TW202227633A - 用於治療grn相關的成年發病神經退化之重組腺相關病毒 - Google Patents

用於治療grn相關的成年發病神經退化之重組腺相關病毒 Download PDF

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Abstract

提供一種有用於治療人類患者的成年發病神經退化性疾病之治療方案，其包含投予具有AAV1殼體及含顆粒蛋白前體( GRN)編碼序列之載體基因體的重組腺相關病毒(AAV)載體。亦提供包含重組AAV載體之組成物及治療患者之成年發病神經退化性疾病的方法，該方法包含投予該重組AAV載體。

Description

用於治療GRN相關的成年發病神經退化之重組腺相關病毒
本發明係關於用於治療GRN相關的成年發病神經退化之重組腺相關病毒。
額顳葉失智症(Frontotemporal dementia；FTD)係一種致命的神經退化性疾病，其通常於六、七十歲表現，具有於執行功能、行為、言語或語言理解能力的不足。此等症狀與影響額葉皮質及顳葉皮質之腦萎縮的特徵性型態有關。患者普遍表現一種進行性的病程，從症狀發作起平均存活8年(Coyle-Gilchrist IT, et al. Neurology. 2016；86(18):1736-43)。
FTD為高度遺傳性，約40%的患者具有陽性家族史(Rohrer JD, et al. Neurology. 2009；73(18):1451-6.)。在5-10% FTD患者中，可在編碼顆粒蛋白前體(progranulin；PGRN)(一種普遍存在的溶酶體蛋白質)的顆粒蛋白(granulin；GRN)基因中鑑定出致病性功能喪失型突變(Rohrer JD, et al. Neurology. 2009；73(18):1451-6)。GRN突變攜帶者表現出迅速且廣泛的腦萎縮，並可能存在其它神經退化性疾病的臨床特徵，例如進行性核上神經麻痺症(progressive supranuclear palsy)、皮質基底核症候群(corticobasal syndrome)、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、路易氏體失智症(dementia with Lewy bodies)或阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)(Le Ber I, et al. Brain: a journal of neurology. 2008；131(3):732-46.)。GRN突變以體染色體顯性方式遺傳，到70歲時外顯率大於90%(Gass J, et al. Human molecular genetics. 2006；15(20):2988-3001)。雖然單一GRN突變的遺傳會導致FTD及其它遲發性神經退化性疾病，但具有同基因型組合之功能喪失型突變(homozygous loss-of-function mutations)的患者在生命中更早顯現出神經性類蠟脂褐質病(neuronal ceroid lipofuscinosis；NCL，巴登氏病(Batten disease)，特徵為自體螢光物質(脂褐質(lipofuscin))在神經元溶酶體中蓄積、快速的認知能力下降及視網膜退化(Smith Katherine R, et al. American Journal of Human Genetics. 2012；90(6):1102-7)。儘管GRN突變的異基因型組合(heterozygous)患者的症狀發作甚晚，但彼等最終在腦及視網膜中發展出與NCL患者相同的溶酶體貯積病灶，且同樣經歷進行性神經退化(Ward ME, et al. Science Translational Medicine. 2017；9(385)；Gotzl JK, et al. Acta neuropathologica. 2014；127(6):845-60)。最近發現顆粒蛋白前體藉由促進溶酶體酸化並充當溶酶體蛋白酶(包括細胞自溶酵素D(cathepsin D)；CTSD)的伴護蛋白(chaperone)，在溶酶體功能中扮演關鍵角色(Beel S, et al. Human molecular genetics. 2017 Aug 1；26(15):2850-2863；Tanaka Y, et al. Human molecular genetics. 2017；26(5):969-88)。編碼CTSD的基因中的突變亦導致NCL表型，支持與溶酶體蛋白酶活性不足有關的常見病理生理學(Siintola E, et al. Brain: a journal of neurology. 2006；129(Pt 6):1438-45)。
目前尚無針對由GRN單套缺失(GRN haploinsufficiency)引起的成年發病神經退化的疾病的改良療法。疾病管理包括目標在降低疾病相關的行為、認知及/或運動的症狀之支持性照護及藥品仿單標示外(off-label)治療(Tsai and Boxer, 2016, J Neurochem. 138 Suppl 1:211-21)。再者，以篩檢具有失智症家族史的個體，更多的患者可在早期被聯繫到，該篩檢目前有鑑於缺乏治療而並非必要的。因此，此疾病譜表示高度未滿足醫療需求的領域。
對於與GRN單套缺失相關的成年發病神經退化性疾病及其相關症狀的治療有所需求。
於一態樣，本文提供一種有用於治療人類患者的成年發病神經退化性疾病之治療方案，其中該方案包含投予重組腺相關病毒(AAV)載體，該重組AAV載體具有AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(inverted terminal repeat；ITR)、顆粒蛋白前體( GRN)編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，該投予包含單次劑量之腦大池內(intra-cisterna magna，ICM)注射，該單次劑量包含：(i)約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量；(ii)約1.1 x 10 11GC/每克腦質量；(iii)約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或(iv)約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。在某些具體實施例中，載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。在某些具體實施例中，載體基因體包含SEQ ID NO：24。在某些具體實施例中，患者已被鑑定為具有 GRN單套缺失及/或額顳葉失智症(FTD)。
於一態樣，本文提供一種包含重組AAV載體之醫藥組成物，該重組AAV載體包含AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，其中該組成物被調配用於腦大池內(ICM)注射至有需要之人類患者，以投予以下劑量：(i)約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量；(ii)約1.1 x 10 11GC/每克腦質量；(iii)約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或(iv)約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。在某些具體實施例中，載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。在某些具體實施例中，載體基因體包含SEQ ID NO：24。
於一態樣，本文提供一種治療具有成年發病神經退化性疾病之患者的方法，該方法包含藉由ICM注射對該患者投予單次劑量之重組AAV，其中該重組AAV包含AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含AAV ITR、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，且其中該單次劑量為(i)約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量；(ii)約1.1 x 10 11GC/每克腦質量；(iii)約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或(iv)約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。在某些具體實施例中，載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。在某些具體實施例中，載體基因體包含SEQ ID NO：24。在某些具體實施例中，患者已被鑑定為具有 GRN單套缺失及/或額顳葉失智症(FTD)。
於一態樣，本文提供一種單位劑型的醫藥組成物，其包含：含約1.44 x 10 13至約4.33 x 10 14GC之重組AAV載體之緩衝液，其中該重組AAV包含AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列。
在某些具體實施例中，顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與 SEQ ID NO：3共有至少 95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。在某些具體實施例中，載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。在某些具體實施例中，載體基因體包含SEQ ID NO：24。在某些具體實施例中，組成物被調配用於ICM注射。在某些具體實施例中，醫藥組成物用於治療具有成年發病神經退化性疾病之人類患者的用途。
由以下本發明的詳細描述，本發明之此等及其它態樣將顯而易見。 【圖式簡單説明】
圖1為AAV1.hPGRN載體基因體之線性圖譜。AAV1.CB7.CI.hPGRN.rBG(下文稱為PBFT02)載體基因體包含在普遍存在的CB7啟動子控制下的人類PGRN編碼序列，其由CMV IE強化子及雞β-肌動蛋白啟動子之間的雜合體所構成。縮寫：BA，β-肌動蛋白；bp，鹼基對；CMV IE，巨細胞病毒立即早期(cytomegalovirus immediate-early)；ITR，反向末端重複；PolyA，多腺核苷酸化；rBG，兔β-球蛋白。 圖2為攜帶載體基因體之順式(cis)質體的線性載體圖譜。 圖3A-圖3D提供GRN -/-小鼠大腦中脂褐質蓄積及己醣胺酶(hexosaminidase)活性的自然史。GRN -/-小鼠(KO)或GRN +/+(WT)對照組在指定的年齡(每個時間點n=10)犧牲。對未染色的大腦切片進行海馬迴、視丘及額葉皮質中的自體螢光物質(脂褐質)成像，並由三位盲審者對脂褐質沉積物進行定量並取平均值(圖3A–圖3C)。脂褐質計數以相對於感興趣區域的總面積表示。測定大腦樣品中的己醣胺酶活性，並以總蛋白濃度標準化(圖3D)。數值表示為對野生型對照組的比率。 圖4顯示以表現人類PGRN的AAV載體或媒劑處理的 Grn-/-小鼠的CFS及腦中的人類PGRN表現。媒劑(PBS)處理的WT小鼠、媒劑處理的 Grn-/-小鼠及AAVhu68.hRN(AAV)處理的 Grn-/-小鼠(ICV劑量：1.00 x 10 11GC)在投劑後65天進行屍體剖檢(N=10/組)。藉由對CSF(WT+PBS：N=5； Grn–/–+PBS：N=6； Grn–/–+AAV：N=9)及來自額葉皮層的腦組織(N=10/組)之ELISA而測量人類PGRN蛋白的濃度。將腦PGRN濃度標準化為從腦中單離的總蛋白質。ELISA的LOD對於CSF為1.25 ng/mL且對於腦為0.08 ng/mg。 圖5顯示以表現人類PGRN的AAV載體或媒劑處理的 Grn-/-小鼠的腦及血清中的己醣胺酶活性。媒劑(PBS)處理的WT小鼠、媒劑處理的 Grn-/-小鼠及AAVhu68.hPGRN(AAV)處理的 Grn-/-小鼠(ICV劑量：1.00 x 10 11GC)在投劑後65天進行屍體剖檢(N=10/組)。在來自額葉皮質的腦組織及血清中測量HEX活性(N=10/組，血清 Grn–/–+AAV除外，其中N=9)。腦HEX活性被標準化為從腦中單離的總蛋白質)。單因子變異數分析(one-way ANOVA)，之後杜凱氏(Tukey)多重比較檢定，*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖6顯示以表現人類PGRN的AAV載體或媒劑處理的 Grn-/-小鼠腦中脂褐質沉積物的定量。媒劑(PBS)處理的WT小鼠、媒劑處理的 Grn-/-小鼠及AAVhu68.hPGRN(AAV)處理的 Grn-/-小鼠(ICV劑量：1.00 x 10 11GC)在投劑後65天進行屍體剖檢(N=10/組)。海馬迴、視丘及額葉皮質未染色冷凍切片中的自體螢光的脂褐質沉積物由盲審者定量(WT+PBS：N=10； Grn–/–+PBS：N=8； Grn–/–+AAV：N=10)。脂褐質計數以每個高倍視野表示。單因子變異數分析，之後杜凱氏多重比較檢定，*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖7A-圖7C顯示藉由AAV媒介的PGRN表現，矯正老年GRN -/-小鼠的腦小神經膠質細胞增生(brain microgliosis)。GRN -/-小鼠(KO)或GRN +/+(WT)對照組在7個月齡時以媒劑(PBS)或表現人類PGRN(10 11GC)的AAVhu68載體之單次ICV注射治療。在注射4個月後犧牲動物，並將腦切片對CD68染色。海馬迴、視丘及額葉皮質影像中的CD68陽性面積由盲審者使用ImageJ軟體定量。面積以每個高倍視野表示。單因子變異數分析，之後杜凱氏多重比較檢定，*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖8顯示在ICM AAV投予後人類PGRN蛋白在NHP的CSF及血漿中的表現。成年NHP(N=2/組)以3.0x10 13GC的劑量接受單次ICM投予PBFT02、AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG、AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG或AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40。在指定的研究日藉由ELISA測量CSF及血漿中的人類PGRN蛋白。虛線表示健康人類對照樣品中的平均正常PGRN濃度。正常人類對照CSF樣品與NHP樣品同時進行評估，而血漿的正常人類PGRN濃度來自已發表的文獻。AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40的血漿分析未在第21天及第28天進行，因為與其它組相比，CSF中的PGRN表現水準較低。 圖9顯示在ICM AAV投予後，NHP的CSF及血清中的抗人類PGRN抗體。成年NHP(N=2/組)接受PBFT02或AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的單次ICM投予，劑量為3.0 x 10 13GC。在指定的研究日藉由ELISA測量CSF及血清中的抗人類PGRN抗體。對於AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG及AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40的抗人類PGRN抗體並未評估。 圖10顯示ICM AAV投予後NHP的體重。成年NHP(N=2/組)以3.0 x 10 13GC的劑量接受單次ICM投予PBFT02、AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG、AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG或AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40。在指定的時間點測量體重。 圖11顯示ICM AAV遞送後在NHP中的CSF白血球計數。成年NHP(N=2/組)以3.0 x 10 13GC的劑量接受單次ICM投予PBFT02、AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG、AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG)或AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40。在指定的時間點評估CSF白血球計數。在所有分析的樣品中，鑑定的細胞主要是小淋巴細胞。 圖12顯示ICM投予AAV1及AAVhu68載體至非人類靈長類動物後的腦轉導水準。將成年恆河獼猴藉由ICM注射投予3 x 10 13GC的由雞β肌動蛋白啟動子表現GFP之AAVhu68(n=2)或AAV1(n=2)載體。投予載體後28天，對動物進行屍體剖檢，並藉由GFP免疫組織化學或免疫螢光對GFP及DAPI進行染色，分析大腦右半球五個區域的切片。以特定細胞類型的標記(NeuN、GFAP及Olig2)同時染色(costaining)可用於定量轉導的星狀細胞(astrocyte)及寡樹突細胞(oligodendrocyte)。對於所有採樣的腦區域計算各細胞類型的平均轉導。誤差槓=五個切片的SEM。 圖13提供一張表格，其顯示ICM投予AAV1(動物ID 1826及2068)及AAVhu68(動物ID 1518及2076)載體至非人類靈長類動物後，神經元、星狀細胞及寡樹突細胞轉導的百分比。將成年恆河獼猴在研究第0天藉由ICM注射投予3 x 10 13GC的由雞β肌動蛋白啟動子表現GFP之AAVhu68(n=2)或AAV1(n=2)載體。投予載體後28天，對動物進行屍體剖檢，並藉由GFP免疫螢光對特定細胞類型(NeuN、GFAP及Olig2)同時染色，分析大腦右半球五個區域的切片。使用HALO軟體定量每種細胞類型的總細胞及每種類型的GFP表現細胞的數量。顯示各區域的各細胞類型轉導的百分比。對於某些動物，從區域5分析兩個切片。 圖14顯示投予PBFT02或媒劑的 Grn-/-小鼠的體重。 Grn –/– 小鼠以4.4 x 10 9GC、1.3 x 10 10GC、4.4 x 10 10GC或1.3 x 10 11GC的劑量ICV投予PBFT02(N=15/組)。 Grn –/– 小鼠及WT小鼠(N=15/組)ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照組。動物每週稱重。誤差槓代表SEM。 圖15顯示在投予PBFT02或媒劑的 Grn-/-小鼠的腦脊髓液中的轉基因產物表現。 Grn –/– 小鼠以4.4 x 10 9GC(N=12)、1.3 x 10 10GC(N=12)、4.4 x 10 10GC(N=13)或1.3 x 10 11GC(N=11)的劑量ICV投予PBFT02。 Grn –/– (N=7)及正常WT小鼠(N=11)ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照組。在第90天，收集CSF並藉由ELISA測量PGRN表現。誤差槓代表SEM。對於1:40稀釋的CSF，ELISA分析的LOD為1.25 ng/mL。 圖16A-圖16C顯示在投予PBFT02或媒劑的 Grn –/– 小鼠之腦中的脂褐質沉積物定量。 Grn –/– 小鼠以4.4 x 10 9GC(N=15)、1.3 x 10 10GC(N=14)、4.4 x 10 10GC(N=15)、1.3 x 10 11GC(N=15)的劑量ICV投予PBFT02。 Grn –/– 及野生型小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照組(N=15/組)。在第90天，收集腦並冷凍切片。使用自動圖像分析軟體，定量在視丘(圖16A)、皮質(圖16B)及海馬迴(圖16C)中的自體螢光的脂褐質沉積物。在第1天自未處理 Grn –/– 及野生型小鼠收集的腦被包括作為基線對照組。誤差槓代表SEM。基於所有第90天的組別相對於媒劑處理的 Grn –/– 對照組之單因子變異數分析、之後的杜凱氏多重比較檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001及 ****p＜0.0001。 圖17A-圖17C顯示投予PBFT02或媒劑的 Grn –/– 小鼠之腦中的CD68表現的定量。 Grn –/– 小鼠以4.4 x 10 9GC(N=15)、1.3 x 10 10GC(N=14)、4.4 x 10 10GC(N=15)、1.3 x 10 11GC(N=15)之劑量ICV投予PBFT02。 Grn –/– 及野生型小鼠以ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照組(N=15/組)。在第90天收集腦，用於CD68 IHC。使用自動圖像分析軟體，將在視丘(圖17A)、皮質(圖17B)及海馬迴(圖17C)中的CD68染色定量作為每個視野的陽性面積。在第1天自未處理之 Grn –/– 及野生型小鼠收集的腦被包括作為基線對照組。誤差槓代表SEM。基於所有第90天的組別相對於媒劑處理的 Grn –/– 對照組之單因子變異數分析、之後的杜凱氏多重比較檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001及****p＜0.0001。 圖18顯示在投予PBFT02或媒劑之 Grn –/– 小鼠腦中之己醣胺酶活性的定量。 Grn –/– 小鼠以4.4 x 10 9GC(N=15)、1.3 x 10 10GC(N=13)、4.4 x 10 10GC(N=15)、1.3 x 10 11GC(N=15)之劑量ICV投予PBFT02。將 Grn –/– 及野生型小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照組(N=15/組)。在第90天，收集腦的第三額葉(主要是皮質組織)的腦樣品，並使用螢光基質測量HEX活性。來自第1天屍體剖檢的未處理的 Grn –/– 及野生型小鼠的腦組織溶胞產物被包括作為基線對照組。誤差槓代表SEM。基於所有第90天的組別相對於媒劑處理的 Grn –/– 對照組之單因子變異數分析、之後的杜凱氏多重比較檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001及****p＜0.0001。 圖19顯示投予PBFT02或媒劑的野生型小鼠的體重。將野生型小鼠ICV投予PBFT02(1.3 x 10 11GC [N=8/組])或媒劑(ITFFB；[N=4/組])。動物在基線(第-4天)及在投劑後每週稱重。將所有投予PBFT02(第2、4、6及8組)的小鼠合併用於分析，並將所有投予媒劑(第1、3、5及7組)的組合併用於分析。誤差槓代表SEM。 圖20顯示對野生型小鼠腦室內投予PBFT02後的載體生物分布。在PBFT02(1.3 x 10 11GC [N=8/組])或媒劑(TFFB；[N=4/組])的單次ICV投予後10、30、60及90天，從野生型小鼠屍體剖檢收集腦、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及骨骼肌(股四頭肌)。每條槓代表每μg DNA檢測到的平均載體基因體。誤差槓代表SEM。LOD為50 GC/μg DNA。 圖21顯示在投予PBFT02或媒劑的野生型小鼠的CNS中的轉基因產物表現。將野生型小鼠ICV投予PBFT02(1.3 x 10 11GC [N=8/組])或媒劑(ITFFB；[N=4/組])。在第10、30、60及90天收集CSF、腦及脊髓，並藉由ELISA測量人類PGRN表現。誤差槓代表SEM。基於非成對t檢定，*p＜0.05，**p＜0.01及****p＜0.0001。 圖22顯示在投予PBFT02或媒劑的野生型小鼠血清中的轉基因產物表現。將野生型小鼠ICV投予PBFT02(1.3 x 10 11GC [N=8/組])或媒劑(ITFFB；[N=4/組])。在第10、30、60及90天收集血清，並藉由ELISA測量人類PGRN表現。誤差槓代表SEM。對每個時間點進行非成對t檢定。 圖23A-圖23F顯示在投予PBFT02或媒劑的野生型小鼠的周邊器官中的轉基因產物表現。將野生型小鼠ICV投予PBFT02(1.3 x 10 11GC [N=8/組])或媒劑(ITFFB；[N=4/組])。在第10、30、60及90天，收集心臟(圖23A)、肝臟(圖23B)、脾(圖23C)、腎臟(圖23D)、股四頭肌(圖23E)及頸部淋巴節(圖23F)。藉由ELISA測量人類PGRN表現。誤差槓代表SEM。基於非成對t檢定，*p＜0.05及**p＜0.01。 圖24顯示來自健康NHP第二趾所記錄的典型正中神經SNAP的典型感覺神經動作電位波。感覺神經傳導速度係藉由將刺激陰極與第二趾處之記錄部位之間的距離除以起始潛伏期(onset latency)(即，刺激及SNAP起始之間的時間)而計算。SNAP振幅計算為SNAP起始與SNAP峰值的電壓差。 圖25顯示ICM投予PBFT02至NHP後的感覺神經動作電位。來自成年NHP在BL以及第28±3天及第90±5天的代表性SNAP波形，該NHP以3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的劑量接受單次ICM投予PBFT02。動物181323(第1組)、171229(第2組)、171311(第3組)及171246(第4組)分別在媒劑、低、中、高劑量組中所有動物所獲得的神經傳導數據中為代表性的，除了以下之外：動物171123(媒劑，第1組)及180668(低劑量，第2組)，此等在第90±5天顯示單側SNAP振幅顯著降低；以及動物171209(高劑量；第4組)，其在第90±5天顯示SNAP振幅雙側顯著降低。 圖26A及圖26B顯示ICM投予PBFT02後，NHP中的SNAP振幅(圖26A)及神經傳導速度(圖26B)。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。在BL以及第28天及第90天進行感覺神經傳導研究。顯示左右正中神經的SNAP振幅及傳導速度。 圖27顯示ICM投予PBFT02後NHP的體重。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。在第0、7、14、28、60及90天監測體重。 圖28顯示ICM投予PBFT02或媒劑後NHP腦脊髓液中的白血球計數。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。在第0、7、14、28、60及90天收集CSF。將白血球定量為每μl CSF的白血球(WBC)數量。 圖29顯示ICM投予PBFT02後NHP中對殼體或轉基因的IFN-γ T細胞反應的總結。 圖30顯示ICM投予PBFT02至NHP後在CSF及血清中的載體藥物動力學。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。在第0、7、14及60天收集CSF。在第0、7、14、28及60天收集全血。藉由TaqMan qPCR定量載體基因體。 圖31顯示ICM投予PBFT02至NHP後尿液及糞便中的載體排出。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。在基線及第5、28、60及90天收集尿液及糞便。藉由TaqMan qPCR定量載體基因體。 圖32顯示ICM投予PBFT02至NHP後在NHP的腦脊髓液及血清中的人類PGRN表現。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。在第0、7、14、28、60及90天收集CSF。在BL及第14、28、60及90天收集血清。藉由ELISA分析樣品以評估人類PGRN表現水準。 圖33顯示ICM投予PBFT02後NHP之腦脊髓液中的人類PGRN蛋白。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。藉由ELISA分析第14天所收集的CSF以評估人類PGRN表現水準。 圖34顯示ICM投予PBFT02後，在NHP之CSF及血清中的抗人類PGRN抗體。成年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=2/組)或劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)的PBFT02。在第0、7、14、28、60及90天收集CSF。在BL及第14、28、60及90天收集血清。藉由ELISA分析樣品以評估抗人類PGRN抗體水準。 圖35顯示ICM投予PBFT02至NHP後90天的載體生物分布。從接受單次ICM投予劑量為3.0 x 10 12GC(低劑量)、1.0 x 10 13GC(中劑量)或3.0 x 10 13GC(高劑量)(N=3/組)之PBFT02後90天的成年NHP屍體剖檢中收集指定的組織。亦從媒劑(ITFFB)處理的NHP(N=2)中收集組織作為對照組。每個槓代表每μg DNA檢測到的平均載體基因體。誤差槓代表SEM。LOD為50 GC/μg DNA。 PBFT02 圖36A-圖36C顯示首次用於人體研究的事件時間表。
提供一種包含重組AAV之醫藥組成物，該重組AAV包含AAV1殼體及具有顆粒蛋白前體編碼序列之載體基因體。該醫藥組成物係有用於治療人類患者之成年發病神經退化性疾病(包括顆粒蛋白前體( GRN)相關額顳葉失智症(FTD))的方法及方案。
如本文中所使用，術語「AAV.hPGRN」或「rAAV.hPGRN」用於指稱重組腺相關病毒，其具有一其中含載體基因體的AAV殼體，該載體基因體包含在調節序列控制下的人類顆粒蛋白前體( GRN，亦為 PGRN)編碼序列。可指定特定的殼體類型，舉例而言，例如：AAV1.hPGRN，其係指具有AAV1殼體之重組AAV；AAVhu68.hPGRN，其係指具有AAVhu68殼體之重組AAV；AAV5.hPGRN係指具有AAV5殼體之重組AAV。
「重組AAV」或「rAAV」為一種DNA酶抗性病毒顆粒，含有兩個元件：AAV殼體、以及包裝在AAV殼體內的至少含有非AAV編碼序列的載體基因體。除非另有說明，否則此術語可與短語「rAAV載體」互換使用。該rAAV為一種「複製缺陷型病毒」或「病毒載體」，因為其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因且不能產生子代。在某些具體實施例中，唯一的AAV序列為AAV反向末端重複序列(ITR)，其通常位於載體基因體的5’及3’末端，以使位於ITR之間的基因及調節序列包裝在AAV殼體內。
如本文中所使用，「載體基因體」係指包裝在形成病毒顆粒的rAAV殼體內部的核酸序列。如此的核酸序列含有AAV反向末端重複序列(ITR)。在本文實施例中，載體基因體由5’至3’，最低限度含有AAV 5’ ITR、編碼序列及AAV 3’ ITR。可選擇來自AAV2(與殼體之來源AAV不同)之ITR、或除了全長以外的ITR。在某些具體實施例中，ITR係來自與生產過程中提供rep功能的AAV相同的AAV來源或反式互補AAV。再者，可使用其它ITR。此外，載體基因體含有引導基因產物表現的調節序列。載體基因體的適當組件於本文中更詳細地討論。
治療性蛋白質及編碼序列：rAAV包括人類顆粒蛋白前體(hPGRN)蛋白質或其執行hPGRN的一或多種生物功能的變異體之編碼序列。此蛋白質之編碼序列被工程化至載體基因體內，以於中樞神經系統(CNS)中表現。
人類PGRN1(hPGRN)最常以GenBank NP_002078的593個胺基酸序列表示特徵，其再現於SEQ ID NO：1。此序列含有在位置1至17的訊息肽、與包含胺基酸18至約593之分泌性顆粒蛋白前體蛋白質或分泌性顆粒蛋白。此蛋白質可裂解成8條鏈：顆粒蛋白1(aka顆粒蛋白G：約胺基酸58至約胺基酸113)、顆粒蛋白2(約胺基酸123至約179)、顆粒蛋白3(約胺基酸206至約胺基酸261)、顆粒蛋白4(約胺基酸281至約胺基酸336)、顆粒蛋白5(約胺基酸364至約胺基酸417)、顆粒蛋白6(約胺基酸442至約胺基酸496)及顆粒蛋白7(約胺基酸518至約胺基酸573)；參照SEQ ID NO：1的編號。在某些具體實施例中，異源訊息肽可取代天然訊息肽。然而，其它具體實施例可包含顆粒蛋白前體與外源訊息肽(例如，人類IL2引導子(leader))。亦參見例如www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia。因此，考量含有顆粒蛋白前體及/或其片段的融合蛋白質。此類融合蛋白質可包含一或多種活性GRN(例如，GRN 1、2、3、4、4、6或7)與彼此之不同的組合，或者一或多種此等肽可與全長PGRN或另一蛋白質或肽(例如，另一活性蛋白質或肽及/或對人類PGRN為外源之訊息肽)結合。
載體基因體被工程化以攜帶此蛋白質之編碼序列，並在人類細胞中表現蛋白質，特別是在中樞神經系統。在某些具體實施例中，該編碼序列可為天然序列，見於GenBank：NM_002087.3，其再現於SEQ ID NO：2。
在某些具體實施例中，編碼序列提供於SEQ ID NO：3。某些其它具體實施例將包含與SEQ ID NO：3具有95%至99.9%或100%同一性的編碼序列，包括彼等之間的值。在一些具體實施例中，為了更好的治療結果，將編碼序列進行密碼子最適化，例如，在哺乳動物細胞中增強表現。可在具有訊息(引導子)序列之全長顆粒蛋白前體的編碼序列上、在不具有訊息(引導子)序列的顆粒蛋白前體上、或在如本文所定義之融合蛋白質的編碼序列的長度上評估同一性。在某些具體實施例中，編碼序列提供於SEQ ID NO：3。某些其它具體實施例將包含與SEQ ID NO：4具有95%至低於100%同一性的編碼序列。可在具有訊息(引導子)序列之全長顆粒蛋白前體的編碼序列上、在不具有訊息(引導子)序列的顆粒蛋白前體上、或在如本文所定義之融合蛋白質的編碼序列的長度上評估同一性。
適當地，此等編碼序列編碼全長顆粒蛋白前體。然而，其它具體實施例中，可包含活性顆粒蛋白鏈與異源訊息肽(例如，人類IL2引導子)。亦參見例如www.signalpeptide.de/index.php?m=listspdb_mammalia。
在某些具體實施例中，可使用人類PGRN之編碼序列(例如，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4)或與其約95%至99.9%或100%相同之序列的片段。此類片段可編碼活性人類GRN(aa 18-593)，或者編碼包含具有活性人類GRN之異源訊息肽的融合肽。在某些具體實施例中，用於一或多種活性GRN(例如，GRN1、2、3、4、4、6或7)之一或多種編碼序列可以與彼此之各種組合的方式而被包括於載體基因體中，或者一或多種此等肽可與全長PGRN或另一編碼序列組合。
不希望受到理論的束縛，據信在CNS的細胞子集(例如，室管膜細胞)中AAV媒介的PGRN表現提供分泌的蛋白質的儲存庫。分泌的PGRN蛋白質(及/或一或多種GRN)被其它細胞經由分揀蛋白(sortilin)或甘露糖-6-磷酸(mannose-6-phosphate)受體攝入，隨後被運送至溶酶體。在某些具體實施例中，該分泌的蛋白質為顆粒蛋白前體。在某些具體實施例中，該分泌的蛋白質為顆粒蛋白。在某些具體實施例中，該分泌的蛋白質包括顆粒蛋白前體與顆粒蛋白之混合物。
在某些具體實施例中，除了顆粒蛋白前體編碼序列外，可包括另一非AAV編碼序列，例如，感興趣的肽、多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它基因產物。有用的基因產物可包括miRNA。miRNA及其它小干擾核酸經由目標RNA轉錄本裂解/降解或目標傳訊RNA(mRNA)的轉譯抑制來調節基因表現。miRNA係被自然地表現，通常作為最終19-25個非轉譯RNA產物。miRNA通過與目標mRNA的3’非轉譯區(UTR)之序列特異性的相互作用來展現其活性。此等內源表現的miRNA形成髮夾型前驅物(hairpin precursors)，隨後被加工成miRNA雙鏈體(miRNA duplex)，進而加工成「成熟的」單股miRNA分子。這種成熟的miRNA引導一種多蛋白質複合物miRISC，其基於彼等之與成熟miRNA的互補性來辨識目標mRNA的靶位，例如在3’ UTR區域。
在某些具體實施例中，表現匣(expression cassette)進一步包含一或多個抑制hPGRN在背根節(drg)中表現的miRNA標靶序列。在某些具體實施例中，該表現匣包含drg特異性miRNA標靶序列的至少兩個串接重複序列，其中該至少兩個串接重複序列包含至少一個第一miRNA標靶序列及至少一個第二miRNA標靶序列，此等可為相同或相異。在某些具體實施例中，該串接miRNA標靶序列為連續的或被1至10個核酸的間隔子(spacer)分隔開，其中該間隔子並非miRNA標靶序列。在某些具體實施例中，至少有二個drg特異性miRNA標靶序列位於hPGRN編碼序列3’側。在某些具體實施例中，該至少兩個drg特異性miRNA串接重複序列的第一者起始於距離hPGRN-編碼序列的3’末端20個核苷酸內。在某些具體實施例中，該至少兩個drg特異性miRNA串接重複序列的第一者起始於距離hPGRN-編碼序列的3’末端至少100個核苷酸內。在某些具體實施例中，該miRNA串接重複序列包含長度200至1200個核苷酸。在某些具體實施例中，至少有二個drg特異性miRNA標靶序列位於hPGRN編碼序列5’ 處。在某些具體實施例中，至少二個drg特異性miRNA標靶序列位於hPGRN編碼序列之5’及3’側兩方。在某些具體實施例中，表現匣mRNA或DNA正股的至少第一及/或至少第二miRNA標靶序列的該miRNA標靶序列係選自(i)AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(miR183，SEQ ID NO：32)；(ii)AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(SEQ ID NO：33)；(iii)AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO：34)；及(iv)AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC(SEQ ID NO：35)。在某些具體實施例中，二個以上的連續miRNA標靶序列為連續的且未被間隔子分隔開。在某些具體實施例中，二個以上的miRNA標靶序列被間隔子分隔開且各間隔子獨立選自下列之一或多種：(A)GGAT；(B)CACGTG；或(C)GCATGC。在某些具體實施例中，位於miRNA標靶序列之間的間隔子可位於第一miRNA標靶序列3’側及/或最後的miRNA標靶序列5’ 側。在某些具體實施例中，miRNA標靶序列之間的間隔子為相同的。參見2020年2月12日申請之國際專利申請號PCT/US19/67872，其藉由引用併入本文。
AAV1來自分支群F(Clade F)的AAVhu68可用於製造靶向並在CNS中表現hPGRN的載體。然而，未預期地觀察到，即使觀察到相當的血漿濃度，與AAVhu68相比，AAV1媒介的PGRN遞送在CNS中提供了更好的PGRN表現。本案發明人等發現，rAAV1.PGRN的鞘內遞送為本文所述療法的有吸引力的遞送途徑。因此，在特別理想的具體實施例中，選擇AAV1殼體。
在某些具體實施例中，提供一種組成物，其包含適於鞘內注射的水性液體及具有AAV殼體的rAAV系群(stock)，該殼體優先靶向室管膜細胞，其中rAAV進一步包含載體基因體，其具有用於遞送至中樞神經系統(CNS)的PGRN編碼序列。在某些具體實施例中，組成物被調配用於枕骨下注射至腦大池中(腦大池內)。在某些具體實施例中，經由電腦斷層掃描(computed tomography；CT)導引的rAAV注射來投予rAAV。在某些具體實施例中，患者被投予單次劑量的組成物。
AAV1殼體係指具有AAV vp1蛋白質、AAV vp2蛋白質及AAV vp3蛋白質的殼體。在特定具體實施例中，AAV1殼體包含約1:1:10預定比例的AAV vp1蛋白質、AAV vp2蛋白質及AAV vp3蛋白質組裝成60個總vp蛋白質的T1二十面體殼體。AAV1殼體能夠包裝基因體序列以形成AAV顆粒(例如，重組AAV，其中基因體為載體基因體)。一般而言，編碼最長的vp蛋白質(即，VP1)的殼體核酸序列在製造具有AAV1殼體的rAAV的過程中反式( trans)表現，敘述於例如美國專利號6,759,237、美國專利號7,105,345、美國專利號7,186,552、美國專利號8,637,255及美國專利號9,567,607，此等藉由引用併入本文。
殼體編碼序列並不存在於最終組裝的rAAV1.hPGRN中。然而，如此的序列用於生產重組AAV。在某些具體實施例中，AAV1殼體編碼序列為編碼SEQ ID NO：26的全長AAV1 VP1蛋白質或其VP2或VP3區域的任何核酸序列。參見例如美國專利號6,759,237、美國專利號7,105,345、美國專利號7,186,552、美國專利號8,637,255及美國專利號9,567,607，此等藉由引用併入本文。在某些具體實施例中，AAV1殼體編碼序列為SEQ ID NO：25。在一些具體實施例中，AAV1殼體為由SEQ ID NO：25編碼序列所生產且具有或不具有轉譯後修飾的蛋白質。然而，此編碼序列的變異體可被工程化及/或其它編碼序列可使用AAV1 VP1、AAV1 VP2及/或AAV VP3胺基酸序列反轉譯(backtranslated)成所需的表現系統。
在某些具體實施例中，包含重組AAV1之組成物具有殼體，其中AAV1含有高度脫醯胺化(N57、N383、N512及N718)的五個胺基酸，基於再現於SEQ ID NO：26的AAV1 VP1的初級序列之編號。
AAV1修飾
酵素 胰蛋白酶 胰蛋白酶 胰蛋白酶 胰蛋白酶 胰蛋白酶 胰蛋白酶 胰蛋白酶
%覆蓋率 N+1 97.6 84.2 92.4 87.4 90.4 85.2 88.9
N35+脫醯胺化 Q 9.5
~N57+脫醯胺化 G 100.0 100.0 100.0 92.0 89.3 86.1 85.5
~N94+脫醯胺化 H 2.3 3.7 4.9 2.2
N113+脫醯胺化 L 5.6
~N214+脫醯胺化 N 0.9 0.4 1.0 0.7
~N223+脫醯胺化 A 21.4 25.9
N227+脫醯胺化 W 4.9 3.1
~N253+脫醯胺化 H 29.7
Q259+脫醯胺化 I 24.6 14.2
~N269+脫醯胺化 D 21.6 5.2
~N271+脫醯胺化 H 27.7
N286+脫醯胺化 R 5.4 5.2
~N302+脫醯胺化 N NN 43.7 48.6 18.8 12.4 28.7 16.3 11.9
~N303+脫醯胺化 N N N 50.8 19.3
~N383+脫醯胺化 G 88.5 86.9 82.5 82.1 84.6 83.4 92.3
~N408+脫醯胺化 N 58.2 43.2 40.5 30.1 25.7 28.3 22.8
~N451+脫醯胺化 Q 20.5
~Q452+脫醯胺化 S 1.7
N477+脫醯胺化 W 4.4 3.1 39.7 1.2 1.3 1.1 1.8
~N496+脫醯胺化 N NN 1.1 69.9
N512+脫醯胺化 G 93.7 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 97.3
N651+脫醯胺化 T 2.0 2.1 1.6 0.6
N691+脫醯胺化 S 57.1
~N704+脫醯胺化 Y 9.4
N718+脫醯胺化 G 98.7 98.1 98.2 89.5 91.9 92.3 87.4
在某些具體實施例中，AAV1的特徵為一種VP同功型(VP isoforms)的異源性族群(heterogenous population)的殼體組成物，該VP同功型係如下表中所定義被脫醯胺化，基於殼體中VP蛋白質的總量(使用質譜法確定)。在某些具體實施例中，AAV殼體在一或多個下列位置、在以下所提供的範圍內進行修飾(使用質譜法確定)。殘基編號基於公開的AAV1序列，該序列於SEQ ID NO：26中再現。
表
基於VP1編號的AAV1殼體位置 %
N35+脫醯胺化 1-15、5-10
~N57+脫醯胺化 65-90、70-95、80-95、75-100、80-100或90-100
N113+脫醯胺化 0-8
~N223+脫醯胺化 0-30、0、20-28
N227+脫醯胺化 0、1-5
~N253+脫醯胺化 0、1-35
Q259+脫醯胺化 0、10-25
~N269+脫醯胺化 0-25
~N271+脫醯胺化 0-25
N286+脫醯胺化 2-10
~N302+脫醯胺化 10-50
~N303+脫醯胺化 0-55
~N383+脫醯胺化 65-90、70-95、80-95、75-100、80-100或90-100
~N408+脫醯胺化 30-65
~N451+脫醯胺化 0-25
~Q452+脫醯胺化 0-5
N477+脫醯胺化 0-45
~N496+脫醯胺化 0-75
N512+脫醯胺化 75-100、80-100、90-100
N651+脫醯胺化 0-3
N691+脫醯胺化 0、1-60
~N704+脫醯胺化 0-10
N718+脫醯胺化 75-100、80-100、90-100
適當的修飾包括彼等描述於以上段落中標識為脫醯胺化調控者，其被併入本文中。在某些具體實施例中，一或多個下列位置或N之後的甘胺酸如本文所述被修飾。在某些具體實施例中，構築AAV1突變體，其中保留在57、383、512及/或718位置的N之後的甘胺酸(即保持未修飾的)。在某些具體實施例中，在前句中所指的四個位置的NG以天然序列被保留。殘基編號係基於公開的AAV1 VP1，其再現於SEQ ID NO：26。在某些具體實施例中，人工NG被導入不同於上表中所指的位置之一的位置。
rAAV 載體如上所指，具有AAV1殼體的重組AAV為本文所述用於治療FTD的較佳載體。在某些具體實施例中，例如，在下列實例中(例如，AAVhu68或AAV5)，其它AAV殼體可用於產生rAAV。在某些具體實施例中，可選擇AAV1殼體，且包含顆粒蛋白前體( GRN)編碼序列之載體基因體的一或多個元件可被取代。
如本文中所使用，AAVhu68殼體係指一種如WO 2018/160582(藉由引用併入本文)所定義之殼體。如本文所述，rAAVhu68具有由AAVhu68核酸(例如，SEQ ID NO：30)表現殼體的生產系統中所生產的rAAVhu68殼體，該核酸編碼SEQ ID NO：31之vp1胺基酸序列及可選擇地編碼另外的核酸序列，例如編碼不含vp1及/或vp2獨特區域的vp 3蛋白質。使用單一核酸序列vp1的生產所產生的rAAVhu68會生產vp1蛋白質、vp2蛋白質及vp3蛋白質的異源性族群。更明確而言，AAVhu68殼體含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞族群，此等亞族群具有來自SEQ ID NO：31中預期的胺基酸殘基的修飾。此等亞族群最低限度包括脫醯胺化天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度脫醯胺化。在一具體實施例中，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：30的序列或與其互補之股，例如，對應的mRNA或tRNA。在某些具體實施例中，vp2及/或vp3蛋白質可另外地或替代地從不同於vp1的核酸序列表現，例如以改變所選擇的表現系統中vp蛋白質的比例。某些具體實施例中，亦提供一種核酸序列，其編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區域(約aa 1至約aa 202)之SEQ ID NO：31的AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)或與其互補之股，對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：30的約nt 607至約nt 2211)。在某些具體實施例中，亦提供一種核酸序列，其編碼不具有vp1獨特區域(約aa 1至約137)之SEQ ID NO：31的AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)或與其互補之股，對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：30的nt 411至2211)。
如本文中所使用，AAV5殼體具有預期的SEQ ID NO：29的胺基酸序列。在某些具體實施例中，自SEQ ID NO：28的核酸序列表現AAV5殼體。
包裝於AAV殼體中並遞送到宿主細胞的基因體序列通常最低限度由轉基因及其調節序列以及AAV反向末端重複(ITR)所構成。單股AAV及自互補(self-complementary；sc)AAV二者皆涵括在rAAV中。轉基因為一種與載體序列異源之核酸編碼序列，其編碼感興趣的多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它基因產物。核酸編碼序列係以允許轉基因在目標組織的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與調節組件可操作地連接。
載體的AAV序列通常包含順式作用(cis-acting)的5’及3’反向末端重複序列(參見例如B. J. Carter, in “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990))。ITR序列長度約為145 bp。儘管允許此等序列的某些程度上的微小修飾，但較佳為實質上編碼ITR的整個序列都使用在分子中。修飾此等ITR序列的能力係在本領域的技術範圍內(參見例如，如Sambrook et al, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；及K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 53 2(1996)之文獻)。在本發明中使用的這種分子的實例為含有轉基因的「順式作用」質體，其中所選擇的轉基因序列及相關的調控元件兩側為5’及3’ AAV ITR序列。在一具體實施例中，ITR來自與提供殼體的AAV不同的AAV。在一具體實施例中，ITR序列來自AAV2。已描述被稱為ΔITR的5’ ITR的縮減版本，其中刪除了D序列(D-sequence)及末端分割位(terminal resolution site；trs)。在其它具體實施例中，使用全長AAV 5’及3’ ITR。然而，可選擇來自其它AAV來源的ITR。當ITR的來源係來自AAV2，而AAV殼體係來自另一AAV來源時，所生成的載體可稱為假型化的(pseudotyped)。然而，此等元件的其它配置可為適當的。
除了上述所指的重組AAV載體的主要元件外，該載體亦包括必需的習知控制元件，其以允許轉基因在用質體載體轉染或用本發明所製造的病毒感染的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式與轉基因可操作地連接。如本文中所使用，「可操作地連接的」序列包括與目的基因相鄰的表現控制序列、及反式或遠距離地作用以控制目的基因的表現控制序列。
調節控制元件通常含有啟動子序列作為表現控制序列的一部分，例如，位於所選擇的5’ ITR序列及編碼序列之間。可使用組成型啟動子(constitutive promoter)、可調節的啟動子(regulatable promoter)[參見例如WO 2011/126808及WO 2013/04943]、組織特異性啟動子或對生理提示有反應的啟動子可被用於本文所述的載體。啟動子可選自不同來源，例如，人類巨細胞病毒(CMV)立即早期強化子/啟動子、SV40早期強化子/啟動子、JC多瘤病毒(JC polymovirus)啟動子、髓鞘質鹼性蛋白(myelin basic protein；MBP)或神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；GFAP)啟動子、單純泡疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(latency associated promoter；LAP)、勞斯氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus；RSV)長末端重複(long terminal repeat；LTR)啟動子、神經元特異性啟動子(neuron-specific promoter；NSE)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor；PDGF)啟動子、hSYN、黑色素濃縮激素(melanin-concentrating hormone；MCH)啟動子、CBA、基質金屬蛋白啟動子(matrix metalloprotein promoter；MPP)及雞β-肌動蛋白啟動子。除了啟動子之外，載體可含有一或多種其它適當的轉錄起始、終止、強化子序列、有效的RNA加工訊息(例如剪接及多腺核苷酸化(polyA)訊息)；穩定細胞質mRNA的序列，例如WPRE；增強轉譯效率的序列(即，Kozak共通序列)；增強蛋白質穩定性的序列；及當需要時，增強所編碼的產物分泌的序列。適當的強化子之實例為CMV強化子。其它適當的強化子包括彼等適於所欲目標組織適應症者。在一具體實施例中，表現匣包含一或多種表現強化子。在一具體實施例中，表現匣含有二個以上的表現強化子。此等強化子可相同或可彼此相異。例如，強化子可包括CMV立即早期強化子。此強化子可能以位置彼此相鄰的兩個拷貝的方式存在。或者，強化子的雙重拷貝可被一或多個序列分開。在另外的具體實施例中，表現匣進一步含有內含子，例如，雞β-肌動蛋白內含子。其它適當的內含子包括技術領域中已知者，舉例而言，例如WO 2011/126808中所述者。適當的polyA序列之實例包括例如：SV40、SV50、牛生長激素(bovine growth hormone；bGH)、人類生長激素及合成的polyA。可選擇地，可選擇一或多種序列以穩定mRNA。此種序列的實例為經修飾之WPRE序列，其可被工程化於polyA序列的上游及編碼序列之下游[參見例如，MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619]。
在一具體實施例中，載體基因體包含：AAV 5’ ITR、啟動子、可選擇的強化子、可選擇的內含子、人類PGRN或包含其之融合蛋白質的編碼序列、poly A及AAV 3’ ITR。在某些具體實施例中，載體基因體包含：AAV 5’ ITR、啟動子、可選擇的強化子、可選擇的內含子、人類PGRN或包含其之融合蛋白質的編碼序列、poly A及AAV 3’ ITR。在某些具體實施例中，載體基因體包含：AAV 5’ ITR、啟動子、可選擇的強化子、可選擇的內含子、hPGRN編碼序列、poly A及AAV 3’ ITR。在某些具體實施例中，載體基因體包含：AAV2 5’ ITR、EF1a啟動子、可選擇的強化子、可選擇的啟動子、hPGRN、SV40 poly A及AAV2 3’ ITR。在某些具體實施例中，載體基因體為AAV2 5’ ITR、UbC啟動子、可選擇的強化子、可選擇的內含子、hPGRN、SV40 poly A及AAV2 3’ ITR。在某些具體實施例中，載體基因體為AAV2 5’ ITR、CB7啟動子、內含子、hPGRN、SV40 poly A及AAV2 3’ ITR。在某些具體實施例中，載體基因體為AAV2 5’ ITR、CB7啟動子、內含子、hPGRN、兔β球蛋白poly A及AAV2 3’ ITR。參見例如SEQ ID NO：22(EF1a.hPGRN.SV40)、SEQ ID NO：23(UbC.PI.hPGRN.SV40)或SEQ ID NO：24(CB7.CI.hPGRN1.rBG)。hPGRN編碼序列係選自本說明書中所定義者。參見例如SEQ ID NO：3或與其95%至99.9%相同之序列、或者SEQ ID NO：4或與其95%至99.9%相同之序列、或者如本文所定義之此等之片段。以下提供實施例中所使用之載體元件的說明性序列，例如，於SEQ ID NO：6(兔球蛋白polyA)、AAV ITR(SEQ ID NO：7及8)、人類CMV IE啟動子(SEQ ID NO：9)、CB啟動子(SEQ ID NO：10)、嵌合內含子(SEQ ID NO：11)、UbC啟動子(SEQ ID NO：12)、EF-1a啟動子(SEQ ID NO：17)、內含子(SEQ ID NO：13)及SV40晚期poly A(SEQ ID NO：14)。對於本發明的某些具體實施例，可選擇載體基因體的其它元件或在此等序列上的改變用於載體基因體。
載體生產為了用於生產AAV病毒載體(例如，重組AAV)，可將表現匣攜帶在遞送至包裝宿主細胞(packaging host cell)的任何適當的載體(例如質體)上。於本發明中有用的質體可被工程化，從而使其適於在原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等活體外複製及包裝。適當的轉染技術及包裝宿主細胞為本技術領域中具有通常知識者已知及/或可容易地設計。
產生及單離適於用作載體之AAV的方法為技術領域中已知。通常參見例如Grieger & Samulski, 2005, “Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications,” Adv. Biochem. Engin/Biotechnol.99: 119-145；Buning et al.,2008, “Recent developments in adeno-associated virus vector technology,” J. Gene Med.10:717-733；及下文引用之參考文獻，此等各藉由引用將其整體併入本文。為了將轉基因包裝到病毒粒子(virion)中，在與含有表現匣的核酸分子相同的構築體中，ITR為順式中唯一所需的AAV組件。cap及rep基因可以反式的方式提供。
在一具體實施例中，本文所述之表現匣被工程化至遺傳元件(例如，穿梭質體(shuttle plasmid))中，將攜帶在其上的免疫球蛋白構築體序列轉移至包裝宿主細胞中以生產病毒載體。在一具體實施例中，所選擇的遺傳元件可藉由任何適當方法遞送至AAV包裝細胞，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA包覆小粒(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染及原生質體融合。穩定的AAV包裝細胞亦可被製造。或者，表現匣可用於產生AAV以外的病毒載體，或用於活體外抗體混合物之製造。用於製造此類構築體的方法為核酸操作且包括遺傳工程、重組工程及合成技術的技術人員已知的。參見例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指一種組裝的rAAV殼體，其缺少包裝在其中的所欲基因體序列。此等亦可稱為「空(empty)」殼體。此類殼體可不含表現匣的可檢測基因體序列，或僅含有不足以達到基因產物表現的部分包裝的基因體序列。此等空殼體對於將目的基因轉移到宿主細胞係沒有功能的。
本文所述之重組腺相關病毒(AAV)可使用已知的技術產生。參見例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此類方法涉及培養含有編碼AAV殼體蛋白質之核酸序列的宿主細胞；功能性rep基因；最低限度由AAV反向末端重複(ITR)及轉基因所構成的表現匣；及足夠的輔助功能，以允許將表現匣包裝至AAV殼體蛋白質中。產生殼體的方法、其所用之編碼序列以及製造rAAV病毒載體的方法已被描述，參見例如Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
在一具體實施例中，提供有用於產生重組AAV的生產細胞培養物。此類細胞培養物含有在宿主細胞中表現AAV殼體蛋白質的核酸；適於包裝至AAV殼體中的核酸分子，例如含有AAV ITR及編碼基因產物的非AAV核酸序列的載體基因體，該非AAV核酸序列可操作連接至引導產物在宿主細胞中表現的序列；及足夠的AAV rep功能及腺病毒輔助功能，以允許將核酸分子包裝至重組AAV殼體中。在一具體實施例中，細胞培養物係由哺乳動物細胞(例如人類胚腎293細胞等)或昆蟲細胞(例如桿狀病毒(baculovirus))所構成。
通常，rep功能來自於與提供位於載體基因體兩側之ITR的AAV相同的AAV來源。在本文實施例中，選擇AAV2 ITR並使用AAV2 rep。編碼序列再現於SEQ ID NO：27。可選擇地，可選擇其它rep序列或另一rep來源(及可選擇地另一ITR來源)。例如，rep可為但不限於AAV1 rep蛋白質、AAV2 rep蛋白質；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78及rep40/52；或其片段；或另一來源。可選擇地，於細胞培養物中rep及cap序列在相同遺傳元件上。在rep序列及cap基因之間可存在間隔子。此等AAV或突變體AAV殼體序列中的任何一種可在引導其在宿主細胞中表現的外源調節控制序列的控制下。
在一具體實施例中，細胞在合適的細胞培養(例如，HEK 293)細胞中製造，製造本文所述之基因療法載體的方法包括技術領域中熟知的方法，例如產生用於製造基因療法載體的質體DNA、產生載體及純化載體。在一些具體實施例中，基因療法載體為AAV載體，且所產生的質體為編碼AAV基因體及目的基因的AAV順式質體、含有AAV rep及cap基因的AAV反式質體、及腺病毒輔助質體。載體產生方法可包括以下方法步驟：例如開始細胞培養、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、將轉染後培養基更換為無血清培養基、以及收穫含有載體的細胞及培養基。
在某些具體實施例中，用於rAAV.hPGRN的製造方法涉及以質體DNA來短暫轉染(transient transfection)HEK293細胞。在PALL iCELLis生物反應器中藉由HEK293細胞之PEI媒介的三重轉染，而製造單一批次或多批次。在可能的情況下，在可拋棄式、封閉式生物處理系統中，藉由澄清、TFF、親和性層析及陰離子交換層析依次純化所收穫的AAV材料。
所收穫的含有載體之細胞及培養基在本文中係指粗製細胞收穫物。在另一系統中，藉由以基於桿狀病毒載體感染將基因療法載體導入昆蟲細胞中。關於此等生產系統的綜述，通常參見例如Zhang et al., 2009, “Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,” Human Gene Therapy 20:922-929，其各自的內容藉由引用整體併入本文。製造及使用此等及其它AAV生產系統的方法亦敘述於下列美國專利案中，其各自內容藉由引用整體併入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；及7,439,065，此等藉由引用併入本文。
之後，粗製細胞收穫物可施以額外方法步驟，例如載體收穫物的濃縮、載體收穫物的透析過濾(diafiltration)、載體收穫物的微射流體法(microfluidization)、載體收穫物的核酸酶消化、微射流體化中間體的過濾、藉由層析之粗製物純化、藉由超高速離心的粗製物純化、藉由切向流過濾的緩衝液交換、及/或調配及過濾以製備大量載體。
使用高鹽濃度下的兩步驟親和性層析純化然後使用陰離子交換樹脂層析以純化載體藥品並除去空殼體。此等方法更詳細描述於2016年12月9日申請之國際專利申請號PCT/US2016/065970，其藉由引用併入本文。關於AAV8的純化方法，2016年12月9日申請之國際專利申請號PCT/US2016/065976；及關於rh10，2016年12月9日申請之國際專利申請號PCT/US16/66013，標題為「Scalable Purification Method for AAVrh10」，亦申請於2015年12月11日；及關於AAV1，2016年12月9日申請之國際專利申請號PCT/US2016/065974；關於「Scalable Purification Method for AAV1」，申請於2015年12月11日，此等全部藉由引用併入本文中。
為了計算空顆粒及完整(full)顆粒含量，將所選擇的樣品的VP3帶體積(band volume)(例如，在本文實施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中GC#=顆粒#)相對於裝載的GC顆粒作圖。將所產生的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試製品峰的帶體積中的顆粒數。然後將每20 μL裝載的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒對基因體拷貝數的比率(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL並x 100得到空顆粒的百分比。
一般而言，用於分析空殼體及具有包裝的基因體之AAV載體顆粒的方法為技術領域中已知的。參見例如Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330；Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128。為了測試變性殼體，該方法包括使經處理的AAV系群進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，其由能夠分離三種殼體蛋白質的任何凝膠組成，例如，在緩衝液中含有3-8% Tris-乙酸鹽的梯度凝膠，然後運行凝膠直至樣品材料分離，並將凝膠印漬到尼龍或硝化纖維素膜上，較佳為尼龍。然後使用抗AAV殼體抗體作為與變性殼體蛋白質結合的初級抗體，較佳為抗AAV殼體單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。然後使用二級抗體，一種與初級抗體結合的抗體並含有用於檢測與初級抗體的結合之手段，更佳為含有與其共價結合之檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。將用於檢測結合的方法用於半定量地測定初級及二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，來自管柱流份的樣品可被取出並在含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE裝載緩衝液(loading buffer)中加熱，並在預鑄的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)上分離殼體蛋白質。可使用SilverXpress(Invitrogen，CA)，根據製造商的說明書進行銀染色，或者其它適當的染色方法，即，SYPRO ruby或考馬斯(Coomassie)染色。在一具體實施例中，可藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱流份中AAV載體基因體(vg)的濃度。將樣品稀釋並用DNA酶I(或另一適當核酸酶)消化以除去外源DNA。在核酸酶去活化後，將樣品進一步稀釋並使用引子及對引子之間的DNA序列具有特異性的TaqMan TM螢光探針進行擴增。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量各樣品達到定義的螢光水準所需的循環數(閾值循環，Ct)。將含有與AAV載體中所含序列之相同序列的質體DNA用於在Q-PCR反應中產生標準曲線。從樣品獲得的循環閾值(Ct)數值用於藉由將其相對於質體標準曲線的Ct值進行標準化來確定載體基因體效價。亦可使用基於數位PCR的終點分析(End-point assay)。
於一態樣，使用最適化的q-PCR方法，其利用廣效絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(例如從Qiagen購得)。更具體而言，最適化的qPCR基因體效價分析與標準分析相似，除了在DNA酶I消化之後，將樣品以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後加熱去活化。適當地，將樣品以等量於樣品大小的蛋白酶K緩衝液稀釋。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理約為0.2 mg/mL，但可在0.1 mg/mL至約1 mg/mL之間變化。處理步驟通常在約55℃下進行約15分鐘，但可在較低溫度(例如，約37℃至約50℃)下進行較長一段時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)，或者在較高溫度(例如，高至約60℃)下進行較短一段時間(例如，約5至10分鐘)。類似地，加熱去活化通常在約95℃下約15分鐘，但溫度可降低(例如，約70℃至約90℃)並延長時間(例如，約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣品稀釋(例如，1000倍)並如標準分析中所述進行TaqMan分析。
另外或可替代地，可使用微滴式數位PCR(ddPCR)。例如，藉由ddPCR確定單股及自互補AAV載體基因體效價的方法已被敘述。參見例如M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr；25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。
簡而言之，用於分離具有經包裝之基因體序列的rAAV顆粒與缺少基因體的AAV中間體的方法涉及對包含重組AAV病毒顆粒及AAV殼體中間體的懸浮液進行快速表現液相層析(fast performance liquid chromatography)，其中AAV病毒顆粒及AAV中間體係與在高pH平衡的強陰離子交換樹脂結合，並進行鹽度梯度，同時監測洗提液在約260及約280下的紫外線吸光度。pH可根據所選擇之AAV調整。參見例如WO 2017/160360(AAV9)、WO2017/100704(AAVrh10)、WO 2017/100676(例如，AAV8)及WO 2017/100674(AAV1)，此等藉由引用併入本文。在此方法中，當A260/A280的比率達到轉折點時，自洗提的流份中收集AAV完整殼體。在一實例中，關於親和性層析步驟，可將透析過濾的產物應用於有效捕獲AAV2血清型的Capture Select TMPoros-AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)。在此等離子條件下，顯著百分比的殘留細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。
組成物本文提供含有至少一種rAAV.hPGRN系群(例如rAAV系群)及可選擇的載劑、賦形劑及/或防腐劑的組成物。
如本文所用，rAAV的「系群(stock)」係指rAAV族群。儘管由於脫醯胺化作用而彼等之殼體蛋白質存在異質性，但預計系群中的rAAV共有相同的載體基因體。系群可包括具有殼體的rAAV，該殼體具有例如所選擇之AAV殼體蛋白質及所選擇之生產系統的異質性脫醯胺化型態特徵。系群可從單一生產系統生產或從生產系統的多次運行中儲集。可選擇多種生產系統，包括但不限於彼等本文所述者。
在某些具體實施例中，組成物包含一種適用於治療顆粒蛋白前體相關額顳葉失智症(FTD)的重組AAV(rAAV)的病毒系群，該rAAV包含：(a)腺相關病毒1殼體；及(b)包裝在AAV殼體中的載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複、人類顆粒蛋白前體的編碼序列、及引導顆粒蛋白前體表現之調節序列。在某些具體實施例中，該載體基因體包含啟動子、強化子、內含子、人類PGRN編碼序列及多腺核苷酸化訊息。在某些具體實施例中，內含子由雞β肌動蛋白剪接供給體及兔β剪接接受體(rabbit β splice acceptor)元件所組成。在某些具體實施例中，載體基因體進一步包含AAV2 5’ ITR及AAV2 3’ ITR，此等位在載體基因體的所有元件的兩側。
較佳地懸浮於生理相容性載劑中的rAAV.hPGRN可投予至人類或非人類哺乳動物患者。在某些具體實施例中，用於投予至人類患者，rAAV被適合地懸浮在含有生理鹽水、界面活性劑及生理相容性鹽或鹽類混合物的水溶液中。適當地，將調配物調整至生理上可接受的pH，例如範圍在pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7或pH 7.2至7.8。由於腦脊髓液的pH為約7.28至約7.32、或pH為7.2至7.4，對於鞘內遞送，可能需要在此pH範圍內；而對於靜脈內遞送，可能需要pH約6.8至約7.2。然而，可選擇最寬範圍及此等子範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。
在某些具體實施例中，調配物可含有不包含碳酸氫鈉的緩衝生理鹽水溶液。此類調配物可含有緩衝生理鹽水溶液，該緩衝生理鹽水溶液在水中包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其混合物中一或多種，例如哈佛氏緩衝液(Harvard’s buffer)。水溶液可進一步含有Kolliphor® P188，一種從BASF購得的泊洛沙姆(poloxamer)，其先前以商標名Lutrol® F68販售。水溶液可具有pH 7.2或pH 7.4。
在另一具體實施例中，調配物可含有緩衝生理鹽水溶液，該緩衝生理鹽水溶液包含1 mM磷酸鈉(Na 3PO 4)、150 mM氯化鈉(NaCl)、3 mM氯化鉀(KCl)、1.4 mM氯化鈣(CaCl 2)、0.8 mM氯化鎂(MgCl 2)及0.001% Kolliphor®188。參見例如harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。在某些具體實施例中，較佳為哈佛氏緩衝液。
在其它具體實施例中，調配物可含有一或多種滲透增強劑。適當的滲透增強劑之實例可包括例如：甘露醇、甘膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚或EDTA。
在另一具體實施例中，組成物包括載劑、稀釋劑、賦形劑及/或佐劑。鑑於轉移病毒所針對的適應症，本技術領域中具有通常知識者可容易地選擇適當的載劑。例如，一種適當的載劑包括生理鹽水，其可用多種緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝生理鹽水)配製。其它例示性載劑包括無菌生理鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、葡聚糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油及水。緩衝劑/載劑應包括防止rAAV黏附到輸液管上，但在活體內不干擾rAAV結合活性的成分。
可選擇地，除了rAAV及載劑之外，組成物亦可含有其它習知醫藥成分，例如防腐劑或化學穩定劑。適當的例示性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯類(parabens)、乙基香草醛、甘油、苯酚及對氯苯酚。適當的化學穩定劑包括明膠及白蛋白。
如本文中所使用，「載劑」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗料、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此類用於醫藥活性物質的介質及試劑的用途為技術領域中所熟知的。補充活性成分亦可摻入組成物中。短語「醫藥上可接受的」係指當投予至宿主時不會產生過敏或類似不良反應的分子實體及組成物。遞送媒劑，例如微脂體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適當的宿主細胞中。特別是，可將遞送轉基因的rAAV載體包封在脂質顆粒、微脂體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等之中而調配用於遞送。
在一具體實施例中，組成物包括適於遞送至受試者的最終調配物，例如，為緩衝至生理相容性pH及鹽濃度的水性液體懸浮劑。可選擇地，一或多種界面活性劑可存在於調配物中。在另一具體實施例中，組成物可作為濃縮物輸送，該濃縮物係被稀釋而投予至受試者。在另一具體實施例中，組成物可被冷凍乾燥並在投予時復原(reconstituted)。
適當的界面活性劑或界面活性劑之組合可選自無毒的非離子界面活性劑之中。在一具體實施例中，選擇末端為一級羥基的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如Pluronic® F68 [BASF]，也稱為泊洛沙姆188，其具有中性pH，平均分子量為8400。可選擇其它界面活性劑及其它泊洛沙姆，即由兩側為兩個聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))親水鏈的聚氧丙烯(聚(環氧丙烷))中央疏水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(聚乙烯二醇(Macrogol)-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧基辛酸甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚氧基10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。在一具體實施例中，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常用字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給予聚氧丙烯核心的近似分子量，最後一個數字x10給予聚氧乙烯含量百分比。在一具體實施例中，選擇泊洛沙姆188。界面活性劑可以懸浮液的高至約0.0005%至約0.001%的量存在。
以足夠的量將載體投予至轉染細胞並提供足夠水準的基因轉移及表現，以提供治療益處而沒有不適當的副作用，或者具有醫學上可接受的生理作用，此可由醫學領域中具有通常知識者確定。可選擇地，可使用鞘內投予以外的途徑，舉例而言，例如直接遞送至所欲之器官(例如，肝臟(可選擇地經由肝動脈)、肺臟、心臟、眼睛、腎臟)、口服、吸入、鼻內、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌內、皮下、皮內及其它腸胃外投予途徑。若需要，可組合投予途徑。
病毒載體的劑量可主要取決於例如所欲治療的病況、患者的年齡、體重及健康等因素，因此可能因患者而異。例如，病毒載體的治療有效人類劑量範圍通常為約25至約1000微升至約100 mL的含有濃度約1x10 9至1x10 16個基因體病毒載體的溶液(治療平均體重70公斤的受試者)，包括該範圍內的所有整數或分數量，並對於人類患者較佳為1.0x10 12GC至1.0x10 14GC。在一具體實施例中，將組成物調配成每劑量含有至少1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9或9x10 9GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，將組成物調配成每劑量含有至少1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10或9x10 10GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，將組成物調配成每劑量含有至少1x10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11或9x10 11GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，將組成物調配成每劑量含有至少1x10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12或9x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，將組成物調配成每劑量含有至少1x10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13或9x10 13GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，將組成物調配成每劑量含有至少1x10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14或9x10 14GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在另一具體實施例中，將組成物調配成每劑量含有至少1x10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15或9x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。在一具體實施例中，對於人類投予，劑量範圍可為每劑量1x10 10至約1x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
在某些具體實施例中，劑量範圍為約1 x 10 9GC/每克腦質量至約1 x 10 12GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量範圍為約1 x 10 10GC/每克腦質量至約3.33 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量範圍為約 3.33 x 10 11GC/每克腦質量至約1.1 x 10 12GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量範圍為約 1.1 x 10 12GC/每克腦質量至約3.33 x 10 13GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量低於 3.33 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量低於1.1 x 10 12GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量低於 3.33 x 10 13GC/每克腦質量。
在某些具體實施例中，劑量為約1 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約2 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約2 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約3 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約4 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約5 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約6 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約7 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約8 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約9 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約1 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約2 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約3 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約4 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約3.3 x 10 10GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約1.1 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約2.2 x 10 11GC/每克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
在某些具體實施例中，作為固定劑量(flat dose)投予至人類之劑量範圍為約1.44 x 10 13至4.33 x 10 14GC之rAAV。在某些具體實施例中，作為固定劑量投予至人類之劑量範圍為約1.44 x 10 13至2 x 10 14GC之rAAV。在某些具體實施例中，作為固定劑量投予至人類之劑量範圍為約3 x 10 13至1 x 10 14GC之rAAV。在某些具體實施例中，作為固定劑量投予至人類之劑量範圍為約5 x 10 13至1 x 10 14GC之rAAV。
在某些具體實施例中，組成物被調配成劑量單位以含有AAV之量，其範圍為約1 x 10 13至8 x 10 14GC之rAAV。在某些具體實施例中，組成物被調配成劑量單位以含有AAV之量，其範圍為約1.44 x 10 13至4.33 x 10 14GC之rAAV。在某些具體實施例中，組成物被調配成劑量單位以含有AAV之量，其範圍為約3 x 10 13至1 x 10 14GC之rAAV。在某些具體實施例中，組成物被調配成劑量單位以含有AAV之量，其範圍為約5 x 10 13至1 x 10 14GC之rAAV。
在某些具體實施例中，投予足以在以下任何一種或多種組織類型中提供10 3GC/μg DNA的單次劑量：額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質、枕葉皮質、延髓、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、頸背根神經節、胸背根神經節、腰背根神經節及三叉神經節。在某些具體實施例中，投予足以在以下任何一種或多種組織類型中提供10 4GC/μg DNA的單次劑量：額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質、枕葉皮質、延髓、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、頸背根神經節、胸背根神經節、腰背根神經節及三叉神經節。
在某些具體實施例中，rAAV以單次劑量投予至受試者。在某些具體實施例中，需要多劑量(例如2個劑量)。
可調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此類劑量可根據所採用的重組載體的治療應用而變化。可監測轉基因的表現水準以確定產生病毒載體的劑量頻率，該病毒載體較佳為含有袖珍基因(minigene)的AAV載體。可選擇地，相似於所述用於治療目的劑量方案可用於使用本發明組成物之免疫。
如本文中所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指藥物經由注射至脊髓管的投予途徑，更具體而言為注射至蜘蛛膜下腔的投予途徑，以使其到達腦脊髓液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內(包括腦室內(ICV))、枕骨下/腦池內及/或C1-2穿刺。例如，可藉由腰椎穿刺手段而導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。在另一實例中，注射可進入腦大池或經由腦實質內(intraparenchymal)遞送。在某些具體實施例中，經由電腦斷層掃描(CT)導引的枕骨下注射到腦大池中(腦大池內)來投予rAAV。在某些具體實施例中，該患者被投予單次劑量。
如本文中所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入腦大池小腦延髓(cisterna magna cerebellomedularis)之腦脊髓液的投予途徑，更具體而言為經由枕骨下穿刺或藉由直接注射至腦大池中，或者經由永久定位的管子。
在某些具體實施例中，rAAV.hPGRN的系群被調配在鞘內最終調配緩衝液(ITFFB；具有0.001% Pluronic F-68的人工CSF)中。將批料冷凍，隨後解凍，必要時儲集，調整至目標濃度，通過0.22 µm過濾器進行無菌過濾，並填充小瓶。在某些具體實施例中，將包含調配緩衝液、rAAV1.hPGRN的懸浮液調整至pH 7.2至7.4。
在一具體實施例中，本文提供的rAAV1.hPGRN的劑量遞送的體積、及濃度可由本技術領域中具有通常知識者確定。例如，可選擇體積約1 µL至150 mL，對於成年人選擇更高體積。通常，對於新生嬰兒，適當的體積約為0.5 mL至約10 mL，對於較大的嬰兒，可選擇約0.5 mL至約15 mL。對於幼兒，可選擇約0.5 mL至約20 mL的體積。對於兒童，可選擇最高至約30 mL的體積。對於少年及青少年，可以選擇最高至約50 mL的體積。在另外其它具體實施例中，患者可接受鞘內投予，可選擇體積約5 mL至約15 mL、或約7.5 mL至約10 mL。可確定其它適當的體積及劑量。可調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且這種劑量可根據所採用的重組載體的治療應用而變化。
在某些具體實施例中，組成物包含：rAAV.EF1a.hPGRN.SV40、rAAV.UbC.PI.hPGRN.SV40或rAAVCB7.CI.hPGRN1.rBG。其中rAAV殼體為AAVhu68、AAV5或AAV1的組成物於下述實施例中說明。在特佳的具體實施例中，rAAV為AAV1。在某些具體實施例中，hPGRN 編碼序列係選自本說明書中所定義者。參見例如，SEQ ID NO：3或與其95%至99.9%相同之序列，或者SEQ ID NO：4或與其95%至99.9%相同之序列，或者如本文所定義之此等的片段。提供用於下述實施例之載體元件的說明性序列，例如，於SEQ ID NO：6(兔球蛋白polyA)、AAV ITR(SEQ ID NO：7及8)、人類CMV IE啟動子(SEQ ID NO：9)、CB啟動子(SEQ ID NO：10)、嵌合內含子(SEQ ID NO：11)、UbC啟動子(SEQ ID NO：12)、EF-1a啟動子(SEQ ID NO：17)、內含子(SEQ ID NO：13)及SV40晚期poly A(SEQ ID NO：14)。
用途如本文中所使用，PGRN單套缺失係指具有PGRN基因中的突變的患者，該突變導致不足的PGRN及/或不足的GRN水準。rAAV1-PGRN治療的目標族群包括患有PGRN單套缺失的患者及/或具有不足的PGRN或不足的GRN水準的患者。在某些具體實施例中，對於PGRN突變，患者為異基因型組合的。在另一其它具體實施例中，該患者係來自PGRN突變的同基因型組合。在某些具體實施例中，對患者投予一種免疫抑制方案組合本文所提供的rAAV1媒介的hPGRN療法。
在某些具體實施例中，rAAV1.PGRN係有用於治療具有GRN單套缺失的患者。此類患者可已被診斷患有由GRN單套缺失所引起之成年發病神經退化或可為症狀發生前。rAAV1.PGRN可以單次劑量投予，經由電腦斷層掃描(CT)導引的枕骨下注射至腦大池中(腦大池內[ICM])。單次劑量係以預定劑量水準投予。在NHP中以單次ICM注射所達成之優異腦轉導導致選擇此投予途徑。在某些具體實施例中，與另一投予途徑(例如，注射至側腦室中)相較之下，投予載體至ICM亦造成降低的抗PGRN T細胞反應。曾經為一種常見的手術，ICM注射(亦稱為枕骨下穿刺)先前已被腰椎穿刺取而代之。然而，可選擇及/或使用其它劑量水準及遞送途徑與此rAAV1媒介的hPGRN療法組合。
在某些具體實施例中，本文所述的rAAV1媒介的療法可提供沒有GRN突變(單套缺失)的人類之大約平均、正常、生理水準的PGRN表現。然而，即使PGRN表現的增加低於正常水準，該治療亦可提供治療效果，提供正常平均水準的約40%至99%，例如，35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或此等範圍之間的其它值。在某些具體實施例中，此可能係由於PGRN水準比治療前的患者表現水準增加至少5%至約70%或更高。在某些具體實施例中，當投予rAAV1媒介的hPGRN導致CSF中PGRN的水準升高(例如，比正常水準高10倍到40倍)時，該治療可提供治療效果。
在某些具體實施例中，藉由下列之一或多種來評估效果：CSF中PGRN蛋白質的水準增加及/或大腦皮質厚度變化。在某些具體實施例中，在投予單次ICM劑量後，藉由下列之一或多種來測量而評估rAAV1媒介的療法的效果：藉由簡易精神狀態檢查(Mini-Mental State Exam；MMSE)、臨床總體印象變化(Clinical Global Impression of Change；CGI-C)、額葉功能測試(Frontal Assessment Battery；FAB)、額顳葉失智症評定量表(Frontotemporal Dementia Rating Scale；FRS)、額葉行為量表(Frontal Behavioral Inventory；FBI)、統一帕金森氏症評定量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale；UPDRS)、語文流暢性測試、用於額顳葉退化加總計分之臨床失智症評定量表(Clinical Dementia Rating for Frontotemporal Lobar Degeneration Sum of Boxes；CDR-FTLD sb)及/或神經精神評估量表(Neuropsychiatric Inventory；NPI)而評估延長生存期、以及改善臨床症狀及日常功能。在某些具體實施例中，藉由改善的神經纖維絲輕鏈(NfL)、tau、磷酸化tau及炎症標記的CSF水準及/或增加的PGRN之血漿水準而證明功效。在某些具體實施例中，藉由測量小神經膠質細胞增生水準的降低或逆轉來評估功效。在某些具體實施例中，藉由進行FDG PET以評估額葉及/或顳葉中的低代謝來證明功效。
在某些具體實施例中，藉由改善GRN患者相關之一或多種臨床症狀來衡量功效，包括例如，行為缺陷(抑制解除、冷漠、失去同情心或同理心、強迫或刻板的行為、或者多食(hyperorality))及認知缺陷(執行功能下降，對情節記憶或視覺空間技能無重大影響)。
在某些具體實施例中，在其它一些更多的非典型的症狀中觀察到改善，包括精神病學特徵(妄想、幻覺及強迫行為)及/或其它認知缺陷(情節記憶障礙、運用失能症(apraxia)及視覺空間功能障礙)。可使用可評估的FTDC基準執行評估，包括對於額葉及/或顳骨退化的徵象之大腦成像、對臨床評定量表的下降之評估(例如用於額顳葉退化之臨床失智症評定量表[CDR-FTLD]、額葉行為量表[FBI]、神經精神評估量表[NPI]及額顳葉失智症評定量表[FRS])、及最終之遺傳測試以確認致病性GRN突變。可使用腦脊髓液(CSF)生物標記(包括tau及類澱粉蛋白-β)以及類澱粉蛋白質正子發射斷層掃描(positron emission tomography；PET)成像。
在某些具體實施例中，在具有原發性進行性失語症(PPA)的 GRN突變攜帶者中觀察到改善，原發性進行性失語症的特徵在於與說話及語言有關的症狀。可使用基於Mesulam基準的準則來診斷彼等，該準則區分PPA的三種臨床變異型：語義變異型PPA(semantic variant PPA；svPPA)、非流暢變異型PPA(nonfluent variant PPA；nfvPPA)及語彙減少變異型PPA(logopenic variant PPA；lvPPA)(Gorno-Tempini et al.,(2011). "Classification of primary progressive aphasia and its variants." Neurology. 76(11):1006-14)。nfvPPA的說話表達能力存在缺陷，且其核心特徵包括語言表達的語法缺失、費力說話及言語失用。svPPA在理解字彙含義的能力上存在缺陷，其核心特徵包括字彙命名及單詞理解能力受損。lvPPA的特徵在於說話時難以找到適當的字彙，但不會伴隨字彙理解能力的下降。lvPPA的核心特徵為字彙檢索及重複句子的能力的缺陷。 GRN突變攜帶者最常存在nfvPPA；然而，他們可在PPA臨床譜內擁有更廣泛的症狀，從而診斷為「未特定PPA(PPA-not otherwise specified)」(Gorno-Tempini et al., 2011；Woollacott and Rohrer, 2016)。
提供一種治療患有與GRN單套缺失相關之神經退化性病況的人類患者的方法。在某些具體實施例中，此病況為顆粒蛋白前體相關額顳葉失智症(FTD)。該方法包含經由具有腺相關病毒1(AAV1)殼體之重組腺相關病毒(rAAV)遞送顆粒蛋白前體之編碼序列至中樞神經系統(CNS)，該rAAV進一步包含包裝在AAV殼體中的載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複、人類顆粒蛋白前體的編碼序列、及引導顆粒蛋白前體表現之調節序列。
提供一種用於治療患有腦病灶之人類患者的方法，該腦病灶係與下列有關：顆粒蛋白前體相關額顳葉失智症、或與GRN單套缺失相關之另一神經退化性病況。該方法包含經由具有腺相關病毒1(AAV1)殼體之重組腺相關病毒(rAAV)而將顆粒蛋白前體之編碼序列投予至中樞神經系統(CNS)，該rAAV進一步包含包裝在AAV殼體中的載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複、人類顆粒蛋白前體的編碼序列、及引導顆粒蛋白前體表現之調節序列。
在某些具體實施例中，本文所提供之方法可進一步包含藉由下列來監測治療：(a)非侵入式評估患者的視網膜貯積病灶的減少，作為腦病灶降低之預測因子；(b)進行磁共振成像以評估腦體積；及/或(c)測量CSF中顆粒蛋白前體的濃度。可選擇地，可評估血漿中的顆粒蛋白前體濃度。
在某些具體實施例中，藉由一或多種下列主要認知、主要行為或認知/其它方法來評估rAAV.hPGRN組成物的功效。以下描述適當的評估。
主要認知評估包括語文流暢性測試、FTLD的臨床失智率或簡易精神狀態檢查(MMSE)。語文流暢性測試係藉由對每位受試者展示相同的圖片/照片並要求口頭描述來進行。在描述過程中，對說話速度(字/分鐘)進行計數、記錄並最終與反映出神經正常成年人的速率進行比較。CDR-FTLD為典型CDR的擴展版本，歷史上一直用於評估阿茲海默氏症譜障礙的嚴重程度。評估包括CDR的原始6個領域(記憶、定向、判斷及解決問題、社群事務、家庭及嗜好、個人照護)以及另外兩個領域：語言及行為，從而在檢測FTLD下降方面更加敏感。等級「0」表示正常行為或語言，而等級「1」、「2」或「3」表示輕度至重度缺陷。「加總計分」或各別領域得分的總和係用於確定整體失智症的嚴重程度。MMSE為一種11項問題總體認知評估，廣泛用於臨床及研究實踐。詢問例如「哪年?哪一季節?哪一日?一週中的哪天?哪月?」的問題並且在每個正確答案給一個分數，且對於每項問題提供最高分。最高總分為30分，其中兩個界限分數為24及27。此等界限為認知能力下降的指標。
主要運動評估包括例如統一帕金森氏症評定量表(UPDRS)。該UPDRS為一種帕金森氏症相關之數種領域的42項、4部分的評估，例如心理、行為以及情緒及日常生活活動。每一項目包括評定量表，範圍通常從0(通常表示無損害)到4(通常表示最嚴重的損害)。記錄每一部分的得分以提供疾病嚴重程度的指標，最高得分為199，表示最嚴重/最大的總失能。
主要行為評估包括例如神經精神評估量表(NPI)或額葉行為量表(FBI)。NPI用於闡明存在於患有腦部疾病的患者的心理病理學。最初，其被開發用於阿茲海默氏症族群；然而，對評估其它病況下的行為變化可能係有用的。評估由10個行為領域及2個神經植物人化區域(neurovegetative areas)所組成，其中有4種積分：頻率、嚴重程度、整體及照護者困擾。NPI總分係藉由將行為領域的領域得分相加，減去照護者困擾得分得出的。FBI為一種24項目的評估，旨在評估與bvFTD特定相關的行為及性格變化，以及鑑別FTD與其它失智症。其係作為與主要照護者的面對面訪談來執行，因為以bvFTD診斷的患者通常對此等類型的變化沒有足夠的了解。其著重在數個行為及性格相關的區域，每個問題的評分從0(無)到3(嚴重/大部分時間)。總分提供深入了解疾病的嚴重程度，並可用於評估隨時間推移的變化。
其它/認知及運動的評估包括例如：哥倫比亞自殺嚴重程度評定量表(Columbia Suicide Severity Rating Scale；C-SSRS)、臨床總體印象變化(CGI-C)、額葉功能測試(FAB)及/或額顳葉失智症評定量表(FDR)。C-SSRS為一種3部分量表，透過評估自殺意念及行為的問題來衡量自殺意念、意念強度及自殺行為。此評估的結果由直接從量表所得之自殺行為殺傷力等級、自殺意念得分及自殺意念強度等級所構成。根據評估準則，大於0的意念得分可表示需要介入。強度等級的範圍為0到25，其中0表示不支持自殺意念。CGI-C為一種簡短、廣泛使用的評估的三個部分之一，該評估由3個項目所構成，此等項目係由臨床醫師觀察員評定。CGI-C的評分為7分制，從研究招募開始，無論任何改善是否完全由治療所引起，範圍從1(大幅改善)到7(非常差)。FAB為一種簡短的評估，以幫助鑑別具有額葉執行功能失常表型的失智症及阿茲海默氏症型的失智症。在輕度失智的患者(MMSE＞24)中特別有用。評估由6個部分所組成，針對認知、運動及行為領域，總分為18分及更高得分表明較佳之表現。FDR為針對患有額顳葉失智症的患者的簡短分期評估，其檢測FTD亞型隨時間推移的疾病進展差異。此簡短的訪談係與主要照護者進行，由30個項目所組成，被分類為從不、有時或總是發生。然後計算百分比分數，並將其轉換為對數分數，並最終轉換為嚴重程度分數。嚴重程度評分範圍為非常輕度到深度。
其它功效的量測包括從診斷點起的生存期增加、在症狀發作後的生存期增加，為一種功效的量測。目前，被診斷為由 GRN突變引起的神經退化的患者從症狀發作起的預期壽命為7-11年。功效的另一種量測為在中額葉皮質及頂葉區域厚度的穩定化及/或萎縮的增加，該區域為目標族群中所有臨床表現中最常見被影響的大腦區域。此可使用MRI或其它成像技術進行評估。其它評估包括生化生物標記。測量CSF及血漿中PGRN蛋白質的水準，作為AAV轉導的讀數，並預期在投予rAAV1.hPGRN後在患者中會增加。在其它具體實施例中，評估神經纖維絲輕鏈(NFL)、tau、磷酸化tau及其它炎症標記的CSF水準。在某些具體實施例中，此等生物標記水準的調控及/或降低與功效有關。
儘管以下實施例著重治療與異基因型組合之GRN單套缺失相關的某些病況，在某些具體實施例中，本文所述載體及組成物可用於治療其它疾病，例如，與GRN基因同基因型組合突變有關之疾病，例如神經性類蠟脂褐質病、癌症(例如，卵巢癌、乳癌、腎上腺癌及/或胰臟癌)、動脈粥樣硬化、第2型糖尿病及代謝性疾病。
進一步的具體實施例如以下「A1」至「F1」。
A1.一種有用於在人類患者中治療成年發病神經退化性疾病之治療方案，其中該方案包含投予具有AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體的重組腺相關病毒(AAV)載體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體 (GRN)編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，該投予包含單次劑量之腦大池內(ICM)注射，該單次劑量包含： (i)   約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量； (ii)  約1.1 x 10 11GC/每克腦質量； (iii) 約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或 (iv)  約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
A2.如具體實施例A1之方案，其中顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。
A3.如具體實施例A1或A2之方案，其中載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。
A4.如具體實施例A1至A3中任一者之方案，其中載體基因體包含SEQ ID NO：24。
A5.如具體實施例A1至A4中任一者之方案，其中患者已被鑑定為具有 GRN單套缺失及/或額顳葉失智症(FTD)。
A6.如具體實施例A1至A5中任一者之方案，其中患者年齡至少35歲。
A7.如具體實施例A1至A6中任一者之方案，其中患者的CSF中具有低濃度之顆粒蛋白前體。
A8.如具體實施例A7之方案，其中患者的CSF中具有比正常水準的50%低之顆粒蛋白前體濃度。
A9.如具體實施例A7之方案，其中患者的CSF中具有約正常水準的30%之顆粒蛋白前體濃度。
A10.如具體實施例A1至A9中任一者之方案，其進一步包含檢測CSF、血清及/或血漿中的顆粒蛋白前體的水準。
A11.如具體實施例A1至A10中任一者之方案，其進一步包含測量 i)    神經纖維絲輕鏈(NfL)、總tau(T-tau)及磷酸化tau(P-tau)中之一種或多種的CSF水準； ii)   評估視網膜脂褐質； iii)  進行MRI以追蹤腦體積、白質完整性、以及中額葉皮質及頂葉區域的厚度中之一種或多種的變化； iv)   進行FDG PET以評估額葉及/或顳葉中的低代謝；及/或 v)    測量EEG/誘發反應電位以評估疾病相關變化的減緩。
A12.如具體實施例A1至A11中任一者之方案，其中該單次劑量足以在以下任何一種或多種組織類型中提供10 3GC/μg DNA：額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質、枕葉皮質、延髓、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、頸背根神經節、胸背根神經節、腰背根神經節及三叉神經節。
A13.如具體實施例A1至A12中任一者之方案，其中該單次劑量足以在以下任何一種或多種組織類型中提供10 4GC/μg DNA：額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質、枕葉皮質、延髓、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、頸背根神經節、胸背根神經節、腰背根神經節及三叉神經節。
B1.一種醫藥組成物，其包含含有AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體的重組AAV載體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，其中該組成物被調配用於腦大池內(ICM)注射至有需要的人類患者以投予以下劑量： (i)   約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量； (ii)  約1.1 x 10 11GC/每克腦質量； (iii) 約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或 (iv)  約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
B2.如具體實施例B1之醫藥組成物，其中該顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。
B3.如具體實施例B1或B2之醫藥組成物，其中該載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。
B4.如具體實施例B1至B3中任一者之醫藥組成物，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：24。
C1.一種治療患有成年發病神經退化性疾病之患者的方法，該方法包含藉由ICM注射投予單次劑量的重組AAV至該患者，其中該重組AAV包含AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含AAV ITR、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，且 其中單次劑量為： (i)   約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量； (ii)  約1.1 x 10 11GC/每克腦質量； (iii) 約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或 (iv)  約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
C2.如具體實施例C1之方法，其中該顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。
C3.如具體實施例C1或C2之方法，其中該載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。
C4.如具體實施例C1至C3中任一者之方法，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：24。
C5.如具體實施例C1至C4中任一者之方法，其中該患者已被鑑定為患有 GRN單套缺失及/或額顳葉失智症(FTD)。
C6.如具體實施例C1至C5中任一者之方法，其中該患者年齡至少35歲。
C7.如具體實施例C1至C6中任一者之方法，其中該患者的CSF中具有低濃度的顆粒蛋白前體。
C8.如具體實施例C7之方法，其中該患者的CSF中具有比正常水準之50%低的顆粒蛋白前體濃度。
C9.如具體實施例C7之方法，其中該患者的CSF中具有約正常水準之30%的顆粒蛋白前體濃度。
C10.如具體實施例C1至C9中任一者之方法，其進一步包含檢測CSF、血清及/或血漿中的顆粒蛋白前體濃度。
C11.如具體實施例C1至C10中任一者之方法，其進一步包含測量： i)    神經纖維絲輕鏈(NfL)、總tau(T-tau)及磷酸化tau(P-tau)中之一種或多種的CSF濃度； ii)   評估視網膜脂褐質； iii)  進行MRI以追蹤腦體積、白質完整性、以及中額葉皮質及頂葉區域的厚度中之一種或多種的變化； iv)   進行FDG PET以評估額葉及/或顳葉中的低代謝；及/或 v)    測量EEG/誘發反應電位以評估疾病相關變化的減緩。
D1.一種單位劑型的醫藥組成物，其包含： 含約1.44 x 10 13至約4.33 x 10 14GC的重組AAV載體之緩衝液， 其中該重組AAV包含AAV1殼體及包裝於其中之載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列。
D2.如具體實施例D2之醫藥組成物，其中該顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。
D2.如具體實施例D1或D2之醫藥組成物，其中該載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。
D4.如具體實施例D1至D3中任一者之醫藥組成物，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：24。
D5.如具體實施例D1至D4中任一者之醫藥組成物，其中該組成物被調配用於ICM注射。
D6.如具體實施例D1至D5中任一者之醫藥組成物，其中該緩衝液包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。
D7.如具體實施例D1至D6中任一者之醫藥組成物，其中該緩衝液包含1 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、1.4 mM氯化鈣、0.8 mM氯化鎂及0.001%泊洛沙姆188。
D8.如具體實施例D1至D6中任一者之醫藥組成物，其具有約3.0 mL、約4.0mL或約5.0 mL的體積。
E1.如具體實施例D1至D8中任一者之醫藥組成物，其用於治療患有成年發病神經退化性疾病的人類患者。
E2.如具體實施例E1之用途的醫藥組成物，其中該患者已被鑑定為患有 GRN單套缺失及/或額顳葉失智症(FTD)。
E3.如具體實施例E1或E2之用途的醫藥組成物，其中該組成物被調配以投予以下劑量： (i)   約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量； (ii)  約1.1 x 10 11GC/每克腦質量； (iii) 約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或 (iv)  約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
F1.一種如具體實施例14至25中任一者之醫藥組成物用於製備治療成年發病神經退化性疾病之醫藥品的用途。
如本文中所使用，術語電腦斷層掃描(CT)係指放射線照相術，其中身體結構的三維影像係藉由電腦從沿軸線製作的一系列平面橫截面影像所構築。
當提及核酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」表示：當利用適當的核苷酸插入或刪除而與另一核酸(或其互補股)最佳排比時，在至少約95%至99%的排比的序列中有核苷酸序列同一性。較佳地，同源為在全長序列、或其開讀框、或長度為至少15個核苷酸的另一適當片段。本文描述了適當片段的實例。
在核酸序列之上下文中，術語「序列同一性」、「序列同一性百分比」或「同一性百分比」係指：當用於最大對應排比時，兩個序列中相同的殘基。序列同一性比較的長度理想可為整個基因體的全長、基因編碼序列的全長或至少約500至5000個核苷酸的片段。然而，較小片段之間的同一性亦為理想，例如至少約9個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36個或更多個核苷酸。類似地，對於胺基酸序列，可在整個蛋白質的全長或其片段容易地確定「序列同一性百分比」。適當地，片段長度為至少約8個胺基酸，並且可多至約700個胺基酸。本文描述了適當片段的實例。
當提及胺基酸或其片段時，術語「實質上同源」或「實質上相似」表示：當利用適當的胺基酸插入或刪除而與另一胺基酸(或其互補股)最佳排比時，在至少約95%至99%的排比的序列中有胺基酸序列同一性。較佳地，同源為在全長序列、或其蛋白質，例如cap蛋白質、rep蛋白質、或者長度為至少8個胺基酸、或更理想地係長度為至少15個胺基酸的片段。本文描述了合適片段的實例。
術語「高度保留的」意指至少80%同一性，較佳為至少90%同一性，更佳為大於97%同一性。藉由本技術領域中具有通常知識者已知的演算法及電腦程式，本技術領域中具有通常知識者可容易地確定同一性。
一般而言，當於兩個不同腺相關病毒之間提及「同一性」、「同源性」或「相似性」時，「同一性」、「同源性」或「相似性」係參照「排比的(aligned)」序列來確定。「排比的」序列或「排比」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常含有缺失或額外的鹼基或胺基酸的校正。在實施例中，使用公開的AAV9序列作為參考點進行AAV排比。使用許多公開或市售的多序列排比程式中的任何一種進行排比。這類程式之實例包括「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」及「MEME」，此等可透過網際網路上的網站伺服器進行存取。此類程式的其它來源為本技術領域中具有通常知識者已知的。或者，亦可使用載體NTI公用程式。還有許多技術領域中已知可用於測量核苷酸序列同一性的演算法，包括上述程式中含有的演算法。作為另一實例，可使用Fasta™(GCG版本6.1的程式)比較多核苷酸序列。Fasta™提供在查詢及檢索序列之間最佳重疊區域的排比及序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用Fasta™及其如GCG版本6.1中所提供的內定參數確定(字組大小為6及用於得分矩陣的NOPAM因數)，藉由引用併入本文。胺基酸序列也可使用多序列排比程式，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」及「Match-Box」程式。一般而言，此等程式之任一者皆於內定值下使用，儘管本技術領域中具有通常知識者可根據需要改變此等設定。或者，本技術領域中具有通常知識者可利用另一演算法或電腦程式，其至少提供如參考的演算法及程式所提供的同一性或排比的水準。參見例如J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999)。
應注意的為，術語「一」或「一個」係指一個(種)或多個(種)。因此，術語「一(或一個)」、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
詞語「包含(comprise/comprises/comprising)」係包括性地而非排他性地解釋。詞語「由…組成(consist/consisting)」及其變化係排他性地而非包括性地解釋。雖然說明書中的多個具體實施例使用「包含」語句來呈現，但在其它情況下，相關具體實施例亦旨在使用「由…組成」或「實質上由…組成」語句來解釋及描述。
如本文中所使用，除非另有指明，術語「約」意指與給定參考值間有10%(±10%，例如，±1、±2、±3、±4、±5、±6、±7、±8、±9、±10、或此等之間的值)的變化。
如本文中所使用，「疾病」、「障礙」及「病況」可互換使用，以表示受試者的不正常狀態。
除非在本說明書中另有定義，否則本文所使用的技術及科學術語具有與本領域中具有通常知識者所通常理解的及參考公開文本所通常理解的相同的含義，該公開文本為本技術領域中具有通常知識者提供了本申請案中使用的許多術語的一般指引。
術語「表現」在本文中以其最廣泛的含義使用，且包含RNA的產生或者RNA及蛋白質的產生。關於RNA，術語「表現」或「轉譯」特別涉及肽或蛋白質的產生。表現可為短暫的或可為穩定的。
如本文中所使用，「表現匣」係指包含編碼序列、啟動子並且可包括其它調節序列的核酸分子，該表現匣可經由遺傳元件(例如，質體)遞送至包裝宿主細胞，並包裝到病毒載體(例如，病毒顆粒)的殼體中。通常，此類用於產生病毒載體的表現匣含有本文所述基因產物的編碼序列，其兩側為病毒基因體的包裝訊息及其它表現控制序列，例如本文所述的彼等。
如本文中所使用，術語「可操作地連接」係指相鄰於目的基因的表現控制序列、及反式或遠距離地作用以控制目的基因的表現控制序列二者。
當提及蛋白質或核酸而使用時，術語「異源的」表示蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間沒有相同關係的兩個以上的序列或子序列。例如，通常重組產生的核酸，具有二個以上的來自無關基因的序列，其排列以產生新的功能性核酸。例如，在一具體實施例中，該核酸具有來自一個基因的啟動子，其被安排以引導來自不同基因的編碼序列的表現。因此，參照編碼序列，該啟動子為異源的。
在本發明的上下文中，術語「轉譯」係關於核糖體的過程，其中mRNA股控制胺基酸序列的組裝以產生蛋白質或肽。
以下實施例僅為說明性的，並不意圖限制本發明。 實施例
縮寫 描述
A 吸光度(Absorbance)
aa 胺基酸
AAV 腺相關病毒
AAV1 腺相關病毒血清型 1
AAV2 腺相關病毒血清型 2
AAV5 腺相關病毒血清型 5
AAVhu68 腺相關病毒血清型hu68
ACMG 美國醫學遺傳學學會(American College of Medical Genetics)
AD 阿茲海默氏症
AD & FDM 阿茲海默氏症及額顳葉失智症突變資料庫 (Alzheimer’s Disease and Frontotemporal Dementia Mutation Database)
Ad5 腺病毒血清型5(Adenovirus Serotype 5)
AE 不良事件(Adverse Events)
AEX 陰離子交換(Anion Exchange)
AmpR 安比西林(Ampicillin)抗性(基因)
ANOVA 變異數分析
ARTFL 額顳葉退化之前瞻研究與治療 (Advancing Research and Treatment for Frontotemporal Lobar Degeneration)
AUC 分析型超高速離心(Analytical Ultracentrifugation)
BA β-肌動蛋白
BCA 二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid)
BDS 大批原料藥(Bulk Drug Substance)
BMCB 細菌主細胞庫(Bacterial Master Cell Bank)
bp 鹼基對
BRF 批次紀錄表(Batch Record Form)
BSA 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)
BSE 牛海綿狀腦病變(Bovine spongiform encephalopathy)
BSC 生物安全櫃(Biological Safety Cabinet)
bvFTD 行為變異型額顳葉失智症(Behavioral Variant Frontotemporal Dementia)
BWCB 細菌工作細胞庫(Bacterial Working Cell Bank)
C9orf72 染色體9開讀框72(基因，人類)
cap 殼體(基因)
CB7 雞β-肌動蛋白啟動子及CMV強化子
CBC 全血細胞計數(Complete Blood Count)
CBER 生物製品評估與研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research)
CBS 皮質基底核症候群(Corticobasal Syndrome)
CDR-FTLD sb 用於額顳葉退化加總計分之臨床失智症評定(CDR)量表
CFR 聯邦法規(Code of Federal Regulations)
CFU 菌落形成單位(Colony Forming Units)
CGI-C 臨床總體印象變化
CI 嵌合內含子(Chimeric Intron)
CMC 化學製造與控制(Chemistry Manufacturing and Controls)
CMO 受託製造機構(Contract Manufacturing Organization)
CMV IE 巨細胞病毒立即早期強化子(Cytomegalovirus Immediate-Early Enhancer)
CNS 中樞神經系統
COA 檢驗證明書(Certificate of Analysis)
CPE 細胞病變作用(Cytopathic Effects)
CRL 查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)
CRO 受託研究機構(Contract Research Organization)
CSF 腦脊髓液(Cerebrospinal Fluid)
C-SSRS 哥倫比亞自殺嚴重程度評定量表(Columbia-Suicide Severity Rating Scale)
CT 電腦斷層掃描(Computed Tomography)
CTL 胞毒型T淋巴球(Cytotoxic T Lymphocyte)
CTSD 細胞自溶酵素D(Cathepsin D)
ddPCR 微滴式數位聚合酶連鎖反應(Droplet Digital Polymerase Chain Reaction)
DLS 動態光散射(Dynamic Light Scattering)
DMEM 達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
DMF 原料藥主檔案(Drug Master File)
DNA 去氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
DO 溶氧(Dissolved Oxygen)
DP 藥品(Drug Product)
DRG 背根節(Dorsal Root Ganglia)
DS 原料藥(Drug Substance)
E1A 早期區域1A(Early Region 1A)(基因)
ECG 心電圖(Electrocardiogram)
EDTA 乙二胺四乙酸
ELISA 酶聯免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
ELISpot 酶聯免疫斑點法(Enzyme-Linked Immunospot)
EU 內毒素單位
F 女性
F/U 追蹤(Follow-Up)
FAB 額葉功能測試(Frontal Assessment Battery)
FBI 額葉行為量表(Frontal Behavioral Inventory)
FBS 胎牛血清(Fetal Bovine Serum)
FDA 食品藥物管理局(Food and Drug Administration)
FDP 填充藥品(Filled Drug Product)
FFB 最終調配緩衝液(Final Formulation Buffer)
FIH 首次用於人體(First-in-Human)
FRS 額顳葉失智症評定量表(Frontotemporal Dementia Rating Scale)
FTD 額顳葉失智症(Frontotemporal Dementia)
FTLD 額顳葉退化(Frontotemporal Lobar Degeneration)
FTDC 國際行為變異型額顳葉失智症基準協會 (International Behavioral Variant FTD Criteria Consortium)
GC 基因體拷貝數(Genome Copies)
GENFI 遺傳性額顳葉失智症倡議(Genetic Frontotemporal Dementia Initiative)
GLP 優良實驗室操作規範(Good Laboratory Practice)
GMP 優良藥品製造規範(Good Manufacturing Practice)
HCDNA 宿主細胞去氧核糖核酸
HCP 宿主細胞蛋白
HEK293 人類胚腎293
HEX 己醣胺酶(蛋白)
hPGRN 人類顆粒蛋白前體(Human Progranulin)
hPGRN v2 人類顆粒蛋白前體2版
ICH 國際藥品法規協和會(International Conference on Harmonization)
ICM 腦大池內(Intra-Cisterna Magna)
ICP 顱內壓(Intracranial Pressure)
ICV 腦室內(Intracerebroventricular)
IDS 艾杜糖醛酸鹽硫酸脂酶(Iduronate-2-Sulfatase)
IDUA 艾杜糖醛酸酶(Iduronidase)
IFN-γ 干擾素γ
IND 研究中新藥(Investigational New Drug)
IT 鞘內(Intrathecally)
ITFFB 鞘內最終調配緩衝液(Intrathecal Final Formulation Buffer)
ITR 反向末端重複(Inverted Terminal Repeat)
IU 感染單位(Infectious Unit)
IV 靜脈內(Intravenous)
KanR 康黴素抗性(Kanamycin Resistance)(基因)
kb 千鹼基(kilobases)
KO 剔除(Knockout)
LAL 鱟變形細胞溶胞產物(Limulus Amoebocyte Lysate)
LBD 路易氏體失智症(Lewy Body Dementia)
LEFFTDS 家族性額顳葉失智症受試者縱向評估 (Longitudinal Evaluation of Familial Frontotemporal Dementia Subjects)
LFTs 肝功能檢查(Liver Function Tests)
LLOQ 最低定量極限
LOD 偵測極限
LP 腰椎穿刺(Lumbar Puncture)
LTFU 長期追踪(Long-Term Follow-Up)
lvPPA 語彙減少變異型原發性進行性失語症 (Logopenic Variant Primary Progressive Aphasia)
M 男性
MAPT 微管相關tau蛋白質(Microtubule-Associated Protein Tau)(基因，人類)
MBR 主批次紀錄(Master Batch Record)
MCB 主細胞庫(Master Cell Bank)
MED 最小有效劑量(Minimum Effective Dose)
MMSE 簡易精神狀態檢查(Mini-Mental State Exam)
MRI 磁共振成像
mRNA 傳訊核糖核酸
MS 質譜法
MTD 最大耐受劑量
N 受試者或動物數量
N/A 不適用
NAbs 中和抗體
NCL 神經性類蠟脂褐質病(Neuronal Ceroid Lipofuscinosis)
nfvPPA 非流暢變異型原發性進行性失語症(Nonfluent Variant Primary Progressive Aphasia)
NFL 神經纖維絲輕鏈(Neurofilament Light Chain)
NGS 次世代定序法(Next-Generation Sequencing)
NHP 非人類靈長類動物(Non-Human Primate)
NHS 自然史研究(Natural History Study)
NPI 神經精神評估量表(Neuropsychiatric Inventory)
NSAID 非類固醇類消炎藥(Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug)
OL 開放性(Open-Label)
PBS 磷酸鹽緩衝生理鹽水
PD 帕金森氏症(Parkinson’s Disease)
PEI 聚乙烯亞胺
PES 聚醚碸
PET 正子發射斷層掃瞄(Positron Emission Tomography)
PGRN 顆粒蛋白前體(蛋白質)
PI 計畫主持人(Principal Investigator)
POC 概念驗證(Proof-of-Concept)
polyA 多腺核苷酸化(Polyadenylation)
PPA 原發性進行性失語症(Primary Progressive Aphasia)
PSP 進行性核上神經麻痺症(Progressive Supranuclear Palsy)
QA 品質保證(Quality Assurance)
QC 品質管制(Quality Control)
qPCR 定量聚合酶連鎖反應
rAAV 重組腺相關病毒
ROA 投予途徑(Route of Administration)
rcAAV 具複製能力腺相關病毒(Replication-Competent Adeno-Associated Virus)
rBG 兔β-球蛋白
rDNA 核糖體去氧核糖核酸
rep 複製酶(基因)
RNA 核糖核酸
SA 單臂(Single Arm)
SAE 嚴重不良事件(Serious Adverse Events)
SDS 十二烷基硫酸鈉
SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳
SRT 安全性審查觸發(Safety Review Trigger)
ssDNA 單股去氧核糖核酸
svPPA 語義變異型原發性進行性失語症(Semantic Variant Primary Progressive Aphasia)
TBD 待確定(To Be Determined)
TCID 50 50% 組織培養感染劑量
TDP-43 TAR DNA結合蛋白43 (TAR DNA-Binding Protein 43) (蛋白質)
TE Tris-EDTA
TFF 切向流過濾(Tangential Flow Filtration)
UbC 泛蛋白C(Ubiquitin C)
UCSF 加州大學舊金山分校(University of California at San Francisco)
UPenn 賓州大學(University of Pennsylvania)
UPDRS 統一帕金森氏症評定量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale)
UPLC 超高效液相層析
US 美國
WT 野生型(Wild Type)
實施例 1 ：材料與方法 載體將工程化人類PGRN cDNA選殖到含有雞β肌動蛋白啟動子與巨細胞病毒早期強化子、嵌合內含子及兔β-球蛋白多腺核苷酸化序列的表現構築體中(圖1)。將第二工程化人類PGRN cDNA選殖到含有人類泛蛋白C啟動子之表現構築體中。該表現構築體的兩側為AAV2反向末端重複。如前所述(Lock M, et al. Hum Gene Ther. 2010；21(10):1259-71)，藉由三重轉染HEK 293細胞及碘克沙醇純化，由此構築體產生腺相關病毒血清型1、5及人類68(AAVhu68)。
動物程序所有動物方案均由賓州大學的機構動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。GRN剔除小鼠的繁殖對係購自The Jackson Laboratory(庫存編號#013175)並在賓州大學保留了一個族群。野生型C57BL/6(庫存編號#000664)作為對照組。在第一項研究中，將2月齡小鼠以異氟烷(isoflurane)麻醉，並以體積5 µL之1x10 11載體基因體拷貝數(GC)注射於側腦室(ICV)。注射60日後，藉由在氯胺酮(ketamine)/賽拉嗪(xylazine)麻醉下放血使小鼠安樂死，並藉由頸椎脫臼確認死亡。在第二項研究中，小鼠在7月齡時接受治療，並在11月齡時犧牲。在屍體剖檢時，藉由心臟穿刺收集血清並藉由枕骨下穿刺用32號針連接到聚乙烯配管收集CSF。血清及CSF樣品立即在乾冰上冷凍並儲存於-80度直至分析。收集額葉皮質用於生物化學處理，並立即在乾冰上冷凍，而其餘的大腦則以10%福馬林固定以進行組織學檢查。
3-4歲之恆河獼猴購自Covance。以經由枕骨下穿刺進入腦大池之特定的測試物品的單次注射(ICM注射)對動物投劑。使用相同裝置及程序對所有動物投劑。在研究的第0天，在投予前使動物鎮靜。在投予測試物品之前，對動物稱重並記錄生命徵象。向動物提供鎮痛劑。
然後將麻醉的獼猴從動物留置空間轉移並以側臥姿置於X光檢驗台上，頭部向前彎曲以收集CSF並投劑至腦大池內。對注射部位無菌地進行準備。使用無菌技術，將21-27號Quincke脊椎穿刺針(Becton Dickinson)推進枕骨下空間，直到觀察到CSF流出。其次，在投劑前收集1.0 mL CSF用於基線分析。穿過的解剖結構包括皮膚、皮下脂肪、硬膜外腔、硬膜及寰枕關節筋膜。針頭朝向腦大池更寬的上部間隙，以避免血液污染及潛在的腦幹損傷。可使用螢光鏡(OEC9800 C-Arm, GE)經由脊髓腔攝影來驗證針穿刺的正確位置。CSF收集後，將魯爾(leur)通路延長導管連接至脊椎穿刺針以促進碘苯六醇(Iohexol)(商標名：Omnipaque 180 mg/mL，General Electric Healthcare)造影劑及測試物品的投劑。經由導管及脊椎穿刺針投予至多2 mL之碘苯六醇。確認針頭位置後，將含有測試物品的注射器(體積等於1.0 mL加上注射器及接頭無效空間的體積)連接到撓性接頭並注射30 ± 5秒。投予後，移除針頭，對穿刺部位施加直接壓力。
組織學與影像學將小鼠大腦固定於10%福馬林中，冷凍保存在蔗糖中，包埋於最佳切削溫度(optimal cutting temperature；OCT)化合物中，並低溫切片。拍攝感興趣區域的自體螢光物質(脂褐質)的低倍影像。使用Image J軟體以盲測法對脂褐質沉積物進行定量。非人類靈長類動物組織固定於10%福馬林中，石蠟包埋並以蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin；H&E)染色。玻片經認證的獸醫病理學家(ELB)審查。對於以GFP載體治療的動物，將腦切片用針對olig2、GFAP或NeuN的抗體進行染色。所有切片均用DAPI及針對GFP的抗體進行共同染色，然後用螢光二級抗體進行染色。在Leica Aperio Versa 200玻片掃描儀上掃描玻片，並從eSlide Manager下載，以在HALO成像軟體(Indica Labs)上進行分析。對每隻動物右腦半球取樣五個區域，並對具有每種細胞類型標記的細胞進行定量。藉由調整以下設定來檢測細胞：在細胞核檢測標籤下的「最小核強度」、「核大小」、「核分割積極性(nuclear segmentation aggressiveness)」及「最小核圓度」。然後，對於每種單獨的染料定義基準，以進一步鑑定細胞並為每種標記產生定量的總細胞數。基於檢測所欲細胞類型的敏感性及可靠性而依據經驗地確定設定；在一些情況下，設定例如細胞質中的NeuN檢測並不能反映標記的真正細胞內定位，但可提供更高的檢測的特異性及靈敏度。藉由自動方式檢測到的所有細胞均經過手動驗證。對於神經元，在「染料1」標籤下，調整「細胞核陽性閾值」及「細胞質陽性閾值」以便只檢測在細胞核及細胞質中都存在NeuN的細胞。對於星狀細胞，選擇DAPI及GFAP標記，且兩者都必須存在於細胞的細胞核及細胞質中才能將該細胞包括在計數中。對於寡樹突細胞，細胞如果DAPI及olig2皆存在於該細胞的細胞核但均不存在於細胞質中，則被計數。對於共定位，使用相同的設定，但是GFP被包括作為在神經元的細胞核中，以及在星狀細胞的細胞核及細胞質兩者中的額外染料。將不表現所有選定標記的細胞，藉由使用細胞核或細胞質「遮蔽」功能對其進行「遮蔽」而從所產生之結果表中消除。由於缺少與olig2共同定位的GFP陽性細胞，而對轉導的寡樹突細胞進行手動計數。在一些情況下，脈絡叢(choroid plexus)的血管或部分呈現自體螢光，並使用「裁剪」工具手動勾勒出輪廓並排除。所得之值係表示為每種細胞類型標記的GFP陽性細胞的百分比。
評估神經炎症 ( CD68 免疫組織化學 )對每隻動物的大腦進行冷凍切片，對CD68進行免疫組織化學染色。簡而言之，藉由在100°C下，在以1:100 稀釋於diH 2O的基於檸檬酸鹽之抗原修復緩衝液(Vector Laboratories，目錄編號#H-3300)中，將玻片培育20分鐘來進行抗原修復。然後洗滌玻片並在含有0.2% Triton-X的1%驢血清中室溫阻斷15分鐘。玻片與兔抗小鼠CD68初級抗體(Abcam，目錄編號#125212)在4°C下陪育隔夜。次日，洗滌玻片並與抗兔IgG TritC結合的二級抗體在室溫下培育1小時。玻片在PBS中洗滌，然後用diH2O洗滌1分鐘。以Fluoromount G或含有DAPI的類似介質作為核複染劑蓋上玻片。使用VIS 圖像分析軟體將CD68染色定量為每個視野的陽性面積。藉由將平均視野大小除以視野大小，然後乘以CD68陽性面積，而將CD68面積標準化為總視野面積(Visiopharm；Hoersholm, Denmark；Version 2019.07.0.6328)。
用於己醣胺酶 (Hex) 分析之樣品製備藉由在96孔黑色塑料分析盤中混合10 μg腦組織溶胞產物或5 μl血清與95 μL反應混合物(1 mM 4-甲基傘形酮-N-乙醯基-β-D-胺基葡萄糖苷(4-Methylumbelliferyl N acetyl-β-D-glucosaminide)[Sigma M2133]、0.15 M NaCl、0.05% Triton X-100及0.1 M乙酸鈉，pH 3.58)來測量 HEX 活性。將盤密封並在37°C下培育30分鐘，藉由添加150 μL終止溶液(290 mM甘胺酸及180 mM檸檬酸鈉，pH 10.9)終止反應。在365 nm激發時，在450 nm的發射波長測量來自反應產物的螢光。
DNA 萃取及生物分布 (TaqMan qPCR)使用TaqMan定量聚合酶鏈反應(qPCR)，對所收集用於載體生物分布分析的組織進行去氧核糖核酸(DNA)萃取及基因體拷貝數定量。簡而言之，將組織機械性均質化並以蛋白酶K消化。以RNA酶A處理樣品，並藉由在70°C下，在緩衝液 AL(目錄編號#19075，QIAGEN)中培育1小時來使細胞溶胞。在QIAGEN離心管柱上萃取及純化DNA。在稀釋至≥90且≤110 ng/μl的濃度後，使用載體特異性引子及/或轉基因特異性引子重複進行qPCR反應。將信號與來自同一研究的幼年動物或陰性對照組動物的已知DNA濃度背景下的線性化質體DNA的標準曲線進行比較。計算每微克DNA的基因體拷貝數。使用額外的對照組來排除PCR反應中的交叉污染及樣品干擾。根據預先定義的Ct值可接受基準來分析原始數據，並確定每次運行的定量限度。所有數據均包括在批次記錄表中及/或附於批次記錄表中。
評估轉基因表現 (ELISA)使用Qiagen TissueLyzer將來自額葉皮質的腦組織冷凍樣品在含有0.9% NaCl(pH 4.0)及0.05% Triton-X100的溶液中於30Hz下均質化2分鐘。樣品在乾冰上冷凍，在室溫下解凍，並短暫渦旋。藉由在桌上型離心機中以10,000 RPM離心10分鐘來使溶胞產物澄清。
使用三明治酶聯免疫吸附分析法(ELISA)在腦組織溶胞產物或CSF中測量人類PGRN表現。簡而言之，ELISA盤在4°C下以抗人類PGRN捕獲抗體塗布隔夜。將盤洗滌，然後在含1%牛血清白蛋白之PBS中於室溫下阻斷2小時。將盤倒空，將100 μl腦組織溶胞產物或CSF在室溫下培育1小時。將盤洗滌並與經生物素結合的抗人類IgG抗體於室溫下培育1小時。將盤洗滌並與經卵白素結合的山葵過氧化酶於室溫下培育1小時。將盤洗滌並於室溫下在含有3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)顯色基質及0.004% H 2O 2之顯影溶液中培育。觀察反應的顯色時間長達30分鐘，直到任何孔的顏色顯露出達到飽和。然後藉由添加含有H 2S0 4的終止緩衝液淬滅反應，並於450 nm測量吸光度。
抗轉基因抗體的評估 (ELISA)藉由間接ELISA測量血清及CSF中的抗人類PGRN抗體。簡而言之，將ELISA盤以重組人類PGRN蛋白(1 μg/mL)於4°C塗布隔夜。將盤洗滌，然後在含1%牛血清白蛋白之DPBS中於室溫阻斷1小時。將血清樣品以1:250稀釋於DPBS，而CSF樣品以1:5稀釋。將稀釋的樣品以一式兩份添加至ELISA盤的孔中，並於37ºC培育1小時。將盤洗滌，並與生物素化抗小鼠IgG抗體於室溫培育1小時，之後洗滌並與經卵白素結合的山葵過氧化酶二級抗體培育1小時。將盤洗滌，並於室溫下在含有3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)顯色基質及0.004% H 2O 2之顯影溶液中培育。觀察反應的顯色時間長達30分鐘，直到任何孔的顏色顯露出達到飽和。藉由添加含有H 2S0 4的終止緩衝液淬滅反應，並於450 nm測量吸光度。
用於 ELISpot 分析的周邊血液單核細胞及淋巴細胞單離 周邊血液單核細胞單離在預先加標籤的50 mL離心管中，以無菌Hank平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution；HBSS)稀釋多達10 mL的血液。充分混合樣品，然後經100% Ficoll-Paque Plus密度梯度離心。去除上層血漿部分。將下面含有PBMC的層置於新試管中，洗滌，並使用ACK溶胞緩衝液使細胞溶胞。以DNA酶I處理懸浮液，離心，並去除由溶胞的紅血球所組成的上清液。使白血球沉澱物鬆散、洗滌、以DNA酶I處理並離心。將沉澱物再懸浮於完全RPMI培養基(含有補充有L-麩醯胺酸、胎牛血清[FBS]、4-(2-羥乙基)-1-哌𠯤乙磺酸[HEPES]、pen/strep及硫酸鍵他黴素(gentamycin)的RPMI 1650培養基)中。
肝淋巴細胞單離收集每隻動物的肝臟切片並於室溫置於無菌RPMI 1640培養基中。肝臟收集後不久，將其於培養皿中切成小塊。將此等塊在磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中洗滌，並使用手動處理器切成1 mm大小的碎片或使用自動組織分離器(tissue dissociator)均質化。組織以膠原酶消化並通過100 μm及40 μm過濾器過濾。將樣品離心，並以補充有1% FBS的PBS洗滌沉澱物以去除膠原酶。將沉澱物再懸浮於補充有5% FBS的RPMI 1640培養基中。然後經由Percoll梯度，在20°C(±2°C)下以2000 RPM離心20分鐘來單離肝淋巴細胞。將肝淋巴細胞在補充有1% FBS的PBS中洗滌兩次，之後以1600 RPM離心5分鐘，每次在20°C(±2°C)下洗滌。將肝淋巴細胞再懸浮於RPMI 1640培養基中。
脾淋巴細胞單離收集每隻動物的脾臟切片並於室溫置於無菌L15培養基中。隨後將其切成小塊，並使用自動組織分離器研磨或均質化。將漿液通過細胞過濾器過濾至50 mL錐形離心管中。將樣品以1700 RPM於20°C(±2°C)離心5分鐘，並丟棄上清液。將細胞沉澱物於室溫再懸浮於ACK溶胞緩衝液中3分鐘。然後，將含有DNA酶I之RPMI 1640培養基添加至樣品，之後立即在20°C(±2°C)下以1700 RPM離心5分鐘。細胞沉澱物以RPMI 1640培養基洗滌以去除DNA酶I及溶胞緩衝液並離心。將經洗滌的脾細胞再懸浮於RPMI 1640培養基中。
骨髓淋巴細胞單離將骨髓於室溫收集到含有肝素及PBS的管中。骨髓在無菌HBSS中稀釋並通過70 μm過濾器過濾，之後通過40 μm過濾器過濾，或者使用自動組織分離器均質化。將過濾的骨髓置於新試管中的Ficoll-Paque層頂部，並以2500 RPM離心25分鐘來離心分離。去除上層部分，並將含有骨髓淋巴細胞的部分移入新試管中。細胞以HBSS洗滌並以1700 RPM離心5分鐘。將細胞沉澱物再次以完全RPMI培養基(含有補充有L-麩醯胺酸、FBS、HEPES、pen/strep及硫酸鍵他黴素的RPMI 1650培養基)洗滌，並以1700 RPM離心5分鐘。將沉澱物再懸浮於RPMI 1640培養基中。
中和抗體分析如前所述評估針對AAVhu68的中和抗體(Calcedo R, et al. J Infect Dis. 2009；199(3):381-90)。
感覺神經傳導研究以氯胺酮/右美托咪定(dexmedetomidine)的組合使動物鎮靜。將經鎮靜動物以側臥或背臥放在帶有加熱袋的手術台上，以保持體溫。由於可能會干擾電信號採集，而未使用電子加熱設備。
感覺神經傳導研究(NCS)，亦稱為感覺神經傳導速度(NCV)測試，使用Nicolet EDX®系統(Natus Neurology)及Viking®分析軟體進行，以測量感覺神經動作電位(SNAP)振幅及傳導速度。簡而言之，將刺激探針放置在正中神經上，陰極最靠近記錄部位。將兩個針狀電極皮下插入到第二趾的遠端趾骨(參考電極)及近端趾骨(記錄電極)的水準，而接地電極放置在刺激探針(陰極)的近端。使用WR50 Comfort Plus Probe兒科刺激器(Natus Neurology)。激發的反應被有差異地放大並顯示在監視器上。最初的採集刺激強度設置為0.0 mA，以便確認缺乏背景電信號。為了找到最佳的刺激位置，將刺激強度增加至10.0 mA，並在沿正中神經移動探針時產生一連串刺激，直到找到最佳位置為止(由最大確定波形決定)。將探針保持在最佳位置，刺激強度以逐步的方式逐漸增加至10.0 mA，直到峰值振幅響應不再增加為止。最後30個刺激反應被記錄並保存於軟體中。對於正中神經，平均最多10次最大刺激反應並報告。測量從記錄部位到刺激陰極的距離(cm)，並將其輸入軟體中。使用反應的起始潛伏期及距離(cm)計算傳導速度。報告傳導速度及SNAP振幅的平均值兩者。對雙側正中神經進行測試。儀器生成的所有原始數據皆被保留作為研究文件的一部分。
實施例 2 ：重組 AAV1.hPGRN藉由HEK293細胞之三重質體轉染，利用以下產生rAAV1.PGRN：1)兩側為AAV ITR的編碼轉基因表現匣的AAV順式質體(稱為pENN.AAV.CB7.CI.hPGRN.rBG.KanR)；2)編碼AAV2 rep及AAV1 cap基因的AAV反式質體(稱為pAAV2/1.KanR)；及3)輔助腺病毒質體(稱為pAdΔF6.KanR)。 A.AAV載體基因體質體序列元件
來自順式質體(稱為pENN.AAV.CB7.CI.hPGRN.rBG.KanR(p4862))中的載體基因體的線性圖譜。參見圖2。
順式質體含有以下載體基因體序列元件： 1.反向末端重複(ITR)：ITR為源自AAV2之相同、反向互補的序列(130個鹼基對[bp]，GenBank：NC_001401)，其位於載體基因體所有組件的兩側。當反式提供AAV及腺病毒輔助功能時，ITR功能為載體DNA複製的起始與載體基因體的包裝訊息二者。從而，ITR序列代表載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。 2.人類巨細胞病毒立即早期強化子(CMV IE)：獲自人類衍生之CMV的此強化子序列(382 bp，GenBank：K03104.1)增加下游轉基因的表現。 3.雞β-肌動蛋白啟動子(BA)：選擇此普遍存在的啟動子(282 bp，GenBank：X00182.1)來驅動任何CNS細胞類型中的轉基因表現。 4.嵌合內含子(CI)：雜合的內含子由雞β-肌動蛋白剪接供給體(973 bp，GenBank：X00182.1)與兔β-球蛋白剪接接受體元件所組成。內含子被轉錄，但藉由剪接將其從成熟的mRNA中移除，從而將其任一側的序列匯集在一起。在表現匣中內含子的存在已顯示促進mRNA從細胞核到細胞質的運送，因此增強用於轉譯之mRNA之穩定水準的蓄積。此為欲增加基因表現水準的基因載體的共同特徵。 5.編碼序列：人類 GRN基因的工程化cDNA(1785 bp，包括兩個終止密碼子)，編碼人類PGRN(hPGRN)蛋白(593個胺基酸[aa]，GenBank：NP_002078)，其涉及溶酶體功能及其它神經系統角色。 6.兔β-球蛋白多腺核苷酸化訊息(rBG PolyA)：rBG polyA訊息(127 bp，GenBank：V00882.1)以順式促進轉基因mRNA的高效多腺核苷酸化。此元件用作轉錄終止的訊息、在初生轉錄本的3’端的特異性裂解事件及添加長多腺核苷酸尾。 B.AAV1反式質體：pAAV2/1.KanR(p0069)
AAV2/1反式質體為pAAV2/1.KanR(p0069)。pAAV2/1.KanR質體為8113 bp長且編碼複製及包裝AAV載體基因體所需的四種野生型AAV2複製酶(Rep)蛋白。pAAV2/1.KanR亦編碼三種野生型AAV1病毒顆粒子蛋白質殼體(Cap)蛋白，此等組裝成AAV血清型1(AAV1)的病毒粒子外殼，以容納AAV載體基因體。包含於pAAV2/1.KanR中的AAV1 cap基因係單離自猿猴來源。
為了創建pAAV2/1.KanR構築體，將來自p5E18(2/2)的3.0千鹼基(kb)片段、來自pAV1H的2.3kb片段及來自p5E18(2/2)的1.7kb片段合併以形成pAAV2/1(p0001)，其在安比西林抗性(AmpR)匣中含有AAV2 rep及AAV1 cap(在文獻中稱為p5E18[2/1])。此選殖策略亦將AAV p5啟動子序列(通常驅動 rep表現)從 rep的5’端遷移至 cap的3’端，在 rep的上游留下一個截短的 p5啟動子。此截短的啟動子調降 rep的表現，從而使載體的產量最大化(Xiao et al., (1999) Gene therapy vectors based on adeno-associated virus type 1. J Virol. 73(5):3994-4003)。
為了產生用於臨床產品生產的pAAV2/1.KanR，將pAAV2/1主鏈序列中的安比西林抗性( AmpR)基因替換為康黴素抗性( KanR)基因。反式質體的所有組件部分均已藉由直接定序驗證。
C.腺病毒輔助質體：pAdDeltaF6(KanR) 質體pAdDeltaF6(KanR)在賓州大學的James M. Wilson博士及其同事的實驗室中構築而成，大小為15,774 bp。該質體含有對AAV複製很重要的腺病毒基因體區域；即， E2A、 E4及 VARNA(腺病毒E1之功能由HEK293細胞提供)。然而，該質體並不含有其它腺病毒複製或結構基因。該質體並不含有對複製重要的順式元件，例如腺病毒ITR；因此，預期不會產生感染性腺病毒。質體源自Ad5之E1、E3缺失分子殖株(pBHG10，一種pBR322系質體)。將缺失導入至Ad5中以去除不必要之腺病毒基因的表現並將腺病毒DNA的量從32 kb減少到12 kb。最後，以康黴素抗性基因替換安比西林抗性基因，以產生pAdeltaF6(KanR)。保留在此質體中的 E2、 E4及 VAI腺病毒基因，以及存在於HEK293細胞中的 E1，對於AAV載體生產都是必需的。
根據USP＜791＞確定的最終產物的pH值應在6.2至7.7範圍內，根據USP＜785＞確定的滲透壓成分應為260至320 mOsm/kg，且藉由ddPCR測定的GC效價大於或等於2.5 x 10 13GC/mL(Lock et al, (2014). “Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.” Hum Gene Ther Methods. 25(2):115-25)。
實施例 3 ：在鼠類疾病模式中的人類 PGRN 轉基因 之 AAV 媒介的遞送使用例如WO 2018/160582所述之已公開的三重轉染技術，產生具有AAVhu68殼體且在CB7啟動子及嵌合內含子(CB7.CI.hPGRN.rBG)的控制下表現人類PGRN(SEQ ID NO：3)之重組AAV載體。
在 Grn剔除小鼠模式中評估人類 Grn轉基因的AAV媒介的遞送。用於 Grn突變( Grn+/-)的小鼠異基因型組合並未呈現與 Grn相關的神經退化性疾病的病理學特徵，可能是因為小鼠的壽命未能允許發展出GRN單套缺失的後遺症，GRN單套缺失在人類中數十年後才首次呈現徵兆。相較之下， Grn-/-小鼠中完全PGRN缺失則概括了在人類中 Grn單套缺失的幾個早期特徵，例如溶酶體功能受損、自體螢光的溶酶體貯積物質(脂褐質)的蓄積及小神經膠質細胞的活化，雖然 Grn-/-小鼠直至兩歲都沒有呈現神經元損失(Lui H, et al. Cell. 2016；165(4):921-35；Ward ME, et al. Sci Transl Med. 2017 Apr 12；9(385):pii: eaah5642)。 Grn+/-及 Grn-/-小鼠均被報導表現出行為異常，但各組之間的發現不一致(Ahmed Z, et al. Am J Pathol. 2010；177(1):311-24；Wils H, et al. The Journal of Pathology. 2012；228(1):67-76；Ghoshal N, et al. Neurobiology of Disease. 2012；45(1):395-408；Filiano AJ, et al. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2013；33(12):5352-61；Yin F, et al. The FASEB Journal. 2010；24(12):4639-47)。同樣地，一些報告表明 Grn-/-小鼠的生存期降低，而另一些報告則發現 Grn-/-小鼠的壽命正常，這與我們的經驗一致(Ahmed Z, et al. Am J Pathol. 2010；177(1):311-24；Wils H, et al. The Journal of Pathology. 2012；228(1):67-76)。儘管 Grn-/-小鼠並未呈現明顯的神經退化或神經病學徵象，但與人類中 Grn單套缺失的顯著生化及組織學相似性，使其成為評估新穎療法的潛在有益模式。因此，將分析聚焦於在 Grn-/-小鼠中的此等生化及組織學上的發現。
這項研究的目的為評估將人類 Grn基因遞送至大腦是否可在 Grn-/-小鼠中消除現有的溶酶體貯積物質並正常化溶酶體的功能。對於溶酶體貯積的反應，細胞調升溶酶體酵素的表現，其可用作溶酶體貯積病的生物標記(Hinderer C, et al. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2014；22(12):2018-27；Gurda BL, et al. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2016；24(2):206-16；Karageorgos LE, et al. Experimental Cell Research. 1997；234(1):85-97)。評估來自不同年齡的 Grn-/-及 Grn+/+小鼠的腦組織中的溶酶體酵素己醣胺酶的活性、以及皮質、海馬迴及視丘中的脂褐質沉積物(圖3A-圖3D)。在整個生命中，己醣胺酶活性的升高為明顯的，而脂褐質則呈現漸進的蓄積。脂褐質早在2個月齡時就很明顯，此與先前的發現一致(Klein ZA, et al. Neuron. 2017；95(2):281-96 e6)。以基於天然單離物AAVhu68的AAV載體進行初步研究，該單離物與分支群F單離物AAV9密切相關。以腦室內(ICV)注射表現人類 Grn的AAVhu68載體或媒劑(PBS)治療2-3月齡之 Grn-/-小鼠(每組N=10)。此外，以媒劑注射同齡群(cohort)的野生型小鼠(N=10)。因為2月齡小鼠的小尺寸難以經由ICM途徑而可靠地投予載體，所以使用ICV ROA(涉及將AAV載體直接注射到腦室的CSF中)，ICM途徑為用於NHP研究及擬議的FIH臨床試驗的ROA。先前的研究證實，以本研究選擇的劑量(10 11GC)，AAVhu68之ICV投予造成僅限於經注射的腦室的附近大腦區域之轉導作用，使其成為一種有用系統，以評估是否可透過藉由小細胞族群分泌PGRN而實現全面改善腦病灶。
投予載體兩個月後，對動物實施安樂死，並收集大腦、CSF及血清。大腦中人類PGRN蛋白質水準的定量證實AAV治療組的轉導(圖4)。PGRN為一種可在CSF中測定的分泌性蛋白質，且在人類GRN突變攜帶者的CSF中會降低(Lui H, et al. Cell. 2016；165(4):921-35；Meeter LH, et al. Dement Geriatr Cogn Dis Extra. 2016；6(2):330-40)。因此，評估經AAV治療的 Grn -/- 小鼠之CSF中PGRN蛋白質的水準，其顯示平均CSF濃度為14 ng/mL，而在經媒劑處理之組別中，人類PGRN低於檢測水準(圖4)。PGRN的表現伴隨著溶酶體酵素表現的正常化，在經AAV治療的 Grn -/-小鼠的大腦中Hex活性水準恢復到接近正常水準(圖5)。在血清中，經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠的HEX活性顯著高於經媒劑處理的WT小鼠。相較之下，經AAV治療的 Grn -/-小鼠中的HEX活性顯著低於經媒劑處理的 Grn -/-小鼠，並與經媒劑處理的WT小鼠相似。
確認在 Grn -/-小鼠的大腦中的PGRN表現後，評估PGRN表現是否減少海馬迴、視丘及皮質中脂褐質沉積物的數量。為此目的，將未染色的經固定之大腦切片置於蓋玻片上，並以盲測法對自體螢光的脂褐質進行成像並定量。與經媒劑處理的WT小鼠相比，經媒劑處理的 Grn -/-小鼠的海馬迴、視丘及額葉皮質中存在明顯更多的脂褐質沉積物。相較之下，AAV投予顯著減少 Grn -/-小鼠所有三個腦區域中脂褐質沉積物的數量至與經媒劑處理的WT小鼠相當的水準(圖6)。
概念研究的初步驗證證明，當貯積物質剛開始出現在大腦中時，早期治療的小鼠中AAV媒介的PGRN表現的治療活性。隨後評估基因轉移對具有早已存在更嚴重之病理的老年小鼠的影響。在此研究中，7月齡之 Grn -/-小鼠接受單次ICV注射表現人類PGRN之AAVhu68載體或媒劑，並於11月齡時犧牲。除了廣泛的腦脂褐質沉積物外，11月齡的 Grn -/-小鼠呈現廣泛的小神經膠質細胞增生，類似於患有由 Grn突變引起的FTD的患者(圖7A–圖7C)(Ahmed Z, et al. Journal of neuroinflammation. J Neuroinflammation. 2007 Feb 11；4:7)。GRN基因的轉移減少了老年小鼠的腦Hex活性及脂褐質沉積物，這與在較年幼動物中的發現相似。此外，小神經膠質細胞的大小及數量在經治療的小鼠大腦中被正常化。
在累計上，將表現人類PGRN之AAV載體以ICV遞送到 Grn -/-小鼠的腦清除了脂褐質聚集體，且幾乎完全正常化溶酶體酵素活性，表明PGRN基因遞送可有效改正 Grn相關神經退化性疾病的潛在病理生理學的關鍵方面。
實施例 4 ：於非人類靈長類動物中之 AAV 媒介的 GRN 基因遞送此研究評估四種載體(PBFT02、AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG、AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40及AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG)，其表現人類顆粒蛋白前驅物(GRN)基因，該基因編碼顆粒蛋白前體(PGRN)蛋白。然而，各候選物由不同的血清型、啟動子、工程化轉基因(SEQ ID NO：3或4)及轉錄終止子組合所組成。
載體以3.0 x 10 13基因體拷貝數(GC)/動物的單次腦大池內(ICM)劑量投予至成年非人類靈長類動物(NHP)。生活中的評估包括日常觀察、體重測量、血液及腦脊髓液(CSF)臨床病理學測定盤(細胞計數、差異、臨床化學及/或總蛋白)，以及對CSF及血清中轉基因表現的評估。亦在顯示最高轉基因表現水準的組別中測量CSF及血清中針對轉基因的抗體。在第35天或第60天對所有NHP進行屍體剖檢，並評估來自具有最高轉基因表現水準組別的腦及脊髓的組織病理學。
分組後，每隻動物以3.0 x 10 13GC(3.3 x 10 11GC/g腦)的劑量接受以下測試物品之一的單次ICM注射： 1.PBFT02 2.AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG 3.AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG 4.AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40 研究設計總結於下表中。
組別 處理 動物ID 性別 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦) a 屍體剖檢日
1 PBFT02 RA3151 M 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 35±2
RA3170 M
2 AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG RA3155 M 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 35±2
RA3160 M
3 AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG RA2981 F 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 35±2
RA2982 F
4 AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40 RA3027 M 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 60±4
RA3153 M
a對於成年恆河獼猴使用90克腦質量計算數值 縮寫：F，雌性；GC，基因體拷貝數；ICM，腦大池內；ID，識別號；M，雄性；N/A，不適用；ROA，投予途徑。
在CSF中，對於所有測試的載體，在第7天檢測到人類PGRN的表現。到第14天，對於所有測試的載體，PGRN的表現皆超過在健康人類對照樣品中所發現的平均表現水準。在投予PBFT02的NHP的CSF中表現始終最高。從第7–35天，投予PBFT02的動物的平均PGRN濃度比正常人類CSF PGRN水準高約40倍(圖8)。對於投予PBFT02的兩隻NHP，CSF PGRN水準似乎在第21-28天左右達到峰值。在血漿中，對於所有測試的載體，在第7天檢測到人類PGRN的表現。在第7天及第14天，在投予PBFT02或AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的NHP中的PGRN表現水準超過健康人類對照樣品所公開的PGRN濃度，且兩種載體的表現似乎在第14-21天左右達到峰值。相較之下，投予AAV5.CB7.CI.hPGRN.rBG的NHP在血漿中顯示出較低水準的PGRN(圖8)。
因為與其它組別相比，在研究期間，投予PBFT02或AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的NHP在CFS及血漿中呈現出更高水準的PGRN，而僅評估此等組別對轉基因的抗體反應。在CSF中，在7-35天內，於投予PBFT02或AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的NHP中檢測到抗PGRN抗體的存在。與投予AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的彼等NHP相比，投予PBFT02的NHP顯示出更早的抗體反應(圖9)。在血清中，在7-14天內，於投予PBFT02或AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的NHP中檢測到抗PGRN抗體的存在。兩個治療組別之間出現抗體反應的時間相似(圖9)。
所有NHP都存活至預定的研究終點(第1-3組為第35±2天，第4組為第60±4天)。對所有動物進行屍體剖檢。在日常觀察中沒有發現與治療相關的異常。在整個研究過程中，所有動物的體重都是穩定的(圖10)。
CSF分析顯示，所有投予的載體在AAV投予後7-21天開始出現無症狀的淋巴細胞增多症(圖11)。與研究中的其它動物相比，投予AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG(RA2981及RA2982)的兩隻動物及投予AAVhu68.UbC.PI.hPGRN2.SV40(RA3153)的一隻動物顯示出一般較溫和的細胞增多症。CSF白血球計數從峰值水準下降，但在研究中的大多數動物屍體剖檢時仍保持升高的水準。
在所研究的任何動物中都沒有與治療相關的大體病理學發現。由於在研究期間投予PBFT02或AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的NHP在CSF及血漿中表現出更高水準的PGRN，而僅對此等組別進行腦及脊髓的組織病理學檢查。投予PBFT02或AAVhu68.CB7.CI.hPGRN.rBG的NHP在腦膜及脈絡叢中顯示偶爾的最小淋巴細胞浸潤。在一些DRG及脊髓切片中亦觀察到感覺神經元及其相關軸突的退化。感覺神經元的發現在嚴重程度上從典型極輕微至輕微，且與臨床徵象無關。
ICM 投予 AAV1 及 AAVhu68 載體至非人類靈長類動物後 CNS 轉導的不同型態以AAV1載體治療的NHP的CSF中表現明顯較高PGRN，促使進一步探索AAV1、AAV5及AAVhu68載體轉導型態的差異。對NHP進行單次ICM注射表現GFP報導基因的AAV1、AAV5或AAVhu68載體(3x10 13GC，每種載體n=2)。注射後28天犧牲動物用於腦轉導的組織學分析。
免疫組織化學顯示，以AAV1及AAVhu68載體治療的NHP大腦遍及瀰漫性、片狀的轉導。在接受AAV5載體的動物大腦中明顯為最小的轉導。為了更準確地特性化AAV1與AAVhu68之間的轉導差異，開發一種半自動方法以定量從多個大腦區域所收集的切片中的轉導細胞。使用以針對GFP的螢光標識抗體染色的切片、及特定細胞類型的標記，分別藉由NeuN、olig2及GFAP染色對神經元、寡樹突細胞及星狀細胞的總數進行定量，之後定量各類型的GFP表現細胞(圖12、圖13)。在所有檢測的區域中，AAV1及AAVhu68型各自轉導不到各種細胞類的百分之一。兩種載體之間神經元的轉導幾乎相等，而AAVhu68似乎適度轉導了更多數量的星狀細胞及寡樹突細胞。
鑑於以AAV1達到的CSF PGRN水準明顯更高，用AAV1及AAVhu68載體所觀察到的大致等效的腦轉導為出乎意料的。藉由免疫組織化學在以AAVhu68治療的動物及以AAV1治療的動物RA1826的側腦室及第四腦室的多個區域中評估室管膜細胞的轉導。令人感興趣的是，來自經AAV1治療的動物(RA1826)的多個腦切片(含有部分腦室系統)證實沿腦室排列的室管膜細胞的廣泛轉導，其在經AAVhu68治療的動物中均未觀察到(未顯示)。在所有採樣區域，包括側腦室及第四腦室的額角、顳角及枕角，平均轉導48%的室管膜細胞。相反地，在給予AAVhu68載體之動物的相同大腦區域中，只有1-2%的室管膜細胞被轉導。在第二隻經AAV1治療的動物中，僅可評估一個側腦室的小片段，該動物顯示出大約1%的室管膜細胞轉導，儘管分析僅限於小的取樣區域。此等發現暗示，在兩個血清型之間其它類型的細胞轉導顯示相似的情況下，在經AAV1治療的動物中之高度轉導的室管膜細胞可能是CSF中之高水準PGRN的來源。由分泌的PGRN媒介的旁觀者效應(bystander effect)使得由GRN突變引起的FTD特別適於AAV基因治療。由於細胞外PGRN可被神經元吸收，因此以AAV1載體達到高CSF PGRN水準(顯然由強健的室管膜細胞轉導所媒介)使AAV1成為一種GRN基因治療的理想選擇。
累積起來，此等研究確立了鞘內AAV遞送在大型動物模式的CSF中實現治療性PGRN表現水準的潛力。
實施例 5 ：在 Grn –/– 小鼠腦室內投予後 PBFT02 的功效以確定最小有效劑量 (MED)本藥理學研究的目的為在 Grn –/– 小鼠腦室內(ICV)投予PBFT02後評估最小有效劑量(MED)及轉基因表現水準，該PBFT02為一種重組腺相關病毒(AAV)血清型1載體，表現人類顆粒蛋白前驅物(GRN)基因，該基因編碼顆粒蛋白前體(PGRN)蛋白。
成年 Grn –/– 小鼠(6.5–8.5月齡)以4.4 x 10 9基因體拷貝數[GC]/動物、1.3 x 10 10GC/動物、4.4 x 10 10GC/動物或1.3 x 10 11GC/動物(分別為1.1 x 10 10GC/g腦、3.3 x 10 10GC/g腦、1.1 x 10 11GC/g腦、3.3 x 10 11GC/g腦)的四個劑量水準之一接受單次ICV投予PBFT02。另外的 Grn –/– 小鼠及C57BL/6J野生型小鼠投予媒劑(鞘內最終調配緩衝液[鞘內最終調配緩衝液，ITFFB])作為對照組。
下表列出各組名稱、劑量水準及投予途徑(ROA)。 表.組別、劑量水準及投予途徑
組別號 N及性別 基因型 治療 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦) a 劑量體積 (μL) ROA 投劑日 屍體剖檢日
1 6 M，9 F Grn –/– PBFT02 1.3 x 10 11 3.3 x 10 11 7.0 ICV 1 90±3
2 9 M，6 F Grn –/– PBFT02 4.4 x 10 10 1.1 x 10 11 7.0 ICV 1 90±3
3 9 M，6 F Grn –/– PBFT02 1.3 x 10 10 3.3 x 10 10 7.0 ICV 1 90±3
4 9 M，6 F Grn –/– PBFT02 4.4 x 10 9 1.1 x 10 10 7.0 ICV 1 90±3
5 6 M，9 F Grn –/– ITFFB N/A N/A 7.0 ICV 1 90±3
6 6 M，9 F 野生型 ITFFB N/A N/A 7.0 ICV 1 90±3
7 6 M，9 F Grn –/– 未處理 N/A N/A N/A N/A N/A 1 b
8 9 M，6 F 野生型 未處理 N/A N/A N/A N/A N/A 1 b
a對於成年小鼠使用0.4 g腦質量計算數值 b未處理的基線同齡群(第7組及第8組)在第7天進行屍體剖檢，但為了分析的目的將其稱為第1天。 縮寫：F，雌性；GC，基因體拷貝數； Grn，顆粒蛋白前驅物(基因，小鼠)；ICV，腦室內；ID，識別號；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；M，雄性；N，動物數量；N/A，不適用；ROA，投予途徑。
在基線(第–7天至第0天)，在投劑前從動物採血並儲存用於將來分析。在投劑當天(第1天)，成年 Grn –/– 小鼠(6.5–8.5月齡)接受單次ICV投予PBFT02(4.4 x 10 9GC/動物、1.3 x 10 10GC/動物、4.4 x 10 10GC/動物或1.3 x 10 11GC/動物)或媒劑(ITFFB)。年齡相符的野生型小鼠亦投予媒劑作為對照組。在投予當天(第1天)，亦將未處理的 Grn1 –/–小鼠及野生型小鼠屍體剖檢作為對照組，以評估臨床病理學及組織病理學的基線異常，以及PBFT02對疾病相關之腦異常的進展或解決的影響。
每天監測給予PBFT02或媒劑的小鼠的生存力並每週稱重。在第90天，對所有生存的老鼠進行屍體剖檢。在屍體剖檢時，分別收集血液及組織用於臨床病理學(CBC及血清化學)及組織病理學。收集CSF以測量轉基因產物表現(人類PGRN蛋白)。收集腦組織以評估 Grn –/– 小鼠模式的疾病相關生物標記特徵。此等生物標記包括大腦貯積物質蓄積(脂褐質沉積物)及神經炎症(CD68免疫組織化學來標記小神經膠質細胞)，此等在視丘、皮質及海馬迴中被定量。大腦第三額葉部分(包括額葉皮質)的溶胞產物用於評估溶酶體酵素HEX的活性。
在研究期間，所有組別在PBFT02或媒劑投予後均維持體重(圖14)。
在PBFT02投予後90天，在屍體剖檢小鼠的CSF中測量轉基因產物的表現(人類PGRN蛋白)。相較於經媒劑處理的 Grn –/– 對照組，人類PGRN在CSF的表現在PBFT02的兩種最高劑量(4.4 x 10 10GC及1.3 x 10 11GC)下增加(圖15)。在投予兩種最低劑量(4.4 x 10 9GC或1.3 x 10 10GC)之PBFT02的 Grn –/– 小鼠中，人類PGRN表現似乎與經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠及野生型對照組相似。然而，PGRN ELISA分析的LOD為1.25 ng/mL，因此限制了檢測兩種最低劑量以及經媒劑處理的 Grn –/– 及野生型對照組中PGRN表現上變化的能力。
與經媒劑處理的 Grn –/– 對照組相比，在第90天的CBC或血清化學檢測盤上未觀察到與PBFT02投予的相關異常。在盲測肉眼觀察及顯微鏡觀察評估中，沒有與PBFT02投予相關的組織病理學發現。
在基線及PBFT02投予後90天，在屍體剖檢小鼠的三個腦區域(視丘、皮質及海馬迴)中定量脂褐質沉積物。在基線及第90天，與皮質及海馬迴相比，視丘中的脂褐質沉積物皆更豐富，這暗示視丘可能比其它腦區域對評估脂褐質聚集物提供更高的敏感性。在視丘中，在未處理的 Grn –/– 小鼠中觀察到的基線脂褐質計數比未處理的野生型對照組更高。在第90天，經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠的平均脂褐質計數高於未經處理的 Grn –/– 基線對照組，表明脂褐質沉積物逐漸增加。相較之下，所有經PBFT02處理的組別(4.4 x 10 9GC/動物、1.3 x 10 10GC/動物、4.4 x 10 10GC/動物及1.3 x 10 11GC/動物)均顯示脂褐質計數顯著低於經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠。未觀察到劑量依賴性反應，因為所有PBFT02劑量組別的脂褐質計數相似。由於所有PBFT02處理組別的平均脂褐質計數與未處理的 Grn –/– 基線對照組相似，而在90天的研究期間，所有劑量水準的PBFT02投予似乎都防止脂褐質的逐步蓄積(圖16A–圖16C)。在皮質及海馬迴中，在基線時，未處理的 Grn-/-小鼠中所觀察到的平均脂褐質計數高於未處理的野生型對照組。類似地，在第90天，在經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠亦觀察到比經媒劑處理的野生型小鼠更高的平均脂褐質計數。所有經PBFT02治療的組別(4.4 x 10 9GC/動物、1.3 x 10 10GC/動物、4.4 x 10 10GC/動物及1.3 x 10 11GC/動物)在第90天的平均脂褐質計數均顯示低於經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠，儘管該減少僅在1.3 x 10 10GC/動物的劑量時在皮質具有統計學意義。未觀察到劑量依賴性反應，因為所有四個PBFT02劑量組別的脂褐質計數相似。
在基線及PBFT02投予後90天，在屍體剖檢小鼠的三個腦區域(視丘、皮質及海馬迴)中定量神經炎症標記CD68。藉由定量CD68染色陽性的組織面積來評估CD68表現。在基線時，當與未處理的野生型對照組相比，未處理的 Grn –/– 小鼠在視丘、皮質及海馬迴中觀察到更高的平均CD68表現。類似地，在第90天，與經媒劑處理的野生型對照組相比，在經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠的視丘、皮質及海馬迴中觀察到更高的平均CD68表現。在第90天的視丘中，觀察到一般劑量依賴性反應，及當與經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠相比，三種最高PBFT02劑量組別(1.3 x 10 10GC/動物、4.4 x 10 10GC/動物及1.3 x 10 11GC/動物)顯示出顯著降低的CD68表現(圖17A)。值得注意的是，與經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠相比，投予最高劑量的PBFT02(1.3 x 10 11GC/動物)的小鼠顯示CD68表現降低約4倍。在第90天的皮質中，所有經PBFT02處理之組別的平均CD68表現均降低，儘管該降低與經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠中的CD68表現沒有顯著差異。未觀察到劑量依賴性反應(圖17B)。在第90天的海馬迴中，與經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠相比，所有PBFT02劑量組別(4.4 x 10 9GC/動物、1.3 x 10 10GC/動物、4.4 x 10 10GC/動物及1.3 x 10 11GC/動物)均顯示顯著較低的CD68表現。此外，對於所有劑量的PBFT02，CD68表現與經媒劑處理的野生型對照組相似。此反應並非劑量依賴性的，因為在所有劑量的PBFT02中CD68的表現都相似(圖17C)。
在基線及PBFT02投予後第90天，對主要由皮質組織組成的腦第三額葉部分的溶胞產物進行HEX活性分析。在基線，在未處理的 Grn –/– 小鼠中腦HEX活性高於未處理的野生型對照組。在第90天，與經媒劑處理的 Grn –/– 小鼠相比，投予最高PBFT02劑量(1.3 x 10 11GC/動物)之 Grn –/– 小鼠顯示顯著降低的腦HEX活性。再者，在最高劑量組別(1.3 x 10 11GC/動物)的HEX活性相似於經媒劑處理的野生型對照組，顯示在此劑量下腦HEX水準正常化(圖18)。
累積地， Grn –/– 小鼠的PBFT02處理導致劑量相關的組織學矯正，在最高劑量(1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])觀察到對脂褐質、神經炎症及溶酶體酵素活性的最廣泛的處理相關影響。最低劑量的PBFT02(4.4 x 10 9GC [1.1 x 10 10GC/g腦])顯著地改善在患有 GRN相關神經退化之患者中所發現的關鍵神經病理學特徵，包括預防視丘中的脂褐質蓄積及減少海馬迴中小神經膠質細胞浸潤(即藉由CD68表現所定義的神經炎症)。雖然在此劑量下，組織學矯正僅限於受檢測之腦區域的子集(可能是由於與 Grn –/– 小鼠的皮質及海馬迴相比，視丘中脂褐質沉積物及CD68表現細胞的總體富集程度更高)，且溶酶體酵素活性(藉由HEX活性測量)並未正常化，但MED被確定為4.4 x 10 9GC(1.1 x 10 10GC/g 腦)。
實施例 6 ：野生型小鼠腦室內投予後 PBFT02 的生物分布及轉基因表現此藥理學研究的目的為評估PBFT02(一種表現人類顆粒蛋白前驅物( GRN)基因的重組腺相關病毒(AAV)血清型1載體，該 GRN基因編碼顆粒蛋白前體(PGRN)蛋白)腦室內(ICV)投予後在野生型小鼠中的載體的生物分布及轉基因表現水準。
在投劑當日(第1日)，成年C57BL/6J野生型小鼠(3.5-5.5月齡)接受PBFT02(1.3 x 10 11基因體拷貝數[GC]/動物[3.3 x 10 11GC/g腦])或媒劑(鞘內最終調配緩衝液[ITFFB])的單次ICV投予。
下表列出各組名稱、劑量水準及投予途徑(ROA)。 表.組別名稱、劑量水準及投予途徑
組別號 N及性別 基因型 治療 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦) a 劑量體積 (μL) ROA 投劑日 屍體剖檢日
1 2 M，2 F 野生型 ITFFB N/A N/A 7.0 ICV 1 10±2
2 4 M，4 F 野生型 PBFT02 1.3 x 10 11 3.3 x 10 11 7.0 ICV 1 10±2
3 2 M，2 F 野生型 ITFFB N/A N/A 7.0 ICV 1 30±3
4 4 M，4 F 野生型 PBFT02 1.3 x 10 11 3.3 x 10 11 7.0 ICV 1 30±3
5 2 M，2 F 野生型 ITFFB N/A N/A 7.0 ICV 1 60±3
6 4 M，4 F 野生型 PBFT02 1.3 x 10 11 3.3 x 10 11 7.0 ICV 1 60±3
7 2 M，2 F 野生型 ITFFB N/A N/A 7.0 ICV 1 90±5
8 4 M，4 F 野生型 PBFT02 1.3 x 10 11 3.3 x 10 11 7.0 ICV 1 90±5
a對於成年小鼠使用0.4 g腦質量計算數值 縮寫：F，雌性；GC，基因體拷貝數；ICV，腦室內；ID，識別號；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；M，雄性；N，動物數量；N/A，不適用；ROA，投予途徑。  
選擇1.3 x 10 11GC/動物的PBFT02劑量，因為其為劑量範圍研究中評估的最高劑量，在該劑量範圍研究中確定了最小有效劑量(實施例5)，且接近小鼠中的最大可行劑量，其受限於體積限制及預期的載體效價。此劑量被預期能夠在小鼠的目標系統(CNS)以及血液及周邊組織中綜合評估載體分布及轉基因產物表現。
在投予當日(第1日)，成年野生型小鼠(3.5-5.5月齡)接受PBFT02(1.3 x 10 11GC/動物)或媒劑(ITFFB)的單次ICV投予。每天監測所有小鼠的生存力且每週稱重一次。在第10、30、60及90天的屍體剖檢中收集CSF、血清及完整的組織清單，以評估載體生物分布及轉基因產物表現(人類PGRN蛋白)。
在整個研究過程中並未發現與PBFT02投予相關的臨床異常。在研究期間，所有組別在PBFT02或媒劑投予後均維持體重(圖9)。
到載體投予後第10天，在經PBFT02處理之小鼠的目標組織(腦)及所有周邊組織(心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟及骨骼肌)中可檢測到PBFT02載體基因體。雖然在一些器官的組織內載體基因體水準在第30、60及90天變動，但通常在第10天後觀察到v載體基因體水準的下降趨勢，所有組織最終在第90天表現出低於第10天的載體基因體水準。一個值得注意的例外為腎臟，其在第90天顯示出與第10天相似的載體基因體水準。在整個研究過程中，與所有其它組織相比，腦表現出最高濃度的載體基因體。在肝臟、脾臟、腎臟及心臟中觀察到較低水準的載體基因體。在整個研究過程中，肺臟及骨骼肌表現出最低水準的載體基因體(圖20)。
在整個研究過程中，除了第60天的腦及肺臟(分別為動物8及7[第5組])及第30天的心臟(動物18 [第3組])之外，PBFT02載體基因體在經媒劑處理的小鼠組織中檢測不到。因為在此等組織中觀察到低水準的載體基因體，彼等在經媒劑處理的小鼠中的存在可能是由於樣品處理過程中的污染。
在PBFT02或媒劑投予至野生型小鼠後的第10、30、60及90天，在目標器官系統(CNS)以及在血清及周邊器官中測量轉基因產物表現(人類PGRN蛋白)。在CSF中，在整個研究中所評估的所有經媒劑處理的小鼠(14/14動物)中皆檢測不到人類PGRN表現水準。相較之下，與經媒劑處理的對照組相比，PBFT02的投予導致在第10天及第30天的CSF中人類PGRN表現水準顯著升高。雖然與經媒劑處理的對照組相比，第60天及第90天的表現水準並未顯著升高，但在大多數受評估的經PBFT02處理的小鼠(在第60天的2/5動物及在第90天的7/8動物)的CSF中仍可檢測到人類PGRN表現。
在第10、30及90天，經PBFT02處理的小鼠顯示平均人類PGRN CSF濃度分別為49.93 ng/mL、34.97 ng/mL及31.41 ng/mL。第60天為唯一的離群值，平均人類PGRN濃度較低，為1.46 ng/mL。尚不清楚為什麼第60天的人類PGRN表現水準低於其它時間點的經PBFT02治療的組別的表現水準。在此研究中並未分析對於人類轉基因產物的抗體；然而，在第60天的經PBFT02治療的組別中，動物可能對人類轉基因產物具有抗體反應(圖21)。
在大腦中，在第10、30及90天，與相同時間點的經媒劑處理的對照組相比，經PBFT02處理的小鼠顯示出顯著升高的人類PGRN水準。與在CSF中觀察到的相似，與經媒劑處理的對照組相比，第60天在腦中的人類PGRN表現水準並未顯著升高，這可能是由於第60天的組別中對人類轉基因產物的抗體反應(圖21)。
在第10、30、60或90天，在脊髓中，PBFT02投予並未顯著增加人類PGRN表現高於經媒劑處理的對照組水準(圖21)。
在第10、30、60或90天，在血清中，PBFT02投予並未顯著增加人類PGRN表現高於經媒劑處理的對照組水準(圖22)。
在研究期間，在經PBFT02處理的小鼠的腎臟、骨骼肌或頸部淋巴結中並未觀察到人類PGRN表現的顯著升高。然而，經PBFT02處理的小鼠顯示在心臟、肝臟及脾臟中人類PGRN表現的短暫升高。在心臟及肝臟中，與經媒劑處理的對照組相比，經PBFT02處理的小鼠顯示在第60天的人類PGRN表現水準顯著升高，但在第10、30或90天則不然。在脾臟中，與經媒劑處理的對照組相比，經PBFT02處理的小鼠顯示第10天的人類PGRN水準顯著升高，但在第30、60或90天則不然(圖23A-圖23F)。
雖然PBFT02載體基因體在鞘內投予後廣泛分布於組織中，但在整個研究過程中，對於治療 GRN相關神經退化的目標器官系統(即CNS)顯示出最高的全面載體轉導水準及持續的轉基因產物表現。
實施例 7 ：成年恆河獼猴腦池內投予 PBFT02 的毒物學及生物分布此毒物學研究的目的為評估PBFT02(一種表現人類顆粒蛋白前體(PGRN)蛋白的重組腺相關病毒血清型1(AAV1)載體)在非人類靈長類動物(NHP)的腦大池內(ICM)投予後的安全性、耐受性、生物分布及分泌(泄出)概貌。
成年雄性及雌性恆河獼猴接受媒劑(鞘內最終調配緩衝液[ITFFB])或劑量為3.0 x 10 12基因體拷貝數(GC)(低劑量；3.3 x 10 10GC/g腦)、1.0 x 10 13GC(中劑量；1.1 x 10 11GC/g腦)或3.0 x 10 13GC(高劑量；3.3 x 10 11GC/g腦)的PBFT02的單次ICM投予。
投予日(第0天)與代表盡可能多之研究組別的動物在投予日期之間錯開。研究設計總結於下表中。 表.組別名稱、劑量水準及投予途徑
組別 處理 (劑量) 劑量 (GC) 劑量 (GC/g腦) 動物ID 性別 ROA 投予體積 (mL) 投劑日 屍體剖檢日
1 ITFFB (媒劑) N/A N/A 171123 雌性 ICM 1.5 0 90±5
181323 雄性
2 PBFT02 (低劑量) 3.0 x 10 12 3.3 x 10 10 171229 雌性
171250 雌性
180668 雄性
3 PBFT02 (中劑量) 1.0 x 10 13 1.1 x 10 11 171118 雌性
171306 雄性
171311 雄性
4 PBFT02 (高劑量) 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 171209 雄性
171246 雌性
181330 雄性
縮寫：GC，基因體拷貝數；ICM，腦大池內；ID，識別號；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；N/A，不適用；ROA，投予途徑。  
評估的最高劑量(3.0 x 10 13GC)為基於預期的載體效價及最大投予體積的最大可行劑量。中劑量(1.0 x 10 13GC)及低劑量(3.0 x 10 12GC)分別低於最大可行劑量的3倍及10倍。選擇此範圍以確保劑量為不同的，並包含在小鼠藥理學研究中所評估的劑量範圍。
此研究包括第90天的屍體剖檢時間點。在先前的ICM程序中，已觀察到DRG及TRG神經元毒性具有可再現的動力學。DRG及TRG神經元在載體投予後14-21天內持續退化。在細胞體退化後，周邊神經及脊髓背柱中的此等細胞的軸突的後續退化(軸突病變(axonopathy))出現在載體投予後約30天。在載體投予後90天犧牲的動物中，軸突變化持續可見。在載體投予後180天，組織學病灶的嚴重程度有時與第30天或第90天相似，但通常有所改善，可能是因為退化的神經元及其相關軸突已被巨噬細胞清除，巨噬細胞在較早的犧牲時間點即存在。基於此等動力學，我們預計90天的屍體剖檢時間點將足以評估DRG及TRG組織學上的發現以及任何相關的臨床徵象。
在PBFT02投予前的基線及投予後第14、28及90天進行標準化神經學檢查。動物偶爾不配合檢測，從而妨礙一些評估。然而，在大多數時間點對每隻動物評估檢測的所有必需內容。一隻接受中等劑量之PBFT02的動物(1.0 x 10 13GC；動物171311，第3組，N=1/3)在第90天沒有縮回反射。然而，注意到該動物用雙手及雙腳抓住籠條及網格並正常行走。無反應歸因於焦慮而非深度痛覺的喪失。在整個研究過程中沒有發現其它異常的神經徵象。
在PBFT02投予前的基線及第28天及第90天對所有動物進行感覺神經傳導研究，以測量雙側正中神經感覺動作電位振幅及傳導速度(圖25)。
對於SNAP振幅，動物間及動物內的變異性很明顯，但數值通常保持在基線測量範圍內(圖26A)。一隻經媒劑處理的動物(ITFFB；動物171123，第1組，1/2動物)及一隻投予低劑量PBFT02的動物(3.0 x 10 12GC；動物180668，第2組，1/3動物)在第90天顯示單側正中神經SNAP振幅顯著降低。一隻投予高劑量PBFT02的動物(3.0 x 10 13GC；動物171209，第4組，1/3動物)顯示到第90天左右正中神經的雙側正中神經SNAP振幅顯著降低。這三隻動物的臨床表現均無異常；然而，在投予高劑量PBFT02(3.0 x 10 13GC)後，動物171209的NCS的發現確實與正中神經的組織病理學的發現相關。對於正中神經傳導速度，在整個研究過程中沒有觀察到任何動物的顯著變化(圖26B)。
在整個研究過程中，所有動物均保持正常體重(圖27)。
在血液CBC、凝血研究或血清化學檢測盤中沒有發現與測試物品相關的顯著異常。所有組別中的數隻動物(5/11)在基線及/或第0天顯示出短暫的肌酸磷酸激酶(CPK)升高(＞1000 U/L)。由於所有升高都涉及CPK的骨骼肌同功型，CPK升高可能繼發於鎮靜或靜脈穿刺期間的肌肉創傷，因此被認為與測試物品無關。少數經PBFT02處理的動物(2/9；動物180668，3.0 x 10 12GC，第2組；動物171209，3.0 x 10 13GC，第4組)顯示出血清鹼性磷酸酶(ALP；＞600 U/L)輕度增加，最初出現在基線或第60天。兩隻動物的ALP升高一直持續到第90天的屍體剖檢。ALP具有多種同功型，包括在肝臟、腎臟及骨骼中發現的同功型，由於動物的年齡，此等變化被認為最有可能是天然生理性的。在第90天，在投予低劑量PBFT02的單一動物(3.0 x 10 12GC；動物17229，第2組)中觀察到輕度血小板減少症，但缺乏相關的臨床徵象及低發生率，暗示這種減少可能是人為造成的。
一些CSF樣品含有紅血球，其歸因於CSF收集過程中的血液污染。在5/9(56%)經PBFT02處理的動物及0/2(0%)經媒劑處理的對照組中發生輕度細胞增多症(定義為≥6個白血球[WBC]/µL)。細胞增多症為淋巴細胞性的(主要由淋巴細胞或淋巴細胞與巨噬細胞的混合物所組成)，且被認為與測試物品相關(圖28)。8–18 WBCs/µL之CSF WBC計數峰值發生於第7天的一隻高劑量的動物(3.0 x 10 13GC；動物171209，第4組)、第14天的一隻高劑量的動物(3.0 x 10 13GC；動物181330，第4組)、第28天的一隻中劑量的動物(1.0 x 10 13GC；動物171306，第3組)及第60天的一隻低劑量的動物(3.0 x 10 12GC；動物171229，第2組)。在中劑量組別的一隻動物(1.0 x 10 13GC；動物171118，第3組)中於第28天及第90天顯示出二個18 WBCs/µL之CSF WBC計數峰值，儘管第28天的結果可能是由於樣品中的血液污染所人為造成的。在所有動物中，細胞增多症為自限性的(self-limited)，且與臨床後遺症無關。
在投予PBFT02之前，在3/11動物(27%)的血清中可檢測到預先存在的針對AAV1殼體的NAb。到第90天，經媒劑處理的動物顯示血清Nab效價並沒有變化，而所有投予PBFT02的動物皆顯示出到第90天的血清Nab效價的增加。低劑量(3.0 x 10 12GC)、中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)組別的Nab效價在第90天相當，表示缺乏劑量依賴性反應。此外，在任何評估劑量下，AAV1 NAb 反應規模似乎不受PBFT02投予之前所預先存在的AAV1 NAb的存在的影響。下表總結血清中NAb對AAV1的反應。 表.在ICM投予PBFT02後，血清中針對AAV1殼體的中和抗體的存在
組別 處理 劑量 (GC) 動物ID HEK293細胞中的AAV1 NAb ¹·²
BL 第0天 第90天
1 ITFFB N/A 171123 160 320 * 160
181323 ＜ 5 ＜ 5 ＜ 5
2 PBFT02 3.0 x 10 12 171229 ＜ 5 ＜ 5 5120 *
171250 20 40 2560 *
180668 ＜ 5 ＜ 5 *† 5120 *
3 PBFT02 1.0 x 10 13 171306 ＜ 5 ＜ 5 *† 2560 +
171118 ＜ 5 ＜ 5 *† 10240 +
171311 ＜ 5 ＜ 5 *† 2560 *
4 PBFT02 3.0 x 10 13 171209 ＜ 5 ＜ 5 *† 5120 +
171246 160 80 *† 5120
181330 ＜ 5 ＜ 5 5120 +
顯示在BL以及研究第0天及第90天對每隻動物抑制AAV1.CMV.LacZ轉導(β-gal表現)≥50%的血清稀釋度的倒數。藍色陰影表示陰性NAb反應(＜5；低於分析的LOD)，而橙色表示陽性NAb反應。 *表示對樣品進行兩次測定以確定終點效價，且第二組數據集顯示在表中。 +表示對樣品進行3次測定以確定終點效價，且第三組數據集顯示在表中。 †表示因第一次分析中的高背景而再次測試樣品。由於高背景而重新測試的所有樣品均顯示Nab效價在原始數值的2倍稀釋範圍內。 縮寫：AAV1，腺相關病毒血清型1；BL，基線；GC，基因體拷貝數；HEK293，人類胚腎293；ID，識別號；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；LOD，偵測極限；N/A，不適用；NAb，中和抗體。
如圖29中總結的，在整個研究期間，兩隻經媒劑處理的對照組動物(ITFFB；2/2動物)對殼體(AAV1)及轉基因產物(人類PGRN)的IFN-γ T細胞反應保持陰性。相較之下，PBFT02投予在8/9(89%)的NHP中引發對AAV1殼體及/或人類PGRN的IFN-γ T細胞反應。單一無反應者為投予中劑量的動物(3.0 x 10 12GC；動物171311，第3組)。
在表現出IFN-γ T細胞反應的動物中，6/8(75%)表現出對AAV1殼體的陽性反應，且6/8(75%)具有針對人類PGRN的反應。在此等動物中，2/8(25%)的NHP僅對AAV1殼體顯示出T細胞反應，而2/8(25%)的NHP僅對人類PGRN顯示出T細胞反應。對 AAV1殼體的IFN-γ 反應很低，範圍為每百萬個細胞58-188個點形成單位(SFU)。在對AAV1殼體表現出反應的六隻動物中，3/6(50%)在研究期間的單個時間點顯示低的短暫IFN-γ反應，包括低劑量組別中的一隻動物(3.0 x 10 12GC；動物171250，第2組)、中劑量組別中的一隻動物(1.0 x 10 13GC；動物171118，第3組)及高劑量組別中的一隻動物(3.0 x 10 13GC；動物171209，第4組)。其餘3/6動物(50%)證實更持久的反應，其從PBMC開始，並在第90天屍體剖檢時通過至少一個組織淋巴細胞群進行。在肝臟中，只有2/6(33%)的NHP具有可檢測的對AAV1殼體之IFN-γ反應。
對於對人類PGRN顯示出IFN-γ反應的6/8動物，除了高劑量組中的單隻動物(3.0 x 10 13GC；動物171209，第4組)在第90天肝臟中的反應觀察到中度至高度陽性反應(每百萬個細胞280至520 SFU)外，其餘所有觀察到的反應均較低(範圍為每百萬個細胞60-200 SFU)。對於人類PGRN的IFN-γ反應，在屍體剖檢時單離的肝淋巴細胞中(6/6動物[100%])比在PBMC(4/6動物[67%])或脾細胞(2/6動物[33%])中更為普遍。
T細胞對殼體及轉基因產物的反應與異常臨床觀察或血液學、凝血及血清化學參數的變化無關。
沒有觀察到與測試物品相關的大體的發現。所有大體的發現都被認為是偶發的。主要在DRG、三叉神經節TRG、脊髓背側白質束及周邊神經中觀察到與測試物品相關的發現。此等發現由在背根神經節(DRG)及三叉神經節(TRG)內具有單核細胞浸潤的神經元退化所組成，並伴隨在脊髓背側白質束及周邊神經內具有或不具有纖維化的軸突退化(即，軸突病變)。總體而言，在所有經PBFT02處理的組別中都觀察到此等發現。中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)組的動物的此等發現的嚴重程度往往更高。無論劑量如何，脊髓及周邊神經中DRG/TRG退化及軸突病變的發生率都相似，而在中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)中觀察到更高的纖維化發生率。其它與測試物相關的發現包括在注射部位之骨骼肌及脂肪組織的慢性炎症。
DRG/TRG 神經元退化在所有經PBFT02處理的組別中都在DRG中觀察到具有單核細胞浸潤之神經元細胞體退化，且認為與測試物相關，DRG延伸軸突集中至脊髓的背側白質束中，並在外圍延伸到周邊神經。在TRG中觀察到類似的發現。DRG/TRG神經元退化的嚴重程度在低劑量時最低(最小；[3.0 x 10 12GC；第2組，2/3動物，6/12神經節])，隨後為高劑量組(最小至輕度；[3.0 x 10 13GC；第4組，3/3動物，6/12神經節])。雖然中劑量組的嚴重程度總體最高(最小到輕度；[1.0 x 10 13GC；第3組，3/3動物，7/12神經節])，但在中劑量組與高劑量組之間未觀察到明顯的劑量反應。所有經PBFT02處理的組別(第2-4組)的發生率相似。一隻經媒劑處理的對照組(動物171123 [ITFFB；第1組，1/2動物])發生最小的神經元細胞體退化，但無法確立這一發現與程序及背景之間的關係。此外，在中劑量組的一隻動物(動物171306 [1.0 x 10 13GC；第3組，1/3動物])及高劑量組的一隻動物(動物171209 [3.0 x 10 13GC；第4組，1/3動物])的腦神經 IX、X、及/或XI中觀察到最小的軸突病變。
脊髓之軸突病變DRG退化導致脊髓背側白質束的軸突病變。雖然所有經PBFT02處理的組別的軸突病變發生率相似，但觀察到嚴重程度呈劑量依賴性增加。嚴重程度從低劑量組(3.0 x 10 12GC；第2組，3/3動物)中的最低增加至中劑量(1.0 x 10 13GC [第3組，3/3動物])及高劑量組(3.0 x 10 13GC [第4組，3/3動物])中的最低至顯著。值得注意的是，中劑量組中的一隻動物(動物171306 [1.0 x 10 13GC；第3組，1/3動物])及高劑量組中的一隻動物(動物171209 [3.0 x 10 13GC；第4組，1/3動物])表現出比投予相同劑量的其它動物更高的總體嚴重程度。
周邊神經之軸突病變DRG退化導致周邊神經的軸突病變。周邊神經軸突病變顯示出劑量依賴性反應。低劑量組的嚴重程度最低(最小至輕度；[3.0 x 10 12GC；第2組，23/30神經])，且從中劑量組(最小至中等；[1.0 x 10 13GC；第3組，26/30神經])到高劑量組(最小至中等；[3.0 x 10 13GC；第4組，23/30神經])地增加。然而，所有經PBFT02處理的組別之間的發生率相對相似。在對照組動物(動物171123 [ITFFB；第1組，1/30神經])中很少觀察到最小的軸突病變，而被認為是偶發的。
神經內膜纖維化在周邊神經中觀察到劑量依賴性神經內膜纖維化(亦稱為軸突周圍纖維化或神經周圍纖維化)，並被認為是繼發於軸突損傷。在低劑量組(3.0 x 10 12GC；第2組)的周邊神經中未觀察到纖維化，而觀察到從中劑量組(1.0 x 10 13GC；第3組，2/3動物，4/30神經)至高劑量組(3.0 x 10 13GC；第4組，2/3動物，6/30神經)中的發生率及嚴重程度兩者由最小至中度漸增的纖維化。在中劑量組的一隻動物(動物171306 [1.0 x 10 13GC；第3組，1/3動物])及高劑量組的一隻動物(動物171209 [3.0 x 10 13GC；第4組，1/3動物])中觀察到周邊神經中纖維化的最高發生率及嚴重程度，其與脊髓中軸突病變的發現的嚴重程度相關。在中劑量組中一隻動物(動物171306 [1.0 x 10 13GC；第3組，1/3動物，1/12神經節])的腰部DRG神經根內亦觀察到輕度神經內膜纖維化，並被認為是繼發於軸突損傷。
注射部位的發現在所有組別中觀察到局部注射部位的發現，包括對照組動物。在ICM注射/CSF收集部位及周圍區域，經媒劑處理的對照組動物在骨骼肌筋膜內顯示出最小的局部急性炎症或骨骼肌內的單核細胞浸潤(ITFFB，第1組，2/2動物)。經PBFT02處理的動物顯示出此等發現的加重的嚴重程度，包括骨骼肌及脂肪組織內輕度至中度的慢性炎症(9/9動物)以及相關的肌纖維變化(8/9動物)。在經PBFT02處理的動物中注射部位的發現的嚴重程度並非劑量依賴性的。此等注射部位的發現部分地被認為與ICM注射及/或重複的CSF收集在程序上有關。然而，出自於局部對測試物品的反應而可能會加劇。
在ICM投予後，可在CSF及周邊血液中檢測到PBFT02載體DNA。CSF中PBFT02的濃度在評估的第一個時間點(第7天)後迅速下降，並且到第60天時，除了在低劑量組中的一隻動物(3.0 x 10 12GC；動物171229，第2組)及高劑量組中的一隻動物(3.0 x 10 13GC；動物 181330，第4 組)外，在大多數動物中檢測不到。對於動物171229及動物181330，CSF中的PBFT02載體DNA濃度在第60天的最後一個採樣時間點呈下降趨勢。在血液中的PBFT02載體DNA濃度下降較慢，其可能歸因於周邊血液細胞的轉導。在CSF或周邊血液中，峰值載體濃度並不出現劑量依賴性(圖30)。
在第0天，在中劑量組的兩隻動物(動物171306及171311 [1.0 x 10 13GC；第3組])的CSF中檢測到PBFT02載體DNA，但未在血液中檢測到。對於第0天PBFT02呈陽性的CSF樣品進行重新測試以確認結果。在第0天於CSF中檢測到低水準的PBFT02載體DNA可能由於在ICM投予過程中CSF樣品受到污染所致。
在載體投予後的第5天，在8/9動物的尿液及所有能夠分析之動物(5/5動物)的糞便中可檢測到PBFT02載體DNA。到PBFT02投予後第28天，在所有動物(9/9動物)的尿液中檢測不到PBFT02載體DNA。PBFT02載體DNA在所有能夠在第28天進行分析之動物(3/3動物)的糞便中檢測不到，並在第60天(9/9動物)的所有糞便樣品中確認檢測不到。尿液及糞便載體濃度峰值並未出現劑量依賴性。
在經媒劑處理的對照組動物的CSF中檢測不到轉基因產物表現(人類PGRN蛋白)。在ICM投予PBFT02後，到第7天時在所有動物的CSF及血清中可檢測到人類PGRN，除了一隻低劑量動物(3.0 x 10 12GC；動物171250，第2組)及一隻高劑量動物(3.0 x 10 13GC；動物171246，第4組)直到第14天才在CSF中表現可檢測到的人類PGRN。這兩隻動物都具有針對AAV1殼體的基線NAb。CSF及血清的表現皆為劑量依賴性的(圖32)。
在CSF中，第14天在1/3中劑量動物(1.0 x 10 13GC；第3組)及2/3高劑量動物(3.0 x 10 13GC；第4組)中觀察到最大人類PGRN表現。低劑量組(3.0 x 10 12GC；第2組，N=3/3)中的所有動物在第28天達到最大表現，中劑量組(1.0 x 10 13GC；第3組)中的2/3動物及高劑量組(3.0 x 10 13GC；第4 組)中的1/3動物亦為如此。在最大表現時，中劑量組(11.58 ng/mL)及高劑量組(11.77 ng/mL)中觀察到的人類PGRN平均濃度比低劑量組(5.27 ng/mL)高約2倍(圖32)。
在血清中，大多數動物在第14天觀察到最大的人類PGRN表現，除了低劑量組中的一隻動物(3.0 x 10 12GC；動物171229，第2組)及中劑量組中的一隻動物(1.0 x 10 13GC；動物171118，第3組)，其二隻動物均在第28天顯示最大表現。觀察到低劑量組(3.0 x 10 12GC，第2組)、中劑量組(1.0 x 10 13GC，第3組)及高劑量組(3.0 x 10 13GC，第4組)的平均最大表現水準分別為109.03 ng/mL、240.12 ng/mL及430.52 ng/mL(圖33)。
到第60天，CSF及血清中的人類PGRN表現在所有經PBFT02處理的動物中從最高水準下降(圖34)。此下降持續到第90天，並與所有經PBFT02處理的動物的CSF及血清兩者中所出現的抗人類PGRN抗體相關(圖34)。
在第90天，在腦、脊髓、DRG、肝臟及脾臟中檢測到高水準的載體基因體(圖35)。在CNS組織中檢測到的載體基因體的數量通常被觀察到為劑量依賴性的。與所有其它經PBFT02處理的NHP相比，一隻低劑量動物(3.0 x 10 12GC；動物171250，第2組)及一隻高劑量動物(3.0 x 10 13GC；動物171246，第4組)中所存在的針對AAV1殼體的基線NAb與肝臟實質減少的載體分布相關。
PBFT02投予導致DRG及TRG感覺神經元(8/9動物)以及其相關的中樞及周邊軸突(9/9動物)之無症狀的退化。此等病灶的嚴重程度從最小到輕微。此等發現顯示中劑量組及高劑量組中有更嚴重病灶的趨勢。在顯示出最嚴重的脊髓軸突損失及周邊神經纖維化的兩隻動物中，一隻高劑量組中的動物(動物171209；3.0 x 10 13GC [3.3 x 10 11GC/g腦])顯示出第90天在雙側正中神經感覺動作電位振幅的顯著減少。由於所有劑量組別中都存在無症狀的感覺神經元病灶，而未定義未觀察到的不良反應水準(no-observed-adverse-effect level；NOAEL)。評估的最高劑量(3.0 x 10 13GC)被認為是最大耐受劑量(MTD)。
實施例 8 ： 人體試驗於患有由GRN基因突變引起的成年發病神經退化性疾病(包括額顳葉失智症)患者進行單次投予PBFT02)之首次用於人體(FIH)第1b期劑量遞增研究(匯總於下表)。PBFT02旨在取代GRN基因。目前沒有針對由GRN單套缺失引起的成年發病神經退化的疾病改善療法。疾病管理包括目的在於減少與疾病相關的行為、認知及/或運動症狀之支持性照護及藥品仿單標示外治療。因此，此疾病譜代表一個高度未被滿足的醫療需求領域。此FIH研究評估了安全性及耐受性，並收集有關療效的初步數據。
  方案名稱： 第1b期開放性、多中心劑量遞增研究以評估將單次劑量PBFT02遞送至具有額顳葉失智症(FTD)及顆粒蛋白前體基因( GRN)突變之成年受試者的腦大池(ICM)中的安全性、耐受性及藥效學作用
  方法 前瞻性、多世代、開放性、劑量遞增研究。
  研究期間 此為為期24個月的研究。招募以滾動審查(rolling basis)進行。24個月的研究之後為36個月的延伸期。每位受試者總計被招募5年。
  研究族群 受試者年齡為 ＞35至 ＜75歲，具有FTD(界定為臨床失智症評定量表[Clinical Dementia Rating Scale；CDR®]加上國家阿茲海默氏症協調中心額顳葉退化[National Alzheimer’s Coordinating Center Frontotemporal Lobar Degeneration；NACC FTLD]總分=0.5或1.0)及GRN突變的遺傳證據(FTD-GRN)
  受試者數量： 最多至15個可評估之受試者
  目標： 主要： 投予單一ICM劑量後，評估PBFT02之全面安全性及耐受性。 次要： 評估單次ICM劑量投予後，以PBFT02治療對CSF及血漿PGRN水準的藥效學(PD)作用。 評估以PBFT02治療對FTLD進展的作用，如以神經影像學、神經退化的體液及眼部生物標記所評估。 評估以PBFT02治療對FTD臨床進展(認知功能、行為、語言、運動徵象及症狀以及生活機能性活動品質)的作用。 評估單次ICM劑量投予後，轉基因表現(血漿及CSF PGRN)的持久性。 評估PBFT02對生存的影響。
研究設計概述 此為第1b期，首次用於人體(FIH)，前瞻性、多世代、開放性、單臂、多中心、劑量遞增研究。計劃招募9名年齡≥35且≤75歲並患有早期症狀性FTD-GRN的受試者參與該研究。符合條件的受試者藉由ICM投予接受單次劑量的PBFT02。從PBFT02投予前1天開始，投予全身性皮質類固醇14天，然後將皮質類固醇劑量逐漸減少。對於每位受試者的總研究時間計劃為總共5年；該設計包括篩選期、基線確定及載體投予(即治療)期以及追蹤期。5年的追蹤期從投劑當天開始。研究分兩部分進行：一項為期24個月的主要研究及一項為期36個月的延伸。安全性及耐受性的主要終點在投劑後12個月，次要終點在投予後12、18及24個月之多個時間點進行評估並分析。在36個月的延伸中，評估安全性及所有次要目標，以衡量對生物標記及疾病進展的作用的持久性。 計劃最多3個劑量遞增同齡群，各有3名受試者。同齡群中的個體受試者的招募在受試者之間至少間隔60天，以允許評估30天的生物標記及神經傳導研究(NCS)數據以及60天的安全性數據。此60天的間隔用於同齡群中的所有受試者(即最多5個受試者)。60天的交錯間隔足以確保有足夠的時間監測急性及預測亞急性的神經毒性，並允許在下一個受試者投劑前對包括安全性、NCS、生物標記及臨床/神經學觀察在內的匯總數據進行綜合分析。在考慮劑量遞增之前，招募3名受試者至給定劑量的同齡群。安全性由試驗委託者(Sponsor)及獨立數據監測委員會(Independent Data Monitoring Committee；IDMC)監測，且進行中的受試者的安全性管理係基於不良事件(AE)及方案中預期定義的停止規則。在第一同齡群中所有受試者的90天安全性及生物標記數據經審核並經IDMC確定合格後，研究可繼續進行，招募受試者至下一個同齡群。
受試者數量 在美國及美國以外的多個臨床中心，多達15名具有FTD及 GRN單套缺失的成年患者。
主要的納入及排除基準 納入基準 1.在招募時男性或女性≥35歲且≤75歲 2.由臨床實驗室改善修正案[Clinical Laboratory Improvement Amendments；CLIA]批准的實驗室、或美國以外國家的當地監管機構所接受的CLIA等效實驗室(在歐盟，基因分型測試必須符合歐洲標準[Conformité Europëenne；CE]標記)記錄為GRN突變攜帶者(在篩選期間被評估或者基於記錄的病史)，作為FTD的原因，符合以下基準之一： a.由阿茲海默氏症及額顳葉失智症突變資料庫(AD&FTDMDB)歸類為致病性的突變(Moore et al 2020) b.不應有可解釋疾病的存在的GRN以外的突變(例如，C9ORF擴增＞30次重複)之歷史基因檢測證據(如果有) c.若篩選時的血漿PGRN水準＞61.55 ng/mL(Galimberti D et al., Neurobiol Aging. 2018:62:245.e9-245.e12)，可在允許招募之前考慮重新檢查基因的確認及可能進一步評估受試者的GRN突變狀態。 3.根據當前國際共識診斷基準的臨床診斷(詳見第6.3節的基準)： a.根據Rascovsky(2011)基準的可能的行為變異型FTD(bvFTD)，或 b.根據Gorno-Tempini(2011)基準的原發性進行性失語症(PPA)變異型(非流暢變異型[nfvPPA]、語義變異型[svPPA]或語彙減少變異型[lvPPA]) 符合基準a或b的受試者可伴隨表現進行性核上神經麻痺(PSP)症候群、皮質基底症候群(CBS)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)，但受試者在篩選時僅具有運動症狀(不符合基準a或b)不具招募資格。 4.血漿NfL水準＞50 pg/mL 5.具有一位可靠的情報提供者/照護者(及後備情報提供者/照護者)，至少每週親自與該受試者交談或看到該受試者 6.CDR plus NACC FTLD總分為0.5或1.0 7.應該住在社區(即，不住在療養院)；根據研究者的裁量，可允許某些程度的輔助生活    排除基準 1.阿茲海默氏症(AD)的生物標記證據。若受試者在過去12個月內未接受過阿茲海默氏症生物標記測試，則對他/她進行第181個胺基酸經磷酸化的血漿tau蛋白(ptau181)水準的篩選；如果血漿ptau181符合AD病理(＞15 pg/mL)，則排除該受試者 2.在AD&FTDMDB中將GRN突變分類為「非致病性」、「可能是良性變異」、「良性變異」或「致病性質不明」 3.以前接受過任何基因療法的治療。在進入此研究之前，任何其它可能改變PGRN水準的療法必須經過至少5個半衰期 4.同基因型組合GRN突變攜帶者 5.Rosen改良型Hachinski缺血量表得分＞7 6.已知存在可合理解釋有症狀受試者的症狀的結構性腦病灶(例如，腫瘤、皮質梗塞) 7.根據基因檢測歷史(如果進行)，在PSEN1、PSEN2或APP中已知存在導致AD的突變 8.柯沙可夫氏腦病變、嚴重酒精或物質依賴(失智症發病5年內)的先前病史，但在FTD疾病發作時飲酒量增加的情況除外 9.未經治療的B12缺乏症病史為排除性的，除非後續實驗室測試(升半胱胺酸及甲基丙二酸)表明該值不具有生理意義。以B12補充治療的受試者可在研究者審查他們的診斷及治療歷史記錄後被招募，以確保疾病/治療的穩定性及順應性 10.未經調節的甲狀腺功能低下症之透過病史或實驗室檢測的證據(促甲狀腺激素[TSH] ＞正常值的150%) 11.血清肌酸酐 ＞ 2 mg/dL 12.肝臟酵素升高(丙胺酸轉胺酶[ALT]或天冬胺酸轉胺酶[AST] ＞2×正常上限[ULN]或者總膽紅素＞ULN) 13.需要補充氧氣的呼吸衰竭 14.無法提供完全同意或缺乏可提供同意的具有充分聯繫的合法授權的照護者 15.任何對MRI或腰椎穿刺(LP)的禁忌症(例如，局部感染、血小板減少症病史、凝血病) 16.對ICM投予程序的任何禁忌症，包括對成像、鞘內造影劑及麻醉的禁忌症，或者任何會增加ICM程序不良結果風險的病況，包括但不限於存在導致腫塊效應或顱內壓升高徵象的佔位性病灶(space occupying lesion)、非交通性水腦症、後顱窩(posterior fossa)或枕骨大孔的佔位性病灶、血管解剖學異常(例如大範圍中線小腦後下動脈(large midline posterior inferior cerebellar artery))、靜脈異常(如大範圍中線小腦靜脈或枕竇)、先天性解剖學異常(如希阿里畸形(Chiari malformation)) 17.會增加腦大池內注射、麻醉、LP及/或MRI併發症的風險之醫療條件或實驗室或生命徵象異常(溫度＞38°C、室內空氣或基線氧氣需求的氧飽和度低於95%、受試者年齡的心率或呼吸頻率異常、年齡的血壓異常、感染證據) 18.免疫功能不全的患者 19.周邊軸索感覺神經病變 20.在投劑14天內接受疫苗 21.人類免疫缺陷病毒(HIV)或者B型或C型肝炎的陽性檢測結果；在篩選1年內或在篩選時確定結核分枝桿菌檢測呈陽性 22.惡性腫瘤(局部皮膚癌除外)或遺傳性癌症症候群的紀錄病史。可納入先前經成功治療惡性腫瘤並有足夠追踪以排除復發的受試者(基於腫瘤科醫師的意見)。受試者的年齡及性別適當的癌症篩檢必須為最新的 23.研究者認為可能導致與GRN突變無關的認知障礙的任何並行疾病，包括失智症的其它原因、神經梅毒、水腦症、中風、小血管缺血性疾病、不受控制的甲狀腺功能低下症、或維生素缺乏症 24.過去6個月內當前或近期有臨床意義的自殺意念病史，對應於哥倫比亞自殺嚴重程度評定量表(C-SSRS)意念的4分(有一定行動意圖但沒有具體計劃的主動自殺意念)或5分(具有特定計劃及意圖的主動自殺意念)，或者過去一年內有自殺行為史，在篩選時藉由C-SSRS驗證。在過去10年內有任何類型的先前自殺企圖或先前有嚴重自殺意念/計劃的受試者，應仔細篩選當前的自殺意念，並且僅在研究者記錄評估後才包括在內。 25.對於有生育能力的女性，在篩檢訪視時呈陽性的血清妊娠試驗、在投予研究產物的第1天前的陽性的血清結果、或不願意在研究期間進行其它妊娠試驗。有生育能力的女性必須使用高效的避孕方法或在投劑後90天內禁慾 26.哺乳期婦女 27.對於有生育能力的男性，從篩檢日起至投劑後90天，不願意使用醫學上認可的雙重屏障避孕方法(例如與避孕藥一起使用的避孕套/隔膜)或禁慾 28.研究者認為會給受試者帶來不適當的風險的任何病況(例如，任何疾病病史、任何當前疾病的證據、身體檢查的任何發現或任何實驗室異常)，或者研究者認為會干擾對研究產品的評估、或對受試者安全性或研究結果的解釋的任何病況 29.在招募30天內需要住院的任何急性疾病 30.不符合方案規定的凝血試驗基準的受試者 31.在篩選前2週內使用抗凝血劑或在研究期間預期使用抗凝血劑為排除性的。抗血小板治療可為可接受的 32.對皮質類固醇的使用過敏或禁忌症 33.已知或懷疑對PBFT02、其任何成分或密切相關的化合物不耐或過敏
結果評量 主要結果評量： •安全性/耐受性 次要結果評量： •藥效學：CSF及血漿PGRN水準 •疾病進展 •疾病病理生理學的生物標記： −NfL、血漿及CSF– 神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)、血漿 •腦體積、皮質厚度及白質完整性之MRI測量 •光同調斷層掃描(OCT，評估視網膜厚度及視網膜脂褐質沉積物) •臨床進展 •CDR plus NACC FTLD的加總計分(SB) •神經認知評估：多語言命名測試(Multilingual Naming Test；MINT)、數字廣度測試(Number Span Test)、語義流暢性(Semantic Fluency)、語文流暢性(Verbal Fluency)、路徑描繪測試(Trail Making Test) A及B、加州語文學習測試(California Verbal Learning Test；CVLT)、班森複雜圖形複製(Benson Complex Figure Copy) (即時及延遲回憶)及蒙特利爾認知評估(Montreal Cognitive Assessment；MoCA) •其它評估：額顳葉失智症評定量表(FRS)、劍橋行為量表修訂版(CBI-R)、臨床總體印象的嚴重程度及變化(CGI-S、CGI-C)、機能性活動問卷(FAQ)以及施瓦布及英格蘭日常生活活動量表(Schwab and England Activities of Daily Living scale；SEADL) •生存
投予途徑 PBFT02作為單次劑量在第1天經由電腦斷層掃描(CT)導引的枕骨下注射投予至受試者腦大池中(腦大池內)。在第1天，使用藥房手冊中提供的劑量計算之研究藥物的適當濃度係由現場研究藥房準備。根據為研究所建立的注射程序，將產品遞送至腦大池中。
安全性評估 安全性評估，包括不良事件(AE)及嚴重不良事件(SAE)的收集、身體及神經檢查、生命徵象、臨床實驗室檢查(血清化學、血液學、凝血、肝臟酵素及膽紅素、尿液分析)、心電圖(ECG)、神經傳導研究(NCS)、總神經病變評分-護理(Total Neuropathy Score-Nurse；TNSn)、哥倫比亞自殺嚴重程度評定量表(C-SSRS)、載體殼體蛋白質及轉基因產物免疫原性、載體泄出、CSF細胞學及化學(細胞計數、蛋白質、葡萄糖)在研究時間表中指定的時間進行。潛在治療相關性惡性腫瘤的監測：受試者的驗血通過全血細胞計數(CBC)檢測盤進行監測，並在5年的追蹤期間，受試者每年經由腦及脊髓之利用釓造影劑的MRI進行監測。
排除基準： 參見上述
目標族群：具有 FTD 及 GRN 單套缺失的輕度症狀的受試者研究族群由患有具有致病性異基因型組合 GRN突變的早期FTD(CDR plus NACC FTLD總分=0.5-1.0)的受試者所組成。在此等患者中，病程通常範圍為4.9-10.0年。因此，此族群提供有利的風險/益處概貌，因為他們在接受治療時已經具有疾病的早期臨床表現，並且預期在試驗過程中會經歷其初期臨床症候群的進展以及其它FTD表現的發作；但因為他們還沒有發生晚期及廣泛的神經退化，他們將從顯著減緩或阻止FTLD病理生理學進展的干預中受益。
FTD症狀發作的平均年齡範圍為54.8-69.5歲。75歲的最大年齡確保包括具有合理生存可能性的患者，此允許分析擬議的終點並減少包括可能具有促成認知障礙的未發現合併症之高齡患者的可能性。
具有同基因型組合GRN突變的受試者已被描述為具有更嚴重及更早發病的巴登氏病，一種影響青少年及年輕人的溶酶體貯積病，因此被排除在本試驗之外。
GRN單套缺失導致成年發病的神經退化。因此，我們認為，具有經確認的GRN單套缺失的35-75歲患者代表被預期從此研究性治療中獲益最多的族群，同時將潛在風險降至最低。
增加 CNS 顆粒蛋白前體水準以減緩 FTLD 神經退化的疾病機制及基本原理 GRN編碼PGRN 蛋白產物(以下稱為PGRN)，其為分泌性糖蛋白。 GRN在整個身體的多種組織中表現，包括神經系統。雖然PGRN的精確分子功能尚不清楚，但新出現的證據暗示，其促使成年發病神經退化的致病作用與溶酶體中的關鍵作用有關。
最近發現PGRN促進溶酶體酸化並作為溶酶體蛋白酶的伴護蛋白，包括細胞自溶酵素D(CTSD)。與此等活動一致，具有 GRN單套缺失的患者表現出稱為脂褐質之自體螢光物質的溶酶體蓄積。相似地，至少有12種不同的遺傳性疾病會導致神經元溶酶體中脂褐質的異常蓄積。所有此等疾病都是由必需溶酶體蛋白缺乏所引起的，並且都會導致神經退化。在具有同基因型組合功能喪失型 GRN突變的患者中同樣觀察到組織學上相同的溶酶體貯積病灶，該患者在生命中更早出現進行性神經退化性疾病，神經性類蠟脂褐質病(NCL)(亦稱為巴登氏病)。再者，編碼溶酶體蛋白酶CTSD之基因中的同基因型組合突變導致巴登氏病表型，類似於由PGRN缺陷所引起的表型。累積起來，此等觀察結果暗示，增加中樞PGRN可矯正FTLD中的溶酶體病理學並減緩神經退化。
以 PBFT02 基因治療的基本原理由GRN單套缺失所引起的成年發病神經退化為一個有吸引力的基因治療候選者，因為其為一種由分泌性蛋白缺乏引起的單基因疾病。雖然新合成的PGRN可直接從反式高基氏體網絡運送到溶酶體，但其也可被分泌並經由分揀蛋白或甘露糖-6-磷酸受體被其它細胞吸收，然後被運送到溶酶體。在選擇性刪除神經元中的 Grn後，在轉基因小鼠中證實了PGRN分泌的一個重要後果。與在所有細胞類型中完全缺乏PGRN蛋白的 Grn-/-動物相比，僅在神經元中摘除PGRN表現不會導致神經元脂褐質蓄積，這表明其它中樞神經系統(CNS)細胞對缺乏PGRN的神經元提供該蛋白質。因此，在CNS的細胞子集中過度表現PGRN可提供一個分泌的蛋白的儲存庫，其可被周圍的細胞吸收，從而產生交叉矯正的潛力。在研究動物中，AAV載體的IT遞送已顯示在整個CNS中轉導細胞，使該途徑成為治療由GRN單套缺失所引起之FTLD的一種有吸引力的方法。此外，我們在 Grn-/-剔除小鼠及NHP中的非臨床研究證實，除了解決與 Grn-/-剔除小鼠中PGRN缺陷相關的溶酶體貯積病灶外，IT AAV遞送還導致在CSF及CNS中健全的PGRN表現。
研究 基本原理FTLD係由五種已知疾病基因之一的突變所引起，包括顆粒蛋白前體( GRN)基因。 GRN編碼顆粒蛋白前體(PGRN)蛋白質產物，其為分泌性糖蛋白。 GRN在整個身體的多種組織中表現，包括神經系統。雖然PGRN的精確分子功能尚不清楚，但新出現的證據暗示其促使FTLD的致病作用與溶酶體中的關鍵作用有關。
GRN中的所有病理性突變都被證實或預測會造成功能喪失並導致降低顆粒蛋白前體(PGN)mRNA水準(~50%)及蛋白質水準(~33%)。在具有 GRN單套缺失的突變攜帶者中，症狀發作的平均年齡為59 ± 7歲，到70歲時疾病外顯率超過90%。患者普遍顯示出進行性病程。症狀發作後平均存活8年，導致平均預期壽命為68 ± 8歲。
由GRN單套缺失引起的FTLD為基因治療的一個有吸引力的候選者，因為其為一種由分泌性蛋白缺乏引起的單基因疾病。雖然新合成的PGRN可直接從反式高基氏體網絡運送到溶酶體，但其也可被分泌並經由分揀蛋白或甘露糖-6-磷酸受體被其它細胞吸收，然後被運送到溶酶體。在研究動物中，AAV載體的鞘內(IT)遞送已顯示在整個CNS中轉導細胞，使此途徑成為治療FTLD-GRN單套缺失的一種有吸引力的方法。此外，我們在 Grn-/-剔除小鼠及NHP中的非臨床研究證實，IT AAV遞送導致在CSF及CNS中健全的PGRN表現並解決與 Grn-/-剔除小鼠中PGRN缺陷相關的溶酶體貯積病灶。
研究目標 主要目標評估PBFT02的總體安全性及耐受性，以及PBFT02在投予單次ICM 劑量後對CSF及血漿顆粒蛋白前體水準的藥效學作用。 次要目標•     評估PBFT02在單次ICM 劑量後對CSF及血漿顆粒蛋白前體水準的藥效學作用的持久性。 •     評估以PBFT02治療對FTLD進展的作用，如以神經影像學、神經退化的體液及眼部生物標記評估。 •     評估以PBFT02治療對FTD臨床進展(認知功能、行為、語言以及運動徵象及症狀)的作用。 •     評估PBFT02對生存的影響。 研究設計及基本原理 研究設計概述
這為一項1/2期、FIH、開放性、單臂、多中心劑量遞增研究，在具有早期FTD及GRN單套缺失的35-75歲受試者中5年內評估作為單次ICM輸注投予的PBFT02之安全性、耐受性及藥效學。安全性、耐受性、藥效學及臨床療效在2年內進行評估，並且所有受試者在PBFT02投予後5年內進行追蹤，用於安全性、耐受性、藥效學及臨床結果的長期評估。
該研究包含篩選期，以確定從大約第-35天到第-7天的每名潛在受試者的資格。確認合格後，受試者接受基線評估，包括腦及脊髓磁共振成像(MRI)、腰椎穿刺收集CFS、抽血、收集尿液、生命徵象、ECG、身體檢查、神經檢查、總神經病變評分-護理(TNSn)、神經傳導研究及臨床評估。在投予PBFT02之前，基線評估發生在第-14天及第0天(含)之間。在治療期的期間，受試者在第1天早上入院。受試者在第1天接受單次ICM劑量的PBFT02，並在投劑後留院觀察至少24小時。隨後的研究訪問發生在投劑後的第7天、第14天、第30天以及3個月及6個月，隨後在投劑後的首2年內每6個月進行一次。長期追蹤訪問以每12個月一次的頻率再進行3年，直至投劑後5年。
該研究由最多3個同齡群，每同齡群3名受試者所組成，每名受試者均以單次ICM注射投予PBFT02。在第一同齡群中，每位受試者被依次招募並給予最低計劃劑量，每名受試者之間有4週的安全觀察期。若沒有觀察到預先定義的安全審查觸發(參見第6.1.1節)，在第一同齡群中的第三名受試者投予PBFT02後4週，由獨立數據監測委員會(IDMC)審查第一同齡群的所有可用數據。
若決定進行更高劑量，依次招募隨後的3名受試者並接受更高劑量，每名受試者之間有4週的安全觀察期。若沒有觀察到預先定義的安全審查觸發，由獨立數據監測委員會(IDMC)審查第二同齡群的所有可用數據。
若尚未達到最大可行劑量，可隨之招募選擇性的第三同齡群並投劑比第二同齡群更高的劑量，每名受試者之間有4週的安全觀察期。
情報提供者(例如親戚、伴侶或朋友)亦為本研究的必需的參與者(參見納入基準)。情報提供者提供臨床量表上的受試者資料，並可幫助AE的報告。由於情報提供者在本研究中發揮的關鍵作用，亦應確定第二後備情報提供者，較佳為在第0天之前。
安全審查觸發研究藥物投予後，觀察每名受試者28天的任何安全審查觸發(SRT)事件。此等係研究者認為4級或5級的任何不良及嚴重不良事件，或者被視為與研究藥物相關的任何3級事件(參見第13節)。在投予後28日期間內的任何時間，若事件發生，IDMC 需要審查該事件並確定是否應繼續或停止研究。
若認為3級事件與研究藥物無關，或者存在任何技術問題，則該事件將由臨床研究醫療團隊審查。若團隊確定IDMC需要進一步審查，則召開IDMC進行審查。如果不需要IDMC審查，則研究繼續進行。
若沒有報告SRT事件，臨床研究醫療團隊在研究藥物投予後28天審查任何報告的不良及/或嚴重不良事件以及可用的安全性數據。醫療團隊確定事件是否需要IDMC 進一步審查並相應地進行。
此循環一直持續到該同齡群的第3名受試者被招募及審查。
當來自第3名受試者的28天資料可用時，將來自該同齡群的所有可用數據匯總並提交給IDMC以確定是否應進行劑量遞增或應停止研究。
若決定增加劑量，招募受試者至同齡群2以接受更高劑量的PBFT02。招募遵循上述對於低劑量的相同程序。如前所述，當來自第3名受試者的數據可用時，將該同齡群中的所有可用數據匯總並提交給DSMB以確定是否應繼續進行研究或應停止研究。
若PBFT02在第二同齡群中耐受性良好並且更高劑量為可行的，則可招募第三同齡群，在依序的受試者之間至少間隔28天以評估安全性及耐受性。
任何受試者於研究藥物投予後28天內經歷安全審查觸發(SRT)事件，該研究將停止，並召開IDMC會議審查研究該事件中的數據。SRT事件被定義成研究者認為4級或5級的任何AE或SAE，或者被認為與研究藥物相關的任何3級事件(第13節)。
除了觸發SRT的事件外，若滿足以下任一基準，則研究將停止並且不再招募新受試者： •     由研究者評估，任何被認為與研究產品或ICM注射程序相關的死亡 •     由研究者評估，被認為與研究產品或ICM注射程序相關的CNS出血、中風或急性麻痺
獨立數據監測委員會審查此等不良事件，並就繼續進行研究及受試者招募做出決定。
劑量遞增基準劑量遞增係基於對安全性(包括臨床及實驗室評估)、耐受性的評估及對CSF PGRN水準的作用的評估。在每名受試者被招募到每個同齡群後進行評估。在每個同齡群之後也進行總結評估。安全性審查觸發基準已經建立，且於以下提供一個演算法來確定何時臨時召開正式獨立數據監測委員會會議。否則，若沒有發現嚴重的安全問題，則當每個同齡群的匯總數據可用時定期召開獨立數據監測委員會會議，他們可提供指引是否繼續進行更高劑量。除了安全性考量外，進行CFS顆粒蛋白前體水準的評估以確定PBFT02具有所欲藥效學作用的程度。
研究設計基本原理 盲測、對照組、研究期、治療組此為開放性、劑量遞增的研究設計。每個同齡群由3名接受積極治療的受試者所組成。研究最初兩年部分足以評估臨床及生物標記疾病進展在主要終點及潛在一些次要終點的作用。另外3年延伸期適用於評估長期安全性。最初，計劃兩個同齡群，一個低劑量同齡群及一個較高劑量同齡群。若PBFT02在第二劑量同齡群中的耐受性良好並且增加劑量為可行的，則可以比第二同齡群更高的劑量招募第三同齡群。這能夠基於安全性、耐受性及於生物標記(包括CSF PGRN水準以及神經退化的其它體液及神經影像生物標記)上的治療效果而確定最佳劑量。
研究族群本研究的目標族群由35至75歲(含)的受試者所組成；具有輕微的FTD徵象及症狀(由CDR plus NACC FTLD總分0.5-1.0定義)；及藉由低CSF PGRN水準及異基因型組合致病性GRN突變的遺傳生物標記證據所確認的GRN單套缺失(由AD&FDMDB分類)；或ACMG指南中「致病性不明」或「顯著性不確定」的GRN 變異，以及一等親患有FTD或相關運動症候群(ALS、PSP、CBD)。具有與阿茲海默氏症或其它可能混淆FTLD治療評估的CNS疾病一致的臨床病史或生物標記特徵的受試者被排除在外。
作為一種基因療法，PBFT02具有使患有由GRN之一個或兩個拷貝中致病性突變所引起的神經退化性疾病的患者受益的潛力。已知的GRN突變經AD&FTDMDB定義為致病性的，該AD&FTDMDB遵循人類基因體變異協會(Human Genome Variation Society)所建立的指南，對AD及FTLD患者中的所有已知突變及非致病性編碼變異進行編目。這種突變解釋方法被評估此等患者的臨床醫生普遍接受，並在與FTLD疾病專家的討論下被採用於此試驗中。
由GRN單套缺失引起的成年發病神經退化的早期臨床表現為異質性的。此異質性導致各種初始臨床表現，隨著疾病的發展還會出現另外的症狀。由於患有FTD的患者在其第一個症狀發作後通常會迅速衰退，而本研究招募表現任一主要臨床FTD表型的受試者，包括行為變異型(bvFTD)(其中行為改變及執行功能障礙為顯著的早期表現)、以及原發性進行性失語症(ppaFTD)(其中語言的理解及/或產生受到損害)。PPA根據特定語言缺陷進一步區分為非流暢變異型PPA(nfvPPA)及語義變異型 PPA(svPPA)，兩者均符合招募條件。若阿茲海默氏症的生物標記與並行的AD不一致，則PPA的第三種亞型，語彙減少變異型lPPA，也有資格受招募。
FTD譜亦包括運動障礙表型，包括進行性核上性麻痺症候群、皮質基底核症候群(CBS)及ALS。為確保此項相對較小的第1期研究中臨床病程的同質性，僅具有運動症狀的受試者並不具備招募資格。然而，本研究中包括具有此等運動障礙伴隨表現的bvFTD或ppaFTD的受試者。
合格的受試者以CDR plus NACC FTLD量表進行篩選，其旨在評估所有FTD臨床表現的症狀嚴重程度，包括記憶、定向、判斷及解決問題、社群事務、家庭及嗜好、個人照護、行為及語言。CDR plus NACC FTLD總分0.5(包括輕度症狀患者)允許將有症狀患者納入神經退化的早期階段，在此階段基因治療的益處可能被最大化。在此早期階段招募患者還允許隨後檢測疾病進展的變化或穩定以及延遲其它症狀的發作。
為了最大限度地降低受試者的風險，此研究排除了對臨床程序有禁忌症、缺乏被預測為致病性的GRN突變、或患有與神經系統或免疫系統相關的疾病的患者。
此外，此研究包括將與癌症相關的風險最小化的排除基準。擬議與癌症相關的排除基準係因為已在多種腫瘤中觀察到PGRN過度表現。PGRN過度表現已被假設促進癌症的進展。因此，我們排除患有惡性腫瘤(局部皮膚癌除外)或有遺傳性癌症症候群記錄病史的患者。然而，根據研究者的裁量，可包括具有先前成功治療的惡性腫瘤及充分追蹤以排除復發的受試者。此外，預計此基因治療不會導致血清PGRN表現高於生理水準。在非人類靈長類動物研究中使用的PBFT02劑量高於該此FIH試驗中所使用的劑量，發現PGRN在PBFT02 ICM投予後在血清中以接近正常水準表現。由於在FIH試驗所招募的受試者在治療前具有循環性PGRN水準約為正常值的30%，因此預計循環性血清PGRN水準最多會恢復到正常。因此，我們不預期任何異常高的PGRN全身性暴露。
由於CNS中一些腦區域的PGRN水準可能高於正常，而密切監測患者可能的CNS腫瘤的徵象。通過CBC檢測盤監測受試者的驗血，並且在圖36A–圖36C中指定的追蹤時間點，每年經由利用釓造影劑的MRI監測受試者的腦及脊髓，持續5年。與釓滯留相關的潛在風險係公認的，但被認為與GRN媒介的腫瘤的潛在風險相平衡。
劑量選擇 (PBFT02)PBFT02旨在取代GRN基因並提高中樞PGRN水準。由GRN單套缺失引起的FTLD為基因療法的一個有吸引力的候選者，因為其為一種由分泌性蛋白缺乏引起的單基因疾病。雖然新合成的PGRN可直接從反式高基氏體網絡運送至溶酶體，但其亦可被分泌並經由分揀蛋白或甘露糖-6-磷酸受體被其它細胞吸收，然後再運送至溶酶體。在選擇性刪除神經元中的Grn後，在轉基因小鼠中證實PGRN分泌的一個重要後果。與在所有細胞類型中完全缺乏PGRN蛋白的 Grn-/-動物相比，僅在神經元中摘除PGRN表現不會導致神經元脂褐質蓄積，這表明其它中樞神經系統(CNS)細胞對缺乏PGRN的神經元提供該蛋白質。因此，在CNS的細胞子集中過度表現PGRN可提供一個分泌的蛋白的儲存庫，其可被周圍的細胞吸收，從而產生交叉矯正的潛力。
起始的PBFT02劑量水準由GLP NHP毒理學研究及鼠類MED研究確定。此FIH劑量遞增研究由1-3個劑量同齡群所組成。所有測試的劑量都有可能產生治療效果。依序投予劑量(低劑量後高劑量)，以便能根據安全性、耐受性及於生物標記(包括CSF PGRN水準，以及神經退化的其它體液及神經影像生物標記)上的治療效果來確定最佳劑量。
終點除了測量安全性及耐受性作為主要終點外，基於當前文獻並與專門研究額顳葉失智症的主要臨床醫生諮詢，為此研究選擇次要功效終點。此等終點追踪臨床結果及疾病生物標記，目的在於為隨後的登錄試驗(registrational trial)確定合適的終點。在圖36A–圖36C中所示的時間點測量終點。選擇此等時間點以促進對PBFT02安全性及耐受性的徹底評估。亦考慮GRN患者的疾病進展速度而選擇此等時間點，以便能評估臨床療效措施。根據草案“FDA Guidance for Industry: Long Term Follow-Up after Administration of Human Gene Therapy Products”(July 2018)，在PBFT02投予後，繼續監測受試者的安全性及有效性共5年。
生物標記下表概述此研究中要評估的生物標記及其總體目的。此等生物標記被詳細描述於此方案的後續章節。除了方案中預先指定的生物標記分析之外，還獲得了對其它生物標記分析的知情同意。
生物標記 受試者選擇 藥效學 疾病病理生理學進展 / 改變
GRN單套缺失的基因檢測 X      
血漿總tau、p-tau 181 X    X
PGRN水準(CFS、血漿) X X   
神經纖維絲輕鏈(NfL) (從基線下降) X    X
視網膜脂褐質 (從基線下降)       X
大腦MRI (在皮質體積、皮質厚度、白質完整性上之疾病相關變化的減緩) X    X
FDG-PET (腦代謝降低的減緩) X    X
EEG/誘發反應電位 (疾病相關變化的減緩)       X
GRN 單套缺失之確定必須基於作為受試者醫療記錄之一部分的經驗證之分析結果或基於作為本研究篩選程序之一部分的臨床現場所進行的基因分型，將受試者記錄為GRN突變攜帶者。
排除具有阿茲海默氏症病理學受試者的生物標記阿茲海默氏症可能被誤認為為FTD，或可能以合併症存在於患有FTD的患者中。因此，為了避免AD對本試驗結果解釋的混淆影響，排除具有阿茲海默氏症病理學生物標記證據的受試者。使用排除基準中概述的經驗證之分析來評估受試者是否存在阿茲海默氏症。
基線及治療後 CSF 及 血漿 PGRN 水準 的確定測量CSF及血漿中PGRN蛋白在基線(用於納入)及隨後的治療後的水準以作為AAV轉導的指標。投予PBFT02後，預計患者的PGRN水準會增加。CSF及血漿PGRN水準的治療相關性增加為本試驗中的劑量遞增及後續試驗的劑量選擇提供了依據。
神經退化之體液生物標記的評估收集體液的生物標記以評估對神經退化的潛在治療效果，以及相關的神經炎症及小神經膠質細胞的活性。在研究過程中還追蹤了神經纖維絲輕鏈(NfL)、總tau(T-tau)、磷酸化tau(P-tau)的CSF水準的治療相關性變化，儘管疾病穩定對此等終點的預測影響尚不清楚。
NfL神經纖維絲為軸突細胞骨架的結構蛋白。在FTD中，與阿茲海默氏症(AD)相比，已顯示NfL次單位的CSF濃度較高。儘管CSF NfL被認為是神經退化的通用生物標記，但最近對其在記憶臨床環境中的有用性之評估暗示，其可用於積極識別FTD，尤其是bvFTD。較高濃度的CSF NfL與較短的FTD生存期相關，這暗示其為疾病強度/嚴重程度的標記。NfL的血漿濃度與CSF密切相關，且最近的數據顯示FTD中NfL的血清或血漿水準增加，反映出疾病強度並預測未來的臨床惡化及磁共振成像的腦體積損失。與此一致的是，NfL濃度似乎僅在有症狀期間升高，症狀前的水準與對照組相似。NfL被認為是神經元喪失或損傷的一般指標。
TauTau及磷酸化tau係與AD、PD及某些形式的FTD亞型中所見的病理相關，且通常與神經元損傷或退化相關，而與亞群無關(除了與潛在AD病理相關的語彙減少變異型原發性進行性失語症[lvPPA])。FTD患者在CFS中的P-tau對T-tau的比率似乎較低。
視網膜脂褐質視網膜退化發生在臨床前異基因型組合GRN突變攜帶者中，這種表型亦於Grn基因剔除小鼠中觀察到。Grn剔除小鼠亦會在整個中樞神經系統中形成自體螢光的聚集體(稱為脂褐質)的顯著沉積物。非侵入式視網膜成像揭示了異基因型組合GRN突變攜帶者的臨床前視網膜脂褐質病。此研究中使用眼部同調斷層掃描(Ocular coherence tomography；OCT)來評估在篩選時及圖36A-圖36C中概述之時間點的視網膜脂褐質。
神經退化之神經影像生物標記的評估 磁共振成像 (MRI)具有GRN單套缺失的患者主要表現出額葉及顳葉皮質中的神經元細胞喪失，症狀發作後全腦體積通常以每年3.4%的速度減少。因此，此利用T1加權的MRI來追蹤腦體積、白質完整性以及中額葉皮質及頂葉區域厚度的變化，此等區域為目標族群的所有臨床表現中最常受影響的大腦區域。隨著時間的推移，投予PBFT02預期會將此等區域萎縮中的衰退穩定下來。收集來自其它皮質或皮質下大腦區域的其它探察的資料，因為萎縮影響的大腦區域在各種臨床表現中可能有所不同，而此等資料可能有助於了解GRN相關神經退化的自然病程。在篩選期間及在圖36A-圖36C中概述之時間點進行MRI。
氟 化去 氧葡萄糖正子 發射 斷層 掃 描 ( Fluorodeoxyglucose positron emission tomography ； FDG PET)在FTD中，低代謝通常見於額葉及前顳葉，更具體地見於雙側內側、下及上外側額葉皮質、前扣帶迴(anterior cingulate)、左顳葉及右頂葉皮質以及尾狀核(caudate nuclei)。通常，低代謝與MRI上的萎縮相關，但通常先於萎縮。對於FTD，FDG PET掃描的靈敏度範圍為47%到90%；特異性為68%到98%。隨著時間的推移，可見到異常的增加，表明FDG PET作為疾病進展的生物標記的潛在有用性。隨著時間的推移，投予PBFT02預期會將此等區域觀察到的低代謝穩定下來。FDG PET成像在篩選期間及在圖36A-圖36C中概述之時間點進行。
EEG/ 誘發反應電位事件相關的EEG活動的振幅或來源活動係探測感覺及認知運動訊息過程中視丘皮質及上升活動系統的同步/解同步及耦合/去耦合機制，並可揭示輕度認知障礙及阿茲海默氏症及干預的漸進影響，尤其是在早期疾病階段，並可能對其它形式的失智症有用。
臨床結果評量評估PBFT02對臨床進展、生活品質及功能的影響。由於目標患者族群表現出表型異質性，而採用在臨床呈現範圍內捕捉所表現之症狀進展的量表來量測隨時間推移的變化。此等功效評估旨在捕捉PBFT02隨著時間的推移穩定症狀下降的能力。在具有不同臨床表現的患者的各種臨床參數間進一步衰退的速率的數據，被用於進一步告知適當終點的選擇，並為了登錄試驗確定具有臨床意義的變化。
行為、語言及認知的評估 CDR plus NACC FTLDCDR plus NACC FTLD為典型臨床失智症評定(CDR)量表的擴展版本，其歷史上一直用於評估AD譜疾病的嚴重程度。評估包括CDR的原始六個領域(記憶、定向、判斷及解決問題、社群事務、家庭及嗜好、個人照護)。其亦包括語言及行為二個額外領域，可使得在檢測FTLD譜患者衰退方面具有更高的靈敏度。綜合評定得分0表示正常行為或語言，而得分0.5、1、2或3表示輕度到嚴重缺陷。CDR plus NACC FTLD的加總計分(CDR plus NACC FTLD sb)得分代表各個領域的總和，並用於確定個別領域及跨多個領域的疾病嚴重程度的進展。
額顳葉功能測試 (Frontotemporal Assessment Battery ； FAB)FAB為評估執行功能的簡要評估。在輕度失智的患者(MMSE＞24)中特別有用。評估由6個部分所組成，針對認知、運動及行為領域。總分為18分及更高得分表明較佳之表現。
額顳葉失智症評定量表 (FRS)FRS衡量疾病進展。其係由對30個探索性問題的項目分析所建構，此等探索性問題係從兩個旨在測量失智相關的行為及失能的較舊工具中挑選出來的。計算統計上定義的閾值以定義嚴重程度。FRS檢測FTD之隨時間推移的疾病進展差異。此簡短的訪談係與主要照護者進行，由30個項目所組成，被分類為從不、有時或總是發生。然後計算百分比分數，並將其轉換為對數分數，並最終轉換為嚴重程度分數。嚴重程度評分的範圍從「非常輕度」到「嚴重」。
波斯頓命名測 試 (Boston Naming Test ； BNT)BNT為一種廣泛使用的評估對證命名能力(confrontation naming ability)的工具。BNT由60幅物體的黑白線條圖所組成，此等線條圖按照詞彙詞頻從床(bed)到算盤(abacus)排序。考慮圖片刺激之順序，發現具有舉名困難(dysnomia)的個體在命名低頻率物體時通常有更大的困難。
多語言命名測試 (MINT)32項MINT為BNT的替代方案，BNT最初開發用於測試4種語言(英語、西班牙語、希伯來語及中文)的命名，MINT注意使語言間項目的難度水準相等。MINT對阿茲海默氏症的命名障礙很敏感。
數字廣度測試數字廣度測試用於衡量個人的工作記憶數字存儲能力，而且為執行功能的測量。參與者會看到一系列數字(例如，「8、3、4」)，並且必須立即重複此等數字。若他們成功地做到，他們會獲得一個更長的列表(例如，「9、2、4、0」)。一個人能記住的最長列表的長度即為這個人的數字廣度。雖然要求參與者在順向數字廣度任務中以給定順序輸入數字，但在反向數字廣度任務中，參與者需要顛倒數字的順序。
語文流暢性 ( 音素測試 )單字流暢性係以語義及字母單字列表生成測試及兩個字母生成任務來衡量。每項任務需要60秒，並合計正確的項目。注明錯誤及違反規則。
路徑描繪測試 ( 口語適應 )路徑描繪測試的口語版本為一種神經心理學測量，其提供對連續心向轉移(sequential set-shifting)的評估，而無需書面路徑描繪測試的運動及視覺要求。最初的目的係作為書面路徑描繪測試的口語模擬，口語版本提供了一種評估身體受限患者的方法。其為一種執行功能的臨床測量。
班森複雜圖形複製 (10 分鐘回憶 )班森複雜圖形為對建構能力的測試。圖形元素係對存在及位置進行評分。在延遲之後測試複製力以測量永久記憶。
加州語文學習測試 (CVLT) ，第二版CVLT作為情節語文學習及記憶的量測的建構效度，在神經心理學文獻中獲得了相當多的支持。此測量使用在四次學習試驗中呈現的9字列表來評估最近的情節記憶。在30秒的轉移注意力任務之後立即進行自由回憶。延遲10分鐘後進行自由回憶及語義提示回憶試驗。
蒙特利爾認知評估 (MoCA)MoCA為一頁30分的測試，旨在作為輕度認知功能障礙的快速篩選工具。其評估不同的認知領域：注意力及專注力、執行功能、記憶、語言、視覺建構技能、概念思維、計算及定向。
生活品質及機能性活動的評估 機能性活動問卷 (FAQ)FAQ衡量日常生活中的工具性活動，例如準備均衡膳食及管理個人財務。由於機能變化在失智症過程中較早被注意到，以及與日常生活的基本活動相比，日常生活的工具性活動需要更高的認知能力，而此工具有用於監測此等機能隨時間推移的變化。
施瓦布及英格蘭日常生活活動量表 (SEADL)施瓦布-英格蘭量表在0-100%的範圍內對日常生活能力活動進行評分，其中100%為完全獨立且沒有失能。此量表有用地整體衡量日常生活活動的獨立性及表現。
臨床總體印象變化CGI-C為一種簡短、廣泛使用的評估的三個部分之一。該評估由3個項目所構成，此等項目係由臨床醫師觀察員評定。CGI-C的評分為7分制，從研究招募開始，無論任何改善是否完全由治療所引起，範圍從1(大幅改善)到7(非常差)。
其它評估 C-SSRS使用哥倫比亞自殺嚴重程度評定量表(C-SSRS)評估自殺風險。C-SSRS為一種3部分量表，衡量自殺意念、意念強度及自殺行為。此評估的結果由直接從量表所得之自殺行為殺傷力等級、自殺意念得分及自殺意念強度等級所構成。根據評估準則，大於0的意念得分可表示需要介入。強度等級的範圍為0到25，其中0表示不支持自殺意念。
安全性評估在治療期期間，定期進行安全性評估，如圖36A–圖36C中所列。此等安全性評估包括但不限於AE及伴隨藥物監測；用於臨床實驗室測試測定(血液學、臨床化學、尿液分析)的血液樣品採集；生命徵象測量；身體及神經學檢查、神經傳導研究及TNSn。
為了將受試者的風險降至最低，此研究排除了對臨床程序有禁忌症、缺乏被預測為致病性的GRN突變、或患有與神經系統或免疫系統相關的疾病的患者。
由於CNS中一些大腦區域的PGRN水準可能高於正常水準，而密切監測患者是否有潛在CNS腫瘤的徵象。通過CBC檢測盤監測受試者的驗血，且在圖36A–圖36C中指定的追蹤時間點，每年經由利用釓造影劑的MRI對受試者進行腦及脊髓的監測，持續5年。與釓滯留相關的潛在風險係被承認的，但認為與GRN媒介的腫瘤的潛在風險相平衡。
研究族群及參與期間 研究參與期間每位受試者的研究期間為60個月(安全性及有效性的期間分析：24個月)。
目標族群目標族群為年齡≥35歲且≤75歲並已被診斷為由GRN單套缺失引起的成人發病神經退化的患者。
受試者的數量及位置在美國及歐洲的多達12個中心招募多達9名成人受試者。在向機構提交期間或通過醫院/醫生轉診來確定受試者。亦利用地方、區域及國家受試者宣導小組夥伴關係來提高對研究的認識。
納入基準1.招募時≥35歲且≤75歲 2.根據以下基準之一確認 GRN突變(在篩選期間或基於使用經驗證之分析的記錄病史)為原因： •根據美國醫學遺傳學學會(ACMG)發布的指南，由阿茲海默氏症及額顳葉失智症突變資料庫(Alzheimer Disease & Frontotemporal Dementia Mutation Database；AD&FTDMDB)歸類為致病性的突變 •在AD&FDMDB中歸類為「致病性不明」或被ACMG指南歸類為「顯著性不確定的變異」，且患者具有相同或相關神經退化性疾病(額顳葉失智症(所有變異型)、進行性核上神經麻痺症、皮質基底核症候群或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症)的家族史 •應無證據表明GRN以外的突變可解釋疾病的存在。 3.依據目前國際共識診斷基準的可能的bvFTD或PPA(非流暢變異型[nfvPPA]、語義變異型[svPPA]或語彙減少變異型[lPPA])之臨床及影像學診斷： •根據Rascovsky(2011)基準的可能的bvFTD A.   必須存在以下三種行為/認知症狀(A-F)。需要確定症狀為持續的或反復出現的，而不是單一的或罕見事件。 A.   早期*行為的抑制解除[必須存在以下症狀(A.1–A.3)之一]： A.1. 社會不當行為 A.2. 失去禮貌或禮儀 A.3. 衝動、魯莽或粗心的行為 B.   早期的冷漠或惰性[必須存在以下症狀(B.1–B.2)之一]： B.1. 冷漠 B.2. 惰性 C.   早期的失去同情心或同理心[必須存在以下症狀(C.1–C.2)之一]： C.1. 對他人需求及感受的反應減弱 C.2. 社會興趣、相互聯繫或個人熱情的減少 D.   早期的固執的、刻板的或強迫性/儀式化行為[必須存在以下症狀(D.1–D.3)之一]： D.1. 簡單的重複動作 D.2. 複雜的、強迫性的或儀式化的行為 D.3. 言詞的刻板化 E.    多食及飲食變化[必須存在以下症狀(E.1–E.3)之一]： E.1. 改變食物偏好 E.2. 暴飲暴食，增加飲酒或吸煙 E.3. 口腔探索或食用不可食用的物品 F.    神經心理學概貌：記憶及視覺空間功能相對保留的執行/世代缺陷[必須存在以下所有症狀(F.1–F.3)]： F.1. 執行任務的缺陷 F.2. 情節記憶的相對保留 F.3. 視覺空間技能的相對保留 B.   表現出顯著的功能衰退(藉由照護者報告或者由臨床失智症評定量表或機能性活動問卷得分證明) C.   成像結果與 bvFTD 一致[必須存在以下(C.1–C.2)之一]： C.1. MRI上的額葉及/或前顳葉萎縮 C.2. PET上的額葉及/或前顳葉低代謝 •根據Gorno-Tempini(2011)基準的原發性進行性失語症變異型 根據Mesulam(2001)的基準診斷PPA 1.最顯著的臨床特徵為語言困難 2.此等缺陷為日常生活活動受損的主要原因 3.失語症應該為症狀發作時及疾病初期最顯著的缺陷 一旦確定PPA診斷，應使用以下內容對PPA變異型進行分類： A.   非流暢變異型[nfvPPA] -必須至少存在以下兩個核心特徵之一： 1.語言產生中的語法缺失 2.費力、停頓的說話，伴隨不一致的語音錯誤及失真(言語失用) -必須存在以下3個其它特徵中的至少2個： 1.對語法複雜的句子的理解受損 2.多餘的單詞理解 3.多餘的客觀知識 -成像必須顯示以下一個或多個結果： a.    MRI上主要的左後額腦島萎縮，或 b.    PET上主要的左後額腦島低代謝 B.   語義變異型PPA [svPPA] -必須存在以下兩個核心特徵： 1.對證命名受損 2.單詞的理解受損 -必須存在以下其它診斷特徵中的至少3個： 1.客觀知識受損，特別是對於低頻率或不熟悉的項目 2.表層閱讀障礙或書寫障礙 3.多餘的複誦 4.多餘的言語產生(語法及運動言語) -成像必須顯示以下一個或多個結果： a.    MRI上主要的前顳葉萎縮 b.    PET上主要的前顳葉低代謝 C.   語彙減少變異型[lPPA]) -必須存在以下兩個核心特徵： 1.自發說話及命名中的單詞檢索受損 2.句子及短語的重複受損 -必須存在以下其它特徵中的至少3個： 1.自發說話及命名中的言語(音韻)錯誤 2.多餘的單詞理解及客觀知識 3.多餘的運動言語 4.缺乏直率的語法 -成像必須顯示以下至少一個結果： a.    MRI上主要的左後薛氏腦裂周圍或頂葉萎縮 b.    PET上主要的左後薛氏腦裂周圍或頂葉低代謝 4.包括具有bvFTD或ppaFTD(如基準#2中定義)的受試者，其伴隨表現進行性核上神經麻痺症候群(PSP)、皮質基底症候群(CBS)或肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)(僅具有運動症狀的受試者不符合招募條件)。 5.具有可靠的情報提供者，其至少每週親自與該受試者交談或見到該受試者 6.CDR plus NACC FTLD總分0.5 7.低顆粒蛋白前體水準：篩選沒有病歷證實的低CSF 顆粒蛋白前體水準之受試者的血漿顆粒蛋白前體水準。若血漿顆粒蛋白前體水準低，則可招募該受試者。 8.提高的NfL：篩選沒有病歷證實的高NfL CSF水準之受試者的血漿NfL水準。若血漿NfL水準升高，則可招募該受試者。
排除基準1.阿茲海默氏症的生物標記證據。先前未被鑑定出具有阿茲海默氏症生物標誌證據，或在過去12個月內未接受過阿茲海默氏症生物標記測試的受試者，篩選該受試者血漿ptau181的水準；如果血漿 ptau181符合AD病理，則排除該受試者。 2.Rosen改良型Hachinski缺血量表得分＞7。 3.MRI上的Fazekas得分＞1。 4.已知存在可合理解釋有症狀受試者的症狀的結構性腦病灶(例如，腫瘤、皮質梗塞)。 5.在PSEN1、PSEN2或APP中已知存在導致阿茲海默氏症的突變。 6.柯沙可夫氏腦病變、嚴重酒精依賴(失智症發病5年內)經常飲酒或其它物質中毒的先前病史。 7.B12缺乏症之經由病史或實驗室測試的證據為排除性的，除非後續實驗室測試(升半胱胺酸及甲基丙二酸)表明該值不具有生理意義。以B12補充治療的受試者可在研究者審查他們的診斷及治療歷史記錄並經試驗委託者的醫學監督書面同意後被招募，以確保疾病/治療的穩定性及順應性。 8.未經調節的甲狀腺功能低下症之經由病史或實驗室檢測的證據([TSH]＞正常值的150%)。 9.腎衰竭(肌酸酐＞2)。 10.肝衰竭(ALT或AST＞正常值的二倍)。 11.需要補充氧氣的呼吸衰竭。 12.大的融合性白質病灶。 13.嚴重的全身性疾病，如心血管疾病惡化。 14.無法提供完全同意或缺乏可提供同意的具有充分聯繫的合法授權的照護者。 15.MRI、ICM遞送或LP的禁忌症(例如，局部感染、血小板減少症、凝血病、顱內壓升高([ICP]由於佔位性病灶))。 16.在AD&FDMDB中將GRN突變分類為「非致病性」、「可能的良性變異」或「良性變異」。 17.免疫功能不全的患者。 18.對於人類免疫缺陷病毒(HIV)或C型肝炎呈陽性測試結果的患者。 19.非GRN突變引起的其它惡性腫瘤或慢性CNS病症。 20.研究者認為可能對受試者構成風險的藥物，例如免疫抑制藥物或全身性皮質類固醇。若在篩選前30天使用穩定劑量並同意在試驗期間保持相同劑量，則可使用非類固醇類消炎藥(NSAID)。 21.惡性腫瘤(局部皮膚癌除外)或有遺傳性癌症症候群的記錄病史。在試驗委託者或指定人員討論及批准後，可包括具有先前已成功治療的惡性腫瘤並充分追蹤以排除復發(基於腫瘤科醫師的意見)的受試者。 22.研究者認為可能導致與GRN突變無關的認知障礙的任何並行疾病，包括失智症的其它原因、神經梅毒、水腦症、中風、小血管缺血性疾病、不受控制的甲狀腺功能低下症、或維生素缺乏症。 23.對於有生育能力的女性，在篩檢訪視時藉由血清妊娠試驗證實尿液呈陽性、在投予研究產物前第1天由血清結果證實尿液呈陽性、或不願意在研究期間進行其它妊娠試驗。 24.對於有生育能力的男性及女性，從篩檢日起至投予載體後52週，不願意使用醫學上認可的雙重屏障避孕方法(例如與避孕藥一起使用的避孕套/隔膜)或禁慾 25.研究者認為會給受試者帶來不適當的風險的任何病況(例如，任何疾病病史、任何當前疾病的證據、身體檢查的任何發現或任何實驗室異常)，或者研究者認為會干擾對研究產品的評估、或對受試者安全性或研究結果的解釋 26.在招募30天內需要住院的任何急性疾病
禁令及限制潛在受試者必須願意並能夠在研究過程中遵守以下禁令及限制，才有資格參與： ●     在研究完成(即最後的追蹤訪問)後至少90天內避免捐血。 ●     與伴隨藥物相關的任何禁令或限制。 ●     在預定訪問研究地點之前的24小時內不允許使用含酒精的產品。
劑量及投予 劑量 腦大池 內輸注為了避開靜脈內(IV)全身性AAV投予以治療CNS的局限性，本研究使用鞘內(IT)載體遞送到腦大池。使用CSF作為用於分散載體的媒劑，IT投予有可能以單次微創程序實現整個CNS的轉基因遞送。動物研究證實，藉由消除穿越血腦屏障的需要，IT遞送產生實質上更有效的CNS基因轉移，且載體劑量比IV方法低得多。對於進入CSF存在多種途徑，包括腰椎穿刺(LP)及腦大池內(ICM)。研究顯示，與以腦大池的水準注射載體相比，經由LP將AAV載體遞送到CFS中，在轉導大腦及脊髓細胞方面的效率至少低10倍。
預先研究及伴隨藥物在篩選開始前最多30天所進行的所有研究前治療必須在篩選時記錄。
從簽署初始ICF開始，直到研究結束訪視(後續追蹤訪視)，必須在整個研究過程中記錄所有伴隨治療。具體而言，任何與研究藥物不同的療法(處方藥或非處方藥，包括疫苗、維生素、草藥補充劑；非藥物療法，如電神經刺激、針灸、特殊飲食、運動方案)都必須記錄在受試者的來源記錄中並輸入eCRF。
超過此時間的伴隨治療也應與新的或惡化的AE一起記錄，直到事件解決。指示受試者在開始任何新藥物或補充劑之前以及在改變任何當前伴隨藥物或補充劑的劑量之前須諮詢研究者或研究中心的其它適當研究人員。
在eCRF中單獨收集有關使用特別感興趣的特定伴隨藥物(即AChE抑制劑、美金剛(memantine)、苯二氮卓類及抗抑鬱藥)的資訊，包括劑量及投予途徑、投予日期及使用適應症。必須提前(或在此後儘快)通知試驗委託者任何投予違禁療法的情況。
與AD相關之症狀的進展不應被記錄為AE，除非根據研究者的意見，彼等被認為是加速的。然而，任何對症治療都會記錄到研究結束訪視(追蹤訪視)。對於將受試者招募至研究的明確目的，不應修改有效的預先存在的治療方法。
如果受試者在研究藥物投劑開始前至少6週服用穩定的藥物，則允許穩定醫療狀況的治療，這在老年族群中可能很常見。如果可能，受試者應在研究期間保持穩定的藥物治療。僅當臨床顯示且必須在eCRF的伴隨藥物部分進行記錄時，才允許更改或添加藥物。
在招募至研究時，以認知增強劑(例如，AChE抑制劑)或用於治療認知缺陷的藥物進行治療為排他性的。基於醫療需要，允許在研究期間出現認知下降的受試者接受已批准的AD療法，但未經試驗委託者明確許可，不允許接受此等預計會對認知表現產生影響的新療法或療法調整(例如，AChE抑制劑或美金剛)。在受試者開始、停止或改變預期對認知有影響的治療劑量之前，必須聯繫試驗委託者的醫學監督以確定受試者是否應繼續參與研究，以及是否應執行臨床結果評量。
研究期間不允許連續(每日)使用苯二氮卓類；但是，允許偶爾攝入短效苯二氮卓類。如果受試者需要以苯二氮卓類進行間歇性治療，則從苯二氮卓類的最後一次投劑與隨後的認知評估之間的間隔必須至少為該化合物的4個半衰期或24小時，以較長者為準。若在任何訪視時或任何短期使用鎮靜藥物用於研究程序(例如，MRI、PET掃描、腰椎穿刺)，則所有認知評估都必須在投予鎮靜劑之前、或者在投予鎮靜劑至少24小時或4個半衰期之後(以較長者為準)進行並完成。
如果打算在整個研究過程中保持劑量不變，則可能會給予其它影響中樞神經系統(CNS)功能的伴隨藥物。從隨機化前6週開始，此等化合物的劑量應保持恆定。為了避免對認知評估的影響，除非有記錄的醫療必要性，以下適用與試驗委託者的醫學監督討論： •在隨機化前至少6週接受穩定劑量之影響CNS功能的藥物的受試者不應在研究期間停止投予該藥物，也不應改變該藥物的劑量。 •在研究期間，受試者不應添加任何影響 CNS 功能的藥物。
若在研究期間出現影響CNS功能的任何不可預見的開始、停止或更改為穩定劑量的治療，必須聯繫試驗委託者的醫學監督以確定受試者是否應繼續參與研究以及是否應執行臨床結果評量。
對於CSF採樣，除非本節另有說明，否則應遵循與伴隨治療相關的當地站點說明。討論可能為患者開具的伴隨精神作用藥物的使用。
研究程序 進行的評估在圖36A-圖36C所示的研究訪視中，所有受試者都需要以下章節中所確定的研究程序。
書面知情同意在任何與研究相關的程序(包括篩選評估)之前，患者/照護者必須簽署IRB/IEC批准的知情同意書(ICF)。
病史及身體檢查研究者收集並記錄受試者的人口統計數據、既往病史、既往及伴隨藥物、身高及體重。一次全面的身體檢查及一次全面的神經檢查，包括力量、感覺、協調性及反射測試，由醫生在基線訪視時進行。討論病史的任何變化，包括不良事件或藥物。
血漿及血清生物標記在同意後抽血用於血漿、自然、DNA及RNA。標準安全實驗室在現場實驗室或由現場簽約的當地實驗室進行，現場工作人員將實驗室數值輸入到eCRF中。如研究操作手冊中所述，由中央實驗室處理的樣品係在現場儲存並由現場在乾冰上分批運輸。在每次研究訪問時，由有經驗的研究人員使用標準程序進行抽血。抽血不需要禁食。如果受試者正在接受全身麻醉，則可在此期間進行抽血以減輕疼痛及不適。
神經傳導研究 (NCS)神經傳導研究(NCS)包括使用研究手冊中指定的標準表面記錄技術測量兩條感覺神經(一條在手臂，一條在腿)的遠端節段的神經傳導速度及振幅。在基線及指定的時間點進行評估NCS。在每個時間點，採取重複測量以最大限度地減少變異性。感覺神經傳導速度以公尺/秒為單位測量，並在反應起始時記錄。以微伏特為單位測量從基線到峰值的感覺神經振幅。在整個研究過程中，所有NCS均在個體受試者身體的同一側進行，並仔細記錄及保持皮膚溫度。臨床站點由集中的核心實驗室專家對NCS進行培訓及認證，經由核心實驗室及試驗委託者的持續審查來確保NCS資料的品質控制。
心電圖 (ECG)心電圖係一種使用連接到受試者胸部、手臂及腿部的電極來記錄心臟中的電活動並檢測異常情況的測試。訪視時測量生命徵象，應先完成心電圖。
腦部磁共振成像 (MRI)在受試者同意後，在圖36A–圖36C所示的研究訪視中對受試者進行MRI。
獲得T1加權的MRI成像以評估疾病進展及以釓造影劑進行安全監測。
腰椎穿刺及 CSF 生物標記在受試者同意後，在圖36A–圖36C所示的研究訪視中為所有受試者收集 CSF。該過程涉及腰椎穿刺。在對病史的最初討論期間，確定受試者當前是否正在服用抗血小板藥物。如果受試者正在服用抗血小板藥物，則該訪視不進行腰椎穿刺。
腰椎穿刺由合格的現場工作人員根據標準醫院程序進行。所有適當的測試前程序都在腰椎穿刺之前進行。腰椎穿刺及CSF採集可在全身麻醉下進行。
標準CSF化學及細胞學測試在現場實驗室或由現場簽約的當地實驗室進行，由現場工作人員將實驗室數值輸入eCRF。由中央實驗室處理的樣品係由現場工作人員在現場儲存並在乾冰上分批運輸，用於FTD特異性生物標記測試(PGRN蛋白、載體DNA、載體中和抗體)及未來的研究(如果獲得同意)。
在研究操作手冊中的所有研究特定樣品的收集、處理及儲存程序都提供給站點。在指定的研究訪視時為受試者收集CSF。在每次此等訪問中，確定受試者當前是否正在服用血液稀釋劑。如果受試者正在服用抗血小板藥物，則不對該訪問進行腰椎穿刺。
總神經病變 評 分 - 護理總神經病變評分-護理包括對於治療突發的感覺、運動及自主神經症狀、以及定量感覺測試(振動及針)對受試者進行針對性的提問。使用Rydel-Seiffer C64分級音叉進行振動測試，使用NeuroPen進行針測試。在臨床現場執行TNSn的個人應具有醫學背景及患者照護經驗(例如，護士、醫師助理、醫師-非神經病學家、經驗豐富的臨床技術人員)。他們應該能夠輕鬆應對患者並收集臨床資料。所有執行TNSn的現場人員都必須使用NeuroPen及Rydel-Seiffer C64刻度音叉完成由試驗委託者開發的培訓模組及培訓文件。
受試者退出及提前終止受試者可隨時退出研究而不影響他們的護理。出於欠缺依從研究程序或訪視時間表，根據研究者的裁量亦可將他們從研究中終止。出於保護受試者的安全相關原因或出於行政原因，研究者亦可使違反研究計劃的受試者退出。eCRF中記錄了每個受試者是否完成了研究以及提前退出/終止的原因(如果適用)。提前退出的受試者，包括因開始接受任何妨礙他們繼續參與的研究產品的治療而提前終止的受試者，應盡一切努力參加最終的研究結束臨床訪視(於第720天訪視)，在此期間進行所有研究結束程序。如果提前終止的原因為死亡，這應該記錄在eCRF及收集的文件中，並與受試者的來源一起保存。
對/從退出研究或提前終止的受試者收集的資料繼續用於分析，直至他們退出或終止。在提前終止後，照護者可撤回對運送到中央實驗室或生物庫的實驗室樣品進行進一步測試的同意；但是，任何已經去識別化的樣品/樣品資料不能從數據集中排除。
(序列表之非關鍵詞文字) 對於含有在數字識別號＜223＞下的非關鍵詞文字的序列，提供下列資訊。
SEQ ID NO 在＜223＞下的非關鍵詞文字
3 ＜223＞ 工程化人類 PGRN1 編碼序列
4 ＜223＞ 工程化hPGRN2 編碼序列 ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(1779)
5 ＜223＞ 合成構築體
6 ＜223＞ 兔球蛋白polyA
7 ＜223＞ 3’ AAV ITR
8 ＜223＞ 5’ AAV ITR
9 ＜223＞ 人類 CMV IE 強化子
10 ＜223＞ CB啟動子
11 ＜223＞ 嵌合內含子
12 ＜223＞ UbC啟動子
13 ＜223＞ 內含子
14 ＜223＞ SV40 晚期polyA
15 ＜223＞ 安比西林抗性基因
16 ＜223＞ COL E1起始
17 ＜223＞ EF-1a啟動子
18 ＜223＞ F1 ori
19 ＜223＞ 康黴素抗性基因
20 ＜223＞ P5啟動子
21 ＜223＞ LacZ啟動子
22 ＜223＞ EF1a.hPGRN.SV40    ＜220＞ ＜221＞ 重複區域 ＜222＞ (1)..(130)
23 ＜223＞ Ubc.PI.hPGRN.SV40
24 ＜223＞ CB7.CI.hPGRN1.rBG    ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1)..(130) ＜223＞ 5’ ITR    ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (198)..(579) ＜223＞ CMV IE 強化子    ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (582)..(863) ＜223＞ 雞β-肌動蛋白啟動子    ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (958)..(1930) ＜223＞ 嵌合內含子    ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (1942)..(3726) ＜223＞ hPGRN    ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (3787)..(3913) ＜223＞ 兔β球蛋白poly A    ＜220＞ ＜221＞ misc_feature ＜222＞ (4002)..(4131) ＜223＞ 3’ ITR
25 ＜223＞ AAV1 VP1 gen    ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(2208)
26 ＜223＞ 合成構築體
27 ＜223＞ AAV2 rep
28 ＜223＞ AAV5殼體 VP1基因    ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(2172)
29 ＜223＞ 合成構築體
30 ＜223＞ AAVhu68 VP1殼體    ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞ (1)..(2211)
31 ＜223＞ 合成構築體
32 ＜223＞ miRNA標靶序列
33 ＜223＞ miRNA標靶序列
34 ＜223＞ miRNA標靶序列
35 ＜223＞ miRNA標靶序列
本說明書中引用的所有文獻皆藉由引用併入本文。在此申請的名為「21-9658PCT_ST25.txt」的序列表及其序列及正文藉由引用併入本文。2019年2月22日申請之美國臨時專利申請號62/809,329、2019年10月21日申請之美國臨時專利申請號62/923,812、2020年2月2日申請之美國臨時專利申請號62/969,108、2020年8月26日申請之美國臨時專利申請號63/070,639及2020年2月21日申請之國際專利申請號PCT/US20/19149，藉由引述而併入本文。儘管已參考特定具體實施例而描述本發明，應理解於不脫離本發明的精神下可進行修改。意圖使此種修改落入所附申請專利範圍的範疇內。
無。
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無。

Claims (29)

  1. 一種有用於治療人類患者的成年發病神經退化性疾病之治療方案，其中該方案包含投予具有AAV1殼體及包裝於該殼體中之載體基因體的重組腺相關病毒(AAV)載體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體 (GRN)編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，該投予包含單次劑量之腦大池內(ICM)注射，該單次劑量包含： (i)   約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量； (ii)  約1.1 x 10 11GC/每克腦質量； (iii) 約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或 (iv)  約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
  2. 如請求項1之方案，其中該顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或2之方案，其中該載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。
  4. 如請求項1至3中任一項之方案，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：24。
  5. 如請求項1至4中任一項之方案，其中該患者已被鑑定為患有 GRN單套缺失及/或額顳葉失智症(FTD)。
  6. 如請求項1至5中任一項之方案，其中該患者年齡至少35歲。
  7. 如請求項1至6中任一項之方案，其中該患者的CSF中具有低濃度的顆粒蛋白前體。
  8. 如請求項7之方案，其中該患者的CSF中具有比正常水準之50%低的顆粒蛋白前體濃度。
  9. 如請求項7之方案，其中該患者的CSF中具有比正常水準之30%低的顆粒蛋白前體濃度。
  10. 如請求項1至9中任一項之方案，其進一步包含檢測CSF、血清及/或血漿中的顆粒蛋白前體水準。
  11. 如請求項1至10中任一項之方案，其進一步包含測量： i)    神經纖維絲輕鏈(NfL)、總tau(T-tau)及磷酸化tau(P-tau)中之一種或多種的CSF水準； ii)   評估視網膜脂褐質； iii)  進行MRI以追蹤腦體積、白質完整性、以及中額葉皮質及頂葉區域的厚度中之一種或多種的變化； iv)   進行FDG PET以評估額葉及/或顳葉中的低代謝；及/或 v)    測量EEG/誘發反應電位以評估疾病相關變化的減緩。
  12. 如請求項1至11中任一項之方案，其中該單次劑量足以在以下任何一種或多種組織類型中提供10 3GC/μg DNA：額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質、枕葉皮質、延髓、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、頸背根神經節、胸背根神經節、腰背根神經節及三叉神經節。
  13. 如請求項1至12中任一項之方案，其中該單次劑量足以在以下任何一種或多種組織類型中提供10 4GC/μg DNA：額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質、枕葉皮質、延髓、小腦、頸脊髓、胸脊髓、腰脊髓、頸背根神經節、胸背根神經節、腰背根神經節及三叉神經節。
  14. 一種醫藥組成物，其包含含有AAV1殼體及包裝於該殼體中之載體基因體的重組AAV載體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列，其中該組成物被調配用於腦大池內(ICM)注射至有需要的人類患者以投予以下劑量： (i)   約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量； (ii)  約1.1 x 10 11GC/每克腦質量； (iii) 約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或 (iv)  約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
  15. 如請求項14之醫藥組成物，其中該顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。
  16. 如請求項14或15之醫藥組成物，其中該載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。
  17. 如請求項14至16中任一項之醫藥組成物，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：24。
  18. 一種單位劑型的醫藥組成物，其包含： 含約1.44 x 10 13至約4.33 x 10 14GC的重組AAV載體之緩衝液， 其中該重組AAV包含AAV1殼體及包裝於該殼體中之載體基因體，該載體基因體包含AAV反向末端重複(ITR)、顆粒蛋白前體編碼序列及引導顆粒蛋白前體在目標細胞中表現的調節序列。
  19. 如請求項18之醫藥組成物，其中該顆粒蛋白前體編碼序列為SEQ ID NO：3或與SEQ ID NO：3共有至少95%同一性的序列，該序列編碼SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。
  20. 如請求項18或19之醫藥組成物，其中該載體基因體進一步包含CB7啟動子、嵌合內含子及兔β球蛋白poly A。
  21. 如請求項18至20中任一項之醫藥組成物，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：24。
  22. 如請求項18至21中任一項之醫藥組成物，其中該組成物被調配用於ICM注射。
  23. 如請求項18至22中任一項之醫藥組成物，其中該緩衝液包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及泊洛沙姆188(poloxamer 188)。
  24. 如請求項18至23中任一項之醫藥組成物，其中該緩衝液包含1 mM磷酸鈉、150 mM氯化鈉、3 mM氯化鉀、1.4 mM氯化鈣、0.8 mM氯化鎂及0.001%泊洛沙姆188。
  25. 如請求項18至24中任一項之醫藥組成物，其具有約3.0 mL、約4.0mL或約5.0 mL的體積。
  26. 如請求項18至25中任一項之醫藥組成物，其用於治療患有成年發病神經退化性疾病的人類患者。
  27. 如請求項26之醫藥組成物，其中該患者已被鑑定為患有 GRN單套缺失及/或額顳葉失智症(FTD)。
  28. 如請求項26或27之醫藥組成物，其中該組成物被調配以投予以下劑量： (i)   約3.3 x 10 10基因體拷貝數(GC)/每克腦質量； (ii)  約1.1 x 10 11GC/每克腦質量； (iii) 約2.2 x 10 11GC/每克腦質量；或 (iv)  約3.3 x 10 11GC/每克腦質量。
  29. 一種如請求項14至25中任一項之醫藥組成物用於製備治療成年發病神經退化性疾病之醫藥品的用途。
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