚴重度等級3=中度，嚴重度等級4=顯著；嚴重度等級5=嚴重。縮寫 ：DRG，背根神經節；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類動物；TRG，三叉神經節。 圖99A-圖99C顯示ICM投予rAAVhu68.hGALC至NHPs後之脊髓軸突病變嚴重性分數，於第90日(圖99A)、第180日(圖99B)，或所有合併分數(圖99C)。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1/組)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在第90日和第180日屍體剖檢的所有經ITFFB和rAAVhu68.hGALC處理的動物的嚴重度等級評分顯示脊髓背側白質束(頸椎、胸椎和腰椎段)的軸突病變。對於每個發現，分派下列分數：嚴重度等級1=最小，嚴重度等級2=輕微，嚴重度等級3=中度，嚴重度等級4=顯著；嚴重度等級5=嚴重。*p＜0.05，基於克拉斯卡－瓦立斯檢定(Kriskall Wallis test)，然後是鄧恩多重比較檢定，將每組與載體處理的對照組進行比較。縮寫 ：GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類。 圖100A-圖100D顯示於以rAAVhu68.hGALC或媒液處理的NHPs的血清及CSF中的GALC酶活性。圖100A繪製了180日研究中的GALC血清水平。圖100B顯示各種劑量下第14日的放大圖。圖100C繪製了180日研究中的GALC CSF水平。圖100D顯示各種劑量下第7日的放大圖。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1/組)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在指定日收集CSF和血清，並分析轉基因產物表現(GALC酶活性)。於血清的第14日圖(圖100B)及CSF的第7日圖(圖100D)中，中空的形狀表示在處理時抗載體衣殼的血清循環Nab為陰性的動物。中空的形狀代表在處理時抗載體衣殼的血清循環Nab為陰性的動物。誤差棒代表標準偏差。縮寫 ：BL，基線；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NAb，中和抗體；NHP，非人類靈長類。 圖101A顯示NHPs經ICM投予rAAVhu68.hGALC後之CSF中抗人類GALC抗體。圖101B顯示NHPs經ICM投予rAAVhu68.hGALC後之血清中抗人類GALC抗體。幼年的NHPs接受單次ICM投予媒液(ITFFB；N=1/組)或rAAVhu68.hGALC，於劑量4.5x1012 GC(低劑量)、1.5x1013 GC(中間劑量)、或4.5x1013 GC(高劑量)(N=3/組)。在指定的日期收集CSF和血清，並藉由ELISA測量針對轉基因產物的抗體(抗人類GALC抗體)。誤差棒代表標準偏差。縮寫 ：BL，基線；ELISA，酵素連結免疫吸附分析法；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N，動物數；NHP，非人類靈長類。
[發明的詳細說明]
提供一種表現人類半乳糖基神經醯胺酶(GALC)蛋白質之重組腺相關病毒(rAAV)，以及含該rAAV之組成物及其用途。於某些具體實施例，rAAV.hGALC首次提供有症狀的嬰兒克拉布氏病(infantile Krabbe)患者(早期嬰兒克拉培氏病(early infantile Krabbe disease，EIKD))之改善病程進展的治療(disease-modifying treatment)。於某些具體實施例，rAAV.hGALC提供一種用於症狀發生前的嬰兒患者的治療。於某些具體實施例，rAAV.hGALC提供一種可矯正導致呼吸衰竭及運動功能喪失的周圍神經療法。於某些具體實施例，rAAV.hGALC提供受益風險比例(benefit-risk ratio)不支持造血幹細胞移植(HSCT)的晚發患者額外選擇，HSCT是目前唯一的改善病程進展的治療。
如本文所使用，「rAAV.GALC」係指具有AAV衣殼之rAAV，該AAV衣殼中包裝至少含一種半乳糖基神經醯胺酶蛋白質(酵素)的編碼序列的載體基因體。rAAVhu68.GALC係指一種rAAV，其中該AAV衣殼為AAVhu68衣殼，其如本文中所定義。以下實施例亦說明其它AAV衣殼。
術語「cGALC」係指一種表現犬GALC之編碼序列，其在以下實施例中用於犬類研究。犬GALC具有26 bp信號肽且蛋白質總長度為669個胺基酸。
術語「hGALC」係指一種人類GALC之編碼序列。
hGALC之同功型1為典型序列且長度為685個胺基酸，此胺基酸序列於SEQ ID NO：6中再現。儘管有認為起始Met位於位置17而不是位置1，但成熟蛋白質位於約胺基酸43至約685，且信號肽位於位置1至42。儘管已知GALC的多個同功型(同功型1-5)，並且已經描述了超過三十六的天然變體，但是本發明人發現在位置641上由蘇胺酸(T)至丙胺酸(A)的變異是特別受期望的。此序列提供於SEQ ID NO：10。此變體為經人類半乳糖基神經醯胺酶(hGALC)編碼序列所編碼之蛋白序列，該編碼序列於本文所提供之rAAV及載體基因體的實施例中說明。半乳糖基神經醯胺酶(GALC)亦被稱為半乳糖腦苷脂酶(galactocerebrosidase)，且這些名稱可以互換使用。於某些具體實施例，此變體可被用於酵素置換療法或聯合療法。
如本文所使用，「CB7.CI.hGALC.rBG」係指載體基因體(例如，如圖2所示)，其包含在普遍存在的CB7啟動子控制下的人類GALC之編碼序列及包括至少一CMV IE(細胞巨大病毒立即早期)增強子、嵌合內含子及兔β-球蛋白(rBG)polyA序列，其皆於兩側為5'ITR及3'ITR。於某些具體實施例，CB7.CI.hGALC.rBG包括編碼具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之成熟GALC蛋白質的GALC編碼序列。於某些具體實施例，CB7.CI.hGALC.rBG包括GALC之編碼序列，其包含SEQ ID NO：9之核酸序列或與其具有95%至99.9%同一性之序列。於又另一具體實施例中，CB7.CI.hGALC.rBG載體基因體包括SEQ ID NO：19。於某些具體實施例，CB7.CI.hGALC.rBG包含SEQ ID NO：10之成熟蛋白質及外源性信號肽之編碼序列。
於某些具體實施例，所考量之融合蛋白質為至少含有成熟GALC，其中全部或一部分天然信號肽被移除(胺基酸1-17，或胺基酸1-42)並以外源性信號肽取代。此類融合蛋白質可含有外源性信號肽及至少成熟人類GALC蛋白質(例如，SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：10之胺基酸43至695)。於某些具體實施例，該融合蛋白質含有適於人類CNS中之細胞的外源性信號肽，即一種取代天然信號肽的信號肽，以改善人類CNS所存在之細胞中的蛋白質(即hGALC)產生、胞內運輸及/或分泌。適於人類CNS中之細胞的外源性信號肽，包括但不限於，天然存在於免疫球蛋白(例如，IgG)、細胞介素(例如，IL-2、IL12、IL18等)、胰島素、白蛋白，β-葡萄醣醛酸苷酶、鹼性蛋白酶，馮威里氏因子(von Willebrand factor；VWF)或纖連蛋白分泌信號肽的那些外源性信號肽(亦參見，例如，www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia)。
本發明亦包括編碼本文提供之GALC蛋白質的核酸序列(例如，SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10或含成熟GALC之融合蛋白質)。於某些具體實施例，編碼序列為編碼該蛋白質的cDNA序列。然而，亦包括對應的RNA序列。
於某些具體實施例，核酸編碼序列具有SEQ ID NO：5的cDNA序列或與其95%至99.9%相同的序列，或其片段。適當的片段包括成熟蛋白質之編碼序列(約nt 127至約nt 2058)，或具有信號肽的片段之成熟蛋白的編碼序列(例如，約nt 54至約nt 2058)。於某些具體實施例，編碼序列具有編碼成熟hGALC之核酸序列SEQ ID NO：5(nt 127至2058)或包含其與外源性前導序列之融合蛋白，或與其95%至99.9%相同之序列。於某些實施方式，編碼序列具有編碼成熟hGALC之核酸序列SEQ ID NO：5(nt 127至2058)或與其95%至99.9%相同的序列，或其包含前導序列和成熟hGALC之片段。於某些具體實施例，該編碼序列編碼具有胺基酸序列SEQ ID NO：10之全長人類GALC蛋白質。於某些具體實施例，該編碼序列編碼SEQ ID NO：5的hGALC前導序列(核酸1至126)及成熟蛋白質(經核酸127至2058編碼)。
於某些具體實施例，表現匣包含一或多個miRNA目標序列，其抑制hGALC於背根神經節(drg)的表現。此種miRNA目標序列可操作地連接至hGALC編碼序列。適合的miRNA目標序列被描述於PCT/US19/67872，2019年12月20日申請，標題為「Compositions for DRG-specific reduction of transgene expression」。國際專利申請案No. PCT/US19/67872藉由引用併入本文。
如本文所使用，克拉培氏病，亦稱為球狀細胞白血質障礙(globoid cell leukodystrophy；GLD)，為一種因影響半乳糖基神經醯胺酶(GALC)活性的突變引起的溶酶體貯積病，GALC是負責降解髓磷脂半乳糖脂的一種酶。依據酶的欠缺嚴重程度已經描述數種類型之克拉培氏病。由最嚴重至最不嚴重的酶欠缺為：早期嬰兒克拉克氏病(EIKD)，定義為≤6個月發病；晚期嬰兒克拉克氏病(LIKD)，定義為7到12個月發病；幼年克拉培氏病(JKD)，定義發病時間為13個月至10歲；以及青少年/成年發作型克拉培氏病。
於某些具體實施例，有效量的rAAV.GALC載體可將CSF中的GALC酶水平提高至正常水平的約30%至約100%以內。於其它具體實施例，有效量的rAAV.GALC載體可將血漿中的GALC酶水平提高至正常水平的約30%至約100%以內。於某些具體實施例，觀察到GALC之CSF或血漿水平的較低增加量，但是觀察到如本文所述與克拉培氏病相關的一種或多種症狀的改善。
「重組AAV」或「rAAV」為一種DNase抗性病毒顆粒，包含AAV衣殼及載體基因體兩個元件，該載體基因體至少含有包裝在AAV衣殼內的非AAV編碼序列。除非另有說明，否則該術語可與短語「rAAV載體」互換使用。rAAV為一種「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」，因為其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因且不能產生子代。於某些具體實施例，唯一的AAV序列是AAV反向末端重複序列(ITR)，通常置於載體基因體的5'和3'末端，以便使位於ITR之間的基因和調節序列包裝在AAV衣殼內。
如本文所使用，「載體基因體」係指包裝在形成病毒顆粒的rAAV衣殼內部的核酸序列。此種核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITRs)。於本文之例中，載體基因體由5’至3’含有(最低限度)AAV 5’ ITR、編碼序列及AAV 3’ ITR。可選擇來自AAV2之ITR，一種異於衣殼之不同來源AAV，或可選擇除全長ITR以外者。於某些具體實施例，ITR係來自與生產過程中提供rep功能的AAV或與反式互補AAV相同的AAV來源。再者，可使用其它ITR。此外，載體基因體含有指導基因產物表現的調節序列，於本文中更詳細地討論載體基因體的適當成分。
AAVhu68 如以下例中所述，本文所提供之rAAV包含AAVhu68衣殼，參見，例如，WO 2018/160582，其藉由引用併入本文。AAVhu68係於演化支F中，AAVhu68(SEQ ID NO：2)與另一演化支F病毒AAV9(SEQ ID NO：4)的區別在於vp1位置67及157的二個經編碼的胺基酸。相反地，另一演化支F AAV(AAV9、hu31、hu31)於位置67具有Ala且於位置157具有Ala。
rAAVhu68係由AAVhu68衣殼及載體基因體組成。在一具體實施例，含rAAVhu68之組成物包含vp1之異源族群、vp2之異源族群及vp3蛋白質之異源族群的組裝。如本文所使用，當用於指vp衣殼蛋白，術語「異源(heterogenous)」或其任何語法變化，係指由不相同元件組成的群體，例如，具有不同經修飾的胺基酸序列之具有vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。SEQ ID NO：2提供AAVhu68 vp1蛋白質之經編碼的胺基酸序列。AAVhu68衣殼含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內和vp3蛋白質內的亞群，它們具有來自SEQ ID NO：2中預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群至少包括某些去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞群包含於SEQ ID NO：2中的天冬醯胺酸-甘胺酸中的對中的至少一個、二個、三個或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸(N)位置，且可選擇地進一步包含其它去醯胺的胺基酸，其中該去醯胺造成胺基酸改變及其它選擇的修飾。此等及其它修改的各種組合被描述於本文中。
如本文所使用，vp蛋白質之「亞群」係指一群vp蛋白質，其具有至少一個共同的定義特徵，且由至少一組成員至少於參考組的所有成員所組成，除非另有指明。例如，vp1蛋白質之「亞群」為至少一個(1)vp1蛋白質及少於裝配好的AAV衣殼中的所有vp1蛋白質，除非另有指明。vp3蛋白質的「亞群」可為一(1)個vp3蛋白質到少於裝配好的AAV衣殼中的所有vp3蛋白質，除非另有指明。例如，vp1蛋白質可為vp蛋白質之亞群；vp2蛋白質可為vp蛋白質之一不同的亞群，及vp3為於組裝的AAV衣殼中的vp蛋白質之又另一亞群。於另一例中，vp1、vp2及vp3蛋白質可含有具有不同的修飾的亞群，例如，至少一、二、三或四個高度去醯胺的天冬醯胺酸，例如，於天冬醯胺酸-甘胺酸對。
除非另有規定，高度去醯胺的係指於參考的胺基酸位置上有至少45%去醯胺、至少50%去醯胺、至少60%去醯胺、至少65%去醯胺、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、97%、99%、多至約100%去醯胺，當與於參考胺基酸位置的預測的胺基酸序列比較(例如，SEQ ID NO：2的胺基酸57之天冬醯胺酸之至少80%可被去醯胺化，基於全部vp1蛋白，或SEQ ID NO：2的胺基酸409處的天冬醯胺酸中20%可被去醯胺化，基於全部vp1、vp2和vp3蛋白質)。此種百分比可使用2D膠體、質譜技術或其它適合的技術來確定。
如本文所提供，SEQ ID NO：2之各去醯胺化的N可獨立為天冬胺酸(Asp)、異天冬胺酸(isoAsp)、天冬胺酸鹽及/或Asp和isoAsp的互變混合，或其等之組合。可存在α-及異天冬胺酸之任何適合的比率。例如，於某些具體實施例，比率可為：由10:1至1:10天冬胺酸對異天冬胺酸；約50:50天冬胺酸:異天冬胺酸；或約1:3天冬胺酸:異天冬胺酸；或其它選擇的比率。於某些具體實施例，在SEQ ID NO：2中一或多個麩醯胺酸(Q)去醯胺化成麩胺酸(Glu)，即α-麩胺酸、γ-麩胺酸(Glu)或α-及γ-麩胺酸之混合物，其可經由普通的戊二醯亞胺(glutarinimide)中間體相互轉化。可存在α-及γ-麩胺酸任何適當的比例。例如，於某些具體實施例，比率可為由10:1至1:10之α對γ，約50:50之α:γ、或約1:3之α:γ、或其它選擇的比率。
如此，rAAVhu68包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的rAAVhu68衣殼內具有去醯胺胺基酸的亞群，至少包括，包含至少一種高度去醯胺的天冬醯胺酸的至少一個亞群。此外，其它修飾可包括異構化，特別於選擇的天冬胺酸(D或Asp)殘基位置上。於再其它具體實施例，修飾可包括在Asp位置上的醯胺化。
於某些具體實施例，AAVhu68衣殼含有與SEQ ID NO：2的經編碼的胺基酸序列相比，具有至少4個至至少約25個去醯胺化胺基酸殘基位置的vp1、vp2及vp3的亞群，其中至少1至10%被去醯胺化。此等中的大部分可為N殘基。然而，Q殘基亦可被去醯胺化。
於某些具體實施例，衣殼藉由一或多個下列各者而進一步被表徵。AAVhu68衣殼蛋白，其包含:由編碼SEQ ID NO：2之1至736預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生之AAVhu68 vp1蛋白質、由SEQ ID NO：1所產生的vp1蛋白質、或由編碼SEQ ID NO：2之1至736預測的胺基酸序列之與SEQ ID NO：1有至少70%相同的核酸序列所產生的vp1蛋白質；由編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸138至736的預測的胺基酸序列的核酸序列表現所產生的AAVhu68 vp2蛋白質、由包含SEQ ID NO：1的至少核苷酸412至2211之序列所產生的vp2蛋白質、或由編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸138至736的預期胺基酸序列之與SEQ ID No：1之至少核苷酸412至2211有至少70%相同的核酸序列所產生的vp2蛋白質，及/或由編碼SEQ ID NO：2之至少約胺基酸203至736預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生之AAVhu68 vp3蛋白質、由包含SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211的序列所產生的vp3蛋白質、或由編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸203至736的預測的胺基酸序列之與SEQ ID NO：1之至少核苷酸607至2211有至少70%相同的核酸序列所產生的vp3蛋白質。
另外或或者，提供一種AAV衣殼，其包含可選擇地包含位置157處的纈胺酸之vp1蛋白質的異源族群、可選擇地包含位置157處的纈胺酸之vp2蛋白質的異源族群、及vp3蛋白質之異源族群，其中基於SEQ ID NO：2的vp1衣殼的編號，至少vp1和vp2蛋白質亞群包含位置157處的纈胺酸，且可選擇地進一步包含位置67處的麩胺酸。另外或或者，提供一種AAVhu68衣殼，其包含：為編碼SEQ ID NO：2的胺基酸序列的核酸序列的產物的vp1蛋白質之異源族群、為編碼SEQ ID NO：2的至少約胺基酸138至736之胺基酸序列的核酸序列的產物的vp2蛋白質之異源族群、及為編碼SEQ ID NO：2的至少胺基酸203至736之核酸序列的產物的vp3蛋白質之異源族群，其中：該vp1、vp2及vp3蛋白質含有具胺基酸修飾的亞群。
AAVhu68 vp1、vp2及vp3蛋白質一般表現為由編碼SEQ ID NO：2的全長vp1胺基酸序列(胺基酸1至736)之相同核酸序列所編碼的選擇性剪接(alternative splice)突變體。可選擇地，vp1編碼序列單獨用於表現vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可以與以下之一或多者共表現：編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區域(約aa 1至約aa 202)的SEQ ID NO：2的AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)之核酸序列、或其互補股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211)，或編碼SEQ ID NO：2之aa 203至736之與SEQ ID NO：1有至少70%至至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。另外或替代地，vp1-編碼及/或vp2-編碼序列可與以下共表現：編碼SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)而不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約137)之核酸序列、或其互補股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之nt 412至22121)、或編碼SEQ ID NO：2之aa 138至736之至少70%至至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)與SEQ ID NO：1相同的序列。
如本文所述，rAAVhu68具有rAAVhu68衣殼，其在自編碼SEQ ID NO：2之vp1胺基酸序列之AAVhu68核酸及可選擇的額外核酸序列(例如，編碼不含vp1及/或vp2獨特區域的vp3蛋白質)表現衣殼之生產系統中所產生。使用單個核酸序列vp1產生的結果產生的rAAVhu68產生vp1蛋白質、vp2蛋白質及vp3蛋白質的異源群體。更特別地，rAAVhu68衣殼含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內和vp3蛋白質內的亞群，它們具有來自SEQ ID NO：2中預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞群至少包括去醯胺的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度去醯胺。
於一具體實施例，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：1之序列或與其互補的股，例如，對應的mRNA或tRNA。於某些具體實施例，vp2及/或vp3蛋白質可被額外地或替代地從不同於vp1的核酸序列表現，例如，以改變所選擇的表現系統中vp蛋白質的比例。於某些具體實施例，亦提供編碼SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)而不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2-獨特區域(約aa 1至約aa 202)之核酸序列、或與其互補的股，對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211)。於某些具體實施例，亦提供編碼SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)而不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約137)之核酸序列、或其互補股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之nt 412至2211)。
然而，可選擇編碼SEQ ID NO：2之胺基酸序列的其它核酸序列用於生產rAAVhu68衣殼。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：1之核酸序列、或至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%與SEQ ID NO：1相同的序列，其編碼SEQ ID NO：2。於某些實施方式，核酸序列具有SEQ ID NO：1之核酸序列、或至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%與SEQ ID NO：1之約nt 412至約nt 2211相同的序列，其編碼SEQ ID NO：2之vp2衣殼蛋白(約aa 138至736)。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID No：1之約nt 607至約nt 2211的核酸序列的核酸序列、或至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%與SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211相同的序列，其編碼SEQ ID NO：2之vp3衣殼蛋白(約aa 203至736)。
設計編碼此rAAVhu68衣殼的包括DNA(基因體或cDNA)或RNA(例如mRNA)之核酸序列係於本領域技術範圍內。於某些具體實施例，編碼AAVhu68 vp1衣殼蛋白之核酸序列係被提供於SEQ ID NO：1。於其它具體實施例，可選擇與SEQ ID NO：1有70%至99.9%同一性的核酸序列以表現AAVhu68衣殼蛋白。於某些其它具體實施例，核酸序列為至少約75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、或至少99%至99.9%與SEQ ID NO：1相同。如此核酸序列可進行密碼子優化以在所選系統(即細胞類型)中表現而可藉由各種方法設計。可使用可於線上取得的方法(例如，GeneArt)、公開的方法或提供密碼子優化服務的公司(例如，DNA2.0(Menlo Park, CA))而進行該優化。一密碼子優化方法被描述於例如，US國際專利公開案No. WO 2015/012924，其藉由引用將其完整內容併入本文。亦參見，例如，US專利公開案No.2014/0032186及US專利公開案No. 2006/0136184。適合地，產物的開讀框(ORF)的整個長度被修飾。然而，於一些具體實施例，可改變ORF之僅一片段。藉由使用此等方法之一者，可將頻率應用於任何給定的多肽序列，並產生編碼該多肽的密碼子優化的編碼區域的核酸片段。許多選項可用於進行對密碼子的實際更改或用於合成如本文所述設計的密碼子優化編碼區域。可使用所屬技術領域中具通常知識者眾所周知的標準及常規分子生物學操作來進行此類修飾或合成。於一途徑，藉由標準方法合成各自的長度為80-90個核苷酸並跨越所需序列的長度之一系列互補的寡核苷酸對。合成此等寡核苷酸對，經過退火黏合(anneal)，它們形成80-90個鹼基對的雙股片段，其含有黏性末端，例如，對中的每個寡核苷酸被合成以延伸3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個鹼基，該鹼基超出與該對中另一個寡核苷酸互補的區域。每對寡核苷酸的單股末端被設計為與另一對寡核苷酸的單股末端退火黏合。允許寡核苷酸對退火黏合，然後使此等雙股片段中的大約五至六個經由黏性的單股末端一起退火黏合，然後它們一起連結並被選殖至標準細菌選殖載體，例如，可獲自Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif的TOPO®載體。然後藉由標準方法定序此構築體。製備此等構築體中的數個，此等構築體由連接在一起的80至90個鹼基對片段的5至6個片段所組成，即由約500個鹼基對的片段所組成，如此使得整個所需序列在一系列質體構築體中表示。然後將此等質體的插入物以適當的限制酶切開，並連接在一起以形成最終構築體。然後將最終構築體選殖至標準細菌選殖載體，並定序。附加的方法對於所屬技術領域中具通常知識者為顯而易見的。此外，基因合成可容易地由市售獲得。
於某些具體實施例，rAAVhu68 vp1、vp2和vp3蛋白質中的N-G對中的天冬醯胺酸(N)是高度去醯胺化的。於rAAVhu68衣殼蛋白的情形，通常顯示4個殘基(N57、N329、N452、N512)去醯胺化水準＞70%，且於不同批次中多數情形＞90%。其它天冬醯胺酸殘基(N94、N253、N270、N304、N409、N477、及Q599)亦於各個批次中顯示出高達~20%的去醯胺化水平。最初使用胰蛋白酶消化物鑑定去醯胺化水平，並以胰凝乳蛋白酶消化物驗證。
於某些具體實施例，rAAVhu68衣殼含有AAVvp1、vp2及/或vp3衣殼蛋白的亞群，在rAAVhu68衣殼蛋白中具有至少四個天冬醯胺酸(N)位置為高度去醯胺化。於某些具體實施例，約20%至50%的N-N對(不包括N-N-N三聯體)顯示去醯胺化。於某些具體實施例，第一個N被去醯胺化。於某些具體實施例，第二個N被去醯胺化。於某些具體實施例，去醯胺化為約15%至約25%去醯胺化。對於AAVhu68蛋白的AAVhu68 vp1、vp2和vp3衣殼蛋白，SEQ ID NO：2的位置259處的Q處之去醯胺化為約8%至約42%。
於某些具體實施例，rAAVhu68衣殼的進一步特徵在於vp1、vp2及vp3蛋白質之D297處的醯胺化。於某些具體實施例，基於SEQ ID NO：2的編號，AAVhu68衣殼中vp1、vp2及/或vp3蛋白質的位置297處的D中約70%至約75%被醯胺化。於某些具體實施例，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個Asp異構化成D-Asp。基於SEQ ID NO：2的編號，這些異構物通常在一或多個殘基位置97、107、384處的Asp以少於約1%的量存在。
於某些具體實施例，rAAVhu68具有具vp1、vp2及vp3蛋白質的AAVhu68衣殼，該蛋白質具有包含在下表中所列出之位置處的一、二、三、四或更多個去醯胺化殘基之組合的亞群。於rAAV中去醯胺化可使用2D膠體電泳、及/或質譜分析、及/或蛋白質模擬(protein modelling)技術確定。線上層析可與Acclaim PepMap管柱及Thermo UltiMate 3000 RSLC system(Thermo Fisher Scientific)耦合至具NanoFlex源的Q Exactive HF Thermo Fisher Scientific)而進行。MS數據係使用Q Exactive HF的依賴於數據的top-20方法所獲取，可從勘測掃描(200-2000 m/z)中動態選擇最豐富的尚未定序的前驅物離子。經由較高能量的碰撞解離片段進行定序，並以預測性自動增益控制確定目標值1e5離子，以4 m/z的窗口進行前驅物分離。以m/z 200時的解析度為120,000獲得勘測掃描。在m/z200時，HCD光譜的解析度可設置為30,000，最大離子注入時間為50 ms，歸一化碰撞能量為30。S-lens RF水平可以設置為50，以使達到胜肽自消化物中佔據的m/z區域之最佳透射率。可以從片段化選擇中排除具有單個、未分配或六個或更高電荷狀態的前驅物離子。BioPharma Finder 1.0軟體(Thermo Fischer Scientific)可用於分析所獲取的數據。對於胜肽圖譜(peptide mapping)，使用單輸入蛋白質FASTA數據庫進行搜索，其中胺甲醯甲基化設置為固定修飾；將氧化、去醯胺及磷酸化設置為可變修飾，質量精度為10ppm，高蛋白酶特異性，MS/MS光譜的信賴度為0.8。適合的蛋白酶之例可以包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。去醯胺胜肽的質譜鑑定相對簡單，因去醯胺化增加完整分子的質量+0.984 Da(-OH及-NH2 基團之間的質量差)。特定胜肽的去醯胺化百分比由去醯胺胜肽的質量面積除以去醯胺和與天然胜肽的面積之和而確定。考慮到可能的去醯胺化位的數目，在不同位置去醯胺的同量異位物種(isobaric species)可能在一個峰中共遷移。因此，源自具有多個潛在去醯胺位點的胜肽的片段離子可用於定位或區分多個去醯胺位。於此等情形，觀察到的同位素圖譜內的相對強度可用於特異性確定不同的去醯胺胜肽異構物的相對豐度。此方法假定所有異構物的片段化效率相同，且在去醯胺化位點上是獨立的。本項技術領域中具通常知識者應理解，可使用此等說明性方法的多種變型。例如，適合的質譜儀可包括例如四極飛行時間質譜儀(QTOF)，諸如Waters Xevo或Agilent 6530或軌道儀器，諸如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(Thermo Fisher)。適合的液相層析系統包括：例如，來自Waters或Agilent systems(1100或1200系列)之Acquity UPLC system。適合的資料分析軟體可包括，例如，MassLynx(Waters)、Pinpoint及 Pepfinder(Thermo Fischer Scientific)、Mascot(Matrix Science)、Peaks DB(Bioinformatics Solutions)。其它技術亦可描述在例如X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267，2017年6月16日線上公開。
去醯胺 基於預測的AAVHu68 (SEQ ID NO：2) 平均%，基於AAVhu68衣殼中VP1/VP2/VP3蛋白質
經去醯胺化的殘基+1 (Neighboring AA) 廣泛的百分比範圍(%) 窄範圍(%)
N57 (N-G) 78至100% 80至100，85至97
N66 (N-E) 0至5 0、1至5
N94 (N-H) 0至15， 0、1至15、5至12、8
N113 (N-L) 0至2 0、1至2
~N253 (N-N) 10至25 15至22
Q259 (Q-I) 8至42 10至40，20至35
~N270 (N-D) 12至30 15至28
~N304 (N-N)(位置303亦為N) 0至5 1至4
N319 (N-I) 0至5 0、1至5、1至3
N329* (N-G)*(位置328亦為N) 65至100 70至95、85至95、80至100、85至100，
N336 (N-N) 0至100 0、1至10、25至100、30至100、30 至95
~N409 (N-N) 15至30 20至25
N452 (N-G) 75至100 80至100、90至100、95至100，
N477 (N-Y) 0至8 0、1至5
N512 (N-G) 65至100 70至95、85至95、80至100、85至100，
~N515 (N-S) 0至25 0、1至10、5至25、15至25
~Q599 (Asn-Q-Gly) 1至20 2至20，5至15
N628 (N-F) 0至10 0、1至10、2至8
N651 (N-T) 0至3 0、1至3
N663 (N-K) 0至5 0、1至5、2至4
N709 (N-N) 0至25 0,1至22，15至25
N735 0至40 0.1至35、5至50、20至35
於某些具體實施例，AAVhu68衣殼的特徵在於，其衣殼蛋白在基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列編號的位置N57、N329、N452及/或N512中的至少一處的至少45%的N殘基被去醯胺化。於某些具體實施例，在此等N-G位置(即基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列的編號，N57、N329、N452及/或N512)的一或多處的至少約60%、至少約70%、至少約80%、或至少90%的N殘基被去醯胺化。於此等及其它具體實施例，AAVhu68衣殼的進一步特徵在於具有一蛋白質群，其中基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列編號，在下列一或多個位置處的N殘基中約1%至約20%已被去醯胺化：N94、N253、N270、N304、N409、N477及/或Q599。於某些具體實施例，至少包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的亞群，基於SEQ ID NO：2的胺基酸序列編號，該亞群在下列一或多個位置處被去醯胺化：N35、N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709、N735，或其組合。於某些具體實施例，衣殼蛋白可具有一或多個醯胺化的胺基酸。
還觀察到其它修飾，其中大多數不導致一個胺基酸轉化為不同的胺基酸殘基。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及vp3中的至少一個Lys被乙醯化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個Asp異構化為D-Asp。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個S(Ser，絲胺酸)被磷酸化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個T(Thr，蘇胺酸)被磷酸化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個W(trp，色胺酸)被氧化。可選擇地，衣殼的vp1、vp2及/或vp3中的至少一個M(Met，甲硫胺酸)被氧化。於某些具體實施例，衣殼蛋白質具有一或多個磷酸化。例如，某些vp1衣殼蛋白質可在位置149處被磷酸化。
於某些具體實施例，rAAVhu68衣殼包含：vp1蛋白質的異源族群，其為編碼SEQ ID NO：2胺基酸序列之核酸序列的產物，其中vp1蛋白質包含位置67處的麩胺酸(Glu)及/或位置157處的纈胺酸(Val)；vp2蛋白質的異源族群，其可選擇地包含位置157處的纈胺酸(Val)；及vp3蛋白質的異源族群。AAVhu68衣殼包含至少一個亞群，其中基於SEQ ID NO：2胺基酸序列的殘基編號，位於vp1蛋白的位置57處的天冬醯胺酸-甘胺酸對中的至少65%的天冬醯胺酸(N)及vp1、v2和vp3蛋白質的位置329、452及/或512處的天冬醯胺酸-甘胺酸對中的至少70%的天冬醯胺酸(N)被去醯胺化，其中去醯胺化導致胺基酸改變。
如本文中更詳細的討論，去醯胺化的天冬醯胺酸可被去醯胺化為天冬胺酸、異天冬胺酸、互變天冬胺酸/異天冬胺酸對、或其等之組合。於某些具體實施例，rAAVhu68進一步特徵在於下列一或多者：(a)各vp2蛋白質獨立為編碼SEQ ID NO：2之至少vp2蛋白質的核酸序列的產物；(b)各vp3蛋白質獨立為編碼SEQ ID NO：2之至少vp3蛋白質的核酸序列的產物；(c)編碼vp1蛋白質的核酸序列為SEQ ID NO：1，或編碼SEQ ID NO：2之胺基酸序列之與SEQ ID NO：1至少70%至至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。可選擇地，該序列單獨用於表現vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可以與以下之一或多者共表現：編碼SEQ ID NO：2的AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)而不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2-獨特區域(約aa 1至約aa 202)之核酸序列、或與其互補的股，對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之約nt 607至約nt 2211)，或編碼SEQ ID NO：2之aa 203至736之與SEQ ID NO：1有至少70%至至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。另外或替代地，vp1-編碼及/或vp2-編碼序列可與以下共表現：編碼SEQ ID NO：2之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)而不具有vp1-獨特區域(約aa 1至約137)之核酸序列、或其互補股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：1之nt 412至2211)，或編碼SEQ ID NO：2之aa 138至736之與SEQ ID NO：1有至少70%至至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。
另外或或者，rAAVhu68衣殼至少包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的亞群，基於SEQ ID NO：2的編號，該亞群在下列一或多個位置處被去醯胺化：N57、N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N329、N336、N409、N410、N452、N477、N512、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其組合；(e)rAAVhu68衣殼包含vp1、vp2及/或vp3蛋白質的亞群，基於SEQ ID NO：2的編號，該亞群在下列一或多個位置處包含1%至20%的去醯胺化：N66、N94、N113、N252、N253、Q259、N270、N303、N304、N305、N319、N328、N336、N409、N410、N477、N515、N598、Q599、N628、N651、N663、N709，或其組合；(f)rAAVhu68衣殼包含vp1的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，vp1蛋白質位置57處的65%至100%的N被去醯胺化；(g)rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質的亞群，其中vp1蛋白質位置57處的75%至100%的N被去醯胺化；(h)rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，位置329處的80%至100%的N被去醯胺化；(i)rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，位置452處的80%至100%的N被去醯胺化；(j)rAAVhu68衣殼包含vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞群，其中基於SEQ ID NO：2的編號，位置512處的80%至100%的N被去醯胺化；(k)rAAV包含約60總衣殼蛋白質，其比率約1個vp1比約1至1.5個vp2比3至10個vp3蛋白質；(l)rAAV 包含約60個總衣殼蛋白質，其比率約1個vp1比約1個vp2比3至9個vp3蛋白質。
於某些具體實施例，修飾AAVhu68以改變天冬醯胺酸-甘胺酸對中的甘胺酸，以便減少去醯胺化。於其它具體實施例，將天冬醯胺酸改變為不同的胺基酸，例如以較慢的速度去醯胺的麩醯胺；或缺少醯胺基的胺基酸(例如，含有醯胺基的麩醯胺及天冬醯胺酸)；及/或缺少胺基的胺基酸(例如含有醯胺基的離胺酸、精胺酸及組胺酸)。如本文所使用，缺少醯胺或胺側鏈的胺基酸係指例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、胱胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、或色胺酸、及/或脯胺酸。諸如所述的修飾可為於編碼的AAVhu68胺基酸序列中發現的1、2或3個天冬醯胺酸-甘胺酸對中。於某些具體實施例，在所有四個天冬醯胺酸-甘胺酸對中沒有進行此種修飾。如此，提供一種具有較低去醯胺化率的方法，用於減少rAAVhu68及/或工程化rAAVhu68變異體的去醯胺化。另外，可以將一種或多種其它醯胺胺基酸改變為非醯胺胺基酸以減少rAAVhu68的去醯胺化。
此等胺基酸修飾可藉由常規遺傳工程技術進行。例如，可產生含有修飾的AAVhu68 vp密碼子的核酸序列，其中編碼SEQ ID NO：22(天冬醯胺酸-甘胺酸對)中位置58、330、453及/或513處之甘胺酸的一至三個密碼子被修飾成編碼甘胺酸以外的胺基酸。於某些具體實施例，可在位於SEQ ID NO：2中位置57、329、452及/或512處的一至三個天冬醯胺酸-甘胺酸對處，對含經修飾的天冬醯胺酸密碼子的核酸序列進行工程化，從而經修飾的密碼子編碼天冬醯胺酸以外的胺基酸。每個修飾的密碼子可編碼不同的胺基酸。或者，一或多個經改變的密碼子可編碼相同的胺基酸。於某些具體實施例，此等經修飾的AAVhu68核酸序列可用於產生具有比天然hu68衣殼更低去醯胺化衣殼的突變體rAAVhu68。此類突變體rAAVhu68可具有降低的免疫原性及/或提高儲存穩定性，特別是以懸浮形式儲存。如本文所使用，「密碼子」係指編碼胺基酸之序列中的三個核苷酸。
如本文所使用，「經編碼的胺基酸序列」係指基於被轉譯為胺基酸的參考核酸序列之已知DNA密碼子的轉譯而預測的胺基酸。下表舉例說明DNA密碼子和20種常見胺基酸，顯示單字母代碼(SLC)和三字母代碼(3LC)。
胺基酸 SLC 3 LC DNA密碼子
異白胺酸 I Ile ATT、ATC、ATA
白胺酸 L Leu CTT、CTC、CTA、CTG、TTA、TTG
纈胺酸 V Val GTT、GTC、GTA、GTG
苯丙胺酸 F Phe TTT、TTC
甲硫胺酸 M Met ATG
半胱胺酸 C Cys TGT、TGC
丙胺酸 A Ala GCT、GCC、GCA、GCG
甘胺酸 G Gly GGT、GGC、GGA、GGG
脯胺酸 P Pro CCT、CCC、CCA、CCG
蘇胺酸 T Thr ACT、ACC、ACA、ACG
絲胺酸 S Ser TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC
酪胺酸 Y Tyr TAT、TAC
色胺酸 W Trp TGG
麩醯胺酸 Q Gln CAA、CAG
天冬醯胺酸 N Asn AAT、AAC
組胺酸 H His CAT、CAC
麩胺酸 E Glu GAA、GAG
天冬胺酸 D Asp GAT、GAC
離胺酸 K Lys AAA、AAG
精胺酸 R Arg CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG
終止密碼子 終止    TAA、TAG、TGA
rAAVhu68衣殼可用於某些具體實施例。例如，此類衣殼可用於產生單株抗體及/或產生用於監測基因療法患者中AAVhu68濃度水平的分析中所使用的試劑。用於產生有用的抗AAVhu68抗體、標記此類抗體或空衣殼的技術及適當的分析形式為所屬技術領域中具通常知識者已知。
於某些具體實施例，本文提供SEQ ID NO：1之核酸序列，或至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%的序列，其編碼具有如本文所述之修飾(例如去醯胺化胺基酸)的SEQ ID NO：2的vp1胺基酸序列。於某些具體實施例，vp1胺基酸序列於SEQ ID NO：2中再現。
如本文所使用，與AAV的群組有關的術語「演化支」係指在系統發生學上彼此相關的一群AAV，基於AAV vp1胺基酸序列比對而確定，如使用近鄰相接演算法(Neighbor-Joining algorithm)通過至少75%(至少1000個重複)的獨立運算值及泊松校正距離(Poisson correction distance)測量值不超過0.05。於文獻中已描述近鄰相接演算法。參見，例如，M. Nei and S. Kumar,Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York(2000)。可用於執行此演算法的電腦程式係可取得。例如，the MEGA v2.1程式執行修飾的Nei-Gojobori法。使用此等技術及電腦程式，及AAV vp1衣殼蛋白質之序列，本項技術領域中具通常知識者可容易地確定所選擇的AAV係包含於本文鑑別的一個演化支中、另一個演化支中、或是於此等演化支之外。參見，例如， G Gao,et al , J Virol, 2004 Jun；78(10：6381-6388，其鑑別演化支A、B、C、D、E及F，GenBank登錄號AY530553至AY530629。亦參見WO 2005/033321。
如本文所使用，「AAV9衣殼」為由多個AAV9 vp蛋白質所組成之自組裝的AAV衣殼。AAV9 vp蛋白質一般被表現為選擇性剪接變異體，由SEQ ID NO：3之核酸序列編碼，該核酸序列編碼SEQ ID NO：4之vp1胺基酸序列(GenBank登錄號：AAS99264)。此等剪接變異體造成SEQ ID NO：4之不同長度的蛋白質。於某些具體實施例，「AAV9衣殼」包括具有與AAS99264具有99%同一性或與SEQ ID NO：4具有99%同一性之胺基酸序列的AAV。亦參見US7906111及WO 2005/033321。如本文所使用，「AAV9變異體」包括彼等描述於例如，WO2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911、及US 8,734,809。
已描述生產衣殼之方法、其編碼序列、及生產rAAV病毒載體之方法。參見，例如， Gao, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10), 6081-6086(2003)及US 2013/0045186A1。
當指核酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」係指在與另一核酸(或其互補股)的適當核苷酸插入或刪除進行最佳比對時，於至少約95%至99%的比對序列中有核苷酸序列同一性。較佳地，該同源為全長序列、或其開讀框、或長度至少為15個核苷酸的其它適合的片段。本文描述適合的片段之例。
於核酸序列之上下文中，術語「序列同一性」、「百分比序列同一性」、或「百分比相同」係指兩個序列中當比對以獲得最大對應性時其為相同。序列同一性比較之長度冀望可為整個基因體之全長、基因編碼序列之全長、或至少約500至5000個核苷酸之片段。然而，較小片段中的同一性，亦可冀望為例如，至少約9個核苷酸，通常至少約20至24個核苷酸，至少約28至32個核苷酸，至少約36或以上之核苷酸。相似地，可容易地確定在蛋白質之全長、或其片段上的胺基酸序列的「百分比序列同一性」。適合地，片段為至少約8個胺基酸長且可多至約700個胺基酸。本文描述適合的片段之例。
當指胺基酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」係指在與另一胺基酸(或其互補股)的適當胺基酸插入或刪除進行最佳比對時，於至少約95%至99%的比對序列中有胺基酸序列同一性。較佳地，該同源為全長序列、或其蛋白質，例如，cap蛋白質、rep蛋白質、或其片段，其為至少8個胺基酸，或更希望地，至少15個胺基酸長。本文描述適合的片段之例。
術語「高度保守」意指至少80%同一性，較佳至少90%同一性，更佳為超過97%同一性。藉由使用本項技術領域中具通常知識者已知的演算法及電腦程式，本項技術領域中具通常知識者可以容易地確定同一性。
一般而言，當提及兩個不同腺相關病毒之間的「同一性」、「同源性」、或「相似性」時，參照「比對」序列來確定「同一性」、「同源性」、或「相似性」。「比對」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常包含缺失或增加的鹼基或胺基酸的校正。在實施例中，使用公開的AAV9序列作為參考點進行AAV比對。使用多種公開或市售的多序列比對程式中的任何一種進行比對。此種程式之例包括：「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」、及「MEME」，其可通過網際網路上的Web伺服器進行。此種程式之其它來源為本項技術領域中具通常知識者所知悉。或者，亦可使用Vector NTI應用程式。本領域中亦有許多可用於測量核苷酸序列同一性的算法，包括含於上述程式中的彼等者。作為另一例，可使用GCG版本6.1的程式FastaTM ，而比較多核苷酸序列。FastaTM 提供查詢序列及檢索序列之間最佳重疊區域的比對及百分比序列同一性。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用Fasta™及其內定參數(字長為6，得分矩陣的NOPAM因子)而確定，如GCG版本6.1中所提供，其藉由引用併入本文。多序列比對程式亦可用於胺基酸序列，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。一般而言，儘管本項技術領域中具通常知識者可依需要改變此等設定，但此等程式之任一者皆可於預設下使用。或者，本項技術領域中具通常知識者可利用另一種演算法或電腦程式，該演算法或電腦程式至少提供與所引用的演算法及程式所提供的同一性或比對水平。參見，例如， J. D. Thomson et al, Nucl.Acids.Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690(1999)。
rAAV 載體 如上所述，AAVhu68序列及蛋白質有用於製造rAAV，且亦有用於重組AAV載體，其可為反義遞送載體、基因療法載體或疫苗載體。此外，如本文所述之工程化AAV衣殼，例如相對於SEQ ID NO：2中vp1衣殼蛋白質的編號，在位置67、157或二者處具有突變體胺基酸者，可用於工程化遞送數種適當核酸分子至標的細胞及組織的rAAV載體。
包裝於AAV衣殼中並遞送到宿主細胞的基因體序列通常由(最低限度)轉基因及其調節序列和AAV反向末端重複(ITR)組成。單股AAV及自我互補(self-complementary；sc)AAV二者皆包含rAAV。轉基因為一種核酸編碼序列，與載體序列異源，其編碼有興趣之多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它基因產物。
尤其，本揭示提供包含人類半乳糖基神經醯胺酶(GALC)之編碼序列的rAAV。於一些具體實施例，編碼序列為工程化GALC編碼序列。於一些具體實施例，編碼序列為SEQ ID NO：9之GALC基因(GALCco)的序列。於某些具體實施例，GALC編碼序列包含與SEQ ID NO：9至少95%相同的序列。
該核酸編碼序列係以在目標組織的細胞中允許轉殖基因轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節成分可操作地連接。於一些具體實施例，調節序列包含β-肌動蛋白啟動子、內含子、及兔球蛋白polyA。於一些具體實施例，調節序列包含SEQ ID NO：13。於一些具體實施例，調節序列包含SEQ ID NO：15。於一些具體實施例，調節序列包含SEQ ID NO：16。
載體的AAV序列通常包含順式作用(cis-acting) 5'及3'反向末端重複序列(參見，例如，B. J. Carter, in “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168(1990))。ITR序列長度為約145 bp。較佳地，儘管允許對此等序列進行某種程度的輕微修飾，但是基本上在分子中使用了編碼ITR的整個序列。修飾此等ITR序列的能力係於本領域技術範圍內。(參見，例如，文件如Sambrook et al, “Molecular Cloning.A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1989)；and K. Fisher et al., J. Virol., 70：520 532(1996))。本發明中所使用的此種分子之例為含有轉基因(transgene)的「順式作用」質體，其中5'及3' AAV ITR序列位於所選擇的轉基因序列及有關的調節元件兩側。於一具體實施例，ITR來自不同於提供衣殼的AAV。於一具體實施例，ITR序列來自AAV2。已描述5’ITR的縮短版，稱為∆ITR，其中刪除了D序列(D-sequence)及末端分割位點(terminal resolution site，trs)。於其它具體實施例，使用全長AAV 5’及3’ITRs。然而，可選擇來自其它AAV來源的ITRs。於ITR之來源為來自AAV2且AAV衣殼來自另一AAV來源時，生成的載體可稱為假型(pseudotype)。然而，此等元件之其它型態可為適合的。於某些具體實施例，載體基因體包括130個鹼基對之縮短的AAV2 ITR，其中外部「一」元件被刪除。使用內部A元件作為模板，在載體DNA擴增過程中，縮短的ITR被還原為145個鹼基對的野生型長度。於其它具體實施例，使用全長或其它AAV 5’及3’ITRs。
除了上列確定的重組AAV載體之主要元件之外，載體亦包括必需的習用控制元件，其以允許轉基因在用質體載體轉染或用本發明產生的病毒感染的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與轉基因可操作地連接。如本文所使用，「可操作地連接」的序列包括與有興趣的基因鄰接的表現控制序列及以反式或於一距離地作用而控制有興趣的基因之表現控制序列兩者。
調節控制元件通常含啟動子序列作為表現控制序列之一部分，例如，位於選擇的5’ ITR序列及編碼序列之間。構成性啟動子(constitutive promoter)、可調節的啟動子[參見，例如， WO 2011/126808及WO 2013/04943]、組織特異性啟動子或對生理提示有反應的啟動子可被用於本文所述的載體。啟動子可選自不同來源，例如， 人類巨細胞病毒(CMV)立即早期增強子/啟動子、SV40早期增強子/啟動子、JC多瘤病毒啟動子、髓鞘質鹼性蛋白質(MBP)或神經膠原纖維酸性蛋白質(glial fibrillary acidic protein，GFAP)啟動子、單純疱疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(latency associated promoter，LAP)、勞氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus，RSV)末端長重複序列(LTR)啟動子、神經元特異性啟動子(NSE)、血小板衍生生長因子(PDGF)啟動子、hSYN、黑色素凝集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)啟動子、CBA、基質金屬蛋白酶啟動子(matrix metalloprotein promoter，MPP)、及雞β-肌動蛋白啟動子。除了啟動子，載體可含有一或多個其它適當轉錄起始、終止、增強子序列、有效的RNA處理訊息諸如剪接(splicing)及多腺苷酸化(polyA)訊息；穩定細胞質的mRNA之序列，例如WPRE；增強轉譯效率之序列(即，Kozak共通序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當需要時，增強所編碼的產物之分泌的序列。適合的增強子之例為CMV增強子。其它適合的增強子包括彼等適合於所欲目標組織適應症者。在一具體實施例，表現匣包含一或多個表現增強子。在一具體實施例，表現匣含二或多個表現增強子。此等增強子可相同或可彼此不同。例如，增強子可包括CMV立即早期增強子。此增強子能夠以位置彼此相鄰的兩個拷貝的方式存在。或者，增強子的雙重拷貝可被一個或多個序列分開。於再另一具體實施例，表現匣進一步包含內含子，例如雞β-肌動蛋白內含子。其它適合的內含子包括本技術領域中已知者，例如，諸如WO 2011/126808所述者。適合的polyA序列之例包括例如，SV40、SV50、牛生長激素(bGH)、人類生長激素、及合成的polyA。可選擇地，可選擇一或多個序列以穩定mRNA。此種序列之例為經修飾的WPRE序列，其可為工程化的polyA序列的上游及編碼序列的下游(參見，例如，MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy(2009)16: 605-619。
此等rAAV特別適合用於治療目的及用於免疫的基因遞送，包括誘導保護性免疫。此外，本發明的組成物亦可用於活體外產生所欲之基因產物。對於活體外生產，可在以含編碼所欲產物之分子的rAAV轉染宿主細胞並在允許表現的條件下培養細胞培養基之後，由所欲之培養物中獲得所欲產物(例如蛋白質)，然後可根據需要純化及分離經表現之產物。用於轉染、細胞培養、純化及分離的適當技術為所屬技術領域中具通常知識者已知。
rAAV 載體生產 於使用於生產AAV病毒載體(例如，重組(r)AAV)，表現匣可被攜帶於任何適合的載體上，例如，質體，其被遞送至包裝的宿主細胞。有用於本發明之質體可經工程化而適合於原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等中之活體外複製及包裝。適合的轉染技術及包裝宿主細胞為本技術領域中具有通常知識者已知及/或可輕易設計。
生產及單離適合作為載體使用之AAV之方法為本技術領域已知。一般參見例如，Grieger & Samulski, 2005, “Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications,”Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99：119-145；Buninget al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology,"J. Gene Med. 10:717-733；及下列引述的參考文獻，其每一者藉由引用而完整併入本文。於將基因包裝到病毒體中，ITR為與包含該表現匣的核酸分子相同的構築體中順式唯一需要的AAV。cap和rep基因可以反式提供。
在一具體實施例，本文所述之表現匣工程化至遺傳成分(例如，穿梭質體(shuttle plasmid))中，將攜帶在其上的免疫球蛋白構築體序列轉移至包裝宿主細胞中以生產病毒載體。於一具體實施例，選擇的基因元件可藉由任何適合的方法而被遞送至AAV包裝細胞，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA塗布丸粒、病毒感染及原生質體(protoplast)融合。亦可製作穩定的AAV包裝細胞。或者，表現匣可用於產生AAV以外的病毒載體，或用於活體外抗體混合物之製造。用於製作此種構築體之方法為核酸操作領域中具有通常知識者所知悉且包括基因工程、重組工程、及合成技術。參見，例如， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指缺少包裝在其中的所欲基因體序列的組裝的rAAV衣殼。此等亦被稱為「空的」衣殼。此種衣殼可不含有表現匣的可檢測的基因體序列，或僅含有不足以達成基因產物表現的部分包裝的基因體序列。此等空的衣殼沒有將感興趣的基因轉移至宿主細胞的功能。
本文所述重組腺相關病毒(AAV)可使用已知技術生產。參見，例如， WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此種方法涉及培養宿主細胞，其含有編碼AAV衣殼蛋白質的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重複序列(ITRs)及轉基因所組成的表現匣；及足夠的輔助功能，以允許將表現匣包裝至AAV衣殼蛋白質中。已描述生產衣殼之方法、其編碼序列、及生產rAAV病毒載體之方法。參見，例如， Gao, et al, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100(10), 6081-6086(2003)及US 2013/0045186A1。
於一具體實施例，提供有用於生產重組rAAVhu68之生產細胞培養物。此類細胞培養物包含在宿主細胞中表現rAAVhu68衣殼蛋白質的核酸；適於包裝至rAAVhu68衣殼中的核酸分子，例如包含AAV ITR及編碼基因產物的非AAV核酸序列的載體基因體，該非AAV核酸序列可操作連接至與指導產物在宿主細胞中表現的序列；及足夠的AAV rep功能和腺病毒輔助者功能，以允許將核酸分子包裝至重組AAVhu68衣殼中。在一具體實施例，細胞培養物由哺乳動物細胞(例如人類胚腎293細胞等)或昆蟲細胞(例如桿狀病毒(baculovirus))組成。
適當地，rep功能是由AAV所提供，該AAV來自與存在於載體基因體中的ITR相同的來源，或來自另一個將載體基因體包裝至AAV衣殼中的來源(例如，AAVhu68)。於某些具體實施例，rep蛋白質來自AAV2。然而，於另一具體實施例，rep蛋白質為AAVhu68rep以外的異源性rep蛋白質，例如但不限於，AAV1 rep蛋白質、AAV2 rep蛋白質、AAV3 rep蛋白質、AAV4 rep蛋白質、AAV5 rep蛋白質、AAV6 rep蛋白質、AAV7 rep蛋白質、AAV8 rep蛋白質；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78及rep40/52；或其片段；或另外的來源。此等AAVhu68或突變體AAV衣殼序列之任一者可於外源調節控制序列的控制下引導其在生產細胞中表現。
在一具體實施例，細胞在合適的細胞培養物(例如，HEK 293)細胞中製造。本文所述的基因療法載體的製備方法包括本領域眾所周知的方法，諸如生產用於生產基因療法載體的質體DNA、載體的生產、及載體的純化。於一些具體實施例，基因療法載體為AAV載體，且所產生的質體為編碼AAV基因體及感興趣之基因的AAV順式質體、包含AAV rep及cap基因的AAV反式質體、及腺病毒輔助質體。載體產生製程可包括諸如細胞培養之起始、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、轉染後培養基交換為無血清培養基、及含有載體的細胞及培養基的收取的方法步驟。所收取的含有載體的細胞和培養基在本文中稱為粗細胞收取物。於另一系統中，藉由以基於桿狀病毒的載體感染而將基因療法載體導入昆蟲細胞中。此等生產系統的綜述，一般參見例如，Zhang et al., 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production, Human Gene Therapy 20:922-929，其各自之內容藉由引用而完整併入本文。製造及使用此等之方法及其它AAV生產系統亦描述於下列U.S.專利，其各自之內容藉由引用而完整併入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；及7,439,065。
於某些具體實施例，rAAV.hGALC之製造方法涉及以質體DNA短暫轉染HEK293細胞。藉由在PALL iCELLis生物反應器中經PEI調控之三重轉染HEK293細胞生產單批或多批次。隨後，藉由澄清、TFF、親和性層析及陰離子交換層析，在可能的一次性、封閉式生物處理系統中純化所收穫的AAV材料。
粗細胞收取物之後可經歷下列方法步驟，諸如載體收取物的濃縮、載體收取物的透析過濾、載體收取物的微流體化、載體收取物的核酸酶消化、微流體化中間體的過濾、藉由層析法的粗純化、藉由超速離心的粗純化、藉由切向流過濾的緩衝液交換、及/或調配及過濾以製備大量載體。
於高鹽濃度下進行兩步驟親和性層析純化，然後進行陰離子交換樹脂層析純化，用以純化載體藥物產物並移除空的衣殼。此等方法更詳細描述於2016年12月9日申請的國際專利申請案No. PCT/US2016/065970，以及其優先權案2016年4月13日申請的US專利申請案No. 62/322,071及2015年12月11日申請的US專利申請案No. 62/226,357，標題為「Scalable Purification Method for AAV9」，其藉由引用而併入本文。關於AAV8的純化方法，國際專利申請號PCT/US2016/065976(2016年12月9日申請)及其優先權文件美國專利申請號62/322,098(2016年4月13日申請)及62/266,341(2015年12月11日申請)，及關於rh10，國際專利申請號PCT/US16/66013(2016年12月9日申請)及其優先權文件，美國專利申請號62/322,055(2016年4月13日申請)及62/266,347，名稱為“Scalable Purification Method for AAVrh10”，同樣申請於2015年12月11日，及關於AAV1，國際專利申請案No. PCT/US2016/065974(2016年12月9日申請)及其優先權文件美國專利申請號62/322,083(2016年4月13日申請)及62/26,351，關於“Scalable Purification Method for AAV1”(2015年12月11日申請)，其等全部藉由引用併入本文中。
為計算空的(empty)及完整的(full)顆粒含量，將所選樣品(例如，在本文的實施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC的#=顆粒的#)的VP3帶(band)體積係對裝載的GC顆粒作圖。所生成的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試物品峰的帶體積中的顆粒數量。然後將每20µL裝載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒對基因體拷貝的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL得到空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL並x100得到空的顆粒的百分比。
一般而言，用於測定空衣殼及具有包裝的基因體之AAV載體顆粒的方法為技術領域中已知。參見，例如，Grimm et al.,Gene Therapy (1999) 6：1322-1330；Sommer et al., Molec.Ther.(2003) 7：122-128。為了測試變性的衣殼，該方法包括對處理過的AAV種系進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該電泳由能夠分離三種衣殼蛋白質的任何凝膠組成，例如，在緩衝液中含有3-8%的Tris-乙酸鹽的梯度凝膠，然後運行凝膠直到分離樣品材料，然後將凝膠印漬到尼龍或硝化纖維素膜上，較佳為尼龍。然後將抗AAV衣殼抗體使用作為結合至變性的衣殼蛋白質的一級抗體，較佳為抗AAV衣殼單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al.,J. Virol .(2000) 74：9281-9293)。然後使用二級抗體，該二級抗體與一級抗體結合且含有用於檢測與一級抗體的結合的手段，更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。使用檢測結合的方法，以半定量地確定一級抗體和二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可從管柱流份中取樣品，並於含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE裝載緩衝液(loading buffer)中加熱，將衣殼蛋白質於預鑄的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)進行解析。可根據製造商的說明使用SilverXpress(Invitrogen，CA)或其它適合的染色方法(即SYPRO ruby或考馬斯染色)進行銀染色。於一具體實施例，可藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱流份中的AAV載體基因體(vg)的濃度。稀釋樣品並以DNase I(或其它合適的核酸酶)消化以移除外源的DNA。核酸酶失活後，使用引子及對引子之間的DNA序列特異的TaqMan™螢光探針進一步稀釋及擴增樣品。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每個樣品達到定義的螢光水準所需的循環數(閾值循環，Ct)。使用含有與AAV載體中含的序列相同的質體DNA，以於Q-PCR反應中生成標準曲線。從樣品獲得的循環閾值(Ct)數值係用於藉由將其標準化為質體標準曲線的Ct值來確定載體基因體力價(titer)。亦可使用基於數位PCR的終點分析。
於一態樣，使用優化的q-PCR方法，其利用廣效絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可由Qiagen購得)。更具體而言，優化的qPCR基因體力價分析除了於DNase I消化後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後進行熱失活之外，與標準分析相似。適合地，以與樣品量相等的量的蛋白酶K緩衝液稀釋樣品。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可於0.1mg/mL至約1mg/mL之間變化。該處理步驟通常於約55℃下進行約15分鐘，但可於較低溫度(例如約37℃至約50℃)下進行較長時間(例如約20分鐘至約30分鐘)；或者於較高的溫度(例如，高至約60°C)下進行較短的時間(例如，約5至10分鐘)。相似地，熱失活通常於約95℃下約15分鐘，但溫度可降低(例如約70至約90℃)且時間延長(例如約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如1000倍)，並如標準分析中所述進行TaqMan分析。
另外或替代地，可使用液滴數位PCR(droplet digital PCR，ddPCR)。例如，已描述一種藉由ddPCR確定單股及自互補的AAV載體基因體力價的方法。參見，例如，M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods. 2014 Apr;25(2)：115-25. doi：10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。
簡而言之，用於從基因體缺陷的AAVhu68中間體中分離具有包裝的基因體序列的rAAVhu68顆粒的方法，涉及對包含重組AAVhu68病毒顆粒和AAVhu689衣殼中間體的懸浮液進行快速高效液相層析，其中將AAVhu68病毒顆粒與AAVhu68中間體結合至一種經平衡於pH 10.2的強陰離子交換樹脂，並經過鹽梯度而同時以約260及約280的紫外線吸光度來監測洗提物。儘管對於rAAVhu68未到最佳，但pH可於約10.0至10.4的範圍內。於此方法中，從A260/A280之比達到反曲點時洗提的流份中收集AAVhu68完整的衣殼。於一例中，對於親和性層析步驟，可將經透析過濾的產物應用於有效捕捉AAV2/hu68血清型的Capture SelectTM Poros-AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留的細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。
組成物及用途 本文提供之組成物含有至少一種rAAV.hGALC種系(例如，rAAVhu68種系或突變體rAAV種系)及可選擇的載劑(carrier)、賦形劑及/或防腐劑。rAAV種系係指多個相同的rAAV載體，例如，如於下文討論的濃度及劑量單位中所述的量。儘管由於去醯胺作用，其衣殼蛋白質具有異質性，但是種系中的rAAV被期待共享相同的載體基因體。種系可包括具有衣殼之rAAV，該衣殼具有例如所選擇的AAV衣殼蛋白質及所選擇的生產系統的特徵性的異質去醯胺樣式。可從單個生產系統生產此種系，亦可從生產系統的多個運行中合併種系。可以選擇各種生產系統，包括但不限於本文所述彼等。
如本文所使用，「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒液、包衣、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝液、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此種用於醫藥活性物質的介質及藥劑的用途為本技術領域中所熟知。補充的活性成分亦可併入此組成物中。用語「醫藥上可接受」係指當投予於宿主時不會產生過敏或類似的不良反應的分子實體及組成物。遞送媒液諸如微脂體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是，可調配rAAV載體遞送的載體基因體用於遞送被包封於脂質粒子、微脂體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等。
於一具體實施例，組成物包括適於遞送至對象之最終調配物，例如，為緩衝至生理上可相容的pH和鹽濃度的水性液體懸浮液。可選擇地，調配物中存在一種或多種界面活性劑。於另一具體實施例，可將組成物作為濃縮物運輸，將其稀釋以投予至對象。於其它具體實施例，組成物可被凍乾並在投予時還原。
適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒的非離子界面活性劑。於一具體實施例，選擇終止於一級羥基的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如，諸如Pluronic® F68 [BASF]，亦稱為泊洛沙姆188(Poloxamer 188)，其具有中性pH，平均分子量為8400。可選擇其它界面活性劑和其它泊洛沙姆，即由一個聚氧伸丙基(聚(環氧丙烷))之中央疏水鏈及兩側的兩個聚氧伸乙基(聚(環氧乙烷))之親水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(Macrogol-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚(polyoxy 10 oleyl ether)、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一具體實施例，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧伸丙基核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧伸乙基含量百分比。於一具體實施例，選擇泊洛沙姆188。界面活性劑可於懸浮液中以高至約0.0005%至約0.001%之量存在。
以足夠的量投予載體以轉染細胞並提供基因轉移及表現之足夠的水準，以提供治療益處，而沒有不適當的副作用，或具有醫學上可接受的生理作用，此可由醫學領域中具有通常知識者確定。習用及醫藥上可接受的投予途徑包括但不限於直接遞送至所欲器官(例如，肝臟(可選擇地經由肝動脈)、肺臟、心臟、眼、腎臟)、口服、吸入、鼻內、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、及其它非經口途徑之投予。若需要，可合併投予途徑。
病毒載體的劑量主要取決於諸如所治療的病況、患者的年齡、體重、及健康狀況的因子，因此於患者間可能會變化。例如，病毒載體之治療上有效的人類劑量一般於範圍為約25至約1000微升至約100mL之溶液，含有濃度為約1x109 至1x1016 基因體病毒載體。調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的重組載體的治療應用而變化。可監測轉基因產物之表現水平以確定產生病毒載體的劑量頻率，較佳為包含小基因的AAV載體。可選擇地，類似於用於治療目的所描述的劑量方案可被用於使用本發明組成物之免疫。
可在劑量單位中調配複製缺陷型病毒組成物以包含一定量之複製缺陷型病毒，即範圍在約1.0x109 GC至約1.0x1016 GC(治療平均體重70公斤的受試者)，包括該範圍內的所有整數或分數量，並對於人類患者較佳為1.0x1012 GC至4.0x1014 GC。於一些具體實施例，組成物被調配成含有1.4x1013 至4x1014 GC之複製缺陷病毒。於一些具體實施例，組成物被調配成含有4x1013 至4x1014 GC之複製缺陷病毒。於一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x109 、2x109 、3x109 、4x109 、5x109 、6x109 、7x109 、8x109 、或9x109 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1010 、2x1010 、3x1010 、4x1010 、5x1010 、6x1010 、7x1010 、8x1010 、或9x1010 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1011 、2x1011 、3x1011 、4x1011 、5x1011 、6x1011 、7x1011 、8x1011 、或9x1011 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1012 、2x1012 、3x1012 、4x1012 、5x1012 、6x1012 、7x1012 、8x1012 、或9x1012 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1013 、2x1013 、3x1013 、4x1013 、5x1013 、6x1013 、7x1013 、8x1013 、或9x1013 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1014 、2x1014 、3x1014 、4x1014 、5x1014 、6x1014 、7x1014 、8x1014 、或9x1014 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x1015 、2x1015 、3x1015 、4x1015 、5x1015 、6x1015 、7x1015 、8x1015 、或9x1015 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一具體實施例，對於人類應用，劑量範圍可為每劑1x1010 至約1x1012 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一具體實施例，對於人類應用，劑量範圍可為每劑1.4x1013 至約4x1014 GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
此等上述劑量能以各種體積的載劑、賦形劑或緩衝液調配物投予，範圍自約25至約1000微升，或更大體積，包括此範圍內所有數量，取決於欲治療區域的大小、使用的病毒力價、投予途徑、及該方法之所欲效果。於一具體實施例，載劑、賦形劑或緩衝液之體積為至少約25µL。於一具體實施例，體積為約50µL。於另一具體實施例，體積為約75µL。於另一具體實施例，體積為約100µL。於另一具體實施例，體積為約125µL。於另一具體實施例，體積為約150µL。於另一具體實施例，體積為約175µL。於又另一具體實施例中，體積為約200µL。於另一具體實施例，體積為約225µL。於又另一具體實施例中，體積為約250µL。於又另一具體實施例中，體積為約275µL。於又另一具體實施例中，體積為約300µL。於又另一具體實施例中，體積為約325µL。於另一具體實施例，體積為約350µL。於另一具體實施例，體積為約375µL。於另一具體實施例，體積為約400µL。於另一具體實施例，體積為約450µL。於另一具體實施例，體積為約500µL。於另一具體實施例，體積為約550µL。於另一具體實施例，體積為約600µL。於另一具體實施例，體積為約650µL。於另一具體實施例，體積為約700µL。於另一具體實施例，體積為約700至1000µL之間。
rAAV.hGALC之治療有效的鞘內/腦池內劑量範圍約為1x1011 至7.0x1014 GC(固定劑量(flat dose))-相當於108 至7x1011 GC/g患者腦質量。或者，下列治療有效之固定劑量可投予至所指定年齡群之患者： ●    新生兒：約1x1011 至約3x1014 GC； ●    3-9月齡：約6x1012 至約3x1014 GC； ●    9月齡-6歲：約6x1012 至約3x1014 GC； ●    3-6歲：約1.2x1013 至約6x1014 GC； ●    6-12歲：約1.2x1013 至約6x1014 GC； ●    12+歲：約1.4x1013 至約7.0x1014 GC； ●    18+歲(成年)：約1.4x1013 至約7.0x1014 GC。
於某些具體實施例，劑量可為範圍約1x109 GC/g腦質量至約1x1012 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約3x1010 GC/g腦質量至約3x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約1.70x1010 GC/g腦質量至約5x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約5x1010 GC/g腦質量至約5x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約5x1010 GC/g腦質量至約1.85x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約1.70x1010 GC/g腦質量至約1.70x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約5.00x1010 GC/g腦質量至約1.70x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約1.70x1011 GC/g腦質量至約5x1011 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約5x1010 GC/g腦質量至約1012 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為範圍約1010 GC/g腦質量至約1012 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為至少1.70x1010 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為至少5x1010 GC/g腦質量。於某些具體實施例，劑量可為至少1.70x1011 GC/g腦質量。
對於嬰幼兒與青少年/成年之間的比例，在某些情況下，對於4至12月齡之嬰兒，腦質量估計約為600g至約800 g；對於9月齡至18月齡約800 g至約1000 g，對於18月齡至3歲約1000 g至約1100 g；對於青少年或成年人為1100 g至約1300 g，或對於成年人為約1300 g。
於一具體實施例，病毒構築體能以至少約1x109 GC至約1x1015 、或約1x1011 至5x1013 GC之劑量被遞送。遞送此等劑量之適當體積及濃度可由本技術領域中具有通常知識者決定。例如，可選擇約1µL至150mL的體積，於成年人選擇較大體積。於某些具體實施例，遞送的體積為約2.0 ml、約2.5 mL、約3.0 ml、約3.5 mL、約4.0 ml、約4.5 mL、約5.0 ml、約5.5 mL、約6.0 ml、約6.5 mL、約7.0 ml、約7.5 mL、約8.0 ml、約8.5 mL、約9.0 ml、約9.5 mL、約10.0 mL、約10.5 ml、約11.0 mL、約11.5 ml、約12.0 mL、約12.5 ml、約13.0 mL、約13.5 ml、約14.0 mL、約14.5 mL、或約15.0 mL。典型地，適合於新生兒的體積為約0.5mL至約10mL，於較大嬰兒，可選擇約0.5mL至約15mL。於學步兒，可選擇約0.5mL至約20mL的體積。於兒童，可選擇多至約30mL的體積。於前青少年及青少年，可選擇多至約50mL的體積。於某些具體實施例，患者接受鞘內投予的體積為約2 mL至約4 mL、約3 mL至約5 mL、約4 mL至約6 mL、約5 mL至約7 mL、約6 mL至約8 mL、約7 mL至約9 mL、或約8 mL至約10 mL。於再其它具體實施例，患者可接受鞘內投予，以約5mL至約15mL的體積，或約7.5mL至約10mL。於某些具體實施例，鞘內投予的體積為約5.0 mL。於某些具體實施例，鞘內投予的體積為約5.6 mL。可決定其它適合的體積及劑量。調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的重組載體的治療應用而變化。
根據已公開方法，可將上述重組載體遞送至宿主細胞。可投予rAAV至人類或非人類的哺乳動物患者，其較佳懸浮於生理學上可相容的載劑。於某些具體實施例，為了投予至人類患者，將rAAV適合地懸浮於水性溶液，該水性溶液含有鹽水、界面活性劑、及生理上可相容的鹽或鹽之混合物。適合地，調整此調配物至生理上可接受的pH，例如，範圍為pH6至9、或pH6.5至7.5、pH7.0至7.7、或pH7.2至7.8。由於腦脊髓液的pH為約7.28至約7.32，對於鞘內遞送，可能需要在此範圍內的pH；而對於靜脈內遞送，可能需要約6.8至約7.2的pH。然而，可選擇最廣範圍及此等子範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。
於另一具體實施例，組成物包括載劑、稀釋劑、賦形劑及/或佐劑。鑑於對所針對的適應症轉移病毒，本技術領域中具有通常知識者可容易地選擇適合的載劑。例如，一適合的載劑包括鹽水，其能以許多種緩衝溶液來調配(例如，磷酸鹽緩衝鹽水)。其它示例性載劑包括無菌的鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、聚葡萄醣、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油、及水。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附到輸注管上但不干擾rAAV活體內結合活性的成分。
於一例，調配物可含有例如，緩衝食鹽溶液，其包含於水中的氯化鈉、碳酸氫鈉、右旋糖、硫酸鎂(例如硫酸鎂・7H2 O)、氯化鉀、氯化鈣(例如氯化鈣・2H2 O)、磷酸氫二鈉及其等之混合物中的一或多種。適當地，對於鞘內遞送，容積滲透壓濃度在與腦脊髓液相容的範圍內(例如，約275至約290)；參見例如，emedicine.medscape.com/article/2093316-overview。可選擇地，對於鞘內遞送，可使用市售稀釋劑作為懸浮劑，或與另一種懸浮劑及其它可選擇的賦形劑組合使用。參見，例如，Elliotts B® solution [Lukare Medical]。
於某些具體實施例，調配物可含有不包含碳酸氫鈉的緩衝食鹽水溶液。此種調配物可含有於水中包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其混合物之一或多者的緩衝食鹽水溶液，諸如Harvard’s緩衝液。水溶液可進一步含有Kolliphor® P188，一種泊洛沙姆，其由BASF商業販售，之前以商標名Lutrol®F68出售。水溶液可具有7.2之pH。
於其它具體實施例，調配緩衝液可含有一或多種之滲透增強劑。適合的滲透增強劑之例可包括，例如，甘露醇、甘膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、去氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、月桂硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚或EDTA。
可選擇地，除了rAAV及載劑之外，本發明之組成物可含有其它習用的醫藥成分，諸如防腐劑、或化學穩定劑。適合的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯(paraben)類、乙基香草醛、甘油、苯酚及對氯苯酚。適合的化學穩定劑包括明膠及白蛋白。
依據本發明之組成物可包含醫藥上可接受的載劑，如上定義。適合地，本文所述組成物包含有效量之一或多種AAV，懸浮於醫藥上適合的載劑及/或與適合的賦形劑混合而被設計用於經由注射、滲透泵、鞘內導管、或以另外的裝置或途徑遞送至對象。於一例中，組成物被調配用於鞘內遞送。
如本文所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指藥物經由注射至椎管的投予途徑，更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊髓液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內(包括腦室內(ICV))、枕骨下/腦池內、及/或C1-2穿刺。例如，可藉由腰椎穿刺方法導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。於另一例，可注射至腦大池。
如本文所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入腦大池小腦延髓之腦脊髓液中的投予途徑，更具體而言係經由枕骨下穿刺或藉由直接注射至腦大池或經由永久定位的管子。於某些具體實施例，使用用於CNS靶向投予的Ommaya儲庫遞送組成物。
如本文所使用，術語電腦斷層造影(CT)係指放射線攝影術，其中藉由電腦自沿軸線製成的一系列平面截面影像而構築身體結構的三維影像。
本文所提供的rAAV.GALC載體及組成物可用於矯正與GALC酶活性不足水平相關症狀。於某些具體實施例，本文所提供的rAAV.GALC載體及組成物可用於患者中治療由GALC的不足所引起的周圍神經功能障礙，可用於治療由GALC不足所引起的呼吸衰竭及/或運動功能喪失，可用於治療克拉培氏病，及/或可用於治療與克拉培氏病相關症狀。
於某些具體實施例，將含有效量rAAV.hGALC之組成物投予小於6月齡具有早期嬰兒克拉培氏病(EIKD)的患者。於某些具體實施例，該患者小於6月齡且具有小於EIKD嚴重性之GALC酶缺乏。
於某些具體實施例，將含有效量rAAV.hGALC之組成物投予大於6月齡(例如，7月齡至約12月齡)具有晚期嬰兒克拉培氏病(LIKD)的患者。於某些具體實施例，該患者大於6月齡，或約7月齡至12月齡，且具有小於LIKD嚴重性之GALC酶缺乏。
於某些具體實施例，患者大於1歲(例如，13月齡至10歲)且具有幼年克拉培氏病(JKD)。於某些具體實施例，該患者為13月齡至10歲且具有小於JKD嚴重性之GALC酶缺乏。
於某些具體實施例，該患者超過10歲(例如，超過10歲至12歲，或10歲至18歲或更年長)，且具有青少年或成年發作型克拉培氏病。
於任何上述具體實施例，可投予本文所提供之rAAV.hGALC療法作為造血幹細胞替代療法、骨髓移植(BMT)及/或基質減量療法(Substrate reduction therapy，SRT)之協同療法。於某些具體實施例，在rAAV.hGALC療法(例如，EIKD)之後進行協同療法，例如HSCT或BMT或酵素替代療法。於某些具體實施例，該療法在投予載體後(包括治療後1週內)產生快速的酵素製造。
於某些具體實施例，酵素替代療法涉及投予SEQ ID NO：10的人類GALC蛋白質。於其它具體實施例，其它hGALC蛋白質變體(例如，如本文所鑑定之規範序列或工程化蛋白質)可用於酵素替代療法。酵素替代療法中可使用不同的hGALC蛋白質組合。於此種具體實施例中，可使用適當製造系統在活體外製造hGALC蛋白質，參見，例如，C. Lee et al, 2005/10/01, Enzyme replacement therapy results in substantial improvements in early clinical phenotype in a mouse model of globoid cell leukodystrophy, FASEB journal, The FASEB Journal 19(11)：1549-51, October 2005]。可調配hGALC蛋白質用於以任何適當途徑遞送(例如，懸浮於生理相容性生理鹽水溶液中)，包括但不限於靜脈內、腹膜內或鞘內途徑。適當劑量可在範圍為1 mg/kg至20 mg/kg，或5 mg/kg至10 mg/kg，且依據需要可每週一次或更多或更少的頻率重新投予(例如，每隔一天一次、每兩週一次等等)。使用CSF投予hAAVhu68.GALC載體，在腦及血清中之GALC水平可為超生理學的、沒有毒性且可觀察到CNS和PNS中神經運動功能和髓鞘化的改善。當在出生後的條件動物模型中進行新生兒CSF投予後再進行骨髓移植時，可在沒有明顯體徵的情況下延長存活期(例如，延長至＞300天)。在症狀發生前的克拉培氏病患者中，單一腦大池注射AAV.cGALC可提供表型矯正、存活率增加、神經傳導正常化及/或改善腦MRI。
於某些具體實施例，提供聯合療法或療程，涉及以rAAVhu68.hGALC及BMT治療患者。於某些具體實施例，在HSCT或BMT(例如，LIKD或JKD)之後提供rAAV.hGALC療法。然而，於某些具體實施例，rAAV.hGALC提供不需要HSCT或BMT之足夠的GALC水平。於某些具體實施例，基因療法治療先於BMT的使用。於某些具體實施例，此聯合療法在骨骼肌(例如，股四頭肌、肺臟、橫膈膜、心臟、肝臟、腎臟)或周圍神經系統或中樞神經系統的某些細胞中提供了增強的轉基因表現。於其它具體實施例，BMT可先於使用本文所述的基因療法治療。
治療的目標是藉由基於rAAV的CNS和PNS指導的基因療法功能性地替代患者不足的GALC。對於EIKD或LIKD患者的療效可藉由評估EIKD或LIKD的一或多個症狀的改善來衡量：哭鬧及煩躁不安、痙攣、拳頭彎曲、失去笑容、頭部控制不佳及進食困難；精神和運動功能惡化，肌肉張力過高或肌肉張力過低、癲癇、失明、失聰及存活率增加(對於EIKD，未經治療通常會在2歲前死亡；對於LIKD，存活期可能會增加到3-5歲)。此外，對於此等及其它克拉培氏病患者，可藉由以下方法評估治療效果：可藉由影像學檢查(例如磁振造影(MRI))監測影響周圍神經及CNS白質(深腦白質和齒狀(dentate)/小腦白質)的脫髓鞘化的減少及脫髓鞘化；異常神經傳導速度(NCV)及/或聽性腦幹誘發電位(brainstem auditory evoked potentials，BAEPs)的降低；腦脊髓液及/或血漿中所觀察到的GALC的水平增加；及/或鞘胺醇半乳糖苷的蓄積減少。
提供包含重組腺相關病毒(rAAV)之組成物，其包含靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼，且在其中已包裝含半乳糖基神經醯胺酶編碼序列的載體基因體，該編碼序列在指導蛋白質表現之調控序列的控制下編碼具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，該載體基因體進一步包含用於包裝載體基因體至AAV衣殼中所需之AAV反向末端重複。
於某些具體實施例，提供有用於治療克拉培氏病之組成物，其包含具有CB7.CI.hGALC.rBG之載體基因體的rAAVhu68。在一具體實施例，載體基因體具有(SEQ ID NO：19)的編碼序列。
於某些具體實施例，提供一種組成物在用於矯正由GALC不足所引起之周圍神經功能障礙的方法及/或治療由GALC不足所引起的呼吸衰竭和運動功能喪失的方法中的用途。於某些具體實施例，該方法包含投予含重組腺相關病毒(rAAV)種系之組成物，該重組腺相關病毒(rAAV)包含：(a)靶定中樞神經系統中之細胞的AAV衣殼且其具有(b)之載體基因體包裝於其中；及(b)包含在指導蛋白質表現之調控序列的控制下編碼具有SEQ ID NO：10之胺基酸序列的成熟半乳糖基神經醯胺酶蛋白質的半乳糖基神經醯胺酶編碼序列之載體基因體，其中該載體基因體進一步包含用於包裝載體基因體於AAV衣殼中所需之AAV反向末端重複。
於某些具體實施例，本文所提供之rAAV.hGALC組成物被鞘內遞送用於治療具有早期嬰兒克拉培氏病之患者。於某些具體實施例，本文所提供之組成物被鞘內遞送用於治療具有晚期嬰兒克拉培氏病(LIKD)之患者。於某些具體實施例，本文所提供之rAAV.hGALC組成物被鞘內遞送用於治療具有幼年克拉培氏病(JKD)之患者。於某些具體實施例，本文所提供之rAAV.hGALC組成物被鞘內遞送用於治療具有青少年或成年發作型克拉培氏病之患者。於某些具體實施例，投予rAAV.hGALC組成物作為造血幹細胞移植(HSCT)、骨髓移植及/或基質減量療法之協同療法。於某些具體實施例，rAAV.hGALC組成物以單一劑量藉由電腦斷層掃描攝影-(CT-)導引枕骨下注射投予至腦大池(intra-cisterna magna)。
投予rAAV.hGALC可穩定化疾病進展，如測量存活率、防止可能支持獲得新里程碑的發展和動作里程碑的喪失、癲癇的發作和頻率。因此，在某些具體實施例，提供用於監測治療之方法，其中在例如，30日、90日及/或6個月測量端點，然後在例如兩年的短期追蹤期內，每6個月測量端點。於某些具體實施例，在長期延期期間，測量頻率降低到每12個月一次。考慮到目標族群中疾病的嚴重性，對象可藉由入選已達成運動技能，發展並隨後喪失了其他運動里程碑，或者尚未顯示出運動里程碑發展的跡象。因此，評估會跟蹤所有里程碑的隨年齡達成和隨年齡喪失。於某些具體實施例，里程碑包括，例如，無支撐坐立、手膝爬行、輔助下站立、輔助下行走、獨自站立及/或獨自行走中的一或多者。於某些具體實施例，治療導致癲癇發作活動延遲及/或癲癇發作頻率降低。
於某些具體實施例，監測對象治療的方法係使用臨床量表來量化在適應行為、認知、語言、運動功能、及/或健康相關生活品質的發展與變化的治療效果。量表及領域包括，例如，貝萊嬰幼兒與學步兒發展量表(Bayley Scales of Infant and Toddler Development)(評估五個領域的嬰幼兒發展：認知、語言、運動、社會情感及適應行為)、文蘭適應行為量表(Vineland Adaptive Behavior Scales)(第三版)(從五個領域評估從出生到成年(0-90歲)的適應行為：溝通、日常生活技能、社交、運動技能和適應不良行為)、皮巴迪動作發展量表(Peabody Developmental Motor Scales)-第二版(測量從出生到五歲兒童的相關運動功能；評估集中在六個領域：反射、靜止、運動、物體操縱、抓握和視覺運動整合)、嬰幼兒學步兒生活品質問卷(Infant Toddler Quality of Life Questionnaire，ITQOL)(針對與健康有關的生活質量的父母報告量度，專為2個月以下嬰兒至5歲幼兒設計)及穆林早期學習量表(Mullen Scales of Early Learning)(評估在68月齡以下的嬰兒及幼兒的語言、運動和感知能力)。於某些具體實施例，藉由評估髓鞘化的變化、髓鞘化相關的功能性結果及潛在疾病生物標記，來監測或評估治療效果。於某些具體實施例，對象治療後中樞和周圍脫髓鞘化進展緩慢或停止。可藉由白質區域的擴散張量磁振造影(diffusion-tensor magnetic resonance imaging，DT-MRI)向異性測量和皮質脊髓運動徑(corticospinal motors tracts)之纖維追踪來追踪中央脫髓鞘鞘化，其中變化為疾病狀態和進展的指標。可藉由對運動神經(深腓骨、脛骨和尺骨神經)和感覺神經(腓腸神經和正中神經)的神經傳導速度(NCV)研究間接測量周圍脫髓鞘鞘化，以監測象徵生物活性髓磷脂變化的波動(即F波和遠端潛伏期、振幅或反應存在或不存在)。
於某些具體實施例，提供一種在rAAV.hGALC投予後監測治療的方法，其中對於那些在治療之前沒有發展出顯著視力喪失的對象，評估該對象視力喪失的延遲或未有視力喪失。因此，視覺誘發電位(VEP)的測量可客觀地測量對視覺刺激的反應，作為中樞視力損害或喪失的指標。於某些具體實施例，使用例如腦幹聽覺誘發反應(BAER)測試，監測對象在治療後的聽力損失。於某些具體實施例，提供一種在rAAV.hGALC投予後監測治療的方法，其中測量對象的鞘胺醇半乳糖苷水平。
應注意的是，術語「一(a或an)」係指一個(種)或多個(種)。如此，術語「一」(a或an)、「一或以上」及「至少一個(種)」於本文中可互換使用。
詞語「含」、「包含」、「涵蓋」、「含有」及「包括」應包含性而非排他性地解釋。詞語「由…組成」(consist、consisting)及其變體被排他性地而不是包含性地解釋。儘管說明書中的多個具體實施例使用「包含」語句來呈現，但在其它情況下，相關具體實施例亦意圖使用「由…組成」或「實質上由…組成」語句來解釋和描述。
如本文所使用，除非另有指明，術語「約」意指與給定參考值間有10%(±10%)的變化。
如本文所使用，「疾病」、「失調」及「症狀」可互換使用，以指示對象的不正常狀態。
術語「表現」在本文中以其最廣泛的含義使用，且包含RNA的產生或RNA及蛋白質的產生。關於RNA，術語「表現」或「轉譯」特別涉及肽或蛋白質的產生。表現可為一時的或可為穩定的。
如本文所使用，「表現匣」係指包含編碼序列、啟動子的核酸分子，且可包括其之其它調節序列。於某些具體實施例，載體基因體可含有二或以上個表現匣。於其它具體實施例，術語「轉基因」可與「表現匣」交替使用。通常，此類用於產生病毒載體的表現匣包含本文所述基因產物的編碼序列，其兩側是病毒基因體的包裝訊號及其它表現控制序列，諸如彼等本文所述者。
縮寫「sc」係指自我互補(self-complementary)。「自我互補AAV」係指其中由重組AAV核酸序列攜帶的編碼區被設計形成分子內雙股DNA模板的構築體。當感染時，並非等待細胞調控的第二股合成，而是scAAV的兩個互補半部將結合形成準備立即複製和轉錄的一個雙股DNA(dsDNA)單元。參見，例如，D M McCartyet al , “Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy,(2001年8月), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254。自我互補AAV描述於例如美國專利號6,596,535；7,125,717；及7,456,683，其各藉由引用整體併入本文。
當使用於所提及之蛋白質或核酸時，術語「異源的」表示該蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間沒有相同關係的兩個或更多個序列或子序列。例如，核酸通常是重組產生的，具有二或多個來自無關基因的序列，其排列以產生新的功能性核酸。例如，於一具體實施例，該核酸具有來自一個基因的啟動子，其被安排以引導來自不同基因的編碼序列的表現。如此，參照編碼序列，該啟動子為異源。
「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」係指合成或人工病毒顆粒，其中含有感興趣基因的表現匣被包裝在病毒衣殼或套膜中，亦被包裝在病毒衣殼內或套膜內的任何病毒基因體序列是複製缺陷的；即，它們無法產生子代病毒粒子但保留感染目標細胞的能力。於一具體實施例，病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酶的基因(該基因體可被工程化為「無膽的(gutless)」-僅含有感興趣的基因，側邊為增幅和包裝人工基因體所需的訊號)，但可能在生產過程中提供此等基因。因此，由於除非存在複製所需的病毒的酶，否則後代病毒顆粒的複製和感染不會發生，而被認為可安全地用於基因療法。
在許多情況下，rAAV顆粒被稱為DNase抗性。然而，除了此核酸內切酶(DNase)之外，其它核酸內切酶及核酸外切酶亦可用於本文所述的純化步驟，以除去污染的核酸。可選擇此類核酸酶以降解單股DNA及/或雙股DNA和RNA。這些步驟可包含單一核酸酶，或針對不同目標之核酸酶的混合物，且可為核酸內切酶或核酸外切酶。
術語「核酸酶抗性」表示AAV衣殼已完全組裝在表現匣周圍，其被設計用於將基因遞送至宿主細胞並保護這些經包裝的基因體序列在核酸酶培養步驟期間免於降解(消化)，核酸酶培養步驟被設計用於除去可能存在於生產過程中的污染的核酸。
如本文所使用，「有效量」係指rAAV組成物的量，其在目標細胞中遞送及表現一定量之來自載體基因體的基因產物。可基於動物模型而不是人類患者來確定有效量。本文描述適當的鼠類模型之例。
除非於本說明書中另有定義，否則本文所用的技術及科學術語具有與本領域中具有通常知識者和參照公開文本所通常理解的相同含義，公開文本為本領域中具有通常知識者提供了本申請案中所使用之許多術語的一般指引。
實施例 下列實施例僅為說明性的且未意圖用於限制本發明。
縮寫 說明
A 吸光度
aa 胺基酸
AAV 腺相關病毒
AAVhu68 腺相關病毒血清型hu68
Ad5 腺病毒血清型5
AE 不良事件
AEX 陰離子交換
AmpR 安比西林抗性(基因)
ANOVA 變異數分析
AUC 分析型超高速離心
BA 雞β-肌動蛋白啟動子
BAER 腦幹聽覺誘發反應
BBB 血腦障壁
BCA 二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid)
BDS 大批原料藥(Bulk Drug Substance)
BMCB 細菌主細胞庫(Bacterial Master Cell Bank)
bp 鹼基對
BRF 批次紀錄表(Batch Record Form)
BSA 牛血清白蛋白
BSC 生物安全櫃(Biological Safety Cabinet)
BWCB 細菌工作細胞庫(Bacterial Working Cell Bank)
cap 衣殼(基因)
CBC 全血細胞計數
CBER 生物製品評估與研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research)
CFR 聯邦法規(Code of Federal Regulations)
CFU 菌落形成單位(Colony Forming Units)
CI 嵌合內含子
CMC 化學製造與控制
CMO 受託製造機構
CMV IE 細胞巨大病毒立即早期增強子
CNS 中樞神經系統
COA 檢驗證明書(Certificate of Analysis)
CRL 查爾斯河實驗室
CRO 受託研究機構(Contract Research Organization)
CSF 腦脊髓液
CT 電腦斷層掃描攝影
CTL 胞毒型T淋巴球
ddPCR 微滴數位化聚合酶連鎖反應(Droplet Digital Polymerase Chain Reaction)
DLS 動態光散射
DMEM 達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
DMF 原料藥主檔案(Drug Master File)
DNA 去氧核糖核酸
DO 溶氧
DP 藥品
DRG 背根神經節
DS 原料藥(Drug Substance)
DSMB 資料安全監視會
E1A 早期區域1A(基因)
ECG 心電圖
EDTA 伸乙二胺四乙酸
ELISA 酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
ELISpot 酶聯免疫斑點法(Enzyme-Linked Immunospot)
ERT 酵素替代療法
EU 內毒素單位
F 雌性
F/U 追蹤(Follow-Up)
FBS 胎牛血清
FDA 食品藥物管理局
FDP 最終藥品
FFB 最終調配緩衝液
FIH 首次於人體執行之藥物臨床試驗(First-in-Human)
GALC 半乳糖基神經醯胺酶(基因，人類)
Galc 半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)
GALC 半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)
GC 基因體拷貝
GLP 優良實驗室操作規範
GMP 優良藥品製造規範
HCDNA 宿主細胞去氧核糖核酸
HCP 宿主細胞蛋白質
HEK293 人類胚腎293
ICH 國際藥品法規協和會(International Conference on Harmonization)
ICM 腦大池內
ICV 腦室內
IDS 己醛醣酸鹽硫酸脂酶(Iduronate-2-Sulfatase)
IFN-γ 干擾素γ
IT 鞘內
ITFFB 鞘內最終調配緩衝液
ITR 反向末端重複序列
IU 感染單位(Infectious Unit)
IV 靜脈內
KanR 康黴素抗性(基因)
LAL 鱟阿米巴樣細胞溶解物(Limulus Amoebocyte Lysate)
LFTs 肝功能檢查
LOD 偵測極限
LTFU 長期追蹤
M 雄性
MBR 主批次紀錄(Master Batch Record)
MCB 主細胞庫(Master Cell Bank)
MED 最小有效劑量
MRI 磁振造影
mRNA 信使核糖核酸
MS 質譜法
MTD 最大耐受劑量
N 對象或動物數量
N/A 不適用
NAbs 中和抗體
NBS 新生兒篩檢
NCV 神經傳導速度
NGS 次世代定序法(Next-Generation Sequencing)
NHP 非人類靈長類
NHS 自然史研究(Natural History Study)
OL 開放式標籤(Open-Label)
PAS 過碘酸希夫
PBS 磷酸鹽緩衝鹽水
PEI 聚乙烯亞胺
PES 聚醚碸
PND 出生後日數
POC 概念驗證
PolyA 多腺核苷酸化(Polyadenylation)
QA 品質保證
QC 品質管制
qPCR 定量聚合酶連鎖反應
rAAV 重組腺相關病毒
rcAAV 具複製能力腺相關病毒(Replication-Competent Adeno-Associated Virus)
rBG 兔β-球蛋白
rDNA 核糖體去氧核糖核酸
rep 複製酶(基因)
RNA 核糖核酸
RPM 每分鐘轉數
SA 單臂
SAE 嚴重不良事件
SD 標準差
SDS 十二烷基硫酸鈉
SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳
SOP 標準作業程序
SRT 安全審核觸發因素(Safety Review Trigger)
ssDNA 單股去氧核糖核酸
TBD 待確定(To Be Determined)
TCID50 50%組織培養感染劑量
TE Tris-EDTA
TFF 切向流過濾(Tangential Flow Filtration)
twi 特威徹功能喪失對偶基因
UPLC 超高效液相層析
US 美國
USP 美國藥典(United States Pharmacopeia)
VEP 視覺誘發電位(Visual Evoked Potential)
VP1 病毒蛋白質1
VP2 病毒蛋白質2
VUS 未知意義變體(Variants of Unknown Significance)
WCB 工作細胞庫(Working Cell Bank)
WHO 世界衛生組織
WT 野生型
實施例 1- 重組 AAVhu68.hGALC
rAAVhu68.hGALC為一種攜帶編碼人類GALC之工程化序列的AAV。rAAVhu68.hGALC之AAVhu68衣殼在胺基酸水平上與AAV9有99%同一性。AAV9[SEQ ID NO：4]與AAVhu68衣殼[SEQ ID NO：2]之間相異的二個胺基酸位於衣殼之VP1(67及157)及VP2(157)區，並確認於圖1。亦參見WO 2018/160852，其藉由引用併入本文。
rAAVhu68.hGALC係由HEK293細胞的三重質體轉染產生的，該HEK293細胞具有編碼兩側有AAV ITR的轉殖基因匣之AAV順式質體、編碼AAV2 rep及AAVhu68 cap基因(pAAV2/hu68.KanR)之AAV反式質體、及輔助腺病毒質體(pAdΔF6.KanR)。
A. AAV 載體基因體質體序列元件
載體基因體的線性圖譜如圖2所示。載體基因體含有下列序列元件：
反向末端重複序列(ITR)：ITR為衍生自AAV2(130 bp，GenBank：NC_001401)的相同反向互補序列，位於載體基因體的所有組件兩側。當反式提供AAV和腺病毒輔助功能時，ITR既作為載體DNA複製的起始點，又作為載體基因體的包裝訊號。如此，ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。
人類細胞巨大病毒立即早期增強子(CMV IE)：此獲自人類衍生之CMV(382 bp，GenBank：K03104.1)的增強子序列增加下游轉基因的表現。
雞β-肌動蛋白(CB)啟動子：選擇此普遍存在的啟動子(282 bp，GenBank：X00182.1)以驅動任何CNS細胞類型中的轉基因表現。
嵌合內含子(CI)：雜合的內含子由雞β-肌動蛋白剪接供體(973 bp，GenBank：X00182.1)與兔β-球蛋白剪接受體成分所組成。此內含子被轉錄，但藉由剪接將其從成熟的mRNA中移除，從而將其任一側的序列匯集在一起。已顯示在表現匣中存在內含子以促進mRNA從細胞核到細胞質的轉運，如此增進用於轉譯的mRNA之穩定水平的蓄積。此為欲在增加基因表現水平的基因載體的共同特徵。
編碼序列：人類GALC 基因的工程化cDNA編碼人類半乳糖基神經醯胺酶蛋白質，其為一種溶酶體酶，負責髓磷脂半乳糖脂的水解和降解(2055 bp；685個胺基酸[aa]，GenBank：EAW81361.1)。
兔β-球蛋白多腺核苷酸化信號(rBG PolyA)：rBG PolyA信號(127 bp，GenBank：V00882.1)促進順式轉殖基因mRNA的高效多腺苷酸化。此元件係為作為轉錄終止的信號、在初期轉錄本的3’端的特定裂解事件及多腺核苷酸尾的添加的功能。
B. 反向質體： pAAV2/1.KanR(p0068)
AAV2/hu68反向質體pAAV2/hu68.KanR(p0068)顯示於圖21。
AAV2/hu68反向質體為pAAV2/hu68.KanR (p0068)。pAAV2/hu68.KanR質體為8030 bp長且編碼複製和包裝AAV載體基因體所需的四種野生型AAV2複製酶(Rep)蛋白。pAAV2/hu68.KanR反式質體亦編碼三個WT AAVhu68病毒顆粒蛋白質衣殼(Cap)蛋白質，其組裝成AAV血清型hu68之病毒顆粒殼以收容AAV載體基因體。
為了產生pAAV2/hu68.KanR反式質體，將源自質體pAAV2/9n(p0061-2)(其在衍生自pBluescript KS載體的質體骨架上編碼野生型AAV2rep 及AAV9cap 基因)的AAV9cap 基因移除並替換為AAVhu68cap 基因。安比西林(ampicillin)抗性(AmpR )基因亦以康黴素(kanamycin)抗性(KanR )基因替換，獲得pAAV2/hu68.KanR(p0068)。此種選殖策略將AAVp5 啟動子序列(通常驅動rep 表現)由rep 的5'端遷移至cap 的3'端，在rep 的上游留下一個截短的p5 啟動子。此經截短的啟動子用於向下調節rep 的表現，因此，使載體的產量最大化(圖4)。
質體的所有組成部分均已藉由直接定序驗證。
C. 腺病毒輔助質體： pAdDeltaF6(KanR)
腺病毒輔助質體pAdDeltaF6(KanR)顯示於(圖5B)。
質體pAdDeltaF6(KanR)大小為15,770 bp。該質體包含對AAV複製很重要的腺病毒基因體區域；即，E2A 、 E4 、及VA RNA(腺病毒E1之功能由HEK293細胞提供)。然而，該質體並不包含其它腺病毒複製或結構基因。該質體並不包含對複製至關重要的順式元件，例如腺病毒ITR；因此，預計不會產生感染性腺病毒。此質體源自Ad5(pBHG10，一種基於pBR322的質體)之E1、E3缺失分子殖株。將缺失導入至Ad5中以消除不必要之腺病毒基因的表現並將腺病毒DNA的數量從32 kb減少到12 kb(圖5A)。最後，將安比西林抗性基因替換為康黴素抗性基因以產生pAdeltaF6(KanR)(圖5B)。保留在此質體中的E2 、E4 及VAI 腺病毒基因，以及存在於HEK293細胞中的E1 ，對於AAV載體生產皆為必須。
實施例 2- 材料及方法
神經運動功能評估 ( 旋轉桿 (RotaRod))
協調及平衡由對治療組不知情的人員使用旋轉桿測試(Ugo Basile；Gemonio，Italy)測量。簡而言之，小鼠首先習慣於旋轉桿，每次試驗最多將5隻小鼠放置在旋轉桿裝置的一條面向牆壁的通道中。使小鼠在固定(非旋轉)桿上穩定自己2分鐘。然後進行兩次習慣試驗，其中桿以每分鐘5轉(RPM)的恆定速度旋轉1分鐘。在每次習慣試驗之間，讓小鼠在旋轉桿收集箱中休息約1分鐘。若老鼠在習慣期摔倒，它被立即放回桿上。
習慣後立即進行測試以測量每隻老鼠在加速時可以在旋轉桿上停留多長時間。將小鼠放置在旋轉桿裝置的一條面向牆壁的通道中，並使其在固定(非旋轉)桿上保持平衡以建立牢固的抓握力。將桿設置為以5 RPM的恆定速度旋轉幾秒鐘，以使鼠標達到平衡。一旦平衡後，將桿設置為在120秒內從5RPM加速到40RPM。對於每隻動物，當小鼠從桿上掉下來、完成兩次被動旋轉或經過120秒時，測試試驗被視為終止。記錄落下潛時(定義為桿加速開始和試驗終止之間的時間)。在每次試驗中，對小鼠總共進行了三個連續的重複測試，運行之間有1-3分鐘的暫停，讓動物在收集箱中休息。
組織學處理及評估
腦
從屍體剖檢動物的頭骨取出整個腦，並使用刀片將整個腦從中矢狀切開成兩塊。將腦的左半球冷凍在乾冰上並儲存在≤-60°C以評估轉基因表現(GALC酶活性測定)，將腦的右半球置於10% NBF中進行組織學檢查。
坐骨神經
收集坐骨神經並立即置於固定在含2.5%戊二醛+2%多聚甲醛的PBS中，室溫下至少約24小時。固定後，樣品在PBS中洗滌，以1%四氧化鋨水溶液後固定2小時，在水中洗滌，並通過上升的乙醇系列脫水，然後環氧丙烷、環氧丙烷和包埋樹脂的混合物，以及單獨的包埋樹脂。包埋樹脂係通過在使用前根據製造商的說明(Ladd Research Industries)混合其組分(LX-122、DDSA、NMA及DMP-30)來製備。然後將樣品放入帶有包埋劑的模具中，在70°C下固化48小時，以超薄切片機切成1 µm厚的切片，以甲苯胺藍染色，乾燥後用Permount封片劑(Permount mounting medium)蓋玻片。
石蠟包埋及切片
根據SOP 4004和SOP 4006將組織樣品包埋在石蠟中並切片。簡而言之，將含有固定組織的包埋匣放入Leica ASP300組織處理器中，讓處理器運行隔夜。使用包埋中心將組織以適當的方向包埋，並將樣品在冷卻板上硬化。然後在切片前修剪塊並在冰上冷卻至少10分鐘。使用切片機製備切片，厚度為5-7 μm。將切片轉移並漂浮在預熱至38-52°C的水浴中以去除皺紋。將切片轉移到載玻片上並在室溫下乾燥。然後通過在60–65°C的溫度下加熱至少15分鐘(或直到石蠟熔化)使載玻片脫蠟。載玻片在二甲苯中溫育(3次，3-5分鐘)，通過乙醇系列再水合，並在蒸餾水中洗滌兩次。然後將包含至少三個連續切片的載玻片染色LFB、PAS(分別為髓鞘化和球狀細胞浸潤，或IBA1 IHC(球狀細胞大小測量)。
LFB/PAS 染色（評估髓鞘化和球狀細胞浸潤）
脫蠟後，以LFB/PAS染色對腦、脊髓和坐骨神經的切片進行染色。簡而言之，將載玻片與LFB溶液(SLMP，LLC；目錄號：STLFBPT)於65℃隔夜。切片在0.05%碳酸鋰溶液和70%乙醇中鑒別，並在顯微鏡下監測直至鑒別完成。然後將載玻片置於0.5%高碘酸中5分鐘(Sigma；目錄號：395B-1Kit)。用流動自來水洗滌後，將載玻片轉移到希夫氏試劑(Sigma；目錄號：395B-1Kit) 15分鐘。用流動自來水沖洗載玻片5分鐘，用蘇木精短暫複染以鑑定細胞核，並蓋上蓋玻片。進行組織病理學評估。
IBA1 免疫組織化學 ( 神經發炎 )
脫蠟後，對腦、脊髓和坐骨神經的切片進行IBA1的免疫組織化學染色。簡而言之，使用基於檸檬酸的抗原暴露溶液(Vector Laboratories；目錄號：H-3300)，在壓力鍋中在100℃下進行抗原恢復20分鐘。載玻片與3%過氧化氫溫育10分鐘，使用親和素/生物素試劑各封閉15分鐘(Vector Laboratory；目錄號：SP-2001)，並在室溫下與1%驢血清和0.2% Triton-X溫育15分鐘。然後將載玻片與兔抗IBA1初級抗體(Abcam；目錄號：ab178846)在4℃下以1：2000稀釋隔夜。載玻片與生物素化驢抗兔IgG二級抗體一起溫育(Jackson；目錄號：711-065-152)以1：1000稀釋，於室溫30分鐘。清洗載玻片，然後以Vectastain ABC試劑(Vector Laboratories；目錄號：PK-6100)溫育。使用DAB套組(Vector Laboratories；目錄號：SK-4100)進行比色顯影，隨後以蘇木精複染並蓋玻片。
GALC 免疫組織化學
組織樣本在福爾馬林中固定至少24小時，並進行石蠟包埋。然後將切片(6 µm)通過二甲苯和乙醇系列脫蠟並放入水中。使用壓力鍋在基於檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)的抗原暴露溶液(Vector Laboratories)中進行抗原恢復。接著，切片依次以2% H2 O2 (15分鐘)、親和素/生物素封閉劑(各15分鐘；Vector Laboratories)及封閉緩衝液(1%驢血清PBS+0.2% Triton，1小時)處理。然後將切片與初級抗體(兔抗人 GALC，ThermoFisher PA5-72315，1：100，4°C隔夜)一起溫育，並在PBS/0.02% Tween-20中洗滌後，來自驢的生物素化二級抗體(30 分鐘)；Jackson ImmunoResearch，1：500)。所有抗體皆於封阻緩衝液中稀釋。洗滌後，根據製造商的說明使用Vectastain Elite ABC套組(Vector Laboratories)，以DAB為受質(5分鐘顯影時間)，將結合的抗體染色呈棕色沉澱物。切片用蘇木精複染以顯示細胞核並蓋上蓋玻片。
評估轉基因表現（ GALC 活性測定）
組織樣本的處理
使用Qiagen TissueLyzer在30 Hz下將冷凍腦在含有0.05% Triton-X100的0.9% NaCl、pH 4.0中均質化2分30秒。樣品在乾冰上冷凍20分鐘，在室溫下解凍，並短暫渦旋。通過在台式離心機中以10,000 RPM離心10分鐘來澄清溶胞產物。將澄清的溶胞產物轉移到新的試管中進行分析。通過二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)測定法測量蛋白質含量。
測量 GALC 酶活性
使用來自Marker Gene Technologies, Inc.的市售套組(目錄號：M2774)測量腦及血清中的GALC活性。對於該測定，將來自50μg腦總蛋白或10μL血清與套組中包含的反應緩衝液混合至最終體積為100μL。含有100μL反應緩衝液的試管作為空白組。將樣品在37°C溫育2小時，然後通過添加套組中提供的1mL終止溶液來終止反應。最後，將每個反應的300μL轉移到96孔黑色盤中，並在365nm激發下使用平盤讀數機在454nm的發射波長下測量螢光。
實施例 3-GALC- 缺陷的特威徹小鼠模型中的 AAVhu68.hGALC 遞送
下述研究使用特威徹小鼠模型以建立遞送AAVhu68.CB7.CI.GALC.rBG(於兩側有AAV2 ITRs的CB7啟動子及BG polyA序列的控制下，含編碼工程化人類GALC cDNA(SEQ ID NO：9)的AAVhu68載體，亦稱為rAAVhu68.hGALC)至CSF中以達到GALC表現水平的治療水平並挽救該疾病的幾種生物標記的潛力。特威徹小鼠的概貌提供於圖6B。
特威徹小鼠為克拉培氏病的天然近親配種模型，1976年在傑克遜實驗室(Jackson Laboratory)被鑑定為自發性突變(Kobayashi T., et al.(1980) Brain Research.202(2)：479-483)。受影響的小鼠對於特威徹功能喪失對偶基因(twi )為同型合子組合，該對偶基因由Galc基因中的G到A突變所組成。此突變產生早期終止密碼子(W339X)。截短的GALC蛋白質具有接近0%的殘留酵素活性，其與嬰兒型克拉培氏病之患者中所觀察到的GALC活性水平相似。異基因型組合的攜帶者小鼠(twi /+)係表型上正常的。
特威徹小鼠中疾病進展已得到充分證明(圖6A)，且各種神經病理學及行為缺陷模擬表型(phenocopy)嬰兒克拉培氏病。如同嬰兒克拉培氏病患者，小鼠GALC缺陷會導致細胞毒性脂質中間體鞘胺醇半乳糖苷的蓄積。特威徹小鼠同樣顯示出PNS和CNS白質因吞噬而充滿鞘胺醇半乳糖苷之球狀細胞的大量浸潤，該球狀細胞被認為源自巨噬細胞及/或小神經膠質細胞譜系(Tanaka K., et al.(1988) Brain Research.454(1)：340-346；Levine S.M., et al.(1994) Intl J Dev Neuro.12(4)：275-288)。此導致脫髓鞘化，這是克拉培氏病患者的疾病關鍵特徵之一。在正常髓鞘化之初始階段後，受影響的特威徹小鼠於10日齡後，由於形成髓磷脂的許旺氏細胞的死亡，在PNS喪失髓磷脂(Jacobs J.M., et al.(1982) J Neurol Sci.55(3)：285-304)及於20日齡由於形成髓磷脂之寡樹突神經膠質細胞的死亡，在CNS中喪失髓磷脂。可能是因為這種延遲，這些小鼠周圍神經中的脫髓鞘化比在CNS中更為嚴重(Suzuki K. & Suzuki K.(1983) The American journal of pathology.111(3)：394-397)。最後，特威徹小鼠表現出持續且迅速的神經惡化，在症狀發作後嬰兒克拉培氏病患者中也觀察到類似情況。這些小鼠中的行為症狀包括讓人聯想到在人類患者中所觀察到的運動表型，包括在約20日齡的震顫、抽搐和後腿無力。小鼠最終在約40日齡發展成特徵為嚴重體重減輕及麻痺的人道終點(Wenger D.A.(2000) Molec Med Today.6(11)：449-451)。我們選擇人道終點作為研究的結束，以評估治療拯救小鼠存活的功效。在人道終點，收集CNS和PNS進行組織病理學觀察脫髓鞘和球狀細胞浸潤(此為小鼠和人類克拉培氏病的標誌)、hGALC表現及轉基因表現(GALC酶活性)。
嬰兒克拉培氏病患者展現出與特威徹小鼠相似的臨床特徵。如此，特威徹小鼠模型足以評估rAAVhu68.hGALC支持嬰兒克拉培氏病適應症的功效(拯救酶活性以提高存活率、運動功能以及腦和神經病理學)。如下所述，使用特威徹小鼠進行的研究證實，在單一ICV投予(在ICM技術上不可行的小鼠模型中最有效的方法)後，rAAVhu68.hGALC在相關組織中表現活性GALC酶素、挽救存活、改善運動功能及改善CNS和PNS組織病理學的功效。
新生特威徹(twi/twi )小鼠(PND 0)接受rAAVhu68.hGALC單一IV投予(以劑量1.0x1011 GC(6.7 x 1011 GC/g腦重量))或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。野生型、異型合子(twi /+)、及同型合子(twi/twi )小鼠(PND 0)被IV投予PBS並作為比較物(參見下表)。生活中的評估包括每天進行的生存能力檢查和生存監測。在人道終點對動物進行屍體剖檢。於屍體剖檢收集腦用於評估轉基因表現(GALC酶活性)。
組別 N 性別 基因型 a 處理 劑量 (GC/ 動物 )b 劑量 (GC/g 腦 ) c 劑量體積 (μL)
1 12 兩者 +/+ 及twi/+ PBS N/A N/A 50.0
2 8 兩者 twi/twi PBS N/A N/A 50.0
3 6 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 1.0 x 1011 6.7 x 1011 50.0
a +/+，野生型小鼠；twi /+，異型合子基因型；twi/twi ，剔除小鼠；twi 等位基因由Galc 基因中功能喪失突變所組成。b 1.0x1014 GC/kg體重c 數值是使用0.15 g的新生小鼠腦質量計算
在rAAVhu68.h GALCtwi/twi 處理的小鼠中觀察到腦GALC活性的最小增加。所有twi/twi 動物在達到人道終點後被安樂死。發現三隻twi/twi 動物死亡並包括在存活分析中。靜脈投予1x1011 GC的rAAVhu68.hGALC導致存活率從twi/twi PBS小鼠的40.5天中位存活(median survival)到twi/tw i小鼠的49天中位存活有統計學意義的小幅增加(圖7)。rAAVhu68.hGALC的靜脈投予導致腦 GALC活性的最小增加，但仍低於野生型水平。在接受rAAVhu68.hGALC的小鼠中，平均GALC活性為野生型水平的44%(圖8)。
接著，進行研究以確定rAAVhu68.hGALC (AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG)在腦室內(ICV)投予後的特威徹小鼠模型中的功效。症狀發生前的特威徹(twi/twi )小鼠被投予rAAVhu68.hGALC ICV，因為已知直接投予到CSF中可促進較低劑量的CNS轉導。特威徹(twi/twi )小鼠(PND 0)接受rAAVhu68.hGALC單一ICV投予(以三劑量水平之一者(2.0x1010 GC、5.0x1010 GC、或1.0x1011 GC))或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。野生型、異型合子(twi /+)、及同型合子(twi/twi )小鼠(PND 0)被ICV投予PBS並作為比較物。生活評估包括生存能力檢查、體重監測、神經運動評估(旋轉桿)和生存監測。在人道終點對動物進行屍體剖檢。在人道終點，收集CNS和PNS進行組織病理學觀察脫髓鞘和球狀細胞浸潤、hGALC表現及轉基因表現(GALC酶活性)。
組別 a N 性別 基因型 處理 劑量 (GC/ 動物 ) 劑量 (GC/g 腦 ) a 劑量體積 (μL) ROA 投劑日 屍體剖檢日
1 15 兩者 +/+ 及twi/+ PBS N/A N/A 2.0 ICV 0 21
2 8 兩者 twi/twi PBS N/A N/A 2.0 ICV 0 人道終點b
3 10 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 2.0 x 1010 1.3 x 1011 2.0 ICV 0 人道終點
4 12 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 5.0 x 1010 3.3 x 1011 2.0 ICV 0 人道終點
5 12 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 1.0 x 1011 6.7 x 1011 2 x 2.0 ICV 雙側 0 人道終點
a        值係使用0.15 g的新生小鼠腦質量計算b        PBS處理的野生型和異型合子小鼠用於旋轉桿和體重控制，且未達到人道終點。牠們在研究完成時被安樂死。
rAAVhu68.hGALC導致統計學顯著劑量依賴性增加，從在PBS處理的twi/twi 小鼠中43天的中位存活到以2x1010 GC之劑量之62天、5x1010 GC之劑量之99天、及1x1011 GC之劑量之130天(圖9)。所有劑量水平與PBS處理的twi/twi 小鼠的體重相比，rAAVhu68.hGALC之投予導致twi/twi 小鼠體重減輕的統計學顯著挽救。體重於小鼠給予rAAVhu68.hGALC之兩個最高劑量組中相同(5.0x1010 GC及1.0x1011 GC)(圖10)。旋轉桿試驗評估了神經運動功能，該試驗通過測量在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的小鼠的落下時間來評估協調和平衡。落下潛時的減少表明神經運動障礙，而落下潛時的增加表明神經運動功能的改善。與PBS處理的twi/twi 小鼠相比，rAAVhu68.hGALC向twi/twi 小鼠ICV投予導致落下潛時的劑量依賴性增加。在兩個最高劑量下，落下潛時的增加具有統計學意義(5.0x1010 及1.0x1011 GC)(圖11)。與野生型PBS處理的小鼠相比，腦 GALC酶活性以劑量依賴性方式增加。與野生型PBS處理組相比，於rAAVhu68.hGALC投劑組之2.0x 1010 GC組，GALC活性為117%，於5.0x 1010 GC組為173%，及於1.0x 1011 GC組為210 %。當與PBS處理的twi/twi 小鼠相比，經rAAVhu68.hGALC處理的小鼠亦具有增加的GALC活性(圖12)。
twi/twi PBS處理的動物的腦表現出輕度至中度腦脫髓鞘化，且所有治療組均表現出正常的WT樣胼胝體髓磷脂強度(圖15)。在twi/twi PBS處理的小鼠胼胝體和小腦的白質中觀察到髓磷脂染色和浸潤減少。所有劑量水平的治療都減少脫髓鞘化並抑制胼胝體中的球狀細胞(圖16)。rAAVhu68.hGALC在小腦中效果較差，於所有經rAAVhu68.hGALC處理的組中皆存有脫髓鞘化和球狀細胞浸潤。在PBS處理的twi/twi 動物和rAAVhu68.hGALC處理的動物中，以2.0x1010 GC和5.0 x 1010 GC組的劑量觀察到類似的脫髓鞘化和球狀細胞浸潤。在rAAVhu68.hGALC劑量為1.0x1011 GC處理的動物中，小腦葉最中央的白質在大多數情況下看起來正常，深藍色髓磷脂染色且沒有球狀細胞，而葉尖含有豐富的球狀細胞(圖16)。野生型小鼠表現出豐富的髓鞘化神經纖維，緊密排列且沒有炎症細胞，而twi/twi 小鼠表現出數量減少的髓鞘化神經纖維和大量增大的單核細胞(球狀細胞)，見於神經纖維之間(圖17)。來自所有rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠的坐骨神經顯示出與PBS處理的twi/twi 組相似的病理，具有嚴重的脫髓鞘化和球狀細胞浸潤(圖17)。此發現可能是由於人道終點被定義為後腿麻痺，當坐骨神經受到嚴重影響時會發生。
在PBS處理的野生型小鼠和所有rAAVhu68.hGALC處理的小鼠胼胝體和皮質中IBA1陽性細胞是正常的。神經炎症持續存在於球狀細胞增大的小腦和腦幹中(圖18)。在以5.0x1010 GC和1.0x1011 GC的劑量投予AAVhu68.hBALC的動物中，IBA1陽性細胞越來越少和越來越小證明了在小腦中觀察到部分治療效果。hGALC在腦皮質、海馬迴、小腦和脈絡叢細胞的神經元中的劑量依賴性表現，而腦幹未被轉導(圖19)。
實施例 4–AAV1.CB7.CI.hGALCco.rBG 、 AAV3B.CB7.CI .hGALCco.rBG 、及 AAV5.CB7.CI.hGALCco.rBG 於新生特威徹 (twi/twi) 小鼠腦室內投予後之評估
進行研究以評估三個額外的臨床載體(AAV1.CB7.CI.hGALCco.rBG、AAV3B.CB7.CI.hGALCco.rBG、AAV5.CB7.CI.hGALCco.rBG)以確定在腦血管內(ICV)投予後於嬰兒克拉培氏病小鼠模型中的功效。潛在的候選者具有不同的血清型，但皆含於CB7啟動子和兩側為AAV2 ITR的BG polyA序列控制下的工程化人類GALC cDNA。
新生特威徹(twi/twi )小鼠(PND 0)接受單一ICV投予AAV1.CB7.CI.hGALCco.rBG、AAV3B.CB7.CI.hGALCco.rBG、或AAV5.CB7.CI.hGALCco.rBG，以劑量2.0x1010 GC(1.3x1011 GC/g腦重)。選擇ICV途徑(涉及將AAV載體直接投予至腦室的CSF)來評估將GALC酶遞送至CNS和PNS的潛力，其為治療嬰兒克拉培氏病的目標。生活評估包括生存能力檢查、體重監測、神經運動評估(旋轉桿)和生存監測。在人道終點對動物進行屍體剖檢。在人道終點，收集CNS和PNS進行組織病理學觀察脫髓鞘和球狀細胞浸潤、hGALC表現及轉基因表現(GALC酶活性)。
表.組別、劑量水平、及投予途徑
組別a N 性別 基因型a 處理 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦)b 劑量體積 (μL)
1 6 兩者 twi/twi AAV1.CB7.CI.hGALCco.rBG 2.0 x 1010 1.3 x 1011 2.0
2 9 兩者 twi/twi AAV3B.CB7.CI.hGALCco.rBG 2.0 x 1010 1.3 x 1011 2.0
3 6 兩者 twi/twi AAV5.CB7.CI.hGALCco.rBG 2.0 x 1010 1.3 x 1011 2.0
a         twi等位基因由Galc基因中的功能喪失突變組成。twi/twi係指基因剔除小鼠。b        值係使用0.15 g的新生小鼠腦質量計算(Gu et al., 2012) 縮寫：GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ID，識別號；N，動物數；N/A，不適用；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；ROA，投予途徑。
所有twi/twi 動物在達到其人道終點後被安樂死。發現一隻twi/twi 動物死亡(AAV3B.hGALC組)並包括在存活分析中。在twi/twi 動物中，AAV1.hGALC投予後的中位存活為57天，AAV3B.hGALC和AAV5.hGALC投予後為51天(圖20A及圖20B)。
AAV5.hGALC的投予導致twi/twi 小鼠體重減輕的挽救。與PBS處理的twi/twi 小鼠相比，AAV5.hGALC的體重挽救具有統計學意義(圖21)。
旋轉桿試驗評估了神經運動功能，該試驗通過測量在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的小鼠的落下時間來評估協調和平衡。落下潛時減少表明神經運動功能受損，而落下潛時增加表明神經運動功能改善(圖22)。對於任何試驗的衣殼，沒有觀察到落下潛時的顯著變化。
與其它衣殼和twi/twi PBS處理組相比，AAV1.hGALC投予後腦中的GALC酶活性水平增加(圖23)。GALC活性在AAV3B.hGALC和AAV5.hGALC之間相似，並且高於 twi/twi PBS處理組。在肝臟中，與twi/twi PBS治療組相比，AAV治療組的GALC酶活性水平較低(圖24)。在血清中，與twi/twi PBS治療組相比，AAV治療組的GALC酶活性水平較低(圖25)。
坐骨神經(圖26)ICV投予AAV1.hGALC後，大腦皮質和海馬迴中的IBA1陽性細胞常態化(圖27)。在用AAV3B.hGACL和AAV5.hGALC處理的動物的胼胝體中觀察到大量IBA1陽性球狀細胞，表明這些衣殼不太有效。AAV1.hGALC投予在大腦皮質、小腦浦金埃氏細胞(Purkinje cell)、脈絡叢脈絡膜細胞、延腦靠近腦橋池(pontine cistern)中產生強大的神經元轉導(圖28)。脈絡叢脈絡膜和一些延腦神經元的更強大的轉導可能是在注射AAV1.hGALC的動物大腦中測量到的更高GALC活性的原因。AAV3B.hGALC主要在小腦中轉導神經元，其它地方很少轉導神經元。AAV5.hGALC導致整體神經元轉導低，主要轉導脈絡叢中的細胞(圖28)。
實施例 5–rAAVhu68.hGALC 幼年特威徹 (twi/twi ) 小鼠腦內投予後之評估
進行研究以確定rAAVhu68.hGALC (AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG)在腦室內(ICV)投予嬰兒克拉培氏病特威徹模型中的功效。rAAVhu68.hGALC是表現人類半乳糖腦苷脂酶(GALC )基因之重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體。於PND 12，幼年特威徹(twi/twi )小鼠接受rAAVhu68.hGALC的單次ICV投予，劑量為1.0x1011 GC或2.0x1011 GC(分別為2.5x1011 或5.0x1011 GC/g腦重)。或者，於PND 21投予rAAVhu68.hGALC，劑量為2.0x1011 GC(5.0x1011 GC/g腦重)。選擇動物的年齡是因為PND12是行為症狀出現之前的年齡(「早期症狀」)，而PND21是小鼠表現出行為症狀(「後期症狀」)的年齡。此外，PND 12及PND 21在人類中分別轉換成2個月齡及9個月齡(www.translatingtime.org)，這與FIH試驗的預期嬰兒人群相似。
生活評估包括每日進行生存能力檢查、體重監測、神經運動評估(旋轉桿)和生存監測。在人道終點對動物進行屍體剖檢。在人道終點，收集CNS和PNS進行組織病理學觀察脫髓鞘和球狀細胞浸潤、hGALC表現及轉基因表現(GALC酶活性)。
表.組別、劑量水平、及投予途徑
組別 N 性別 基因型a 處理 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦)b 劑量體積 (μL) ROA 屍體剖檢日
1 4 兩者 twi/twi PBS N/A N/A 4.0 IV 人道終點c
2 13 兩者 +/+ 及twi/+ PBS N/A N/A 4.0 IV 人道終點
3 12 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 1.0 x 1011 2.5 x 1011 4.0 IV 人道終點
4 11 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 2.0 x 1011 5.0 x 1011 2 x 4.0(n=3)；4.0(n=8) ICV 人道終點
1 16 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 2.0 x 1011 5.0 x 1011 5.0 ICV 人道終點
a +/+，野生型小鼠；twi /+，異型合子基因型；twi/twi ，剔除小鼠；twi 等位基因由Galc 基因中功能喪失突變所組成。b 值係使用0.4 g的新生小鼠腦質量計算(Gu et al., 2012)c PBS處理的野生型和異型合子小鼠用於旋轉桿和體重控制，且未達到人道終點。牠們在研究完成時被安樂死。縮寫： GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ID，識別號；N，動物數；N/A，不適用；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；ROA，投予途徑。
所有twi/twi 動物在達到人道終點後被安樂死。當在PND 12和PND 21投予AVhu68.hGALC時，觀察到twi/twi 小鼠的存活率顯著增加(圖29A及圖29B)。於PND12處理的小鼠的中位存活在PBS處理的小鼠中為41.5天，在rAAVhu68.hGALC劑量為1.0x1011 GC治療的小鼠中為71天，在rAAVhu68.hGALC劑量為2.0 x 1011 GC治療的小鼠中為81天。於PND21用2.0x1011 GC劑量的rAAVhu68.hGALC處理的小鼠中位存活為52天。與PND21相比，在PND12上以2.0x1011 GC劑量使用rAAVhu68.hGALC治療的動物的存活在統計學上顯著提高(圖30)。於PND12和PND21處理的小鼠的中位存活分別為81天和52天。與PBS處理的小鼠相比，於PND12以1.0x1011 GC或2.0x1011 GC的劑量投予rAAVhu68.hGALC，導致twi/twi 小鼠體重減輕的統計學顯著挽救(圖31)。rAAVhu68.hGALC以2.0x1011 GC的劑量於PND 21處理，與媒液處理的動物相比，並沒有顯著挽救體重減輕(圖32)。
旋轉桿試驗評估了神經運動功能，該試驗通過測量在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的小鼠的落下時間來評估協調和平衡。落下潛時的減少表明神經運動障礙，而落下潛時的增加表明神經運動功能的改善。與PBS處理的小鼠相比，於PND12向twi/twi 小鼠ICV投予rAAVhu68.hGALC落下潛時在統計上顯著增加(圖33)。PBS處理的野生型及twi/+ 小鼠的落下潛時相似。以2.0 x 1011 GC的劑量於PND21向twi/twi小鼠投予rAAVhu68.hGALC並沒有改善落下潛時(圖34)。
於PND12投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠中，腦GALC酶活性以劑量依賴性方式增加(圖35)。當小鼠於PND21以2.0x1011 GC的劑量之rAAVhu68.hGALC處理時，GALC酶活性的增加不太明顯。與於PND 12處理的小鼠相比，用2.0x1011 GC劑量的rAAVhu68.hGALC，於PND 21處理的twi/twi 小鼠的肝臟和血清GALC酶活性更高(圖36及圖37)。於PND21處理的小鼠體內較高的GALC活性可能是治療後存活時間較短的結果，這會導致幼年動物肝臟生長後轉基因損失較少。twi/twi PBS處理的動物的大腦顯示胼胝體和小腦白質中髓磷脂染色減少，並且在小腦葉中觀察到大量PAS染色的球狀細胞(圖38)。在PND 12和PND21投予的所有劑量組的rAAVhu68.hGALC處理的小鼠減少胼胝體中的脫髓鞘，但於觀察到球狀細胞浸潤的小腦中糾正的脫髓鞘方面效果較差。
野生型小鼠表現出豐富的髓鞘化神經纖維，緊密排列且沒有炎症細胞，而twi/twi 小鼠表現出數量減少的髓鞘化神經纖維和大量增大的單核細胞(球狀細胞)，見於神經纖維之間。在PND 12或PND21，用rAAVhu68.hGALC治療的所有twi/twi小鼠的坐骨神經顯示髓磷脂纖維中度至重度脫髓鞘化(圖39)。此發現可能是由於人道終點被定義為後腿麻痺，當坐骨神經受到嚴重影響時會發生。rAAVhu68.hGALC治療的存活時間最長的小鼠具有更多的髓磷脂纖維。
在PND12上以rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi皮質中的IBA1陽性細胞與野生型相似，而在PND21處理的小鼠在所有分析的大腦區域中表現出球形細胞和擴大的活化小神經膠質細胞(圖40)。胼胝體、小腦中持續存在神經炎症和增大的球狀細胞(圖40)及於腦幹中(資料未顯示)。在用rAAVhu68.hGALC在PND12或PND21處理的twi/twi 小鼠中觀察到hGALC在大腦皮質和海馬神經元(靠近注射部位)中的強表現(圖41)。僅在PND 12以rAAVhu68.hGALC治療的動物中，小腦中的浦金埃氏細胞對hGALC呈陽性。關於投予年齡，rAAVhu68.hGALC-處理，未轉導腦幹。
實施例 6- 評估 rAAVhu68.hGALC 向幼年特威徹 (twi/twi ) 小鼠的遞送
進行另外的研究以確定rAAVhu68.hGALC (AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG)在腦室內(ICV)投予後的特威徹小鼠中的功效。於PND 12，幼年特威徹(twi/twi )小鼠接受的rAAVhu68.hGALC的單次ICV投予，劑量為2.0x1011 GC(1.3x1012 GC/g腦重)。選擇動物的年齡是因為PND12為行為症狀出現之前的年齡(「早期症狀」)並轉換為2個月齡的人類(www.translatingtime.org)且類似於預期的嬰兒族群FIH試驗。
生活評估包括每日進行生存能力檢查、體重監測、及神經運動評估(旋轉桿)。在PND40對動物進行屍體剖檢。在屍體剖檢，收集CNS和PNS進行組織病理學觀察脫髓鞘和球狀細胞浸潤、hGALC表現及轉基因表現(GALC酶活性)。
表.組別、劑量水平、及投予途徑
組別a N 性別 基因型a 處理 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦)c 劑量體積 (μL) ROA 投劑日 屍體剖檢日
1 7 兩者 +/+ PBS N/A N/A 4.0 ICV 12±1 PND40
2 8 兩者 twi/twi PBS N/A N/A 4.0 ICV 12±1 PND40
3 10 兩者 twi/twi AAVhu68.CB7.hGALCco.rBG 2.0 x 1011 1.33 x 1012 4.0 ICV 12±1 PND40
a       +/+，野生型小鼠；twi /+，異型合子基因型；twi/twi ，剔除小鼠；twi 等位基因由Galc 基因中功能喪失突變所組成。b       值係使用0.4 g的新生小鼠腦質量計算(Gu et al., 2012)縮寫： GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ID，識別號；N，動物數；N/A，不適用；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；ROA，投予途徑。
每週由對治療組不知情的人員使用未公開的緊握能力、步態、震顫、脊柱後彎(kyphosis)及毛皮品質評估(下表)對臨床體徵進行評分。選擇此等措施以根據twi/twi 小鼠通常表現出的症狀來評估臨床狀態。分數高於0表示臨床惡化。
評估類別 觀察 臨床分數
後肢緊握 無緊握 0
非永久性緊握 1
永久性緊握 2
步態 正常 0
步態輕微異常，但小鼠輕鬆自發地移動 1
步態明顯異常，自主活動能力下降 2
向前移動嚴重困難，拖拉後腿 3
震顫 正常 0
最小的震顫，只有在小鼠不動時才可見 1
中度震顫，在休息和移動時明顯。抽搐 2
明顯的震顫和抽搐，在休息和移動時都很明顯。 3
脊柱曲率 正常 0
輕度脊柱後彎(脊柱彎曲)，但能夠完全拉直脊柱 1
無法完全伸直脊柱；維持持續的輕度脊柱後彎 2
走路或坐著時保持明顯的後凸 3
毛皮品質 正常 0
任何異常(抓撓、脫毛等) 1
以2.0x1011 GC的劑量投予rAAVhu68.hGALC挽救了體重減輕，其值與投予載體的野生型小鼠相當(圖42)。
旋轉桿試驗評估了神經運動功能，該試驗通過測量在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的小鼠的落下時間來評估協調和平衡。落下潛時的減少表明神經運動障礙，而落下潛時的增加表明神經運動功能的改善。與PBS處理的twi/twi 小鼠相比，向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致落下潛時在統計上顯著增加(圖43)。與PBS處理的twi/twi 小鼠相比，向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC降低了總臨床評分(圖44)。rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi小鼠具有與野生型PBS處理的小鼠相似的臨床評分。
與野生型或twi/twi PBS處理的小鼠相比，rAAVhu68.hGALC處理的小鼠的腦GALC酶活性增加(圖45)。與野生型或twi/twi PBS處理的小鼠相比，rAAVhu68.hGALC處理的小鼠的肝臟GALC酶活性增加(圖46)。與野生型或twi/twi PBS處理的小鼠相比，rAAVhu68.hGALC處理的小鼠的於PND28及PND 40的血清中GALC酶活性增加(圖47A及圖47B)。
rAAVhu68.hGALC投予至twi/twi 小鼠沒有脫髓鞘化的跡象(圖48)。rAAVhu68.hGALC處理的小鼠的脫髓鞘化水平與野生型PBS處理的小鼠相似。在twi/twi PBS處理的小鼠的腦幹、胼胝體和小腦的白質中觀察到髓磷脂染色減少和大量PAS染色的球狀細胞浸潤(圖49)。rAAVhu68.hGALC對twi/twi 小鼠的處理減少了此等富含髓磷脂的區域的脫髓鞘化並抑制球狀細胞(圖48)。在PBS處理的twi/twi小鼠中，周圍神經的髓磷脂纖維數量顯著減少，神經纖維結構顯得雜亂無章(圖50)。相比之下，來自用rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 的周圍神經顯示出一些脫髓鞘化，但與PBS處理的小鼠相比，神經纖維的數量和結構沒有那麼雜亂無章(圖50)。於坐骨神經亦觀察到類似的發現(圖50)。
當與PBS處理的twi/twi 小鼠顯示嚴重脫髓鞘化相比，rAAVhu68.hGALC投予減少了脊髓背束(dorsal tract)的脫髓鞘化(圖51)。野生型PBS處理的小鼠中的IBA1陽性細胞很小並且均勻分布在整個大腦中，而在PBS處理的twi/twi小鼠中，小膠質細胞很大並且在皮質、胼胝體、腦幹及小腦中呈現出斑片狀的粗糙染色外觀(圖52A-圖52C)。在以rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 中，皮質、胼胝體中IBA1陽性細胞的染色更加一致，但小腦和腦幹中的斑片狀染色，即神經炎症持續存在(圖52A-圖52C)。rAAVhu68.hGALC投予顯著減少皮質皮質、海馬迴、胼胝體中的IBA1陽性細胞(圖53)。然而，它在小腦和腦幹中保持在相同水平。
rAAVhu68.hGALC投予於周圍神經減少神經炎症(圖50)。當與PBS處理的twi/twi 小鼠相比，rAAVhu68.hGALC投予不會抑制神經炎症(圖54)。hGALC在皮質、海馬迴神經元中強表現，小腦浦金埃氏神經元有少量陽性染色，但投予rAAVhu68.hGALC的twi/twi小鼠腦幹無明顯染色(圖55)。在野生型和twi/twi PBS處理的小鼠的腦中未觀察到陽性染色。
實施例 7- 骨髓移植合併 rAAVhu68.hGALC 投予的效果
此研究調查rAAVhu68.hGALC及骨髓移植(BMT)雙重療法的潛在效益。由於克拉培氏病顯著的神經炎症成分，因而探討此合併療法。理論上，具有協同作用，因為HSCT在CNS中提供GALC酶的另一種來源(來自移植細胞所衍生之巨噬細胞/小神經膠質細胞及經rAAVhu68.hGALC轉導的神經元)，而rAAVhu68.hGALC提供PNS之矯正，不受HSCT的影響。此外，此研究亦審查不同的組合治療的設計以評估rAAVhu68.hGALC在以下患者中是否有效：1)先通過NBS方案接受HSCT，然後進行基因療法的患者，及/或2)如果符合條件，先接受基因療法然後接受HSCT的患者。
合併療法研究總結於下表。
表.小鼠中AAV及BMT合併療法之研究
組別 基因型 N 處理#1 時間點 處理#2 時間點 基本原理
1 twi/twi 13 BMT PND 10 - - 評估BMT單一療法的功效
2 twi/twi 7 rAAVhu68.hGALC PND 0 BMT PND 10 在新生的症狀發生前的小鼠中評估以rAAVhu68.hGALC治療之後儘早進行BMT的療效
3 twi/twi 7 BMT PND 10 rAAVhu68.hGALC PND 12 評估BMT之後進行rAAVhu68.hGALC治療的療效；在先導實驗中，發現PND 10是BMT最早的時間點，因為硫酸布他卡因(busulfan)調理對重量小於4 g的小鼠有毒
4 twi/twi TBD rAAVhu68.hGALC PND 12 BMT PND 28 在疾病進展較晚階段的早期有症狀小鼠中評估rAAVhu68.hGALC治療之後進行BMT的療效
5 twi/twi 12 rAAVhu68.hGALC PND 0* - - 對照組：在症狀發生前之小鼠中的rAAVhu68.hGALC單一療法
6 twi/twi 13 rAAVhu68.hGALC PND 12* - - 對照組：在早期有症狀的小鼠中的rAAVhu68.hGALC單一療法
7 twi/twi 12 PBS * - - 對照組：僅以媒液治療
以劑量為1.00 x 1011 GC投予rAAVhu68.hGALC。 所有接受BMT的小鼠在BMT程序開始前1-2天亦以硫酸布他卡因進行完全骨髓抑制調理(myeloablative conditioning)，以減少內源性骨髓細胞的數量。 *歷史對照組用於這些組別。組別5是來自研究1的歷史對照組。組別6是來自研究2的歷史對照組。組別7是來自研究1 N=8隻小鼠(PND 0)與研究2 N=4隻小鼠(PND 12)所構成的歷史對照組。縮寫 ：AAV，腺相關病毒；BMT，骨髓移植；GC，基因體拷貝；PBS，磷酸鹽緩衝鹽水；PND，出生後日數；TBD，待確定。
使用1.00x1011 GC的rAAVhu68.hGALC劑量是因為預期由於合併療法所致之更好反應，該合併療法允許比先前rAAVhu68.hGALC單一療法研究中所使用更低的rAAVhu68.hGALC劑量。就存活、體重及神經系統觀察(例如，是否有震顫和異常緊握反射)方面評估rAAVhu68.hGALC的功效。
組別1-3的存活數據如圖56A及圖56B所示。迄今為止，症狀發生前的特威徹小鼠(twi/twi )在PND 0以ICV投予rAAVhu68.hGALC治療之後在PND 10進行BMT的組合(組別2)上，可達到最佳的存活。在沒有明顯症狀下，存活延長至＞300天。基於先前所述的臨床評估，這些小鼠呈現更好的身理狀況，顯示出輕微的震顫，沒有明顯的步態異常，亦無緊握(分析仍在進行；數據未顯示)。在rAAVhu68.hGALC之前接受BMT的小鼠(組別3)目前仍存活(N=3/7)，但牠們顯示出明顯的震顫，某些步態異常和較低的體重。然而，硫酸布他卡因調理療法與BMT結合使用對10日齡以下的年輕小鼠具有毒害，且在組別2及3中的小鼠在BMT之前或之後不久均顯示出死亡率增加，而與合併療法的順序無關。組別4被注射以模仿將基因療法投予至早期有症狀的患者之後進行BMT的臨床相關情況。
總之，這些數據表明，在克拉培氏病的鼠類模型中，將rAAVhu68.hGALC治療與隨後的BMT結合可能比單獨的各種治療提供更高的效果。
實施例 8-rAAVhu68.hGALC 於腦室內投予於特威徹 (twi/twi ) 小鼠後確定最小有效劑量 (MED) 的功效
本藥理學研究的目的是確定腦室內(ICV)投予AAVhu68.CB7.CI.GALC.rBG(rAAVhu68.hGALC)後嬰兒克拉伯病之特威徹小鼠模型中的最小有效劑量(MED)和轉基因表現水平。
生活中的評估包括每天進行的觀察、生存監測、體重測量、神經系統檢查、神經運動功能評估(旋轉桿)和血清轉基因表現(GALC酶活性)的評估。在投予當天(PND 12-14 [未治療的基線群])、投予後4週(PND 40-42 [PND 40群])和人道終點，對未治療的小鼠進行屍體剖檢，以評估存活率(至多twi/twi 小鼠投予後10週[存活群])。在屍體剖檢，收集一份完整的組織清單用於組織病理學評估。收集大腦、脊髓和坐骨神經的樣本用於評估髓鞘化(勒克司堅牢藍[LFB]染色)以及球狀細胞浸潤和神經炎症(過碘酸希夫[PAS]染色和IBA1免疫組織化學)。收集大腦、周圍器官和血清用於轉基因表現分析(GALC酶活性)。收集血液以進行全血細胞計數(CBC)，並進行分類和血清臨床化學分析。
在編入時(PND 12-14)，將一窩小鼠隨機分配到治療組。選擇動物的年齡來模擬早期症狀患者的疾病階段。由於研究的規模和幼仔出生日期的不可預測性，幼仔在可用時被注射，隨機化過程如下：當幼仔可用時，將交配籠卡編號輸入隨機列表生成器。然後將隨機列表按升序分配給研究組(第一個編號分配給第1組，第二個編號分配給第2組，依此類推，直到所有組都被編入)。隨機化列表保存在研究活頁夾中。較早編入的動物被分配到每組中的存活群，而後來編入的小鼠則被分配到PND 40群。在斷奶前死亡率的情況下(有適當的理由)，根據研究負責人的判斷更換動物。
分組後，每隻動物(未經治療的基線對照除外)接受以下治療之一的單次ICV注射： ●    rAAVhu68.hGALC(試驗物)，劑量為6.8 x 109 GC/動物 ●    rAAVhu68.hGALC(試驗物)，劑量為2.0 x 1010 GC/動物 ●    rAAVhu68.hGALC(試驗物)，劑量為6.8 x 1010 GC/動物 ●    rAAVhu68.hGALC(試驗物)，劑量為2.0 x 1011 GC/動物 ●    ITFFB(對照品)
下表列出了組別名稱、劑量水平及投予途徑(ROA)。
表.組別、劑量水平、及投予途徑
組別 編號 N及性別 基因型a 處理 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦)b 劑量體積 (μL) ROA 投劑日 屍體剖檢群
1 3M、3F twi/twi 未處理 N/A N/A N/A N/A N/A PND 12–14
2 3M、3F WT 未處理 N/A N/A N/A N/A N/A PND 12–14
3a 4M、5F twi/twi ITFFB N/A N/A 4.0 ICV PND 12-14 PND 40-42
3b 4M、5F twi/twi ITFFB N/A N/A 4.0 ICV PND 12-14 存活
4a 2M、7F WT ITFFB N/A N/A 4.0 ICV PND 12-14 PND 40-42
4b 5M、3F WT ITFFB N/A N/A 4.0 ICV PND 12-14 存活
5a 5M、3F twi/twi rAAVhu68.hGALC 2.0 x 1011 5.0 x 1011 4.0 ICV PND 12-14 PND 40-42
5b 6M、3F twi/twi rAAVhu68.hGALC 2.0 x 1011 5.0 x 1011 4.0 ICV PND 12-14 存活
6a 6M、3F twi/twi rAAVhu68.hGALC 6.8 x 1010 1.7 x 1011 4.0 ICV PND 12-14 PND 40-42
6b 5M、3F twi/twi rAAVhu68.hGALC 6.8 x 1010 1.7 x 1011 4.0 ICV PND 12-14 存活
7a 3M、5F twi/twi rAAVhu68.hGALC 2.0 x 1010 5.0 x 1010 4.0 ICV PND 12-14 PND 40-42
7b 5M、4F twi/twi rAAVhu68.hGALC 2.0 x 1010 5.0 x 1010 4.0 ICV PND 12-14 存活
8a 5M、3F twi/twi rAAVhu68.hGALC 6.8 x 109 1.7 x 1010 4.0 ICV PND 12-14 PND 40-42
8b 5M、5F twi/twi rAAVhu68.hGALC 6.8 x 109 1.7 x 1010 4.0 ICV PND 12-14 存活
a        twi等位基因由Galc 基因中的功能喪失突變組成。b        使用0.4 g腦質量為幼年/成年小鼠計算值。縮寫： F，雌性；Galc ，半乳糖基神經醯胺酶(基因，小鼠)；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ID，識別號；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；M，雄性；N，動物數；N/A，不適用；PND，出生後日數；ROA，投予途徑；twi ， 特威徹對偶基因；WT，野生型。
在PND 40群中，一隻twi/twi 小鼠投予載體(動物1074；組3a；N=1/9)在PND 38時因疾病進展而實施安樂死，根據研究定義的體重減輕達到20%安樂死標準。PND 40群中的所有其它動物都在預定的屍體剖檢中存活。
在存活群，所有媒液處理的野生型小鼠(N=8/8)都存活到研究終止，而大多數rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠(N=34/36)和媒液處理的twi/twi 對照(N=8/9)根據研究定義的安樂死標準被安樂死。所有安樂死的twi/twi 小鼠都表現出疾病進展的跡象。在剩餘的小鼠中，發現2/36 rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠和1/9媒液處理的twi/twi 小鼠死亡。發現動物1071(rAAVhu68.hGALC，2.0 x 1010 GC；第7b組)在PND23(治療後11天)死亡，可能是由於斷奶後未能茁壯成長。發現動物1053(rAAVhu68.hGALC，2.0x1011 GC；第5b組)在PND23(治療後11天)死亡，發現動物 1062(ITFFB；第3b組)在PND21(治療後第7天)死亡；然而，無法確定這兩隻老鼠的死因。
累積地，與媒液處理的twi/twi 對照組相比，以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)投予rAAVhu68.hGALC導致twi/twi 小鼠的存活顯著的劑量依存性增加(圖57)。媒液處理的twi/twi 對照組的中位存活年齡為40.5天，而rAAVhu68.hGALC處理的小鼠表現出與劑量相關的存活增加。在rAAVhu68.hGALC治療的動物中，中位存活年齡為44.5天(6.8x109 GC)、48天(2.0x1010 GC)、56.5天(6.8x1010 GC)、或70天(2.0 x1011 GC)。所有媒液處理的WT小鼠都存活到研究終點，並在 125天的中位年齡被安樂死。
在整個研究過程中沒有發現與 rAAVhu68.hGALC相關的臨床異常。
在研究過程中發現以下三隻twi/twi 小鼠死亡： ● 發現動物1071(rAAVhu68.hGALC，2.0 x 1010 GC；第7b組)在PND 23(投劑後11天)死亡。在PND 22前一天(投劑後10天)，注意到該動物與其同籠飼養動物相比表現出較小的體型(＜5g)、嗜睡和駝背姿勢。由於未觀察到與疾病相關的神經系統體徵(例如，震顫或共濟失調)，且組織病理學未發現任何重大發現，因此認為死因是斷奶後未能茁壯成長。 ● 動物1053(rAAVhu68.hGALC，2.0x1011 GC；第5b組)在前一天表現出類似癲癇發作的行為(強直陣攣活動伴多動)後，在PND 23(治療後11天)被發現死亡。除了預期的疾病相關的坐骨神經和小腦白質中的脫髓鞘化和球狀細胞浸潤外，動物1053的組織病理學沒有大體或微觀發現。由於癲癇樣活動不是twi/twi小鼠的記錄表型，動物1053的死因尚未確定，儘管不能排除可能與ICV程序相關的病因。 ● 發現動物1062(ITFFB；第3b組在組織病理學報告中鑑定為M34-3F，因為它在微晶片植入之前死亡)在PND 21(治療後7天)時死亡。沒有發現臨床異常，且組織病理學顯示，除了預期的疾病相關的CNS中的脫髓鞘化外，其它沒有顯著發現。動物1062的死因尚未確定。
PND 40和存活群中剩餘的rAAVhu68.hGALC處理(N=67/69)及媒液處理(N=17/18)twi/twi 小鼠表現出與克拉培氏病表型相關的臨床症狀，包括震顫、共濟失調、後肢無力、後肢麻痺、脊柱後彎及/或體重減輕。這些動物在PND 40的預定屍體剖檢時安樂死，或在滿足研究定義的安樂死標準後由於疾病進展而出於人道原因實施安樂死。
當與從PND 21-22(斷奶)到PND 41-42的性別匹配媒液處理的twi/twi 小鼠的體重相比，以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)投予rAAVhu68.hGALC導致雄性和雌性twi/twi 小鼠體重減輕的顯著劑量依賴性挽救(圖58A及圖58B)。
在存活群中，雖然所有twi/twi 小鼠組在PND 41-42後均表現出體重下降，但體重減輕率與劑量成反比，rAAVhu68.hGALC的較高劑量導致通常較慢的身體twi/twi 小鼠的體重減輕。研究中未發現與體重相關的性別差異(圖59A及圖59B)。
以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致總臨床評分顯著劑量依賴性降低-與從PND 21-22(斷奶)到 PND 41-42的媒液處理的twi/twi 小鼠相比。臨床嚴重程度評分的顯著降低表明在rAAVhu68.hGALC投予後克拉培氏病相關臨床表型有所改善(圖60)。
在存活群中，雖然所有twi/twi 小鼠組在人道安樂死前PND 41-42後臨床嚴重程度評分逐漸增加，但增加率與劑量呈負相關，較高劑量的rAAVhu68.hGALC導致twi/twi 小鼠的臨床嚴重程度評分增加通常較慢。在rAAVhu68.hGALC的最高劑量(2.0x1011 GC)下，twi/twi 小鼠在人道安樂死時達到顯著低於媒液處理的twi/twi 小鼠的峰值臨床嚴重程度評分，表明總體臨床嚴重性評分更佳的人道終點條件(圖61)。
旋轉桿試驗評估了神經運動功能，該試驗通過測量在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的小鼠的落下時間來評估協調和平衡。落下潛時減少表明神經運動功能受損，而落下潛時增加表明神經運動功能改善。以6.8x1010 GC或2.0x1011 GC的劑量向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致在PND 35-37上與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，落下潛時呈劑量依賴性增加(治療後3週)，這表明rAAVhu68.hGALC投予後神經運動功能得到改善(圖62)。
在血清中，與於PND 35-37(處理後3週)媒液處理的twi/twi小鼠相比，以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致GALC酶活性顯著劑量依賴性增加。此外，所有劑量的rAAVhu68.hGALC(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)都將GALC酶活性增加到媒液處理的野生型水平或更高(圖63)。
在大腦中，與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)投予rAAVhu68.hGALC導致GALC酶活性顯著的劑量依賴性增加。此外，此等劑量的rAAVhu68.hGALC(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0 x 1011 GC)將twi/twi 小鼠的平均GALC酶活性增加至高於媒液處理的野生型對照的水平(圖64)。
在心臟中，以所有劑量(6.8x109 GC、2.0 x 1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)投予rAAVhu68.hGALC導致GALC酶活性與媒液處理的twi/twi 小鼠(圖65A)。
在四頭肌中，與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0 x 1011 GC)投予 rAAVhu68.hGALC導致GALC酶活性顯著的劑量依賴性增加(圖67A及圖67B)。於肝臟(圖65C)、肺臟、及橫膈膜(圖66C)，與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以兩種最高劑量(6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致GALC酶活性的顯著劑量依賴性增加。
在腎臟中，與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以2.0x1011 GC的最高劑量向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致GALC酶活性顯著增加(圖65B)。
與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，在任何劑量的rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠的脾臟中均未觀察到GALC酶活性增加(圖65D)。然而，應該注意的是，已知用於該測定的人工螢光受質會與其他胞溶體酶反應，如β-半乳糖苷酶。由於媒液處理的twi/twi 小鼠的脾臟和腎臟中的背景GALC酶活性都很高，因此這些器官中可能存在非特異性活性。
當將rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠中基因產物表現與媒液處理的野生型對照組比較時，於twi/twi 小鼠中平均GALC酶活性恢復至野生型水平或更高，在心臟及四頭肌中為所有劑量之rAAVhu68.hGALC下(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC)；於腦及橫膈膜為最高的三個劑量下(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC)；於脾臟為最高的兩個劑量下(6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)；及於肝臟及肺臟為最高劑量下(2.0x1011 GC)(圖65C及圖66A)。
沒有與rAAVhu68.hGALC治療相關的毒性。由於twi/twi 小鼠模型的表型會因後腿麻痺(雙後腿麻痺/拖拽)而導致嚴重的行走困難，此等動物由於無法接近食物及而表現出身體消瘦和無法茁壯成長。在臨床病理參數中注意到與twi/twi 表型相關的幾種異常，包括淋巴細胞計數、天門冬胺酸轉胺酶(AST)、膽紅素、丙胺酸轉胺酶(ALT)、葡萄糖、澱粉酶、三酸甘油酯。此外，藉由rAAVhu68.hGALC投予而校正了一些異常。本節僅討論表型或rAAVhu68.hGALC校正的參數。
在基線時，未處理的twi/twi 小鼠表現出與未處理的WT對照相似的淋巴細胞計數。然而，在PND 40及人道終點，如預期的那樣，與媒液處理的野生型對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出淋巴細胞(淋巴細胞減少症)的顯著減少。相比之下，以2.0x1010 GC、6.8 x 1010 GC或2.0x1011 GC的劑量向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC，可使淋巴細胞計數常規化至與藉由PND 40-42(處理後4週)進行媒液處理的野生型對照組相似的水平。於人道終點，於twi/twi 小鼠，所有劑量之rAAVhu68.hGALC(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC)常規化淋巴球計數至進行媒液處理的野生型對照組相似的水平(圖67A及圖67B)。
在基線時，未處理的twi/twi 小鼠和未處理的WT對照組之間的血清AST水平似乎相似，儘管未處理的twi/twi 組中的低樣本數量排除了統計分析。在PND 40時，與媒液處理的WT對照組相比，媒液處理的twi/twi 小鼠的AST水平增加，而所有rAAVhu68.hGALC處理組表現出與媒液處理的WT對照相似的AST水平。於人道終點，媒液處理的twi/twi 小鼠的AST水平與媒液處理的WT對照相當，而投予rAAVhu68.hGALC之劑量為6.8x109 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC的twi/twi 小鼠的AST水平增加，當與媒液處理的WT對照相比時(圖68A及圖68B)。在PND 40和人道終點觀察到的AST升高似乎主要是由於少數異常值。雖然研究中沒有動物，包括AST水平升高的異常值，在組織病理學上表現出可以解釋這些升高的肝臟損傷，但不能排除與治療相關的影響。然而，因為媒液處理的twi/twi 小鼠於PND 40時亦顯示出升高的AST水平，最可能的解釋是這是一種與表型相關的異常。
在基線時，未處理的twi/twi 小鼠和未處理的WT對照組之間的總膽紅素水平似乎相似，儘管未處理的twi/twi 組中的低樣本數量排除了統計分析。在PND 40時，當與媒液處理的WT對照組相比，媒液處理的twi/twi 小鼠和以2.0x1010 GC的劑量之rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠的膽紅素水平增加。於人道終點，當與媒液處理的WT對照組相比時，媒液處理的twi/twi 小鼠和以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC和2.0 x 1011 GC)的rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠的膽紅素水平增加(圖68C及圖68D)。研究中沒有動物在組織病理學上表現出可以解釋總膽紅素升高的肝臟損傷。因此，需要注意的是，最低rAAVhu68.hGALC劑量組(6.8x109 GC)的PND 40群中樣本數量不足，排除了統計分析，膽紅素水平升高可能與twi/twi 小鼠表型有關，並且在兩個最高rAAVhu68.hGALC劑量組(6.8x1010 GC和2.0x1011 GC)中，PND 40的膽紅素水平常規化為劑量相關的治療效果。
在基線時，未處理的twi/twi 小鼠和未處理的WT對照組之間的丙胺酸轉胺酶(ALT)水平似乎相似，儘管未處理的twi/twi 組中的低樣本數量排除了統計分析。於PND 40時，所有媒液處理組和rAAVhu68.hGALC處理組的twi/twi 小鼠表現出與媒液處理的WT對照組相似的ALT水平。在人道終點，當與媒液處理的WT對照組相比，媒液處理的twi/twi 小鼠和6.8x109 GC、6.8x1010 GC和2.0x1011 GC的劑量之rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠的ALT水平增加(圖69A及圖69B)。研究中沒有動物在組織病理學上表現出可以解釋ALT升高的肝臟損傷。因此，在人道終點在twi/twi 小鼠中觀察到的ALT升高可能與twi/twi 小鼠表型有關，並且似乎不受rAAVhu68.hGALC投予的影響。
在基線時，未處理的twi/twi 小鼠和未處理的WT對照組之間的葡萄糖水平似乎相似，儘管未處理的twi/twi 組中的低樣本數量排除了統計分析。於PND 40，媒液處理的twi/twi 小鼠及投予劑量2.0x1010 GC之 rAAVhu68.hGALC的twi/twi 小鼠，展現出葡萄糖水平減少，當與媒液處理的WT對照組相比，而兩個最高rAAVhu68.hGALC劑量組(6.8x1010 GC和2.0x1011 GC)中的葡萄糖水平似乎與媒液處理的WT對照組相似。在人道終點，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠和twi/twi 小鼠投予最高劑量的rAAVhu68.hGALC(2.0x1011 GC)表現出降低的葡萄糖水平，而其餘的rAAVhu68.hGALC劑量組(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC)表現出的葡萄糖水平與媒液處理的WT對照組相似(圖70A及圖70B)。
由於小鼠在屍體剖檢採血前並未禁食，因此這一發現的意義尚不清楚。由於與WT對照組相比，在PND 40和人道終點處，媒液處理的twi/twi 小鼠展現葡萄糖水平的降低，此一發現可能與餵養困難有關，由於進行性運動失調，twi/twi 小鼠時於接近人道終點展現。因此，需要注意的是，最低rAAVhu68.hGALC劑量組(6.8x109 GC)的PND 40群中樣本數量不足，排除了統計分析，在twi/twi 小鼠中，在兩個最高劑量的rAAVhu68.hGALC(6.8x1010 GC和2.0x1011 GC)下葡萄糖水平的常規化可能代表PND 40時的劑量相關治療效果。目前尚不清楚這種治療效果是否會持續到twi/twi 小鼠的人道終點，因為劑量依賴性效果不明顯。
在基線時，未處理的twi/twi 小鼠和未處理的WT對照組之間的澱粉酶水平似乎相似，儘管未處理的twi/twi 組中的低樣本數量排除了統計分析。在PND 40時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠和所有rAAVhu68.hGALC劑量組觀察到相似的澱粉酶水平。在人道終點，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠和twi/twi小鼠投予6.8x1010 GC劑量之rAAVhu68.hGALC者表現出澱粉酶水平升高，而其餘的rAAVhu68.hGALC劑量組(6.8x109 GC、2.0x1010 GC 和2.0x1011 GC)表現出與媒液處理的WT對照相似的澱粉酶水平(圖70C及圖70D)。由於媒液處理的twi/tw 小鼠在人道終點表現出高於WT水平的澱粉酶升高，此一發現可能與餵養困難有關，由於進行性運動失調，twi/twi小鼠時於接近人道終點展現。在大多數rAAVhu68.hGALC劑量組(6.8x109 GC、2.0x1010 GC或2.0x1011 GC)中，人道終點的澱粉酶水平的常規化很可能反映了治療相關效應。
在基線時，未處理的twi/twi 小鼠和未處理的WT對照組之間的三酸甘油酯水平似乎相似，儘管未處理的twi/twi組中的低樣本數量排除了統計分析。在PND 40時，與媒液處理的WT對照相比，投予2.0x1010 GC的rAAVhu68.hGALC劑量的twi/twi 小鼠的三酸甘油酯水平降低。在人道終點，在媒液處理的twi/twi 小鼠和投予兩種最高劑量rAAVhu68.hGALC(6.8x1010 GC和2.0x1011 GC)的twi/twi 小鼠中觀察到三酸甘油酯水平降低。由於小鼠在屍體剖檢採血前並未禁食，因此這一發現的意義尚不清楚。與WT小鼠的水平相比，在人道終點觀察到的媒液處理的twi/twi 小鼠中三酸甘油酯水平降低可能與餵養困難有關，由於進行性運動失調，twi/twi小鼠時於接近人道終點展現。在PND 40或人道終點未觀察到rAAVhu68.hGALC對三酸甘油酯水平的明顯治療相關影響，由於三酸甘油酯的減少與劑量不相關。
在本研究中評估的腦、脊髓、坐骨神經或任何內臟器官中均未發現與rAAVhu68.hGALC相關的毒性。
rAAVhu68.hGALC在twi/twi 小鼠中治療克拉培氏病相關病理的功效係藉由與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，所有rAAVhu68.hGALC處理組的神經系統中髓磷脂丟失和球狀細胞浸潤的顯著或趨勢減少(校正)來證明。雖然沒有明顯的劑量效應，但接受最高rAAVhu68.hGALC劑量(2.0x1011 GC)，至較少範圍，次高rAAVhu68.hGALC劑量(6.8x1010 GC)的小鼠，與較低劑量相比通常在顯微鏡下表現出更顯著的校正twi/twi 疾病表型。
於基線(PND 12-14)，未處理的twi/twi 小鼠存有球狀細胞。與腦相比，嚴重程度通常從極小到輕微，在脊髓和周圍神經中更為明顯。這一發現表明，在投予rAAVhu68.hGALC時，疾病相關病理已經存在。在PND 40(處理後4週)和存活群安樂死的人道終點(twi/twi 小鼠處理後長達10週)，於幾個神經解剖學區域(腦、脊髓及/或坐骨神經)中當與媒液處理的twi/twi 對照的結果相比，rAAVhu68.hGALC處理的twi/twi 小鼠展現脫髓鞘化和球形細胞浸潤減少。值得注意的是，與媒液處理的twi/twi 對照相比，於PND 40及人道端點，所有劑量的rAAVhu68.hGALC(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC和2.0x1011 GC)都減少了大腦白質中的脫髓鞘化和球狀細胞浸潤。與媒液處理的twi/twi 對照相比，兩種最高劑量的rAAVhu68.hGALC(6.8x1010 GC和2.0x1011 GC)在PND 40時減少了坐骨神經中的脫髓鞘化和球狀細胞浸潤。與媒液處理的twi/twi 對照相比，最高劑量的rAAVhu68.hGALC(2.0x1011 GC)在PND 40時減少了脊髓中的脫髓鞘化和球狀細胞浸潤。
組織病理學未發現小鼠肝臟中的任何顯著病變，可以解釋觀察到的肝臟相關臨床病理參數的變化。肝臟中唯一顯著的發現是rAAVhu68.hGALC投予後肝臟微空泡的改善。在存活群中，媒液處理的twi/twi 小鼠沒有表現出肝細胞空泡化(0級)，而所有媒液處理的WT小鼠都表現出輕度至中度的微泡空泡化(2級至3級)。以所有劑量(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致大多數動物的微空泡增加，達到與媒液處理的WT對照相當的水平(圖71)。肝細胞空泡化通常是由於三酸甘油酯和酐醣生理儲備的存在。媒液處理的twi/twi 小鼠中沒有空泡形成可能是由於在人道終點的消耗表型的結果導致缺乏三酸甘油酯及/或酐醣儲備。rAAVhu68.hGALC處理後空泡形成的增加可能反映了在所有劑量之rAAVhu68.hGALC(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC)之消瘦表型的改善。肝臟微空泡的改善似乎沒有出現劑量依賴性。
發現三隻小鼠死亡，包括動物1071(rAAVhu68.hGALC，2.0x1010 GC；第7b組；PND 23，處理後11天)、動物1053(rAAVhu68.hGALC，2.0 x 1011 GC；第5b組；PND 23，處理後11天)、及動物1062(ITFFB；第3b組；PND 21，處理後7天)。除了twi/twi 小鼠表型典型的CNS和PNS中的脫髓鞘化和球狀細胞浸潤的發現外，沒有注意到其它大體或微觀異常。這些死亡的原因尚未確定；然而，不能排除動物1053(rAAVhu68.hGALC，2.0x1011 GC；第5b組)的程序相關原因，其在死亡前1天表現出癲癇發作。
對腦(皮質、小腦、腦幹)、脊髓(頸、腰、胸)和坐骨神經進行IBA1免疫組織化學，以觀察CNS和PNS中的球狀細胞。使用影像分析軟體測量個別IBA1陽性細胞的大小(平均目標面積)。預計IBA1陽性細胞的大小會隨著疾病表型的改善而減少。
在皮質中，未處理的twi/twi 小鼠中IBA1陽性細胞的大小與基線時未處理的WT小鼠的大小相似。在PND 40時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以三種最高劑量(2.0x1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致IBA-1陽性細胞大小的顯著劑量依賴性減少。值得注意的是，在rAAVhu68.hGALC的兩個最高劑量(6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)，IBA-1陽性細胞的大小與媒液處理的WT對照的大小相似。在人道終點(存活群)，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。向twi/twi 小鼠投予所有劑量之rAAVhu68.hGALC(6.8x109 GC、2.0x1010 GC、6.8x1010 GC、或2.0x1011 GC)，於媒液處理的twi/twi 小鼠相比，造成IBA-1-陽性細胞大小為顯著且一般劑量依賴的減少(圖72A-圖72C)。
在小腦中，未處理的twi/twi 小鼠中IBA1陽性細胞的大小與基線時未處理的WT小鼠的大小相似。在PND 40時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/tw i小鼠相比，於任何劑量向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC不會減少IBA-1陽性細胞大小。在人道終點(存活群)，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以最高劑量(2.0x1011 GC)向twi/twi小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致IBA-1陽性細胞大小的顯著增加(圖72D-圖72F)。
在腦幹中，未處理的twi/twi 小鼠中IBA1陽性細胞的大小與基線時未處理的WT小鼠的大小相似。在PND 40時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以二種最高劑量(6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致IBA-1陽性細胞大小的顯著降低。在人道安樂死時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，於任何劑量向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC不會減少IBA-1陽性細胞圖大小(圖73A-圖73C)。
在脊髓中，未處理的twi/twi 小鼠中 IBA1陽性細胞的大小與基線時未處理的WT小鼠的大小相似。在PND 40時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以三種最高劑量(2.0 x 1010 GC、6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致IBA-1陽性細胞大小的顯著減少。在人道終點(存活群)，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，於任何劑量向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC不會減少IBA-1陽性細胞圖大小(圖73D-圖73F)。
在坐骨神經中，未處理的twi/twi 小鼠中的IBA1陽性細胞的大小顯著大於基線時未處理的WT對照的大小。在PND 40時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠仍表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以二種最高劑量(6.8x1010 GC或2.0x1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致IBA-1陽性細胞大小的顯著降低。在人道安樂死時，與媒液處理的WT對照相比，媒液處理的twi/twi 小鼠表現出明顯更大的IBA-1陽性細胞。與媒液處理的twi/twi 小鼠相比，以最高劑量(2.0 x 1011 GC)向twi/twi 小鼠投予rAAVhu68.hGALC導致IBA-1陽性細胞大小的顯著減少(圖此外，在最高劑量的rAAVhu68.hGALC(2.0x1011 GC)下，IBA-1陽性細胞在PND 40和人道安樂死時均接近媒液處理的WT大小(圖74A-圖74C)。
總而言之，MED被確定為2.0x1010 GC(5.0 x 1010 GC/g腦)，因為該劑量顯著改善了生存、身體消瘦/發育不良(體重減輕)、克拉培氏病相關的臨床症狀(臨床評估評分)，表型淋巴細胞減少症(其可能表明自主神經元變性減少)。該劑量減少腦中的脫髓鞘化、球狀細胞浸潤和神經炎症(LFB/PAS半定量評分)，並降低腦和脊髓中的球狀細胞大小(IBA-1 IHC定量)。該劑量也是導致腦中轉基因產物表現(GALC活性)顯著增加的最小劑量，腦為關鍵的目標組織。
實施例 9-AAV 媒介的基因療法治療克拉培氏病犬的療效 - 經由腦大池注射 rAAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG
儘管特威徹小鼠為一種信息豐富的疾病模型，但確實有一些局限性。小鼠僅表現出輕度的CNS受累，這與嬰兒克拉培氏病患者不同，後者表現出更嚴重的腦萎縮脫髓鞘化的CNS特徵。此外，小鼠的小尺寸造成實驗的挑戰。ICV途徑必須用於小鼠，因為它們的小尺寸使得難以經由預期的臨床途徑(ICM)而可靠地注射AAV載體。亦無法從小鼠身上獲得足夠數量的CSF和血液的系列樣本，以進行所有所需的藥理學分析。因此，以rAAVhu68.GALC的治療在較大動物中評估，於克拉培氏病的犬模型中，它可以克服這些技術限制並確認我們的治療方法的可擴展性。
與特威徹小鼠一樣，克拉培氏病犬是一種自然發生的體染色體隱性遺傳疾病模型，源於GALC基因中的自發A到C突變，導致錯義突變(Y158S)。突變的GALC蛋白質具有接近0%的殘留酵素活性，其與嬰兒型克拉培氏病之患者中所觀察到的GALC活性水平相似。儘管異型合子犬不會表現出症狀，但突變的同型合子的犬會受到影響。
克拉培氏病犬表型的進展包括CNS和PNS兩者中鞘胺醇半乳糖苷水平升高、脫髓鞘化、及球狀細胞浸潤，以及相關的行為表型。克拉培氏病犬大約4至6週齡大時出現後肢無力、胸肢辨距不良(thoracic limb dysmetria)和震顫。與嬰兒克拉培氏病患者相似，克拉培氏病犬在症狀出現後表現出持續且快速的神經系統惡化。最終，此等症狀會在8-15週左右發展為以嚴重運動失調、骨盆肢體癱瘓、消瘦、尿失禁和感覺缺陷為特徵的人道終點(Fletcher T.F. & Kurtz H.J.(1972) Am J Pathol.66(2)：375-8；Wenger D.A.(2000) Molec Med Today.6(11)：449-451；Bradbury A.M., et al.(2018) Hum Gene Ther.29(7)：785-801)。
表.克拉培氏病之鼠類及犬隻模型以及與人類早期嬰兒表現的比較
   突變 GALC 活性水平 呈現症狀及演變 病理學
特威徹小鼠 鼠類： G.A1017(W339X) 小於正常的10% ●  於18-22日時抽搐、後肢無力 ●  於40-45日時嚴重體重減輕及麻痺 PNS ＞ CNS
克拉培氏病犬 犬：A.C 473(Y158S) 小於正常的10 % ●  於4-6週時胸肢辨距不良、後肢無力、震顫 ●  大約15週時出現骨盆肢體麻痺、嚴重運動失調、消瘦、尿失禁、感覺障礙 PNS及CNS
人類早期嬰兒 克拉培氏病 各式各樣，最常見的為在內含子10附近開始的30 kb刪除(502T/del) 小於正常的10% ●  6月齡前出現煩躁、痙攣、吞嚥困難 ●  新的里程碑獲得的退化和缺乏、失聰、失明、癲癇、兩年前死亡 PNS及CNS
縮寫 ：A，腺嘌呤；C，胞嘧啶；CNS，中樞神經系統；G，鳥嘌呤；GALC，半乳糖基神經醯胺酶；kb，千鹼基；PNS，周圍神經系統；W339X，在位置339色胺酸改變為終止密碼子；Y158S，在位置158酪胺酸為絲胺酸的取代。
本研究的目的係評估腦大池內(ICM)投予嬰兒克拉培氏病之犬模型後，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG(一種表現犬半乳糖腦苷脂酶(GALC)酶的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體)的功效、藥理學、安全性和生物分布。在2-3週齡時，罹患克拉培氏病的狗接受AAVhu68.cGALCco的單次ICM投予，劑量為3.0x1013 GC，或媒液(鞘內最終製劑緩衝液[ITFFB])投予。野生型同窩仔亦被投予媒液。
生活評估包括籠邊觀察、體重監測、每兩週一次的行為和運動功能監測、身體檢查、標準化神經學檢查、腦髓鞘化評估(通過磁共振成影[MRI]及腦幹聽覺誘發反應[BAER]評估)和周圍神經髓鞘化(通過神經傳導研究[NCS]評估)、CSF神經鞘脂質定量以分析鞘胺醇半乳糖苷的積累(疾病生物標誌物)、血清和CSF中的轉基因產物表現(GALC活性測定)。在處理後6個月(n=2)或在人道終點(n=4)進行屍體剖檢，除了健康野生型未處理的同窩對照，其與最後處理的動物同時安樂死。在屍體剖檢時，從每隻動物獲得組織用於全面的組織病理學檢查和生物分布分析。收集腦組織和周圍神經的樣本以評估髓鞘化和儲存(勒克司藍/過碘酸希夫[PAS]染色)。還收集了腦和脊髓組織的樣本，以量化小膠質細胞的活化和球狀細胞浸潤(IBA1 IHC)。
在這個大型動物模型中可以獲得幾種相關的生物標誌物，以及進行預期臨床投予途徑(ICM)的能力，這使其成為研究基因治療功效的有吸引力的模型。為了防止對外源蛋白的過度免疫反應產生混淆結果，投予編碼GALC犬類版(AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG)的載體。儘管投予的轉基因不同，但載體利用普遍存在的CB7啟動子、與AAVhu68.CB7.CI.hGALCco.rBG相同的AAVhu68衣殼。選擇動物的年齡以確保在行為症狀出現之前治療克拉培氏病犬。此外，此年齡反映了預期的嬰兒患者人群的年齡。
分組後，每隻動物接受AAVhu68.CB7.cGALCco的單次ICM注射，劑量為3x1013 GC/動物或媒液(ITFFB)。下表列出了組別名稱、劑量水平及投予途徑(ROA)。提供研究設計於圖77。
組別 處理 劑量 (GC) ROA GALC 功能喪失 突變狀態a 動物ID 性別 投劑b 預定的屍體剖檢 實際的屍體剖檢 屍體剖檢 的年齡
1 媒液 N/A ICM 同型合子 (克拉培氏病犬) K930 F 研究第0天 研究第70±3天 研究第35天c 8週
K948 M 研究第66天c 12週
2a AAVhu68.cGALCco 3.0 x 1013 ICM 同型合子 (克拉培氏病犬) K938 M 研究第0天 研究第180±3天 研究第181天 28週
K939 F 研究第182天 28週
2b AAVhu68.cGALCco 3.0 x 1013 ICM 同型合子 (克拉培氏病犬) K937 M 研究第0天 長期 研究第261天d 39週
K933 M 研究第572天 85週e
3 媒液 N/A ICM 野生型 K928 F 研究第0天 長期 研究第587天 87週f
a   突變狀態係指犬GALC A.C 473(Y158S)功能喪失突變。GALC功能喪失突變的同型合子動物表現出反映人類克拉培氏病的表型，在文中被稱為克拉培氏病犬。b   投劑時動物為 2-3週齡。c   由於動物符合與疾病進展一致的人道安樂死標準，因此進行了非預定的屍體剖檢。d   由於急性高熱發作和疑似癲癇發作，因此進行了非預定的屍體剖檢。動物沒有表現出與已知的犬克拉培氏病自然史一致的症狀。e   因為實質的體重減少(28%)，因此進行了非預定的屍體剖檢。f    當最後一個治療的動物被安樂死時進行安樂死。 縮寫：AAVhu68.cGALCco，AAVhu68.CB7.CI.cGALCco.rBG；F，雌性；GALC ， 半乳糖基神經醯胺酶(基因，犬)；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ID，識別號；M，雄性；N/A，不適用；ROA，投予途徑；TBD，待確定。
選擇預定的180天屍體剖檢時間點以在固定時間點收集組織，並在治療後6個月和最後一隻接受媒液處理的克拉培氏病犬存活後4個月尋求疾病的生物標誌物。此時間被認為是足夠的時間來測量有意義的疾病相關表型和生物標誌物的最終進展，於與能夠在12週齡前達到人道終點的未治療幼犬進行比較。為了獲得長期追蹤並評估治療的持久性，兩隻狗被編入長期追蹤(治療後多達19個月)。
使用兩週一次的錄影、定期神經學檢查、腦部MRI和電生理學(NCV和BAER)，評估行為和運動功能的進展。初始時間點被設計為捕捉媒液克拉培病犬組中的疾病顯現及進展。每2至3個月對接受處理的克拉培病犬進行定期測試。長期追蹤包括一隻野生型媒液處理的犬，以與處理的動物進行比較。
兩隻接受媒液處理的克拉培氏病犬達到預定義的人道終點，其特徵是於8週齡(動物K930)及12週齡(動物K948)時嚴重的後肢無力和無法站立和行走，這與此疾病的自然歷史一致。
在處理後9個月(38週)的早晨觀察中，發現一隻接受過載體處理的克拉培氏病犬K937側臥，體溫明顯升高(106.4度)。獸醫懷疑癲癇發作並IV投予0.5 mg/kg的Valium，收集血液用於CBC、化學和培養以及CSF進行細胞學檢查。儘管直腸溫度恢復正常，但動物仍然臥著，因此選擇進行安樂死。血液檢查的重要發現包括嗜中性白血球增多症(16,647/μl；與先前測量質相比增加4倍)、輕度淋巴細胞減少(337/μL)、D-二聚體增加(＞5,400 ng/mL；範圍＜250)、纖維蛋白原輕度增加(455 mg/dl；150-400 mg/dL範圍)、AST(184 IU/L；範圍15-66 IU/L)、及BUN(37 mg/dL；範圍6-31 mg/dL)。血培養顯示存在抗二甲苯青黴素表皮葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus epidermidis)。CSF顯示蛋白質水平輕度升高(69mg/dL)，WBC數量較少(每微升2個)且沒有傳染性病原體。病理報告顯示，脫髓鞘化和球狀細胞浸潤之克拉培氏病相關病變不如媒液處理的克拉培氏病犬對照(動物K930和K948)明顯，並且與6個月預定屍體剖檢時間點的2隻處理犬(動物K938和K938)相似。脊髓和周圍神經未顯示脫髓鞘化，暗示治療效果得到維持，並且與該動物在急性高熱發作之前的正常運動功能一致。
動物K937的臨床表現(急性側臥、體溫過高、疑似癲癇發作)不是克拉培氏病的典型表現。臨床病理學和病理學報告與感染性病因相符。血液培養顯示存在抗抗生素的表皮葡萄球菌之生長。此狗的記錄表明，在發熱前8天，由於右前P4爪墊上的磨蝕性病變，其正在接受局部抗生素軟膏治療。然而，不能排除與克拉培氏病腦脫髓鞘化和球狀細胞浸潤相關的疑似癲癇發作。
由於體重減輕，動物K933(AAVhu68.cGALC.co-treatment)在19.5個月大時被安樂死。體重減輕為反覆嘔吐和反流的結果，對症治療沒有反應。在安樂死時最大體重減輕28%之前大約4天進行的X射線顯示與巨型食道相當的氣體膨脹食道。屍體剖檢時，狗出現雙側嚴重增大的唾液腺，此可能可解釋吞嚥困難和反流。最終進行的食道肌電圖顯示沒有去神經支配的跡象(缺乏自發活動)。在安樂死時，行為和運動功能以及神經系統檢查均正常。
兩隻接受媒液處理的克拉培氏病犬達到預定義的人道終點，其特徵是於第35日(8週齡；動物K930)或第66日(12週齡；動物K948)，嚴重的後肢無力和無法站立和行走，這與此疾病的自然歷史一致。相比之下，所有AAVhu68.cGALCco治療的狗(N=4/4)皆保持正常的運動功能，並且沒有達到與後肢麻痺相關的預先定義的人道終點。
所有ICM投予的AAVhu68.cGALCco或媒疫(ITFFB)的動物皆良好地耐受該過程，並順利地從鎮靜中恢復。在研究期間，在投予AAVhu68.cGALCco的動物中沒有與測試物品相關的不良事件。
所有治療犬的生長和體重增加均正常(圖78)。一隻AAVhu68.cGALC.co治療的狗(K933)由於體重減輕而在19.5個月齡(85週)時被安樂死。
所有動物都在開放空間玩耍被錄影以評估它們的行為和運動功能。動物K928、K930、K933的評估開始於12週齡且動物K937、K938、K939、K948的評估開始於3至4週齡。兩隻接受媒液處理的克拉培氏病犬(動物K930和K948)顯示出預期的克拉培氏病相關異常運動功能。動物K930在8週齡時出現頭部和肢體震顫、意向性震顫和嚴重的後肢無力，伴有肌肉萎縮和關節鬆弛，使動物無法站立和行走(人道終點標準)。動物K948在7週齡時開始表現出後肢無力，並在12週時發展為共濟失調、嚴重虛弱和無法站立和行走(人道終點)。
以AAVhu68.cGALCco處理的所有動物在開放遊戲期間表現出與媒液處理的野生型對照相似的正常運動功能，並展示行走、跑步、跳躍和用後肢站立的能力。所有AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(4/4)皆表現出正常行為，與看護者玩耍及尋找/取得玩具，這暗示此處理在研究期間防止了所有動物的克拉培氏病相關表型。
從11週齡開始，在其中一隻接受媒液處理的克拉培氏病犬(動物K948)中觀察到異常神經系統發現，包括全身本體感覺缺陷、運動失調、頭部震顫/軀幹搖擺、肌肉萎縮、缺乏威脅反射(表明疑似失明)和寬底式姿勢(wide-based posture)。觀察後不久就對此動物實施安樂死。另一隻經媒液處理的克拉培氏病犬(動物K930)在第一個預定的神經學評分時間點之前達到人道終點。在整個研究期間，與野生型媒液處理的動物相比，所有AAVhu68.cGALC.co處理的犬(4/4)表現出相似的神經學檢查。
於6週齡(動物K930和K948)及12週齡(動物K948)的媒液處理的克拉培氏病犬的NCV，於所有評估的所有四個神經中通常低於媒液處理的野生型對照(圖79A-圖79D)。兩隻經媒液處理的克拉培氏病犬皆顯著地表現出橈感覺神經中NCV的完全喪失。相比之下，在整個研究過程中，AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬在第180天屍體剖檢(動物K938、K939)、在第261天進行緊急屍體剖檢(動物K937)或正在進行的長期群(動物K933)表現出的NCV類似於媒液處理的野生型對照者。所有處理的犬(4/4)皆具有類似於WT對照之正常的NCV。
BAER記錄的I波和V波之間的峰間潛伏期(IPL)表明腦幹聽覺通路內的傳導潛伏期，如此表明中樞神經傳導。其中一隻經媒液處理的克拉培氏病犬(動物K948)未激起誘發電位(聽力閾值＞90 dB；圖80)。另一隻媒液處理的克拉培氏病犬(動物K930)顯示I-V IPL增加(平均3.275毫秒，與媒液處理的野生型犬平均2.275毫秒相比)。所有處理的克拉培氏病犬4/4)皆具有與媒液處理的野生型犬相似的正常I-V IPL。
在一隻經媒液處理的克拉培氏病犬(動物K948)中無法確定聽力閾值(＞90 dB)，但在另一隻經媒液處理的克拉培氏病犬(動物K930)中與經媒液處理的野生型犬(動物K928)相似(圖81)。在整個研究期間直到在19.5個月(81週)大時被安樂死，所有經處理的克拉培氏病犬的聽力閾值與經媒液處理的野生型犬相似。
在8-10週齡時，媒液處理的克拉培氏病犬(動物K930和K948)表現出比媒液處理的野生型對照更高的累積白質高強度分數，表明髓磷脂喪失。儘管AAVhu68.cGALCco投予並未使累積腦白質高強度評分常規化為媒液處理的野生型動物水平，但所有四隻AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬確實表現出比媒液處理的克拉培氏病犬更低的累積白質高強度評分。該結果表明AAVhu68.cGALCco投予導致克拉培氏病犬腦中髓磷脂的保存。隨後，在61週齡時，AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K933)表現出與8週齡時相似的累積白質高強度評分。AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K933)的得分仍然高於媒液處理的野生型對照(動物K928；圖82A)。
每隻動物個體腦區域的MRI評分顯示，AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬在某些腦區域表現出與媒液處理的野生型對照相當的白質高強度評分(胼胝體和小腦白質中的低強度指示)正常髓鞘化)，同時在其它區域顯示更高的分數(半卵圓形中心、放射冠和枕葉白質中的高強度，表明脫髓鞘化)。這一發現表明治療並沒有同等地校正所有白質區域，可能是由於ICM投予後AAVhu68.cGALCco的分布。均已完全矯正的胼胝體和小腦與CSF密切接觸。此外，在AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬中得到良好校正的腦區域，與8-10週齡的媒液處理的克拉培氏病犬相比，其維持與在61週齡時正常之類似的低強度。
犬CSF中醣神經鞘脂質，包括乳糖神經醯胺(LC)、葡苷基神經醯胺(GluC)、半乳糖基神經醯胺(GalC)、葡萄糖鞘鞍醇(glucosylsphingosine)(GluS)、半乳糖基神經鞘胺醇(GalS)和乳糖基神經鞘胺醇(LS)。其中，與WT相比，在克拉培氏病媒液處理的犬中只有鞘胺醇半乳糖苷(又稱為半乳糖基鞘胺醇)顯示明顯增加。
從處理後第0天到第180天，在媒液處理的野生型犬的CSF中檢測不到鞘胺醇半乳糖苷(圖83)。雖然在基線時(第0天)，兩種接受媒液處理的克拉培氏病犬的CSF中都檢測不到鞘胺醇半乳糖苷，但在第28天，兩隻動物的鞘胺醇半乳糖苷皆升高，且於人道安樂死時(動物K930的第35天和動物K948的第66天)，鞘胺醇半乳糖苷水平進一步增加。在接受媒液處理的克拉培氏病犬中，鞘胺醇半乳糖苷的升高與神經系統症狀的發生和進展相關。
相比之下，對於所有四隻AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬，在大多數時間點都檢測不到鞘胺醇半乳糖苷。一隻動物在評估的所有時間點都表現出不可檢測的鞘胺醇半乳糖苷水平(N=1/4；動物K933)，而在第120天(N=2/4，動物K937和K939)輕度短暫升高或第180天評估的最後時間點輕度升高(N=1/4；動物K938)。所有處理的犬(4/4)在處理後6個月內保持未檢測到非常低的CSF鞘胺醇半乳糖苷水平。
三隻(3/4)AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K938、K938、K939)在注射後2週出現輕度和短暫的淋巴細胞增多症(值從4,674到5,590個細胞/μL)。此一發現可能與處理有關，因為它在媒液處理的克拉培氏病或野生型動物中未觀察到。由於低度提升和瞬態性質，它不被認為是不利的。
沒有凝血參數和血清臨床化學的載體相關修飾。
兩隻AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K933和K938)在注射後4週出現短暫的輕度CSF單核細胞增多症(圖96C)。這一發現與載體相關且不被認為是不利的，因為它為自限性的且不伴隨任何神經系統徵候。在6個月時未觀察到與 AAVhu68.cGALCco遞送相關的組織病理學病變，背根神經節正常，顯示無感覺神經元毒性(圖96D)。
屍體剖檢和組織病理學
用AAVhu68.cGALCco或媒液處理的所有克拉培氏病犬的器官重量與用媒液處理的野生型犬和公佈的值相似。人道終點或預定時間點的屍體剖檢顯示沒有與測試物品相關的肉眼病變。在一隻接受媒液處理的犬(動物K930)中觀察到克拉培氏病相關的肌肉萎縮。在一隻AAVhu68.cGALCco處理犬(動物K933)中觀察到唾液腺增大。
AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K938、K939、K937)與媒液處理的克拉培氏病犬相比，組織學顯示腦、脊髓和周圍神經中的髓鞘化增加及球狀細胞浸潤減少(圖84)。
與增加的髓鞘化和減少的球狀細胞浸潤一致，與媒液處理克拉培氏病犬者相比，腦、脊髓及周圍神經中組織切片的盲法半定量評分顯示，AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K938、K939、K937)的脫髓鞘化平均嚴重程度評分始終較低(圖85A)及球狀細胞浸潤(圖85B)。
在腦中，神經炎症(由IBA1 %面積表示)、球狀細胞浸潤(IBA1 %面積)和球狀細胞儲存(由IBA1+細胞大小表示)，於3/4的AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K937、K938、K939)大腦皮質，1/4的AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K938)胼胝體，2/4的AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(動物K937和K938)半卵圓形中央(centrum semi-ovale)，以及所有4/4的AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病的內囊(internal capsule)和小腦，顯著降低(圖86A及圖86B)。在AAVhu68.cGALCco處理中觀察到的水平與媒液處理的野生型動物相似。存活至19.5個月的AAVhu68.cGALCco處理犬(動物K933)在大腦和小腦的所有區域顯示出正常水平的IBA1，表明治療效果的持久性。此一觀察結果亦表明，其導致體重減輕和安樂死的臨床狀況與CNS疾病進展無關。
在脊髓中，所有狗的胸腰椎段神經炎症(由IBA1 %面積表示)、球狀細胞浸潤(IBA1 %面積)和球狀細胞儲存(由 IBA1+細胞大小表示)均常規化，而頸椎段介於媒液處理的克拉培氏病犬和媒液處理的野生型狗之間(圖87A及圖87B)。這一發現的原因尚不清楚，但可能表明腰椎和胸椎區域的轉基因表現更高。長期9個月和19.5個月齡犬組織的矯正與其他在6個月時安樂死的治療犬相似，顯示出缺乏疾病進展和治療的持久性。
轉基因表現
在坐骨神經中，所有犬的神經炎症(由IBA1%面積表示)、球狀細胞浸潤(IBA1%面積)和球狀細胞儲存(由IBA1+細胞大小表示)均常規化且從6個月(預定的屍體剖檢)到9個月和19.5個月(非預定的屍體剖檢)未顯示疾病進展。
在CSF中，在所有AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(N=4/4)中，在第0天到處理後28天，測量的GALC酶活性可檢測到高於基線水平。對於每隻AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬，在研究持續期間，水平保持在或高於媒液處理的野生型GALC活性水平，包括治療後多至19.5個月。AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬的表現水平在研究期間在大多數動物中保持相對穩定，除了動物K933，其在第28天表現出GALC酶活性的顯著峰值，然後在第100天到19.5個月處理後下降到穩定水平。最後，在第28天和第70天，在人類安樂死之前，所有AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬(N=4/4)的GALC酶活性水平超過媒液處理的對照組(圖88A-圖88B)。
在血清中，AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬表現出的GALC活性水平與媒液處理的克拉培氏病犬和媒液處理的野生型對照相當，且研究中所有動物的GALC活性水平在後續持續時間內保持穩定(至多到處理後18個月)(圖88C及圖88D)。AAVhu68.cGALCco投予後血清GALC活性水平沒有增加可能是由於處理年齡(2-3週齡)，因為已經表明由於器官的細胞分裂和生長而AAV轉導在未成熟動物的肝臟中是不持久的。
在CNS、PNS和周圍組織中，觀察到GALC酶活性的變動性，此可能是由於採樣變動及/或與在組織上進行此測定相關的已知技術限制，此等組織表現其它酶，這些酶可以切割螢光受質並產生背景信號。儘管有此等警告，但與媒液處理的動物相比，ICM投予AAVhu68.cGALCco通常會導致CNS和PNS之關鍵目標組織中GALC酶活性增加。
於CNS(腦及脊髓)，與媒液處理的克拉培氏病犬的GALC活性水平相比，大部分AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬的小腦、額葉皮質、延腦、枕葉皮質、及脊髓(頸椎、胸椎及腰椎)中的GALC活性水平增加(圖89A-圖89G)。
於PNS，與媒液處理的克拉培氏病犬的GALC活性水平相比，大部分AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬的頸椎及腰椎DRG中的GALC活性水平增加。與媒液處理的狗相比，在1/3 AAVhu68.cGALCco處理療犬(動物K939)中檢測到坐骨神經中GALC活性水平略有增加(圖90A-圖90D)。
在周圍器官中，與媒液處理的克拉培氏病犬相比，AAVhu68.cGALCco投予增加了大多數動物的橫膈膜、心臟和腎臟中的GALC活性水平。與媒液處理的克拉培氏病犬比，1/3 AAVhu68.cGALCco處理犬(動物K939)之股四頭肌中觀察到GALC活性增加。與媒液處理的克拉培氏病犬比，AAVhu68.cGALCco投予似乎沒有增加肝臟中的GALC酶活性，此與血清中GALC酶活性的觀察結果一致(圖91C)。
生物分布
在AAVhu68.cGALCco處理的克拉培氏病犬中檢測到載體基因體，在脊髓、腦和背根神經節中觀察到最高的轉導水平(圖92)。周圍器官(肝臟、心臟、腎臟、肌肉)顯示最低轉導。
總之，將AAVhu68.cGALCco之ICM投予2-3週齡的症狀發生前克拉培氏病犬中增加治療克拉培氏病(CNS和PNS組織)的關鍵目標組織中的轉基因產物表現(GALC活性)。轉基因產物亦在CSF中表現，其暗示在CNS和PNS中存在交叉矯正的可能性。AAVhu68.cGALCco投予實質提高了存活率，保留神經運動功能和周圍神經功能，並降低疾病相關生物標誌物(鞘胺醇半乳糖苷)的CSF水平。AAVhu68.cGALCco投予亦防止腦、脊髓及周圍神經中的脫髓鞘化及球狀細胞浸潤。
實施例 10– 於非人類靈長類中之毒物學研究
使用如小鼠MED研究相同的rAAVhu68.hGALC載體進行毒物學研究，並在NHP中進行研究，因為它們可更佳地複製人類的大小及CNS解剖學，並可使用臨床ROA(ICM)進行治療。可預期的是，在大小、解剖學及ROA上的相似性會造成代表性的載體分佈及轉導輪廓，其可允許比可能在小鼠或犬隻中更準確地評估毒性。此外，與囓齒動物或犬隻模型相比，在NHP中可進行更嚴謹的神經學評估，允許更靈敏地檢測CNS毒性。
ICM載體投予於CNS隔室中造成立即的載體分布。劑量按腦質量縮放，其提供CSF隔室大小的近似值。劑量轉換基於新生小鼠的0.15 g腦質量(Gu Z., et al.(2012) PLoS One.7(7)：e41542.)、幼年-成年小鼠的0.4 g腦質量(Gu Z., et al.(2012) PLoS One.7(7)：e41542.)、幼年及成年恒河猴的90 g腦質量(Herndon J.G., et al.(1998) Neurobiol Aging.19(3)：267-72)、犬隻的60 g腦質量、4-12月齡嬰兒的800 g腦質量及成年人類的1300 g腦質量(Dekaban A.S.(1978) Ann Neurol.4(4)：345-56)。用於NHP毒物學研究、鼠類MED研究的劑量及等效的人類劑量顯示於下表。
表.用於鼠類MED研究、NHP毒物學研究的載體劑量及等效犬及人類劑量：
劑量 (GC/g腦質量) 幼年小鼠MED研究(GC) 幼年NHP毒物學研究(GC) 犬(GC) 人類(GC)
5.00 x 1011 2.00 x 1011 4.50 x 1013 3.00 x 1013 4.00 x 1014
1.70 x 1011 6.80 x 1010 1.50 x 1013 - 1.40 x 1014
5.00 x 1010 2.00 x 1010 4.50 x 1012 - 4.00 x 1013
1.70 x 1010 6.80 x 109 - - 1.40 x 1013
縮寫：GC，基因體拷貝；MED，最小有效劑量；NHP，非人類靈長類。
選擇幼年NHP係因為NHP中樞神經系統(CNS)的尺寸作為我們目標臨床人群的代表性模型，並允許我們經由ICM注射使用建議的臨床投予途徑(ROA)投予rAAVhu68.hGALC。此研究設計成提供rAAVhu68.hGALC的ROA相關安全性的關鍵數據。選擇幼年動物來模擬將編入計劃的臨床試驗的兒科族群。
本研究中使用的NHP總數被認為係提供評估rAAVhu68.hGALC在三個劑量水平和兩個屍體剖檢時間點的毒性所需的最小數量，並解釋NHP之間的變異性。
本研究使用一組22隻動物(12隻雄性及10隻雌性)。根據SOP7006將動物分配到本研究中。簡而言之，動物在研究開始前進行額外的測試，包括醫療記錄審查、體檢、體重更新，以及研究主持人要求的任何測試/程序。一旦將動物納入研究，該動物的所有醫療記錄都將作為研究文件的一部分存檔。如果動物不符合分配到研究的資格或被從研究中移除，則在研究主持人的酌情決定和批准下用替代動物替換它們。
分組後，每隻動物接受對照品(ITFFB)或試驗物(rAAVhu68.hGALC)的以下處理之一種的單次ICM注射： 1.)   ITFFB(對照品) 2.)   低劑量之rAAVhu68.hGALC(4.5x1012 GC；試驗物) 3.)   中劑量之rAAVhu68.hGALC(1.5x1013 GC；試驗物) 4.)   高劑量之rAAVhu68.hGALC(4.5x1013 GC；試驗物)
劑量投予日期(第0天)與代表盡可能多的研究組的動物在投予日期之間錯開。研究設計摘述於下。
表.組別、劑量水平、及投予途徑
組別 處理 (劑量) 劑量 (GC) 劑量 (GC/g腦) 動物ID 性別 ROA 投予體積 (mL) 投劑日 屍體剖解日  
1 ITFFB N/A N/A 18-162 雌性 ICM 1.0 0 90±4  
2 載體 (低劑量) 4.5 x 1012 5.0 x 1010 18-168 雌性  
18-173 雌性  
18-091 雄性  
3 載體 (中劑量) 1.5 x 1013 1.7 x 1011 18-167 雄性  
18-176 雄性  
18-187 雌性  
4 載體 (高劑量) 4.5 x 1013 5.0 x 1011 18-080 雄性  
18-166 雄性  
18-185 雌性  
5 ITFFB N/A N/A 18-159 雄性 ICM 1.0 0 180±5  
6 載體 (低劑量) 4.5 x 1012 5.0 x 1010 18-042 雌性  
18-121 雌性  
18-171 雄性  
7 載體 (中劑量) 1.5 x 1013 1.7 x 1011 18-055 雄性  
18-181 雌性  
18-183 雌性  
8 載體 (高劑量) 4.5 x 1013 5.0 x 1011 18-038 雌性  
18-158 雌性  
18-170 雄性  
縮寫： GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ID，識別號；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；N/A，不適用；ROA，投予途徑。
研究事件總結在下表中。
表.研究事件
研究日 基線 (第-28至-1日) 第0日 第 5±2日 第 7±1日 第 14±2日 第 28±3日 第 60±3日 第 90±4日 第 120±4日a 第 150±4日a 第 180±5日a
投劑(載體或ITFFB)    X                           
體重、溫度、呼吸速率、心率 X X    X X X X X X X X
神經學檢查 X          X X X X X X X
感覺神經傳導研究 X             X X X X X X
生物標記(血液)c –轉基因產物表現 X          X X X X X X X
生物標記(CSF)c –轉基因產物表現    X    X X X X X X X X
臨床病理學(血液) X X    X X X X X X X X
臨床病理學(CSF)    X    X X X X X X X X
免疫學：抗衣殼的NAb X             X X X X X X
免疫學：T細胞對衣殼或轉基因的反應 (PBMC上的IFN-γ ELISpot)。 X             X X X X X X
免疫學：T細胞對衣殼或轉基因的反應 (淋巴細胞上的IFN-γ ELISpot)                      Xb       X
載體藥物動力學 (血液及CSF)    X    X X X X X       X
載體排泄 (尿液及糞便) X    X       X X X X X X
屍體剖檢及樣品收集e    Xb    X
a     僅第5–8組(第180±5日屍體剖檢時間點的動物)。b     僅第1–4組(第90±4日屍體剖檢時間點的動物)。c     收集血液和CSF用於評估轉基因產物表現(GALC酶活性測定)和針對轉基因產物的抗體(抗人類GALC抗體 ELISA)。d     從肝臟、脾臟和骨髓獲得淋巴細胞。e     收集樣品用於評估組織病理學、轉基因產物表現(GALC酶活性測定)。收集並儲存組織用於未來的載體生物分布分析。縮寫： CSF，腦脊髓液；ELISA，酵素連結免疫吸附分析法；ELISpot，酵素連結免疫吸附點法；GALC，半乳糖基神經醯胺酶(蛋白質)；IFN‑γ，干擾素γ；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；NAbs，中和抗體；PBMC，周圍血液單核球。
觀察
生存力評估(籠內)
每天目視觀察動物的一般外觀或毒性跡象，包括但不限於神經系統徵象或嗜睡、痛苦和行為變化。將任何異常情況通知臨床獸醫或指定人員和研究主持人。只有在臨床獸醫或指定人員和研究主持人批准後才能進行治療，除非在緊急情況下危及NHP或在無法及時聯繫臨床獸醫和/或研究主持人的情況下對NHP進行人道安樂死。
生活中的檢查
身體檢查
每次麻醉時，對所有動物進行身體檢查。觀察動物在生命體徵、肌肉張力、皮毛和皮膚、眼睛、生殖器等方面的任何異常。所有異常發現立即傳達給研究主持人並記錄。在屍體剖檢時，檢查動物的肉眼異常。注意所有變化。作為預防性健康和群體維護的一部分，動物亦根據SOP 7016接受半年例行體檢。
神經學監測
在上表所示的時間點對動物進行神經學監測。簡而言之，評估分為五個部分，評估以下內容：心理、姿勢和步態、本體感覺、腦神經、及脊髓反射。每次評估的測試都以相同的順序進行。評估者並非形式上對治療組不知情；然而，評估者通常在評估時仍不知悉治療組。根據適用情況為每個評估類別給出數字分數並記錄(正常：1；異常：2；降低：3；增加：4；無：5；N/A：不適用)。
心理狀態
為了評估心理狀態，在檢查員操作之前，於籠邊通過注意動物如何與檢查員和環境相互作用來評估NHP。除了呼吸特徵和努力以及任何過度流淚或流涎之外，還記錄任何變化，如抑鬱、遲鈍、迷失方向或昏迷行為。
姿勢和步態
為了評估姿勢和步態，在檢查員操作之前，於籠邊通過觀察動物在籠中如何移動來評估NHP。記錄任何損傷，如運動失調、輕癱、癱瘓或絆倒/落下/震顫/抽搐/不協調運動。檢查員亦觀察動物的姿勢、頭部位置(頭部傾斜、頭部或頸部轉動)、寬底式姿勢、棲息能力、顫抖或無意運動，並記錄任何異常情況。
本體感覺
本體感受評估為可選的，因為它們只能對受約束的動物進行。通過將動物站立在平坦表面，如桌面上，並將每隻後腳(一次一隻)的背面翻轉到桌面上來評估本體感覺定位。動物應立即矯正腳的位置，並記錄任何延遲的反應及/或未能矯正腳的位置。通過將靈長類動物緩慢地移向具有凸出部分(例如桌面)的平坦表面並使後足的背面接觸表面來評估視覺放置。靈長類動物應該藉由將雙腳的足底放在桌面上來做出反應。除了靈長類動物的眼睛被檢查者的手遮住外，觸覺放置的評估方式與視覺放置相同。
顱神經
顱神經評估是在籠子中藉由利用向後擠壓機制或在籠子外的椅子上進行，同時藉由注意面部/頭部對稱性以及面部和顱骨肌肉張力進行限制。記錄任何異常。威脅反射係藉由將操作者的手伸向靈長類動物的每隻眼睛來評估，注意不要產生氣流或碰觸靈長類動物面部的任何部分。威脅反射測試確定當檢查者的手靠近臉部時動物是否每隻眼睛眨眼，並記錄任何異常。檢查每隻眼睛的對稱性(位置、瞳孔大小和形狀)。通過用雙手遮住眼睛5秒鐘，移開手，然後將光線直接照射到眼睛中以評估瞳孔收縮，使用透射照明器或筆燈評估雙眼的瞳孔光反射。注意到瞳孔反應的對稱性(收縮速度和收縮的總體程度)。通過將棉尖塗抹器接觸到外眥然後接觸內眥來評估雙眼的眼瞼反射。動物應在每次觸摸時眨眼，並記錄任何異常情況。通過用鑷子夾住鼻中隔並確定動物是否對有害刺激作出反應來評估鼻中隔的感覺。在椅子上或手動約束的動物中評估眼睛定位，其中鼻子可以升高而眼睛保持在正常位置。當頭部輕輕地左右移動時，眼睛應該跟隨頭部的運動(眼球震顫)，並記錄任何異常。
脊髓反射
通過評估靈長類動物的肌肉力量來評估脊髓神經/脊髓反射。如果手動約束，則由握住雙後肢(每隻手一肢)的處理者評估肌肉力量，以評估靈長類動物抵抗肢操縱的能力。如果在籠子一側評估肌肉力量，則通過將玩具或其它合適的物體遞給動物並握在其手中，同時檢查員在拉回的同時繼續握住物體來評估肌肉力量。在每種情況下，動物抵抗檢查員行為的能力都被記錄下來。藉由以止血鉗捏住每隻後腳並確定動物是否快速彎曲膝蓋並將其四肢向上拉向身體來評估縮回反射。記錄此反應。會陰反射係藉由以棉籤輕輕撫摸肛門周圍的皮膚來評估，並評估動物是否收縮由周圍皮膚起皺所指示的外括約肌。
感覺神經傳導研究
以氯胺酮(ketamine)/右美托咪定(dexmedetomidine)的組合使動物鎮靜。將經鎮靜動物放在帶有加熱袋的手術台上，使其側臥或背臥，以保持體溫。由於可能會干擾電信號採集，因此未使用電子加熱設備。
感覺神經傳導研究(NCS)，亦稱為感覺神經傳導速度(NCV)測試，使用Nicolet EDX®系統(Natus Neurology)和Viking®分析軟體進行，以測量感覺神經動作電位(SNAP)振幅和傳導速度。簡而言之，將刺激探針放置在正中神經上，陰極最靠近記錄部位。將兩個針狀電極皮下插入到趾骨II的遠端指骨(參考電極)和近端指骨(記錄電極)的水平，而接地電極放置在刺激探針(陰極)的近端。使用WR50 Comfort Plus Probe兒科刺激器(Natus Neurology)。激發的反應被差異放大並顯示在監視器上。最初的採集刺激強度設置為0.0 mA，以便確認缺乏背景電信號。為了找到最佳的刺激位置，將刺激強度增加至10.0 mA，並在沿正中神經移動探針時產生一串刺激，直到找到最佳位置為止(由最大確定波形確定)。將探針保持在最佳位置，刺激強度以逐步的方式逐漸增加至10.0 mA，直到峰值幅度響應不再增加為止。最後三十個刺激反應被記錄並保存於軟體中。平均最多10次最大刺激反應，並報告正中神經。測量從記錄部位到刺激陰極的距離(cm)，並將其輸入軟體中。使用響應的開始潛伏期和距離(cm)計算傳導速度。報告傳導速度和SNAP振幅的平均值兩者(圖93)。對雙側正中神經進行測試。
結果
臨床觀察
在整個研究過程中每天監測動物。沒有可歸因於試驗物投予的臨床異常。下面記錄並討論與測試物投予無關的幾種異常情況。此等觀察結果和相關治療(如果需要)不會影響研究，因為症狀會隨著時間的推移完全緩解或改善，並且不會影響對生命終點的評估。
在研究開始前或基線時，一些動物的彎曲桿菌(campylobacter)及/或糞便寄生蟲的糞便培養呈陽性，伴有或不伴有間歇性腹瀉，並接受抗生素和抗真菌藥治療。在研究期間，此等動物中之三隻被關在一起(4.5x1013 GC；動物18-080、18-166及18-185；第4組)並出現間歇性腹瀉，食慾下降，與繼發於微生態失調(dysbosis)的志賀菌病一致。在第1-3天開始注意到這些發現，並在獸醫支持性護理下在第48天解決。這些動物的血液血液學值受腹瀉影響。
在第59天的神經系統檢查期間，注意到動物18-080(4.5x1013 GC，第4組)有一個小的直腸脫垂，該脫垂在沒有治療的情況下自行解決，並且在當天晚些時候對動物進行鎮靜以進行NCS和CSF收集時未觀察到。注意到動物18-171(1.5x1013 GC，第7組)在第6天出現輕度皮炎，到第14天無需治療即可消退。動物18-181(1.5x1013 GC，第7組)在第90天的CSF採集點表現出輕度皮炎，這歸因於對消毒擦洗劑的反應。皮炎在用局部抗生素治療後消退。動物18-121(4.5x1012 GC，第6組)在第76天在手臂、耳朵、面部顯示出表面刮痕，右耳有小血腫，這歸因於與同籠夥伴打架。同籠夥伴被重新分配，傷口在抗生素療程後癒合。在第47天，在動物18-183(1.5 x 1013 GC，第7組)的籠條、指板和柵欄上發現有血跡，與動物右手第三指的裂傷一致。沒有注意到疼痛或腫脹，且損傷無需治療即可解決。
在基線時，動物18-187(1.5x1013 GC，第3組)表現出歸因於皮炎的腹股溝皮膚變紅。治療後皮膚變紅有所改善，但在第85天安排的屍體剖檢時並未完全消退。該動物還在第15天和第63天表現出與月經週期有關的陰道出血。觀察到動物18-042(4.5x1012 GC，第6組)在第95天輪轉。
感覺神經傳導研究
在基線和此後每月對所有動物進行感覺NCS以測量雙側正中神經SNAP振幅和傳導速度(圖94A及圖94B；圖95A及圖95B)。
在一媒液處理的對照(動物18-159；ITFFB，第6組)和一低劑量動物(動物18-168；4.5x1012 GC，第2組)、中劑量(動物18-181；1.5x1013 GC，第7組)和高劑量(動物18-080；4.5x1013 GC，第4組)組中，觀察到SNAP振幅從基線水平降低，超過正常個體動物變異性(圖94A及圖94B；圖95A及圖95B)。高劑量動物(動物18-080；4.5x1013 GC，第4組)表現出從第28天到第90天屍體剖檢的左側正中神經的SNAP振幅降低，根據與組織病理學的相關性，此可能歸因於與測試物品相關的感覺神經元毒性。其餘三隻動物的SNAP振幅降低(動物18-159[媒液：ITFFB]、動物18-168[低劑量：4.5x1012 GC]、動物18-181[中劑量：1.5x1013 GC])被認為與測試物無關，並歸因於與在幼年NHP中執行NCS相關的技術可變性。在整個研究過程中，動物間和動物內SNAP振幅的變異性很明顯，記錄針相對於神經的位置會影響SNAP振幅。在縱向研究中經常觀察到SNAP振幅的變化，特別是在仍在生長的幼年動物中，因此，從一個時間點到另一個時間點，可能會稍微修改解剖標誌。神經傳導速度受電極定位的影響較小，因此在研究中變化較少(圖94及圖95)。對於任何其它動物，均未觀察到與 SNAP振幅降低相關的異常臨床發現。
體重
在整個研究過程中，第90天和第180天群中的動物均表現出體重增加。在某些動物的單一時間點觀察到短暫的體重減輕，包括第7天9/18 rAAVhu68.hGALC處理的NHP和2/2媒液處理的對照，第28天1/18 rAAVhu68.hGALC處理的NHP，和第90天1/18 rAAVhu68.hGALC處理的NHP。觀察到的重量損失被認為與試驗物無關。
在第7天，大多數動物(6/11)的體重比之前記錄的經歷最小(＜3%)體重減輕，包括3/6隻投予低劑量rAAVhu68.hGALC(4.5 x 1012 GC；動物18-091 [-1.72%；第2組]、18-042 [-2.00%；第6組]、18-121 [-2.27%；第6組])，2/6動物投予中劑量(1.5 x 1013 GC；動物18-167 [-1.75%；第3組]、18-187 [-2.44%；第3組])，及1/6動物投予高劑量(4.5x1013 GC；動物18-170 [-2.13%；第8組])。於剩餘動物中，觀察到比之前記錄的體重的約3-10%之較大體重減輕，於2/2媒液處理的對照組(ITFFB；動物18-162 [-6.12%；第1組]、18-159[-3.64%；第5組])，1/6低劑量動物(4.5x1012 GC；動物18-171 [-6.38%；第6組])，及2/6高劑量動物(4.5x1013 GC；動物18-166 [-8.33%；第4組]及18-185 [-10.87%；第4組])。表現出最高百分比體重減輕的兩動物(動物18-166和18-185；4.5x1013 GC，第4組)在第3-10天表現出腹瀉和食慾下降，這與志賀菌病一致，這是造成這種暫時性體重減輕的原因。對於其餘動物，沒有注意到導致觀察到的暫時體重減輕的臨床症狀。在研究期間的所有後續時間點，所有動物繼續增加及/或保持體重。由於2/2媒液處理的動物在第7天表現出暫時的體重減輕，因此認為該發現不太可能與試驗物相關。
於第28天，一高劑量動物(4.5x1013 GC；動物18-080；第4組)展現較先前於第14日紀錄的體重減輕3.57%。此動物在第18-25天出現間歇性腹瀉或軟便，並伴有食慾不振，這與志賀菌病一致，這是造成這種暫時性體重減輕的原因。在用抗生素和纖維補充劑治療後，動物在所有隨後的評估時間點體重增加。
於第90天，一高劑量動物(4.5x1013 GC；動物18-038；第8組)展現較先前於第60日紀錄的體重減輕4.26%。將動物置於補充餵養中並在所有後續評估時間點體重增加。沒有注意到導致這種體重減輕的胃腸道症狀。由於媒液處理的動物在此研究期間亦表現出暫時的體重減輕，因此認為該發現不太可能與試驗物相關。
腦脊髓液
血液學 ( 細胞計數 )
8/18 rAAVhu68.hGALC處理的動物和無媒液處理的對照中發生輕度淋巴細胞或中性粒細胞增多(≥6個白細胞/μL)(圖96A及圖96C)。在其中一些情況下，細胞增多可能與血液稀釋有關，因為在收集過程中血液污染導致在某些CSF樣本中觀察到＞30個紅細胞[RBCs]/μL。表現出可能繼發於血液稀釋的淋巴細胞增多症的動物包括低劑量組中的1/6動物(4.5x1012 GC；動物18-121 [第6組])，中劑量組中3/6動物(1.5x1013 GC；動物18-176 [第3組]，動物18-181、動物18-183 [第7組])，及高劑量組中1/6動物(4.5x1013 GC；動物18-170 [第8組])。在這些動物中，在rAAVhu68.hGALC投予後7-180天觀察到峰值CSF白血球計數為8-63個細胞/μL。表現出非血液稀釋的淋巴細胞或中性球細胞增多症的動物包括低劑量組中的1/6動物(4.5x1012 GC；動物18-168 [第2組])及高劑量組中的2/6動物(4.5x1013 GC；動物18-038及動物18-158 [第8組])。在這些動物中，在rAAVhu68.hGALC投予後14天觀察到峰值CSF白血球計數為8-22個細胞/μL。輕度CSF細胞增多症被認為與試驗物有關，並且在所有情況下，細胞增多症都是自限性的，與臨床後遺症無關。
臨床化學
在研究期間，在任何動物中均未觀察到CSF總蛋白或葡萄糖的異常。
存在針對 AAVhu68 衣殼的中和抗體
在研究中，12/20隻動物的血清中基線時可檢測到針對AAVhu68衣殼的NAb，包括1/2媒液處理的對照和7/18 rAAVhu68.hGALC處理的NHP。
在媒液處理的對照中，對預先存在的AAVhu68 NAb(動物18-159；ITFFB，第5組)呈陰性的動物在整個研究過程中保持陰性。對預先存在的AAVhu68 NAb呈陽性的其它媒液處理的對照中的NAb力價(動物18-162；ITFFB，第1組)保持在基線，在研究期間在預先存在的NAb力價的兩個稀釋中，這被認為是最小的變化。
在rAAVhu68.hGALC處理的動物中，到第28天，在18/18動物中觀察到對AAVhu68衣殼的NAb反應。對於所有投予rAAVhu68.hGALC的動物，在第180天檢測到AAVhu68 NAb，在大多數動物中在第28天和第60天之間觀察到峰值反應。在NAb力價達到峰值後，在所有動物中觀察到力價降低或維持直至研究結束。雖然低劑量組(4.5x1012 GC)和中劑量組(1.5x1013 GC)的NAb值在研究期間相當，但在高劑量組中觀察到NAb反應的幅度增加(4.5x1013 GC)。這種差異在第28天最為明顯，此時高劑量組(4.5x1013 GC)動物的幾何平均力價比低劑量組(4.5x1012 GC)和中劑量組(1.5x1013 GC)大約5倍。然而，到第60天，NAb反應幅度的差異減小。到第90天，高劑量組(4.5x1013 GC)中動物的NAb力價比低劑量組(4.5x1012 GC)和中劑量組(1.5x1013 GC)高約2倍，直到研究結束，這些力價仍保持在2到3倍之間。僅分別在第60天(p=0.03)和第150天(p=0.05)，觀察到高劑量組(4.5x1013 GC)和低劑量組(4.5x1012 GC)或中劑量組(1.5x1013 GC)的力價之間的統計學顯著差異。最後，在rAAVhu68.hGALC投予之前，AAVhu68 NAb反應的大小似乎不受預先存在的AAVhu68 NAb的影響，無論劑量如何。
在整個研究中收集的血清中對 AAVhu68的NAb反應總結如下。
表.血清中存在針對AAVhu68衣殼的中和抗體
組別 試驗物 劑量(GC) 動物ID 屍體剖檢日期 AAVhu68 NAb50
BL 第28日 第60日 第90日 第120日 第150日 第180日
1 ITFFB N/A 18-162 第90日 80 320* 160 80
2 載體 4.5 x 1012 18-091 第90日 ＜5 320* 320 640
18-168 10 640* 1280 1280
18-173 80 2560* 1280 1280
3 載體 1.5 x 1013 18-167 第90日 160 2560* 640+ 640
18-176 ＜5 640* 320 640
18-187 ＜5 2560* 5120* 2560*
4 載體 4.5 x 1013 18-080 第90日 10 1280* 2560* 1280
18-166 80 10240* 5120* 1280
18-185 5 10240* 5120* 2560*
5 ITFFB N/A 18-159 第180日 ＜5 ＜5 ＜5* ＜5* ＜5 ＜5 ＜5
6 載體 4.5 x 1012 18-042 第180日 80 320* 640 160 320 1280 1280
18-121 5 320* 640 1280 640 1280 1280
18-171 5 320* 640 640 640 160 160
7 載體 1.5 x 1013 18-055 第180日 ＜5 80 320 320 160 160 160
18-181 ＜5 320* 1280 320 320 320 640
18-183 ＜5 320* 2560* 1280 2560 1280 1280
8 載體 4.5 x 1013 18-038 第180日 ＜5 320* 640 640 1280 1280 1280
18-158 80 2560* 5120* 1280 1280 2560 2560
18-170 40 2560* 1280 1280 2560 2560 640
顯示每個時間點抑制AAVhu68.CMV.LacZ轉導(β-gal表現)≥50%的倒數血清稀釋度。測定的可變性為±一2倍血清稀釋度。 *表示對樣品進行兩次測試以確定終點NAb力價，第二個數據組顯示在表中。+ 表示樣品進行三次測試以確定終點力價，但第二次檢測結果有效，見下表。縮寫 ：β-gal，β-半乳糖苷酶；BL，基線；GC，基因體拷貝；ID，識別；ITFFB，鞘內最終製劑緩衝液；LOD，偵測極限；N/A，不適用；NAb，中和抗體。
對 AAV 衣殼及轉基因產物的 T 細胞反應
在研究期間，4/20 NHP對衣殼(AAVhu68)或轉基因產物(人類GALC)均未表現出IFN-γT細胞反應。這些無反應者包括1/2媒液處理的對照和3/18 rAAVhu68.hGALC處理的動物。通過第90天的屍體剖檢，單一媒液處理的無反應者(ITFFB；動物18-162，第1組)對T細胞反應保持陰性。在rAAVhu68.hGALC處理的動物中，低劑量組(4.5x1012 GC；動物18-173，第2組；動物18-121，第6組)中的2/6無反應者分別在第90天和第180天通過屍體剖檢對T細胞反應保持陰性，中劑量組(1.5x1013 GC；動物18-167，第3組)中的1/6無反應者在第90天保持陰性。16/20 NHP在研究期間表現出對衣殼和/或轉基因產物的IFN-γ T細胞反應。反應者包括1/2媒液處理的對照和15/18 rAAVhu68.hGALC處理的動物。單一媒液處理的動物(ITFFB；動物18-159，第5組)在第28天的PBMC和第180天的屍體剖檢時對肝臟淋巴細胞中的轉基因產物顯示出T細胞反應。在該動物中未檢測到對衣殼的T細胞反應。由於動物18-159未被投予rAAVhu68.hGALC，這種低的、短暫的反應似乎與處理無關。rAAVhu68.hGALC處理的動物中的反應者包括低劑量組(4.5x1012 GC，第2組和第6組)中的4/6動物，中劑量組(1.5x1013 GC，第3組和第7組)中的5/6動物，以及高劑量組(4.5x1013 GC，第4組和第8組)中的6/6動物。
在表現出T細胞反應的15/18 rAAVhu68.hGALC處理的動物中，大多數(14/15)僅對轉基因產物或對轉基因產物和衣殼兩者皆有反應。只有1/15的動物對單獨的衣殼表現出T細胞反應，此為投予低劑量的動物(4.5x1012 GC；動物18-091，第2組)。
關於反應盛行率，T細胞對轉基因產物的反應比對衣殼的反應更盛行。在不同劑量組或屍體剖檢群中，T細胞對衣殼的反應的盛行率沒有明顯差異。然而，與低劑量組(4.5x1012 GC)的反應相比，中劑量(1.5x1013 GC)和高劑量組(4.5x1013 GC)的T細胞對轉基因產物的反應似乎更為盛行。在屍體剖檢群中，T細胞對肝臟淋巴細胞中轉基因產物的反應在第180天比在第90天更盛行，而淋巴結和骨髓淋巴細胞在第90天的反應似乎比第180天更盛行，但需要注意的是在淋巴結和骨髓淋巴細胞中表現出反應的動物數量低。
關於反應的幅度，T細胞對衣殼的反應是低幅度的(每百萬細胞58-178點形成單位[SFU])，這在整個研究中的所有劑量組和細胞群中皆為相似。相比之下，T細胞對轉基因產物的反應幅度更高(每百萬細胞58-843 SFU)，一些細胞群表現出更大的反應。特別是，與PBMC和其它組織特異性淋巴細胞群相比，肝臟淋巴細胞對轉基因產物表現出更高的T細胞反應。與低劑量組(4.5x1012 GC)中的反應相比，在中劑量組(1.5x1013 GC)和高劑量組(4.5x1013 GC)中，T細胞對肝臟淋巴細胞中的轉基因產物的反應亦普遍較高。
T細胞對衣殼和轉基因產物的反應與異常臨床觀察或血液學、凝血和血清化學參數的變化無關。
大體病理學發現
沒有觀察到與試驗物相關的大體發現。所有大體發現都被認為是偶然的或死後相關程序。
組織學發現
主要在DRG和三叉神經節(TRG)中周圍神經系統的感覺神經元中觀察到與試驗物相關的發現。DRG/TRG發現由感覺神經元變性所組成。在脊髓和周圍神經的背側白質束內觀察到繼發性軸索變性(即軸突病)，分別包含來自DRG神經元的中樞軸突和周圍軸突。總體而言，在所有rAAVhu68.hGALC處理組的DRG中都觀察到此等發現，且僅在第90天群中的兩中劑量動物的TRG中零星觀察到此等發現。發生率和嚴重程度較低。分析每隻動物的三個DRG片段(頸椎、胸椎、腰椎)，在rAAVhu68.hGALC處理的動物中總共有54個DRG片段。31%的DRG節段(17/54)報告了1級(最小)DRG神經元變性，而69%是正常的或顯示偶然的背景病變。
DRG 神經元變性。 與試驗品相關的組織病理學發現由神經元細胞變性和DRG中單核細胞浸潤所組成，此神經元細胞軸突集中突出到脊髓的背根白質束和外圍突出到周圍神經。最高嚴重程度等級為1(最低)，代表DRG部分內散發性單獨的神經元的神經元變性。
於第90天，最小(1級)DRG變性的發生率可能是劑量依賴性的，因為該發現在低劑量組(4.5x1012 GC)中不存在，僅在中劑量組(1.5x1013 GC；2/3動物，3/9神經節，第3組)和高劑量組(4.5x1013 GC；3/3動物，5/9神經節，第4組)中觀察到。比較中劑量組(1.5x1013 GC)和高劑量組(4.5x1013 GC)，發生率和嚴重程度(最小)相似。
在第180天，在所有劑量下都觀察到最小(1級)DRG變性，並且發生率似乎是劑量依賴性的。在低劑量組中觀察到的發生率最低，其中一隻動物在一個神經節中表現出最小的DRG變性(4.5x1012 GC；1/3動物，1/9神經節，第6組)。在中劑量組(1.5x1013 GC；3/3動物，4/9神經節，第7組)和高劑量組(4.5x1013 GC；2/3動物，4/9神經節，第8組)中觀察到更高的發生率。比較中劑量組(1.5x1013 GC)和高劑量組(4.5x1013 GC)，發生率和嚴重程度(最小)相似。第90天和第180天屍體剖檢群中觀察到的個體DRG變性嚴重程度評分被呈示於圖98A-圖98C。
脊髓軸突病。 DRG神經元變性導致頸、胸和腰脊髓背側白質束的軸突病。軸突病變在顯微鏡下與軸突變性一致。各組的發生率相似，總體嚴重程度較低。低劑量組(4.5x1012 GC)及中劑量組(1.5x1013 GC)具有相似的嚴重程度，從無到2級(輕度)背側軸突病。3級(中度)軸突病變於高劑量(4.5x1013 GC)僅零星於2/6動物中觀察到。
於第90天，軸突病的發生率為劑量依賴，從低劑量組(4.5x1012 GC；2/9節段，第2組)中1/3動物表現出軸突病，中劑量組(1.5x1013 GC；6/9節段，第3組)中2/3動物表現出軸突病、和3/3動物在高劑量組(4.5x1013 GC；8/9節段，第4組)中表現出軸突病。然而，軸突病變之嚴重度不是明顯的劑量依賴性。嚴重度範圍從低劑量組(4.5x1012 GC)和中劑量組(1.5x1013 GC)的最低到輕度增加到高劑量組(4.5x1013 GC)的最低到中等。
於第180天，軸突病變的發生率似乎非劑量依賴。軸突病變之發生率於高劑量組(4.5x1013 GC；2/3動物，5/9段，第8組)及低劑量組(4.5x1012 GC；3/3動物，5/9段，第6組)最高，於中劑量組(1.5x1013 GC；2/3動物，3/9段，第7組)觀察到較低發生率。較高嚴重度於高劑量組(4.5x1013 GC；最低至中度，第8組)觀察到，其次為低劑量組(4.5x1012 GC；最低，第6組)，然後中劑量組(1.5x1013 GC；最低，第7組)。
跨時間點比較，背側白質束的軸突病變未觀察到明顯的時間依賴性反應；然而，與第90天相比，第180天沒有惡化或進展的跡象。在低劑量(4.5x1012 GC)下，發現的嚴重度從第90天的最小到輕微下降到第180天的最小，但發生率增加。於中劑量(1.5x1013 GC)，發生率及嚴重度兩者由第90天最小至輕微下降到第90天最小。於高劑量(4.5x1013 GC)，嚴重度從第90天的大部分輕微增加到第180天的輕微到中等，但發生率下降，導致不同時間點的嚴重度評分相當。因此，很難對不同時間點脊髓背側白質束的軸突病變進行明確解釋，且可能反映個體動物的變異性。第90天和第180天屍體剖檢群中觀察到的脊髓軸突病變的嚴重度分數呈示於圖99A-圖99C。
周圍神經的軸突病。 DRG變性導致周圍神經的軸突病，其在顯微鏡下與軸突變性一致，通常在雙側觀察到。
於第90天，周圍神經軸突病變之發生率及嚴重度兩者似乎為劑量依賴。由低劑量(4.5x1012 GC；2/3動物，13/30神經；第2組)至中劑量(1.5x1013 GC；3/3動物，17/30神經，第3組)至高劑量(4.5x1013 GC；3/3動物，19/30神經，第4組)發生率增加，且嚴重度由低劑量組(4.5x1012 GC；第2組)之最小增加至中劑量組(1.5x1013 GC，第3組)及高劑量組(4.5x1013 GC；第4組)的最小至輕度。
於第180天，周圍神經軸突病的發生率和嚴重度隨著劑量的增加而增加，由低劑量(4.5x1012 GC；最小，1/3動物，1/30神經，第6組)至中劑量(1.5x1013 GC；最小，2/3動物，4/30神經，第7組)至高劑量(4.5x1013 GC；最小至輕微，3/3動物，7/30神經，第8組)。
跨時間點比較，從第90天到第180天，所有劑量組的周圍神經軸突病的發生率和累積嚴重度均下降。
在高劑量組(4.5x1013 GC)的2/6動物中觀察到被認為繼發於軸突損傷的最小至輕度神經內膜纖維化(即軸突周圍或神經周圍纖維化)，表明可能為劑量依賴。於第90天，在高劑量組(4.5x1013 GC；1/3動物，1/10神經，第4組)之動物18-080的單一神經(左近端正中神經)中觀察到輕度神經內膜纖維化。從第28天到第90天的屍體剖檢，左側正中神經的神經內膜纖維化與左側正中神經的SNAP振幅單側減少相關，但與右側正中神經無關。在第180天，在高劑量組(4.5x1013 GC；1/3動物；第8組)中動物18-038的10/10周圍神經節段(近端和遠端正中神經、腓神經、坐骨神經、脛神經)中觀察到最小至輕度神經內膜纖維化。動物18-038還表現出輕微到輕微的單核細胞浸潤，主要由一些周圍神經檢查(4/10神經)內的淋巴細胞和漿細胞組成。跨時間點比較，纖維化的明顯進展或消退並不明顯，此發現可能僅代表個體動物的變異性，因為每個時間點受到影響的神經和動物數量有限。
注射位置發現。 在所有組中，包括媒液處理的動物，在ICM/CSF收集位的骨骼肌和脂肪組織內均觀察到局部注射部位的發現。
與試驗物相關的發現由輕度至中度慢性炎症所組成，其特徵在於骨骼肌及/或脂肪組織中的單核細胞浸潤以及相關的肌纖維變化(即退化和再生)。從第90天到第180天，注射部位的此等發現並沒有惡化，在某些情況下，它們有所改善。在第90天，骨骼肌炎症、肌纖維再生和肌纖維變性的嚴重程度和發生率(在較小程度上)呈劑量依賴性，當與中劑量組(1.5x1013 GC；最小至輕微；2/3動物，第3組)或低劑量組(4.5x1012 GC；最小至輕度；2/3動物，第2組)相比，高劑量組(4.5x1013 GC；最小至中度，3/3動物，第4組)中觀察較高嚴重度及發生率。在第180天，骨骼肌炎症(最小到輕度)和肌纖維再生(最小)的發生率和嚴重度不是劑量依賴性，因為此等發現在所有rAAVhu68.hGALC處理組中皆為相似。所有劑量組的肌纖維變性(最小)的嚴重度也相似；然而，觀察到肌纖維變性的發生率具有劑量依賴性，因為與中劑量組(1.5x1013 GC；1/3動物，第7組)及低劑量組(4.5x1012 GC；1/3動物，第6組)相比，高劑量組(4.5x1013 GC；3/3動物，第8組)展現出此發現。跨時間點比較，尚不清楚骨骼肌炎症和肌纖維變化的發生率和嚴重度是否表現出時間依賴性反應。中劑量組(1.5x1013 GC)及低劑量組(4.5x1012 GC)由第90天(分別為2/3動物，第2組；2/3動物，第3組)至第180天(分別為3/3動物，第6組；3/3動物，第7組)中增加骨骼肌發炎的發生率，但於高劑量組(4.5x1013 GC)由第90天(3/3動物，第4組)至第180天(3/3動物，第8組)未觀察到發生率有差異。高劑量組(4.5x1013 GC)由第90天(輕度至中度；第4組)至第180天(輕度；第8組)中骨骼肌發炎的嚴重度降低，而於低劑量組(4.5x1012 GC)及中劑量組(1.5x1013 GC)橫跨不同時間點表現出相對相似的嚴重度(輕度)。在所有組中，肌纖維變性/再生的發生率和嚴重度從第90天到第180天有所改善或保持相對不變。
在第90天，在媒液處理的對照動物(最小，1/1動物，第1組)和低劑量組(4.5x1012 GC；輕度，1/3動物，第2組)和中劑量組(1.5x1013 GC；輕度，1/3動物，第3組)。在第180天，在任何動物中均未觀察到骨骼肌中的單核細胞浸潤，表明該發現已解決。鑑於在媒液處理的對照動物中存在浸潤，此一發現的意義尚不清楚，它可能是偶然的或可能與ICM注射及/或重複CSF收集有關。
轉基因表現的評估
在CNS組織和主要器官(肝臟和心臟)中評估轉基因產物表現(GALC酶活性)。然而，由於該測定無法區分人類GALC酶和內源性恒河猴GALC酶，正常NHP中存在的高水平內源性恒河猴 GALC酶活性使得難以檢測由於人類GALC的表現而導致的酶活性增加。相比之下，血清和CSF的內源性恒河猴GALC酶活性的背景水平顯著降低，從而能夠評估此等生物流體中的轉基因產物表現。然而，應該指出的是，由於轉基因產品活性的快速喪失，預計分析會變得複雜，這通常歸因於對人類轉基因產品的抗體反應。
儘管此等警告，但還是在血清和CSF中評估GALC酶活性(圖100A-圖100D)。到rAAVhu68.hGALC投予後評估的第一個時間點(血清為第14天，CSF為第7天)，在所有劑量組動物的血清和CSF中可偵測到GALC酶活性(圖100A-圖100D)。在血清中，在評估的第一個時間點(第14天)觀察到GALC酶活性的劑量依賴性增加，在低劑量(4.5x1012 GC)、中劑量(1.5x1013 GC)和高劑量(4.5x1013 GC)下比媒液處理的對照水平分別增加約2倍、5.7倍和6.6倍。如預期，第14天後觀察到血清中GALC酶活性迅速下降，這與第14-28天左右血清和CSF中抗人類GALC抗體表現的開始相關(圖101)。
於CSF中，在整個180天的研究，於GALC酶活性之動物內和動物間變異性很明顯(圖100C)。然而，在誘導CSF循環抗人類GALC抗體之前評估的第一個時間點(第7天)(圖101A)，接受兩種最高劑量(1.5x1013 GC或4.5x1013 GC)的動物表現出的GALC酶活性水平分別比媒液處理的對照組高約2倍和1.75倍。低劑量(4.5x1012 GC)的水平似乎與媒液處理的對照相似，儘管在該群中觀察到具有低水平GALC酶(動物18-121，第6組)的異常值。
預先存在的抗AAVhu68衣殼之NAb的存在(由圖100B及圖100D之血清第14天和CSF第7天同齡組中的實心形狀表示)似乎不影響血清或CSF中的GALC酶活性，支持在克拉培氏病患者的目標器官系統(CNS和PNS)中實現治療性轉基因表現的潛力，無論NAb狀態如何。
結論 ●     在所有評估劑量下，ICM投予rAAVhu68.hGALC的耐受性均良好。rAAVhu68.hGALC對臨床和行為體徵、體重或神經系統和身體檢查均未產生不利影響。與rAAVhu68.hGALC投予相關的血液和CSF臨床病理沒有異常，除了某些動物中CSF白血球的無症狀輕度暫時增加。 ●     rAAVhu68.hGALC投予導致DRG感覺神經元及其相關的中樞和周圍軸突零星無症狀退化。此等病變的嚴重度為不存在至最小，相關的軸突病大多是最小至輕微。於中劑量組(1.5x1013 GC [1.7x1011 GC/g腦])及高劑量組(4.5x1013 GC [5.0x1011 GC/g腦])中，DRG發現呈劑量依賴性，具有較高發病率及/或更嚴重病變的趨勢。在第90天和第180天，DRG發現和相應的軸突病相似，暗示沒有進展。 ●     監測感覺神經傳導以提供感覺神經元DRG病理的靈敏測量。高劑量組(4.5x1013 GC [5.0x1011 GC/g腦])中的一隻動物患有單側正中神經內膜纖維化，這與到第28天左正中神經的SNAP振幅單側降低相關。研究中的所有其它動物都表現出不存在或無症狀的DRG感覺神經元病理。 ●     到評估的第一個時間點(CSF為第7天，血清為第14天)，所有劑量組的動物都可偵測到CSF和血清中的轉基因表現(即，GALC酶活性)。於此CSF中，接受兩種較高劑量(1.5x1013 GC [1.7x1011 GC/g腦]或4.5x1013 GC [5.0x1011 GC/g腦])顯示GALC活性水平分別比媒液處理的對照水平高約2倍和1.75倍。於血清中，於所有劑量組的動物(4.5x1012 GC [5.0x1010 GC/g腦]、1.5x1013 GC [1.7x1011 GC/g腦]、或4.5x1013 GC [5.0x1011 GC/g腦])展現的GALC活性水平分別比媒液處理的對照組高約2倍、5.7倍和6.6倍。CSF和血清中的轉基因產物表現不受預先存在的對載體衣殼的NAb的影響，支持在克拉培氏病患者的目標器官系統(CNS和PNS)中實現治療活性的潛力，而不管NAb狀態如何。 ●     在大多數經rAAVhu68.hGALC處理的動物的PBMC及/或組織淋巴細胞(肝臟、脾臟、骨髓、淋巴結)中可檢測到對載體衣殼及/或人類轉基因產物的T細胞反應。T細胞反應通常與任何異常的臨床發現無關。
實施例 11– 克拉培氏病以 rAAVhu68.hGALC 的處理
FIH試驗是單一ICM投予rAAVhu68.hGALC的1/2期劑量遞增研究，於患有由GALC基因中同型合子或異型合子突變引起的嬰兒型克拉培氏病的兒科患者。此FIH試驗編入並治療至少12名追蹤2年的對象，並在投予後進行總共5年的持續長期追蹤(LTFU)，符合草案描述的腺病毒載體的推薦LTFU「FDA Guidance for Industry：Long Term Follow-Up after Administration of Human Gene Therapy Products」(2018年7月)。主要目標是評估rAAVhu68.hGALC的安全性和耐受性。本研究的次要目標是評估 rAAVhu68.hGALC對疾病相關評估的影響，包括存活、適合年齡的神經認知測量以及適合年齡的運動及/或語言評估。此等終點係在與疾病專家和臨床醫生協商後選擇，並基於對未經治療的嬰兒克拉培氏病患者的疾病演變的觀察。
可選擇地，可評估HSCT和AAV基因治療的聯合療法。
FIH係一項針對rAAVhu68.hGALC的開放標籤、多中心、劑量遞增研究，旨在評估嬰兒型克拉培氏病兒科對象的安全性、耐受性和探索性療效終點。劑量遞增階段評估單次ICM投予兩個劑量水平的rAAVhu68.hGALC的安全性和耐受性，以對象交錯、順序投予。rAAVhu68.hGALC劑量水平是根據GLP NHP毒物學研究和鼠(MED)研究的數據確定，包括低劑量(投予至群1)和高劑量(投予的群2)。預期兩個劑量水平皆具有賦予治療益處的潛力，同時應理解，若可忍受，則預期較高的劑量將為有利的。依次評估低劑量和高劑量，能確定所測試的劑量的最大耐受劑量(MTD)。最後，擴展群(群3)接受rAAVhu68.hGALC的MTD。投予載體後快速產生GALC酶(治療後 1週)提供了延長的治療窗口。
獨立安全委員會將對所有群之間及第二群完全登錄後的所有累積安全性數據進行安全審查，對於關於試驗的進一步進行提出建議。每當觀察到安全審核觸發因素(SRT)時，安全委員會亦進行複查。每一群中第一及第二對象之間的1個月投予間隔使用於評估顯示急性免疫反應、免疫原性或其它劑量限制性毒性及任何感覺神經病變之臨床複查的AE，該感覺神經病變可能與DRG轉導繼發的感覺神經病理學發展的預期時間一致，其發生於非臨床研究中2-4週內。
額外的對象被編入接受MTD的擴充的群中。此等額外的對象之編入並不需要對象之間有4週的觀察窗。可選擇地，此群接受HSCT與rAAVhu68.hGALC的聯合療法。
追蹤所有受治療的對象2年以評估安全性輪廓，並特徵化rAAVhu68.hGALC的藥效動力學和功效性質。在研究的LTFU期間，額外追蹤對象3年(投予後共計5年)以評估長期臨床療效，其符合草案「FDA Guidance for Industry：Long Term Follow-Up after Administration of Human Gene Therapy Products」(2018年7月)。
表.首次人類臨床試驗方案概要
方案名稱： 1/2期開放標籤、多中心、劑量遞增研究以評估單一劑量rAAVhu68.hGALC遞送至患有嬰兒球狀細胞白血質障礙(克拉培氏病)之小兒對象的腦大池(ICM)中的安全性和耐受性
對象數： 多至12名可評估的對象
目標： 主要： 投予單一ICM劑量經24個月後，經由評估下列以評價rAAVhu68.hGALC之安全性及耐受性： ○      不良事件(AEs)及嚴重不良事件(SAEs) ○      生命跡象及身體檢查 ○      神經學檢查 ○      心電圖(ECGs) ○      感覺神經傳導研究(用於評估DRG毒性) ○      實驗室評估(血清化學、血液學、凝血研究、肝功能檢查(LFTs)、尿液分析及CSF化學及細胞學) ○      載體及轉基因產物的免疫原性   次要 ( 探索功效 ) ： ●      投予單一ICM劑量後超過2年，基於以下端點評價rAAVhu68.hGALC的藥效動力學及生物活性： ○      CSF及血清中GALC之水平    ●      投予單一ICM劑量經2年後，經量測下列以評價rAAVhu68.hGALC之功效： ○      存活 ○      疾病進展，藉由達成時的年齡、失去時的年齡及維持或取得適於年齡發展里程碑的兒童百分比評價 ○      疾病進展，藉由達成時的年齡、失去時的年齡及維持動作里程碑(由WHO標準定義)的對象百分比和疾病分期進展的對象百分比評價。   探索： ●      為了進一步評估單一ICM劑量後經過2年rAAVhu68.hGALC的功效，如以下量測： ○      藉由癲癇發作日記評估癲癇發作年齡和發作頻率 ○      臨床結果，藉由貝萊量表(BSID-III)或穆林早期學習量表(依據對象年齡)、文蘭適應行為量表(第三版)、皮巴迪動作發展量表、嬰幼兒及學步兒生活品質問卷評價    ●      為了進一步評估單一ICM劑量後經過24個月 rAAVhu68.hGALC的藥效動力學效果，如以下量測： ○      中樞神經系統髓鞘化藉由MRI及DT-MRI量測 ○      腓深神經、脛骨神經、尺骨神經、腓腸神經、正中神經的神經傳導速度(NCV)測量(以評價感覺及運動神經周圍神經病變) ○      視覺誘發電位(VEP) ○      腦幹聽覺誘發反應(BAER) ○      疾病之CSF及血漿/血清生物標記，包括鞘胺醇半乳糖苷及其它
研究設計： 藉由單一ICM注射投予rAAVhu68.hGALC於患有嬰兒克拉培氏病之小兒對象之1/2期、FIH、多中心、開放標籤、單臂、劑量遞增研究。在2年內評估安全性和耐受性、藥效動力學和臨床功效，並在投予rAAVhu68.hGALC後追蹤5年，對所有對象進行安全性和耐受性、藥效動力學、疾病進展及臨床結果的長期評估。該研究由篩選階段以確定從大約-35天到-1天的每個潛在對象的資格。在確認對象的資格和父母/監護人願意讓他們的孩子參與研究的意願後，受試者將接受基礎評估，包括腦部磁振造影(MRI)、腦脊髓液(CSF)採集之腰椎穿刺(LP)、抽血、尿液採集、肺活量、ECG、體檢、神經學檢查及臨床評估。基礎評估發生在第-1天及第0天，且投予rAAVhu68.hGALC前，應在基線再次確認是否合格。在治療階段，對象在第0天早晨入院對象在第0日接受單次ICM劑量的rAAVhu68.hGALC，並在投予後留在醫院至少24小時以進行觀察。後續研究訪視是在投劑後第7天、第30天、3個月及6個月，然後在投劑後的前2年每6個月一次。以每12個月一次頻率LTFU訪視額外3年，至投劑後5年。    該研究由以下三個作為單次ICM注射投予的rAAVhu68.hGALC的群所組成。 ●      群1(低劑量)：依序編入三名符合條件的對象(對象＃1至＃3)，並投予低劑量的rAAVhu68.hGALC，在第一名對象和第二名對象之間有4週的安全觀察期。若無觀察到安全審查觸發因素(SRT)，則在對群1的第三名對象進行rAAVhu68.hGALC投予後4週，由安全委員會評估所有可用的安全性數據。 ●      群2(高劑量)：若決定進行，依序編入三名符合條件的對象(對象＃4至＃6)，並給予高劑量的rAAVhu68.hGALC，在第四名對象和第五名對象之間有4週的安全觀察期。若未觀察到SRTs，則安全委員會會評估所有可用的安全性數據，包括來自群1對象的安全數據，在群2第三名對象接受rAAVhu68.hGALC後的4週。 ●      群3(MTD)：在安全委員會提出正面建議之前，編入另外6名對象(對象#7至#12)，並以MTD投予單一ICM劑量的rAAVhu68.hGALC。在此群中，每名對象之間的投予間隔不超過4週的安全觀察期，且在對該群中前三名對象投劑後，無需安全委員會審查。    總之，預期高劑量或低劑量群中總共編入9位對象，且總共編入12位對象(橫跨所有劑量)。
納入標準 1.於編入時≥1個月齡且＜9個月齡，且在≤6個月齡時為症狀發生前或出現克拉培氏病的首發症狀 2.白血球GALC活性低於檢測中心實驗室的正常下限(LLN)(例如，在Mayo Clinic，＜0.30 nmol/小時/mg蛋白質)。 3.全血鞘胺醇半乳糖苷 ＞ 10 nM 4.與早期嬰兒克拉培氏病相關的雙等位基因致病性GALC 基因變異或被歸類為可能致病的變異(必須在臨床實驗室改進修正案[CLIA]或根據當地標準認證的CLIA等效實驗室進行測試) 5.在任何與研究相關的程序(包括篩選評估)之前，父母或對象的LAR提供書面知情同意書 6.有症狀的對象必須表現出最低水平的神經和發育功能，表明他們有可能從治療中受益，至少可以減緩或穩定他們的疾病。特別是，對象必須證明以下臨床特徵(在適合年齡的情況下)： a.      在比賽中用力推腿(貝萊運動量表、粗動作子群，項目1) b.      抬頭(貝萊運動量表、粗動作子群，項目3) c.      眼睛跟隨移動的人(貝萊運動量表、粗動作子群，項目2) d.      微笑回應說話者的注意力(貝萊語言量表，富有表現力的，項目2)
排除標準 1.於研究人員的意見，任何歸因於克拉培氏病或任何其他狀況的臨床上重大的神經認知功能障礙，可能會使研究結果的解釋混亂。 2.若任何對象患有急性疾病，需要在編入後30日內住院，則使該對象編入之前，必須與發起人的醫療監護者討論病史。 3.有慢性通氣輔助呼吸支持史(定義為使用超過12小時/天的雙水平氣道正壓通氣、持續氣道正壓通氣或呼吸機)或因疾病需要氣管切開術。備注：這並不排除使用呼吸器(respiratory vest)的患者。 4.頑固性癲癇發作或不受控制的癲癇定義為癲癇持續狀態發作或需要住院治療的癲癇發作。 a.      這不排除具有與EEG結果無關的凝視史的對象。 5.除熱性痙攣外，嬰兒或兒童期發作的癲癇症或癲癇家族史。 a.      這不排除有克拉培氏病家族史的對象。 6.ICM投予程序的任何禁忌症，包括螢光鏡成影、IT造影劑和麻醉的禁忌症，或任何會增加ICM程序不良結果風險的情況，包括但不限於存在引起佔位效應或顱內壓增高徵象的佔位性病變、非交通性腦積水、後顱窩或枕骨大孔佔位性病變、異常血管解剖如大中線小腦後下動脈、靜脈異常，如小腦中線大靜脈或枕竇、先天性解剖異常如希阿里畸形(Chiari malformation)。 7.MRI或LP的任何禁忌。 8.先前的基因治療。 9.在篩選前4週內或在該臨床研究中所使用之研究產品的5個半衰期內(以較長者為準)，登錄於使用研究產品的其它任何臨床研究 10.HSCT之前 11.在投劑前或投劑後14天內接受疫苗。 12.估計腎小球濾過率(eGFR) ＜60 mL/min/1.73 m2 (基於肌酐)，使用 Bedside Schwartz方程式(Schwartz and Work, 2009)確定。 13.血液學異常： a.      凝血功能障礙(INR ＞ 1.5或活化部分凝血活酶時間[aPTT]＞40秒)。 b.      血小板減少症(血小板計數 ＜ 每微升100,000)。 c.      WBC ＜ 5.5 x 103 個細胞/µL d.      血紅素 ＜ 10 g/dL 14.AST或ALT＞3 x ULN或總膽紅素＞1.5 x ULN。 15.呼吸功能異常： a.      在沒有上呼吸道感染的情況下需要吸痰 b.      篩查期間評估的低氧血症(清醒時氧[O2 ]飽和度低於96%或睡眠時氧飽和度低於96%，無通氣支持)。通氣支持被定義為依賴補充氧氣或使用呼吸機或雙水平氣道正壓通氣(BiPap)或持續氣道正壓通氣(Cpap)機。 16.在沒有間發病(intercurrent illness)的情況下外周灌注差或溫度不穩定 17.醫療條件或實驗室或生命體徵異常會增加ICM注射、麻醉、螢光鏡、LP、及/或MRI併發症的風險(溫度 ＞38°C，室內空氣或基線需氧量的氧飽和度低於95%，心率或對象年齡的呼吸頻率異常、年齡的血壓異常、感染證據) 18.於研究者的意見，任何條件(例如，任何疾病的病史、任何當前疾病的證據、身體檢查的任何發現或任何實驗室異常)都將干擾研究產品的評估或對象安全性或研究結果的解釋。此包括: a.      研究者認為臨床上異常的實驗值具有臨床意義。 b.      免疫功能的潛在缺陷 c.      多種及嚴重威脅生命的感染的病史
研究產品 rAAVhu68.hGALC
投予途徑和程序 rAAVhu68.hGALC在第0天通過CT引導的枕下注射到腦大池中作為單劑量投予於住院對象。    在第0天，與研究相關的研究藥房製備一含有5.6 mL適當力價的rAAVhu68.hGALC的注射器，並將其運送到手術室。       在研究藥物投予之前，對象被麻醉，插管，注射部位準備好並使用無菌技術覆蓋。進行LP以移除預定體積的CSF，然後IT注射碘化造影劑，以幫助可視化腦大池的相關解剖學結構。可於針頭插入之前或期間給予IV造影劑，以作為IT造影劑之替代。使用IV或IT造影劑的決定由執行該程序的介入醫師自行決定。於螢光鏡引導下，將一根脊髓針(22-25 G)推入腦大池。可使用較大的導引針以輔助針頭放置。確認針頭放置後，將延伸套件連接到脊椎穿刺針上，並使其充滿CSF。在介入醫師的裁量下，可對延伸套件連接含造影劑的注射器，並少量注入以確認針頭在腦大池中的放置。確認針頭放置後，將含有 rAAVhu68.hGALC的注射器連接到延伸裝置。在1-2分鐘內緩慢注入注射器中的內容物，以遞送5.0mL的體積。
安全性評估 進行安全性評估，包括不良事件(AE)和嚴重不良事件(SAE)的收集、身體和神經系統檢查、生命體徵、臨床實驗室測試(血清化學、血液學、凝血、LFT、尿液分析)、ECG、神經傳導研究和CSF細胞學和化學(細胞計數、蛋白質、葡萄糖)。 研究人員主要負責在整個研究期間以及在劑量遞增階段期間每個對象編入之前對安全性數據(AE、SAE、實驗室數據等)進行持續的醫學審查。安全委員會在整個研究過程中以指定的時間間隔審查安全數據，並向發起人提出關於進一步開展研究的建議。在群1中的前三名對象之後和群2中的前三名對象之後進行安全性評估。
統計方法
沒有計劃用於安全性評估的統計比較；所有結果僅用於描述。列出數據並產生匯總表。
對次要終點和探索性終點進行統計比較。將每個時間點的測量值與每個對象的基線值以及來自年齡匹配的健康對照的數據和來自具有類似每個終點都可用的群特徵的克拉培氏病患者的自然史數據進行比較。
所有數據都顯示在對象數據列表中。分類變量使用頻率和百分比進行匯總，連續變量使用描述性統計(非缺失觀察的數量、平均值、標準差、中位數、最小值和最大值)進行匯總。圖形顯示視情況而定。
族群理論基礎
研究族群 – 兒科族群
FIH側重於在9個月齡之前出現症狀的嬰兒對象，他們代表未滿足需求最高的族群，因為此等患者不適合進行HSCT。此外，此等患者的病程非常具有破壞性，且具有快速且高度可預測的衰退，在運動和認知障礙的表現方面為同質(Bascou N., et al.(2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1):126)。事實上，在9個月齡之前出現症狀的患者的病程類似於早期嬰兒克拉培氏病，伴隨著快速而嚴重的認知和運動障礙進展，並且在出現疾病的最初徵兆和症狀後無法獲得任何功能性技能。此等患者中的大多數預計會在生命的最初幾年內死亡(2年存活率範圍為26~50%(Duffner P.K., et al.(2011) Pediatr Neurol. 45(3):141-8; Beltran-Quintero M.L., et al.(2019) Orphanet J Rare Dis. 14(1):46)。9至12個月齡的嬰兒的表型變化更大，有些表現出嚴重的早期嬰兒克拉培氏病表型，而另一些則表現出較輕的疾病表現，具有(接近)正常的認知和明顯更好的適應性和精細運動技能，這使得很難預測新診斷患者的表型，其發病時間在9到12個月之間(Bascou N., et al.(2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1):126)。因此，該族群僅限於症狀發作＜9個月齡的對象，其可預測的快速下降支持在合理的隨訪期內進行穩健的研究設計和功能結果評估。對於這一群體，治療有望穩定疾病進展並防止喪失技能(如獲得發展和運動里程碑等)、延長生存期、延遲或預防癲癇發作。
儘管有共同的潛在病理生理學，但成人克拉培氏病表型和病程明顯比毀滅性的嬰兒克拉培氏病形式更溫和，因此成人疾病穩定的證明不能為嬰兒克拉培氏病的治療提供理由。重要的是，成人克拉培氏病的發病變化很大，進展速度較慢，而且隨著數年至數十年的速度緩慢而變化更大(Jardim L.B., et al.(1999) Arch Neurol. 56(8):1014-7; Debs R., et al.(2013) J Inherit Metab Dis. 36(5):859-68)。設計一個能夠在長期自然過程中明確證明試驗性療法之功效的臨床試驗將非常具有挑戰性。提供能夠穩定甚至改善疾病表現的治療選擇的事實是另一個重要的考慮因素(Sharp M.E., et al.(2013) JIMD Rep. 10:57-9; Laule C., et al.(2018) Journal of Neuroimaging. 28(3):252-255)。最後，NBS在美國尚未得到廣泛採用，且在歐洲亦沒有，且模糊、非特定的臨床表現意味著成年克拉培氏病繼續是診斷不足的，因此接觸這種患者仍然極為罕見(Wasserstein M.P., et al.(2016) Genet Med. 18(12):1235-1243)。
研究族群 – 排除患有嚴重疾病的對象
考慮到克拉培氏病具有被認為在很大程度上是不可逆之CNS損傷的性質及在嬰兒族群中疾病進展非常迅速，在無或輕度至中度疾病的患者中，這些疾病沒有呈現出與疾病後期階段相關的獨特症狀，包括失聰、失明、嚴重虛弱及原始反射的喪失，而rAAVhu68.hGALC被預期在此患者中可發揮最大的潛在效益(Escolar M.L., et al.(2006) Pediatrics. 118(3):e879-89)。此外，在非常重症中，異常瞳孔反射、眼球急動或視覺跟蹤困難比具有中度徵狀及症狀的患者更常見，且在早期疾病階段通常不會觀察到(Escolar M.L., et al.(2006) Pediatrics. 118(3):e879-89)。因此，多於一種這些症狀的證據被認為是重症的指標，並被排除在試驗之外。由於嚴重的殘疾，這些患者不太可能從治療中獲得實質性的益處，超出臨床功能低水平的疾病穩定被排除在外，益處/風險狀況將是不利的，並且他們將在各種臨床和儀器評估中表現出地板效應，這將排除對rAAVhu68.hGALC功效的評估。由於疾病後遺症的嚴重狀況，該族群亦可出現與非治療相關的安全問題的更高風險，因此被排除在本試驗之外。
具有臨床癲癇之患者並不從試驗中排除，除非調查人員認為該孩子有其它重症症狀，並且不太可能從治療中受益。此係因為1)癲癇並非與重症有獨特的關聯，且2)癲癇為試驗的終點，將具有癲癇的患者排除可能會使研究偏向於不易遭受癲癇的族群。
研究族群 –包括症狀發生前的對象 在僅對rAAVhu68.hGALC評估的研究之劑量遞增部分(群1及群2)中，排除症狀發生前的嬰兒克拉培氏病患者。關於此等患者，至少在美國，HSCT被認為是一種治療選項和治療選擇，即使它僅提供延緩疾病進展的作用。普遍的US KOL看法是在此族群中測試未經證實的試驗療法將被認為是不道德的，因為極其狹窄的治療窗口將有力地剝奪患者獲得顯示提供至少部分益處之治療的機會(即，如果基因療法證實不成功，那麼就不太可能有時間以HSCT「挽救」)。因此，應將rAAVhu68.hGALC留給最明顯未滿足需求的患者(即，患有不符合HSCT資格而具有徵狀及症狀的嬰兒克拉培氏病患者)。
研究族群 –年齡下限的正當理由
考慮到症狀發作可發生在產期，甚至在子宮內，治療應儘早進行以最大程度地發揮潛在的益處，因此，本研究的最低年齡選擇在給藥時為1月齡，因為目前的一致性規範建議在符合條件的患者中於1月齡前進行HSCT(Kwon J.M., et al.(2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1):30)。要求年齡至少為1個月以上允許對象及其家庭在參加此試驗之前考慮其它形式的護理標準治療。
選擇年齡下限的另一個考慮因素是確保可在這樣年輕的患者中安全地進行治療，尤其是ICM程序。在仔細審查1或2週齡嬰兒的成像掃描後，賓夕法尼亞大學的一名介入的放射學專家證實，假設治療的基本原理是被支持的，在1月齡的嬰兒中進行CT導引的ICM投予並沒有特殊的解剖學上的顧慮。
終點
除了將安全性和耐受性作為主要終點指標之外，亦根據當前文獻並與專門研究克拉培氏病的主導臨床醫師進行諮詢，為該研究選擇了第二及探索性藥效動力學及功效終點。這些終點預期在此族群中證實有意義的功能性和臨床結果。在30日、90日及6個月內對終點進行測量，然後在2年的短期追踪期內每6個月進行測量，但需要鎮靜及/或腰椎穿刺者除外。長期延展階段，測量頻率降低為每12個月一次。選擇此等時間點以促進全面評估rAAVhu68.hGALC的安全性和耐受性。考慮到未治療的嬰兒克拉培氏病患者的疾病進展速度快，亦選擇早期時間點及6個月的間隔。此允許在隨訪期間對治療對象進行全面的藥效學和臨床療效評估，該隨訪期間存在未治療的比較數據。在rAAVhu68.hGALC投予後總共5年內，繼續監測對象的安全性和有效性，依據草案「FDA Guidance for Industry : Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products」(2018年7月)。
疾病進展和臨床結果
鑒於嬰兒族群中疾病進展快速和均勻的速率(Duffner P.K., et al.(2011) Pediatr Neurol. 45(3):141-8; Bascou N., et al.(2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1):126)，初步結果評估的2年追蹤被認為足以評估rAAVhu68.hGALC隨著時間的影響。此外，治療後5年的LTFU對於評估長期預後提供非常有用的訊息，如果該療法可有效延長存活期並穩定患者於與HSCT後症狀發生前的患者中所觀察到的結果相似或更好的水平。
投予rAAVhu68.hGALC可穩定化疾病進展，如測量存活率、防止可能支持獲得新里程碑的發展和動作里程碑的喪失、癲癇的發作和頻率。對於大多數被診斷患有早期嬰兒克拉培氏病的患者，死亡通常發生在生命的前3年，晚期嬰兒族群的中位死亡率延長至5年，其中合併有7-12個月症狀發作的患者(Duffner P.K., et al.(2012) Pediatr Neurol. 46(5):298-306)。藉由將納入標準限制為發病於9月齡或之前的患者，該族群具有更嚴重的類早期嬰兒表型和病程(Bascou N., et al.(2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1):126)。考慮到未經治療的嬰兒克拉培氏病迅速的衰退，在追蹤期期間以rAAVhu68.hGALC治療可延長預期壽命。動作里程碑的發展取決於對象編入時的年齡和疾病階段(Bascou N., et al.(2018) Orphanet J Rare Dis. 13(1):126; Beltran-Quintero M.L., et al.(2019) Orphanet J Rare Dis. 14(1):46)。考慮到目標族群中疾病的嚴重性，對象可藉由入選已達成運動技能，發展並隨後喪失了其他運動里程碑，或者尚未顯示出運動里程碑發展的跡象。因此，評估會跟蹤所有里程碑的隨年齡達成和隨年齡喪失。基於下表中所概述的世界衛生組織(WHO)基準，動作里程碑的達成被定義為6個粗里程碑。
表.WHO粗運動里程碑績效標準
粗運動里程碑 多中心生長參考研究表現規範 (Multicenter Growth Reference Study Performance Criteria)
無支撐坐立 兒童直立坐著，頭部直立至少10秒鐘。兒童不使用手臂或手來平衡身體或支撐姿勢。
手膝爬行 兒童交替地前後移動手和膝蓋。腹部不接觸到支撐表面。有持續且連續的動作，至少連續三個。
輔助下站立 兒童雙腳以直立姿勢站立，以雙手托住一穩定物體(例如，家具)而不靠在上面。身體不碰到穩定的物體，且腿支撐著大部分體重。兒童如此在幫助下站立至少10秒鐘。
輔助下行走 兒童處於直立的姿勢，背部挺直。兒童用兩手之一隻手握住一穩定物體(例如，家具)向側邊或前方進行邁步。一隻腿向前移動，而另一隻腿支撐部分體重。兒童以此方式取得至少五步。
獨自站立 兒童以雙足(不是腳趾)直立姿勢站立，背部挺直。雙腿支撐兒童100%體重。沒有與人或物體的接觸。兒童獨自站立至少10秒鐘。
獨自行走 兒童在直立姿勢背部挺直下，至少要獨立走五步。一條腿向前移動，另一條腿支撐大部分體重。沒有與人或物體的接觸。
改編自(Wijnhoven T.M., et al. (2004) Food Nutr Bull. 25(1 Suppl):S37-45)。 縮寫：WHO，世界衛生組織。
考慮到患有嬰兒克拉培氏病之對象可在在生命的最初幾週或幾個月內發展出症狀，且在4月齡(中位數：5.9月齡)前通常不會表現出獲得第一個WHO動作里程碑(無支撐坐立)，此終點可能缺乏評估治療效益廣度的敏感性，尤其是在治療時點具有明顯的症狀的對象中。為了此原因，亦包括對可應用於嬰兒的適合年齡的發展里程碑的評估(Sharp M.E., et al.(2013) JIMD Rep. 10:57-9)。一缺點係該發布的工具旨在供臨床醫生和父母使用，並且在具有里程碑意義的典型年齡範圍內組織技能，而沒有參考正常範圍。然而，該數據對於總結相對於未治療的具嬰兒克拉培氏病的兒童或神經型兒童的典型獲取時間隨時間推移所保持、獲得或喪失的發展里程碑可能提供資訊。
雖然癲癇並非嬰兒族群呈現的症狀，但大約30-60%的嬰兒患者最終會在疾病的後期發展出癲癇(Duffner P.K., et al.(2011) Pediatr Neurol. 45(3):141-8)。癲癇發作活動的延遲發作使我們能夠確定以rAAVhu68.hGALC治療是否可以預防或延緩此族群中癲癇發作，或降低癲癇發作事件的頻率。要求父母保存癲癇發作日記，以追蹤癲癇的發生、頻率、長度及癲癇類型。此等條目將在每次訪問時與臨床醫生討論並解釋。
作為探索性量測，臨床量表用於量化rAAVhu68.hGALC在適應行為、認知、語言、運動功能和健康相關生活質量的發展和變化的效果。所建議的每種量測已在克拉培氏病族群或相關族群中使用。
量表和相關領域簡要敘述如下： ●     貝萊嬰幼兒與學步兒發展量表(第三版)：評估五個跨領域的嬰幼兒發展：認知、語言、運動、社會情感及適應行為。在試驗中評估所有領域。 ●     文蘭適應行為量表(第三版)：從五個方面評估從出生到成年(0-90歲)的適應行為：溝通、日常生活技能、社會化、運動技能、及適應不良行為。從v2到v3的改進併入一些問題，可更佳地理解發育障礙。 ●     皮巴迪動作發展量表第二版：測量從出生到五歲兒童的相關運動功能。估集中在六個領域：反射、靜止、運動、物體操縱、抓握和視覺運動整合。 ●     嬰幼兒學步兒生活品質問卷(ITQOL)：與健康有關的生活品質之經父母報告的量測，設計用於2月齡嬰兒至5歲幼兒。 ●     穆林早期學習量表：評估不超過68月齡嬰兒的語言、運動和知覺能力。
疾病生物標記
為了評估rAAVhu68.hGALC對疾病病理的效果，測量髓鞘化的變化、與髓鞘化有關的功能性結果及潛在疾病的生物標記。作為疾病的主要標誌，投予rAAVhu68.hGALC可使中樞和周圍脫髓鞘化減慢或停止進程。可藉由白質區域的擴散張量磁振造影(diffusion-tensor magnetic resonance imaging，DT-MRI)向異性測量和皮質脊髓運動徑(corticospinal motors tracts)之纖維追踪來追踪中央脫髓鞘鞘化，其中變化為疾病狀態和進展的指標(McGraw P., et al.(2005) Radiology. 236(1):221-30; Escolar M.L., et al.(2009) AJNR Am J Neuroradiol. 30(5):1017-21)。藉由對運動神經(深腓骨、脛骨和尺骨神經)和感覺神經(腓腸神經和正中神經)的神經傳導速度(NCV)研究間接測量周圍脫髓鞘鞘化，以監測象徵生物活性髓磷脂變化的波動(即F波和遠端潛伏期、振幅或反應存在或不存在)。
根據一項研究，視覺障礙的發展在早期嬰兒克拉培氏病很普遍，有61.2%的族群在該疾病的某個時點發展至視力喪失(Duffner P.K., et al.(2011) Pediatr Neurol. 45(3):141-8)。類似於癲癇，視力減退不是常見的症狀。此對治療前未出現明顯視力喪失的對象提供評估rAAVhu68.hGALC延緩或預防視力喪失之能力的機會。因此，視覺誘發電位(VEP)的測量可客觀地測量對視覺刺激的反應，作為中樞視力損害或喪失的指標。聽力喪失在疾病發展過程中也很常見，並藉由腦幹聽覺誘發反應(BAER)測試來測量聽覺異常的早期跡象。
GALC負責鞘胺醇半乳糖苷的水解。克拉培氏病中GALC的缺乏導致中樞和周圍蓄積鞘胺醇半乳糖苷。增加鞘胺醇半乳糖苷的水平已被建議作為克拉培氏病的指標(Escolar M.L., et al.(2017) Mol Genet Metab. 121(3):271-278)。雖然有證據支持將其用於檢測早期及嚴重的嬰兒克拉培氏病，但隨時間推移對鞘胺醇半乳糖苷水平波動的解釋，隨後的治療可能很困難，因為在晚期疾病中鞘胺醇半乳糖苷水平也可能會下降。因此，僅憑鞘胺醇半乳糖苷水平下降的證據不足以證明其具有治療效果，除非伴隨有臨床疾病的穩定。
(序列表非關鍵詞文字) 對於包含在數字識別號＜223＞下的非關鍵詞文字的序列，提供下列資訊。
SEQ ID NO：(包含非關鍵詞文字) 在＜223＞下的非關鍵詞文字
1 ＜223＞  AAVhu68 vp1衣殼
2 ＜223＞  合成構築體
3 ＜223＞  AAV9 VP1衣殼 ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1)..(2208) ＜223＞  AAV9 VP1衣殼
4 ＜223＞  合成構築體
5 ＜223＞  人類GALC編碼序列 ＜220＞ ＜221＞  sig_肽 ＜222＞  (1)..(126) ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1)..(2058)
6 ＜223＞  合成構築體
7 ＜223＞  工程化犬GALC ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1)..(2007)
8 ＜223＞  合成構築體
9 ＜223＞  工程化人類GALC編碼序列    ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1)..(2055) ＜220＞ ＜221＞  sig_肽 ＜222＞  (1)..(126) ＜220＞ ＜221＞  mat ＜222＞  (108)..(2055)
10 ＜223＞  合成構築體   
11 ＜223＞  AAV2- 5' ITR
12 ＜223＞  CMV IE啟動子
13 ＜223＞  CB啟動子
14 ＜223＞  CB7啟動子
15 ＜223＞  嵌合內含子
16 ＜223＞  兔球蛋白polyA
17 ＜223＞  AAV2- 3' ITR
18 ＜223＞  具犬GALC的載體基因體
19 ＜223＞  CB7.CI.hGALC.rBG ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (1)..(130) ＜223＞  5' ITR ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (198)..(579) ＜223＞  CMV IE增強子 ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (582)..(863) ＜223＞  CB啟動子 ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (836)..(839) ＜223＞  TATA ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (958)..(1930) ＜223＞  嵌合內含子 ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (1948)..(4002) ＜223＞  hGALCco ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (4042)..(4168) ＜223＞  兔球蛋白poly A ＜220＞ ＜221＞  misc_特徵 ＜222＞  (4257)..(4386) ＜223＞  3' ITR
20 ＜223＞  AAV1 VP1基因 ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1)..(2208)
21 ＜223＞  合成構築體
22 ＜223＞  AAV5衣殼VP1基因 ＜220＞ ＜221＞  CDS ＜222＞  (1)..(2172)
23 ＜223＞  合成構築體
24 ＜223＞  AAV3B VP1衣殼
25 ＜223＞  UbC啟動子
26 ＜223＞  SV40晚期polyA
27 ＜223＞  EF-1a啟動子
本說明書所引用之所有文件藉由引用併入本文。於此提出的序列表命名為「21-9660PCT_ST25」且其中的序列和文本藉由引用併入。美國臨時專利申請案號62/810,708，2019年2月26日申請；美國臨時專利申請案號62/817,482，2019年3月12日申請；美國臨時專利申請案號63/877,707，2019年7月23日申請；美國臨時專利申請案號63/916,652，2020年10月17日申請；美國臨時專利申請案號63/023,459，2020年5月12日申請；美國臨時專利申請案號63/070,653，2020年8月26日申請；美國臨時專利申請案號63/073,756，2020年9月2日申請；及國際專利申請案號PCT/US20/19794，2020年2月26日，藉由引用併入本文。儘管已經參考特定具體實施例描述本發明，但應當理解，可於不脫離本發明的精神的情況下進行修改。此種修改意圖落入所附申請專利權利的範籌內。
無。
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無。

Claims (15)

  1. 一種醫藥組成物，其包含具有AAV衣殼及包裝於其中的載體基因體之重組AAV(rAAV)之種系(stock)，其中該載體基因體包含： (a)  5’反向末端重複(ITR)； (b)  CB7啟動子； (c)  內含子； (d)  半乳糖基神經醯胺酶(galactosylceramidase(GALC))編碼序列，其包含SEQ ID NO：9之核苷酸1至2055，或與編碼SEQ ID NO：10之胺基酸1至685具有至少95%同一性的序列； (e)  polyA；及 (f)  3’ITR， 其中該組成物被調配用於投予劑量約1.7x1010 基因體拷貝(GC)/g腦質量至約5.0x1011 GC/g腦質量。
  2. 如請求項1之醫藥組成物，其中該AAV衣殼為AAVhu68衣殼。
  3. 如請求項1或2之醫藥組成物，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：19之核苷酸198至4168。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組成物，其中該組成物被調配用於一劑1.4 x 1013 GC至4.0 x 1014 GC之投予。
  5. 如請求項1至3中任一項之醫藥組成物，其中該組成物被調配用於一劑4.0 x 1013 GC至4.0 x 1014 GC之投予。
  6. 如請求項1至5中任一項之醫藥組成物，其中該組成物被調配用於腦大池內(intracisternal magna(ICM))投予。
  7. 如請求項1至6中任一項之醫藥組成物，其中總體積為4.5 mL至5.5 mL。
  8. 一種於治療罹患克拉培氏病的患者中使用的如請求項1至7中任一項之醫藥組成物，其於rAAV之投予之前或之後，可選擇地在包含骨髓移植的組合方案。
  9. 如請求項8之使用的醫藥組成物，其中該治療：i)增加血清及/或腦脊髓液(CSF)中GALC表現及酶活性，ii)增加皮質及/或海馬迴的神經元中的GALC表現及活性，及/或iii)增加血清及/或腦脊髓液(CSF)中的鞘胺醇半乳糖苷(psychosine)。
  10. 如請求項8或9之使用的醫藥組成物，其中該患者為少於2個月齡、少於6個月齡、或少於12個月齡。
  11. 如請求項8至10中任一項之使用的醫藥組成物，其中該rAAV以1.4 x 1013 GC至4.0 x 1014 GC之劑量投予。
  12. 如請求項8至10中任一項之使用的醫藥組成物，其中該rAAV以4.0 x 1013 GC至4.0 x 1014 GC之劑量投予。
  13. 一種如請求項1至7中任一項之醫藥組成物之用途，其用於治療需要其之患者的克拉培氏病，可選擇地隨後進行骨髓移植。
  14. 一種如請求項1至7中任一項之醫藥組成物之用途，其用於治療需要其之患者的克拉培氏病，可選擇地隨後進行骨髓移植。
  15. 一種如請求項1至7中任一項之醫藥組成物在製備用於治療克拉培氏病之藥物之用途。
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