TW202338086A - 有用於治療異染性白質失養症之組成物 - Google Patents

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Abstract

提供一種具有AAVhu68殼體及載體基因體之重組腺相關病毒(rAAV)，該載體基因體包含編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A(ARSA)之核酸序列。亦提供一種有用於生產rAAV之生產系統；一種包含rAAV之醫藥組成物；及一種經由投予有效量之rAAV至需要之對象而治療具有異染性白質失養症之對象、或改善異染性白質失養症之症狀、或延遲異染性白質失養症之進展之方法。

Description

有用於治療異染性白質失養症之組成物
在此提出的電子序列表名稱為「UPN-22-9955TW.xml」(台灣申請案序列表的中文本檔案名稱：PD1227707_Sequence.xml；外文本：PD1227707_Foreign Sequence.xml)，大小為113,892位元組，創建於2023年1月6日，該電子序列表的內容(例如，其中的序列及文字)藉由引用而完整併入本文中。
本案係關於有用於治療異染性白質失養症之組成物。
異染性白質失養症(Metachromatic Leukodystrophy，MLD)為單基因體染色體隱性神經鞘脂質貯積症，由編碼溶酶體酶ARSA的基因中的突變所引起(Von Figura et al., 2001；Gieselmann and Krageloh-Mann, 2010)。ARSA缺乏會導致其天然受質的蓄積，該天然受質為硫酸化的半乳糖神經鞘脂質(半乳糖苷基神經醯胺-3-O-硫酸酯及半乳糖苷基神經鞘胺醇-3-O-硫酸酯)，通常稱為髓硫脂類(sulfatides)。除了周圍神經系統(PNS)中的許旺氏細胞(Schwann cell)及巨噬細胞之外，髓硫脂類還蓄積於中樞神經系統(CNS)中的寡樹突細胞、小神經膠質細胞及某些類型的神經元的溶酶體內(Peng and Suzuki, 1987)。儘管主要影響PNS及CNS，但髓硫脂貯積亦發生於內臟器官；最顯著為腎臟、肝臟(Toda et al., 1990)、及膽囊(Rodriguez-Waitkus et al., 2011；McFadden and Ranganathan, 2015)。
MLD病患(即，在對偶基因兩者上帶有突變的病患)一般具有的ARSA酶活性在基於合成受質的分析中為對照值的0–10%。具有單個突變的ARSA對偶基因及一個正常對偶基因的帶有ARSA突變者，於臨床上不受影響且通常具有大約為對照值的10%的ARSA酶活性，而具有假性缺乏(pseudodeficiency)(PD，ARSA缺乏的另一種遺傳上不同的形式)對偶基因的無症狀個體具有約為健康對照的10-20%之ARSA酶活性(Gomez-Ospina, 2017)。臨床上，可基於跨越疾病嚴重度的廣連續範圍的症狀發作年齡而區分MLD的三種形式：快速進展的重度嬰兒晚期(late infantile)型、少年(juvenile)型、及遲發性緩慢進展的成年型，分別佔MLD診斷的50-60%、20-30%及15-20%(Gomez-Ospina, 2017、Wang et al., 2011)。嬰兒MLD被認為是一種孤兒疾病。嬰兒晚期MLD於30個月齡之前發病，為該疾病的最嚴重的形式。嬰兒晚期型具有統一的臨床表現及快速進展、可預測的病程。少年MLD的特徵係發病年齡介於30個月至16歲之間，中位發病年齡取決於研究而為6歲2個月(Kehrer et al., 2011a)至10歲(Mahmood et al., 2010)。為了更佳地將臨床表型(phenotype)特徵化，已描述少年MLD病患之子集，稱為少年早期(early juvenile)MLD，其具有臨床發病年齡≤6歲，且與具有嬰兒晚期MLD的兒童相比，具有相似的初始疾病發展，儘管沒那麼快速(Biffi et al., 2008；Chen et al., 2016；Sessa et al., 2016)。少年早期及嬰兒晚期表型統稱為早發性MLD(Sessa et al., 2016)。於少年晚期MLD病患(即症狀發作於7–16歲之間的病患)中，通常首先出現行為問題、注意力不足或認知衰退，有時伴隨步態障礙。
沒有被核准的用於MLD的治癒或改善病程進展的療法(disease-modifying therapy)。由於MLD係由有缺陷的ARSA引起的，因此各種研究途徑針對藉由替代CNS之受影響的神經組織中的功能性ARSA來矯正生化缺陷。酶替代療法(Enzyme replacement therapy，ERT)及造血幹細胞移植(HSCT)依賴於提供正常的酶至缺乏ARSA的細胞，而基因療法途徑則基於野生型ARSA於不同細胞類型中的過度表現(Patil and Maegawa, 2013)。使用臍帶血(UCB)、同種異體的周邊血液幹細胞、或同種異體的骨髓之造血幹細胞移植(HSCT)的功效取決於MLD表型及相對於病患疾病狀態的介入時機(Patil and Maegawa, 2013；van Rappard et al., 2015)。骨髓移植(BMT)需要有可使用的人類白血球抗原匹配的兄弟姊妹供體以得到最佳結果(Boucher et al., 2015)，且帶有移植及調理相關併發症(transplant- and conditioning-related complications)的風險，諸如移植物抗宿主病(GvHD)、感染及死亡。臍帶血(UCB)移植提供BMT替代方案，具有下列優點：較快的可用性、較低的GvHD風險、較低的死亡率、較高的全供體嵌合率、及較佳的酶缺陷矯正(Batzios and Zafeiriou, 2012；Martin et al., 2013)。然而，BMT於歐洲並非廣泛可取得。腦植入緩慢，通常需數月才能使細胞植入、移行至CNS、分化並恢復酶水準(enzyme level)。再者，以HSCT達到的生理上的酶水準可能不足以矯正整個CNS的不足。此可解釋為什麼移植對快速進展的早發性MLD無效，且即使於症狀發生之前進行，亦可能無法矯正或穩定疾病的所有態樣(de Hosson et al., 2011；Martin et al., 2013；Boucher et al., 2015)。
如此，仍有對於可停止或預防此等病患中疾病進展的速效性(fast-onset)療法的實質未滿足需求。
除了HSCT之外，亦存在其它各種基於細胞的途徑，此等途徑(過度)表現ARSA並將酶遞送至受影響的細胞及治療MLD的神經學表現，包括經微膠囊化的重組細胞、寡樹突細胞及神經的前驅細胞以及胚胎幹細胞。此等細胞療法於動物模式中已顯示相當的髓硫脂貯積清除率(Patil and Maegawa, 2013)，但尚未於人類測試。
已嘗試離體慢病毒基因療法(ex vivo lentiviral gene therapy)，其以編碼人類ARSA的慢病毒載體將自體CD34+細胞轉導並對病患重新投予經過基因矯正的細胞，藉此組合造血幹細胞移植與基因療法(HSC-GT)(Biffi et al., 2013)。儘管此療法對於(在罹患疾病的年長兄弟姊妹的診斷後)症狀發生前的階段所鑑別的病患是有希望的，但尚未顯示對已有症狀的病患有效。不幸地，因為新生兒篩檢尚非可行，而大多數新的MLD診斷係於症狀發作後進行，使得對於許多MLD病患，其為不太可能的治療選擇。此外，有骨髓清除性調理療法(myeloablative conditioning regimen)固有的風險及有與此等整合載體相關的插入誘變的風險。
NHP中進行的藥理毒理學研究證實，由在注射部位周圍的腦發炎(腦炎)所造成之顯著的劑量限制性毒性(Zerah et al., 2015)。正在進行1/2期臨床研究以評估AAVrh10媒介的ARSA基因轉移於患有早發性MLD的兒童的腦中的安全性及功效(NCT01801709)(Aubourg, 2016)，同樣涉及在腦的白質中的12個部位的腦內載體投予(Zerah et al., 2015)。除了以摘要形式之外，該試驗的結果尚未公開，初步報告暗示於預防發病或停止疾病進展上缺乏功效(Sevin et al., 2018)。該試驗的試驗委託者尚未討論缺乏功效的原因。除了AAVrh10媒介的基因療法之外，腦內遞送的慢病毒基因療法亦招募了患有任何形式之MLD的病患(NCT03725670)。
酶替代療法(ERT)現為數種溶酶體貯積症(Lysosomal Storage Disease，LSD)的標準照護(SOC)(Sands, 2014)且依賴於細胞經由甘露糖-6-磷酸受體攝入所輸注的酶的能力(Ghosh et al., 2003)。於MLD，ERT減少Arsa -/-小鼠之腎臟、周圍神經、及CNS的髓硫脂貯積(Matzner et al., 2005)。在對人類ARSA具有免疫耐受性及超乎尋常的髓硫脂合成的加重MLD小鼠模式中，僅於早期時間點治療的小鼠中觀察到MLD症狀的改善及髓硫脂貯積的減少，暗示IV投予ERT可能不適用於具晚期症狀的病患(Matthes et al., 2012)。在相同模式中，連續IT輸注重組ARSA以繞過BBB(Stroobants et al., 2011)導致髓硫脂貯積的完全逆轉及CNS功能異常的矯正，而於小鼠的其它非臨床研究中則導致降低髓硫脂貯積、及改善功能的結果(Matzner et al., 2009；Piguet et al., 2012)。然而，於人類，以ERT進行的代謝矯正的程度不可能充份且即時地阻止於早發性MLD中發生的快速大腦脫髓鞘(cerebral demyelination)(Rosenberg et al., 2016)。由於BBB限制大多數大蛋白質進入CNS，因此咸信ERT可能僅在直接遞送至CNS時才起作用(Abbott, 2013)，及半衰期短將需要頻繁投予。此假設於ERT臨床試驗中得到證實，該試驗試圖通過頻繁的高劑量IV投予(NCT00681811)或IT注射(Giugliani et al., 2018)克服此等限制。然而，連同IT投予的ERT在早發性及少年晚期MLD(NCT01510028)，以IV投予的ERT的嬰兒晚期MLD病患的結果令人失望(NCT00418561)。
基於小分子的治療可有潛力克服對於目前MLD的療法的限制(例如，藉由穿過BBB)，且亦可提出該疾病的不同致病機制。殺鼠靈(Warfarin)(可邁丁(Coumadin))為一種抗凝血劑，已在嬰兒晚期MLD病患的一小的同齡群(cohort)中作為受質-還原劑進行測試。對尿中的髓硫脂水準或腦生物標記N-乙醯天冬胺酸(N-acetylaspartate)及肌醇水準無有益影響(Patil and Maegawa, 2013)。
HSCT及HSC-GT的有限獲益、受限族群、短治療窗口(therapeutic window)以及相關的風險，結合以其它研究途徑獲得的整體令人失望的非臨床結果，表示對於其它可行的治療選擇之顯著未滿足的臨床需求，尤其對於早發性MLD病患。
所期望者為一種用於治療與異常ARSA基因及/或異染性白質失養症相關的病況的替代療法。
本文提供一種治療性的、重組的、及複製缺陷的(replication-defective)腺相關病毒(rAAV)，其有用於在需要的對象中治療與芳基硫酸酯酶A(arylsulfatase A)基因(ARSA)突變相關的疾病(例如，異染性白質失養症，即MLD或ARSA假性缺乏)。理想地，rAAV為複製缺陷的且帶有載體基因體，該載體基因體包含反向末端重複序列(ITR)、及編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A(hARSA)的核酸序列，該編碼功能性hARSA的核酸序列係在引導hARSA於目標細胞中表現的調節序列的控制下。於某些具體實施例，rAAV進一步包含AAVhu68殼體，載體基因體被包裝於其中。於某些具體實施例，載體基因體由於其未含有AAVhu68基因體序列，對AAVhu68殼體係完全外源的。
在某些具體實施例中，提供用於治療異染性白質失養症或與芳基硫酸酯酶A (ARSA)基因突變相關之疾病的醫藥組成物。該組成物可包含重組腺相關病毒(rAAV)及至少一種水性緩衝液、至少一種載劑、至少一種賦形劑及/或至少一種防腐劑，該rAAV包含AAVhu68殼體及載體基因體，該載體基因體包含：5’ AAV反向末端重複序列(ITR)、含有CMV IE強化子及CB啟動子之CB7啟動子、及可操作地連接至調節序列的編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A (hARSA)之核酸序列、polyA訊息、及3’ AAV ITR，該調節序列包含引導hARSA表現之CB7啟動子，其中該hARSA編碼序列包含SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 1至nt 1521的序列、或與編碼功能性hARSA之序列至少95%至99.9%相同之序列；該組成物可經由鞘內投予以單一治療劑量遞送。在某些具體實施例中，調節元件進一步包含Kozak序列、內含子、另外的強化子、及/或TATA訊息中的一種或多種。在某些具體實施例中，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。在某些具體實施例中，載體基因體包含SEQ ID NO：5之nt 1至nt 3883的序列。在某些具體實施例中，AAVhu68殼體係由編碼SEQ ID NO：7之胺基酸序列的序列所產生。在某些具體實施例中，組成物包含：人工腦脊髓液，其包含緩衝食鹽水、及鈉、鈣、鎂、鉀中的一種或多種或者其混合物；及界面活性劑。在某些具體實施例中，組成物進一步包含至少一種界面活性劑，可選擇地以醫藥組成物之0.0005%至約0.001%存在。在某些具體實施例中，組成物之pH範圍為6.5至8.5。在某些具體實施例中，組成物適於腦大池內注射(ICM)或腦室內投予。在某些具體實施例中，單一劑量包含3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量至3.5 x 10 11GC/公克腦質量。在某些具體實施例中，劑量為：(a) 約3.3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量；(b)約1.1 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量；或(c)約3.3 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量。
在某些具體實施例中，提供rAAV.hARSA在製造用於治療性治療異染性白質失養症或與芳基硫酸酯酶A (ARSA)基因突變相關之疾病的藥物的用途。該藥物可經由鞘內投予包含3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量至3.5 x 10 11GC/公克腦質量之單一劑量遞送至病患。在某些具體實施例中，劑量為：(a)約3.3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量；(b)約1.1 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量；或(c)約3.3 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量。
在某些具體實施例中，提供一種治療患有異染性白質失養症或與芳基硫酸酯酶A (ARSA)基因突變相關疾病之對象的方法。該方法包含藉由ICM注射投予單一劑量之重組AAV至該對象，其中該重組AAV包含包裝於其中之AAVhu68殼體及載體基因體，該載體基因體包含AAV ITR、包含SEQ ID NO：1之hARSA編碼序列或與編碼功能性hARSA之序列至少95%相同的序列、及引導功能性hARSA在目標細胞中之表現的調節序列，其中該單一劑量為3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量至3.5 x 10 11GC/公克腦質量，或可選擇地，(i)約3.3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量；(ii)約1.1 x 10 11GC/公克腦質量；或(iii)約3.3 x 10 11GC/公克腦質量。
由下列發明之詳細說明，本發明之此等及其它態樣將顯而易見。
本文提供用於治療由芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因的突變及/或功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準(例如，異染性白質失養症(MLD))所引起的疾病之組成物及方法。於某些具體實施例，亦提供用於治療由ARSA基因的突變及/或功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病或症狀之組成物及方法。將有效量之具有AAVhu68殼體與包裝在其中的編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A(hARSA)蛋白質的載體基因體之重組腺相關病毒(rAAV)遞送至需要的對象。理想地，此rAAV係以水性緩衝液調配。於某些具體實施例，此懸浮液適合於鞘內注射。於某些具體實施例，該rAAV載體被稱為AAVhu68.hARSAco，其中hARSA編碼序列為一工程化的hARSA編碼序列(稱為「hARSAco」或「hARSA」，除非特別指明，例如，SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 55至nt 1521、SEQ ID NO：3、或與其至少約95%至約99.9%相同的序列)。於某些具體實施例，hARSAco為SEQ ID NO：1。於某些具體實施例，hARSAco為SEQ ID NO：3。於某些具體實施例，rAAV載體被稱為AAVhu68.CB7.hARSAco，其中工程化的hARSA編碼序列係於調節序列的控制下，該調節序列包括CB7啟動子。如本文所使用，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(包括C4強化子)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、可選擇的內含子及可選擇的連接這些元件的間隔子序列。參見例如包含具有SEQ ID NO：16序列之CB7的啟動子。在某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、內含子(其包含雞β-肌動蛋白內含子與兔β-球蛋白剪接供體(即，嵌合內含子))、及連接雜合啟動子元件的可選擇的間隔子序列。在某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(SEQ ID NO：19)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子(SEQ ID NO：18)、可選擇的內含子(SEQ ID NO：17)、及連接雜合啟動子元件的可選擇的間隔子序列。在某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件係指人類巨細胞病毒(CMV)立即早期(IE)強化子(SEQ ID NO：31)、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子(SEQ ID NO：32)、可選擇的嵌合內含子(SEQ ID NO：33)、及連接雜合啟動子元件的可選擇的間隔子序列。在某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件包含SEQ ID NO：29之核酸序列。在某些具體實施例中，CB7啟動子或啟動子元件包含SEQ ID NO：30之核酸序列。較佳地，間隔子序列為非編碼的，且在某些具體實施例中，可具有不同的長度。在某些具體實施例中，組合物經鞘內遞送。在某些具體實施例中，鞘內投予為腦大池內注射(ICM)。
編碼演化支F腺相關病毒(AAV)的殼體的核酸序列，在本文中稱為AAVhu68，被用於產生AAVhu68殼體及攜帶載體基因體的重組AAV(rAAV)。WO 2018/160582及本詳細描述中提供與AAVhu68相關的其它詳細細節。本文所述的AAVhu68載體非常適合用於將包含工程化的hARSA編碼序列的載體基因體遞送至中樞神經系統(CNS)及周圍神經系統(PNS)中的細胞，中樞神經系統包括腦、海馬迴、運動皮質、小腦及運動神經元，周圍神經系統包括腦及脊髓以外的神經及神經節。此等載體可用於靶向CNS及/或PNS中的其它細胞以及某些其它組織及細胞，例如腎臟或肝臟或膽囊。 I. 芳基硫酸酯酶 A(hARSA)
芳基硫酸酯酶A(ARSA)具有水解腦苷脂硫酸酯的酶活性(即以下反應：腦苷脂3-硫酸酯+H 2O=腦苷脂+硫酸酯)。已鑑定出人類ARSA(hARSA)蛋白質(UniProtKB-P15289，ARSA_HUMAN)的兩種同工型：P51608-1，SEQ ID NO：2；及P51608-2，SEQ ID NO：15。於整個說明書，除非另有指明，否則所述ARSA為hARSA。
如本文所使用，功能性hARSA蛋白係指同功型、天然變異體、變異體、多形體、或截斷的hARSA蛋白，其具有野生型hARSA蛋白(例如，P51608-1，SEQ ID NO：2；或P51608-2，SEQ ID NO：15)之至少約10%之酵素活性(即，酶活性)。參見OMIM # 607574 (omim.org/entry/607574)、genecards.org/cgi-bin/carddisp. pl?gene=ARSA及uniprot.org/uniprot/P15289，各網頁藉由引用而完整併入本文。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白具有野生型hARSA蛋白(例如，P51608-1，SEQ ID NO：2；或P51608-2，SEQ ID NO：15)之至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或以上之酶活性。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白具有野生型hARSA蛋白(例如，P51608-1，SEQ ID NO：2；或P51608-2，SEQ ID NO：15)之約10%至約15%、約10%至約20%、約10%至約25%、約10%至約30%、約10%至約50%、約10%至約75%、約10%至約90%、約10%至約100%、約10%至約3倍、約15%至約20%、約15%至約25%、約15%至約30%、約15%至約50%、約15%至約75%、約15%至約90%、約15%至約100%、約15%至約3倍、約20%至約25%、約20%至約30%、約20%至約50%、約20%至約75%、約20%至約90%、約20%至約100%、約20%至約3倍、約25%至約30%、約25%至約50%、約25%至約75%、約25%至約90%、約25%至約100%、約25%至約3倍、約50%至約75%、約50%至約90%、約50%至約100%、約50%至約3倍、約75%至約90%、約75%至約100%、或約75%至約3倍之酶活性。測量hARSA酶活性之方法(例如，經由基於合成受質的測定及/或經由髓硫脂負荷測定)可見於實施例以及各種公開文獻，諸如Kreysing et al., High residual arylsulfatase A (ARSA) activity in a patient with late-infantile metachromatic leukodystrophy. Am J Hum Genet. 1993 Aug;53(2):339-46.；Lee-Vaupel M and Conzelmann E. A simple chromogenic assay for arylsulfatase A. Clin Chim Acta. 1987 Apr 30;164(2):171-80；Böhringer et al., Enzymatic characterization of novel arylsulfatase A variants using human arylsulfatase A-deficient immortalized mesenchymal stromal cells. Hum Mutat. 2017 Nov;38(11):1511-1520. doi: 10.1002/humu. 23306. Epub 2017 Sep 6；及Francesco Morena, et al., A new analytical bench assay for the determination of arylsulfatase a activity toward galactosyl-3-sulfate ceramide: implication for metachromatic leukodystrophy diagnosis. Anal Chem. 2014 Jan 7;86(1):473-81. doi: 10.1021/ac4023555. Epub 2013 Dec 11。
於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含(i)訊息肽、及(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 19至aa 507之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含(i)訊息肽、及(ii) SEQ ID NO：15之胺基酸序列(即，SEQ ID NO：2之aa 85至aa 507)或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含(i)訊息肽、(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 19至aa 444之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列、及(iii) SEQ ID NO：2之aa 448至aa 507之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於另一具體實施例，(ii)之胺基酸序列可藉由雙硫鍵而被連接至(iii)之胺基酸序列。可利用其它化學鍵，例如，共價鍵、及非共價鍵(包括氫鍵結、離子鍵結、疏水鍵結、及凡得瓦鍵結)。於再另一具體實施例，(ii)及(iii)之胺基酸序列間的連接係藉由所述鍵結之組合所形成。於另一具體實施例，(ii)及(iii)之胺基酸序列間的連接為肽連接子(參見例如parts.igem.org/protein_domains/linker)。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含(i)訊息肽、(ii)SEQ ID NO：2之胺基酸(aa)85至aa 444之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列、及(iii) SEQ ID NO：2之aa 448至aa 507之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於另一具體實施例，(ii)之胺基酸序列可藉由雙硫鍵而被連接至(iii)之胺基酸序列。可利用其它化學鍵，例如，共價鍵、及非共價鍵(包括氫鍵結、離子鍵結、疏水鍵結、及凡得瓦鍵結)。於再另一具體實施例，(ii)及(iii)之胺基酸序列間的連接係藉由所述鍵結的組合而形成。於另一具體實施例，(ii)及(iii)之胺基酸序列間的連接為肽連接子(參見例如parts.igem.org/protein_domains/-linker)。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含(i)訊息肽、及(ii) SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 23至aa 348之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含(i)訊息肽、及(ii) SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 19至aa 448之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含(i)訊息肽、及(ii) SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 448至aa 507之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於某些具體實施例，具有特定同一性之功能性hARSA蛋白具有：基於SEQ ID NO：2的編號之aa 85至aa 507以外的修飾；及/或基於SEQ ID NO：2的編號之aa 29、69、123、125、150、229、281、282任一者以上之外的修飾；及/或任一hARSA保留的功能域(domain)(例如，具有Pfam：PF00884之硫酸酯酶功能域)之外的修飾；及/或基於SEQ ID NO：2的編號之aa 19至aa 444之外的修飾；及/或基於SEQ ID NO：2的編號之aa 448至aa 507之外的修飾；及/或基於SEQ ID NO：2的編號之aa 23至aa 348之外的修飾；或其的任何組合。參見例如von Bülow R et al, Crystal structure of an enzyme-substrate complex provides insight into the interaction between human arylsulfatase A and its substrates during catalysis, J Mol Biol. 2001 Jan 12;305(2):269-77。
於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列或與其至少約90%(例如，至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%)相同之胺基酸序列。
如本文所使用，訊息肽(有時稱為訊息序列、靶向訊息、定位訊息、定位序列、輸送肽、前導序列或前導肽)為短的肽(通常為15-30個胺基酸長)，存在於大多數預定走向分泌路徑之新合成蛋白質的N端(Blobel G, Dobberstein B (Dec 1975). "Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma". J Cell Biol. 67 (3): 835–51)。此等蛋白質包括彼等存在於某些胞器(內質網、高基氏體或胞內體)內、自細胞分泌的、或插入至大部份細胞膜中者。於某些具體實施例，訊息肽具有SEQ ID NO：2之aa 1至aa 18之胺基酸序列或SEQ ID NO：4之aa 1至aa 20之胺基酸序列。於某些具體實施例，訊息肽係來自由CNS細胞(例如，神經元)、PNS細胞、或另外的細胞(諸如腎臟細胞、或肝臟細胞)分泌的另外的蛋白質。訊息肽較佳為人類來源的或人類訊息肽之衍生物，且為約15至約30個胺基酸長，較佳為約17至25個胺基酸長，或約18個胺基酸長。於某些具體實施例，訊息肽為天然訊息肽(SEQ ID NO：2之胺基酸1至18)。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含替換天然訊息肽之外源的前導序列。於另一具體實施例，訊息肽可為來自人類IL2或突變的訊息肽。於另一具體實施例，人類serpinF1分泌訊息可使用作為訊息肽。當提及功能性hARSA蛋白時，此種包含外源的訊息肽及hARSA之成熟部分(例如，SEQ ID NO：2之aa 19至507、SEQ ID NO：2之aa 19至aa 444、SEQ ID NO：2之aa 85至aa 507、SEQ ID NO：2之aa 23至aa 348、或SEQ ID NO：2之aa 448至507)的嵌合hARSA蛋白被包括於本文所述的各種具體實施例。
本文提供一種編碼功能性hARSA蛋白之核酸序列，稱為hARSA編碼序列或ARSA編碼序列或hARSA或ARSA。於某些具體實施例，hARSA編碼序列被修飾或工程化(hARSA或hARSAco)。於某些具體實施例，hARSA編碼序列具有SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 55至nt 1521之序列或與其至少95%至99.9%相同之序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1之nt 55至nt 1521或與其至少約70%(例如，至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.9%)相同之核酸序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或與其至少95%至99.9%相同之序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或與其至少約70%(例如，至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.9%)相同之核酸序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：3或與其至少95%至99.9%相同之序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：3或與其至少約70%(例如，至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、或至少約99.9%)相同之核酸序列。
hARSA之轉錄變異體(其亦為hARSA編碼序列)可見於NCBI參考序列NM_000487.5、NM_001085425.2、NM_001085426.2、NM_001085427.2、NM_001085428.2、NM_001362782.1、AB448736.1、AK092752.1、AK098659.1、AK301098.1、AK310564.1、AK315011.1、BC014210.2、BI770997.1、BM818814.1、BP306351.1、BQ184813.1、BU632196.1、BX648618.1、CA423492.1、CN409235.1、CR456383.1、DA844740.1、DB028013.1、GQ891416.1、KU177918.1、KU177919.1、及X52151.1。各個NCBI參考序列藉由引用而完整併入本文。於某些具體實施例，經修飾或工程化的hARSA編碼序列與NCBI參考序列之一者共有少於約70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%同一性。於某些具體實施例，經修飾或工程化的hARSA編碼序列與NCBI參考序列之一者共有約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.9%同一性。
如本文所述，「核酸」或「核苷酸」可為RNA、DNA、或其修飾物，且可為單股或雙股，且可選自例如包括下列之群組：編碼感興趣的蛋白質之核酸、寡核苷酸、核酸類似物，例如肽-核酸(PNA)、假互補PNA(pc-PNA)、鎖核酸(LNA)等。此種核酸序列包括例如但不限於編碼蛋白質之核酸序列，例如作為轉錄抑制蛋白、反義分子、核糖核酸酵素、小抑制性核酸序列而作用者，例如但不限於RNAi、shRNAi、siRNA、micro RNAi(mRNAi)、反義寡核苷酸等。
於核酸序列之上下文中，術語「百分比(%)同一性」、「序列同一性」、「序列同一性百分比」、或「百分比相同的」係指兩個序列中對應比對時相同的殘基。序列同一性比較之長度期望可為整個基因體之全長、基因編碼序列之全長、或至少約500至5000個核苷酸之片段。然而，亦期望可為較小片段中的同一性，例如，至少約9個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36或以上之核苷酸。
可容易地確定蛋白質、多肽、約32個胺基酸、約330個胺基酸或其的肽片段或對應的核酸序列編碼序列的整個全長的胺基酸序列的同一性百分比。適合的胺基酸片段可為至少約8個胺基酸長，且可為多至約700個胺基酸。一般而言，當提及兩個不同序列間的「同一性」、「同源性」或「相似性」時，參考「比對」序列來確定「同一性」、「同源性」或「相似性」。「比對」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常含有缺失或增加的鹼基或胺基酸的矯正。
使用多種公開或市售的多序列比對程式中的任何一種進行比對。序列比對程式可用於胺基酸序列，例如，「Clustal X」、「Clustal Omega」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。一般而言，儘管本技術領域中具有通常知識者可依需要更改此等設定，但是此等程式中的任何一個可於預設值設定下使用。或者，本技術領域中具有通常知識者可利用至少提供與參考的演算法及程式所提供的同一性或比對水準之另一種演算法或電腦程式。參見例如J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999)。
多序列比對程式亦可用於核酸序列。此種程式之例包括「Clustal W」、「Clustal Omega」、「CAP Sequence Assembly」、「BLAST」、「MAP」、及「MEME」，此等程式可通過網際網路上的網站伺服器進行存取。此種程式的其它來源為本技術領域中具有通常知識者已知的。或者，亦可使用Vector NTI應用程式。亦有許多本技術領域中已知可用於測量核苷酸序列同一性的演算法，包括上述程式中所含者。作為另一例，可使用GCG版本6.1的程式Fasta™，而比較多核苷酸序列。Fasta™提供查詢序列及檢索序列之間最佳重疊區域的比對及序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用Fasta™及其如GCG版本6.1中所提供的預設參數(字長為6，評分矩陣的NOPAM因子)而確定，藉由引用併入本文。 II. 異染性白質失養症 (MLD)
本文提供rAAV、載體、方法及組成物，有用於治療由硫酸酯酶A(ARSA)基因之突變及/或功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病或異常病況，本文稱為「疾病」，例如，異染性白質失養症(MLD)。參見例如omim.org/entry/250100。
異染性白質失養症(MLD)可被分類為下列類型：早發性MLD，其包括嬰兒MLD(一般開始於等於或早於30個月齡)及少年早期MLD(通常開始於30個月齡至6歲之間(包括6歲))；少年MLD，其包括少年早期MLD及少年晚期MLD(通常開始於7歲至16歲之間，包括16歲)；及成年MLD(具有晚於16歲之發病)。嬰兒晚期MLD病患具有破壞性的病程，在運動及認知障礙方面均呈現同質性的快速且可預測的衰退(Kehrer et al., 2011a；Sessa et al., 2016)。此等兒童中的大多數在5歲之前死亡，98名病患的平均存活為4.2歲，5年存活率為25%。具有少年早期MLD(症狀發作在30個月齡至6歲之間)的兒童的表型與具有嬰兒晚期MLD的兒童的表型非常相似，儘管少年早期MLD病患可能具有較不快速的初始疾病發展(Biffi et al., 2008；Chen et al., 2016；Sessa et al., 2016)。然而，一旦出現明顯症狀，尤其是當少年早期MLD病患失去獨立行走的能力時，他們的病程可像嬰兒晚期MLD病患一樣快速惡化。此等兒童亦具有與嬰兒晚期MLD病患相似的徵象及症狀，具有首先發展的神經肌肉困難，其係單獨或與行為及認知症狀併發(Groeschel et al., 2011；Kehrer et al., 2014)。少年早期及嬰兒晚期表型整體稱為早發性MLD(Sessa et al., 2016)。
於某些具體實施例，本文所述rAAV、載體、組成物及方法有用於治療MLD、早發性MLD、嬰兒MLD、嬰兒晚期MLD、少年MLD、少年早期MLD、少年晚期MLD、或成年MLD。於某些具體實施例，本文所述rAAV、載體、組成物及方法可改善對象的疾病症狀及/或延遲疾病的進展。於某些具體實施例，本文所述rAAV、載體、組成物及方法有用於治療嬰兒晚期及少年早期MLD。
於某些具體實施例，本文所述rAAV、載體、方法或組成物之對象或病患具有MLD、或被診斷為MLD。於某些具體實施例，本文所述rAAV、載體、方法或組成物之對象或病患被診斷為嬰兒晚期MLD或少年早期MLD。MLD的診斷可通過基因及生化測試進行。基因測試可鑑別ARSA中的突變，而生化測試則包括硫酸酯酶的酶活性及尿液中的髓硫脂排泄。磁振造影(MRI)可確認MLD的診斷。MRI顯示人腦的成像，並可顯示髓鞘質的存在與否。存在受MLD影響的個體的腦中髓鞘質喪失的典型樣式。隨著疾病的進展，成像顯示出對於腦的蓄積損傷。於年幼兒童中，最初的腦成像可能是正常的。
於某些具體實施例，本文所述rAAV、載體、方法或組成物之對象為小於18歲的人類(例如，小於約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個月大、或小於約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18歲)。另外或替代地，對象為新生兒或大於1個月大的人類(例如，大於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個月大、或大於約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18歲)。於某些具體實施例，病患為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11個月大、或約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18歲。於某些具體實施例，病患為約30個月齡至約7歲。於某些具體實施例，病患為約30個月齡至16歲、7歲至16歲、或16歲至40歲。
「病患」或「對象」於本文中互換使用，意指雄性或雌性哺乳類動物，包括人類、獸醫學或農場動物、家畜動物或寵物、及通常用於臨床研究的動物。於一具體實施例，此等rAAV、載體、方法及組成物之對象為人類病患。於一具體實施例，此等rAAV、載體、方法及組成物之對象為男性或女性人類。於某些具體實施例，此等rAAV、載體、方法及組成物之對象被診斷為異染性白質失養症及/或具有異染性白質失養症之症狀。
疾病症狀(例如，MLD症狀，與無MLD的健康對照比較)可包括但不限於下列：ARSA的濃度及/或水準及/或生物活性降低(例如，在血清或CSF中)、尿液髓硫脂類增加、CNS髓鞘化(脫髓鞘負荷及樣式)、藉由MRI測得的白質萎縮、神經元代謝物N-乙醯天冬胺酸(NAA)、肌醇(mI)、膽鹼(Cho)及/或乳酸鹽(lactate，Lac)水準異常(減少或增加)(例如，藉由質子磁振頻譜(MRS)測得)、CSF髓硫脂及溶血髓硫脂(lyso-sulfatide)水準增加、視覺誘發電位(VEP)異常、腦幹聽覺誘發反應(BAER)異常、膽囊壁增厚(例如通過超音波評估)；運動功能受損(例如，藉由異染性白質失養症的粗大動作功能分類(GMFC-MLD)或粗大動作功能評量(GMFM)測得)、藉由達成年齡、喪失年齡以及保持或獲得動作里程碑的兒童的百分比所評估的動作里程碑達成之延遲(由世界衛生組織[WHO]基準定義)、認知功能受損(例如，藉由貝萊嬰兒發展量表(Bayley Scale of Infant Development)[BSID-III]、魏氏兒童智力量表第五版(Wechsler Intelligence Scale for Children, Fifth Edition)[WISC-V]測得的總智商(Total Intelligence Quotient)[IQ]及子域智商(sub-domain IQ))、壽命延長(與病患相比)、神經學臨床檢查(NCE)之異常結果、尺神經、腓深神經、正中神經、腓腸神經之神經傳導速度(NCV)降低、藉由癲癇發作日記記錄的癲癇發作的發病年齡較早且癲癇發作的頻率較高、行為功能受損(例如，藉由文蘭適應行為量表第三版(Vineland Adaptive Behavior Scales, Third Edition)(Vineland-III)測得)、較低的藍斯基表現指數(Lansky Performance Index)及/或降低的兒童生活品質量表(Pediatric Quality of Life Inventory)(例如，PedsQL及PedsQL-IS)、及/或照護者/父母的生活品質下降。
於某些具體實施例，疾病症狀(例如，MLD症狀，與無MLD的健康對照比較)可包括異常性質(例如生物標記活性、電生理學活性、及/或成像參數)及臨床觀察(例如，粗大及精細動作功能受損、認知及語言發展受損、異常的神經學檢查所見、行為及里程碑發展受損、以及照護者/父母報告的結果及生活品質評估下降)。
該異常性質包括但不限於產生髓鞘質的寡樹突細胞及許旺氏細胞的功能障礙、周圍神經傳導異常、具有緩慢神經傳導速度(NCV)的周圍神經病變、顯示典型白質(例如，胼胝體之壓部(splenium)及頂枕白質、投射纖維、小腦白質、基底神經節、及視丘)樣式的腦磁振造影(MRI)(例如，異常白質中具有正常訊號強度帶的放射條紋的「虎斑樣式」，參見例如Gieselmann and Krageloh-Mann, 2010；Martin et al., 2012；van Rappard et al., 2015)；U型纖維侵犯及小腦改變、白質脫髓鞘、白質低密度雙側區域(尤其是額葉)、以及反映髓鞘質喪失的大腦萎縮)、腦生物標記N-乙醯天冬胺酸及肌醇的異常水準。
臨床觀察包括但不限於：表現為手腳不靈活、用腳趾行走、及頻繁跌倒的粗大動作障礙；精細動作技能；步態異常；痙攣性下肢輕癱或共濟失調性運動；神經肌肉困難；神經症狀(虛弱的徵象、發展為痙攣的協調性喪失及失禁)；低張症及深部腱反射壓抑；癲癇發作(seizure)；失智；癲癇(epilepsy)；排尿困難肌肉僵直；餵食困難；四肢疼痛；語言功能受損；認知技能受損；視覺及聽覺受損；喪失先前獲得的動作及認知里程碑；學校或工作表現衰退、注意力不集中、行為異常、精神病學症狀、智力受損、發笑失控、皮質障礙(例如失用症、失語症、失認症)、酒精或藥物使用、不良資金管理、情緒不穩定、不適當情感、及神經精神病學症狀(包括精神病、思覺失調症、妄想及幻覺)。
疾病進展係指疾病症狀之對象的發病年齡、出現的頻率、嚴重度或複發。疾病進展的延遲通常意指疾病症狀的發作年齡升高、出現頻率較低、嚴重度降低或複發較少。
如上所述，術語「增加」、「降低」、「減少」、「改善」、「提升」、「較低」、「較高」、「較少」、「較多」、「改進」、「延遲」、「損害」、「異常」、「厚的」或其任何語法變化、或表示變化的任何相似術語，意指與對應參考(例如，未治療的對照或正常情況下無MLD的對象)比較為約5倍、約2倍、約1倍、約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%、約5%的變動，除非另有指明。
本文的組成物及方法對不存在標準照護(HSCT及HSC-GT為無效)的有症狀的早發性病患提供快速作用的改善病程進展的治療(disease-modifying treatment)；及/或提供一種可保留或矯正CNS病理及周圍神經功能的療法，後者不能被HSCT矯正且導致進行性精細及粗大動作功能喪失以及呼吸衰竭；及/或提供HSC-GT的替代治療選擇，HSC-GT需要嚴格的骨髓清除性調理，僅於症狀發作之前進行才有效，且可能無法實質解決所有病患中的周圍神經病變。
於某些具體實施例，病患接受在無本文所述的rAAV、載體、組成物或方法下其不符合資格的協同療法(co-therapy)。此種協同療法可包括酶替代療法(ERT)及經由臍帶血(UCB)、同種異體的周邊血液幹細胞、或同種異體的骨髓之造血幹細胞移植(HSCT)。
可選擇地，可於需要的對象使用免疫抑制協同療法。用於此類協同療法的免疫抑制劑包括但不限於糖皮質素、類固醇、抗代謝物質、T細胞抑制劑、巨環內酯類藥物(例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物(rapalog))、以及細胞生長抑制劑，包括烷化劑、抗代謝物質、細胞毒性抗生素、抗體、或對免疫親和素(immunophilin)為活性的藥劑。免疫抑制劑可包括氮芥(nitrogen mustard)、亞硝基脲、鉑化合物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、氟尿嘧啶、放線菌素、蒽環類(anthracycline)、絲裂黴素C、博萊黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、IL-2受體(CD25)或CD3導向的抗體、抗IL-2抗體、環孢菌素(ciclosporin)、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、IFN-β、IFN-γ、類鴉片或TNF-α(腫瘤壞死因子-α)結合劑。於某些具體實施例，免疫抑制療法可於基因療法投予之前或之後的0、1、2、3、4、5、6、7日、或更多日開始。此種免疫抑制療法可涉及一、二或以上藥物(例如，糖皮質素、強體松(prednelisone)、黴酚酸啉乙酯(micophenolate mofetil，MMF)及/或西羅莫司(即，雷帕黴素))之投予。可將此種免疫抑制藥物以相同的劑量或調整的劑量而投予至需要的對象一次、兩次或更多次。此種療法可能涉及在同一天共同投予兩種或多種藥物(例如強體松、黴酚酸啉乙酯(MMF)及/或西羅莫司(即雷帕黴素))。此等藥物的一種或多種可在基因療法投予後以相同的劑量或調整的劑量繼續使用。根據需要，此種療法可持續約1週(7日)、約60日或更長時間。於某些具體實施例，選擇無他克莫司的方案。 III. 表現匣
本文提供一種亦稱為表現匣的核酸序列，其包含編碼功能性hARSA蛋白之hARSA編碼序列及於目標細胞中引導hARSA表現的調節序列。如本文所使用，「表現匣」係指包含編碼序列(例如，hARSA編碼序列)、啟動子的核酸分子，且可包括其它其之調節序列。必要的調節序列係以允許其在目標細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式，可操作地連接至hARSA編碼序列。如本文所使用，「可操作地連接」的序列包括與hARSA編碼序列鄰接的表現控制序列及反式(trans)或遠距地作用以控制hARSA編碼序列的表現控制序列兩者。此種調節序列一般包括例如啟動子、強化子、內含子、Kozak序列、多腺苷酸化序列、及TATA訊息中的一種或多種。於某些具體實施例，啟動子為雞β-肌動蛋白啟動子，具有巨細胞病毒強化子(CB7)啟動子(例如，SEQ ID NO：5之nt 198至nt 862，本文中亦稱為hSyn或Syn)。然而，於某些具體實施例，可選擇其它啟動子、或另外的啟動子。
於某些具體實施例，調節序列於目標細胞中引導hARSA表現。於某些具體實施例，目標細胞為神經系統細胞、寡樹突細胞、小神經膠質細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、於CNS中的神經元、周圍神經系統(PNS)細胞、許旺氏細胞、PNS中的巨噬細胞、或內臟器官中的細胞(例如，腎臟細胞、肝臟細胞及膽囊細胞)。於某些具體實施例，目標細胞可為中樞神經系統細胞。於某些具體實施例，目標細胞為興奮性神經元、抑制性神經元、神經膠質細胞、皮質細胞、額葉皮質細胞、大腦皮質細胞、脊髓細胞中的一或多種。於某些具體實施例，目標細胞為周圍神經系統(PNS)細胞，例如視網膜細胞。除了彼等來自神經系統的細胞之外，亦可選擇其它細胞作為目標細胞，諸如單核球、B淋巴球、T淋巴球、NK細胞、淋巴結細胞、扁桃腺細胞、骨髓間質細胞、幹細胞、骨髓幹細胞、心臟細胞、上皮細胞、食道細胞、胃細胞、胎兒腸細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝臟細胞、腎臟細胞、肺臟細胞、唾液腺細胞、甲狀腺細胞、腎上腺細胞、乳房細胞、胰臟細胞、胰島細胞、膽囊細胞、前列腺細胞、膀胱細胞、皮膚細胞、子宮細胞、子宮頸細胞、睾丸細胞、或任何其它於無MLD之對象中表現功能性hARSA蛋白之細胞。參見genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ARSA&keywords=arsa#expression。
在某些具體實施例中，調節序列包含普遍存在之啟動子。在某些具體實施例中，載體基因體(在兩側為ITR序列的表現匣內)中之調節序列在5’端包含可操作地連接至hARSA序列的CB7啟動子(CMV IE強化子(C4)+連接子序列+CB啟動子)，且在3’端包含多腺苷酸化位。在某些具體實施例中，調節元件進一步包含Kozak序列、內含子、第二或其他強化子、及TATA訊息中的至少一種或多種。
於某些具體實施例，附加或替代的啟動子序列可被包括作為表現控制序列(調節序列)之一部分，例如，位於選擇的5’ ITR序列與編碼序列之間。組成啟動子(constitutive promoter)、可調節的啟動子[參見例如WO 2011/126808及WO 2013/04943]、組織特異性啟動子、或對生理線索有反應的啟動子可用於本文所述的載體中。啟動子可選自不同來源，例如，人類巨細胞病毒(CMV)立即早期強化子/啟動子、SV40早期強化子/啟動子、JC多瘤病毒啟動子、髓鞘質鹼性蛋白質(MBP)或神經膠原纖維酸性蛋白質(GFAP)啟動子、單純疱疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(latency associated promoter，LAP)、勞氏肉瘤病毒(rouse sarcoma virus，RSV)長末端重複序列(LTR)啟動子、神經元特異性啟動子(NSE)、血小板衍生生長因子(PDGF)啟動子、hSYN、黑色素凝集激素(melanin-concentrating hormone，MCH)啟動子、CBA、基質金屬蛋白啟動子(matrix metalloprotein promoter，MPP)、及雞β-肌動蛋白啟動子。
除了啟動子之外，表現匣可含有一或多個其它適當的轉錄起始序列、轉錄終止序列、強化子序列、有效的RNA加工訊息諸如剪接(splicing)及多腺苷酸化(polyA)訊息；穩定細胞質的mRNA之序列，例如WPRE；增強轉譯效率之序列(即，Kozak共通序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當期望時，增強所編碼的產物之分泌的序列。適合的強化子之例為CMV強化子。其它適合的強化子包括彼等適合於所欲目標組織適應症者。於一具體實施例，調節序列包含一或多個表現強化子。於一具體實施例，調節序列含有二或更多個表現強化子。此等強化子可相同或可彼此不同。例如，強化子可包括CMV立即早期強化子(SEQ ID NO：19)。此強化子能夠以位置彼此相鄰的兩個拷貝的方式存在。或者，強化子的雙重拷貝可被一個或多個序列分開。於再另一具體實施例，表現匣進一步含有內含子，例如雞β-肌動蛋白內含子(SEQ ID NO：17)。於某些具體實施例，內含子為由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成的雜合內含子–嵌合內含子(CI)。其它適合的內含子包括本技術領域中已知者，例如，諸如WO 2011/126808所述者。適合的polyA序列之例包括例如兔球蛋白poly A、SV40、SV50、牛生長激素(bGH)、人類生長激素、及合成的polyA。可選擇地，可選擇一或多個序列以穩定mRNA。此種序列之一例為經修飾的WPRE序列，其可工程化在polyA序列的上游及編碼序列的下游(參見例如MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619)。於某些具體實施例，不存在WPRE序列。
可選擇地，於某些具體實施例，除了hARSA編碼序列之外，可包括另一非AAV編碼序列，例如，肽、多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它感興趣的基因產物。有用的基因產物可包括miRNA。miRNA及其它小的干擾核酸經由目標RNA轉錄本切割/降解或目標傳訊RNA(mRNA)的轉譯阻遏來調節基因表現。miRNA天然地表現，通常作為最終的19-25個非轉譯RNA產物。miRNA通過與目標mRNA的3’非轉譯區(UTR)進行序列特異性相互作用來展現其活性。此等內源性表現的miRNA形成髮夾前驅物，其隨後被加工成雙股miRNA(miRNA duplex)，並進一步加工成「成熟的」單股miRNA分子。此成熟的miRNA導引多蛋白複合體(multiprotein complex) miRISC，miRISC基於其與成熟miRNA的互補性來鑑別目標mRNA的靶位，例如於3’UTR區域。
於某些具體實施例，表現匣可進一步包含背根神經節(drg)特異性miRNA脫靶序列以調節CNS或周圍背根神經節中的表現水準。於某些具體實施例，表現匣或載體基因體於非轉譯區(UTR)3’至基因產物編碼序列中包含一個或多個miRNA標靶序列。於某些具體實施例，存在至少一種對miR-183及/或miR-182具有特異性的標靶序列。於某些具體實施例，至少兩個drg特異性miRNA標靶序列位於hARSA編碼序列的5’及3’兩者。於某些具體實施例，用於表現匣mRNA或DNA正股之至少第一及/或至少第二miRNA標靶序列的miRNA標靶序列係選自(i)AGTGAATTCTACCAGTGCCATA(miR183，SEQ ID NO：20)；(ii)AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(SEQ ID NO：21)；(iii)AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO：22)；及(iv)AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC(SEQ ID NO：23)。於某些具體實施例，構築體進一步包含至少二個縱排重複序列，該至少二個縱排重複序列包含至少第一miRNA標靶序列及至少第二miRNA標靶序列，其可相同或不同。於某些具體實施例，縱排miRNA標靶序列為連續的或被1至10個核酸的間隔子分開，其中該間隔子不為miRNA標靶序列。於某些具體實施例，位於hARSA編碼序列的3’處至少有兩個drg特異性miRNA標靶序列。於某些具體實施例，至少兩個drg特異性miRNA縱排重複序列中的第一個重複序列的起點在距hARSA編碼序列的3’端的20個核苷酸以內。於某些具體實施例，至少兩個drg特異性miRNA縱排重複序列中的第一重複序列的起點距hARSA編碼序列的3’端至少100個核苷酸。於某些具體實施例，miRNA縱排重複序列包含200至1200個核苷酸長。於某些具體實施例，位於hARSA編碼序列的5’處至少有兩個drg特異性miRNA標靶序列。於某些具體實施例，兩個或更多個連續的miRNA標靶序列為連續的且未被間隔子隔開。於某些具體實施例，兩個或更多個miRNA標靶序列被間隔子分開且各間隔子係獨立選自下列之一或多個：(A)GGAT；(B)CACGTG；或(C)GCATGC。於某些具體實施例，位於miRNA標靶序列之間的間隔子可位於第一miRNA標靶序列的3’及/或最後一個miRNA標靶序列的5’。於某些具體實施例，miRNA標靶序列之間的間隔子相同。
參見2018年12月21日申請之US專利臨時申請號62/783,956、及2019年12月20日申請之國際申請號PCT/US2019/067872，其藉由引用併入本文。於某些具體實施例，表現匣或載體基因體中未包括miR序列。 IV.  AAVhu68
與另一演化支F殼體AAV9相比，被選作AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.RBG之殼體的AAVhu68血清型具有兩個編碼的胺基酸差異，基於VP1蛋白質編號，差異在位置67及157處，如SEQ ID NO：7所示。相較之下，另一演化支F AAV (AAV9，hu31，hu31)在位置67具有Ala，在位置157具有Ala。在某些具體實施例中，AAV殼體血清型可選自AAVhu31 vp1 (SEQ ID NO：11及12)或AAVhu32 vp1 (SEQ ID NO：13及14)。參見例如WO 2022/082109，提供工程化的AAVhu68編碼序列；WO 2018/160582；WO 2019/169004；及WO 2019/168961，上述全部皆藉由引用而完整併入本文中。
AAVhu68於NHP及小鼠之神經系統中顯示轉導特徵。此包括廣泛的皮質神經元轉導(數據未顯示)及一小部分產生髓鞘質的寡樹突細胞。此外，AAVhu68轉導具有伸入PNS的軸突之運動神經元及具有伸入脊髓與周圍神經的軸突之DRG感覺神經元(數據未顯示)。在腹角的下運動神經元及DRG的感覺神經元中觀察到轉導。轉導的運動神經元具有對周圍神經有貢獻的軸突。如此，AAVhu68殼體靶向CNS及PNS中的細胞，其兩者均在MLD病患中受到影響。此外，儘管新合成的ARSA可直接從高基氏體成熟面網(trans-Golgi network)運輸到溶酶體，其亦可被分泌並經由甘露糖6-磷酸受體而被其它細胞攝入，隨後被運至溶酶體。如此，潛在的缺陷可藉由表現ARSA酶的rAAVhu68.hARSA提供給相鄰的缺少功能性酶的CNS細胞而被交叉矯正。
如本文所使用，與AAV的群組相關的術語「演化支(clade)」係指在種系發生上彼此相關的一群AAV，係如下所決定：使用近鄰相接演算法(Neighbor-Joining algorithm)，(至少1000次重複的)自我重複抽樣值至少75%及基於AAV vp1胺基酸序列比對的卜瓦松矯正距離(Poisson correction distance)測量值不超過0.05。於文獻中已描述近鄰相接演算法。參見例如M. Nei and S. Kumar, Molecular Evolution and Phylogenetics (Oxford University Press, New York (2000)。可取得可用於實現此演算法的電腦程式。例如，MEGA v2.1程式實現修飾的Nei-Gojobori法。使用此等技術及電腦程式、及AAV vp1殼體蛋白質之序列，本技術領域中具有通常知識者可容易地確定所選擇的AAV係含於本文鑑別的一個演化支中、含於另一個演化支中、或係於此等演化支之外。參見例如G Gao, et al, J Virol, 2004 Jun; 78(10): 6381-6388，其鑑別演化支A、B、C、D、E及F，並提供新穎AAV之核酸序列，GenBank登錄號AY530553至AY530629。亦參見WO 2005/033321。
於某些具體實施例，AAVhu68殼體藉由下列之一或多個而進一步被特徵化。AAVhu68殼體蛋白質包含：由編碼SEQ ID NO：7之1至736的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生的AAVhu68 vp1蛋白質、由SEQ ID NO：6所產生的vp1蛋白質、或由與SEQ ID NO：6至少70%相同且編碼SEQ ID NO：7之1至736之預測的胺基酸序列的核酸序列所產生的vp1蛋白質；由編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生的AAVhu68 vp2蛋白質、由包含SEQ ID NO：6之至少核苷酸412至2211的序列所產生的vp2蛋白質、或由與SEQ ID NO：6之至少核苷酸412至2211至少70%相同且編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸138至736之預測的胺基酸序列的核酸序列所產生的vp2蛋白質；及/或由編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列的表現所產生的AAVhu68 vp3蛋白質、由包含SEQ ID NO：6之至少核苷酸607至2211之序列所產生的vp3蛋白質、或由與SEQ ID NO：6之至少核苷酸607至2211至少70%相同且編碼SEQ ID NO：7之至少約胺基酸203至736之預測的胺基酸序列的核酸序列所產生的vp3蛋白質。在某些具體實施例中，AAVhu68殼體包含：(i) 由編碼SEQ ID NO：7之核酸序列所產生的AAVhu68 vp1蛋白質、AAVhu68 vp2蛋白質及AAVhu68 vp3蛋白質的異質族群，其中該AAVhu68vp1蛋白質基於SEQ ID NO：7之編號而包含在位置67處的麩胺酸及位置157處的纈胺酸，且該AAVhu68vp2蛋白質包含在位置157處的纈胺酸；或(ii) AAVhu68 vp1、AAVhu68 vp2及AAVhu68 vp3蛋白質之異質族群，其中該AAVhu68 vp1蛋白質為SEQ ID NO：7之胺基酸1至736 (vp1)，其基於SEQ ID NO：7中胺基酸位置而包含在位置67處之麩胺酸及在位置157處的纈胺酸，且進一步包含含修飾之胺基酸的vp1蛋白質亞族群，其中該AAVhu68 vp2蛋白質為SEQ ID NO：7之胺基酸138至736 (vp2)，其基於SEQ ID NO：7中胺基酸位置而包含在位置157處的纈胺酸，且進一步包含含修飾之胺基酸的vp2蛋白質亞族群，以及其中該AAVhu68 vp3蛋白質為SEQ ID NO：7之胺基酸203至736 (vp3)，其基於SEQ ID NO：7中胺基酸位置而包含含修飾之胺基酸的vp3蛋白質亞族群，其中在(i)及(ii)中之AAVhu68 vp1、AAVhu68 vp2及AAV hu68 vp3蛋白質相對於SEQ ID NO：7中之胺基酸，在位置57、329、452、512之各位置處的天冬醯胺酸-甘胺酸對中包含至少50%至100%之去醯胺化的天冬醯胺酸(N)，其中該去醯胺化的天冬醯胺酸被去醯胺化成天冬胺酸、異天冬胺酸、相互轉換的天冬胺酸/異天冬胺酸對或其之組合，如使用質譜分析所測定。在某些具體實施例中，AAVhu68殼體包含：(a) vp1蛋白質亞族群，其中該vp1蛋白質之位置57處的N的75%至100%被去醯胺化，如使用質譜分析所測定；及/或(b) vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞族群，其中基於SEQ ID NO：2之編號而在位置329處的N的75%至100%被去醯胺化，如使用質譜分析所測定；及/或 (c) vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞族群，其中基於SEQ ID NO：7之編號而在位置452處的N的75%至100%被去醯胺化，如使用質譜分析所測定；及/或 (d) vp1蛋白質、vp2蛋白質及/或vp3蛋白質的亞族群，其中基於SEQ ID NO：7之編號而在位置512處的N的75%至100%被去醯胺化，如使用質譜分析所測定。
AAVhu68 vp1、vp2及vp3蛋白質一般表現為由相同核酸序列所編碼的選擇性剪接(alternative splice)變異體，該核酸序列編碼全長vp1胺基酸序列(胺基酸1至736)。可選擇地，單獨使用vp1編碼序列來表現vp1、vp2及vp3蛋白質。或者，此序列可與一個或多個核酸序列共表現，該核酸序列編碼AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)而不具有vp1獨特區(約aa 1至約aa137)及/或vp2獨特區(約aa 1至約aa 202)，或其互補股、對應的mRNA或tRNA(例如，轉錄自SEQ ID NO：6之約核苷酸(nt) 607至約nt 2211的mRNA)、或與編碼SEQ ID NO：7之aa 203至736的SEQ ID NO：6至少70%到至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。另外或替代地，vp1編碼及/或vp2編碼序列可與核酸序列共表現，該核酸序列編碼SEQ ID NO：7之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)而不具有vp1獨特區(約aa 1至約137)，或其互補股、對應的mRNA或tRNA(例如，轉錄自SEQ ID NO：6之nt 412至2211的mRNA)、或與編碼SEQ ID NO：7之約aa 138至736的SEQ ID NO：6至少70%到至少99%(例如，至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%)相同的序列。
如本文所述，rAAVhu68具有在生產系統中所生產的rAAVhu68殼體，該系統自編碼SEQ ID NO：7之vp1胺基酸序列的AAVhu68核酸序列表現殼體，及自可選擇的額外核酸序列表現殼體，例如，編碼不含vp1及/或vp2獨特區的vp3蛋白質的核酸序列。自使用單個核酸序列vp1的生產所產生的rAAVhu68，產生vp1蛋白質、vp2蛋白質及vp3蛋白質的異質族群。更特別地，AAVhu68殼體含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞族群，它們具有自SEQ ID NO：7中預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞族群至少包括去醯胺化的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸被高度去醯胺化。
於一具體實施例，AAVhu68 vp1核酸序列具有SEQ ID NO：6之序列、或與其互補的股，例如，對應的mRNA或tRNA。於某些具體實施例，vp2及/或vp3蛋白質可被額外地或替代地從不同於vp1的核酸序列表現，例如，以改變所選擇的表現系統中vp蛋白質的比率。於某些具體實施例，亦提供一核酸序列，其編碼SEQ ID NO：7之AAVhu68 vp3胺基酸序列(約aa 203至736)而無vp1獨特區(約aa 1至約aa 137)及/或vp2獨特區(約aa 1至約aa 202)，或與其互補的股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：6之約nt 607至約nt 2211)。於某些具體實施例，亦提供一核酸序列，其編碼SEQ ID NO：7之AAVhu68 vp2胺基酸序列(約aa 138至736)而無vp1獨特區(約aa 1至約137)，或與其互補的股、對應的mRNA或tRNA(SEQ ID NO：6之nt 412至2211)。
然而，可選擇編碼SEQ ID NO：7之胺基酸序列之其它核酸序列以用於生產rAAVhu68殼體。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：6之核酸序列、或與SEQ ID NO：6至少70%至99%相同、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%相同且編碼SEQ ID NO：7之序列。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：6之核酸序列、或與SEQ ID NO：6之約nt 412至約nt 2211至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%相同且編碼SEQ ID NO：7之vp2殼體蛋白質(約aa 138至736)之序列。於某些具體實施例，核酸序列具有SEQ ID NO：6之約nt 607至約nt 2211之核酸序列、或與SEQ ID NO：6之nt 607至約nt 2211至少70%至99%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%相同且編碼SEQ ID NO：7之vp3殼體蛋白質(約aa 203至736)之序列。
設計編碼此AAVhu68殼體的核酸序列係於本領域技術範圍內，包括DNA(基因體或cDNA)或RNA(例如mRNA)。於某些具體實施例，編碼AAVhu68 vp1殼體蛋白質之核酸序列係被提供於SEQ ID NO：6。參見WO 2018/160582，其藉由引用而完整併入本文。於某些具體實施例，生產AAVhu68殼體，使用SEQ ID NO：6之核酸序列或至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%之序列，其編碼具有修飾的SEQ ID NO：7之vp1胺基酸序列(例如，去醯胺化的胺基酸)，如本文所述。於某些具體實施例，vp1胺基酸序列再現於SEQ ID NO：7。
如本文所使用，當用於指vp殼體蛋白質，術語「異質(heterogenous)」或其任何語法變化，係指由不相同的元件所組成的族群，例如具有：具有不同的經修飾的胺基酸序列之vp1、vp2或vp3單體(蛋白質)。SEQ ID NO：7提供AAVhu68 vp1蛋白質之經編碼的胺基酸序列。與vp1、vp2及vp3蛋白質(亦稱為同功型)結合使用的術語「異質」係指殼體內vp1、vp2及vp3蛋白質的胺基酸序列的不同。AAV殼體含有vp1蛋白質內、vp2蛋白質內及vp3蛋白質內的亞族群，其具有自預測的胺基酸殘基的修飾。此等亞族群至少包括某些去醯胺化的天冬醯胺酸(N或Asn)殘基。例如，某些亞族群包含至少一、二、三或四個高度去醯胺化的天冬醯胺酸-甘胺酸對中的天冬醯胺酸(N)位置及可選擇地進一步包含其它去醯胺化的胺基酸，其中該去醯胺化造成胺基酸改變及其它可選擇的修飾。
如本文所使用，vp蛋白質之「亞族群(subpopulation)」係指一群vp蛋白質，其具有至少一個共同的定義特徵，且由參考組的至少一個組成員到少於所有成員所組成，除非另有指明。
例如，vp1蛋白質之「亞族群」為至少一個(1)vp1蛋白質及少於組裝好的AAV殼體中的所有vp1蛋白質，除非另有指明。vp3蛋白質的「亞族群」可為一個(1)vp3蛋白質到少於組裝好的AAV殼體中的所有vp3蛋白質，除非另有指明。例如，於組裝的AAV殼體中，vp1蛋白質可為vp蛋白質之亞族群；vp2蛋白質可為vp蛋白質之一不同的亞族群，及vp3為vp蛋白質之又另一亞族群。於另一例中，vp1、vp2及vp3蛋白質可含有具有不同的修飾的亞族群，例如，於例如天冬醯胺酸-甘胺酸對中之至少一、二、三或四個高度去醯胺化的天冬醯胺酸。
除非另有指明，高度去醯胺化的係指於參考的胺基酸位置上，當與於參考胺基酸位置的預測的胺基酸序列比較而至少45%去醯胺化、至少50%去醯胺化、至少60%去醯胺化、至少65%去醯胺化、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%、或多至約100%去醯胺化(例如，基於SEQ ID NO：7(AAVhu68)編號的胺基酸57之天冬醯胺酸，可基於總vp1蛋白質而至少80%去醯胺化，可基於總vp1、vp2及vp3蛋白質而至少80%去醯胺化)。此種百分比可使用2D膠體、質譜分析技術或其它適合的技術來確定。
不希望受理論束縛，咸信AAV殼體中vp蛋白質的至少高度去醯胺化的殘基之去醯胺化本質上主要為非酵素性的，係由殼體蛋白質中的官能基團所造成，其將所選擇的天冬醯胺酸去醯胺化，及在較小程度上將所選擇的麩醯胺酸殘基去醯胺化。大多數去醯胺化vp1蛋白質的有效殼體組裝表明，此等事件發生於殼體組裝後，或者各別單體(vp1、vp2或vp3)中的去醯胺化在結構上具有良好的耐受性，並且在很大程度上不會影響組裝動力。VP1獨特(VP1-u)區(約aa 1-137)中的廣泛去醯胺化通常被認為於細胞進入之前位於內部，暗示VP去醯胺化可能發生在殼體組裝之前。N的去醯胺化可通過其C端殘基的骨架氮原子對Asn的側鏈醯胺基碳原子進行親核攻擊而發生。咸信會形成一個中間體閉環的琥珀醯亞胺殘基。然後此琥珀醯亞胺殘基進行快速水解以產生最終產物天冬胺酸(Asp)或異天冬胺酸(IsoAsp)。因此，於某些具體實施例，天冬醯胺酸(N或Asn)的去醯胺化會導致Asp或IsoAsp，其可通過琥珀醯亞胺中間體而相互轉換。
如本文所提供，VP1、VP2或VP3中各去醯胺化的N可獨立地為天冬胺酸(Asp)、異天冬胺酸(isoAsp)、天冬胺酸鹽、及/或Asp及isoAsp之相互轉換的摻混物、或其組合。可存在α-及異天冬胺酸之任何適合的比率。例如，於某些具體實施例，比率可為10:1至1:10之天冬胺酸對異天冬胺酸、約50:50之天冬胺酸:異天冬胺酸、或約1:3之天冬胺酸:異天冬胺酸、或其它選擇的比率。
於某些具體實施例，rAAV具有具vp1、vp2及vp3蛋白質之AAV殼體，該蛋白質具有包含於實施例11所提供的表中所列位置的二、三、四或以上的去醯胺化殘基之組合的亞族群，且藉由引用併入本文。於rAAV中的去醯胺化可使用2D膠體電泳、及/或質譜分析(MS)、及/或蛋白質模擬(protein modelling)技術來確定。線上層析可利用與具NanoFlex源的Q Exactive HF(Thermo Fisher Scientific)聯結的Acclaim PepMap管柱及Thermo UltiMate 3000 RSLC系統(Thermo Fisher Scientific)而進行。MS數據係使用Q Exactive HF的依賴於數據的top-20方法所獲取，從勘測掃描(200–2000 m/z)中動態地選擇最豐富的尚未定序的前驅物離子。經由較高能量的碰撞解離片段化進行定序，利用以預測性自動增益控制而確定的目標值1e5離子，並以4 m/z的窗口進行前驅物單離。以m/z 200下的解析度為120,000而獲得勘測掃描。在m/z200下，HCD頻譜的解析度可設置為30,000，最大離子注入時間為50 ms，歸一化碰撞能量為30。S-lens RF水準可設置為50，以給出肽在消化物中所佔的m/z區域之最適透射率。可從片段化選擇中以單個、未分配或六個或更高電荷狀態而排除前驅物離子。BioPharma Finder 1.0軟體(Thermo Fischer Scientific)可用於分析所獲取的數據。對於肽圖譜(peptide mapping)，使用單輸入蛋白質FASTA數據庫進行搜索，其中脲基甲基化設置為固定修飾；將氧化、去醯胺化及磷酸化設置為可變修飾，質量精度為10 ppm，高蛋白酶特異性，MS/MS頻譜的信賴度為0.8。適合的蛋白酶之例可包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。去醯胺化的肽的質譜鑑定相對簡單，因去醯胺化增加完整分子的質量+0.984 Da(–OH及–NH 2基團之間的質量差)。特定肽的去醯胺化百分比係藉由去醯胺化的肽的質量面積除以去醯胺化與天然的肽的面積之和而確定。考慮到可能的去醯胺化位的數目，在不同位置去醯胺化的同量異位物種(isobaric species)可能在一個峰中共遷移。因此，源自具有多個潛在去醯胺化位的肽的片段離子可用於定位或區分多個去醯胺化位。於此等情形，觀察到的同位素樣式內的相對強度可用於特異性地確定不同的去醯胺化的肽異構物的相對豐度。此方法假定所有異構物種的片段化效率相同，且在去醯胺化位上是獨立的。本技術領域中具有通常知識者應理解，可使用此等說明性的方法的多種變異型。例如，適合的質譜儀可包括例如四極飛行時間質譜儀(QTOF)，諸如Waters Xevo或Agilent 6530；或orbitrap儀器，諸如Orbitrap Fusion或Orbitrap Velos(Thermo Fisher)。適合的液相層析系統包括例如來自Waters之Acquity UPLC系統、或Agilent系統(1100或1200系列)。適合的數據分析軟體可包括例如MassLynx (Waters)、Pinpoint and Pepfinder (Thermo Fischer Scientific)、Mascot (Matrix Science)、Peaks DB (Bioinformatics Solutions)。可描述又一其它技術，例如，於X. Jin et al, Hu Gene Therapy Methods, Vol. 28, No. 5, pp. 255-267，線上公開於2017年6月16日。
除了去醯胺化之外，可發生不會導致一個胺基酸轉換為不同的胺基酸殘基之其它修飾。此種修飾可包括乙醯化的殘基、異構化、磷酸化或氧化。
去醯胺化的調節：於某些具體實施例，修飾AAV以改變天冬醯胺酸-甘胺酸對中的甘胺酸，以減少去醯胺化。於其它具體實施例，將天冬醯胺酸改變為不同的胺基酸，例如以較慢的速度去醯胺化的麩醯胺酸；或缺少醯胺基的胺基酸(例如麩醯胺酸及天冬醯胺酸含有醯胺基)；及/或缺少胺基的胺基酸(例如離胺酸、精胺酸及組胺酸含有胺基)。如本文所使用，缺乏醯胺或胺之側基的胺基酸係指例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、胱胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、或色胺酸、及/或脯胺酸。諸如所述的修飾可於所編碼的AAV胺基酸序列中發現的1、2或3個天冬醯胺酸-甘胺酸對中。於某些具體實施例，在所有四個天冬醯胺酸-甘胺酸對中沒有進行此種修飾。如此，用於減少AAV及/或具有較低去醯胺化率的工程化的AAV變異體的去醯胺化的方法。另外或替代地，可將一種或多種其它醯胺胺基酸改變為非醯胺胺基酸以減少AAV的去醯胺化。於某些具體實施例，本文所述的突變體AAV殼體含有天冬醯胺酸-甘胺酸對中的突變，使得甘胺酸被改變為丙胺酸或絲胺酸。突變體AAV殼體可含有一個、兩個或三個突變，其中參考AAV天然地含有四個NG對。於某些具體實施例，AAV殼體可含有一個、兩個、三個或四個此種突變，其中參考AAV天然地含有五個NG對。於某些具體實施例，突變體AAV殼體在NG對中僅含有單個突變。於某些具體實施例，突變體AAV殼體含有兩個不同NG對中的突變。於某些具體實施例，突變體AAV殼體含有兩個不同的NG對的突變，其位於AAV殼體中結構上分開的位置。於某些具體實施例，該突變並非位於VP1獨特區。於某些具體實施例，突變之一者位於VP1獨特區。可選擇地，突變體AAV殼體於NG對中不含修飾，但含有突變以最小化或消除位於NG對之外的一個或多個天冬醯胺酸或麩醯胺酸中的去醯胺化。
如本文所使用，「AAV9殼體」為一自組裝AAV殼體，由多種AAV9 vp蛋白質所構成。AAV9 vp蛋白質一般被表現為選擇性剪接變異體，由SEQ ID NO：9之核酸序列或其至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%之序列所編碼，其編碼GenBank登錄號：AAS99264之vp1胺基酸序列。於某些具體實施例，「AAV9殼體」包括具有與AAS99264為99%相同或與SEQ ID NO：10為99%相同之胺基酸序列之AAV。亦參見US7906111及WO 2005/033321。如本文所使用，「AAV9變異體」包括彼等述於例如WO2016/049230、US 8,927,514、US 2015/0344911、及US 8,734,809者。亦參見WO 2019/169004；及WO 2019/168961，所有這些皆藉由引用而完整併入本文。
已描述生產殼體之方法、其編碼序列、及生產rAAV病毒載體之方法。參見例如Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
當指核酸或其片段時，術語「實質上同源性」或「實質上相似性」表示在與另一核酸(或其互補股)的適當核苷酸插入或刪除進行最適比對時，於至少約95至99%的比對序列中存在核苷酸序列同一性。較佳地，同源性為全長序列、或其開讀框(open reading frame)、或長度至少為15個核苷酸的其它適合的片段。本文描述適合的片段之例。
於核酸序列之上下文中，術語「序列同一性」、「序列同一性百分比」、或「百分比相同的」係指兩個序列中當比對以獲得最大對應性時為相同的殘基。序列同一性比較之長度期望可為整個基因體之全長、基因編碼序列之全長、或至少約500至5000個核苷酸之片段。然而，亦期望可為較小片段中的同一性，例如，至少約9個核苷酸、通常至少約20至24個核苷酸、至少約28至32個核苷酸、至少約36或以上之核苷酸。相似地，可容易地確定在蛋白質之全長、或其片段的胺基酸序列的「序列同一性百分比」。適合地，片段為至少約8個胺基酸長且可多至約700個胺基酸。適合的片段之例述於本文。
當指胺基酸或其片段時，術語「實質上同源性」或「實質上相似性」表示在與另一胺基酸(或其互補股)的適當胺基酸插入或刪除進行最適比對時，於至少約95至99%的比對序列中有胺基酸序列同一性。較佳地，同源性為全長序列、或其蛋白質(例如，cap蛋白質、rep蛋白質)、或其片段(其為至少8個胺基酸，或更理想地，至少15個胺基酸長)。適合的片段之例述於本文。
術語「高度保留」意指至少80%同一性，較佳為至少90%同一性，更佳為超過97%同一性。同一性係由本技術領域中具有通常知識者藉由依據本技術領域中具有通常知識者已知的演算法及電腦程式而容易地確定。
一般而言，當提及兩個不同的腺相關病毒之間的「同一性」、「同源性」、或「相似性」時，參照「比對」序列而確定「同一性」、「同源性」、或「相似性」。「比對」序列或「比對」係指多個核酸序列或蛋白質(胺基酸)序列，與參考序列相比，通常含有缺失或增加的鹼基或胺基酸的矯正。在實施例中，使用公開的AAV9序列作為參考點進行AAV比對。使用多種公開或市售的多序列比對程式中的任何一種進行比對。此種程式之例包括「Clustal Omega」、「Clustal W」、「CAP Sequence Assembly」、「MAP」、及「MEME」，其可通過網際網路上的網站伺服器進行存取。此種程式之其它來源為本技術領域中具有通常知識者已知的。或者，亦可使用Vector NTI應用程式。亦有許多本技術領域中已知可用於測量核苷酸序列同一性的演算法，包括上述程式中所含者。作為另一例，可使用GCG版本6.1的程式Fasta™，而比較多核苷酸序列。Fasta™提供查詢序列及檢索序列之間最佳重疊區域的比對及序列同一性百分比。例如，核酸序列之間的序列同一性百分比可使用Fasta™及其如GCG版本6.1中所提供的預設參數(字長為6，評分矩陣的NOPAM因子)而確定，藉由引用併入本文。多序列比對程式亦可用於胺基酸序列，例如，「Clustal Omega」、「Clustal X」、「MAP」、「PIMA」、「MSA」、「BLOCKMAKER」、「MEME」、及「Match-Box」程式。通常，儘管本技術領域中具有通常知識者可依需要更動此等設定，但此等程式中之任一者皆可於預設值設定下使用。或者，本技術領域中具有通常知識者可利用至少提供與參考的演算法及程式所提供的同一性或比對水準之另一種演算法或電腦程式。參見例如J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., “A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”, 27(13):2682-2690 (1999)。 V.    rAAV
本文提供一種治療性的、重組的、及複製缺陷的腺相關病毒(rAAV)，其有用於在需要其之對象中治療與芳基硫酸酯酶A基因(ARSA)突變相關之疾病或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起之疾病(例如，異染性白質失養症(MLD))。rAAV期望為複製缺陷的且帶有載體基因體，該載體基因體包含反向末端重複序列(ITR)、及於引導hARSA於目標細胞中表現的調節序列的控制下之編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A(hARSA)之核酸序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列包含SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 55至nt 1521之序列、或與其至少95%至99.9%相同且編碼功能性hARSA之序列。於某些具體實施例，載體基因體包含反向末端重複序列(ITR)及第III部分所述的表現匣。於另一具體實施例，rAAV包含AAV殼體。
AAV殼體可基於目標細胞而選擇。於某些具體實施例，AAV殼體適合用於神經系統(例如，CNS或PNS)中載體基因體之遞送。於某些具體實施例，AAV殼體適合用於神經元、神經系統細胞、寡樹突細胞、小神經膠質細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、CNS中的神經元、周圍神經系統(PNS)細胞、許旺氏細胞、PNS中的巨噬細胞、或內臟器官中的細胞(例如，腎臟細胞、肝臟細胞及膽囊細胞)中載體基因體之遞送。於某些具體實施例，AAV殼體適合用於如本文所述之另外的目標細胞中載體基因體之遞送。
於某些具體實施例，AAV殼體選自cy02殼體、rh43殼體、AAV8殼體、rh01殼體、AAV9殼體、rh8殼體、rh10殼體、bb01殼體、hu37殼體、rh02殼體、rh20殼體、rh39殼體、rh64殼體、AAV6殼體、AAV1殼體、hu44殼體、hu48殼體、cy05殼體、hu11殼體、hu32殼體、pi2殼體、或其變異型。於某些具體實施例，AAV殼體為演化支F殼體，諸如AAV9殼體、AAVhu68殼體、AAV-PHP.B殼體、hu31殼體、hu32殼體、或其變異型。參見例如公開於2015年4月14日之WO 2005/033321；WO 2018/160582；及US 2015/0079038，其各自藉由引用而完整併入本文。於某些具體實施例，AAV殼體為非演化支F殼體，例如演化支A、B、C、D、或E殼體。於某些具體實施例，該非演化支F殼體為AAV1或其變異型。於某些具體實施例，AAV殼體轉導神經系統細胞之外的目標細胞。於某些具體實施例，AAV殼體為演化支A殼體(例如，AAV1、AAV6)、演化支B殼體(例如，AAV 2)、演化支C殼體(例如，hu53)、演化支D殼體(例如，AAV7)、或演化支E殼體(例如，rh10)。仍然可選擇其它AAV殼體。
於某些具體實施例，rAAV包含其中包裝了載體基因體的AAVhu68殼體。於某些具體實施例，AAVhu68殼體係由編碼SEQ ID NO：7之預測的胺基酸序列的序列所產生。
更多詳細內容參見第V部分。於某些具體實施例，載體基因體因為其不含AAVhu68基因體序列，對AAVhu68殼體為完全外源的。
功能性hARSA述於第I部分。於某些具體實施例，功能性hARSA具有訊息肽及SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 19至aa 507之序列。於某些具體實施例，使用天然hARSA訊息肽，例如，SEQ ID NO：2之aa 1至aa 18。於某些具體實施例，訊息肽具有SEQ ID NO：4之aa 1至aa 20之胺基酸序列。於某些具體實施例，功能性hARSA具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之胺基酸序列。
於某些具體實施例，hARSA編碼序列係與SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 55至nt 1521約95%至100%相同。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。於另一具體實施例，hARSA編碼序列編碼SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 19至aa 507之序列。於再另一具體實施例，hARSA編碼序列編碼SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之序列。關於hARSA編碼序列之詳細內容參見第I部分。
於某些具體實施例，調節序列引導hARSA於神經系統細胞中表現。於某些具體實施例，調節序列包含普遍存在的啟動子，例如，CB7啟動子。於另一具體實施例，調節元件包含Kozak序列、多腺苷酸化序列、內含子、強化子、及TATA訊息中的一或多種。於某些具體實施例，調節序列包含下列一或多者：衍生自雞β-肌動蛋白(BA)啟動子及人類巨細胞病毒立即早期強化子(CMV IE)的調節元件(例如，CB7啟動子，SEQ ID NO：5之nt 198至nt 862)、由雞BA剪接供體及兔β-球蛋白(rBG)剪接受體元件所組成的嵌合內含子(例如，CI，SEQ ID NO：5之nt 956至nt 1928)、及衍生自rBG基因之多腺苷酸化(PolyA)訊息(例如，rBG，SEQ ID NO：5之nt 3539至nt 3665)。於某些具體實施例，載體基因體具有SEQ ID NO：5之核苷酸(nt) 1至nt 3883之序列。詳細內容參見第III部分。
於某些具體實施例，該rAAV或包含該rAAV之組成物可投予至需要其之對象以改善與ARSA突變相關或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)之症狀、及/或延遲與ARSA突變相關或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)之進展。詳細內容參見第II部分。
於某些具體實施例，如本文所述的rAAV係適合用於經由腦大池內注射(ICM)投予至病患，包括經由CT導引的枕骨下注射至腦大池。於某些具體實施例，如本文所述的rAAV係適合用於投予至7歲或更小的對象。於某些具體實施例，如本文所述的rAAV係適合用於投予至需要的對象以改善異染性白質失養症之症狀或與芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因突變相關的疾病之症狀、及/或延遲異染性白質失養症之進展或與芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因突變相關的疾病之進展。詳細內容參見第II部分及第VIII部分。於某些具體實施例，如本文所述的rAAV係以單一劑量投予。
於某些具體實施例，載體基因體為單股AAV載體基因體。於某些具體實施例，於本發明可利用rAAV載體，其含有自互補(self-complementary，sc)AAV載體基因體。
必需的調節控制元件係以允許其在攝入rAAV的細胞中轉錄、轉譯及/或表現的方式而可操作地連接至基因(例如，hARSA編碼序列)。如本文所使用，「可操作地連接」的序列包括與感興趣的基因鄰接的表現控制序列及反式或遠距地作用以控制感興趣的基因之表現控制序列兩者。此種調節序列典型地包括例如啟動子、強化子、內含子、polyA、自切割連接子(例如，弗林蛋白酶(furin)、弗林蛋白酶F2A(furin-F2A)、IRES)中的一或多種。下列實施例利用CB7啟動子以表現hARSA。然而，於某些具體實施例，可選擇其它啟動子、或另外的啟動子。於某些具體實施例，附加或替代的啟動子序列可被包括作為例如位於選擇的5’ ITR序列及編碼序列之間的表現控制序列(調節序列)之一部分。組成啟動子、可調節的啟動子[參見例如WO 2011/126808及WO 2013/04943]、組織特異性啟動子、或對生理線索有反應的啟動子可用於本文所述的載體中。啟動子可選自不同來源，例如，人類巨細胞病毒(CMV)立即早期強化子/啟動子、SV40早期強化子/啟動子、JC多瘤病毒啟動子、髓鞘質鹼性蛋白質(MBP)或神經膠原纖維酸性蛋白質(GFAP)啟動子、單純疱疹病毒(HSV-1)潛伏相關啟動子(LAP)、勞氏肉瘤病毒(RSV)長末端重複序列(LTR)啟動子、神經元特異性啟動子(NSE)、血小板衍生生長因子(PDGF)啟動子、hSYN、黑色素凝集激素(MCH)啟動子、CBA、基質金屬蛋白啟動子(MPP)、及雞β-肌動蛋白啟動子。除了啟動子之外，載體可含有一或多個其它適當的轉錄起始序列、轉錄終止序列、強化子序列、有效的RNA加工訊息諸如剪接及多腺苷酸化(polyA)訊息；穩定細胞質的mRNA之序列，例如WPRE；增強轉譯效率之序列(即，Kozak共通序列)；增強蛋白質穩定性之序列；及當期望時，增強所編碼的產物之分泌的序列。適合的強化子之例為CMV強化子。其它適合的強化子包括彼等適合於所欲目標組織適應症者。於一具體實施例，調節序列包含一或多個表現強化子。於一具體實施例，調節序列含有二或更多個表現強化子。此等強化子可相同或可彼此不同。例如，強化子可包括CMV立即早期強化子(SEQ ID NO：19)。此強化子能夠以位置彼此相鄰的兩個拷貝的方式存在。或者，強化子的雙重拷貝可被一個或多個序列分開。於再另一具體實施例，表現匣進一步含有內含子，例如雞β-肌動蛋白內含子(SEQ ID NO：17)。於某些具體實施例，內含子為由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成的雜合內含子–嵌合內含子(CI)。其它適合的內含子包括本技術領域中已知者，例如，諸如WO 2011/126808所述者。適合的polyA序列之例包括例如SV40、SV50、牛生長激素(bGH)、人類生長激素、及合成的polyA。可選擇地，可選擇一或多個序列以穩定mRNA。此種序列之一例為經修飾的WPRE序列，其可工程化在polyA序列的上游及編碼序列的下游(參見例如MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619)。於某些具體實施例，不存在WPRE序列。
於某些具體實施例，除了hARSA編碼序列之外，可包括另一非AAV編碼序列，例如，肽、多肽、蛋白質、功能性RNA分子(例如，miRNA、miRNA抑制劑)或其它感興趣的基因產物。有用的基因產物可包括miRNA。miRNA及其它小的干擾核酸經由目標RNA轉錄本切割/降解或目標傳訊RNA(mRNA)的轉譯阻遏來調節基因表現。miRNA天然地表現，通常作為最終的19-25個非轉譯RNA產物。miRNA通過與目標mRNA的3’非轉譯區(UTR)進行序列特異性相互作用來展現其活性。此等內源性表現的miRNA形成髮夾前驅物，其隨後被加工成雙股miRNA，並進一步加工成「成熟的」單股miRNA分子。此成熟的miRNA導引多蛋白複合體miRISC，miRISC基於其與成熟miRNA的互補性來鑑別目標mRNA的靶位，例如於3’UTR區域。
載體之AAV序列一般包含順式作用(cis-acting)的5’及3’反向末端重複(ITR)序列(參見例如B. J. Carter, in “Handbook of Parvoviruses”, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990))。ITR序列為約145個鹼基對(bp)長。較佳地，儘管允許對此等序列進行某些程度的微小修飾，但實質上於分子中使用編碼ITR的整個序列。修飾此等ITR序列的能力係於本領域技術範圍內。(參見例如，諸如Sambrook et al, “Molecular Cloning. A Laboratory Manual”, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；及K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)之文章)。本發明中所使用的此種分子之例為含有轉基因的「順式作用」質體，其中5’及3’ AAV ITR序列位於所選擇的轉基因序列及相關的調節元件兩側。於一具體實施例，ITR來自不同於提供殼體的AAV之AAV。於一具體實施例，ITR序列來自AAV2。已描述5’ITR的縮短版，稱為∆ITR，其中刪除了D序列(D-sequence)及末端分割位(terminal resolution site，trs)。在某些具體實施例中，載體基因體包括130個鹼基對的縮短的AAV2 ITR，其中外部「A」元件被刪除。在使用內部A元件作為模板的載體DNA擴增過程中，縮短的ITR恢復為145個鹼基對的野生型長度。於其它具體實施例，使用全長AAV 5’及3’ ITR。在其他具體實施例中，可選擇較長或較短的AAV ITR。然而，可選擇其它AAV來源的ITR。於ITR之來源為來自AAV2且AAV殼體來自另一AAV來源時，生成的載體可稱為假型(pseudotype)。然而，此等元件之其它組態可為適合的。在某些具體實施例中，5’ ITR序列包括：ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct [SEQ ID NO：25]。
在某些具體實施例中，3’ ITR序列包括：aggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa [SEQ ID NO：26]。
於某些具體實施例，構築載體基因體，其包含5’ AAV ITR–啟動子–可選擇的強化子–可選擇的內含子–hARSA編碼序列–polyA–3’ ITR，稱為AAV.啟動子.可選擇的強化子.可選擇的內含子.hARSA或hARSAco.polyA。於某些具體實施例，ITR來自AAV2。於某些具體實施例，存在多於一個啟動子。於某些具體實施例，強化子存在於載體基因體。於某些具體實施例，存在多於一個強化子。於某些具體實施例，內含子存在於載體基因體。於某些具體實施例，存在強化子及內含子。於某些具體實施例，內含子為由人類β-球蛋白剪接供體及免疫球蛋白G(IgG)剪接受體元件所組成之雜合內含子–嵌合內含子(CI)。於某些具體實施例，polyA為SV40 poly A(即，衍生自猴病毒40(SV40)晚期基因之多腺苷酸化(PolyA)訊息)。於某些具體實施例，polyA為兔β-球蛋白(RBG) poly A。於某些具體實施例，載體基因體包含5’ AAV ITR–CB7啟動子–hARSA編碼序列–poly A–3’ ITR。參見例如SEQ ID NO：28之表現匣(通過poly的雜合啟動子)。
如本文所使用，載體基因體或包含載體基因體之rAAV於本文例示為AAV.啟動子(可選擇的).Kozak(可選擇的).內含子(可選擇的).hARSA編碼序列(例如，hARSA、hARSAco).miRNA (可選擇的).polyA(可選擇的).填充片段(Stuffer)(可選擇的)。於某些具體實施例，rAAV於本文例示為AAV殼體.啟動子(可選擇的).Kozak(可選擇的).內含子(可選擇的).hARSA編碼序列.miRNA(可選擇的).polyA(可選擇的).填充片段(可選擇的)。
於另一態樣，提供有用於生產rAAV之生產系統。於此系統，培養細胞，其包含編碼AAVhu68殼體蛋白質之核酸序列、如本文所述之載體基因體及足夠的AAV rep功能及輔助功能以允許將載體基因體包裝到AAV殼體中。在某些具體實施例中，載體基因體具有包含SEQ ID NO：5之nt 1至nt 3883的序列(SEQ ID NO：27)。在某些具體實施例中，表現匣具有包含SEQ ID NO：5之nt 198至nt 3665的序列(SEQ ID NO：28)。於某些具體實施例，細胞培養為人類胚胎腎臟293細胞培養。於某些具體實施例，AAV rep係來自不同於AAVhu68之AAV，例如，來自AAV2。於某些具體實施例，AAV rep編碼序列及cap基因位於相同核酸分子，其中於rep序列及cap基因之間可選擇性地有間隔子。於另一具體實施例，間隔子為atgacttaaaccaggt(SEQ ID NO：24)。
於生產AAV病毒載體(例如，重組(r)AAV)之用途，載體基因體可攜帶於任何適合的載體上，例如，質體，其被遞送至包裝宿主細胞(packaging host cell)。有用於本發明之質體可經工程化而使其適合於原核細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞等中之活體外複製及包裝。適合的轉染技術及包裝宿主細胞為本技術領域中具有通常知識者已知的及/或可輕易設計的。於圖6-7提供說明性的生產過程。於某些具體實施例，質體具有SEQ ID NO：5之序列。
生產及單離適合作為載體使用之AAV之方法為本技術領域已知者。一般參見例如Grieger & Samulski, 2005, Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications, Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145；Buning et al., 2008, Recent developments in Adeno-associated virus vector technology, J. Gene Med. 10:717-733；及下列引述的參考文獻，其每一者藉由引用而完整併入本文。為了將基因包裝到病毒顆粒中，ITR為與含有該基因的核酸分子相同的構築體中順式所需的唯一AAV組件。cap及rep基因能以反式來提供。
於一具體實施例，選擇的基因元件可藉由任何適合的方法而被遞送至AAV包裝細胞，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA塗布丸粒(high velocity DNA-coated pellet)、病毒感染及原生質體(protoplast)融合。亦可製造穩定的AAV包裝細胞。用於製造此種構築體之方法為核酸操作領域中具有通常知識者已知的且包括基因工程、重組工程、及合成技術。參見例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012)。
術語「AAV中間體」或「AAV載體中間體」係指缺少包裝在其中的所欲基因體序列的組裝的rAAV殼體。此等亦可稱為「空的」殼體。此種殼體可不含表現匣的可檢測的基因體序列，或僅含有不足以達成基因產物表現的部分包裝的基因體序列。此等空的殼體沒有將感興趣的基因轉移至宿主細胞的功能。
使用已知技術可生產本文所述的重組腺相關病毒(AAV)。參見例如WO 2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此種方法涉及培養宿主細胞，其含有編碼AAV殼體蛋白質的核酸序列；功能性rep基因；至少由AAV 反向末端重複序列(ITR)及轉基因所構成的表現匣；及足夠的輔助功能以允許將表現匣包裝至AAV殼體蛋白質中。已描述生產殼體之方法、其編碼序列、及生產rAAV病毒載體之方法。參見例如Gao, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003)及US 2013/0045186A1。
於一具體實施例，提供有用於生產重組AAVhu68之生產細胞培養。此種細胞培養含有於宿主細胞中表現AAVhu68殼體蛋白質的核酸；適於包裝至AAVhu68殼體中的核酸分子，例如，載體基因體，其含有AAV ITR及編碼基因的非AAV核酸序列，該基因可操作地連接至引導該基因於宿主細胞中表現的調控序列；及充足的AAV rep功能及腺病毒輔助功能，以允許將載體基因體包裝到重組AAVhu68殼體中。於一具體實施例，細胞培養係由哺乳動物細胞(例如，人類胚胎腎臟293細胞等)或昆蟲細胞(例如，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda，Sf9)細胞)構成。於某些具體實施例，桿狀病毒(baculovirus)提供將載體基因體包裝至重組AAVhu68殼體所必須的輔助功能。
可選擇地，rep功能係由除AAVhu68以外的AAV提供。於某些具體實施例，至少部分rep功能來自AAVhu68。於另一具體實施例，rep蛋白質為除AAVhu68rep以外的異源的rep蛋白質，例如但不限於AAV1 rep蛋白質、AAV2 rep蛋白質、AAV3 rep蛋白質、AAV4 rep蛋白質、AAV5 rep蛋白質、AAV6 rep蛋白質、AAV7 rep蛋白質、AAV8 rep蛋白質；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78及rep40/52；或其片段；或其它來源。此等AAVhu68或突變體AAV殼體序列之任一者可於引導其在宿主細胞中表現的外源調節控制序列的控制下。
於一具體實施例，於適合的細胞培養(例如，HEK 293或Sf9)或懸浮液中製備細胞。本文所述的基因療法載體的製備方法包括本技術領域眾所周知的方法，諸如用於生產基因療法載體之質體DNA的生產、載體的生產、及載體的純化。於一些具體實施例，基因療法載體為AAV載體且生產的質體為編碼AAV載體基因體及感興趣的基因的AAV順式質體(cis-plasmid)、含有AAV rep及cap基因的AAV反式質體(trans-plasmid)、及腺病毒輔助質體。載體產生過程可包括諸如細胞培養的起始、細胞繼代、細胞接種、以質體DNA轉染細胞、轉染後培養基交換為無血清培養基、及含有載體的細胞及培養基的收取之方法步驟。所收取的含有載體的細胞及培養基在本文中稱為粗細胞收取物。於另一系統中，藉由以基於桿狀病毒的載體感染而將基因療法載體導入昆蟲細胞中。此等生產系統的綜述，一般參見例如Zhang et al., 2009, Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production, Human Gene Therapy 20:922-929，其各自之內容藉由引用而完整併入本文。製造及使用此等之方法及其它AAV生產系統亦描述於下列U.S.專利，其各自之內容藉由引用而完整併入本文：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；及7,439,065。亦參見2022年8月16日申請之美國專利臨時申請號63/371,597，發明名稱為「用於製造具有包裝的載體基因體的rAAV之可量測的方法(Scalable Methods for Producing rAAV with Packaged Vector Genomes)」；及2022年8月16日申請之美國專利臨時申請號63/371,592，發明名稱為「用於重組腺相關病毒的下游純化之可量測的方法(Scalable Methods for Downstream Purification of Recombinant Adeno-associated Virus)」，二者藉由引用而完整併入本文中。
粗細胞收取物之後可經歷下列方法步驟以製備大量載體，例如載體收取物的濃縮、載體收取物的透析過濾、載體收取物的微流體化、載體收取物的核酸酶消化、微流體化中間體的過濾、藉由層析法的粗純化、藉由超速離心的粗純化、藉由切向流過濾的緩衝液交換、及/或調配及過濾。使用高鹽濃度下的兩步驟親和性層析純化，然後使用陰離子交換樹脂層析，以純化載體藥物產物並移除空的殼體。此等方法更詳細描述於WO 2017/160360，2016年12月9日申請的國際專利申請號PCT/US2016/065970，以及其優先權案2016年4月13日申請的美國專利申請號62/322,071及2015年12月11日申請的美國專利申請號62/226,357，發明名稱為「AAV9之可量測的純化方法(Scalable Purification Method for AAV9)」。其藉由引用而併入本文。
為了計算空的(empty)及完整的(full)顆粒含量，將所選樣本(例如，在本文的實施例中，碘克沙醇(iodixanol)梯度純化的製劑，其中基因體拷貝(GC)的#=顆粒的#)的VP3帶(band)體積對加載的GC顆粒作圖。所生成的線性方程式(y=mx+c)用於計算測試物峰的帶體積中的顆粒數量。然後將加載的每20 µL的顆粒數(pt)乘以50，得到顆粒(pt)/mL。Pt/mL除以GC/mL得到顆粒對基因體拷貝的比率(pt/GC)。Pt/mL–GC/mL得到空的pt/mL。空的pt/mL除以pt/mL並x 100得到空的顆粒的百分比。
通常，用於分析空的殼體及具有包裝的基因體的AAV載體顆粒的方法為本技術領域已知的。參見例如Grimm et al., Gene Therapy (1999) 6:1322-1330；Sommer et al., Molec. Ther. (2003) 7:122-128。為了測試變性的殼體，該方法包括對經處理的AAV原液(stock)進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，該電泳由能夠分離三種殼體蛋白質的任何凝膠所組成，例如，在緩衝液中含有3-8%的Tris-乙酸鹽的梯度凝膠，然後運行凝膠直到分離樣本材料，然後將凝膠印漬到尼龍或硝化纖維素膜上，較佳為尼龍。然後使用抗AAV殼體抗體作為結合至變性的殼體蛋白質的初級抗體，較佳為抗AAV殼體單株抗體，最佳為B1抗AAV-2單株抗體(Wobus et al., J. Virol. (2000) 74:9281-9293)。然後使用二級抗體，該二級抗體與初級抗體結合且含有用於檢測與初級抗體的結合的手段，更佳為含有與其共價結合的檢測分子的抗IgG抗體，最佳為與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)共價連接的綿羊抗小鼠IgG抗體。使用檢測結合的方法，以半定量地確定初級抗體及二級抗體之間的結合，較佳為能夠檢測放射性同位素發射、電磁輻射或比色變化的檢測方法，最佳為化學發光檢測套組。例如，對於SDS-PAGE，可從管柱流份(fraction)中取樣本，並於含有還原劑(例如DTT)的SDS-PAGE加載緩衝液(loading buffer)中加熱，將殼體蛋白質於預鑄的梯度聚丙烯醯胺凝膠(例如Novex)進行解析。可使用SilverXpress(Invitrogen，CA)根據製造商的說明進行銀染或其它適合的染色方法(即SYPRO ruby或考馬斯染色)。於一具體實施例，可藉由定量即時PCR(Q-PCR)測量管柱流份中的AAV載體基因體(vg)的濃度。稀釋樣本並以DNase I(或其它合適的核酸酶)消化以移除外源的DNA。核酸酶失活後，使用引子及對引子之間的DNA序列為特異性的TaqMan™螢光探針進一步稀釋及擴增樣本。在Applied Biosystems Prism 7700序列檢測系統上測量每個樣本達到定義的螢光水準所需的循環數(閾值循環，Ct)。使用含有與AAV載體中所含的序列相同的序列的質體DNA，以於Q-PCR反應中生成標準曲線。從樣本獲得的循環閾值(Ct)數值係用於藉由將其標準化為質體標準曲線的Ct值來確定載體基因體效價(titer)。亦可使用基於數位PCR的終點分析。
於一態樣，使用了最適化的q-PCR方法，其利用廣效絲胺酸蛋白酶，例如蛋白酶K(例如可由Qiagen購得)。更具體而言，最適化的qPCR基因體效價測定除了於DNase I消化後，將樣本以蛋白酶K緩衝液稀釋並以蛋白酶K處理，然後進行熱失活之外，與標準測定相似。適合地，以與樣本量相等的量的蛋白酶K緩衝液稀釋樣本。蛋白酶K緩衝液可濃縮至2倍或更高。通常，蛋白酶K處理為約0.2mg/mL，但可於0.1mg/mL至約1mg/mL之間變化。該處理步驟通常於約55℃下進行約15分鐘，但可於較低溫度(例如約37℃至約50℃)下進行較長時間(例如約20分鐘至約30分鐘)；或者於較高的溫度(例如，高至約60°C)下進行較短的時間(例如，約5至10分鐘)。相似地，熱失活通常於約95℃下約15分鐘，但溫度可降低(例如約70至約90℃)且時間延長(例如約20分鐘至約30分鐘)。然後將樣本稀釋(例如1000倍)，並如標準測定中所述進行TaqMan分析。
另外或替代地，可使用液滴數位PCR(droplet digital PCR，ddPCR)。例如，已描述藉由ddPCR確定單股及自互補的AAV載體基因體效價的方法。參見例如M. Lock et al, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. Doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14。
簡而言之，用於從缺乏基因體的AAVhu68中間體中分離具有包裝的基因體序列的rAAVhu68顆粒的方法，涉及對包含重組AAVhu68病毒顆粒及AAVhu68殼體中間體的懸浮液進行快速高效液相層析，其中將AAVhu68病毒顆粒及AAVhu68中間體結合至一種經平衡於pH約10.2的強陰離子交換樹脂，並經過鹽梯度而同時以約260奈米(nm)及約280nm的紫外線吸光度來監測洗提物。儘管對於rAAVhu68非最適的，pH可於約10.0至10.4的範圍內。於此方法中，從A260/A280之比達到反曲點時洗提的流份中收集AAVhu68完整的殼體。於一例中，對於親和性層析步驟，可將經透析過濾的產物應用於有效捕捉AAV2/hu68血清型的Capture Select TMPoros- AAV2/9親和性樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留的細胞DNA及蛋白質流過管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。
rAAV.hARSA被懸浮於適合的生理學上相容的組成物(例如，緩衝食鹽水)。此組成物可被冷凍儲存，之後解凍並可選擇地以適合的稀釋劑稀釋。或者，可將載體製備為無需執行冷凍及解凍步驟之適合遞送至病患之組成物。
如本文所使用，術語「Nab效價」為產生多少中和抗體(例如，抗AAV Nab)的量度，該中和抗體中和其靶向的表位(epitope)(例如，AAV)的生理作用。抗AAV Nab效價可例如Calcedo, R., et al., Worldwide Epidemiology of Neutralizing Antibodies to Adeno-Associated Viruses. Journal of Infectious Diseases, 2009. 199(3): p. 381-390所描述般的測量，其藉由引用而併入本文。
縮寫「sc」係指自互補。「自互補AAV」係指其中重組AAV核酸序列所攜帶的編碼區域已被設計以形成分子內雙股DNA模板的構築體。於感染時，scAAV的兩個互補部分將會聯合而形成一個準備用於立即的複製及轉錄之雙股DNA(dsDNA)單元，而非等待細胞媒介的第二股的合成。參見例如D M McCarty et al, “Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis”, Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254。自互補AAV述於例如，U.S.專利號6,596,535；7,125,717；及7,456,683，其每一者藉由引用而完整併入本文。
「複製缺陷的病毒」或「病毒載體」係指合成或人工的病毒顆粒，其中含有感興趣的基因的表現匣被包裝於病毒殼體或套膜中，亦被包裝於該病毒殼體或套膜中的任何病毒基因體序列為複製缺陷的；即，它們無法產生後代病毒顆粒，但保留感染目標細胞的能力。於一具體實施例，病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酶的基因(該基因體可被工程化為「無膽的(gutless)」-僅含有感興趣的基因，兩側為增幅及包裝人工基因體所需的訊息)，但可能在生產過程中提供此等基因。因此，其由於除非存在複製所需的病毒的酶，否則後代病毒顆粒的複製及感染不會發生，而被認為可安全地用於基因療法。
於許多情形，rAAV顆粒被稱為DNase抗性。然而，除了此核酸內切酶(DNase)之外，於本文所述純化步驟中亦可使用其它核酸內切酶及核酸外切酶，以移除污染的核酸。此種核酸酶可被選擇以降解單股DNA及/或雙股DNA、以及RNA。此種步驟可含有單一核酸酶、或導向不同目標的核酸酶之混合物，且可為核酸內切酶或核酸外切酶。
術語「核酸酶抗性」表明AAV殼體已完全組裝於表現匣周圍，其被設計以遞送基因至宿主細胞並保護此等經包裝的基因體序列免於在被設計用以去除生產過程中可能存在的污染核酸之核酸酶培養步驟中被降解(消化)。 VI. 其它載體
於一態樣，本文提供一載體，其有用於在需要其之對象中治療與ARSA突變相關的疾病或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)。載體帶有在引導hARSA於目標細胞中表現的調節序列的控制下之編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A(hARSA)之核酸序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列與 SEQ ID NO：1為約95%至100%相同。另外或替代地，功能hARSA蛋白具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1。於某些具體實施例，該載體或包含該載體之組成物可投予至需要其之對象以改善與ARSA突變相關的疾病或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)之症狀、及/或延遲與ARSA突變相關的疾病或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)之進展。
於某些具體實施例，載體包含表現匣。於某些具體實施例，表現匣包含在引導hARSA表現的調節序列的控制下之編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A(hARSA)之核酸序列。於某些具體實施例，功能性hARSA蛋白包含訊息肽及SEQ ID NO：2之胺基酸(aa) 19至aa 507之胺基酸序列。於某些具體實施例，訊息肽具有SEQ ID NO：2之aa 1至aa 18之胺基酸序列或SEQ ID NO：4之aa 1至aa 20之胺基酸序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列具有SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 55至nt 1521之序列、或與其至少95%至99.9%相同且編碼功能性hARSA之序列。於某些具體實施例，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。詳細內容參見第I及III部分。
於某些具體實施例，載體為病毒載體，選自重組小病毒(parvovirus)、重組慢病毒(lentivirus)、重組反轉錄病毒(retrovirus)、或重組腺病毒；或非病毒載體，選自裸露的DNA、裸露的RNA、無機粒子、脂質粒子、聚合物系載體、或幾丁聚醣系調配物。可藉由任何適合方法遞送選擇的載體，包括轉染、電穿孔、微脂體遞送、膜融合技術、高速DNA塗布丸粒、病毒感染及原生質體融合。用於製備此種構築體的方法為核酸操作領域中具有通常知識者已知的，且包括基因工程、重組工程及合成技術。參見例如Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY。
於某些具體實施例，載體適合經由腦大池內注射(ICM)投予至病患，包括經由CT導引的枕骨下注射至腦大池。於某些具體實施例，載體適合投予至7歲或更小的對象。於某些具體實施例，載體適合投予至需要其之對象以改善異染性白質失養症之症狀或與芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因突變相關的疾病之症狀、及/或延遲異染性白質失養症之進展或與芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因突變相關的疾病之進展。於某些具體實施例，載體係以單一劑量投予。更詳細內容參見第II部分及第VIII部分。
「複製缺陷的病毒」或「病毒載體」係指合成或人工的病毒顆粒，其中含有感興趣的基因(例如，hARSA編碼序列)的表現匣被包裝於病毒殼體或套膜中，亦被包裝於該病毒殼體或套膜中的任何病毒基因體序列為複製缺陷的；即，它們無法產生後代病毒顆粒，但保留感染目標細胞的能力。於一具體實施例，病毒載體之基因體不包括編碼複製所需酶的基因(該基因體可被工程化為「無膽的」-僅含有感興趣的轉基因，兩側為增幅及包裝人工基因體所需的訊息)，但可能在生產過程中提供此等基因。因此，其由於除非存在複製所需的病毒的酶，否則後代病毒顆粒的複製及感染不會發生，而被認為可安全地用於基因療法。此種複製缺陷的病毒可為腺相關病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒(整合的或非整合的)、或其它適合的病毒來源。 VII. 組成物
於再一態樣，本文提供一組成物，其包含如本文所述rAAV或載體及水性懸浮介質。於某些具體實施例，提供水性組成物，其包含調配緩衝液及所述rAAV或載體。於某些具體實施例，調配緩衝液包含：人工腦脊髓液，其包含緩衝食鹽水、及鈉、鈣、鎂、鉀中的一種或多種或者其混合物；及界面活性劑。於某些具體實施例，調配緩衝液包含約0.0005%至約0.001%的界面活性劑。於某些具體實施例，組成物之pH為7.2至7.8。於某些具體實施例，AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG藥品由如本文所述非複製重組腺相關病毒(rAAV)載體及調配緩衝液所組成。
於某些具體實施例，提供包含如本文所述之rAAV及調配緩衝液之水性醫藥組成物。於某些具體實施例，調配緩衝液包含：人工腦脊髓液，其包含緩衝食鹽水、及鈉、鈣、鎂、鉀中的一種或多種或者其混合物；及界面活性劑。於某些具體實施例，界面活性劑係以醫藥組成物之0.0005%至約0.001%存在。於某些具體實施例，組成物的pH在7.5至7.8之範圍。於某些具體實施例，調配緩衝液適合靜脈內遞送、鞘內投予、或腦室內投予。
於某些具體實施例，提供一種包含所述載體及調配緩衝液之醫藥組成物。於某些具體實施例，調配緩衝液適合靜脈內遞送、鞘內投予、或腦室內投予。
於某些具體實施例，組成物適合經由腦大池內注射(ICM)投予至病患，包括經由CT導引的枕骨下注射至腦大池。於某些具體實施例，組成物適合投予至7歲或更小的對象。於某些具體實施例，組成物適合投予至需要其之對象以改善異染性白質失養症之症狀或與芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因突變相關的疾病之症狀、及/或延遲異染性白質失養症之進展或與芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因突變相關的疾病之進展。於某些具體實施例，以單一劑量投予組成物。於某些具體實施例，組成物每mL具有至少2.50 x 10 13GC rAAV。
本文提供之組成物含有至少一種rAAV原液(stock)(例如，rAAVhu68原液或突變體rAAVhu68原液)及可選擇的載劑、賦形劑及/或防腐劑。rAAV原液係指許多相同的rAAV載體，例如，諸如下文討論濃度及劑量單位時描述的量。
如本文所使用，「載劑(carrier)」包括任何及所有的溶劑、分散介質、媒劑、塗料、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑、等張及吸收延遲劑、緩衝液、載劑溶液、懸浮液、膠體等。此種用於醫藥活性物質的介質及藥劑的用途為本技術領域中眾所周知的。補充的活性成分亦可併入此組成物中。用語「醫藥上可接受的」係指當投予於宿主時不會產生過敏或類似的不良反應的分子實體及組成物。遞送媒劑諸如微脂體、奈米膠囊、微粒、微球、脂質顆粒、囊泡等可用於將本發明之組成物導入適合的宿主細胞中。特別是，遞送載體基因體的rAAV載體可調配用於被包封於脂質粒子、微脂體、囊泡、奈米球或奈米顆粒等之任一者中而遞送。
於一具體實施例，組成物包括適於遞送至對象之最終調配物，例如，為緩衝至生理上可相容的pH及鹽濃度的水性液體懸浮液。可選擇地，調配物中存在一種或多種界面活性劑。於另一具體實施例，可將組成物作為濃縮物運輸，將其稀釋以投予至對象。於其它具體實施例，組成物可被冷凍乾燥並在投予時還原。
適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒的非離子界面活性劑。於一具體實施例，選擇以一級羥基封端的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如，諸如Pluronic ®F68 [BASF]，亦稱為泊洛沙姆188(Poloxamer 188)，其具有中性pH，平均分子量為8400。可選擇其它界面活性劑及其它泊洛沙姆，即由一個聚氧伸丙基(聚(環氧丙烷))之中央疏水鏈及兩側的兩個聚氧伸乙基(聚(環氧乙烷))之親水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(聚乙烯二醇15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚乙二醇辛酸甘油酯(Polyoxy capryllic glyceride))、聚乙二醇10油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一具體實施例，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧伸丙基核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧伸乙基含量百分比。於一具體實施例，選擇泊洛沙姆188。於一具體實施例，界面活性劑能以懸浮液之高至約0.0005%至約0.001% (基於重量比率，w/w%)的量存在。於另一具體實施例，界面活性劑能以懸浮液之高至約0.0005%至約0.001% (基於體積比率，v/v%)的量存在。於再另一具體實施例，界面活性劑能以懸浮液之高至約0.0005%至約0.001%的量存在，其中n%表明每100mL懸浮液中n公克。於再另一具體實施例，界面活性劑能以懸浮液之高至約0.0005%至約0.001%(基於重量對體積的比率，v/w%)的量存在。
如本文所使用，於某些具體實施例，於提及濃度時，「%」為重量比率，例如，物質(經由溶劑溶解到溶液中)重量對於溶劑重量的百分比、或物質(經由溶劑溶解到溶液中)重量對於溶液重量的百分比。於某些具體實施例，於提及濃度時，「%」為體積比率，例如，物質(經由溶劑溶解到溶液中)體積對於溶劑體積的百分比、或物質(經由溶劑溶解到溶液中)體積對於溶液體積的百分比。於某些具體實施例，於提及濃度時，「%」表明每100mL之溶劑或溶液中物質(經由溶劑溶解到溶液中)之公克數。於某些具體實施例，於提及濃度時，「%」為重量對體積的比率，例如，物質(經由溶劑溶解到溶液中)重量對於溶劑體積的百分比、或物質(經由溶劑溶解到溶液中)重量對於溶液體積的百分比。
以足夠的量投予載體以轉染細胞並提供基因轉移及表現之足夠的水準，以提供治療益處，而沒有不適當的不良影響、或具有醫學上可接受的生理作用，此可由醫學領域中具有通常知識者確定。習用及醫藥上可接受的投予途徑包括但不限於直接遞送至所欲器官(例如，腦、CSF、肝臟(可選擇地經由肝動脈)、肺臟、心臟、眼、腎臟)、口服、吸入、鼻內、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、腦實質內(intraparenchymal)、腦室內、鞘內、ICM、腰椎穿刺及其它非經口途徑之投予。若期望，可組合投予途徑。
病毒載體的劑量主要取決於諸如所治療的病況、病患的年齡、體重、及健康狀況的因子，因此於病患間可能會變化。例如，病毒載體之治療上有效的人類劑量一般於範圍為約25至約1000微升至約100 mL之溶液，含有濃度為約1 x 10 9至1 x 10 16載體基因體拷貝。於某些具體實施例，遞送體積約1 mL至約15 mL、或約2.5 mL至約10 mL、或約5mL之懸浮液。於某些具體實施例，遞送體積約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、或約15 mL之懸浮液。於某些具體實施例，以此體積投予一總共約8.9 x 10 12至2.7 x 10 14GC之劑量。於某些具體實施例，以此體積投予一約1.1 x10 10GC/g腦質量至約3.3 x 10 11GC/g腦質量之劑量。於某些具體實施例，以此體積投予一每公克腦質量約3.0 x10 9、約4.0 x10 9、約5.0 x10 9、約6.0 x10 9、約7.0 x10 9、約8.0 x10 9、約9.0 x10 9、約1.0 x10 10、約1.1 x10 10、約1.5 x10 10、約2.0 x10 10、約2.5 x10 10、約3.0 x10 10、約3.3 x10 10、約3.5 x10 10、約4.0 x10 10、約4.5 x10 10、約5.0 x10 10、約5.5 x10 10、約6.0 x10 10、約6.5 x10 10、約7.0 x10 10、約7.5 x10 10、約8.0 x10 10、約8.5 x10 10、約9.0 x10 10、約9.5 x10 10、約1.0 x10 11、約1.1 x10 11、約1.5 x10 11、約2.0 x10 11、約2.5 x10 11、約3.0 x10 11、約3.3 x10 11、約3.5 x10 11、約4.0 x10 11、約4.5 x10 11、約5.0 x10 11、約5.5 x10 11、約6.0 x10 11、約6.5 x10 11、約7.0 x10 11、約7.5 x10 11、約8.0 x10 11、約8.5 x10 11、約9.0 x10 11GC之劑量。
對象年齡 假定的腦質量(g)
≥4至＜9個月 600
≥9至＜18個月 1000
≥18個月至＜3歲 1100
≥3歲 1300
調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的重組載體的治療應用而變化。可監測轉基因產物之表現水準以確定產生病毒載體之劑量頻率，較佳為含有袖珍基因(minigene)的AAV載體。可選擇地，與用於治療目的所描述者相似的劑量方案可利用於使用本發明之組成物的免疫。
能以劑量單位來調配複製缺陷的病毒組成物，使含有複製缺陷的病毒之量在約1.0 x 10 9GC至約1.0 x 10 16GC之範圍(以治療一對象)，包括該範圍內的所有整數或分數量，且對於人類病患較佳為1.0 x 10 12GC至1.0 x 10 14GC。於一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、或9x10 9GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10、或9x10 10GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11、或9x10 11GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12、或9x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13、或9x10 13GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14、或9x10 14GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15、或9x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一具體實施例，對於人類應用，劑量可為每劑1x10 10至約1x10 12GC之範圍，包括該範圍內的所有整數或分數量。
此等上述劑量能以各種體積的載劑、賦形劑或緩衝液調配物投予，範圍自約25至約1000微升，或更大體積，包括此範圍內所有數量，取決於欲治療區域的大小、使用的病毒效價、投予途徑、及該方法之所欲效果。於一具體實施例，載劑、賦形劑或緩衝液之體積為至少約25 µL。於一具體實施例，體積為約50 µL。於另一具體實施例，體積為約75 µL。於另一具體實施例，體積為約100 µL。於另一具體實施例，體積為約125 µL。於另一具體實施例，體積為約150 µL。於另一具體實施例，體積為約175 µL。於再另一具體實施例，體積為約200 µL。於另一具體實施例，體積為約225 µL。於再另一具體實施例，體積為約250 µL。於再另一具體實施例，體積為約275 µL。於再另一具體實施例，體積為約300 µL。於再另一具體實施例，體積為約325 µL。於另一具體實施例，體積為約350 µL。於另一具體實施例，體積為約375 µL。於另一具體實施例，體積為約400 µL。於另一具體實施例，體積為約450 µL。於另一具體實施例，體積為約500 µL。於另一具體實施例，體積為約550 µL。於另一具體實施例，體積為約600 µL。於另一具體實施例，體積為約650 µL。於另一具體實施例，體積為約700 µL。於另一具體實施例，體積為約700及1000 µL之間。
於某些具體實施例，劑量可在約1 x 10 9GC/g腦質量至約1 x 10 12GC/g腦質量之範圍。於某些具體實施例，劑量可在約1 x 10 10GC/g腦質量至約1 x 10 12GC/g腦質量之範圍。於某些具體實施例，劑量可在約3 x 10 10GC/g腦質量至約5 x 10 11GC/g腦質量之範圍。
於一具體實施例，病毒構築體能以至少約1x10 9GC至約1 x 10 15、或約1 x 10 11至5 x 10 13GC之劑量被遞送。遞送此等劑量之適合的體積及濃度可由本技術領域中具有通常知識者決定。例如，可選擇約1 µL至150mL的體積，對於成年人選擇較大體積。典型地，適合新生兒的體積為約0.5 mL至約10 mL，對於較大嬰兒，可選擇約0.5 mL至約15mL。對於幼兒，可選擇約0.5 mL至約20mL的體積。對於兒童，可選擇多至約30mL的體積。對於前青少年(pre-teen)及青少年，可選擇多至約50mL的體積。於又一其它具體實施例，病患可接受鞘內投予，選擇約5 mL至約15mL的體積，或約7.5 mL至約10 mL。可決定其它適合的體積及劑量。可調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的重組載體的治療應用而變化。
可將上述重組載體依據已公開的方法遞送至宿主細胞。可投予rAAV至人類或非人類的哺乳動物病患，其較佳懸浮於生理學上可相容的載劑。於某些具體實施例，為了投予至人類病患，將rAAV適合地懸浮於水性溶液，該水性溶液含有食鹽水、界面活性劑、及生理上可相容的鹽或鹽之混合物。適合地，調整此調配物至生理上可接受的pH，例如，範圍為pH 6至9、或pH 6.5至7.5、pH 7.0至7.7、或pH 7.2至7.8。由於腦脊髓液之pH為約7.28至約7.32，於鞘內遞送，理想可為pH於此範圍內；而於靜脈內遞送，理想可為約6.8至約7.2之pH。然而，可選擇該最廣範圍及此等子範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。
於另一具體實施例，組成物包括載劑、稀釋劑、賦形劑及/或佐劑。鑑於轉移病毒所針對的適應症，本技術領域中具有通常知識者可容易地選擇適合的載劑。例如，一適合的載劑包括食鹽水，其能以許多緩衝溶液來調配(例如，磷酸鹽緩衝食鹽水)。其它示例性載劑包括無菌的食鹽水、乳糖、蔗糖、磷酸鈣、明膠、聚葡萄糖、瓊脂、果膠、花生油、芝麻油、及水。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附到輸液管上但不干擾rAAV活體內結合活性的成分。適合的界面活性劑或界面活性劑的組合可選自無毒的非離子界面活性劑。於一具體實施例，選擇以一級羥基封端的雙官能嵌段共聚物界面活性劑，例如，諸如泊洛沙姆188(亦以商業名稱Pluronic® F68 [BASF]、Lutrol® F68、Synperonic® F68、Kolliphor® P188而為人所知)，其具有中性pH，具有8400之平均分子量。可選擇其它界面活性劑及其它泊洛沙姆，即由一個聚氧伸丙基(聚(環氧丙烷))之中央疏水鏈及兩側的兩個聚氧伸乙基(聚(環氧乙烷))之親水鏈所構成的非離子三嵌段共聚物、SOLUTOL HS 15(聚乙烯二醇15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚乙二醇辛酸甘油酯)、聚乙二醇油基醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。於一具體實施例，調配物含有泊洛沙姆。此等共聚物通常以字母「P」(用於泊洛沙姆)跟三個數字命名：前兩個數字x100給出聚氧伸丙基核心的近似分子量，最後一個數字x10給出聚氧伸乙基含量百分比。於一具體實施例，選擇泊洛沙姆188。界面活性劑能以懸浮液之多至約0.0005%至約0.001%的量存在。
於一例中，調配物可含有，例如，緩衝食鹽水溶液，該緩衝食鹽水溶液係於水中包含氯化鈉、碳酸氫鈉、右旋糖、硫酸鎂(例如硫酸鎂・7H 2O)、氯化鉀、氯化鈣(例如氯化鈣・2H 2O)、磷酸氫二鈉及其混合物中的一或多種。適合地，對於鞘內遞送，容積滲透濃度(osmolarity)在與腦脊髓液相容的範圍內(例如，約275至約290)；參見例如emedicine.medscape.com/-article/2093316-overview。可選擇地，對於鞘內遞送，可使用市售稀釋劑作為懸浮劑，或與另一種懸浮劑及其它可選擇的賦形劑組合使用。
參見例如Elliotts B®溶液[Lukare Medical]。各10mL之 Elliotts B溶液含有：氯化鈉，USP - 73 mg；碳酸氫鈉，USP - 19 mg；右旋糖，USP 8 mg；硫酸鎂・7H2O，USP  3 mg；氯化鉀，USP- 3 mg；氯化鈣・2H2O，USP -2 mg；磷酸氫二鈉・7H2O，USP- 2 mg；注射用水，USP qs 10 mL。
電解質之濃度：鈉149 mEq/公升；碳酸氫根22.6 mEq/公升；鉀4.0 mEq/公升；氯132 mEq/公升；鈣2.7 mEq/公升；硫酸根2.4 mEq/公升；鎂2.4 mEq/公升；磷酸根1.5 mEq/公升。
成分的分子式及分子量為：
成分 分子式 分子量
氯化鈉 NaCl 58.44
碳酸氫鈉 NaHCO 3 84.01
右旋糖 C 6H 12O 6 180.16
硫酸鎂・7H2O Mg 2SO 4・7H2O 246.48
氯化鉀 KCl 74.55
氯化鈣・2H2O CaCl 2・2H 2O 147.01
磷酸氫二鈉・7H2O Na 2HPO 4・7H 2O 268.07
Elliotts B溶液之pH為6至7.5，容積滲透濃度為每公升288 mOsmol (計算值)。於某些具體實施例，係以pH範圍6.8至8、或7.2至7.8、或7.5至8來遞送含有rAAVhu68.hARSA的組成物。於鞘內遞送，理想可為pH高於7.5，例如，7.5至8、或7.8。
於某些具體實施例，調配物可含有不包含碳酸氫鈉之緩衝食鹽水水性溶液。此種調配物可含有於水中包含磷酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂及其混合物之一或多者的緩衝食鹽水水性溶液，諸如Harvard緩衝液。水性溶液可進一步含有Kolliphor® P188，一種泊洛沙姆，其由BASF商業販售，之前以商標名Lutrol®F68出售。該水性溶液可具有7.2之pH。
於另一具體實施例，調配物可含有包含下列之緩衝食鹽水水性溶液：1 mM磷酸鈉(Na 3PO 4)、150 mM氯化鈉(NaCl)、3 mM氯化鉀(KCl)、1.4 mM氯化鈣(CaCl 2)、0.8 mM氯化鎂(MgCl 2)、及0.001%泊洛沙姆(例如，Kolliphor®) 188，pH 7.2。參見例如harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。於某些具體實施例，Harvard緩衝液為較佳，因Harvard緩衝液觀察到較佳的pH穩定性。下表提供Harvard緩衝液及Elliot’s B緩衝液之比較。
腦脊髓液(CSF)組成物
成分 單位 CSF Elliot’s B Harvard’s
Na + mEq/L 117-137 149 150
K + mEq/L 2.3-4.6 4.0 3.0
Mg + mEq/L 2.2 2.4 0.8
Ca 2+ mEq/L 2.2 2.7 1.4
Cl - mEq/L 113-127 132 155
HCO 3 - mEq/L 22.9 22.6 0
Phos mg/dL 1.2-2.1 1.5 1.0
葡萄糖 mg/dL 45-80 80 -
Pluronic % - 0.001% (添加) 0.001% (添加)
容積滲透濃度 mOsm/L 295 288 290
pH 7.31 6.0-7.5* 漂移至9+ (8.2+ w/o 滴定) 7.2 (被滴定至)
於某些具體實施例，調配緩衝液為具有Pluronic F68的人工CSF。於其它具體實施例，調配物可含有一或多種之滲透增強劑。適合的滲透增強劑之例可包括例如甘露醇、甘膽酸鈉、牛磺膽酸鈉、去氧膽酸鈉、水楊酸鈉、辛酸鈉、癸酸鈉、月桂硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂醚或EDTA。
可選擇地，除了rAAV及載劑之外，本發明之組成物可含有其它習用的醫藥成分，諸如防腐劑、或化學穩定劑。適合的示例性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯類(parabens)、乙基香草醛、甘油、苯酚及對氯苯酚。適合的化學穩定劑包括明膠及白蛋白。
依據本發明之組成物可包含醫藥上可接受的載劑，如上定義。適合地，本文所述組成物包含有效量之一或多種AAV，懸浮於醫藥上適合的載劑及/或與適合的賦形劑混合而被設計用於經由注射、滲透泵、鞘內導管、或以另外的裝置或途徑遞送至對象。於一例中，組成物被調配用於鞘內遞送。
如本文所使用，術語「鞘內遞送」或「鞘內投予」係指經由注射進入椎管的投予途徑，更具體而言為進入蜘蛛膜下腔以使其到達腦脊髓液(CSF)。鞘內遞送可包括腰椎穿刺、室內(包括腦室內(ICV))、枕骨下/腦池內、及/或C1-2穿刺。例如，可藉由腰椎穿刺的手段導入物質以在整個蜘蛛膜下腔擴散。於另一例中，可注射至腦大池(即腦大池內或ICM)。在某些具體實施例中，鞘內投予如2019年11月29日公開的美國專利公開號2018-0339065 A1中所述進行，其藉由引用而完整併入本文。在某些具體實施例中，CNS投予係使用Ommaya Reservoir (亦稱為Ommaya裝置或Ommaya系統)進行。
如本文所使用，術語「腦池內遞送」或「腦池內投予」係指藥物直接進入腦大池小腦延髓之腦脊髓液中的投予途徑，更具體而言係經由枕骨下穿刺或藉由直接注射至腦大池或經由永久定位的管子。
於某些具體實施例，最終調配緩衝液包含人工腦脊髓液及界面活性劑，該人工腦脊髓液包含緩衝食鹽水、及鈉、鈣、鎂、鉀中的一種或多種或者其混合物。於某些具體實施例，界面活性劑為懸浮液之約0.0005% w/w至約0.001% w/w。於某些具體實施例，界面活性劑為Pluronic F68。於某些具體實施例，Pluronic F68係以懸浮液的約0.0001%的量存在。於某些具體實施例，用於鞘內遞送的組成物的pH為7.5至7.8。
於某些具體實施例，本文所述組成物之治療在動物及/或人類病患中具有最小至輕度的DRG感覺神經元的無症狀變性，對於感覺神經毒性及次臨床感覺神經元病灶為良好耐受的。
於某些具體實施例，本文所述組成物於治療的對象有用於改善功能的及臨床的結果。此種結果可於下列時間點測量：組成物投予後約30日、約60日、約90日、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約13個月、約14個月、約15個月、約16個月、約17個月、約18個月、約19個月、約20個月、約21個月、約22個月、約23個月、約24個月、約2.5年、約3年、約3.5年、約4年、約4.5年及然後每年一次直到約5年。測量頻率可為約每1個月、約每2個月、約每3個月、約每4個月、約每5個月、約每6個月、約每7個月、約每8個月、約每9個月、約每10個月、約每11個月、或約每12個月。
於某些具體實施例，與未治療的對照比較，本文所述組成物於經治療的對象中顯示所測量的藥效學及臨床功效。
於某些具體實施例，可經由下列一或多種而評估藥效學功效、臨床功效、功能性結果、臨床結果、疾病改善、或疾病進展：ARSA之濃度及/或水準及/或生物活性(例如，於血清或於CSF)、尿液髓硫脂類、CNS髓鞘化(脫髓鞘負荷及樣式)、藉由MRI測得的白質萎縮、神經元代謝物N-乙醯天冬胺酸(NAA)、肌醇(mI)、膽鹼(Cho)及/或乳酸鹽(Lac)水準(例如，藉由質子磁振頻譜(MRS)測得)、CSF髓硫脂及溶血髓硫脂水準、視覺誘發電位(VEP)、腦幹聽覺誘發反應(BAER)、膽囊壁增厚(例如，經由超音波評估)；運動功能(例如，藉由異染性白質失養症之粗大動作功能分類(GMFC-MLD)或粗大動作功能評量(GMFM)測得)、藉由達成的年齡、喪失的年齡及保持或獲得動作里程碑的兒童的百分比來評估之動作里程碑達成(如世界衛生組織[WHO]基準所定義)；認知功能(例如，藉由貝萊嬰兒發展量表[BSIDIII]、魏氏兒童智力量表第五版[WISC-V]測得的總智商[IQ]及子域IQ)；壽命(與病患比較)、神經學臨床檢查(NCE)；尺神經、腓深神經、正中神經、腓腸神經之神經傳導速度(NCV)；藉由癲癇發作日記記錄的癲癇發作的發病年齡及頻率；行為功能(例如，藉由文蘭適應行為量表第三版(VinelandIII)測得)；藍斯基表現指數；兒童生活品質量表(例如，PedsQL及PedsQL-IS)；及照護者/父母的生活品質。
於某些具體實施例，可藉由下述評估藥效學功效、臨床功效、功能性結果、臨床結果、疾病改善、或疾病進展：異常性質(例如生物標記活性、電生理學活性、及/或成像參數)及臨床觀察(例如，粗大及精細動作功能、認知及語言發展、神經學檢查所見、行為及里程碑發展、以及照護者/父母報告的結果及生活品質評估降低)。可評估其它疾病改善或疾病進展，參見第II及VIII部分，其相關段落藉由引用而完整併入本文。
替代地或附加地，藥效學功效、臨床功效、功能性結果、或臨床結果可包括生物標記，例如，rAAVhu68.hARSAco.之藥效學及生物活性。 IIX. 方法
於另一態樣，提供一種方法，其用於治療具有與ARSA突變相關的疾病或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)之對象、或改善與ARSA突變相關的疾病或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)的症狀、或延遲與ARSA突變相關的疾病或由功能性芳基硫酸酯酶A缺乏正常水準所引起的疾病(例如，MLD)之進展。該方法包含投予有效量之如本文所述rAAV或載體至需要的對象。於某些具體實施例，該載體或rAAV可經由腦大池內注射(ICM)投予至病患，例如，CT導引的枕骨下注射至腦大池。於某些具體實施例，提供一種載體或組成物，其可被投予至具有異染性白質失養症之7歲或更小的病患。於某些具體實施例，該方法涉及以單一劑量遞送rAAV或載體至人類病患。於某些具體實施例，以每公克腦質量3.00 x 10 10基因體拷貝(GC)(GC/g)至1.00 x 10 12GC/g腦質量之間的劑量投予rAAV。於某些具體實施例，投予後，對象之疾病症狀被改善及/或疾病進展被延遲。
儘管神經系統導向的AAV基因療法於活體內主要靶向神經元，但交叉矯正潛力開啟了矯正缺乏ARSA的髓鞘化細胞的可能性，該細胞於活體內無法被大多數基因療法載體所轉導(Cearley et al., 2008；Lawlor et al., 2009)。
於某些具體實施例，本文中「有效量」為達成MLD症狀之改善及/或延遲MLD進展的量。
以足夠的量投予載體以轉染細胞並提供基因轉移及表現之足夠的水準，以提供治療益處，而沒有不適當的不良影響、或具有醫學上可接受的生理作用，此可由醫學領域中具有通常知識者確定。習用及醫藥上可接受的投予途徑包括但不限於直接遞送至所欲器官(例如，腦、CSF、肝臟(可選擇地經由肝動脈)、肺臟、心臟、眼、腎臟)、口服、吸入、鼻內、鞘內、氣管內、動脈內、眼內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、腦實質內、腦室內、鞘內、ICM、腰椎穿刺及其它非經口途徑之投予。若期望，可組合投予途徑。
病毒載體(例如，rAAV)的劑量主要取決於諸如所治療的病況、病患的年齡、體重、及健康狀況的因子，因此於病患間可能會變化。例如，病毒載體之治療上有效的人類劑量一般於範圍為約25至約1000微升至約100mL之溶液，含有濃度為約1 x 10 9至1 x 10 16載體基因體拷貝。於某些具體實施例，遞送體積約1 mL至約15 mL、或約2.5 mL至約10 mL、或約5mL的懸浮液。於某些具體實施例，遞送體積約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、或約15mL的懸浮液。於某些具體實施例，以此體積投予一總共約8.9 x 10 12至2.7 x 10 14GC之劑量。於某些具體實施例，以此體積投予一約1.1 x10 10GC/g腦質量至約3.3 x 10 11GC/g腦質量之劑量。於某些具體實施例，以此體積投予一每公克腦質量約3.0 x10 9、約4.0 x10 9、約5.0 x10 9、約6.0 x10 9、約7.0 x10 9、約8.0 x10 9、約9.0 x10 9、約1.0 x10 10、約1.1 x10 10、約1.5 x10 10、約2.0 x10 10、約2.5 x10 10、約3.0 x10 10、約3.3 x10 10、約3.5 x10 10、約4.0 x10 10、約4.5 x10 10、約5.0 x10 10、約5.5 x10 10、約6.0 x10 10、約6.5 x10 10、約7.0 x10 10、約7.5 x10 10、約8.0 x10 10、約8.5 x10 10、約9.0 x10 10、約9.5 x10 10、約1.0 x10 11、約1.1 x10 11、約1.5 x10 11、約2.0 x10 11、約2.5 x10 11、約3.0 x10 11、約3.3 x10 11、約3.5 x10 11、約4.0 x10 11、約4.5 x10 11、約5.0 x10 11、約5.5 x10 11、約6.0 x10 11、約6.5 x10 11、約7.0 x10 11、約7.5 x10 11、約8.0 x10 11、約8.5 x10 11、約9.0 x10 11GC之劑量。
調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的重組載體的治療應用而變化。可監測轉基因產物之表現水準以確定產生病毒載體之劑量頻率，較佳為含有袖珍基因的AAV載體。可選擇地，與用於治療目的所描述者相似的劑量方案可利用於使用本發明之組成物的免疫。
能以劑量單位來調配複製缺陷的病毒組成物，使含有複製缺陷的病毒之量在約1.0 x 10 9GC至約1.0 x 10 16GC之範圍(以治療一對象)，包括該範圍內的所有整數或分數量，且對於人類病患較佳為1.0 x 10 12GC至1.0 x 10 14GC。於一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、或9x10 9GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10、或9x10 10GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11、或9x10 11GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12、或9x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13、或9x10 13GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14、或9x10 14GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，調配組成物以使每劑含有至少1x10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15、或9x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
於一具體實施例，對於人類應用，劑量範圍可為每公斤體重1x10 10至約1x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
於一具體實施例，載體之有效量為每公斤體重約1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、或9x10 9GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公斤體重約1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10、或9x10 10GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公斤體重約1x10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11、或9x10 11GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公斤體重約1x10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12、或9x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公斤體重約1x10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13、或9x10 13GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公斤體重約1x10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14、或9x10 14GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公斤體重約1x10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15、或9x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
於一具體實施例，對於人類應用，劑量範圍可為每公克(g)腦質量1x10 10至約1x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於一具體實施例，載體之有效量為每公克(g)腦質量約1x10 9、2x10 9、3x10 9、4x10 9、5x10 9、6x10 9、7x10 9、8x10 9、或9x10 9GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公克(g)腦質量約1x10 10、2x10 10、3x10 10、4x10 10、5x10 10、6x10 10、7x10 10、8x10 10、或9x10 10GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公克(g)腦質量約1x10 11、2x10 11、3x10 11、4x10 11、5x10 11、6x10 11、7x10 11、8x10 11、或9x10 11GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公克(g)腦質量約1x10 12、2x10 12、3x10 12、4x10 12、5x10 12、6x10 12、7x10 12、8x10 12、或9x10 12GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公克(g)腦質量約1x10 13、2x10 13、3x10 13、4x10 13、5x10 13、6x10 13、7x10 13、8x10 13、或9x10 13GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公克(g)腦質量約1x10 14、2x10 14、3x10 14、4x10 14、5x10 14、6x10 14、7x10 14、8x10 14、或9x10 14GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。於另一具體實施例，載體之有效量為每公克(g)腦質量約1x10 15、2x10 15、3x10 15、4x10 15、5x10 15、6x10 15、7x10 15、8x10 15、或9x10 15GC，包括該範圍內的所有整數或分數量。
此等上述劑量能以各種體積的載劑、賦形劑或緩衝液調配物投予，範圍自約25至約1000微升，或更大體積，包括此範圍內所有數量，取決於欲治療區域的大小、使用的病毒效價、投予途徑、及該方法之所欲效果。於一具體實施例，載劑、賦形劑或緩衝液之體積為至少約25 µL。於一具體實施例，體積為約50 µL。於另一具體實施例，體積為約75 µL。於另一具體實施例，體積為約100 µL。於另一具體實施例，體積為約125 µL。於另一具體實施例，體積為約150 µL。於另一具體實施例，體積為約175 µL。於再另一具體實施例，體積為約200 µL。於另一具體實施例，體積為約225 µL。於再另一具體實施例，體積為約250 µL。於再另一具體實施例，體積為約275 µL。於再另一具體實施例，體積為約300 µL。於再另一具體實施例，體積為約325 µL。於另一具體實施例，體積為約350 µL。於另一具體實施例，體積為約375 µL。於另一具體實施例，體積為約400 µL。於另一具體實施例，體積為約450 µL。於另一具體實施例，體積為約500 µL。於另一具體實施例，體積為約550 µL。於另一具體實施例，體積為約600 µL。於另一具體實施例，體積為約650 µL。於另一具體實施例，體積為約700 µL。於另一具體實施例，體積為約700及1000 µL之間。
於某些具體實施例，劑量可在約1 x 10 9GC/g腦質量至約1 x 10 12GC/g腦質量之範圍。於某些具體實施例，劑量可在約1 x 10 10GC/g腦質量至約3 x 10 11GC/g腦質量之範圍。於某些具體實施例，劑量可在約1 x 10 10GC/g腦質量至約2.5 x 10 11GC/g腦質量之範圍。於某些具體實施例，劑量可在約5 x 10 10GC/g腦質量之範圍。
於一具體實施例，病毒構築體能以至少約1x10 9GC至約1 x 10 15、或約1 x 10 11至5 x 10 13GC之劑量被遞送。遞送此等劑量之適合的體積及濃度可由本技術領域中具有通常知識者決定。例如，可選擇約1 µL至150 mL的體積，對於成年人選擇較大體積。典型地，適合新生兒的體積為約0.5 mL至約10 mL，對於較大嬰兒，可選擇約0.5 mL至約15 mL。對於幼兒，可選擇約0.5 mL至約20 mL的體積。對於兒童，可選擇多至約30 mL的體積。對於前青少年及青少年，可選擇多至約50 mL的體積。於又一其它具體實施例，病患可接受鞘內投予，選擇約5 mL至約15 mL的體積，或約7.5 mL至約10 mL。可決定其它適合的體積及劑量。可調整劑量以平衡治療益處與任何副作用，且此種劑量可依據運用的重組載體的治療應用而變化。
可將上述重組載體依據已公開的方法遞送至宿主細胞。可投予rAAV至人類或非人類的哺乳動物病患，其較佳懸浮於生理學上可相容的載劑。於某些具體實施例，為了投予至人類病患，將rAAV適合地懸浮於水性溶液，該水性溶液含有食鹽水、界面活性劑、及生理上可相容的鹽或鹽之混合物。適合地，調整此調配物至生理上可接受的pH，例如，範圍為pH 6至9、或pH 6.5至8.5、pH 7至7.8。由於腦脊髓液之pH為約7.28至約7.32，於鞘內遞送，理想可為pH於此範圍內；而於靜脈內遞送，理想可為約6.8至約7.2之pH。然而，可選擇該最廣範圍及此等子範圍內的其它pH用於其它遞送途徑。
於某些具體實施例，本文所述組成物之治療在動物及/或人類病患中具有最小至輕度的DRG感覺神經元的無症狀變性，對於感覺神經毒性及次臨床感覺神經元病灶為良好耐受的。
於某些具體實施例，對於該rAAV、載體、組成物、及方法所提議的族群由下述對象所組成：具有早發性嬰兒晚期及少年早期MLD的對象，其具有症狀發作＜7歲，且其之可預測及快速的衰退於合理的追蹤期間內支持穩健的研究設計及功能性結果的評估。
經由該rAAV、載體、組成物或方法之治療係為了改善疾病症狀及延遲疾病進展，包括穩定潛在的病理，從而預防疾病發病並允許正常或接近正常的運動及認知發展，或實質上防止或延遲技能喪失(諸如獲得的發展及動作里程碑)及疾病進展。症狀發生前的病患有資格接受此治療。
AAV.hARSAco之AAVhu68殼體及ICM ROA有效地轉導皮質的神經元、一小部分產生髓鞘質的寡樹突細胞、具有伸入PNS的軸突之運動神經元、及具有伸入脊髓與周圍神經兩者的軸突之DRG感覺神經元。鑑於CNS及PNS均具有廣泛的轉導概貌(transduction profile)，ARSA酶交叉矯正可治療於許多MLD病患中觀察到的CNS表現及周圍神經病變兩者，HSC‑GT或HSCT並未解決此等問題。
鑑於MLD的性質，CNS損傷被認為是很大程度上不可逆的且於早發性族群中快速的疾病進展，本文所述rAAV、載體、組成物或方法於不具有疾病或具有輕度至中度疾病的病患中賦予最大的獲益潛力。ICM遞送的AAV基因療法，諸如AAV.hARSAco，與基於HSC的療法相比，顯示快速的動力學起始作用，於投予後3週於CSF中具有ARSA表現高峰(參見實施例)。結果，即使在已經具有某些疾病的臨床徵象的病患中，AAVhARSAco亦可能停止疾病進展。因此，具有輕度至中度徵象及症狀的早發性MLD的病患會有資格接受藉由本文所述的rAAV、載體、組成物或方法之治療(稱為「治療」)，包括彼等具有輕度步態異常的病患，其能夠步行且能夠獨立行走至少10步，於動作里程碑獲得的明顯延遲(基於WHO基準，定義為＞達到指定里程碑時的年齡的第95個百分位數(Wijnhoven et al., 2004))，及於神經學檢查的輕度徵象。
於具有輕度至中度症狀的病患中不常見的疾病進展指標將被排除在試驗範圍之外，包括例如需要胃造口術的進食困難、癲癇發作的發展、低認知功能、神經學檢查發現的嚴重異常(諸如輕快的反射、嚴重的肌張力減退(hypotonus)或肢體痙攣、嚴重的吞嚥困難、運用障礙或共濟失調)、以及視覺或聽覺喪失。於某些具體實施例，此疾病進展的延遲顯示在臨床功能低水準下穩定疾病。
於某些具體實施例，該方法的藥效學及功效結果係於1、3及6個月測量，然後於2年的短期追蹤期內每6個月進行測量，除了彼等需要鎮靜及/或LP者之外。於長期追蹤期間，評估頻率降低至每12個月一次。考量未治療的早發性MLD病患的疾病進展的快速，亦選擇前2年的早期時間點與6個月的間隔。
於某些具體實施例，經由評估粗大動作功能而顯示疾病症狀的改善或疾病進展的延遲。GMFC-MLD為經過驗證的、可靠且簡單的工具，用於MLD病患粗大動作功能及隨著時間的衰退之標準化評估(Kehrer et al., 2011b)。其以類似工具為模型，該工具評估具有腦性麻痺的兒童的運動功能，並基於自發運動的差異將兒童的運動功能分類成五個級別之一(Palisano et al., 2006)。Kehrer等人改編與具有MLD病患相關的分類系統，並提供了一個分類系統，其中級別間的差異在具有MLD的兒童之日常生活中會被認為是有意義的(下表)(Kehrer et al., 2011a；Kehrer et al., 2011b)。GMFC-MLD已被用於描述MLD的自然史(Kehrer et al., 2011a)及評估治療介入後的運動功能(Sessa et al., 2016)兩者。GMFC-MLD的一個潛在限制為該工具係於18個月齡以上的兒童驗證，由於其表示兒童正常學習步行時的年齡上限(Largo et al., 1985；WHO, 2006)。然而，該工具仍然適用於在這個年齡之前達到步行里程碑的兒童。
表.於異染性白質失養症中的粗大動作功能分類系統
級別0 在沒有支撐下步行，具有年齡正常的表現品質
級別1 在沒有支撐下步行，但表現品質下降，即，站立或步行時不穩定
級別2 在支撐下步行。在沒有支撐下不可能步行(少於五步)
級別3 在沒有支撐下坐著、及有諸如爬行或滾動的移位動作。在有或沒有支撐下皆不可能步行
級別4 (a)在沒有支撐下坐著但沒有移位動作，或 (b)在沒有支撐下不可能坐著，但有諸如爬行或滾動的移位動作
級別5 在沒有支撐下無移位動作也無法坐著，但可控制頭部
級別6 喪失任何移位動作以及喪失任何頭部及軀幹控制
GMFM被包括作為評估疾病症狀的改善或疾病進展的延遲的量度。其係一種標準化的觀察工具，被設計及驗證以測量具有腦性麻痺的兒童的隨著時間之粗大動作功能的變化以及介入後粗大動作功能的變化(Russell et al., 1989；Lundkvist Josenby et al., 2009；Alotaibi et al., 2014)。GMFM為一種88個項目的工具，其評估運動功能，該功能分組為五個功能區域：躺著及滾動、坐著、爬行及跪著、站立、以及步行、跑步及跳躍。亦已對健康兒童開發了參考曲線，此等兒童通常在5歲之前獲得量表上最困難的技能(步行、跑步、跳躍)(Palisano et al., 2006)。儘管該工具未針對具有MLD的兒童作驗證，但已被證實有用於在症狀發生前階段接受治療的對象中接受HSC-GT的早發性MLD病患表現出(接近)正常的粗大動作發展(Sessa et al., 2016；Fumagalli et al., 2017)。88個項目工具的優點之一為其含有大量有關運動功能各個方面的資訊，且子域可分別被彙總及報告。由於平台效應(plateau effect)，該工具於年齡較大的少年早期病患(在納入研究之前可能已達到GMFM最高分數)可能無法提供足夠的資訊(即無法測量新技能的獲取)，儘管其仍然能夠顯示粗大動作功能隨著時間的維持或喪失。
周圍神經病變為MLD之常見、痛苦、及逐漸衰弱的表現，可加重此等病患的精細及粗大動作功能異常(Gieselmann and Krageloh-Mann, 2010；van Rappard et al., 2015)。基於HSC的治療似乎並未實質改善周圍神經病變(Boucher et al., 2015；van Rappard et al., 2016)。AAV.hARSAco轉導神經元、DRG及周圍神經軸突細胞的能力允許在腦及周圍神經功能異常中表現ARSA酶。可進行神經學檢查以評估周圍神經病變的臨床表現，且可對代表性的運動神經及感覺神經(腓深神經、正中神經、尺神經及腓腸神經)進行神經傳導研究。由於MLD主要是一種脫髓鞘疾病，因此神經傳導速度被認為是該疾病的一種相關的神經生理學參數(Biffi et al., 2008)，且可被測量。
動作里程碑發展取決於對象納入時的年齡及疾病階段。依據納入時對象的年齡，對象可能已達到某些運動技能或尚未顯示出動作里程碑發展的徵象。評估將會追蹤所有里程碑之達成年齡(age-at-achievement)及喪失年齡(age-at-loss)。動作里程碑達成將會基於下表中列出的WHO基準，定義為六個粗大動作里程碑。
表.粗大動作里程碑(Gross Motor Milestone)之世界衛生組織實作基準
粗大動作里程碑 多中心生長參考研究實作基準 (Multicenter Growth Reference Study Performance Criteria)
在無支撐下坐著 兒童直立坐著，且頭部直立至少10秒鐘。兒童不使用手臂或手來平衡身體或支撐姿勢。
手膝爬行 兒童交替地向前或向後移動手及膝蓋。腹部不接觸到支撐表面。有持續且連續的動作，至少連續三個。
在輔助下站立 兒童以雙腳直立姿勢站立，以雙手抓住一穩定物體(例如，家具)而不靠在上面。身體不碰到穩定的物體，且腿支撐著大部分體重。兒童因此在輔助下站立至少10秒鐘。
在輔助下行走 兒童處於直立的姿勢，且背部挺直。兒童以單或雙手抓住一穩定物體(例如，家具)向側邊或前方進行邁步。一腿向前移動，而另一腿支撐部分體重。兒童以此方式走至少五步。
獨自站立 兒童以雙腳(非腳趾)直立姿勢站立，且背部挺直。雙腿支撐兒童100%體重。沒有與人或物體的接觸。兒童獨自站立至少10秒鐘。
獨自行走 兒童在直立姿勢且背部挺直下，至少獨立走五步。一腿向前移動，另一腿支撐大部分體重。沒有與人或物體的接觸。
改編自(Wijnhoven et al., 2004)
可評估神經認知及行為的表現以顯示疾病症狀的改善或疾病進展的延遲。評估此等表現對於具有少年早期MLD的兒童尤其重要，其行為及認知的症狀係該疾病的重要表現，可能與運動功能異常同時發展。臨床量表可用於量化AAV.hARSAco對認知、語言及運動功能的發展及變化的效果，可使用BSID-III及WISC-V評估，並根據病患的估計的發展年齡過渡到適當年齡的評估工具。可將結果與一般發育的兒童及未治療的兒童的標準進行比較。每種提議的測量先前已被用於MLD族群(Clarke et al., 1989；Boucher et al., 2015；Sessa et al., 2016)。 ●    BSID-III：此量表主要用於評估1–42個月齡的嬰兒及幼兒的發育(Albers and Grieve, 2007)。其由一系列標準化的發展性遊戲任務所組成。藉由將成功完成的項目的原始分數轉換為量表分數及綜合分數，然後將此等分數與來自相同年齡的一般發育兒童的標準所獲得的分數進行比較，取得發展商數(developmental quotient)。該BSID-III具有三個主要子測試。認知量表包括如注意熟悉及不熟悉的物體、尋找落下的物體、以及假裝遊戲等項目。語言量表評估語言的理解及表達(例如，遵循指示及指出物體名稱的能力)。運動量表測量粗大動作及精細動作的技能(例如，抓握、坐著、堆疊積木、及爬樓梯)。如此，BSID‑III可提供額外的運動功能資訊，以補充GMFC‑MLD及GMFM。 ●    WISC-V：此量表為一個別給予6至16歲的兒童的智力測驗。其產生表示兒童一般智力的全量表智商(Full Scale IQ)，並提供五個主要指數分數：語文理解指數、視覺空間指數、流體推理指數、工作記憶指數、及處理速度指數。此等指數表示兒童在離散認知領域(discrete cognitive domain)中的能力。
存活率被包括作為改善疾病症狀或延遲疾病進展的量度。大多數被診斷為嬰兒晚期MLD的病患預期會在生命的前5年死亡，其5年存活率為25%(Mahmood et al., 2010)，儘管目前的支持性照護的水準可將存活延長到生命的二十年(Gomez-Ospina, 2017)。如此，5年的追蹤可能足以證明嬰兒晚期族群的存活獲益，儘管其可能不夠長期以評估少年早期同齡群的存活。重要地，隨著支持性照護的水準的改進，具有早發性MLD的兒童現在可存活到10歲以上，儘管其功能水準很低。
雖然癲癇發作並非早發性族群的常見症狀，但其為疾病晚期的特徵(Gieselmann and Krageloh-Mann, 2010；Mahmood et al., 2010)。可能會要求父母保留日記以記錄癲癇發作的活動(發病、癲癇發作的頻率、長度及類型)，從而可評估AAV.hARSAco是否可預防或延遲癲癇發作的發病或減少癲癇發作事件的頻率。
可使用MLD病患以前使用的工具評估適應行為伴隨父母及病患的生活品質的測量，以顯示疾病症狀的改善或疾病進展的延遲(Martin et al., 2013；Boucher et al., 2015；Sessa et al., 2016)： ●    Vineland-III：從五個領域評估從出生到成年(0–90歲)的適應行為：溝通、日常生活技能、社會化、運動技能及適應不良行為)。Vineland-II到Vineland-III的改進將可更好地理解發展障礙的問題併入。 ●    PedsQOL及PedsQL-IS：如嚴重的兒科疾病，疾病對家庭的負擔為顯著的。兒童生活品質量表(Pediatric Quality of Life Inventory)™為一種經過驗證的工具，其評估兒童及其父母的生活品質(藉由父母代理報告)。其已在健康的兒童及青少年中得到驗證，並已用於多種兒科疾病(Iannaccone et al., 2009；Absoud et al., 2011；Consolaro and Ravelli, 2016)。因此，包含PedsQL以評估AAV.hARSAco對病患及其家人的生活品質的影響。其可應用於2歲及以上的孩子的父母，因此，隨著兒童年齡超過5年追蹤期，而可能會提供更多資訊。兒童生活品質量表™嬰兒量表(Varni et al., 2011)為由父母完成的經驗證的模組化工具，被設計用於測量與健康相關的生活品質，專門針對1–24個月齡的健康及患病嬰兒。其亦提供由5歲以上的兒童自我報告的可能性。 ●    藍斯基表現指數：測量個人的功能狀態並提供表示該人進行正常日常活動能力的分數的量表。
如本文所述的rAAV(例如，AAV.hARSAco)、載體、組成物或方法於疾病病理學之效果可被測量以顯示疾病症狀之改善或疾病進展的延遲，包括在髓鞘化、與髓鞘化相關的功能性結果、及潛在的疾病生物標記中的改變。
可檢查MLD的主要檢驗標記(hallmark)，即中樞及周圍的脫髓鞘，以顯示rAAV投予後疾病症狀的改善或疾病進展的延遲。中樞脫髓鞘可藉由白質區域的MRI測量來追蹤，白質區域的變化為疾病狀態及進展的指標(Gieselmann and Krageloh-Mann, 2010；Martin et al., 2012；van Rappard et al., 2015)。藉由MRI檢測到的中樞脫髓鞘與粗大動作功能異常的程度呈正相關(Groeschel et al., 2011)。周圍脫髓鞘可經由對運動神經(腓深神經、脛神經、及尺神經)及感覺神經(腓腸神經及正中神經)的NCV研究間接測量，此亦提供周圍神經病變的讀數。NCV研究監測生物活性髓鞘質的變化的指示性波動(即，F波及遠端潛伏期(distal latency)、幅度、或存在或不存在反應)。
除了測量總脫髓鞘分數及腦白質萎縮之外，還可隨著時間使用質子MRS測量各種腦神經元代謝物，包括NAA、mI、Cho、及Lac。有證據表明NAA水準與粗大動作功能強烈相關，隨著病程的進展，NAA訊號強度會降低(Kruse et al., 1993；Dali et al., 2010)。此外，質子MRS研究已顯示於MLD疾病發展過程中，NAA/肌酸酐比率降低，Cho/肌酸酐比率以及mI及Lac水準增加(Martin et al., 2012)。如此，可將神經元代謝物評估作為顯示疾病症狀改善或疾病進展延遲的生物標記。
有證據表明周圍神經及CSF髓硫脂及溶血髓硫脂的蓄積與腓腸神經中電生理學參數異常及大量髓鞘化纖維喪失相關(Dali et al., 2015)。因此，CSF(溶血)髓硫脂水準可能反映了PNS中的疾病嚴重度，且可能提供評估療法對周圍神經系統的影響的標記。可包括CSF髓硫脂及溶血髓硫脂水準，以顯示疾病症狀的改善或疾病進展的延遲。
與癲癇發作類似，視覺喪失並非早發性MLD的常見症狀，但確實出現在疾病的晚期(Gieselmann and Krageloh-Mann, 2010；van Rappard et al., 2015)。通過使用VEP追蹤視覺喪失，提供了評估如本文所述的rAAV延遲或預防視覺喪失的能力的機會。VEP可用於客觀地測量對視覺刺激的反應，作為中樞視覺障礙或喪失的指標。聽覺喪失於疾病進展過程中亦很常見，且可經由BAER測試測量聽覺異常的早期徵兆。
內臟組織中MLD的後遺症之一，涉及髓硫脂在膽囊壁的沉積，導致膽囊壁增厚及息肉，可能需要手術介入且可於超音波上可視化(Rodriguez-Waitkus et al., 2011；Kim et al., 2017)。膽囊異常為MLD中的通常所見，且使病患易患膽囊癌(van Rappard et al., 2016)，且發生於所有MLD亞型中。
於某些具體實施例，可進行以下列出的測定以顯示疾病症狀的改善及/或疾病進展的延遲： 血液學、血清化學、凝血、LFT；尿液分析；HepB/HepC/HIV血清學；血清生物標記(ARSA)；血清及尿液中的載體DNA；血清抗AAVhu68 nAb；ELISpot(殼體及ARSA)；CSF收集及評估；LP(以收集CSF)；CSF細胞學及化學；CSF疾病生物標記(ARSA、髓硫脂、溶血髓硫脂)；CSF抗AAVhu68 nAb；於CSF中的載體DNA；身體檢查(包括身高及體重)；神經學檢查；生命徵象；ECGd；感覺神經傳導研究；GMFC-MLD；GMFM；BSID-IIIe；WISC-V；Vineland-IIIe；藍斯基表現指數；PedsQL；PedsQL-IS；照護者/父母QoL評估；動作里程碑評估；癲癇發作日記完成培訓；複查癲癇發作日記；成像評估；MRI；MRS；NCV測量；及VEP。
相關縮寫列於下文： AAVhu68：腺相關病毒血清型 hu68；AE：不良事件；ARSA：芳基硫酸酯酶A；BAER：腦幹聽覺誘發反應；BSID-III：貝萊嬰幼兒發展量表，第三版；CSF：腦脊髓液；DNA：去氧核糖核酸；ECG：心電圖；ELISpot：酵素結合免疫斑點(enzyme-linked immunospot)；GMFC-MLD：異染性白質失養症中的粗大動作功能分類；GMFM：粗大動作功能評量；HepB：B型肝炎；HepC：C型肝炎；HIV：人類免疫不全病毒；ICM：腦大池內；LFT：肝功能測試；LP：腰椎穿刺；MRI：磁振造影；MRS：磁振頻譜；nAb：中和抗體；NCV：神經傳導速度；PedsQL/PedQL-IS：兒童生活品質量表；QoL：生活品質；VEP：視覺誘發電位；Vineland-III：文蘭適應行為量表，第三版；WISC-V：魏氏兒童智力量表，第五版。
該rAAV、載體、組成物及方法在投予至CNS及PNS兩者後數日內均提供超生理水準(supra-physiologic level)的ARSA酶，在MLD病患中CNS及PNS兩者均受到影響。AAVhu68殼體及ICM途徑係基於神經元、DRG及周圍神經軸突細胞的優異轉導之觀察而被選擇。儘管髓鞘化細胞的載體轉導受限，但交叉矯正潛力將會允許酶被寡樹突細胞攝取。此外，AAV載體及ARSA酶可沿著軸突運輸，擴大了治療性酶在腦中及至周圍的表現。 X. 遞送醫藥組成物至腦脊髓液的器具及方法
於某些具體實施例，AAV.CB7.CI.hARSAco. rBG係作為單一劑量投予，經由電腦斷層造影(CT)導引的枕骨下注射至腦大池(腦大池內[ICM])。
使用AAV媒介的基因轉移已成功治療單基因CNS疾病之許多動物模式，且使用第一代AAV載體的幾項早期人類研究證明了載體遞送至腦的安全性(Janson et al., 2002；Mandel and Burger, 2004；Kaplitt et al., 2007；Mittermeyer et al., 2012；Bartus et al., 2014)。然而，此等載體的低效率阻止了將動物模式中的功效轉化為臨床效益。隨著第二代AAV載體的出現，基因轉移到腦的潛力已大幅增強。尤其，一些演化支F分離株，如AAV9，已證明極其有效的腦轉導(Gray et al., 2013；Haurigot et al., 2013；Hinderer et al., 2014；Bell et al., 2015)。使用此等更有效的載體，基因療法已顯示出大幅增強的治療各種神經學病症的潛力，並且利用第二代載體的數項計畫已經進入臨床(Haurigot et al., 2013；Hinderer et al., 2014；Bell et al., 2015；Gurda et al., 2016；Hinderer et al., 2016)。
CNS基因轉移的早期研究不僅受到第一代AAV載體基因轉移效率低的挑戰，而且還受到可用的遞送方法的限制的挑戰。大多數早期的非臨床及臨床研究利用直接載體注射至腦或脊髓的實質中(Vite et al., 2005；Worgall et al., 2008；Colle et al., 2010；Ellinwood et al., 2011；Tardieu et al., 2014)。儘管此方法在注射部位附近產生穩健的轉導，但是難以將此方法轉化至影響整個CNS細胞的疾病，因需要大量的載體注射以達成廣泛的轉基因遞送。CNS基因轉移的另一個阻礙為發現腦實質內的載體注射可在注射部位引起發炎，其可促進針對轉基因產物的適應性免疫反應(Worgall et al., 2008；Colle et al., 2010；Ellinwood et al., 2011；Ciesielska et al., 2013)。已開發出兩種替代的載體遞送方法以更安全及有效地靶向CNS的大區域。
第一者係基於發現一些AAV載體(包括AAV9)可於IV遞送後於CNS中轉導細胞(Foust et al., 2009)。然而，IV載體遞送具有兩個關鍵限制。首先，載體穿入至CNS的低效率需要非常大的載體劑量以達到轉基因表現的治療水準，增加了全身性毒性的風險，且為了許多病患族群而潛在地需要製造上可能不可行的載體數量(Gray et al., 2011；Hinderer et al., 2014；Gurda et al., 2016)。其次，因預先存在的對載體殼體的Nab，而IV載體遞送後對CNS的基因轉移受到了極大的限制(Gray et al., 2011)。鑑於AAV NAb在人類中的高度普遍性，此使大量病患族群不適合作為IV AAV治療的候選。為了規避IV AAV靶向CNS的限制，已開發出IT載體遞送作為替代方法。使用CSF作為載體分散的媒劑，IT ROA具有潛力以一次微創注射而達成於整個CNS及PNS中的轉基因遞送。動物研究已證明藉由避免穿過血腦障壁的需要，IT遞送造成實質上更有效率的CNS基因轉移，且載體劑量比IV法所需的劑量低得多(Gray et al., 2011；Hinderer et al., 2014)。由於抗體在CSF中的水準非常低，因此IT載體遞送不受預先存在的對AAV殼體的NAb的影響，使得此方法可適用於更廣泛的病患族群(Haurigot et al., 2013)。可使用多種CSF進入途徑進行IT AAV遞送。腰椎穿刺(LP)為進入CSF的最常見方法，因此被評估為NHP中AAV投予的一途徑。發現經由LP將AAV9載體遞送至CSF，與腦大池之水準更優異之載體注射相比，轉導腦及脊髓之細胞的效率至少低10倍(Hinderer et al., 2014)。
在NHP中以單次ICM注射達成優異的腦轉導，造成選擇此ROA用於AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的臨床研究。由於腦幹或附近血管損傷的病例稀少，在造影前的時期，LP最終取代一種常見處置，ICM注射(亦稱為枕骨下穿刺)(Saunders and Riordan, 1929)。今日，該處置可於即時CT導引下執行，即時CT導引允許於針頭插入期間將關鍵結構可視化，例如延髓、椎動脈及小腦下後動脈(Pomerantz et al., 2005；Hinderer et al., 2014)。
於一態樣，本文提供之載體可經由此段落所提供的方法及/或裝置及述於WO 2018/160582者進行鞘內投予，其藉由引用而併入本文。或者，可選擇其它裝置及方法。
於某些具體實施例，此方法包含：經由脊椎穿刺針(spinal needle)之CT導引的枕骨下注射至病患的腦大池的步驟。如本文中所使用，術語電腦斷層造影(CT)係指放射線攝影術，其中藉由電腦自沿軸線製成的一系列平面截面影像而構築身體結構的三維影像。
在治療當天，準備適當濃度的rAAVhu68.hARSAco。將含有5.6 mL之適當濃度的rAAVhu68.hARSAco的注射器送入處置室。進行研究藥物投予時有下列人員在場：進行此處置的介入醫師；麻醉師及呼吸技術人員；護士及醫師助理；CT(或手術室)技術人員；現場研究協調員。在藥物投予之前，先進行腰椎穿刺以移除預定體積的CSF，然後鞘內(IT)注射碘化造影劑，以幫助將腦大池的相關解剖學結構可視化。可於針頭插入之前或期間投予靜脈內(IV)造影劑，以替代鞘內造影劑。在介入醫師的裁量下決定使用IV或IT造影劑。對對象進行麻醉、插管，且置於處置台上。使用無菌技術將注射部位備妥並用布蓋好。在螢光鏡導引下，將一根脊椎穿刺針(22-25 G)推進至腦大池。可使用較大的導引針以輔助針頭放置。確認針頭放置後，將延伸套件連接到脊椎穿刺針上，並使其充滿CSF。在介入醫師的裁量下，可對延伸套件連接含有造影劑的注射器，並少量注入以確認針頭在腦大池中的放置。藉由CT導引+/-照影劑注射而確認針頭放置後，將含有5.6mL之rAAVhu68.hARSAco的注射器連接到延伸套件。耗費1-2分鐘緩慢注入注射器中的內容物，遞送5.0 mL的體積。將針頭緩慢地從對象移除。
於一具體實施例，劑量可藉由腦質量而按比例調整，腦質量提供CSF腔室大小的近似值。於另一具體實施例，劑量轉換係基於下述之腦質量：成年小鼠為0.4 g，幼年恆河獼猴為90 g，4–18個月齡的兒童為800 g。下表提供了鼠類MED研究、NHP毒理學研究的說明性劑量以及等效的人類劑量。
劑量 (GC/g腦質量) 小鼠(GC) NHP(GC) 人類(GC)
3.33×10 11 1.30×10 11 3.00×10 13 2.70×10 14
1.11×10 11 4.40×10 10 1.00×10 13 8.90×10 13
3.33×10 10 1.30×10 10 3.00×10 12 2.70×10 13
1.11×10 10 4.40×10 9 - 8.90×10 12
於某些具體實施例，以單一劑量投予rAAVhu68.hARSAco載體至對象。於某些具體實施例，期望為多劑量(例如2劑量)。例如，對於6個月以下的嬰兒，可能期望分開幾日、幾週或幾個月而遞送多劑量。
於某些具體實施例，rAAVhu68.hARSAco載體之單一劑量為約1 x 10 9GC至約3 x 10 11GC。於某些具體實施例，rAAVhu68.HARSA之劑量為1 x 10 10GC/腦質量至3.33 x 10 11GC/腦質量。於其它具體實施例，可選擇不同劑量。
組成物可被調配成劑量單位，以含有範圍為約1 x 10 9基因體拷貝(GC)至約5 x 10 13GC (以治療平均70 kg體重的對象)之量的AAV。於一具體實施例，進行腰椎穿刺，其中移除約15 mL (或以下)至約40 mL CSF，且其中將載體與CSF混合及/或懸浮於可相容的載劑並遞送至對象。於一例中，載體濃度為約3 x 10 13GC，但其它量諸如約1 x 10 9GC、約5 x 10 9GC、約1 x 10 10GC、約5 x 10 10GC、約1 x 10 11GC、約5 x 10 11GC、約1 x 10 12GC、約5 x 10 12GC、或約1.0 x 10 13GC。
可與本文提供的rAAVhu68.hARSAco組成物一起遞送協同療法。如本申請中較早描述的協同療法係藉由引用併入本文。
在某些具體實施例中，提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其有用於治療異染性白質失養症或與hARSA基因缺陷相關之病症。rAAV可包含：(a) AAVhu68殼體；及(b) 包裝於(a)之AAV殼體中的載體基因體，其中該載體基因體包含反向末端重複序列(ITR)及在調節序列控制下編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A (hARSA)的核酸序列，該調節序列引導hARSA表現，其中該hARSA編碼序列包含SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 55至nt 1521的序列、或與編碼功能性hARSA的序列至少95%至99.9%相同的序列。在某些具體實施例中，功能性蛋白包含訊息肽及SEQ ID No：2的胺基酸(aa) 19至aa 507的胺基酸序列。在某些具體實施例中，訊息肽具有SEQ ID NO：2的aa 1至aa 18的胺基酸序列或SEQ ID NO：4的aa 1至aa 20的胺基酸序列。在某些具體實施例中，調節序列引導hARSA在神經系統細胞中的表現。在某些具體實施例中，調節序列包含普遍存在之啟動子，包括CB7啟動子。在某些具體實施例中，調節元件包含Kozak序列、多腺苷酸化序列、內含子、強化子及TATA訊息中的一種或多種。在某些具體實施例中，hARSA編碼序列與SEQ ID NO：1至少95%至99.9%相同並編碼功能性hARSA。在某些具體實施例中，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。在某些具體實施例中，載體基因體具有SEQ ID NO：5之nt 1至nt 3883的序列。在某些具體實施例中，AAVhu68殼體係由編碼SEQ ID NO：7之預測的胺基酸序列的序列所產生。
在某些具體實施例中，提供一種水性醫藥組成物，其包含一種或多種本文所述之rAAV及/或載體以及調配緩衝液。在某些具體實施例中，調配緩衝液包含：人工腦脊髓液，其包含緩衝食鹽水、及鈉、鈣、鎂、鉀中的一種或多種或者其混合物；及界面活性劑。在某些具體實施例中，界面活性劑以醫藥組成物之0.0005%至約0.001%存在。在某些具體實施例中，組成物之pH範圍為7.5至7.8。在某些具體實施例中，調配緩衝液適於腦大池內注射(ICM)、靜脈內遞送、鞘內投予或腦室內投予。在某些具體實施例中，載體包含表現匣，其中該表現匣包含在調節序列控制下編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A (hARSA)的核酸序列，該調節序列引導hARSA表現。功能性hARSA蛋白可包含訊息肽及SEQ ID No：2的胺基酸(aa) 19至aa 507的胺基酸序列。在某些具體實施例中，訊息肽具有SEQ ID NO：2的aa 1至aa 18的胺基酸序列或SEQ ID NO：4的aa 1至aa 20的胺基酸序列。在某些具體實施例中，hARSA編碼序列具有SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 55至nt 1521的序列、或與編碼功能性hARSA的序列至少95%至99.9%相同的序列。在某些具體實施例中，hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。在某些具體實施例中，載體為病毒載體，選自重組腺相關病毒、重組小病毒、重組慢病毒、重組反轉錄病毒、或重組腺病毒；或非病毒載體，選自裸露的DNA、裸露的RNA、無機粒子、脂質粒子、聚合物系載體、或幾丁聚醣系調配物。在某些具體實施例中，提供醫藥組成物，其包含如本文所提供之載體及調配緩衝液。在某些具體實施例中，調配緩衝液適於靜脈內遞送、腦大池內注射(ICM)、鞘內投予、或腦室內投予。
在某些具體實施例中，提供治療異染性白質失養症或與芳基硫酸酯酶A (ARSA)基因突變相關疾病的方法，其包含投予有效量之rAAV、醫藥組成物、及/或載體至有需要的對象。在某些具體實施例中，rAAV或載體經由CT導引的枕骨下注射投予至腦大池。在某些具體實施例中，該方法涉及以單一劑量遞送rAAV、醫藥組成物、或載體。在某些具體實施例中，以介於每公克腦質量3.00 x 10 10基因體拷貝(GC)(GC/g)至1.00 x 10 12GC/g腦質量之劑量投予rAAV。
詞語「包含」(comprise、comprises、及comprising)應包括性地而非排他性地解釋。詞語「由…組成」(consist、consisting)及其變化應排他性地而非包括性地解釋。儘管說明書中的多個具體實施例使用「包含」語句來呈現，但在其它情況下，相關具體實施例亦意圖使用「由…組成」或「實質上由…組成」語句來解釋及描述。
術語「表現」在本文中以其最廣泛的含義來使用，且包含RNA的產生或RNA及蛋白質的產生。關於RNA，術語「表現」或「轉譯」特別涉及肽或蛋白質的產生。表現可為暫時的或可為穩定的。
如本文所使用，「表現匣」係指包含編碼序列、啟動子並且可包括其之其它調控序列的核酸分子。於某些具體實施例，載體基因體可含有兩個或更多個表現匣。於其它具體實施例，術語「轉基因」可與「表現匣」互換使用。通常，此類用於產生病毒載體的表現匣含有本文所述基因產物的編碼序列，其兩側為病毒基因體的包裝訊息及其它表現控制序列，例如彼等本文所述者。
當使用於所提及之蛋白質或核酸時，術語「異源的」表示該蛋白質或核酸包含在自然界中彼此之間沒有相同關係的兩個或更多個序列或子序列。例如，核酸通常係重組產生的，具有二或更多個來自無關基因的序列，其被安排以產生新的功能性核酸。例如，於一具體實施例，該核酸具有來自一個基因的啟動子，其被安排以引導來自不同基因的編碼序列的表現。如此，參照編碼序列，該啟動子為異源的。
如本文所使用，「有效量」係指rAAV組成物的量，其在目標細胞中遞送及表現一定量之來自載體基因體的基因產物。可基於動物模式而非人類病患來確定有效量。本文描述適合的鼠類或NHP模式之例。
於本發明之上下文中，術語「轉譯」係關於在核糖體上的一種過程，其中mRNA股控制胺基酸序列之組裝以生產蛋白質或肽。
應注意術語「一」(a或an)係指一或以上，例如，「一強化子」應理解為表示一或多個強化子。如此，術語「一」(a或an)、「一或以上」及「至少一種」於本文中可互換使用。
如上述，術語「約」當使用於修飾一數值時意指±10%的變動，除非另有指明。
除非於本說明書中另有定義，否則本文所使用的技術及科學術語具有與本技術領域中具有通常知識者及參照公開文本所通常理解的相同含義，公開文本為本技術領域中具有通常知識者提供了本申請案中所使用之許多術語的一般指引。 實施例
下列實施例僅為說明性的且未意圖用於限制本發明。
載體AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(亦稱為AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG或AAVhu68.hARSAco或AAV.hARSAco)被遞送至CSF以達成治療性ARSA表現水準並挽救MLD之數個生物標記。 實施例 1 - AAV.hARSAco 載體
於下表中說明AAV.hARSAco之組件。
名稱： AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG(AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG)
基因插入物： 工程化的人類芳基硫酸酯酶A(ARSA)基因
控制元件： 衍生自雞β-肌動蛋白(BA)啟動子之調節元件 人類巨細胞病毒立即早期強化子(CMV IE)
其它元件： 由雞BA剪接供體及兔β-球蛋白(rBG)剪接受體元件所組成的嵌合內含子 衍生自rBG基因的多腺苷酸化(PolyA)訊息 兩個反向末端重複序列序列(ITR)
AAV血清型： AAVhu68
載體構築自順式質體，其含有自具有巨細胞病毒強化子的雞β-肌動蛋白啟動子(CB7；SEQ ID NO：16)表現的人類ARSA之編碼序列(SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3)，兩側為AAV2反向末端重複序列。
藉由黏附性HEK 293細胞的三重轉染，該載體被包裝於AAV血清型hu68殼體(WO 2018/160582)並藉由碘克沙醇梯度離心純化，如先前於Lock, M., et al. Rapid, Simple, and Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale. Human Gene Therapy 21, 1259-1271 (2010)中所述。
更具體而言，AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG係藉由將HEK293工作細胞庫(WCB)細胞以AAV順式質體(pENN.AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG.KanR)、編碼AAV2 rep及AAVhu68 cap基因的AAV反式質體(pAAV2/hu68.KanR)、及輔助腺病毒質體(pAdΔF6.KanR)進行三重質體轉染所產生。在一些具體實施例中，AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG包裝的載體基因體的大小為3883個鹼基(SEQ ID NO：5的nt 1至nt 3883)，具有從完整的145-bp ITR末端縮短了15 bp之130-bp ITR。在一些具體實施例中，AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG包裝的載體基因體的大小為3913個鹼基(SEQ ID NO：5之nt 1至nt 3883)，具有完整的 145-bp ITR。
順式質體(圖2)含有下列載體基因體序列元件： 反向末端重複序列(ITR)：ITR為衍生自AAV2的相同反向互補序列(130鹼基對[bp]，GenBank：NC_001401)，位於載體基因體的所有組件的兩側。當反式地提供AAV及腺病毒輔助功能時，ITR具有作為載體DNA複製的起始序列及載體基因體的包裝訊息兩者的功能。因此，ITR序列表示載體基因體複製及包裝所需的唯一順式序列。 人類巨細胞病毒立即早期強化子(CMV IE)：此獲自人類衍生之巨細胞病毒的強化子序列(382 bp，GenBank：K03104.1)增加下游轉基因的表現。 雞β-肌動蛋白(BA)啟動子(SEQ ID NO：18)：選擇此普遍存在的啟動子(281 bp，GenBank：X00182.1)以驅動在任何細胞類型中的轉基因表現。 嵌合內含子(CI)：此雜合內含子由雞BA剪接供體(973 bp，GenBank：X00182.1)及兔β-球蛋白剪接受體元件所組成。此內含子被轉錄，但藉由剪接而從成熟的傳訊核糖核酸(mRNA)中被移除，從而將其任一側的序列匯集在一起。已顯示在表現匣中存在內含子係促進mRNA從細胞核到細胞質的運輸，如此增強用於轉譯的mRNA之穩定水準的蓄積。此為欲增加基因表現水準的基因載體的共同特徵。 編碼序列：編碼芳基硫酸酯酶A之人類ARSA基因的工程化的互補去氧核糖核酸(cDNA)(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3)，芳基硫酸酯酶A為一種溶酶體酶，負責硫酸化的半乳糖神經鞘脂質、半乳糖苷基神經醯胺-3-O-硫酸酯及半乳糖苷基神經鞘胺醇-3-O-硫酸酯之脫硫酸(1527 bp；509個胺基酸[aa]，GenBank：NP_000478.3)。 兔β-球蛋白多腺苷酸化訊息(rBG PolyA)：rBG PolyA訊息(127 bp，GenBank：V00882.1)順式地促進轉基因mRNA的高效多腺苷酸化。此元件具有作為下列的訊息的功能：轉錄終止、在初期轉錄本的3’端的特定切割事件及長多腺苷酸尾的添加。
此質體之所有組件部分已藉由直接定序驗證。
AAV2/hu68反式質體(圖3)為pAAV2/hu68.KanR。其為8030 bp長且編碼為AAV載體基因體的複製及包裝所需的四個野生型AAV2複製酶(Rep)蛋白質。pAAV2/hu68.KanR 質體亦編碼三個野生型 AAVhu68病毒顆粒蛋白質殼體(Cap)蛋白質，其可組裝成AAV血清型hu68之病毒顆粒外殼以收容AAV載體基因體。此新穎AAVhu68序列獲自人類心臟組織DNA。
為了產生pAAV2/hu68.KanR反式質體，將源自質體pAAV2/9n(其在衍生自pBluescript KS載體的質體骨架上編碼野生型AAV2 rep及AAV9 cap基因)的AAV9 cap基因移除並替換為AAVhu68 cap基因。胺苄青黴素抗性(AmpR)基因亦以康黴素抗性(KanR)基因替換，獲得pAAV2/hu68.KanR。此選殖策略將AAV p5啟動子序列(其通常驅動rep表現)由rep之5’端遷移至cap之3’端，留下經截斷的rep之上游p5啟動子。此經截斷的啟動子用於向下調節rep的表現，因此，使載體的產量最大化。質體的所有組件部分已藉由直接定序驗證。
質體pAdDeltaF6(KanR)(圖4)被構築且大小為15,770 bp。該質體含有對AAV複製為重要的腺病毒基因體區域；即，E2A、E4及VA RNA(腺病毒E1之功能由HEK293細胞提供)。然而，該質體並不含有其它腺病毒複製或結構基因。該質體並不含有對複製至關重要的順式元件，諸如腺病毒ITR；因此，預期不會產生傳染性腺病毒。該質體衍生自Ad5之E1、E3缺失分子殖株(pBHG10，一種pBR322系質體)。將缺失導入至Ad5中以消除不必要之腺病毒基因的表現並將腺病毒DNA的數量從32 kb減少到12 kb(圖5A)。最後，將胺苄青黴素抗性基因替換為康黴素抗性基因以產生pAdeltaF6(KanR)(圖5B)。保留在此質體中的E2、E4及VA腺病毒基因，以及存在於HEK293細胞中的E1，對於AAV載體生產皆為必需的。
AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG係藉由HEK293細胞之暫時轉染，隨後進行下游純化而製造。製造過程流程圖示於圖6及7。在圖表的左側表明進入產品製備的主要試劑，製程中品質評估描述在圖表的右側。亦提供每個生產及純化步驟的描述。除非另有指明，產品製造遵循單元操作的線性流程，並利用丟棄式之封閉的生物處理系統。從細胞接種到收取收集，涉及細胞培養的生產過程的所有步驟均使用無菌的一次性丟棄式管及袋組合件而無菌地進行。使用康寧淺皿(T型燒瓶，CellSTACK [CS-10]及/或HYPERStack [HS-36])擴增細胞。細胞於生物反應器中轉染，所有開放操作均於ISO 5級環境中的II級生物安全櫃(BSC)中進行。如果可能，於封閉系統中進行純化製程。
開發了AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的製造過程，涉及以質體DNA暫時轉染人類胚胎腎臟 293(HEK293)細胞。生產中使用的HEK293工作細胞庫(WCB)如FDA及國際醫藥法規協和會(ICH)指南中所述進行測試及合格性確認。為了支持臨床發展，藉由HEK293細胞在生物反應器中的聚乙亞胺(PEI)媒介的三重轉染來生產單批或多批原料藥物質(BDS)。在可能的情況下，在丟棄式封閉的生物處理系統中，依序藉由澄清、切向流過濾(TFF)、親和性層析、及離子交換層析而純化收取的AAV材料。該產品在鞘內最終調配緩衝液(ITFFB；具有0.001% Pluronic F-68的人工CSF)中調配。將一批或多批BDS冷凍，隨後解凍，必要時合併，調整至目標濃度，通過0.22 µm過濾器進行無菌過濾，填充小瓶。
使用兩種不同的生物反應器：小規模或先導性規模(pilot-scale)的生物反應器及大規模生物反應器。小規模生物反應器係線性規模的生物反應器，其具有與大規模生物反應器相等的用於細胞生長的床高度。小規模生物反應器及大規模生物反應器的使用允許以最少的製程及材料影響來進行可擴充的製造。大規模生物反應器及/或小規模生物反應器用於生產毒理學批次。大規模生物反應器用於生產藥品優良製造規範(GMP)原料藥(DS)批次以用於臨床試驗及用以核發許可證。以計畫的多個批次及並在必要時將其合併來生產大規模GMP生產批次大小，以滿足藥品(DP)供應所需的載體數量。隨著產品從支持IND的非臨床研究發展到臨床開發以及通過核發許可證的過程，AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的製造過程大部分保持不變。被假設影響產品品質的製程參數不會被修改。儘管用於GMP製造的PEI及質體DNA為GMP-Source™或INDReady™等級材料，但大多數關鍵的原材料仍保持相同，包括HEK293 WCB。
隨著實施利用大規模生物反應器的放大規模的製造過程，並基於組合目前生物反應器平台的製造經驗，通過比較性測試來解決與製程變化相關的任何潛在的影響，以確保產品的一致性、純度、功效及安全性不會改變。將以更新的程序或以新材料製造的新批次與先前批次進行比較之比較性測試，由包括在檢驗證明書(COA)中的測試子集所組成。新批次符合先前建立的規格，且比較性評估(下表)中包括的所有測試均使用相似的方法論，並在可能的情況下，於相同的測試地點進行。
表.比較性評估
可比較性 測試 方法 規格/允收準則
功效 活體外功效 酶活性分析 符合參考
GC:IU比 TCID 50 500–3000 GC:IU
純度 純度 SDS-PAGE ≥ 90%病毒顆粒蛋白質
顆粒含量分析 AUC TBD a
一致性 血清型一致性 MS 確認為 AAVhu68血清型
分子一致性 桑格定序或NGS 符合參考序列，除了ITR外
安全性 滅菌 USP ＜71＞ 無微生物生長
rcAAV 三重繼代，qPCR 未檢測到
a於完成毒理學批次製造及產品建立製造運行後，確定以AUC進行的顆粒含量分析 AUC：分析型超速離心；GC：基因體拷貝；ITR：反向末端重複序列；IU：感染單位；MS：質譜分析；NGS：次世代定序；qPCR：定量聚合酶連鎖反應；rcAAV：具複製能力之腺相關病毒；SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TBD：待確定；TCID 50：50%組織培養感染劑量；USP：美國藥典。
細胞培養及收取的製造過程包含四個主要製造步驟：(a)細胞接種及擴增、(b)暫時轉染、(c)載體收取、及(d)載體澄清。於概述流程圖中描述此等製程步驟(圖6)。下面提供了每個製程的一般說明。
(a)   細胞接種及擴增 將經完整特徵化的HEK293細胞系用於生產製程。已經生產WCB。用於載體生產的細胞培養係由一或兩個解凍的WCB小瓶開始，並按照主批次紀錄(MBR)文件進行擴增。使用組織培養塑料製品使細胞擴增，允許產生足夠的細胞量，以接種到每DS批次載體生產之大規模生物反應器容器表面區域中。將細胞培養於由杜爾貝寇氏改良的伊戈培養基(DMEM)構成的培養基中，該培養基補充了10%經γ射線照射的紐西蘭來源的胎牛血清(FBS)。細胞為錨定依賴性，使用不含動物產品的細胞解離試劑TrypLE™ Select來完成細胞解離。細胞接種使用無菌的一次性拋棄式生物處理袋及管組(set)而完成。反應器係受溫度、pH及溶氧(DO)控制。
(b)   暫時轉染 生長約4日後(DMEM培養基+10% FBS)，將細胞培養基替換為新鮮的無血清DMEM培養基，並使用基於PEI的轉染方法以三種生產質體來轉染細胞。生產過程中使用的所有質體均在如上所述的CMO品質系統的環境中進行生產，並具利用基礎結構的控制以確保可追溯性、文件控制及材料隔離。在BSC中準備充足的質體DNA轉染複合體，以轉染多達500 m 2(每批BDS)。最初，製備一個DNA/PEI混合物，其中含有與GMP級PEI(PEIPro HQ，PolyPlus Transfection SA)成最適比率的順式(載體基因體)質體、反式(rep及cap基因)質體、及輔助質體。在小規模最適化研究中，確定最適合AAV生產的該質體比率。充分混合後，使溶液在室溫下靜置多至25分鐘，然後添加到無血清培養基中以淬滅反應，最後添加到生物反應器中。反應器受溫度及DO控制，並培養細胞5日。
(c)   載體收取 使用拋棄式生物處理袋，藉由無菌方式以泵將培養基從生物反應器中抽出，而自生物反應器中收取經轉染的細胞及培養基。收取後，添加洗滌劑、核酸內切酶及MgCl 2(核酸內切酶的輔助因子)以釋放載體並消化未包裝的DNA。在控制溫度的一次性混合器中將產品(於拋棄式生物處理袋中)於37°C培養2小時，以提供足夠的時間對轉染程序的結果之收取物中殘存的細胞及質體DNA進行酶消化。執行此步驟以最小化最終載體DP中的殘留DNA量。培養後，添加NaCl至最終濃度為500 mM，以幫助在過濾及下游TFF期間回收產物。
(d)   載體澄清 使用串聯連接的預濾器及深層過濾套管(1.2/0.22 µm)作為無菌、封閉的管及袋組，其係藉由蠕動泵驅動，而自產物中去除細胞及細胞碎片。澄清確保保護下游過濾器及層析管柱免於結垢，而降低負荷菌(bioburden)的過濾確保於下游純化之前，在過濾器列的末端去除在上游生產過程中可能引入的任何負荷菌。
該純化製程包含四個主要製造步驟：(a)藉由TFF的濃縮及緩衝液交換、(b)親和性層析、(c)陰離子交換層析、及(d)藉由TFF之濃縮及緩衝液交換。於概述流程圖中描述此等製程步驟(圖6)。下面提供了每個製程的一般說明。
大規模切向流過濾 藉由使用定制的無菌、封閉式生物處理管、袋及膜組的TFF，達成經澄清的產物之體積減少(20倍)。TFF的原理係使溶液在平行於適合的孔隙度(100 kDa)的膜的壓力下流動。壓差驅動較小尺寸的分子穿過膜並有效地進入廢物流，同時保留大於膜孔的分子。藉由使溶液再循環，平行流掃過膜表面，防止膜孔結垢及由於與膜結合而產物損失。藉由選擇適當的膜孔徑及表面積，可於保留並濃縮所欲分子的同時，快速減少液體樣本的體積。TFF應用中的透析過濾，涉及以與液體通過膜至廢物流之相同的速率對循環樣本添加新鮮緩衝液。隨著透析過濾體積的增加，越來越多量的小分子自循環樣本被去除。此透析過濾造成澄清產物的適度純化，但亦達成與後續的親和性管柱層析步驟相容的緩衝液交換。因此，利用100 kDa的PES(聚醚碸)膜進行濃縮，然後以最少四倍透析體積(diavolume)之由20 mM Tris pH 7.5及400 mM NaCl構成的緩衝液進行透析過濾。然後將經透析過濾的產物以1.2/0.22 µm深層過濾套管進一步澄清，以移除任何沉澱的物質。
親和性層析 將經透析過濾後的產物應用於有效捕獲AAVhu68血清型的Poros TMCapture-Select TMAAV親和性樹脂(Life Technologies)。於此等離子條件下，顯著百分比之殘留細胞DNA及蛋白質流過該管柱，而AAV顆粒被有效捕獲。施用後，以5倍體積的低鹽核酸內切酶溶液(250 U/mL核酸內切酶、20 mM Tris pH 7.5、40 mM NaCl、及1.5 mM MgCl 2)處理管柱，以移除任何殘留的宿主細胞及質體核酸。洗滌管柱以移除其它進料雜質，然後進行低pH階段洗提(400 mM NaCl、20 mM檸檬酸鈉，pH 2.5)，其立即藉由收集至1/10體積的中和緩衝液(200 mM Bis-Tris丙烷，pH 10.2)中而被中和。
陰離子交換層析 為了達成進一步減少製程中的雜質，包括空的AAV顆粒，而將Poros-AAV洗提液合併者稀釋50倍(20 mM Bis-Tris丙烷、0.001% Pluronic F-68，pH 10.2)以降低離子強度並使其與CIMultus TMQA整體式基質(BIA Separations)結合。低鹽洗滌後，使用60倍管柱體積的NaCl線性鹽梯度(10–180 mM NaCl)洗提載體產物。此淺鹽梯度有效地將沒有載體基因體的殼體顆粒(空的顆粒)從含有載體基因體的顆粒(完整的顆粒)中分離，而生成富含完整顆粒的製備物。收集完整的顆粒峰洗提物並加以中和。評估峰面積並將其與先前的數據進行比較，以確定近似的載體產率。
藉由中空纖維切向流過濾之濃縮及緩衝液交換 使用TFF，將合併的陰離子交換中間體進行濃縮及緩衝液交換。於此步驟中，使用100kDa的膜且為中空纖維TFF膜。於此步驟期間，使產物達到目標濃度，然後緩衝液交換至ITFFB(具有0.001% Pluronic F-68的人工CSF)。移出樣本進行測試(圖7)。將原料藥物質(BDS)無菌過濾(0.22µm)，儲存於無菌容器中，並於隔離區中於≤–60°C冷凍，直至釋放以進行最終填充。
將冷凍的原料藥物質解凍，合併並使用最終調配緩衝液(FFB)調整至目標濃度(稀釋或經由TFF濃縮步驟)。該產物最終通過0.22 µm過濾器過濾，並被填充至帶有壓接密封塞的無菌West Pharmaceutical的Crystal Zenith(環狀烯烴聚合物)小瓶中。貼有標籤的小瓶儲存於≤–60°C。
順式、反式及輔助質體之細菌主細胞庫(BMCB)甘油原液係藉由將1mL之來自經轉形的Stbl2™大腸桿菌細胞的1 L隔夜培養物與等體積的無菌50%甘油混合而製成。從該混合物製備每個構築體兩個0.5 mL等分試樣的BMCB甘油原液，並在–80°C下保存於Nalgene低溫冷凍小瓶中。為了驗證BMCB甘油原液，對擴增的質體DNA進行內部結構分析，該分析涉及限制酶消化，然後進行凝膠電泳，並藉由於Qiagen的桑格定序進行全質體序列分析。為了準備細菌工作細胞庫(BWCB)甘油原液等分試樣以送至質體DNA生產商，自BMCB甘油原液接種3 mL培養物，並隔夜培養。其次，將1mL的隔夜培養物用於製備如上述的BWCB甘油原液等分試樣。藉由對從剩餘的2 mL隔夜細菌培養物中萃取的DNA進行前述結構分析，驗證了新的BWCB甘油原液等分試樣。一旦在質體DNA製造商處收到，BWCB甘油原液被儲存於–80°C的項目特定位置。藉由刮削冷凍的BWCB甘油原液來接種生產培養物。
用於作為藥品優良製造規範(GMP)載體製造的原料之質體係在不符合GMP設施的設施中生產；然而，質體係以設計為符合現行藥品優良製造規範(cGMP)中間體的要求之方式製造。質體生產以專用組件並以專用套件進行。進行生產程序及監督以確保具有高純度DNA的品質一致的產品，符合嚴格的放行準則，如下表所示。質體生產中使用的組件為「無動物的」(基於來自每個組件產品供應商的COA)，且於製程中使用的所有組件(發酵瓶、容器、膜、樹脂、管柱、管以及任何與質體接觸的組件)專用於單一質體，並經認證為無TSE/BSE。所利用的PolyFlo®樹脂、管柱及組件係採購以用於製造單一質體之排他性用途。質體的發酵、溶胞及純化，在標有指定質體名稱的專用房間內進行。於彼等房間中不同時處理其它質體。於每個質體生產活動之間清潔房間及設備。在使用於生產重組載體前，除了測試無菌性及黴漿菌的存在之外，還使用次世代定序(NGS)對每個製造的質體進行完整定序，以排除其它質體的污染。
藥理/毒理學之載體生產中使用的所有質體DNA均通過Puresyn的優質研究就緒計畫(Puresyn’s Premium-Research Ready Program)製造。Puresyn的優質研究就緒計畫係使用清潔及隔離程序以及一次性組件而生產，然而其並非在專用房間內生產。
表.質體生產的放行規格
參數 規格
外觀 透明、無色、無可見顆粒
A260:280 1.7–2.0
濃度 1.0–1.1 mg/mL
DNA均質性 ≥ 90%超螺旋
殘餘RNA 於1.0μg加載下未檢測到
ssDNA、線狀DNA、染色體DNA 於1.0μg加載下未檢測到
內毒素 ＜ 30 EU/mg
同一性 與提供的序列及結構資訊一致
蛋白質 僅供參考
負荷菌 5日後無生長
pH 7.5–8.5
調配物 TE(10 mM Tris、1.0 mM EDTA pH 7.9–8.1)
HEK293細胞最初係藉由以剪切的第5型腺病毒(Ad5)DNA將HEK細胞轉形而產生(Graham et al., 1977)。細胞表現rAAV生產所需的E1A及E1B基因產物。HEK293細胞可高度轉染，在質體DNA轉染後可產生高水準的rAAV。
載體基因體同一性：DNA定序 以Baseline Zero核酸內切酶及Plasmid Safe DNAse處理AAV載體(2.00 x 10 11GC)，以消除環境中未包封的DNA，然後在95°C下於1x磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)及0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)中培養10分鐘使載體基因體變性。變性的載體基因體隨後藉由於熱循環器中以0.6°C/分鐘的速度將反應混合物緩慢冷卻至24°C而進行降溫貼合，使用QIAquick PCR純化套組(QIAGEN)進行淨化，並於Covaris超音波處理器上剪切至500 bp的平均大小。在具有高靈敏度DNA試劑套組的2100 Bioanalyzer(Agilent)上評估DNA剪切。根據製造商的步驟準則，使用NEBNextUltraII庫套組將經剪切的DNA製備至NGS庫中，進行大小選擇，並藉由Agencourt AMPure XP珠粒(Beckman Coulter)進行淨化。然後在Bioanalyzer上再次分析各個NGS庫的片段大小分布，並在等莫耳濃度合併之前藉由Qubit® 3.0螢光計進行定量。根據Illumina的Miseq System Denature and Dilute Libraries Guide，藉由Qubit® 3.0螢光計測量最終合併庫的濃度，將其變性並稀釋至8 pM。PhiX對照在最終庫中的摻加率為10%。於MiSeq定序儀上使用Illumina MiSeq Nano Reagent Kit V2(250 bp雙端(paired-end))進行定序。如上所述，使用NGS比對方法進行數據分析。 藉由MiSeq電腦，將定序讀數進行自動解多工及轉接子剪切(adapter trimming)。將每個質體的經剪切的讀數與對應的參考序列進行比對，使用BBTools生物訊息學軟體套件(sourceforge.net/projects/bbmap)調出序列變異體。此外，BBMap(jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/)用於生成VCF及BAM檔案。VCF檔案藉由定製UNIX script進一步解析，以產生簡化的定位分隔表(僅保留CHROM、REF、ALT、QUAL、TYPE、DEPTH、AF、RAF、SB、DP4區)。在IGV Integrated Genomic Viewer軟體(software.broadinstitute.org/software/igv/)中目視檢查BAM檔案，以確保適當的NGS比對。與NGS比對方法並行，使用NOVOPlasty (github.com/ndierckx/NOVOPlasty)進行從頭組裝(de novo assembly)以構建長的成圓形的序列。將從頭的序列與原始載體基因體參考序列比對，以將在比對方法中可忽略的大序列排列予以特徵化。
載體殼體同一性：VP1之AAV殼體質譜分析 使用VP之胰蛋白酶消化，隨後在Q-Exactive Orbitrap質譜儀上進行串聯式質譜分析(MS)特徵化，以定序殼體蛋白質肽，達成DP的AAVhu68血清型之確認。來自所定序的串聯式質譜的頻譜庫及靶向MS法(targeted MS method)被用於測定可獨特地鑑別特定AAV病毒顆粒血清型的特徵肽(signature peptide)。針對藉由消化測試物所產生的串聯式質譜，篩選了對八種血清型(AAVhu68、AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10、及AAVhu37)具有特異性的特徵肽庫。為了進行陽性鑑定，僅檢測來自單一血清型的特徵肽。
基因體拷貝效價 已開發一種基於ddPCR的技術來確定AAV載體的GC效價(Lock et al., 2014)。參考標準品係於先導生產(pilot run)期間生成，用於對該測定進行合格性確認。該方法為實用的，報告與qPCR相當或更佳的效價，且不需要質體標準曲線。所利用的測定涉及以DNase I消化，隨後進行ddPCR分析以測量經包封的載體GC。使用針對polyA區的序列特異性引子及與該相同區雜交的帶有螢光標籤的探針組合，而完成DNA檢測。該測定中導入了許多標準品、驗證樣本、及對照(用於背景及DNA污染)。使用先導參考標準品對此測定進行合格性確認。藉由建立及定義測定參數，包括靈敏度、檢測極限(LOD)、合格範圍及測定內及測定間精度，而對此測定進行合格性確認。建立內部AAVhu68參考批次，並將其用於進行合格性研究。
感染單位效價 感染單位(IU)測定用於確定rAAV載體在RC32細胞(表現rep2的HeLa細胞)中的有成效的攝取及複製。已採用類似於先前公開的96孔終點格式。簡而言之，RC32細胞係藉由rAAV BDS的連續稀釋液及Ad5的均勻稀釋液共同感染，在rAAV的每種稀釋度下進行12重複。感染後72小時，將細胞進行溶胞，並進行qPCR以檢測超過輸入的rAAV載體擴增。進行終點稀釋50%組織培養感染劑量(TCID 50)計算(Spearman-Karber)，以確定表示為IU/mL的複製效價。由於「傳染性」值取決於每個顆粒之與細胞的接觸、受體結合、內化(internalization)、運輸至細胞核、以及基因體複製，因此彼等受測定幾何形狀以及所使用細胞系中適當受體的存在及結合後路徑的影響。於永生化細胞系中通常不維持受體及結合後路徑，如此，傳染性測定效價並非存在的「傳染性」顆粒數量的絕對量度。然而，包於殼體的GC與「感染單位」之比(稱為GC/IU比)可用於作為批次之間產品一致性的量度。
顆粒含量分析 在分析型超速離心機(AUC)中測得的沉降速度可檢測到聚集體、其它次要成分，並提供基於不同的沉降係數之不同顆粒物種的相對量的良好定量。此係基於長度及時間之基本單位的絕對方法，不需要標準分子作為參考。將載體樣本加載到具有兩通道木炭環氧樹脂十字頭架(charcoal-epon centerpiece)且具有12 mM的光程長的槽中。將提供的稀釋緩衝液加載到每個槽的參考通道中。然後將經加載的槽放入AN-60Ti分析型轉子中，並加載到裝有吸光度及RI檢測器的Beckman-Coulter ProteomeLab XL-I分析型超速離心機中。在20°C完全平衡溫度後，使轉子達到最終運行速度每分鐘12,000轉(RPM)。約每3分鐘記錄一次於280 nm掃描的吸光度，持續約5.5小時(每個樣本總共110次掃描)。使用c(s)法分析原始數據，並在分析程式SEDFIT中執行。將生成的大小分布作圖並將峰進行積分。與每個峰相關的百分比值表示所有峰下總面積的峰面積分數，且係基於在280 nm下生成的原始數據。許多實驗室使用此等值來計算完整：空的之比率。然而，因空的顆粒及完整顆粒在此波長下具有不同的消光係數，所以可相應地調整原始數據。消光係數調整前後的空的顆粒的比率及完整單體峰值兩者皆用於確定完整:空的之比率，並記錄兩個比率。
宿主細胞DNA qPCR測定用於檢測殘留的HEK293 DNA。在摻加「無關的DNA」後，從約1 mL產物中萃取總DNA(無關的、載體、及殘留的基因體DNA)。使用針對18S rDNA的qPCR對HCDNA進行定量。基於摻加的無關的DNA的回收率，將檢測到的DNA的量進行標準化。測試了三種不同的擴增子(amplicon)大小，以建立殘留HCDNA的尺寸譜。
宿主細胞蛋白質 進行ELISA以測量污染的宿主HEK293細胞蛋白質的水準。根據供應商提供的說明，使用Cygnus Technologies的HEK293宿主細胞蛋白質第二代ELISA套組。
具複製能力之AAV測定 分析樣本中有無在生產過程期間可能出現之具複製能力之AAV2/hu68(rcAAV)。已開發出一種三繼代測定，由基於細胞的擴增及繼代、隨後之藉由即時qPCR的rcAAV DNA檢測(針對caphu68)所組成。基於細胞的成分係由接種的單層HEK293細胞(P1)、與測試樣本及野生型人類Ad5的稀釋液所組成。所測試產物的最大量為載體產物的1.00 x 10 10GC。由於腺病毒的存在，rcAAV在細胞培養中擴增。2日後，產生細胞溶胞產物，且Ad5被熱失活。然後將澄清的溶胞產物傳遞至第二輪細胞(P2)，以增強靈敏度(再次在Ad5存在下)。2日後，產生細胞溶胞產物，且Ad5被熱失活。然後將澄清的溶胞產物傳遞到第三輪細胞(P3)，以最大化靈敏度(再次在Ad5存在下)。2日後，將細胞進行溶胞以釋放DNA，然後對其進行qPCR以檢測AAVhu68 cap序列。以Ad5依賴性方式擴增AAVhu68 cap序列表明rcAAV之存在。使用含有AAV2 rep及AAVhu68 cap基因的AAV2/hu68替代陽性對照，能夠確定該測定之LOD(0.1 IU、1 IU、10 IU及100 IU)。使用rAAV的連續稀釋液(1.00×10 10GC、1.00x10 9GC、1.00x10 8GC、及1.00x10 7GC)，可定量測試樣本中存在的rcAAV的大約數量。進行該測試方法。
活體外功效 為了使ddPCR GC效價與基因表現相關聯，進行活體外相對功效生物測定。簡而言之，將細胞平鋪於96孔盤中，並於37℃/5% CO 2下培養隔夜。次日，將細胞以連續稀釋的AAV載體感染，並於37°C/5% CO 2下培養長達3天。於培養期間結束時，收集細胞培養基並基於比色受質的切割而測定ARSA活性。
總蛋白質、殼體蛋白質、蛋白質純度、及殼體蛋白質比 首先使用二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BSA)測定，相對於牛血清白蛋白(BSA)蛋白質標準曲線，定量載體樣本的總蛋白量。藉由將等份樣本與套組中提供的Micro-BCA試劑混合而進行測定。相同的程序適用於BSA標準品的稀釋液。將混合物在60℃下培養，並於562nm測量吸光度。使用4參數擬合，自已知濃度的標準品吸光度生成標準曲線。根據4參數迴歸進行未知樣本的定量。 為了提供rAAV純度的半定量測定，將樣本的基因體效價標準化，並於還原條件下藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離5.00 x 10 9GC。然後將SDS-PAGE凝膠以SYPRO Ruby染料染色。任何雜質帶均藉由光密度測定法定量。除了三種AAV特異性蛋白質(VP1、VP2及VP3)之外，出現的染色帶被認為是蛋白質雜質。報告雜質帶的雜質質量百分比以及近似分子量。SDS-PAGE凝膠亦用於定量VP1、VP2及VP3蛋白質並確定其比率。
基因體拷貝對感染單位的比率 GC/IU比為產物一致性之一量度。將ddPCR效價(GC/mL)除以「感染單位」(IU/mL)，得到計算的GC/IU比。 實施例 2- 於小鼠的藥理學及劑量範圍研究
進行一項研究以確定AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207) (一種表現人類芳基硫酸酯酶A ( ARSA)基因的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體)於成年雄性C57BL/6J (野生型)小鼠進行腦室內(ICV)投予後之功效及劑量範圍。
成年雄性C57BL/6J (野生型)小鼠接受單次ICV投予AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.0 x 10 10GC (2.5 x 10 10GC/腦；低劑量)或1.0 x 10 11GC (2.5 x 10 11GC/腦；高劑量)。對年齡相符之C57BL6/J小鼠投予媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS])作為對照。每天監測動物的生存力。在第7天及第21天屍檢時，收集血清用於評估轉基因產物表現(ARSA酶活性)及抗轉基因產物抗體(抗人類ARSA抗體)。在屍檢時亦收集腦及肝臟以評估轉基因產物表現(ARSA酶活性)。
在腦中，在AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予後21天，在左側及右側大腦半球中測量ARSA酶活性(圖8)。觀察到劑量依賴性反應，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC)或高劑量(1.0 x 10 11GC) AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的小鼠腦中，與媒劑處理之對照相比，分別觀察到ARSA酶活性增加1.2倍及1.3倍。對於AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療之動物，右側及左側半球之間ARSA酶活性水準並沒有明顯差異。
在血清中，投予低劑量(1.0 x 10 10GC) AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的野生型小鼠在第7天展現的轉基因產物表現(ARSA酶活性)水準與媒劑處理的對照相似，在第21天增加至比媒劑處理的對照水準高1.3倍。投予高劑量(1.0 x 10 11GC) AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的野生型小鼠與媒劑處理的對照相比，在第7天(高4倍)及第21天(高2.5倍)均顯示增加的ARSA酶活性，與第21天相比，第7天記錄的ARSA酶活性水準略高。此外，亦觀察到劑量依賴性效應，投予高劑量AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.0 x 10 11GC)之野生型小鼠比投予低劑量AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.0 x 10 10GC)之野生型小鼠在第7天(高4倍)及第21天(高2倍)均展現更高的ARSA酶活性(圖9)。
在肝臟中，在轉基因產物表現上觀察到劑量依賴性增加，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC)或高劑量(1.0 x 10 11GC) AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的小鼠，與媒劑處理之對照相比，分別觀察到ARSA酶活性增加15倍及37倍(圖10)。
在第7天，投予低劑量(1.0 x 10 10GC)或高劑量(1.0 x 10 11GC) AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的野生型小鼠血清中並沒有展現高於在媒劑處理之對照中觀察到的水準的抗人類ARSA抗體表現。在第21天，在AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療之小鼠中觀察到抗人類ARSA抗體表現增加至高於媒劑處理之對照的水準，投予低劑量(1.0 x 10 10GC)之動物比投予高劑量(1.0 x 10 11GC)之動物展現更高水準的抗人類ARSA抗體(圖11)。
結果總結： ●     單次單側ICV注射AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致疾病相關目標器官(腦)中轉基因產物表現(ARSA酶活性)的劑量依賴性增加，與媒劑處理的對照相比，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC [2.5 x 10 10GC/g腦])或高劑量(1.0 x 10 11GC [2.5 x 10 11GC/g腦])之AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的小鼠分別觀察到高1.2倍及1.3倍水準的ARSA酶活性。 ●     在肝臟中，觀察到ARSA酶活性的劑量依賴性增加，與媒劑處理的對照相比，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC [2.5 x 10 10GC/g腦])或高劑量(1.0 x 10 11GC [2.5 x 10 11GC/g腦])之AAV.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)的小鼠分別觀察到高15倍或37倍的表現。 ●     在血清中，觀察到ARSA酶活性的劑量依賴性增加。在第7天，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC [2.5 x 10 10GC/g腦])或高劑量(1.0 x 10 11GC [2.5 x 10 11GC/g腦])之AAV.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)的野生型小鼠中，ARSA酶活性分別與媒劑處理的對照相似或比其高4倍。到第21天，與媒劑處理的對照相比，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC [2.5 x 10 10GC/g腦])或高劑量(1.0 x 10 11GC [2.5 x 10 11GC/g腦])之AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的野生型小鼠中，ARSA酶活性分別高1.3倍或2.5倍。 ●     到第21天，在血清中可檢測到抗人類ARSA抗體高於媒劑處理的對照水準。抗體係小鼠中對外來人類轉基因產物表現的預期反應。在第21天，藉由ELISA 檢測到的抗體水準與肝臟中的轉基因產物表現呈負相關。 ●     總之，以1.0 x 10 10GC (2.5 x 10 10GC/g腦)或1.0 x 10 11GC (2.5 x 10 11GC/g腦)之劑量ICV投予AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至野生型小鼠導致在疾病相關的目標組織(腦)及周圍(肝臟及血清)中轉基因產物表現(ARSA酶活性)。 實施例 3- 於小鼠的細胞向性研究
進行一項研究以評估在腦室內(ICV)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG (一種表現人類芳基硫酸酯酶A ( ARSA)基因的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體)至成年雄性 C57BL/6J (野生型)小鼠後之轉基因產物表現。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG與AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)相同，除了其表現人類ARSA的帶有血球凝集素(HA)標籤的版本，以便藉由免疫螢光(IF)改進組織檢測。
成年雄性C57BL/6J (野生型)小鼠接受單次ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為1.0 x 10 10GC (2.5 x 10 10GC/腦；低劑量)或1.0 x 10 11GC (2.5 x 10 11GC/腦；高劑量)。對年齡相符之C57BL6/J小鼠投予媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS])作為對照。每天監測動物的生存力。在第7天及第21天的屍檢時，收集血清用於評估轉基因產物的表現(ARSA酶活性)。在屍檢時亦收集腦及肝臟以評估轉基因產物表現(ARSA酶活性或人類ARSA免疫螢光[IF])。
本研究的目的係在ICV投予類似於AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的AAV載體至成年C57BL/6J (野生型)小鼠後，評估在CNS之疾病相關目標組織(產生髓鞘質的寡樹突細胞)及周圍(血清及肝臟)中的細胞的轉基因產物表現。
使用的載體為 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，除了包括編碼帶有C端血球凝集素(HA)肽標籤之人類密碼子最適化的ARSA酶的轉基因外，其與AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)相同。帶有HA標籤的ARSA轉基因對本研究為較佳的，因為用於免疫螢光(IF)的抗人類ARSA一抗可能與野生型動物的內源性鼠類ARSA發生交叉反應。在ICV投予此類似的AAV載體後觀察到的ARSA表現概貌預期可表示投予AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後小鼠中的ARSA表現。
在研究第0天，成年C57BL/6J (野生型)小鼠接受單次ICV投予兩種劑量(1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)之一的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG或對照物(PBS [媒劑])。每天進行生存力檢查。在第7天及第21天的屍檢時，收集血清用於評估轉基因產物的表現(ARSA酶活性)。在屍檢時亦收集腦及肝臟以評估轉基因產物表現(ARSA酶活性)。收集的腦樣本含有皮質及皮質下白質，以評估OLIG2陽性寡樹突細胞中的轉基因產物表現(人類ARSA IF)。
21天的研究期間被認為足以在預期的轉基因表現的起始、高峰及平台區期間評估轉基因產物表現(ARSA酶活性)。對腦進行轉基因產物表現評估，因為其係治療人類MLD的重要目標器官，並對肝臟進行評估，因為其係一個被高度灌流的器官。收集血清以評估PNS中交叉矯正的潛力。
在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG投予後21天，取得含有皮質及皮質下白質的腦樣本以評估OLIG2陽性寡樹突細胞中的轉基因產物表現(HA IF)(圖12)。投予低劑量(1.0 x 10 10GC)導致皮質及皮質下白質中表現人類ARSA的細胞數量最少(藉由HA陽性訊號的存在而檢測)。相較之下，投予高劑量(1.0 x 10 11GC)的動物在皮質及皮質下白質中顯示出更多表現ARSA的細胞。此外，在含有大量表現ARSA的推定神經元(HA陽性、OLIG2陰性細胞，其形態與神經元相容)的腦區域中，觀察到表現人類ARSA之寡樹突細胞(HA陽性、OLIG2陽性細胞)的富集。
在血清中，投予低劑量(1.0 x 10 10GC)之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG的野生型小鼠在第7天及第21天呈現出與媒劑處理之對照相似的轉基因產物表現(ARSA酶活性)水準。與媒劑處理的對照相比，投予高劑量(1.0 x 10 11GC)之AAVhu68.CB7.CI. hARSAco-HA.rBG的野生型小鼠在第7天(高5倍)及第21天(高2倍)顯示增加的ARSA酶活性，與第 21 天相比，在第7天觀察到更高的ARSA酶活性水準。此外，觀察到劑量依賴性效應，投予高劑量(1.0 x 10 11GC)之野生型小鼠比投予低劑量(1.0 x 10 10GC)的野生型小鼠在第7天(高6倍)及第21天(高2倍)呈現出更高的ARSA酶活性(圖13)。
在肝臟中，在兩種劑量下均觀察到穩健的轉基因產物表現，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC)或高劑量(1.0 x 10 11GC)之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG的小鼠，與媒劑處理之對照相比分別觀察到ARSA酶活性增加22倍及23倍(圖14)。
結果總結： ●     以1.0 x 10 10GC (2.5 x 10 10GC/g腦)或1.0 x 10 11GC (2.5 x 10 11GC/g腦)之劑量單次單側ICV注射AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG導致在皮質及皮質下白質中的人類ARSA之劑量依賴性表現(HA IF)。在寡樹突細胞(HA陽性、OLIG2陽性細胞)及推定神經元(HA陽性、OLIG2陰性細胞)中均可檢測到人類ARSA表現。 ●     在血清中，觀察到ARSA酶活性的劑量依賴性增加。在第7天，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC [2.5 x 10 10GC/g腦])或高劑量(1.0 x 10 11GC [2.5 x 10 11GC/g腦])之AAVhu68.CB7.CI. hARSAco-HA.rBG的野生型小鼠中，ARSA酶活性分別與媒劑處理的對照相似或比其高5倍。到第21天，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC [2.5 x 10 10GC/g腦])或高劑量(1.0 x 10 11GC [2.5 x 10 11GC/g腦])之AAVhu68.CB7.CI. hARSAco-HA.rBG的野生型小鼠中，ARSA酶活性分別與媒劑處理的對照相似或比其高2倍。 ●     在肝臟中，在投予低劑量(1.0 x 10 10GC)或高劑量(1.0 x 10 11GC) AAVhu68.CB7.CI. hARSAco-HA.rBG的小鼠中觀察到ARSA酶活性比媒劑處理之對照增加22–23倍。 ●     總之，以1.0 x 10 10GC (2.5 x 10 10GC/g腦)或1.0 x 10 11GC (2.5 x 10 11GC/g腦)之劑量ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG至野生型小鼠導致在疾病相關目標組織(腦中產生髓鞘質的寡樹突細胞及推定神經元)及周圍(肝臟及血清)中的轉基因產物表現(ARSA酶活性及ARSA蛋白表現)，暗示在CNS及PNS中進行交叉矯正的可能性。 實施例 4- 腦大池內投予 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG 至成年恆河獼猴後的轉基因產物表現及細胞定位
進行藥理學研究以評估AAVhu68.CB7. CI.hARSAco-HA.rBG在腦大池內(ICM)投予至成年恆河獼猴非人類靈長類動物(NHP)後的藥效學及有限安全性概貌。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG為一種表現人類芳基硫酸酯酶A ( ARSA)基因的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體，與AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)相同，除了其表現人類ARSA之帶有血球凝集素(HA)標籤的版本，以藉由免疫染色改進組織檢測。
成年雄性(N=1)及雌性(N=1)恆河獼猴非人類靈長類動物(NHP)接受單次ICM投予AAVhu68. CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC [3.3 x 10 11GC/g腦])。生活中評估包括臨床觀察、體重測量、血液及腦脊髓液(CSF)的臨床病理學、以及血清及CSF中轉基因產物表現(ARSA酶活性)的評估。在第21天進行屍檢。在屍檢時，收集中樞神經系統(CNS)、周圍神經系統(PNS)及周圍器官的組織用於評估轉基因產物現(ARSA酶活性)。亦收集CNS及PNS組織以確定轉基因產物表現的細胞定位(使用辨識HA標籤的抗體進行ARSA免疫組織化學[IHC]或ARSA免疫螢光[IF])。
組別 治療 動物ID 性別 劑量 (GC) 劑量 (GC/g腦) a ROA 注射體積 給藥日 屍檢日
1 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG RA2397 F 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 ICM 1 mL 0 21±1
RA2477 M
a劑量基於成年NHP的腦質量90 g按比例調整(Herndon et al., 1998)。 縮寫：F，雌性；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ID，識別號碼；M，雄性；ROA，投予途徑。
在研究第0天，成年恆河獼猴NHP(5–6歲)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC。生活中評估包括臨床觀察、體重測量、血液及CSF的臨床病理學(細胞計數、臨床化學及/或總蛋白)、以及血清及CSF中轉基因產物表現(ARSA酶活性)的評估。在第21天進行屍檢。在屍檢時收集CNS(腦、脊髓)、PNS (DRG、坐骨神經)及周圍器官(胰臟、心臟、腎臟及四頭肌)的組織用於評估轉基因產物表現(ARSA酶活性)。亦收集CNS組織(脊髓)及PNS組織(DRG、TRG、三叉神經及周圍神經[正中神經、橈神經、坐骨神經、腓神經、脛神經])以確定轉基因產物表現的細胞定位(ARSA IHC或ARSA IF，使用辨識血球凝集素[HA]標籤的抗體)。亦收集並儲存額外的組織，用於未來可能的組織病理學及載體生物分布分析。 結果 : 死亡 率
兩隻動物皆存活到預定的屍檢時間點。 臨床觀察
臨床觀察未發現與治療相關之異常。 體重
在整個研究過程中，兩隻動物的體重皆為穩定的(圖15)。 血液
未發現與治療相關的血液臨床病理學異常。 腦脊髓液
在第21天(治療後評估的唯一時間點)，沒有發現與測試物相關的CSF異常，包括沒有證據表明在ICM投予AAV載體後經常觀察到的輕度無症狀淋巴細胞增多症(定義為≥ 6個白血球/µL CSF)(圖16)。 腦脊髓液及血清
評估在第21天屍檢時收集的CSF及血清中轉基因產物表現(ARSA酶活性)。然而，由於此測定無法區分人類ARSA酶與內源性恆河獼猴ARSA酶的活性，內源性恆河獼猴ARSA酶活性使得難以檢測由於人類轉基因產物的表現導致的酶活性增加。為此，在投予AAV之前的第0天，在兩隻動物的CSF及血清中可檢測到ARSA酶活性，因此這些水準被認為是此分析的內源性恆河獼猴ARSA酶活性的基線水準(圖17)。
在CSF中，到第7天(評估的第一時間點)，兩隻動物(N=2/2)皆展現ARSA酶活性從基線水準增加。對於一隻動物，ARSA酶活性水準在第14天達到基線水準的3.6倍峰值，隨後在第21天的屍檢時降至基線水準的2.3倍。對於另一隻動物，從第7天到第21天評估的最後一個時間點，ARSA酶活性逐漸增加，在第21天屍檢時達到基線水準的4.2倍的峰值(圖17)。
在血清中，在第21天屍檢時，兩隻動物(N=2/2)皆展現ARSA酶活性從基線水準增加2.4至3.2倍，在第7天或第14天的較早時間點觀察到從基線水準極少的增加(約1.5倍)甚至沒有增加(圖17)。 ARSA 酶活性 - 腦脊髓液及血清
評估在第21天屍檢時收集的CSF及血清中轉基因產物表現(ARSA酶活性)。然而，由於此測定無法區分人類ARSA酶與內源性恆河獼猴ARSA酶的活性，內源性恆河獼猴ARSA酶活性使得難以檢測由於人類轉基因產物的表現導致的酶活性增加。為此，在投予AAV之前的第0天，在兩隻動物的CSF及血清中可檢測到ARSA酶活性，因此這些水準被認為是此分析的內源性恆河獼猴ARSA酶活性的基線水準(圖17)。
在CSF中，到第7天(評估的第一時間點)，兩隻動物(N=2/2)皆展現ARSA酶活性從基線水準增加。對於一隻動物，ARSA酶活性水準在第14天達到基線水準的3.6倍峰值，隨後在第21天的屍檢時降至基線水準的2.3倍。對於另一隻動物，從第7天到第21天評估的最後一個時間點，ARSA酶活性逐漸增加，在第21天屍檢時達到基線水準的4.2倍的峰值(圖17)。
在血清中，在第21天屍檢時，兩隻動物(N=2/2)皆展現ARSA酶活性從基線水準增加2.4至3.2倍，在第7天或第14天的較早時間點觀察到從基線水準極少的增加(約1.5倍)甚至沒有增加(圖17)。 ARSA 酶活性 - 組織
評估在第21天屍檢時收集的組織中轉基因產物表現(ARSA酶活性)。然而，由於此測定無法區分人類ARSA酶與內源性恆河獼猴ARSA酶的活性，內源性恆河獼猴ARSA酶活性使得難以檢測由於人類轉基因產物的表現導致的酶活性增加。為此，來自一項非相關的研究中之動物組織中的ARSA酶活性被用於確定內源性恆河獼猴ARSA酶活性的背景水準，以便與AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG治療之動物組織中觀察到的酶水準進行比較(圖18)。
在兩隻動物中，除了周圍神經(坐骨神經)外，在腦(小腦、海馬迴、頂葉皮質、枕葉皮質)、DRG(胸椎及腰椎)、及脊髓(胸椎)的某些區域檢測到ARSA酶活性明顯增加高於背景水準。相較之下，儘管來自2隻未處理動物的「正常」值的高個體變異性使得任何解釋都變得困難，在兩隻動物中，ARSA酶活性高於背景水準的增加在腦(額葉皮質、延髓、顳葉皮質)及脊髓(頸椎)或周圍器官(胰臟、心臟、腎臟、四頭肌)之其他區域並不明顯(圖18)。 人類 ARSA 免疫染色 (HA 標籤 IHC 及 IF )
當藉由IHC (圖19)或IF (圖20A)分析時，在來自非相關研究的相當年齡之未處理的對照恆河獼猴的神經系統組織中未觀察到可檢測的轉基因產物表現(人類ARSA蛋白，經由HA標籤免疫染色檢測)，表明當使用抗體檢測併入表現ARSA的AAV載體中的HA標籤時，無法檢測到來自內源性恆河獼猴ARSA蛋白的背景訊號。相較之下，在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG的NHP中，在脊髓運動神經元(IHC)及DRG (IHC)、TRG (IF)及周圍神經(IHC及IF：正中神經、橈神經、坐骨神經及腓神經；IF：脛神經及三叉神經)的細胞中檢測到表現人類ARSA蛋白的細胞(圖19及圖20A-圖20B)。
結果總結： ●     以3.0 x 10 13GC (3.3 x 10 11GC/g腦)之劑量單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA. rBG係耐受性良好的，在臨床觀察、體重測量或者血液或CSF的臨床病理學中沒有發現與測試物相關的異常。 ●     對於兩隻動物(N=2/2)，AAVhu68.CB7.CI. hARSAco-HA.rBG投予導致治療後第7天在CSF中及第21天在血清中可檢測的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。CSF中的ARSA酶活性在第14–21天達到基線水準的2.3–4.2倍的峰值。血清中的ARSA酶活性在第21天達到基線水準的2.4–3.4倍的峰值，在較早時間點觀察到從基線水準極少的增加甚至沒有增加。兩隻動物(N=2/2)在疾病相關目標組織中還呈現出ARSA酶活性明顯增加高於背景水準，包括某些腦區域(小腦、海馬迴、頂葉皮質、枕葉皮質)、DRG、脊髓及周圍神經(坐骨神經)。相較之下，儘管來自2隻未處理動物的「正常」值的高個體變異性使得任何解釋都變得困難，ARSA酶活性高於背景水準的增加在周圍器官(胰臟、心臟、腎臟、四頭肌)及腦的某些區域(額葉皮質、延髓、顳葉皮質)中並不明顯。 ●     AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG投予導致在脊髓運動神經元、DRG、TRG及周圍神經(正中神經、橈神經、坐骨神經、腓神經、脛神經及三叉神經)中的轉基因產物表現(使用辨識HA標籤之抗體的ARSA IHC或ARSA IF)。 ●     總而言之，此項研究建立了鞘內注射AAV遞送在CSF中以及用於治療MLD的CNS及PNS之疾病相關目標組織中達成治療性ARSA表現水準的潛力。 實施例 5-AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) 在成年食蟹獼猴中經由腦大池鞘內遞送的劑量範圍藥效學及先導安全性研究
進行一項研究以評估AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)(一種表現人類芳基硫酸酯酶A ( ARSA)基因的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體)在成年食蟹獼猴非人類靈長類動物(NHP)進行腦大池內(ICM)投予後的藥效學及初步安全性概貌。
成年雄性及雌性食蟹獼猴NHP接受單次ICM投予低劑量(3.0 x 10 12GC [3.3 x 10 10GC/g腦])、中劑量(1.0 x 10 13GC [1.1 x 10 11GC/g腦])、或高劑量(3.0 x 10 13GC [3.3 x 10 11GC/g腦])之AAVHU68.CB7.CI. HARSACO.RBG (GTP-207)。生活中評估包括每日觀察、體重測量、血液及腦脊髓液(CSF)的臨床病理學、以及CSF及血清中轉基因產物表現(ARSA酶活性)及抗轉基因產物抗體(抗人類ARSA抗體)的評估。在第42天進行屍檢，並評估腦、脊髓及DRG的組織病理學及轉基因產物表現(ARSA免疫組織化學[IHC])。對於組織病理學，脊髓及DRG被選擇用於組織病理學，因為之前ICM投予AAV載體的研究揭露這些組織中的與治療相關所見由對DRG感覺神經元及其相關軸突的無症狀的極少至中度毒性所組成。已觀察到DRG感覺神經元毒性具有可再現性動力學，在載體投予後14‑21天內一致地變性。細胞體變性後，在周圍神經及脊髓背索中這些細胞的軸突的後續變性(軸突病變)出現在載體投予後30天左右。在載體投予後90天犧牲的動物中持續可見到軸突變化。基於這些動力學，我們預計42天的屍檢時間點足以評估DRG組織學所見及任何相關的臨床徵象。
分組後，每隻動物以下列劑量之一接受單次ICM注射AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(測試物)： 1.)3.0 x 10 12GC (低劑量) 2.)1.0 x 10 13GC (中劑量) 3.)3.0 x 10 13GC (高劑量)
表.組別名稱、劑量水準、及投予途徑
組別 治療 動物ID 性別 劑量 (GC) 劑量 (GC/g腦) a ROA 注射 體積 給藥日 屍檢日
1 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) B5533 F 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 ICM 1 mL 0 42±2
B3081 M
2 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) B4119 M 1.0 x 10 13 1.1 x 10 11 ICM 1 mL 0 42±2
B5012 M
3 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) M00861 M 3.0 x 10 12 3.3 x 10 10 ICM 1 mL 0 42±2
B5573 F
a劑量基於成年NHP的腦質量90 g按比例調整。 縮寫：F，雌性；GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ID，識別號碼；M，雄性；ROA，投予途徑。
在研究第0天，成年食蟹獼猴NHP (6–9歲)接受單次ICM投予AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為低劑量(3.0 x 10 12GC)、中劑量(1.0 x 10 13GC)、或高劑量(3.0 x 10 13GC)。生活中評估包括臨床觀察、體重測量、血液及腦脊髓液(CSF)的臨床病理學(細胞計數、臨床化學及/或總蛋白)、以及血清及CSF中轉基因產物表現(ARSA酶活性)及抗轉基因產物抗體(抗人類ARSA抗體)的評估。在第42天進行屍檢。收集腦、脊髓及背根神經節(DRG)用於組織病理學及/或轉基因產物表現的評估(ARSA免疫組織化學[IHC])。收集並儲存額外的組織，用於未來可能的組織病理學評估及載體生物分布分析。 結果 臨床觀察
注意到中劑量組中的一隻動物(動物B4119；1.0 x 10 13GC，第2組)在第18天時右腿不負重並且右腳腳趾捲曲。這種情況直到整個研究結束時一直存在，有時還伴有臉部扭曲及揉臉，但沒有發現其他缺陷。身體檢查時，右後肢觸診正常，運動範圍正常，與左肢相比顯示出對稱的肌肉量。骨盆、右腿及右腳的X光片未顯示任何異常。直到研究結束時，以美洛昔康(meloxicam)(0.2 mg/kg)治療動物。屍檢所見顯示右後肢近端肌肉的輕度肌肉萎縮，這在組織病理學觀察中是正常的。還注意到動物B4119在第15天腹側頸部/右肩胛骨上有一個小結節/腫塊，該結節一直持續到研究結束。
在第23天，觀察到動物B5012在尾巴上拔毛。仔細檢查後，發現尾部中間有一個直徑約1公分的粉紅色、潮濕的病灶。儘管在整個研究過程中使用各種藥物(美洛昔康、三重抗生素軟膏、頭孢力欣(cephalexin)(過量的)、磺胺嘧啶銀(silver sulfadiazine)、洛赫西定(chlorhexidine)及生理食鹽水)進行治療，但尾部病灶一直持續到研究結束。 體重
在整個研究過程中，所有動物的體重皆為穩定的(圖21)。 血液
未發現與治療相關之異常。 腦脊髓液
當在CSF樣本中觀察到紅血球時，由於在放置脊椎穿刺針期間無意接觸皮下或硬腦膜血管而導致血液沾染，細胞增多症可能與血液稀釋(hemodilution)相關。數隻動物展現可能繼發於血液稀釋的淋巴細胞增多症(≥6白血球/µL CSF及＞30 RBCs/µL)，包括低劑量組中的1/2的動物(3.0 x 10 12GC，第3組；動物M00861 [第21天])、中劑量組中的2/2的動物(1.0 x 10 13GC，第2組；動物B4119 [第35天]及動物B5012 [第21天及第35天])。
不太可能歸因於血液稀釋的輕度淋巴細胞增多症(≥6白血球/µL CSF及≤20紅血球(RBC)/µL)發生在AAV投予後第21天的低劑量組中的1/2的動物(3.0 x 10 12GC，第3組；動物M00861 [第42天])中，中劑量組中的1/2的動物(1.0 x 10 12GC，第2組；動物B4119 [第42天])、及高劑量組中的1/2的動物(3.0 x 10 13GC，第1組；動物B3081 [第21、35、及42天])(圖22)。細胞增多症的嚴重度呈劑量依賴性，與低劑量組(3.0 x 10 12GC，第3組)相比，中劑量組(1.0 x 10 12GC，第2組)及高劑量組(3.0 x 10 13GC，第1組)觀察到更高的CSF白血球計數。
對於研究中展現CSF中白血球計數升高的5隻動物，觀察到時間依賴性反應，所有動物的CSF白血球計數未處理而在第21天後從峰值水準下降。到第42天，中劑量組(1.0 x 10 13GC，第2組)的2/2的動物及高劑量組(3.0 x 10 13GC，第1組)的1/2的動物的細胞增多症完全消退。然而，在第42天(評估的最後一個時間點)，低劑量組(3.0 x 10 12GC，第 3 組)中單隻動物(N=1/1)及高劑量組的1/2的動物(3.0 x 10 1313 GC，第1組)的CSF白血球計數仍然輕微升高(8–10 WBCs/μL CSF)，表現出CSF細胞增多症。 大體病理 所見
在研究中的任何動物中皆沒有與治療相關的大體病理所見。 組織病理學 所見
進行有限的組織病理學分析，聚焦於DRG及其在脊髓及周圍神經內的對應軸突，因為它們已被鑑別為AAV媒介的病理學的潛在目標。AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)相關的組織病理學所見係由DRG感覺神經元的變性與脊髓背側白質束及周圍神經中相關中樞軸突的繼發性變性(軸突病變)所組成，這與ICM基因轉移成功後通常看到的一致。DRG感覺神經元變性及相關的軸突病變的嚴重度為劑量依賴性的(圖23)。一隻未以AAV治療之食蟹獼猴動物被包括在組織病理學分析作為對照，以協助確定測試物與背景病灶，因為與恆河獼猴相比，我們的設施在食蟹獼猴方面的先前經驗較少。此動物(M11300)在腰椎節段具有最小的(等級1) DRG神經元變性，以及在脊髓的背側白質及坐骨神經中具有最小的(等級1)軸突病變。
DRG 神經元變性。DRG神經元變性的發生率及嚴重度呈劑量依賴性。高劑量組的發生率及嚴重度最高(最小到嚴重[等級1–5]；2/2的動物；4/6的神經節；3.0 x 10 13GC，第1組)，其次為中劑量組(最小到顯著[等級1–4]；2/2的動物，3/6的神經節；1.0 x 10 13GC，第2組)，而在低劑量組中未觀察到DRG所見(2/2的動物，6/6的神經節；3.0 x 10 12GC，第3組)(圖23)。
脊髓軸突病變 ( 背側白質束 )。脊髓背側白質束中軸突病變的發生率及嚴重度通常呈劑量依賴性。高劑量組(最小到中等[等級1-3]；2/2的動物，6/6個脊髓切片；3.0 x 10 13GC，第1組)及中劑量組(最小到顯著[等級1–4]；2/2的動物，6/6個脊髓切片；1.0 x 10 13GC，第2組)的發生率及嚴重度最高，低劑量組(最小[等級1]；1/2的動物，3/3個脊髓切片；3.0 x 10 12GC，第3組)最低(圖23)。
周圍神經的軸突病變。周圍神經中軸突病變的發生率及嚴重度通常呈劑量依賴性。高劑量組(最小到顯著[等級1–4]；2/2的動物，6/6的神經；3.0 x 10 13GC，第1組)及中劑量組(最小到顯著[等級1–4]；2/2的動物，6/6的神經；1.0 x 10 13GC，第2組)的發生率及嚴重度最高，低劑量組(最小至輕度[等級1-2]；2/2的動物，5/6的神經；3.0 x 10 12GC，第3組)最低。 組織病理學所見之討 論
中劑量組中單側跛行動物(B4119)呈現的組織病理學所見與AAV相關的DRG毒性一致，具有輕度至顯著的背根神經節(DRG)神經元變性及對應的最小(等級1，正中神經)至中度(等級 3，坐骨神經)或顯著(等級4，脛神經)的軸突病變。在另一隻沒有異常臨床徵象的動物(B5533；3.0 x 10 13GC)中亦見到脛神經及坐骨神經嚴重度為等級4的周圍神經軸突病變。因此，不能確定但並不排除B4119的周圍神經所見與跛行之間的因果關係。 轉基因產物表現之評估 腦脊髓液及血清
評估CSF及血清中轉基因產物表現(ARSA酶活性)。然而，由於該測定無法區分人類ARSA酶及內源性食蟹獼猴ARSA酶，正常NHP中存在的內源性ARSA酶活性使得難以檢測由於人類轉基因產物的表現而導致的酶活性增加。因此，在AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予前的第0天，檢測所有劑量組的CSF及血清中的ARSA酶活性(圖24)。
在CSF中，到第7–14天，在高劑量(3.0 x 10 13GC，第1組；N=2/2動物)及中劑量(1.0 x 10 13GC，第2組；N=2/2)的所有動物及低劑量(3.0 x 10 12GC；第3組)的1/2的動物的ARSA酶活性從第0天的基線水準增加。對於這些動物，ARSA酶活性水準在第7–21天達到峰值。ARSA酶活性呈劑量依賴性，與低劑量組(高約1.1倍)相比，中劑量組及高劑量組在表現上展現從基線水準更大的增加(分別高約2–4倍及1.6–40倍)(圖24)。正如預期，到第42天時CSF中的ARSA酶活性下降至接近或低於基線值的水準，這與第21–35天左右的CSF及血清中抗人類ARSA抗體表現的起始相關(圖25)。
在血清中，除了中劑量組中的一隻動物(1.0 x 10 13GC，第2組；動物B5012)之外，所有動物的ARSA酶活性均從第0天的基線水準增加，到第7天觀察到峰值水準(圖24)。ARSA酶活性的增加似乎並非劑量依賴性的。正如預期，到第42天時血清中的ARSA酶活性下降至接近或低於基線值的水準，與血清及CSF中抗人類ARSA抗體表現的起始相關(圖25)。 腦及脊髓
從治療後42天進行屍檢的NHP收取腦及脊髓組織，用於藉由IHC對人類ARSA表現進行全面的組織學評估。
在投予高劑量AAVHU68.CB7.CI.HARSACO. RBG (GTP-207)(3.0 x 10 13GC，動物B5533及B3081)的NHP中，在整個腦(包括皮質、海馬迴、視丘及小腦)中檢測到表現人類ARSA酶的轉導細胞(圖26)。頸椎、胸椎及腰椎脊髓以及頸椎、胸椎及腰椎DRG的細胞也表現人類ARSA酶(圖27)。
結果總結： ●    AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)耐受性良好，儘管一隻中劑量動物表現出非負重單側跛行，這可能與測試物相關，但與組織病理學變化的關係尚無定論。臨床病理變化包括從第21天開始的淋巴細胞增多症。未處理而CSF白血球計數在第21天後從峰值水準下降，但對於一些動物，在第42天屍檢仍輕微升高。 ●    到治療後第7–14天，在大多數動物的CSF及血清中可檢測到轉基因產物表現(ARSA 酶活性)。在第7–14天的CSF中及在第7天的血清中觀察到峰值表現。CSF ARSA酶活性呈劑量依賴性，與低劑量組(高約1.1倍，3.0 x 10 12GC)相比，中劑量組(1.0 x 10 13GC)及高劑量組(3.0 x 10 13GC)在表現上展現從基線水準更大的增加(分別高約2–4倍及1.6–40倍)。相較之下，血清中的ARSA酶活性水準並未呈劑量依賴性。正如預期，到第42天時，CSF及血清中的ARSA酶活性均下降至接近或低於基線值的水準，與第21–35天左右CSF及血清中對外來人類轉基因產物的體液反應(抗人類ARSA抗體)的起始相關。 ●    AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的NHP在用於治療MLD的關鍵目標組織(腦及DRG)中證實轉基因產物表現(人類ARSA IHC)。此結果表明，儘管對外來人類轉基因產物產生了體液免疫反應，但轉導的細胞在治療後仍會在目標組織內持續存在至少42天，在需要它來矯正神經元及產生髓鞘質的細胞的地方產生ARSA。 ●    在第42天的與測試物相關的組織病理學所見係由DRG感覺神經元的無症狀變性以及脊髓及周圍神經中相關的中樞軸突的繼發性變性(軸突病變)所組成。感覺神經元所見的嚴重度為最小到嚴重(等級1–5)，且所見的發生率及嚴重度通常為劑量依賴性的，中劑量組及高劑量組的一些動物分別表現出顯著(等級4)或嚴重(等級5)的DRG神經元變性。 ●    總之，此研究建立了鞘內AAV遞送在大型動物模式的CSF中達到治療性ARSA表現水準的潛力。AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)證實了遞送ARSA至CNS及PNS中的缺陷神經元及產生髓鞘質的細胞。儘管一隻中劑量的動物表現出非負重單側跛行，但該治療耐受性良好。在脊髓及DRG的組織病理學所見與AAV載體的ICM投予後NHP中所報告的類似所見一致。 實施例 6-Arsa -/- 小鼠模式
這項自然史研究的目的係將一種新穎異染性白質失養症(MLD)的Arsa–/–小鼠模式的表型予以特徵化，該模式係使用規律間隔重複短迴文序列簇(CRISPR)相關蛋白9 (CRISPR-Cas9)基因編輯技術而創建的。
在研究第0天，將衍生自相同品系(品系407047)的兩種MLD小鼠模式納入研究。這些模式為1) 未治療的Arsa–/–小鼠及2) 投予表現GAL3ST1之AAV載體以增加髓硫脂貯積的Arsa–/–小鼠，試圖創建加重的MLD模式(以下稱為AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠)。對於MLD小鼠模式，成年小鼠在約3個月齡時納入，且年齡相符的C57BL/6J野生型小鼠被包括作為對照。
生活中評估包括存活監測、體重測量、臨床評分評估及神經運動功能評估(窄沿測試、RotaRod測定及窄道步態分析)。在約9個月齡及15個月齡時進行屍檢。在血漿(液相層析/質譜[LC/MS])、周圍器官及與治療MLD的神經學特徵相關的目標組織(中樞神經系統[CNS]及周圍神經系統[PNS])(艾爾遜藍染色及LC/MS)中評估髓硫脂貯積。在CNS中對溶酶體貯積病灶(溶酶體相關膜蛋白1 [LAMP-1]免疫組織化學[IHC])及星狀細胞增生/神經發炎(神經膠原纖維酸性蛋白[GFAP] IHC)進行量化。亦評估CNS、周圍器官及血清中殘留的內源性ARSA酶活性，以評估小鼠模式中ARSA減弱(knockdown)的程度。
文獻中沒有報告自然存在的MLD動物模式。有兩種實驗室生成的MLD的Arsa基因剔除小鼠模式，均由德國的Volkmar Gieselmann小組創建(Hess et al., 1996；Ramakrishnan et al., 2007)。MLD的兩種現有小鼠模式皆展現正常的壽命。然而，彼等確實顯示了在具有MLD的病患中觀察到的一些特徵，包括在CNS細胞(寡樹突細胞、小神經膠質細胞、某些類型的神經元)及PNS細胞(許旺氏細胞及巨噬細胞)中的神經學症狀及毒性髓硫脂類的蓄積，伴隨或不伴隨CNS及PNS中相關的脫髓鞘。
表.先前發表的異染性白質失養症小鼠模式
基因型 敘述 髓硫脂蓄積 脫髓鞘 神經學症狀 壽命
Arsa–/–(單一突變體) (Hess et al., 1996) •              Arsa剔除(同源重組) 到6個月 ( 脂質分析 )   到10-12個月 ( 組織學 ) 無 到6-10個月步態樣式異常及rotarod表現降低 正常
tg/Arsa–/–(雙突變體) (Ramakrishnan et al., 2007) •              Arsa剔除(同源重組) •              Plpl啟動子控制下的 Gal3stl轉基因(驅使髓鞘化細胞的過度表現) 到6個月 ( 脂質分析 )   到17個月 ( 組織學 ) 到 17-18個月 (PNS ＞ CNS) •              於＞16個月大的小鼠，於尾部懸吊時後肢抓握導致進行性後肢癱瘓，且到21-24 個月時無法留在rotarod上    •              到22-24個月時NCV減少 正常
縮寫：Arsa，芳基硫酸酯酶A (基因，小鼠)；CNS，中樞神經系統；Gal3stl，半乳糖-3-O-轉磺酶-l (基因，小鼠)；GAL3STI，半乳糖-3-O-轉磺酶-l (蛋白質)；NCV, 神經傳導速度；PNS，周圍神經系統；tg，轉基因。
新穎Arsa–/–小鼠品系係使用CRISPR/Cas9的胚胎顯微注射創建的。此基因工程策略針對位於15號染色體上的小鼠Arsa基因，使用多個導引RNA(guide RNA)促進外顯子2至外顯子4的靶向缺失(targeted deletion)。雖然典型的Arsa–/–模式採用新黴素匣的同源重組來產生無效等位基因，但CRISPR/Cas9基因編輯預計會在比以前的基因靶向方法更短的時間內產生具有相當的表型的完全剔除。使用此方法，產生四隻創始動物(founder)，其具有小鼠Arsa基因之外顯子2–4缺失，長度範圍從1105個鹼基對(bp)至1133 bp。所有四隻創始動物皆與C57BL/6J野生型(WT)小鼠進行一次交配，並成功地將缺失的等位基因傳遞給F1代。F1代攜帶者(carrier)再次與C57BL6/J背景雜交，以進一步稀釋任何不要的脫靶編輯。所有四個品系皆產生F2代攜帶者，這些攜帶者被繁殖以產生並特徵化為四個Arsa–/–小鼠品系(品系407046、407047、407048及407049)。
此研究將品系407047 Arsa–/–小鼠模式的表型、以及投予單一劑量的表現人類半乳糖-3-O-轉磺酶1 (GAL3ST1)的AAV載體(AAV9-PHP.B.CB7.hGal3ST1co. rBG)之額外的品系407047 Arsa–/–小鼠的表型予以特徵化。GAL3ST1酶催化膜醣脂的硫酸化，包括髓硫脂合成的最終步驟，髓硫脂係髓鞘的主要脂質成分。假設投予AAV9-PHP.B.CB7.hGal3ST1co.rBG會增加髓硫脂貯積，試圖創建加重的(即，更嚴重的) MLD小鼠模式。有關AAV9-PHP.B.CB7.hGal3ST1co.rBG載體的詳細內容呈現於表3。
研究動物非隨機的。組別名稱、劑量水準及投予途徑(ROA)呈現於下表。
表.組別名稱、劑量水準及投予途徑
組別 N及性別 基因型 處理 劑量 (GC/動物) 劑量 體積 (µL) ROA 給藥日 屍檢 研究日 屍檢 年齡(月)
1 SM SF Arsa–/– 無 N/A N/A N/A N/A 360±8 15
2 7M 6F C57BL/6J (WT) 無 N/A N/A N/A N/A 360±8 14-15
3 4M 4F Arsa–/– 無 N/A N/A N/A N/A 180±12b 8-9
4 4M 4F C57BL/6J (WT) 無 N/A N/A N/A N/A J80±12b 9
5 SM OF Arsa–/– AAV9-PHP.B.CB7.hGal3ST!co.rBG 1.0 X 10 12 100 IV 0 180±12 9
6 6M OF C57BL/6J (WT) AAV9-PHP.B.CB7.hGal3STlco.rBG 1.0 X 10 12 100 IV 0 180±12 8-10
在第128天較早對此組中的兩隻動物進行屍檢，以評估4個月齡時的ARSA表現(IM、IF)；其餘動物在第180±12天進行屍檢。 縮寫：Arsa，芳基硫酸酯酶A (基因，小鼠)；F，雌性；GC，基因體拷貝；ID，識別號碼；IV，靜脈內；M，雄性；N，動物數量；NIA，不適用；ROA，投予途徑；WT，野生型。
在研究第0天，未治療的成年(約3個月齡) Arsa–/–小鼠及年齡相符之C57BL/6J野生型對照被納入研究。此外，AAV-GAL3ST1處理的成年(約2個月齡) Arsa–/–小鼠及C57BL/6J野生型對照被納入該研究，試圖產生加重的MLD小鼠模式。
生活中評估包括在不同的時間點的生存力檢查、體重測量、臨床評分評估及神經運動功能評估(窄沿測試、RotaRod測定及窄道步態分析)。在第180天(約9個月齡)及第360天(約15個月齡)進行屍檢。在血漿(LC/MS)、腦、脊髓、坐骨神經、肝臟、脾臟、腎臟、心臟及四頭肌中評估髓硫脂貯積(艾爾遜藍染色及LC/MS)。對腦及脊髓中的溶酶體貯積病灶(LAMP1 IHC)及星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)進行量化。亦評估腦、脊髓、肝臟、脾臟、腎臟及血清中的ARSA酶活性。
研究包括第180天及第360天的屍檢時間點。對於第3組及第4組，選擇對應於約9個月齡的第180天時間點，以評估在先前已生成的MLD小鼠模式中所觀察到的髓硫脂貯積及神經學異常時疾病表型的早期階段。此外，對於第5組及第6組，選擇第180天的屍檢時間點，因為假設通過以AAV9-PHP.B.CB7.hGal3ST1co.rBG處理成功地加重髓硫脂貯積會導致更早的表型發展。對於第1組及第2組，選擇對應於15個月齡的第360天時間點，以評估CNS及PNS的長期表型進展及可能的遲發性脫髓鞘，這已在先前生成的MLD小鼠模式中觀察到。對於第3組及第4組中的兩隻動物，在第128天(4個月齡)較早進行屍檢。對於此動物子集選擇較早的屍檢時間點，以獲得有關 Arsa–/–小鼠模式中ARSA表現減弱程度的早期讀數。
在疾病表型的預期發病及進展期間，以頻繁的間隔進行所有生活中評估。每月獲取體重以監測體重減輕(即身體消瘦)，其可被預期伴隨神經運動功能惡化並且在具有MLD之病患中類似地觀察到。震顫、步態及協調性、緊握反射、姿勢及毛皮品質的臨床評分評估每隔一週進行一次，並基於先前生成的共濟失調小鼠模式的已知表型。臨床評分能夠評估疾病進展，包括共濟失調的發展，這在MLD病患中也被類似地觀察到(Guyenet et al., 2010)；較高的臨床分數會表明較嚴重的表型。使用窄沿測試、RotaRod測定及窄道步態分析(CatWalk gait analysis)評估神經運動功能。窄沿測試每隔一週進行一次，由評估動物在籠子窄沿(ledge)上的平衡及行走的能力所組成。RotaRod測定每月進行一次，並藉由測量小鼠在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的落下時間來評估協調性及平衡。窄道(CatWalk)測定每2個月進行一次，由一個系統所組成，該系統追踪小鼠走過玻璃板時的足跡，以量化動物的速度及步態的各個方面。選擇這些測定來評估協調性及平衡(窄沿測試、RotaRod測定)及步態(窄道)，因為在先前的MLD小鼠模式中觀察到進行性運動表型，這些表型讓人聯想到在人類病患中觀察到的那些運動表型，包括共濟失調、後肢無力及癱瘓。預期神經運動功能的下降會導致窄沿測試的分數增加或RotaRod測試的落下潛伏期減少。與健康對照相比，亦預期神經運動功能的下降會導致藉由窄道測定評估的步態及/或行走速度異常，包括動物的支撐基礎、印記位置、步頻、步序規律性、平均身體速度及/或步幅的異常。
在屍檢時，收集用於治療MLD的關鍵目標組織(CNS [腦、脊髓]及PNS [坐骨神經])、以及周圍器官(肝臟、脾臟、腎臟、心臟、四頭肌)及血漿，以評估髓硫脂貯積(艾爾遜藍染色及藉由LC/MS的定量)，因為髓硫脂類係毒性受質，在具有MLD的小鼠及人類中，在缺乏功能性ARSA酶的情況下會蓄積。還在腦及脊髓中評估溶酶體貯積病灶(LAMP1 IHC)及星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)，因為這些係小鼠及人類MLD的神經病理學檢驗標記，會因疾病的進展而隨著時間增加。此外，在4個月齡的小鼠子集中評估殘留的內源性ARSA酶活性，以評估 Arsa–/–小鼠中ARSA表現的減弱。在與治療MLD的神經學特徵相關的目標組織(腦、脊髓)以及周圍器官(肝臟、腎臟、脾臟)及全身血清中測量殘留的ARSA酶活性。
臨床評分評估
兩名研究人員使用對緊握能力、步態、震顫、脊柱後凸及毛皮品質的評估對臨床徵象進行評分。選擇這些測量係為了基於 Arsa–/–小鼠通常展現的症狀評估臨床狀態。高於0的分數表示臨床惡化。 表.臨床評分評估
評估類別 觀察 分數
毛皮品質 有光澤的被毛，光滑的毛皮，照料很好、乾淨的被毛 0
照料沒有很好、輕微油膩或粗糙的被毛 1
粗糙的被毛 - 被毛油膩、骯髒、直立 2
非常粗糙的被毛，脫水 3
步態 活躍的、精力充沛的。四肢支撐體重。連後肢、腹部皆抬起 0
能跑，但行動遲緩。走路時跛行。 1
不願移動，嚴重跛行，骨盆降低，雙腳遠離身體 2
僅在手動刺激時最小限度地移動，拖拽腹部 3
震顫 無震顫徵象 0
非常輕微，暫時性 1
輕度，近距離觀察可見 2
中度，立即可見 3
嚴重，影響活動性 4
緊握 後肢始終從腹部向外張開 0
＞50%的時間，一後肢向腹部縮回 1
＞50%的時間，兩後肢皆部分縮回 2
＞50%的時間，後肢完全縮回並接觸腹部 3
四肢永久完全抓握 4
姿勢 正常，平坦的背部 - 走路時容易拉直脊柱 0
短暫的駝背，僅在休息時明顯 - 輕度但能夠拉直脊柱 1
直立休息，背部駝背，移動時無法完全拉直但輕度 2
走路及坐著時明顯並保持脊柱後凸 3
神經運動功能評估 窄沿測試
窄沿測試測量協調性，協調性在與共濟失調相關的神經退化性疾病(諸如MLD)中受損。根據已公開的步驟準則(Guyenet et al., 2010)，通過進行窄沿測試來評估小鼠的表型進展。簡而言之，將動物從牠的籠子中抬起，並放置於籠子的窄沿上。觀察小鼠並基於牠沿著窄沿引導並回到籠子裡的能力分配分數。高於0的分數表示神經運動功能下降。
表.窄沿測試評分
分數 觀察
0 小鼠在不失去平衡的情況下沿著窄沿行走，並用腳掌優雅且不失去平衡地降低身子回牠的籠子
1 小鼠在沿著窄沿行走時失足，但在其他方面看起來協調。
2 當下降到籠子中時，小鼠不能有效地使用牠的後腿，或者頭朝下著地而非以腳掌著地
3 小鼠在行走或試圖降低自己時幾乎或完全從窄沿上落下，或者儘管受到刺激但仍然搖晃並拒絕移動。
縮寫：N/A，不適用。
RotaRod
使用RotaRod測試(Ugo Basile；Gemonio, Italy)測量協調性及平衡。簡而言之，藉由每次試驗最多放置5隻小鼠在RotaRod裝置面向牆壁的通道中，先使小鼠習慣RotaRod。讓小鼠在固定的(非旋轉的)桿上穩定2分鐘。然後執行兩個習慣化試驗，桿以每分鐘5轉(RPM)的恆定速度旋轉1分鐘。在每次習慣化試驗之間，允許小鼠在RotaRod收集箱中休息大約1分鐘。若小鼠在習慣化階段落下，立即將其放回桿上。
在習慣之後，立即進行測試試驗以測量每隻小鼠在旋轉桿加速時可在旋轉桿上停留多長時間。小鼠被放置在面向牆壁的RotaRod裝置的通道中，並允許在固定的(非旋轉的)桿上平衡以建立牢固的抓握。然後將桿設置為以5 RPM的恆定速度旋轉幾秒鐘，以使小鼠達到平衡。一旦平衡，將桿設置為在300秒鐘內從5 RPM加速到40 RPM。對於每隻動物，當小鼠從桿上落下、完成兩次順從旋轉或經過300秒鐘時，測試試驗被視為終止。記錄落下潛伏期(定義為桿開始加速與試驗終止之間的時間)。在每個試驗中對小鼠進行總共三個連續的重複測試，在運行之間暫停1–3分鐘，讓動物在收集箱中休息。 窄道步態分析
使用CatWalk XT步態分析系統(Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands)評估步態及步行速度。CatWalk XT追踪小鼠走過玻璃板時的足跡。該系統量化每個掌印的尺寸，並統計分析動物的速度及步態的其他特徵。
為了執行此評估，在測試開始之前，將Catwalk XT以適當寬度的步道設定進行校正。所有實驗設定皆輸入到Catwalk XT軟體中，包括動物類型、時間點及運行基準。在Catwalk XT上運行之前，將動物帶入房間並在黑暗中適應至少30分鐘。一旦適應完成，選擇一隻動物並將其放置在步道的入口處。研究人員開啟採集軟體，並讓動物沿著步道行走。動物的籠子被置於步道的盡頭以示鼓勵。當動物在規定的時間限制內成功走到窄道的盡頭時，運行即完成，否則重複運行。動物進行三個試驗，最短期間為0.50秒鐘，最長期間為5.00秒鐘。需三次成功運行才被認為試驗完成。如果一隻動物在10分鐘的測試後未能完成3次運行，則僅使用完成的運行進行分析。連續兩天對動物進行兩次測試。測試的第一天用於使動物習慣測試設備，測試的第二天進行評分。使用Catwalk XT軟體對運行進行自動分類，然後檢查足跡的準確性及適當的標識。任何非足跡數據均被手動刪除。所有數據皆導入Microsoft Excel及GraphPad Prism 7.0中進行分析。 窄道步態分析參數評估
Catwalk XT系統自動測量的參數包括支撐基礎、印記位置、步頻、步序規律性、平均身體速度及步幅，如下所述。計算並分析每組的平均值。
支撐基礎由Catwalk XT系統確定為前掌或後掌之間的平均寬度。印記位置由Catwalk XT系統確定為後掌位置與在身體相同側(同側)及在相同步行週期中先前放置之前掌的位置之間的距離。動物的步頻由Catwalk XT系統確定為每秒鐘步數。步序由Catwalk XT系統藉由確定落入通常在健康小鼠中觀察到的六種正規樣式之一的步數百分比來評估。平均身體速度由Catwalk XT 系統基於特定腳掌的步行週期，藉由將動物身體從該腳掌的一次初始接觸到下一次接觸的行進距離除以行進該距離的時間來確定。步幅由Catwalk XT系統基於同一腳掌連續放置之間的距離(距離單位)來確定。接觸區域由Catwalk XT系統基於Illuminated Footprints™技術來確定，其中腳掌由位於步道下方的高速攝影機捕捉。印記寬度及印記長度由Catwalk XT系統從腳印分類中使用的視訊影像與掌印來確定。一旦分類完成，CatWalk軟體會自動計算與各個足跡相關的參數。 組織學處理及評估 LAMP-1 IHC ( 評估溶酶體貯積病灶 )
對脫石蠟的石蠟切片進行LAMP-1免疫組織化學染色。簡而言之，藉由在10 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中將玻片在100°C下煮沸6分鐘來進行抗原修復(antigen retrieval)。然後將玻片與2%過氧化氫一起培養15分鐘，使用抗生物素蛋白/生物素試劑各阻斷15分鐘(Vector Laboratory；目錄號：SP-2001)，並與具有0.2% Triton-X的含1%驢血清之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)在室溫下一起培養10分鐘。然後將玻片與大鼠抗小鼠LAMP-1初級抗體(Abcam，目錄號 Ab25245)在37°C下一起培養1小時。洗滌玻片，然後與生物素化的驢抗兔IgG二級抗體(Jackson；目錄號：711-065-152)在室溫下一起培養45分鐘。洗滌玻片，然後與Vectastain ABC試劑(Vector Laboratories；目錄號：PK-6100)一起培養。使用3,3’‑二胺基聯苯胺(DAB)套組(Vector Laboratories；目錄號：SK-4100)進行比色顯影，然後以蘇木色素複染並蓋上蓋玻片進行評估。 GFAP IHC ( 評估星狀細胞增生 / 神經發炎 )
對脫石蠟的石蠟切片進行GFAP免疫組織化學染色。簡而言之，藉由在10 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中將玻片在100°C下煮沸6分鐘來進行抗原修復。然後將玻片與2%過氧化氫一起培養15分鐘，使用抗生物素蛋白/生物素試劑各阻斷15分鐘(Vector Laboratory；目錄號：SP-2001)，並與具有0.2% Triton-X的含1%驢血清之PBS在室溫下一起培養10分鐘。然後將玻片與兔抗小鼠GFAP初級抗體(Abcam，目錄號ab7260)在37°C下一起培養1小時。洗滌玻片，然後與生物素化的驢抗兔IgG二級抗體(Jackson；目錄號：711-065-152)在室溫下一起培養45分鐘。洗滌玻片，然後與Vectastain ABC試劑(Vector Laboratories；目錄號：PK-6100)一起培養。使用DAB套組(Vector Laboratories；目錄號：SK-4100)進行比色顯影，然後以蘇木色素複染並蓋上蓋玻片進行評估。 艾爾遜藍染色 ( 評估髓硫脂貯積 )
對脫石蠟的石蠟切片進行艾爾遜藍染色。簡而言之，將玻片在艾爾遜藍(1 g艾爾遜藍、90 mL H2O、10 mL 1N HCl；pH 1.0)中染色15分鐘。然後將玻片從染色劑中取出，在流動的自來水下洗滌1分鐘，然後在Nuclear Fast Red中複染2–3分鐘。將玻片在乙醇中脫水，然後在二甲苯中脫水，並蓋上蓋玻片進行評估。 組織病理學評估
使用VisioPharm影像分析軟體，從全玻片掃描數位影像(掃描器Aperio AT2)並將存在玻片上的陽性表面除以整個組織表面來將LAMP-1及GFAP IHC染色進行量化。艾爾遜藍染色並未量化。簡而言之，使用VIS版本2019.07.0.6328 (Visiopharm, Hoersholm, Denmark)手動勾勒出腦及脊髓的切片的染色良好且完整的區域。對於腦，使用IHS-S (強度、色調、飽和度模式)分類特徵，經由定限化(thresholding)對LAMP-1陽性區域進行定量。使用HDAB-蘇木色素分類特徵，經由定限化對LAMP-1陰性區域進行量化，並使用LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域分類來生成所勾勒的部分中LAMP-1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。對於脊髓，使用HDAB-DAB分類特徵，經由定限化對LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域進行量化，並使用LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域分類來生成所勾勒的部分中IBA1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。 藉由 LC/MS 對髓硫脂貯積進行定量
將解凍的組織冷凍乾燥隔夜，並在4°C下使用Precellys珠磨均質機(Bertin Technologies, Rockville, MD)在帶有陶瓷珠的2.0 mL聚丙烯管中研磨成細粉。在分析天平上稱量粉末的等分試樣(約2.5–5.0 mg)，然後在4°C下在Precellys均質機中在500 µL 80%甲醇中均質化。然後在100 µL均質物的等分試樣中摻加10 µL d 3-C18-髓硫脂內標準品(25 µM)，並在2.0 mL Eppendorf管中用400 µL冰冷甲醇萃取。樣本在4°C下以14,000 x g離心5分鐘。甲醇上清液的等分試樣(400 µL)在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並在150 µL甲醇中復原用於LC/MS分析。
製備了髓硫脂標準品的校正樣本。在分析天平上稱量髓硫脂類(溶血髓硫脂及 C16、C18、d 3-C18及C24:1；Matreya, State College, PA)的標準品粉末，並在2:1 甲基三級丁基醚/甲醇中製備個別原液溶液(1 mM)。d 3-C18髓硫脂內標準品原液溶液用甲醇稀釋，得到25 µM摻加內標準品溶液。將個別原液溶液的等分試樣合併，以製成含50 µM溶血髓硫脂、50 µM C16、250 µM C18及250 µM C24:1髓硫脂之甲醇的高校正摻加溶液。此高校正摻加溶液在甲醇中連續稀釋以製成用於溶血髓硫脂及C16髓硫脂的0.1、0.25、0.5、1、5、10、25及50 µM的校正曲線摻加溶液，以及用於C18及C24:1髓硫脂的0.5、1.25、2.5、5、25、50、125及250 µM的校正曲線摻加溶液。藉由將10 µL各種摻加溶液及10 µL d 3-C18-髓硫脂內標準品(25 µM)移液至100 µL 80%甲醇中，產生用於LC/MS分析的校正曲線溶液，導致用於溶血髓硫脂及C16髓硫脂的0.01、0.025、0.05、0.1、0.5、1、2.5及5 µM的LC/MS校正曲線，以及用於C18及C24:1髓硫脂之0.05、0.125、0.25、0.5、2.5、5、12.5及25 µM的LC/MS校正曲線。將400 µL甲醇等分試樣添加至各溶液中。將樣本渦旋(vortex)，將400 µL在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並於150 µL甲醇中復原而用於LC/MS分析。
使用Agilent 1290 Infinity UHPLC/6495B三級四極質譜儀(triple quadrupole mass spectrometer)定量髓硫脂類。將96孔盤中的生物萃取物及校正溶液注入(5 µL)並在UHPLC上分離。在45°C下，在Waters Acquity BEH C18 2 x 100 mm、1.7 µM管柱上以0.4 mL/分鐘的流速藉由梯度洗提來洗提硫化物。使用7.5 分鐘梯度，從35%溶劑A (70/30去離子水/乙腈/0.1%甲酸)及65%溶劑B (50/50乙腈/異丙醇/0.1%甲酸)開始，保持0.5分鐘並在5.5分鐘內增加至100%溶劑B，在100%溶劑B下保持7.5分鐘，然後在7.6至10分鐘內重新平衡回到起始條件。HPLC流在最初的0.5分鐘內被轉移到廢液中，然後被引導至電灑游離源。在質譜儀上以正電離模式藉由電灑游離將髓硫脂類離子化。以250°C的氮氣溫度、14 L/分鐘的氣流、45 psi的霧化器、325°C的屏蔽氣體(sheath gas)溫度、12L/分鐘的屏蔽氣體流速、3500 V的毛細管電壓、及500 V的噴嘴電壓來操作Agilent Jet Stream電灑游離源。在正電離模式下，使用多反應監測(MRM)對峰寬為0.7 Da、電子倍增器電壓為400 V的髓硫脂類進行定量。例如，藉由監測 m/z264.2，使用 m/z780.57 → 264.2的C16髓硫脂的一級躍遷定量C16，而二級躍遷 m/z780.57 → 682.6藉由H 2SO 4的中性丟失從母離子產生，用於確認主要轉變為真正的髓硫脂。Agilent MassHunter軟體用於生成線性或二次校正曲線(1/x 或 1/x 2加權及R 20.99或更佳)以量化生物樣本中的髓硫脂類。 測量 ARSA 酶活性
使用對硝基兒茶酚測定測量經透析的血清或組織樣本中的ARSA酶活性。簡而言之，將經透析的血清(稀釋1:5，1份血清+4份稀釋劑)或組織(稀釋0.3 mg/mL)在含或不含125 μM硝酸銀的基礎緩衝液(0.5 M乙酸鈉緩衝液，pH 5.0；10%氯化鈉；0.5 mM焦磷酸鈉)中稀釋，並將30 μL稀釋樣本加載至96孔盤的八個孔中(一式四份)。之後，添加30 μL受質(10 mM 4‑硝基兒茶酚硫酸鹽)。藉由立即以一式兩份(4個孔)加入90 μL 1N NaOH (終止溶液)來終止反應，並將其餘樣本在37°C下培養1小時。藉由添加90 μL 1N NaOH (終止溶液)來終止反應。藉由使用盤讀取器(plate reader)於515 nm讀取盤來測量吸光度。計算在含或不含硝酸銀的孔的60分鐘時的吸光度減去0分鐘時的吸光度。從不含硝酸銀所獲得的值減去含硝酸銀所獲得的值。藉由將最終吸光度值乘以4-硝基兒茶酚於515 nm的消光係數來確定ARSA特異性活性。結果表示為每小時每毫克蛋白質的ARSA活性。 結果 動物特質
所有動物皆存活到預定的屍檢，除了一隻雌性Arsa–/–小鼠(動物1301，第1組)在第157天(33週齡，8個月齡)由於與表型進展無關的皮膚狀況而被安樂死。 體重
未治療的雌性Arsa–/–小鼠展現與年齡相符之雌性野生型對照相似的體重增加，直到大約7個月齡，此時Arsa–/–及野生型小鼠的體重增加樣式開始分歧。在這個時間點之後，未治療的雌性Arsa–/–小鼠的體重通常停滯，到9個月齡時，雌性Arsa–/–小鼠在評估的大多數時間點均展現顯著低於雌性野生型對照的體重，而野生型對照體重持續增加至15個月齡(評估的最後時間點)。
未治療的雄性Arsa–/–小鼠到10個月齡時展現與年齡相符之雄性野生型對照相似的體重增加。到11個月齡時，未治療的雄性Arsa–/–小鼠在評估的大多數時間點均展現顯著低於雄性野生型對照的體重，而野生型對照體重持續增加至15個月齡(評估的最後時間點)(圖28)。
AAV-GAL3ST1處理的雄性Arsa–/–小鼠到9個月齡時展現顯著低於年齡相符之雄性野生型對照的體重。(圖29)。並未對AAV-GAL3ST1處理的小鼠進行更長期的評估，因為假設髓硫脂貯積的惡化可能導致更早的表型發展。因此，尚不清楚牠們在9個月齡之後如何進展。 臨床評分評估
臨床評分用於評估小鼠的臨床狀態，分數高於0表示臨床惡化。
從第32週(約10個月齡)開始，未治療的Arsa–/–小鼠在評估的所有時間點均展現顯著高於年齡相符之野生型對照的臨床分數，臨床分數在整個研究過程中逐漸增加直至在第52週(約15個月齡)評估的最後時間點。此結果表明未治療的Arsa–/–小鼠的臨床狀態逐漸惡化(圖30)。
相似於在未治療的Arsa–/–小鼠中觀察到的情況，在研究第26週期間(評估的最後時間點，約9個月齡)，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠與年齡相符之雄性野生型對照的臨床分數之間並無差異。此結果表明，與未治療的Arsa–/–小鼠相比，以AAV.GAL3ST1處理不會產生更早的表型(圖31)。 神經運動功能 窄沿測試
窄沿測試測量協調性，協調性在與共濟失調相關的神經退化性疾病(諸如MLD)中受損。小鼠被分配從0至3的分數，分數越高表示協調性越降低。
從第24週(約8個月齡)開始，未治療的Arsa–/–小鼠在評估的大多數時間點均展現顯著高於年齡相符之野生型對照的平均窄沿測試嚴重度分數，嚴重度分數在整個研究過程中逐漸增加直至在第52週(約15個月齡)評估的最後時間點。此結果表明未治療的Arsa–/–小鼠的神經運動功能逐漸惡化(圖32)。
相似於在未治療的Arsa–/–小鼠中觀察到的情況，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠及年齡相符之雄性野生型對照的窄沿測試嚴重度分數之間並無差異，直到第26週(約9個月齡)，此時AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠與年齡相符之野生型對照相比，平均窄沿測試嚴重度分數表現出統計學上顯著增加。此結果表明，與未治療的Arsa–/–小鼠相比，AAV.GAL3ST1不會產生更早的表型(圖33)。 RotaRod
神經運動功能藉由RotaRod測試評估，其藉由測量小鼠在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的落下時間來評估協調性及平衡。落下潛伏期的減少表明神經運動障礙，而落下潛伏期的增加表明神經運動功能得到改善。
儘管未治療的Arsa–/–小鼠顯示出一種趨勢，暗示與野生型對照相比，在研究第360天(約15個月齡)平均落下潛伏期輕微減少，但Arsa–/–小鼠與野生型對照之間的結果在評估的任何時間點皆沒有統計學差異(圖34)。
在到研究第180天(約9個月齡)期間，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠與野生型對照之間的RotaRod表現並未見到差異(圖35)。 窄道步態分析
使用CatWalk XT步態分析系統，通過測量支撐基礎、印跡位置、步頻、步序規律性、平均身體速度、步幅、接觸面積、印記寬度及印記長度來評估神經運動功能。與野生型對照相比，神經運動功能異常預期會導致Arsa–/–小鼠的步態及/或步行速度異常。
到第300天(約13個月齡)，與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠展現前肢支撐基礎在統計學上顯著減少，這種情況一直持續到評估的最後一個時間點第360天(約15個月齡；圖36A)。在第360天(約15個月齡；圖36B)，與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠還展現後肢支撐基礎在統計學上顯著增加。
與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠左側或右側的印記位置未觀察到統計學上顯著差異(數據未顯示)。
與野生型對照相比，在第300天(約13個月齡)觀察到未治療的Arsa–/–小鼠的步頻在統計學上顯著降低(圖37)，但這種差異可能是由於測定變異性所致，因為在第360天(約15個月齡)評估的最後一個時間點沒有觀察到步頻在統計學上顯著降低。
到第360天(約15個月齡)，與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠展現步序規律性顯著降低(圖38)。
與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠的平均速度未觀察到統計學上的顯著差異(數據未顯示)。
與野生型對照相比，除了第300天(約13個月齡)時的左側外，在所有測量的時間點，未治療的Arsa–/–小鼠的右前及左前步幅明顯更長(圖39)。左右後步幅的變化更大。與野生型對照相比，在基線(約3個月齡)及第180天(約9個月齡)時，未治療的Arsa–/–小鼠的右後步幅顯著更長，而與野生型對照相比，在第60天(約4個月齡)時，未治療的Arsa–/–小鼠的右後步幅顯著更短。與野生型對照相比，在基線(約3個月齡)及第180天(約9個月齡)時，未治療的Arsa–/–小鼠的左後步幅顯著更長，而與野生型對照相比，在第300天(約13個月齡)時，未治療的Arsa–/–小鼠的右後步幅顯著更短。
足跡面積參數分析顯示，與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠在印記寬度及印記長度測量沒有統計學上顯著差異(數據未顯示)，除了在第60天(約4個月齡)時，與野生型對照相比，Arsa–/–小鼠右後肢足跡接觸面積在統計學上顯著減少(圖40)。
窄道步態分析未顯示AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠與野生型對照之間的任何顯著差異(數據未顯示)。
總而言之，與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠所記錄的各種窄道測量值之間的差異暗示在此研究過程中，未治療的Arsa–/–小鼠出現輕度步態異常及神經運動功能降低。 組織學所見 LAMP-1 IHC ( 評估溶酶體貯積病灶 )
進行LAMP-1 IHC以評估未治療的Arsa–/–小鼠及野生型對照的腦及脊髓中的溶酶體貯積病灶。LAMP-1陽性區域的增加表明溶酶體貯積增加。
與年齡相符的野生型對照相比，在第27週(約9個月齡)及第52週(約15個月齡)，未治療的Arsa–/–小鼠在皮質、小腦及腦幹中表現出增加的LAMP-1染色(圖41)。
使用影像分析軟體對LAMP-1 IHC染色進行的定量證實，與野生型相比，未治療的Arsa–/–小鼠在第27週(約9個月齡)及第52週(約15個月齡)在整個腦(皮質、胼胝體、海馬迴、小腦、腦幹)及脊髓中呈現出更多的LAMP-1陽性染色(由較大的平均LAMP-1陽性區域表示)(圖42)。從第27週(約9個月齡)至第52週(約15個月齡)，Arsa–/–小鼠在評估的脊髓及所有腦區域(皮質、胼胝體、海馬迴、小腦、腦幹)的LAMP-1陽性染色(由平均LAMP-1陽性區域的增加表示)亦呈現出時間依賴性增加，其中在脊髓中觀察到最大的增加。
LAMP-1 IHC分析未在AAV-GAL3ST1處理的ARSA–/–小鼠(第5組及第6組)上進行，因為牠們沒有顯示出預期的更為顯著或較早的表型。 FAP IHC ( 評估星狀細胞增生 / 神經發炎 )
進行GFAP IHC以將反應性星狀細胞可視化並評估腦及脊髓中的星狀細胞增生及神經發炎。GFAP陽性區域的增加表明星狀細胞增生及神經發炎的增加。
在第27週(約9個月齡)及第52週(約15個月齡)時，與年齡相符的野生型對照相比，未治療的ARSA–/–小鼠顯示出腦(皮質、海馬迴、小腦、腦幹)及脊髓中GFAP IHC染色的增加(圖43)。
使用影像分析軟體對GFAP IHC進行量化證實，與野生型對照相比，在第27週(約9個月齡)及第52週(約15個月齡)，未治療的ARSA–/–小鼠在脊髓及所有腦區域(皮質、胼胝體、腦幹、小腦)中展現更多GFAP陽性染色(由較大的平均GFAP陽性區域表示)的趨勢，只有腦幹及胼胝體達到統計顯著性(圖44)。第27週(約9個月齡)至第52週(約15個月齡)，Arsa–/–小鼠在評估的脊髓及除了海馬迴以外的所有腦區域(皮質、胼胝體、腦幹、小腦)的GFAP-1陽性染色(由平均GFAP-1陽性區域的增加表示)中亦呈現出時間依賴性增加，表明星狀細胞增生/神經發炎隨著時間的進展。
未對AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠(第5組及第6組)進行GFAP IHC分析。 艾爾遜藍染色 ( 評估髓硫脂貯積 )
藉由艾爾遜藍染色評估腦、腎臟、肺臟、坐骨神經及脊髓中的髓硫脂貯積。艾爾遜藍染色強度的增加表明髓硫脂貯積(即ARSA酶的有毒受質)增加。
在第52週(約15個月齡)，評估的最後一個時間點，未治療的Arsa–/–小鼠在脊髓及周圍神經中展現少許甚至沒有艾爾遜藍染色(髓硫脂貯積)，與野生型對照相似(數據未顯示)。然而，與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠確實展現腎臟中的艾爾遜藍染色及神經元中的艾爾遜藍染色點的實質增加，基於比色檢測方法而表明實質的腎臟髓硫脂貯積及最小的腦神經元髓硫脂貯積(圖45)。
在約9個月齡時(研究第27週)，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠在腦、坐骨神經及脊髓中展現極少甚至沒有的艾爾遜藍染色(髓硫脂貯積)，與野生型對照相似。然而，與野生型對照相比，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠確實表現出腎臟中的艾爾遜藍染色增加，表明腎臟髓硫脂貯積增加(圖46)。 LC/MS ( 量化髓硫脂貯積 )
在約9個月齡(研究第27週)時進行LC/MS分析以量化未治療的Arsa–/–小鼠及AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠的腦、脊髓、坐骨神經、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、四頭肌及血漿中的髓硫脂貯積。未治療的Arsa–/–小鼠也在約15個月齡(研究第52週)時進行評估，以評估髓硫脂貯積隨著時間的進展。
在腦中，在約9個月齡及約15個月齡，與年齡相符的WT對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠中觀察到C16:0髓硫脂類、C18:0髓硫脂及溶血髓硫脂物種的水準顯著增加。與未治療的Arsa–/–小鼠相比，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠具有相當的貯積水準(圖47)。
在腎臟中，在約9個月齡及約15個月齡，與野生型對照中觀察到的水準相比，未治療的Arsa–/–小鼠中觀察到C16:0髓硫脂物種及溶血髓硫脂的水準顯著增加。相較之下，在約9個月齡時，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠及野生型對照之間C16:0髓硫脂物種或溶血髓硫脂的水準沒有顯著差異(圖48)。
在肝臟中，在約15個月齡時，與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠展現C16:0、C:22:0及C24:0髓硫脂物種的水準顯著較高，但在約9個月齡時沒有，這表明髓硫脂貯積隨著時間的進展。在約9個月齡時，在AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠中C22:0髓硫脂物種的水準顯著高於在野生型對照中觀察到的水準；然而，在此年齡時，AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠及野生型對照之間觀察到C16:0及C24:0髓硫脂物種的水準並無顯著差異(圖49)。
在四頭肌中，未治療的Arsa–/–小鼠在約9個月齡時分別展現相似及高3倍的C16:0及C:18:0髓硫脂物種的水準。這些差異越來越大，以至於與野生型對照相比，觀察到約15個月大的Arsa–/–小鼠四頭肌的C16:0及C:18:0髓硫脂物種的水準分別高2倍及14倍，表明髓硫脂貯積隨著時間的進展。在坐骨神經中，與野生型對照相比，約9個月大及約15個月大的Arsa–/–小鼠展現C16:0髓硫脂物種的水準分別高2倍及3倍。到約15個月齡時，與野生型對照相比，Arsa–/–小鼠於坐骨神經中具有高16倍的溶血髓硫脂水準。在脊髓中，約9個月齡及約15個月齡時，與野生型對照相比，Arsa–/–小鼠展現高3倍的C16:0髓硫脂物種的水準。與野生型對照相比，約9個月齡及約15個月齡的Arsa–/–小鼠的脊髓溶血髓硫脂水準分別高2倍及3倍。在心臟中，與野生型對照相比，在約9個月齡及約15個月齡時Arsa–/–小鼠呈現出C16:0髓硫脂物種的水準分別高12倍及10倍。在脾臟中，與野生型對照相比，約9個月齡及約15個月齡時，Arsa–/–小鼠的C16:0髓硫脂物種的水準分別高22倍及14倍。最後，與野生型對照相比，約9個月齡及約15個月齡時，Arsa–/–小鼠的C16:0髓硫脂物種的血漿水準分別高5倍及6倍。 內源性 ARSA 酶活性
在野生型及未治療的Arsa–/–小鼠子集的血清及組織(腦、脊髓、肝臟、腎臟、脾臟)中評估內源性ARSA酶活性。在此分析中包括的未治療的Arsa–/–小鼠在血清中呈現出最小的非特異性酶活性，平均水準低於野生型小鼠。當使用基於對硝基兒茶酚的測定將使用ARSA抑制劑硝酸銀所獲得的值(非特異性活性)減去沒有抑制劑所獲得的值(總硫酸酯酶活性)時，未治療的Arsa–/–小鼠在腦、脊髓、肝臟、腎臟及脾臟中亦證實極少甚至沒有殘留的ARSA酶活性。這與使用抗ARSA抗體的西方印漬法上沒有帶(band)一致(圖50)。這些結果證實Arsa–/–小鼠中成功的ARSA表現的減弱。
結果總結： •     Arsa–/–小鼠直到評估的最後一個時間點展現正常的壽命(約15個月齡)。 •     未治療的Arsa–/–小鼠展現各種讓人聯想到MLD的臨床、行為、生化及組織學的表型。 •     與年齡相符之野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠展現體重增加的顯著減少，雌性在9個月齡開始及雄性在11個月齡開始。 •     與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠在約10個月齡開始在臨床評分評估中展現顯著的進行性臨床下降。 •     在未治療的Arsa–/–小鼠中發現各種神經運動缺陷，包括從約8個月齡時開始顯著降低的窄沿測試表現及到約13個月齡時在窄道步態評估中可觀察到的輕度步態異常。直到15個月齡(最後評估的時間點)，在RotaRod評估中，未治療的Arsa–/–小鼠未觀察到異常。 •     未治療的Arsa–/–小鼠在約9個月齡時開始展現整個腦(皮質、胼胝體、小腦、腦幹)及脊髓的貯積病灶(LAMP-1 IHC)及星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)的逐漸增加。 •     與野生型對照相比，未治療的Arsa–/–小鼠藉由LC/MS分析表現出腦、脊髓、坐骨神經、心臟、四頭肌、腎臟、肝臟、脾臟及血漿中的髓硫脂貯積顯著增加。 •     未治療的Arsa–/–小鼠在16週齡(4個月齡)時，腦、脊髓、肝臟、腎臟及脾臟中表現出極少甚至沒有殘留的ARSA酶活性。在血清中檢測到一些非特異性殘留酶活性，其水準低於野生型對照。 •     AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠呈現出正常的壽命及與未治療的Arsa–/–小鼠相似的表型嚴重度及進展，表明在AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠中產生更早期及/或更顯著的表型並增加髓硫脂貯積的嘗試並未成功。因此選擇未治療的Arsa–/–小鼠用於未來的藥理學研究。 實施例 7- 腦室內投予 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) 至 Arsa –/– 小鼠後，評估人類芳基硫酸酯酶 A (ARSA) 的表現及功效
進行一項研究以評估在腦室內(ICV)投予至成年 Arsa –/– 小鼠後AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP‑207)的短期影響，並最適化生物標記分析用於未來的藥理學研究。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)為一種表現人類芳基硫酸酯酶A ( ARSA)基因的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體。
成年(6–7個月大)雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP‑207)，劑量為4.5 x 10 10GC(1.1 x 10 11GC/g 腦，N=2)。年齡相符的 Arsa –/– 或C57BL6/J(野生型)小鼠被投予媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS])作為對照(分別為N=1及N=2)。在這項先導研究中，基於群落中的可用度納入少量動物(每組N=1-2)。目的係最適化生物標記並對AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的短期藥理作用進行定性評估，以準備同時進行的更大規模的藥理學研究。生活中評估包括每天進行的生存力檢查及收集血清用於評估轉基因產物表現(ARSA酶活性)。在治療後第30天進行屍檢。在血漿、周圍器官及與治療MLD相關的目標組織(中樞神經系統[CNS]及周圍神經系統[PNS])中評估髓硫脂貯積(液相層析/質譜[LC/MS])。在CNS中對溶酶體貯積病灶(溶酶體相關膜蛋白1 [LAMP-1]免疫組織化學[IHC])及星狀細胞增生/神經發炎(神經膠原纖維酸性蛋白[GFAP] IHC)進行分析。亦評估CNS及周圍組織中的轉基因產物表現(ARSA IHC及/或ARSA酶活性)。 組別名稱、劑量水準及投予途徑
研究動物非隨機的。組別名稱、劑量水準及投予途徑(ROA)呈現於下表。
表.組別名稱、劑量水準及投予途徑
組別 N 性別 基因型 處理 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦) a 劑量體積 (μL) ROA 給藥 日 屍檢年齡 (月)
1 1 M Arsa –/– 無 N/A N/A N/A N/A N/A 9 b
2 2 M C57BL/6J(WT) PBS N/A N/A 5.0 ICV 0 8
3 1 M Arsa –/– PBS N/A N/A 5.0 ICV 0 7
4 2 M Arsa –/– AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) 4.5 x 10 10 1.1 x 10 11 5.0 ICV 0 7
a數值係使用成年小鼠的腦質量0.4 g計算(Gu et al., 2012)。 b此動物被納入非臨床研究5 (W2977)。在本研究中僅包括此動物藉由LC/MS的髓硫脂定量數據。 縮寫：F，雌性；GC，基因體拷貝；ICV，腦室內；ID，識別號碼；LC/MS，液相層析/質譜；N，動物數量；N/A，不適用；PBS，磷酸鹽緩衝食鹽水；ROA，投予途徑；WT，野生型。
在研究第0天，成年C57BL/6J(野生型)小鼠接受單次ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP‑207)(4.5 x 10 10GC)或對照物(PBS [媒劑])。每天進行生存力檢查。在第7天及第30天的屍檢時，收集血清用於評估轉基因產物表現(ARSA酶活性)。在屍檢時，收集腦、脊髓、肝臟、腎臟、心臟及脾臟用於評估轉基因產物表現(ARSA酶活性測定及/或ARSA IHC)。收集腦、脊髓、肝臟、腎臟、心臟、脾臟、坐骨神經、四頭肌及血漿以評估髓硫脂貯積(LC/MS)。對CNS (腦及脊髓)中的溶酶體貯積病灶(LAMP1 IHC)及星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)進行評估。 組織學處理及評估 LAMP-1 IHC ( 評估溶酶體貯積病灶 )
對脫石蠟的石蠟切片進行LAMP-1免疫組織化學染色。簡而言之，藉由在10 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中將玻片在100°C下煮沸6分鐘來進行抗原修復。然後將玻片與2%過氧化氫一起培養15分鐘，使用抗生物素蛋白/生物素試劑各阻斷15分鐘(Vector Laboratory；目錄號：SP-2001)，並與具有0.2% Triton-X的含1%驢血清之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)在室溫下一起培養10分鐘。然後將玻片與大鼠抗小鼠LAMP-1初級抗體(Abcam，目錄號 Ab25245)在37°C下一起培養1小時。洗滌玻片，然後與生物素化的驢抗兔IgG二級抗體(Jackson；目錄號：711-065-152)在室溫下一起培養45分鐘。洗滌玻片，然後與Vectastain ABC試劑(Vector Laboratories；目錄號：PK-6100)一起培養。使用3,3’‑二胺基聯苯胺(DAB)套組(Vector Laboratories；目錄號：SK-4100)進行比色顯影，然後以蘇木色素複染並蓋上蓋玻片進行評估。 GFAP IHC ( 評估星狀細胞增生 / 神經發炎 )
對脫石蠟的石蠟切片進行GFAP免疫組織化學染色。簡而言之，藉由在10 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)中將玻片在100°C下煮沸6分鐘來進行抗原修復。然後將玻片與2%過氧化氫一起培養15分鐘，使用抗生物素蛋白/生物素試劑各阻斷15分鐘(Vector Laboratory；目錄號：SP-2001)，並與具有0.2% Triton-X的含1%驢血清之PBS在室溫下一起培養10分鐘。然後將玻片與兔抗小鼠GFAP初級抗體(Abcam，目錄號 ab7260)在37°C下一起培養1小時。洗滌玻片，然後與生物素化的驢抗兔IgG二級抗體(Jackson；目錄號：711-065-152)在室溫下一起培養45分鐘。洗滌玻片，然後與Vectastain ABC試劑(Vector Laboratories；目錄號：PK-6100)一起培養。使用DAB套組(Vector Laboratories；目錄號：SK-4100)進行比色顯影，然後以蘇木色素複染並蓋上蓋玻片進行評估。 ARSA 免疫組織化學 (IHC)
脫石蠟後，對人類ARSA蛋白進行IHC。簡而言之，使用基於檸檬酸的抗原未遮蔽溶液(Vector Laboratories；目錄號：H-3300)，在100°C的壓力鍋中進行抗原修復20分鐘。將玻片與3%過氧化氫一起培養10分鐘，使用抗生物素蛋白/生物素試劑各阻斷15分鐘(Vector Laboratory；目錄號：SP-2001)，並與具有0.2% Triton-X的1%驢血清在室溫下一起培養15分鐘。然後將玻片與以1:500稀釋的兔ARSA初級抗體(Sigma；目錄號：HPA005554)在4°C下一起培養隔夜。將玻片與以1:500稀釋的生物素化的驢抗兔IgG二級抗體(Jackson；目錄號：711-065-152)在室溫下一起培養30分鐘。洗滌玻片，然後與Vectastain ABC試劑(Vector Laboratories；目錄號：PK-6100)一起培養。使用DAB套組(Vector Laboratories；目錄號：SK-4100)進行比色顯影，然後以蘇木色素複染並蓋上蓋玻片。 藉由 LC/MS 對髓硫脂貯積進行定量
將解凍的組織冷凍乾燥隔夜，並在4°C下使用Precellys珠磨均質機(Bertin Technologies, Rockville, MD)在帶有陶瓷珠的2.0 mL聚丙烯管中研磨成細粉。在分析天平上稱量粉末的等分試樣(約2.5–5.0 mg)，然後在4°C下在Precellys均質機中在500 µL 80%甲醇中均質化。然後在100 µL均質物的等分試樣中摻加10 µL C18:0-CD3-髓硫脂內標準品(N-ω-CD3-十八醯基髓硫脂，Matreya State College, PA，目錄號1536；25 µM)，並在2.0 mL Eppendorf管中用400 µL冰冷甲醇萃取。樣本在4°C下以14,000 x g離心5分鐘。甲醇上清液的等分試樣(400 µL)在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並在150 µL甲醇中復原用於LC/MS分析。
製備了髓硫脂標準品的校正樣本。在分析天平上稱量髓硫脂類(溶血髓硫脂 目錄號1904；C16:0 目錄號1875、C18:0目錄號1932、C18:0-CD3目錄號1536、及C24:1目錄號1931；Matreya, State College, PA)的標準品粉末，並在2:1甲基三級丁基醚/甲醇中製備個別原液溶液(1 mM)。C18:0-CD3髓硫脂內標準品原液溶液用甲醇稀釋，得到25 µM摻加內標準品溶液。將個別原液溶液的等分試樣合併，以製成含50 µM溶血髓硫脂、50 µM C16:0、250 µM C18:0及250 µM C24:1髓硫脂之甲醇的高校正摻加溶液。此高校正摻加溶液在甲醇中連續稀釋以製成用於溶血髓硫脂及C16:0髓硫脂的0.1、0.25、0.5、1、5、10、25及50 µM的校正曲線摻加溶液，以及用於C18:0及C24:1髓硫脂的0.5、1.25、2.5、5、25、50、125及250 µM的校正曲線摻加溶液。藉由將10 µL各種摻加溶液及10 µL C18:0-CD3-髓硫脂內標準品(25 µM)移液至100 µL 80%甲醇中，產生用於LC/MS分析的校正曲線溶液，導致用於溶血髓硫脂及C16髓硫脂的0.01、0.025、0.05、0.1、0.5、1、2.5及5 µM的LC/MS校正曲線，以及用於C18:0及C24:1髓硫脂之0.05、0.125、0.25、0.5、2.5、5、12.5及25 µM的LC/MS校正曲線。將400 µL甲醇等分試樣添加至各溶液中。將樣本渦旋，將400 µL在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並於150 µL甲醇中復原而用於LC/MS分析。
使用Agilent 1290 Infinity UHPLC/6495B三級四極質譜儀定量髓硫脂類。將96孔盤中的生物萃取物及校正溶液注入(5 µL)並在UHPLC上分離。在45°C下，在Waters Acquity BEH C18 2 x 100 mm、1.7 µM管柱上以0.4 mL/分鐘的流速藉由梯度洗提來洗提硫化物。使用7.5分鐘梯度，從35%溶劑A (70/30去離子水/乙腈/0.1%甲酸)及65%溶劑B (50/50乙腈/異丙醇/0.1%甲酸)開始，保持0.5分鐘並在5.5分鐘內增加至100%溶劑B，在100%溶劑B下保持7.5分鐘，然後在7.6至10分鐘內重新平衡回到起始條件。HPLC流在最初的0.5分鐘內被轉移到廢液中，然後被引導至電灑游離源。在質譜儀上以正電離模式藉由電灑游離將髓硫脂類離子化。以250°C的氮氣溫度、14 L/分鐘的氣流、45 psi的霧化器、325°C的屏蔽氣體溫度、12L/分鐘的屏蔽氣體流速、3500 V的毛細管電壓、及500 V的噴嘴電壓來操作Agilent Jet Stream電灑游離源。在正電離模式下，使用多反應監測(MRM)對峰寬為0.7 Da、電子倍增器電壓為400 V的髓硫脂類進行定量。例如，藉由監測m/z 264.2，使用m/z 780.57 → 264.2的C16:0髓硫脂的一級躍遷定量C16:0，而二級躍遷m/z 780.57 → 682.6藉由H 2SO 4的中性丟失從母離子產生，用於確認主要轉變為真正的髓硫脂。Agilent MassHunter軟體用於生成線性或二次校正曲線(1/x或1/x2加權及R2 0.99或更佳)以量化生物樣本中的髓硫脂類。 測量 ARSA 酶活性
使用對硝基兒茶酚測定測量經透析的血清或組織樣本中的ARSA酶活性。簡而言之，將經透析的血清(稀釋1:5，1份血清+4份稀釋劑)或組織在基礎緩衝液(0.5 M乙酸鈉緩衝液，pH 5.0；10%氯化鈉；0.5 mM焦磷酸鈉)中稀釋，並將40 μL稀釋樣本加載至96孔盤的四個孔中(一式二份)。之後，將40 μL受質(含10 mM 4-硝基兒茶酚硫酸鹽之基礎緩衝液)添加至樣本中，並藉由立即在四個孔中的兩個孔中添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)來終止反應。然後將盤於37°C培養5小時。藉由添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)來終止反應。藉由使用盤讀取器於515 nm讀取盤來測量吸光度。ARSA特異性活性係藉由將在5小時獲得的吸光度減去0分鐘時的吸光度乘以4-硝基兒茶酚標準曲線於515 nm的消光係數，然後除以藉由BCA測定測量的孔中的蛋白質量(mg)來確定。ARSA活性的結果以每五小時每毫克蛋白質的奈莫耳(nmol/mg/5小時)呈現。 動物特質
所有動物皆存活到預定的第30天屍檢。 組織學 所見 LAMP-1 IHC ( 評估溶酶體貯積病灶 )
進行LAMP-1 IHC以評估 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠的腦及脊髓中的溶酶體貯積病灶。LAMP-1陽性區域的增加表明溶酶體貯積增加。呈現從腦組織收集的數據。
在第30天，與年齡相符之野生型對照小鼠相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠表現出在皮質、海馬迴、小腦及腦幹中的LAMP-1染色增加(圖51及圖52)。與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠相比，投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠表現出在皮質及海馬迴中的LAMP-1染色減少。然而，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207)治療的Arsa –/–小鼠的小腦、腦幹(圖52)、及脊髓(數據未顯示)中未見到LAMP-1染色差異。 GFAP IHC ( 評估星狀細胞增生 / 神經發炎 )
進行GFAP IHC以將反應性星狀細胞可視化並評估腦及脊髓中的星狀細胞增生及神經發炎。GFAP陽性區域的增加表明星狀細胞增生及神經發炎的增加。呈現從腦組織收集的數據。
在第30天，與年齡相符之野生型對照小鼠相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠表現出在皮質、小腦及腦幹中的GFAP染色增加(圖53及圖54)。與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠相比，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠表現出在皮質及海馬迴中的GFAP染色減少。然而，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)治療的Arsa –/–小鼠的小腦、腦幹(圖54)、或脊髓(數據未顯示)中未見到GFAP染色差異。 ARSA IHC ( 轉基因產物表現 )
在屍檢時收取數個CNS及PNS組織用於藉由IHC對人類ARSA表現進行全面的組織學評估。呈現從腦組織收集的數據。
在第30天的屍檢中，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠在皮質、海馬迴、小腦及腦幹的細胞中證實沒有ARSA蛋白表現(圖55及圖56)。相較之下，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠在這些組織中的每種中皆表現出ARSA蛋白表現，且ARSA陽性細胞在皮質及海馬迴中比在小腦及腦幹中更為豐富。在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的小鼠的脊髓中未見到ARSA表現(數據未顯示)。在周圍組織中，僅在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)的Arsa –/–小鼠肝臟及心臟中證實強烈的ARSA表現(圖57)，而在脾臟、腎臟、四頭肌或肺臟並未見到ARSA表現(數據未顯示)。 LC/MS ( 量化髓硫脂貯積 )
進行LC/MS分析以量化第30天屍檢時腦、坐骨神經、肝臟、脾臟、腎臟、心臟、四頭肌及血漿中的髓硫脂貯積。以下僅呈現可在測試的組織中檢測到的髓硫脂物種。
在腦中，與年齡相符之野生型對照小鼠相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中分析的所有髓硫脂物種均較高。與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠相比，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠證實髓硫脂貯積的矯正，數種物種(C16、C18、C20、C22及溶血髓硫脂)的水準降低(圖58)。
在坐骨神經中，在媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中檢測到分析的所有可檢測的髓硫脂物種的最高水準(圖59)。總體而言，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之 Arsa –/– 小鼠顯示出髓硫脂蓄積的矯正，其水準與在年齡相符之野生型對照小鼠中測量的水準相似或更低。
在肝臟中，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中分析的所有可檢測到的髓硫脂物種均高於年齡相符之野生型對照小鼠(圖60)。投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠證實，與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠相比，除了溶血髓硫脂外，所有髓硫脂物種的水準均降低，與年齡相符之野生型對照小鼠相比，具有類似或更低的C16:0、C16:0-OH、C22:0、及C24:1髓硫脂物種的水準。
在脾臟中，C16:0及C18:0髓硫脂物種的水準在媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中最高，且在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠與年齡相符之野生型對照小鼠之間相似(圖61)。在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠中溶血髓硫脂的濃度最高，與WT對照相似。
在腎臟中，與年齡相符之野生型對照小鼠相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中分析的所有髓硫脂物種均較高(圖62)。一些髓硫脂物種在AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa -/- 小鼠中顯示水準降低，但仍高於WT對照(C20:0、C22:0、C22-0-OH)。
在心臟中，C16:0及C24:0髓硫脂物種的水準在媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中最高，而且在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠中被矯正(圖63)。然而，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)的投予並未矯正 Arsa –/– 小鼠中C24:1及溶血髓硫脂的水準。
在四頭肌中，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)並未矯正髓硫脂類的蓄積(圖64)。
在血漿中，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的投予矯正了投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)之 Arsa –/– 小鼠中的C16:0及溶血髓硫脂的水準，且水準與年齡相符之野生型對照小鼠相似(圖65)。 ARSA 酶活性 ( 評估轉基因產物表現 )
在血清及組織(腦、心臟、脊髓、肝臟、腎臟、脾臟)中評估ARSA酶活性。為了測量ARSA酶活性，測試三種不同的蛋白質濃度以確定該測定的最適蛋白質加載(圖66)。在腦及脊髓中，0.3 mg/mL (每孔12 µg)的蛋白質濃度對於測試的組織似乎為最適的。然而，結果顯示AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)與媒劑處理的動物之間腦中的ARSA酶活性相似。對此結果的可能解釋為組織收集的方法及/或測定的低靈敏度及/或特異性。對於這項研究，收集並處理了腦的整個右矢狀半部分。鑑於轉基因產物的表現在注射部位最高(人類ARSA IHC)，且遠離注射部位而逐漸下降，在半腦中的測定活性可能已導致來自AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物的測試樣本中的ARSA酶活性稀釋。此外，這些測定中使用的受質對於ARSA及其他硫酸酯酶(如ARSB、ARSK、C2硫酸酯酶)並非特異性的，它們可從4-硝基兒茶酚中切割硫酸根基團(Benitez and Halver, 1982；Lubke and Damme, 2020)。結果，由於其他水解酶的活性，存在背景非特異性活性，這解釋了媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中接近野生型水準的陽性活性。在周圍組織中，樣本的蛋白質加載濃度並不影響ARSA酶活性。有趣的是，我們檢測到與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠及野生型對照相比，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物的肝臟及脾臟中強烈增加。
在第7天，媒劑處理的野生型對照小鼠與投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠之間ARSA酶活性水準通常相似，且與 Arsa –/– 對照相比，ARSA酶活性水準增加(圖67)。在第30天的屍檢中，媒劑處理的野生型對照小鼠具有與第7天測量相似的ARSA酶活性水準。然而，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠證實，與第7天相比，ARSA酶活性輕微降低。
結果總結： ●     投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠，藉由免疫組織化學，在大腦皮質、海馬迴、小腦及腦幹的細胞中的ARSA蛋白表現，ARSA陽性細胞在皮質及海馬迴中更為豐富。 ●     以AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療 Arsa –/– 小鼠，導致與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠相比，在大腦皮質及海馬迴中溶酶體病理(藉由LAMP-1 IHC測量)及星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)的減少。在小腦、腦幹及脊髓中沒有發現差異。此對應於在藉由IHC觀察到更豐富的ARSA表現之區域中更好的矯正。 ●     與媒劑處理的 Arsa–/–小鼠中測得的水準相比，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠在腦、肝臟、脾臟、心臟、坐骨神經及血漿中具有降低的幾種髓硫脂物種的水準。在腦中，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予證實髓硫脂類的矯正，與媒劑處理的 Arsa–/–小鼠相比，C16、C18、C20、C22及溶血髓硫脂的水準降低。在心臟、肝臟、脾臟及在血漿的C16水準中亦觀察到類似的結果。在腎臟中，雖然一些髓硫脂類在治療的小鼠中低於對照，但增加的髓硫脂水準並未矯正到野生型的水準。 ●     不同蛋白質濃度的分析表明，0.3 mg/mL (每反應12 µg)的加載濃度對於腦及脊髓中的ARSA酶活性為最適的。在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療及媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的腦中ARSA酶活性並未觀察到差異。從整個矢狀半腦測定ARSA活性可能導致酶活性稀釋，因為在測試的劑量下，轉導在吻端及腦室周圍區域更為穩健。 ●     投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠證實肝臟、脾臟及血清中ARSA酶活性增加。 實施例 8- 研究評估 AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) 在腦室內投予至 Arsa –/– 小鼠後的療效及最適劑量
進行一項功效及劑量範圍研究以在異染性白質失養症(MLD)之新穎 Arsa –/– 小鼠模式中，將AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)在腦室內(ICV)投予後的長期影響予以特徵化，該AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)係一種表現人類芳基硫酸酯酶A ( ARSA)基因的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體。
在研究第0天，成年(4–5個月大) Arsa –/– 小鼠接受單次ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為三種劑量(1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC/g腦]、4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦]、或1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])中的一種。包括投予媒劑(磷酸鹽緩衝食鹽水[PBS])之另外的 Arsa –/– 小鼠及野生型C57BL6/J小鼠作為對照。評估每組10隻動物(5隻雄性及5隻雌性)。
生活中評估包括存活監測、體重測量、臨床評分評估及神經運動功能評估(窄沿測試、RotaRod測定及窄道步態分析)。在約19–20個月齡時進行屍檢。在CNS、周圍器官及血清中評估ARSA酶活性。在血漿(液相層析/質譜[LC/MS])、周圍器官及與治療MLD的神經學特徵相關的目標組織(中樞神經系統[CNS]及周圍神經系統[PNS])中藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。在CNS中量化疾病負擔的組織學標記、溶酶體貯積病灶(溶酶體相關膜蛋白1 [LAMP-1]免疫組織化學[IHC])及星狀細胞增生/神經發炎(神經膠原纖維酸性蛋白[GFAP] IHC)。
本研究的目的係將AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)在ICV投予至成年(4–5個月大) Arsa –/– 小鼠後之劑量範圍的長期功效予以特徵化，包括對神經行為功能及存活的影響。
組別名稱、劑量水準及投予途徑(ROA)呈現於下表。
表.組別名稱、劑量水準及投予途徑
組別 N及 性別 基因型 處理 劑量 (GC/動物) 劑量 (GC/g腦) a 劑量體積 (μL) ROA 給藥 日 屍檢 研究日 屍檢年齡 (月)
1 5 M 5 F C57BL/6J (WT) PBS N/A N/A 5 ICV 0 450 19-20
2 5 M 5 F Arsa –/– PBS N/A N/A 5 ICV 0 144-450 b 9-20
3 6 M 5 F c Arsa –/– GTP-207 1.3 x 10 11 3.3 x 10 11 5 ICV 0 450 19-20
4 5 M 5 F Arsa –/– GTP-207 4.5 x 10 10 1.1 x 10 11 5 ICV 0 450 19-20
5 5 M 5 F Arsa –/– GTP-207 1.3 x 10 10 3.3 x 10 10 5 ICV 0 450 19-20
a數值係使用成年小鼠的腦質量0.4 g計算(Gu et al., 2012)。 b此組中的三隻動物被發現在研究第433日(N=1)及第443日(N=2)死亡，由於在研究第144日及第375日的人道終點，兩隻動物根據獸醫的建議進行緊急屍檢。 c由於在ICV給藥後4天達到人道終點，根據獸醫的建議對一隻小鼠實施安樂死。動物展現增加的呼吸費力及身體狀況不佳。因此，11隻小鼠注射1.3 x 10 11GC的載體。 縮寫： Arsa ，芳基硫酸酯酶A (基因，小鼠)；F，雌性；GC，基因體拷貝；ID，識別號碼；IV，靜脈內；M，male；N，動物數量；N/A，不適用；ROA，投予途徑；WT，野生型。
在研究第0天，成年(4-5個月齡) Arsa –/– 小鼠與年齡相符之C57BL/6J野生型對照接受三種劑量(1.1 x 10 11GC或4.5 x 10 10GC或1.1 x 10 10GC)中的一種之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或對照物(PBS [媒劑])的單次ICV投予。
生活中評估包括在不同的時間點的生存力檢查、獸醫臨床觀察、體重測量、臨床評分評估及神經運動功能評估(窄沿測試、RotaRod測定及窄道步態分析)。在第450天(19-20個月齡)或當小鼠基於獸醫臨床觀察達到人道終點時進行屍檢。在血漿、腦、脊髓、坐骨神經、肝臟及腎臟中評估髓硫脂貯積(藉由LC/MS)。對腦及脊髓中的溶酶體貯積病灶(LAMP-1 IHC)及星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)進行量化。亦在腦(疾病相關目標)、肝臟、心臟(ICV給藥後轉導的主要周圍器官)及血清中評估ARSA酶活性。 臨床觀察 臨床評分評估
兩名研究人員使用對緊握能力、步態、震顫、脊柱後凸及毛皮品質的未公開評估對臨床徵象進行評分。選擇這些測量以基於 Arsa –/– 小鼠通常展現的症狀評估臨床狀態。高於0的分數表示臨床惡化。操作員在收集及記錄分數時並不知道處理及基因型。
評估類別 觀察 分數
毛皮品質 有光澤的被毛，光滑的毛皮，照料很好、乾淨的被毛 0
照料沒有很好、輕微油膩或粗糙的被毛 1
粗糙的被毛 - 被毛油膩、骯髒、直立 2
非常粗糙的被毛，脫水 3
步態 活躍的，精力充沛的。四肢支撐體重。連後肢、腹部皆抬起 0
能跑，但行動遲緩。走路時跛行。 1
不願移動，嚴重跛行，骨盆降低，雙腳遠離身體 2
僅在手動刺激時最小限度地移動，拖拽腹部 3
震顫 無震顫徵象 0
非常輕微，暫時性 1
輕度，近距離觀察可見 2
中度，立即可見 3
嚴重，影響活動性 4
緊握 後肢始終從腹部向外張開 0
＞50%的時間，一後肢向腹部縮回 1
＞50%的時間，兩後肢皆部分縮回 2
＞50%的時間，後肢完全縮回並接觸腹部 3
四肢永久完全抓握 4
姿勢 正常，平坦的背部 - 走路時容易拉直脊柱 0
短暫的駝背，僅在休息時明顯 - 輕度但能夠拉直脊柱 1
直立休息，背部駝背，移動時無法完全拉直但輕度 2
走路及坐著時明顯並保持脊柱後凸 3
神經運動功能評估 窄沿測試
窄沿測試測量協調性，協調性在與共濟失調相關的神經退化性疾病(諸如MLD)中受損。根據已公開的步驟準則(Guyenet et al., 2010)，通過進行窄沿測試來評估小鼠的表型進展。簡而言之，將動物從牠的籠子中抬起，並放置於籠子的窄沿上。觀察小鼠並基於牠沿著窄沿引導並回到籠子裡的能力分配分數。高於0的分數表示神經運動功能下降。
分數 觀察
0 小鼠在不失去平衡的情況下沿著窄沿行走，並用腳掌優雅且不失去平衡地降低身子回牠的籠子
1 小鼠在沿著窄沿行走時失足，但在其他方面看起來協調。
2 當下降到籠子中時，小鼠不能有效地使用牠的後腿，或著頭朝下著地而非以腳掌著地
3 小鼠在行走或試圖降低自己時幾乎或完全從窄沿上落下，或者儘管受到刺激但仍然搖晃並拒絕移動。
縮寫：N/A，不適用。
RotaRod
使用RotaRod測試(Ugo Basile；Gemonio, Italy)測量協調性及平衡。簡而言之，藉由每次試驗最多放置5隻小鼠在RotaRod裝置面向牆壁的通道中，先使小鼠習慣RotaRod。讓小鼠在固定的(非旋轉的)桿上穩定2分鐘。然後執行兩個習慣化試驗，桿以每分鐘5轉(RPM)的恆定速度旋轉1分鐘。在每次習慣化試驗之間，允許小鼠在RotaRod收集箱中休息大約1分鐘。若小鼠在習慣化階段落下，立即將其放回桿上。
在習慣之後，立即進行測試試驗以測量每隻小鼠在旋轉桿加速時可在旋轉桿上停留多長時間。小鼠被放置在面向牆壁的RotaRod裝置的通道中，並允許在固定的(非旋轉的)桿上平衡以建立牢固的抓握。然後將桿設置為以5 RPM的恆定速度旋轉幾秒鐘，以使小鼠達到平衡。一旦平衡，將桿設置為在120秒鐘內從5 RPM加速到40 RPM。對於每隻動物，當小鼠從桿上落下、完成兩次順從旋轉或經過120秒鐘時，測試試驗被視為終止。記錄落下潛伏期(定義為桿開始加速與試驗終止之間的時間)。在每個試驗中對小鼠進行總共三個連續的重複測試，在運行之間暫停1–3分鐘，讓動物在收集箱中休息。 窄道步態分析
使用CatWalk XT步態分析系統(Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands)評估步態及步行速度。CatWalk XT追踪小鼠走過玻璃板時的足跡。該系統量化每個掌印的尺寸，並統計分析動物的速度及步態的其他特徵。
為了執行此評估，在測試開始之前，將Catwalk XT 以適當寬度的步道設定進行校正。所有實驗設定皆輸入到Catwalk XT軟體中，包括動物類型、時間點及運行基準。在Catwalk XT上運行之前，將動物帶入房間並在黑暗中適應至少30分鐘。一旦適應完成，選擇一隻動物並將其放置在步道的入口處。研究人員開啟採集軟體，並讓動物沿著步道行走。動物的籠子被置於步道的盡頭以示鼓勵。當動物在規定的時間限制內成功走到窄道的盡頭時，運行即完成，否則重複運行。動物進行三個試驗，最短期間為0.50秒鐘，最長期間為5.00秒鐘。需三次成功運行才被認為試驗完成。如果一隻動物在10分鐘的測試後未能完成3次運行，則僅使用完成的運行進行分析。連續兩天對動物進行兩次測試。測試的第一天用於使動物習慣測試設備，測試的第二天進行評分。使用Catwalk XT軟體對運行進行自動分類，然後檢查足跡的準確性及適當的標識。任何非足跡數據均被手動刪除。所有數據皆導入Microsoft Excel及GraphPad Prism 7.0中進行分析。 窄道步態分析參數評估
Catwalk XT系統自動測量的參數包括支撐基礎、印記位置、步頻、步序規律性、平均身體速度及步幅，如下所述。計算並分析每組的平均值。
支撐基礎由Catwalk XT系統確定為前掌或後掌之間的平均寬度。印記位置由Catwalk XT系統確定為後掌位置與在身體相同側(同側)及在相同步行週期中先前放置之前掌的位置之間的距離。動物的步頻由Catwalk XT系統確定為每秒鐘步數。步序由Catwalk XT系統藉由確定落入通常在健康小鼠中觀察到的六種正規樣式之一的步數百分比來評估。平均身體速度由Catwalk XT 系統基於特定腳掌的步行週期，藉由將動物身體從該腳掌的一次初始接觸到下一次接觸的行進距離除以行進該距離的時間來確定。步幅由Catwalk XT系統基於同一腳掌連續放置之間的距離(距離單位)來確定。接觸區域由Catwalk XT系統基於Illuminated Footprints™技術來確定，其中腳掌由位於步道下方的高速攝影機捕捉。印記寬度及印記長度由Catwalk XT系統從腳印分類中使用的視訊影像與掌印來確定。一旦分類完成，CatWalk軟體會自動計算與各個足跡相關的參數。 LAMP-1 IHC ( 評估溶酶體貯積病灶 ) 及 GFAP IHC ( 評估星狀細胞增生 / 神經發炎 )
按照標準免疫組織化學(IHC)步驟準則，使用Bond聚合物檢測系統(Leica Biosystems，DS9800)及DAB作為色素原，在Leica Bond Rx自動染色機上對FFPE組織切片進行IHC。對於所有染色，檸檬酸鹽緩衝液 pH6用於抗原修復(20分鐘)。使用單株大鼠抗體1D4B(Abcam ab25245，1:50稀釋)檢測 LAMP1，使用來自Abcam的兔抗體(ab7260，1:4000稀釋)檢測 GFAP，使用來自Sigma的兔抗體(HPA005554，1:200稀釋)檢測ARSA。所有初級抗體的培養時間均設置為30分鐘。即用型二級聚合物抗體來自Vector Laboratories (抗大鼠抗體用於LAMP1，MP-7444，培養時間20分鐘)或來自Leica (兔抗體用於GFAP及ARSA，BOND Polymer Refine Detection DS9800，培養時間8分鐘)。染色後，玻片通過乙醇及二甲苯脫水並蓋上蓋玻片。
使用影像分析軟體對LAMP-1及GFAP IHC進行量化。簡而言之，使用VIS版本2019.07.0.6328 (Visiopharm, Hoersholm, Denmark)手動勾勒出腦、脊髓及坐骨神經的切片的染色良好且完整的區域。對於腦，使用IHS-S (強度、色調、飽和度模式)分類特徵，經由定限化對LAMP-1陽性區域進行定量。使用HDAB-蘇木色素分類特徵，經由定限化對LAMP-1陰性區域進行量化，並使用LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域分類來生成所勾勒的部分中LAMP-1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。對於脊髓，使用HDAB-DAB分類特徵，經由定限化對LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域進行量化，並使用LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域分類來生成所勾勒的部分中IBA1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。對於坐骨神經，使用HDAB-DAB分類特徵經由定限化對LAMP-1陽性區域進行定量。使用HDAB-蘇木色素分類特徵，經由定限化對LAMP-1陰性區域及處理引起的空白空間進行量化，並使用LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域(但非空白空間)分類來生成所勾勒的部分中LAMP-1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。 藉由 LC/MS 對髓硫脂貯積進行定量
將解凍的組織冷凍乾燥隔夜，並在4°C下使用Precellys珠磨均質機(Bertin Technologies, Rockville, MD)在帶有陶瓷珠的2.0 mL聚丙烯管中研磨成細粉。在分析天平上稱量粉末的等分試樣(約2.5–5.0 mg)，然後在4°C下在Precellys均質機中在500 µL 80%甲醇中均質化。然後在100 µL均質物的等分試樣中摻加10 µL C18:0-CD3-髓硫脂內標準品(N-ω-CD3-十八醯基髓硫脂，Matreya State College, PA，目錄號1536；25 µM)，並在2.0 mL Eppendorf管中用400 µL冰冷甲醇萃取。樣本在4°C下以14,000 x g離心5分鐘。甲醇上清液的等分試樣(400 µL)在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並在150 µL甲醇中復原用於LC/MS分析。
製備了髓硫脂標準品的校正樣本。在分析天平上稱量髓硫脂類(溶血髓硫脂 目錄號1904；C16:0目錄號1875、C18:0目錄號1932、C18:0-CD3目錄號1536、及C24:1目錄號1931；Matreya, State College, PA)的標準品粉末，並在2:1甲基三級丁基醚/甲醇中製備個別原液溶液(1 mM)。C18:0-CD3髓硫脂內標準品原液溶液用甲醇稀釋，得到25 µM摻加內標準品溶液。將個別原液溶液的等分試樣合併，以製成含50 µM溶血髓硫脂、50 µM C16:0、250 µM C18:0及250 µM C24:1髓硫脂之甲醇的高校正摻加溶液。此高校正摻加溶液在甲醇中連續稀釋以製成用於溶血髓硫脂及C16:0髓硫脂的0.1、0.25、0.5、1、5、10、25及50 µM的校正曲線摻加溶液，以及用於C18:0及C24:1髓硫脂的0.5、1.25、2.5、5、25、50、125及250 µM的校正曲線摻加溶液。藉由將10 µL各種摻加溶液及10 µL C18:0-CD3-髓硫脂內標準品(25 µM)移液至100 µL 80%甲醇中，產生用於LC/MS分析的校正曲線溶液，導致用於溶血髓硫脂及C16髓硫脂的0.01、0.025、0.05、0.1、0.5、1、2.5及5 µM的LC/MS校正曲線，以及用於C18:0及C24:1髓硫脂之0.05、0.125、0.25、0.5、2.5、5、12.5及25 µM的LC/MS校正曲線。將400 µL甲醇等分試樣添加至各溶液中。將樣本渦旋，將400 µL在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並於150 µL甲醇中復原而用於LC/MS分析。
使用Agilent 1290 Infinity UHPLC/6495B三級四極質譜儀定量髓硫脂類。將96孔盤中的生物萃取物及校正溶液注入(5 µL)並在UHPLC上分離。在45°C下，在Waters Acquity BEH C18 2 x 100 mm、1.7 µM管柱上以0.4 mL/分鐘的流速藉由梯度洗提來洗提硫化物。使用7.5分鐘梯度，從35%溶劑A (70/30去離子水/乙腈/0.1%甲酸)及65%溶劑B (50/50乙腈/異丙醇/0.1%甲酸)開始，保持0.5分鐘並在5.5分鐘內增加至100%溶劑B，在100%溶劑B下保持7.5分鐘，然後在7.6至10分鐘內重新平衡回到起始條件。HPLC流在最初的0.5分鐘內被轉移到廢液中，然後被引導至電灑游離源。在質譜儀上以正電離模式藉由電灑游離將髓硫脂類離子化。以250°C的氮氣溫度、14 L/分鐘的氣流、45 psi的霧化器、325°C的屏蔽氣體溫度、12L/分鐘的屏蔽氣體流速、3500 V的毛細管電壓、及500 V的噴嘴電壓來操作Agilent Jet Stream電灑游離源。在正電離模式下，使用多反應監測(MRM)對峰寬為0.7 Da、電子倍增器電壓為400 V的髓硫脂類進行定量。具有碰撞能量的母離子到子離子躍遷的MRM表如下所示(100)。例如，藉由監測m/z 264.2，使用m/z 780.57 → 264.2的C16:0髓硫脂的一級躍遷定量C16:0，而二級躍遷m/z 780.57 → 682.6藉由H 2SO 4的中性丟失從母離子產生，用於確認主要轉變為真正的髓硫脂。Agilent MassHunter軟體用於生成線性或二次校正曲線(1/x或1/x2加權及R2 0.99或更佳)以量化生物樣本中的髓硫脂類。 測量 ARSA 酶活性
使用對硝基兒茶酚測定測量經透析的組織樣本中的ARSA酶活性。簡而言之，將經透析的組織(腦=0.6 mg/mL；肝臟0.025-0.3 mg/mL；心臟=0.3 mg/mL)在基礎緩衝液(0.5 M乙酸鈉緩衝液，pH 5.0；10%氯化鈉；0.5 mM焦磷酸鈉)中稀釋，並將40 μL稀釋樣本加載至96孔盤的四個孔中(一式二份)。接下來，將40 μL受質(含10 mM 4-硝基兒茶酚硫酸鹽之基礎緩衝液)添加至樣本中，並藉由在四個孔中的兩個孔添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)立即終止反應。然後將盤於37°C培養5小時。藉由在剩下的孔中添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)終止反應。藉由使用盤讀取器於515 nm讀取盤來測量吸光度。ARSA特異性活性係藉由將在5小時獲得的吸光度減去0分鐘時的吸光度乘以4-硝基兒茶酚(4-NC)標準曲線於515 nm的消光係數，然後除以藉由BCA測定測量的孔中的蛋白質量(mg)來確定。ARSA活性的結果表示為每五小時每毫克組織產生的奈莫耳(nmol) 4-NC。 結果
媒劑處理的 Arsa –/– 對照小鼠壽命縮短，50%的小鼠在研究第450天存活(中位數存活年齡：594.5天)，而媒劑處理的野生型對照為100% (中位數生存期未定義)。所有AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa –/– 動物皆存活至預定的屍檢，除了一隻雄性 Arsa –/– 小鼠(動物1139，第3組)在研究第4天(4.8個月齡)被安樂死。該動物在檢查中展現呼吸率及費力增加，身體狀況不佳。臨床徵象可能歸因於注射程序，因此該動物被排除在研究及生存分析之外。此結果表明，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) ICV投予在所有劑量下皆提供了存活益處，並改善在 Arsa –/– 小鼠中見到的縮短的壽命(圖68)。 體重
未治療的雌性Arsa –/–小鼠展現與年齡相符之雌性野生型對照相似的體重增加，直到大約15–16個月齡(第330天)，此時Arsa –/–及野生型小鼠的體重增加模式開始分歧。在此時間點之後，未治療的雌性 Arsa –/– 小鼠的體重通常停滯，然後下降，雖然這種差異由於動物間的變異性而在統計學上沒有差異。儘管在第390天及第450天之間觀察到的下降似乎被中劑量(4.5 x 10 10GC)及高劑量(1.3 x 10 11GC)的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療所阻止，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa –/– 雌性小鼠均未顯示與媒劑處理的野生型小鼠顯著不同的體重。由於未知原因，來自所有組的經治療的 Arsa –/– 小鼠開始時的基線體重均低於媒劑處理的對照(基於多重比較Dunnett檢定的混合效應模型，低劑量及中劑量組的p＜0.05*，高劑量組並不顯著)。由於這係在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予之前，此較低的基線體重不被認為與治療相關(圖69)。
未治療的雄性 Arsa –/– 小鼠展現與年齡相符之雄性野生型對照相似的體重增加，直到大約14–15個月齡(第300天)，此時 Arsa –/– 小鼠及野生型小鼠的體重增加模式開始分歧。在此時間點之後，未治療的雌性 Arsa –/– 小鼠的體重通常停滯，然後下降，雖然這種差異由於動物間的變異性而在統計學上沒有差異。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa –/– 雄性小鼠均未顯示出與未治療小鼠顯著不同的體重。由於未知原因，投予中劑量之AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207) (4.5 x 10 10GC)的 Arsa –/– 小鼠開始時的基線體重低於媒劑處理的對照(基於具有多重比較Dunnett檢定的混合效應模型，p＜0.05*)。由於這係在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予之前，此較低的基線體重不被認為與治療相關(圖69)。 臨床評分評估
臨床評分用於評估小鼠的臨床狀態，使用從評估一般健康及神經學參數的共濟失調評估分數改編的複合評分：毛皮品質、震顫、步態、脊柱後凸及緊握反射，分數高於0表示臨床惡化，且最高理論分數為17分。
媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠展現顯著高於年齡相符之野生型對照的臨床分數，臨床分數在整個研究過程中逐漸增加直至在第450天(19–20個月齡)評估的最後時間點。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa –/– 小鼠(低劑量[1.3 x 10 10GC]、中劑量[4.5 x 10 10GC]、及高劑量[1.3 x 10 11GC])顯示的臨床分數顯著低於年齡相符的媒劑處理的對照 Arsa –/– 小鼠。此結果表明，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)在所有劑量下防止在 Arsa –/– 小鼠中見到的臨床狀態逐漸惡化(圖70)。 神經運動功能 窄沿測試
窄沿測試測量協調性，協調性在與共濟失調相關的神經退化性疾病(諸如MLD)中受損。小鼠被分配從0至3的分數，分數越高表示協調性越降低。
媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠展現顯著高於年齡相符的野生型對照的窄沿測試分數，在整個研究過程中逐漸增加，並到研究第180天(10–11個月齡)時觀察到最高分數。投予低劑量之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.3 x 10 10GC)之 Arsa –/– 小鼠顯示統計學上顯著低於年齡相符之媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的窄沿測試分數直到第120天，但此後與對照相似。投予高劑量之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.3 x 10 11GC)的 Arsa –/– 小鼠顯示顯著低於年齡相符之媒劑對照的臨床分數並保持較低直到第450天(19–20個月齡)的最後時間點。此結果表明，投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)改善了在 Arsa –/– 小鼠中見到的協調性逐漸惡化，儘管只有最高劑量(1.3 x 10 11GC)顯示出持續效果(圖71)。 RotaRod
神經運動功能藉由RotaRod測試評估，其藉由測量小鼠在逐漸加速的旋轉桿上奔跑的落下時間來評估協調性及平衡。落下潛伏期的減少表明神經運動障礙，而落下潛伏期的增加表明神經運動功能得到改善。
媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠展現比年齡相符之野生型對照顯著較短的落下潛伏期，從第180天(10-11個月齡)至第450天(19‑20個月齡)逐漸惡化。投予高劑量之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.3 x 10 11GC)及高劑量之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(4.5 x 10 10GC)的 Arsa –/– 小鼠分別從第360天至第450天及從第390天至第450天顯示比年齡相符之媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠顯著增加的落下潛伏期。此結果表明，在兩種最高劑量(1.3 x 10 11GC及4.5 x 10 10GC)下，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)改善了在 Arsa –/– 小鼠中見到的神經運動功能的逐漸惡化(圖72)。 窄道步態分析
使用CatWalk XT步態分析系統評估神經運動功能，該系統測量各種參數。與野生型對照相比，神經運動功能異常預期會導致 Arsa –/– 小鼠的步態及/或步行速度異常。
從給藥後2個月到8個月(6–7個月齡至12–13個月齡)，與年齡相符之媒劑處理的野生型小鼠相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠後肢的支撐基礎(兩後掌之間的距離)逐漸增加。在10個月(14–15個月齡)時，與年齡相符之媒劑處理的野生型小鼠相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠有後續的表型喪失及明顯正常化，具有相似的數值。投予低劑量(1.3 x 10 10GC)、中劑量(4.5 x 10 10GC)或高劑量(1.3 x 10 11GC)之AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠在6個月(10–11個月齡)及8個月(12–13個月齡)時顯示後肢支撐基礎的顯著改善；在後續的時間點所有組明顯正常化的原因尚不清楚。
此結果表明，投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG(GTP-207)在所有劑量(低劑量[1.3 x 10 10GC]、中劑量[4.5 x 10 10GC]及高劑量[1.3 x 10 11GC])下改善了支撐基礎直至12–13個月齡，但由於此讀數在以後的時間點隨著時間明顯不一致而有限制(圖73)。前肢的支撐基礎與自然歷史研究不一致，表型在12個月左右(16–17個月齡)明顯逆轉，導致任何治療效果皆無法解釋。
期間及平均速度係小鼠穿過窄道坡道的速度的兩個指標，顯示從6個月(10–11個月齡)至最後第15個月的時間點(19–20個月齡)，與年齡相符之野生型對照相比， Arsa –/– 小鼠展現顯著更慢的步態。投予低劑量(1.3 x 10 10GC)、中劑量(4.5 x 10 10GC)、或高劑量(1.3 x 10 11GC)之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠在14個月及15個月(18–20個月齡)時顯示顯著更短的期間，而在15個月時速度高於 Arsa –/– 對照(圖74)。此結果表明，投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)在所有劑量下均改善了小鼠的活動性及步態。由於測量之間的高度變異性，因此無法解釋兩個最終時間點之前的統計顯著性，可能是由於較輕度的表型(參見圖74中12個月時的明顯改善)。
從8個月(12‑13個月齡)到最後15個月的時間點(19–20個月齡)，與年齡相符之野生型對照相比， Arsa –/– 小鼠的步幅(一隻腳掌在一步中行進的距離)顯示運動幅度逐漸降低。投予低劑量(1.3 x 10 10GC)、中劑量(4.5 x 10 10GC)或高劑量(1.3 x 10 11GC)之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的 Arsa –/– 小鼠顯示，與 Arsa –/– 對照相比，在14及15個月(18–20個月齡)時，至少一隻腳掌的運動幅度顯著增加(圖75)。此結果表明，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)在所有劑量下均改善了小鼠的活動性及步態。由於測量之間的高度變異性，因此無法解釋兩個最終時間點之前的統計顯著性，可能是由於較輕度的表型(參見圖74中12個月時的明顯改善)。 ARSA 酶活性
ARSA酶活性係使用比色測定測量，該比色測定測量從對硝基兒茶酚硫酸鹽人工受質中釋放的有色產物(對硝基兒茶酚)。此測定對於ARSA並非特異性的，因為受質可被其他硫酸酯酶切割，例如ARSB，其被假設來解釋在媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中測得的陽性值(即非特異性酶活性)。與媒劑處理的小鼠相比，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的小鼠的ARSA活性增加反映出人類ARSA轉基因產物的表現，因為預期其他硫酸酯酶不會在治療後增加。
ARSA酶活性在AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)投予後15個月在所有評估的器官(肝臟、腦及心臟)中增加，觀察到的ARSA酶活性水準相當於或高於媒劑處理的野生型動物。在腦中，與媒劑處理的對照相比，ARSA酶活性的增加在低劑量(1.3 x 10 10GC)及中劑量(4.5 x 10 10GC)時高1.2倍，在高劑量(1.3 x 10 11GC)時高1.3倍。在肝臟，與媒劑處理的對照相比，ARSA酶活性的增加在低劑量(1.3 x 10 10GC)時高1.4倍，在中劑量(4.5 x 10 10GC)時高5.3倍，而在高劑量(1.3 x 10 11GC)時高7.1倍。在心臟，與媒劑處理的對照相比，ARSA酶活性的增加在中劑量(4.5 x 10 10GC)時高1.6倍，且在高劑量(1.3 x 10 11GC)時高3.6倍，而在低劑量(1.3 x 10 10GC)時並未觀察到心臟中ARSA酶活性增加(圖76A)。
進行液相層析–質譜(LC–MS)分析以量化腦中的髓硫脂貯積。 Arsa -/- 小鼠證實C16及C18髓硫脂物種顯著增加，其被AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療矯正(圖76B)。
結果總結：● Arsa –/– 小鼠展現較短的壽命，此可藉由所有劑量(1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC/g腦]、4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦]、或1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])之AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)治療來挽救。 ●     各組間體重無統計學上的差異。 ●     藉由測量神經學及一般健康參數的複合臨床評分測量， Arsa –/– 小鼠展現進行性神經學障礙。在所有劑量(1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC/g腦]、4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦]、或1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])下，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207)治療的小鼠顯示神經學惡化顯著減緩。 ● Arsa –/– 小鼠呈現出藉由窄沿測試測量的進行性協調性障礙，其藉由最高劑量1.3 x 10 11GC (3.3 x 10 11GC/g腦)的AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)治療而部分被改善。 ● Arsa –/– 小鼠展現藉由RotaRod測定測量的進行性神經運動障礙，其藉由中劑量(4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦])及高劑量(1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])的AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)治療而部分被改善。 ● Arsa –/– 小鼠展現藉由CatWalk系統測量的進行性步態障礙，由異常的支撐基礎、較慢的運動速度及減少的腳掌運動幅度(步幅)所組成，其藉由所有劑量(1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC/g腦]、4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦]、或1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])的AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療而被改善。 ●     在腦及肝臟中，在所有劑量(1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC/g腦]、4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦]、或1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])下，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)將ARSA酶活性水準增加至高於或相當於野生型的水準，而在心臟中則係在中劑量(4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦])及高劑量(1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])下。 ●     此研究中測試的最低劑量(1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC/g腦])基於存活挽救、複合臨床評分改善、步態改善以及腦及肝臟中ARSA酶活性水準而證實顯著功效。 實施例 9-AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) 之在 ARSA -/- 小鼠進行腦室內投予後的功效以確定最小有效劑量
進行了一項研究，以確定在腦室內(ICV)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後在嬰兒異染性白質失養症(MLD)疾病小鼠模式中的最小有效劑量(MED)及轉基因表現水準。
四個月大 Arsa -/- 小鼠接受單次投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為四種中的一種(1.3 x 10 11基因體拷貝 [GC] [3.3 x 10 11GC/g腦]、4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦]、1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC/g腦]、或4.5 x 10 9GC [1.1 x 10 10GC/g腦])。額外的 Arsa -/- 小鼠及野生型小鼠投予媒劑(鞘內最終調配緩衝液[ITFFB])或為保持未處理的基線對照。選擇動物的年齡來模擬早期有症狀病患的疾病階段。
組別名稱、劑量水準及投予途徑(ROA)呈現於下表。
表.組別名稱、劑量水準及投予途徑
組別# 處理 b(劑量) 劑量體積 (mL) 受影響的小鼠 ( ARSA-/-)(N) WT小鼠 (+/+)(N) 生活中評估 犧牲：基線 犧牲：注射後180 +/- 5天 (N)
1 無 N/A - 10 (5M，5F) ●     無 10 (WT) 10 ( ARSA-/-) N/A
2 無 N/A 10 (5M，5F) -
3 媒劑 (人工CSF ITFFB) 0.005 - 20 (10M，10F) ●        每日生存力檢查 ●        每週臨床觀察 ●        每週體重 ●        血液生物標記評估 (ARSA酶活性及髓硫脂定量) ●        神經學分數 N/A 20
4 c 媒劑 (人工CSF ITFFB) 0.005 20 (10M，10F) - N/A 20
5 d GTP‑207 1.3 x 10 11 GC 0.005 20 (10M，10F) - N/A 20
6 GTP‑207 4.5 x 10 10 GC 0.005 20 (10M，10F) - N/A 20
7 GTP‑207 1.3 x 10 10 GC 0.005 20 (10M，10F) - N/A 20
8 GTP‑207 4.5 x 10 9 GC 0.005 20 (10M，10F) - N/A 20
數值係使用成年小鼠的腦質量0.4 g計算。一隻動物1351(媒劑，ITFFB；第4組)被發現在研究第144天死亡。沒有注意到臨床異常，且在先前的生存力檢查期間將該動物記錄為存活的。在研究第60天，一隻小鼠5988 (GTP-207，1.3 x 10 11GC；第5組)在出現與程序相關的併發症後，根據獸醫的建議進行安樂死，該動物呈現出呼吸率降低伴隨短暫增加的呼吸費力。耳朵、前掌及口鼻部是蒼白的。一隻動物8566(GTP-207，1.3 x 10 11GC；第5組)被發現在研究第112天死亡。沒有注意到臨床異常，且在先前的生存力檢查期間將該動物記錄為存活的。 縮寫： Arsa ，芳基硫酸酯酶A (基因，小鼠)；F，雌性；GC，基因體拷貝；ID，識別號碼；IV，靜脈內；M，雄性；N，動物數量；N/A，不適用；ROA，投予途徑；WT，野生型；ml，毫升；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液。
此研究採用四種劑量水準的 AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)來鑑定ICV投予後的MED。選擇最高劑量1.3 x 10 11基因體拷貝[GC] [3.3 x 10 11GC/g腦]，因為該劑量接近小鼠的最大可行劑量(maximum feasible dose)，其受限於體積限制(對於ICV投予，在成年小鼠中較佳為5.0 μL或更少)及預期的載體效價。選擇最大可行劑量及三種較低劑量(4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC/g腦]、1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC/g腦]、或4.5 x 10 09GC [1.1 x 10 10GC/g腦])以括出在非人類靈長類動物中進行毒理學研究的計畫劑量範圍。
4個月大的 Arsa -/- 小鼠接受單次投予四種劑量水準中的一種(1.3 x 10 11、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 09GC)的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)。額外的 Arsa -/- 小鼠及野生型小鼠投予媒劑(鞘內最終調配緩衝液[ITFFB])或保持未處理作為對照。
生活中評估包括每日生存力檢查、體重測量、神經學檢查(基線、第90天及第180天)、血清轉基因表現評估(ARSA酶活性)及血漿中髓硫脂水準的量化(第170天)。在給藥當天(4個月齡[未處理小鼠，基線同齡群])及給藥後第180天進行屍檢。在屍檢時，收集一份完整清單的組織用於組織病理學評估。收集腦、脊髓及坐骨神經的樣本用於評估溶酶體功能異常(LAMP-1染色)以及神經發炎(僅在腦及脊髓中)(神經膠原纖維酸性蛋白[GFAP]免疫組織化學[IHC])。收集吻端腦(用於第1亞組及第3亞組)、肝臟及心臟用於轉基因表現測定(ARSA酶活性)。收集吻端腦(用於第2亞組及第4亞組)、脊髓、坐骨神經、肝臟及腎臟，使用液相層析質譜(LC-MS)進行髓硫脂分析。收集血液用於全血細胞計數(complete blood count，CBC)以及差異分析及血清臨床化學分析。
每天評估兩次生存力，每週測量一次體重以監測體重減輕(即身體消瘦或體重增加停止)，其可被預期伴隨神經運動功能惡化並且在具有MLD之病患中類似地觀察到。震顫、步態及協調性、緊握反射、姿勢及毛皮品質的臨床評分評估每月進行一次，並基於先前生成的共濟失調小鼠模式的已知表型。臨床評分能夠評估疾病進展，包括共濟失調的發展，其在MLD病患中也被類似地觀察到(Guyenet et al., 2010)；較高的臨床分數表明較嚴重的表型。
為了評估投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)是否增加 Arsa -/- 小鼠中的轉基因產物表現(ARSA酶)，在血清、疾病相關組織(腦)及已知AAV ICV投予後被轉導的組織(腦、肝臟、心臟)中測量ARSA活性，以評估AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP- 207)的藥理學。
此外，收集用於治療MLD的關鍵目標組織(CNS [腦、脊髓]及PNS [坐骨神經])、以及周圍器官(肝臟、腎臟)及血漿，以評估髓硫脂貯積(LC/MS)，因為髓硫脂類係在缺乏功能性 Arsa酶的情況下會蓄積的毒性受質，且這些組織係在具有MLD的小鼠及人類中與疾病相關的目標。還在腦及脊髓中評估溶酶體貯積病灶(LAMP1 IHC)及星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)，因為這些係小鼠及人類MLD的神經病理學檢驗標記，會因疾病的進展而隨著時間增加。 臨床評分評估
在基線、第90天(±3天)及第180天(±5天)使用未公開的緊握能力、步態、震顫、脊柱後凸及毛皮品質的評估進行小鼠的神經學檢查及評分，詳細內容如下表。這些測量基於 Arsa -/- 小鼠通常出現的症狀有效地評估牠們的臨床狀態。高於0的分數表示臨床惡化。在評分程序中，評估者不知道動物的組別資訊。
表.臨床評分評估
評估類別 觀察 分數
毛皮品質 有光澤的被毛，光滑的毛皮，照料很好、乾淨的被毛 0
照料沒有很好、輕微油膩或粗糙的被毛 1
粗糙的被毛 –被毛油膩、骯髒、直立 2
非常粗糙的被毛，脫水 3
步態 活躍的，精力充沛的。四肢支撐體重。連後肢、腹部皆抬起 0
能跑，但行動遲緩。走路時跛行。 1
不願移動，嚴重跛行，骨盆降低，雙腳遠離身體 2
僅在手動刺激時最小限度地移動，拖拽腹部 3
震顫 無震顫徵象 0
非常輕微，暫時性 1
輕度，近距離觀察可見 2
中度，立即可見 3
嚴重，影響活動性 4
緊握 後肢始終從腹部向外張開 0
＞50%的時間，一後肢向腹部縮回 1
＞50%的時間，兩後肢皆部分縮回 2
＞50%的時間，後肢完全縮回並接觸腹部 3
四肢永久完全抓握 4
姿勢 正常，平坦的背部 – 走路時容易拉直脊柱 0
短暫的駝背，僅在休息時明顯 – 輕度但能夠拉直脊柱 1
直立休息，背部駝背，移動時無法完全拉直但輕度 2
走路及坐著時明顯並保持脊柱後凸 3
組織學處理及評估 LFB/PAS 染色 ( 評估髓鞘化 )
脫石蠟後，腦、脊髓及坐骨神經的切片以LFB/PAS染色。簡而言之，將玻片與LFB溶液(SLMP, LLC；目錄號：STLFBPT)在65°C下一起培養隔夜。切片在0.05%碳酸鋰溶液及70%乙醇中分化，並在顯微鏡下監測直至分化完成。然後將玻片置於0.5%過碘酸中5分鐘(Sigma；目錄號：395B-1Kit)。以流動的自來水洗滌後，將玻片轉移到Schiff氏試劑(Sigma；目錄號：395B-1Kit)中15分鐘。玻片以流動的自來水清洗5分鐘，以蘇木色素短暫複染用於細胞核鑑定，然後蓋上蓋玻片。進行組織病理學評估。 免疫組織化學染色 (LAMP-1 、 GFAP 、 ARSA)
按照標準免疫組織化學(IHC)步驟準則，使用Bond聚合物檢測系統(Leica Biosystems，DS9800)及DAB作為色素原，在Leica Bond Rx自動染色機上對FFPE組織切片進行IHC。對於所有染色，檸檬酸鹽緩衝液 pH6用於抗原修復(20分鐘)。使用單株大鼠抗體1D4B(Abcam ab25245，1:50稀釋)檢測 LAMP1，使用來自Abcam的兔抗體(ab7260，1:4000稀釋)檢測 GFAP，使用來自Sigma的兔抗體(HPA005554，1:200稀釋)檢測ARSA。所有初級抗體的培養時間均設置為30分鐘。即用型二級聚合物抗體來自Vector Laboratories (抗大鼠抗體用於LAMP1，MP-7444，培養時間20分鐘)或來自Leica (兔抗體用於GFAP及ARSA，BOND Polymer Refine Detection DS9800，培養時間8分鐘)。染色後，玻片通過乙醇及二甲苯脫水並蓋上蓋玻片。
使用影像分析軟體對LAMP-1及GFAP IHC進行量化。簡而言之，使用VIS版本2019.07.0.6328 (Visiopharm, Hoersholm, Denmark)手動勾勒出腦、脊髓及坐骨神經的切片的染色良好且完整的區域。對於腦，使用IHS-S (強度、色調、飽和度模式)分類特徵，經由定限化對LAMP-1陽性區域進行定量。使用HDAB-蘇木色素分類特徵，經由定限化對LAMP-1陰性區域進行量化，並使用LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域分類來生成所勾勒的部分中LAMP-1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。對於脊髓，使用HDAB-DAB分類特徵，經由定限化對LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域進行量化，並使用LAMP-1陽性及LAMP-1陰性區域分類來生成所勾勒的部分中IBA1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。對於坐骨神經，使用HDAB-DAB分類特徵經由定限化對LAMP-1陽性區域進行定量。使用HDAB-蘇木色素分類特徵，經由定限化對LAMP-1陰性區域及處理引起的空白空間進行量化，並使用LAMP‑1陽性及LAMP-1陰性區域(但非空白空間)分類來生成所勾勒的部分中LAMP-1陽性的百分比、LAMP-1陽性物體的數量、及該部分中辨識的所有LAMP-1物體的平均大小。 藉由 LC/MS 對髓硫脂貯積進行定量
將解凍的組織冷凍乾燥隔夜，並在4°C下使用Precellys珠磨均質機(Bertin Technologies, Rockville, MD)在帶有陶瓷珠的2.0 mL聚丙烯管中研磨成細粉。在分析天平上稱量粉末的等分試樣(約2.5–5.0 mg)，然後在4°C下在Precellys均質機中在500 µL 80%甲醇中均質化。然後在100 µL均質物的等分試樣中摻加10 µL C18:0-CD3-髓硫脂內標準品(N-ω-CD3-十八醯基髓硫脂，Matreya State College, PA，目錄號1536；25 µM)，並在2.0 mL Eppendorf管中用400 µL冰冷甲醇萃取。樣本在4°C下以14,000 x g離心5分鐘。甲醇上清液的等分試樣(400 µL)在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並在150 µL甲醇中復原用於LC/MS分析。
製備了髓硫脂標準品的校正樣本。在分析天平上稱量髓硫脂類(溶血髓硫脂 目錄號1904；C16:0 目錄號1875、C18:0 目錄號1932、C18:0-CD3目錄號1536、及C24:1目錄號1931；Matreya, State College, PA)的標準品粉末，並在2:1甲基三級丁基醚/甲醇中製備個別原液溶液(1 mM)。C18:0-CD3髓硫脂內標準品原液溶液用甲醇稀釋，得到25 µM摻加內標準品溶液。將個別原液溶液的等分試樣合併，以製成含50 µM溶血髓硫脂、50 µM C16:0、250 µM C18:0及250 µM C24:1髓硫脂之甲醇的高校正摻加溶液。此高校正摻加溶液在甲醇中連續稀釋以製成用於溶血髓硫脂及C16:0髓硫脂的0.1、0.25、0.5、1、5、10、25及50 µM的校正曲線摻加溶液，以及用於C18:0及C24:1髓硫脂的0.5、1.25、2.5、5、25、50、125及250 µM的校正曲線摻加溶液。藉由將10 µL各種摻加溶液及10 µL C18:0-CD3-髓硫脂內標準品(25 µM)移液至100 µL 80%甲醇中，產生用於LC/MS分析的校正曲線溶液，導致用於溶血髓硫脂及C16髓硫脂的0.01、0.025、0.05、0.1、0.5、1、2.5及5 µM的LC/MS校正曲線，以及用於C18:0及C24:1髓硫脂之0.05、0.125、0.25、0.5、2.5、5、12.5及25 µM的LC/MS校正曲線。將400 µL甲醇等分試樣添加至各溶液中。將樣本渦旋，將400 µL在96孔盤中於45°C下在氮氣下乾燥，並於150 µL甲醇中復原而用於LC/MS分析。
使用Agilent 1290 Infinity UHPLC/6495B三級四極質譜儀定量髓硫脂類。將96孔盤中的生物萃取物及校正溶液注入(5 µL)並在UHPLC上分離。在45°C下，在Waters Acquity BEH C18 2 x 100 mm、1.7 µM管柱上以0.4 mL/分鐘的流速藉由梯度洗提來洗提硫化物。使用7.5 分鐘梯度，從35%溶劑A (70/30去離子水/乙腈/0.1%甲酸)及65%溶劑B (50/50乙腈/異丙醇/0.1%甲酸)開始，保持0.5分鐘並在5.5分鐘內增加至100%溶劑B，在100%溶劑B下保持7.5分鐘，然後在7.6至10分鐘內重新平衡回到起始條件。HPLC流在最初的0.5分鐘內被轉移到廢液中，然後被引導至電灑游離源。在質譜儀上以正電離模式藉由電灑游離將髓硫脂類離子化。以250°C的氮氣溫度、14 L/分鐘的氣流、45 psi的霧化器、325°C的屏蔽氣體溫度、12L/分鐘的屏蔽氣體流速、3500 V的毛細管電壓、及500 V的噴嘴電壓來操作Agilent Jet Stream電灑游離源。在正電離模式下，使用多反應監測(MRM)對峰寬為0.7 Da、電子倍增器電壓為400 V的髓硫脂類進行定量。例如，藉由監測m/z 264.2，使用m/z 780.57 → 264.2的C16:0髓硫脂的一級躍遷定量C16:0，而二級躍遷m/z 780.57 → 682.6藉由H 2SO 4的中性丟失從母離子產生，用於確認主要轉變為真正的髓硫脂。Agilent MassHunter軟體用於生成線性或二次校正曲線(1/x 或 1/x2加權及R2 0.99或更佳)以量化生物樣本中的髓硫脂類。 測量 ARSA 活性
使用對硝基兒茶酚測定測量經透析的血清或組織樣本中的ARSA酶活性。簡而言之，將經透析的血清(稀釋1:5，1份血清+4份稀釋劑)或組織在基礎緩衝液(0.5 M乙酸鈉緩衝液，pH 5.0；10%氯化鈉；0.5 mM焦磷酸鈉)中稀釋，並將40 μL稀釋樣本加載至96孔盤的四個孔中(一式二份)。接下來，將40 μL受質(含10 mM 4-硝基兒茶酚硫酸鹽之基礎緩衝液)添加至樣本中，並藉由在四個孔中的兩個孔添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)立即終止反應。然後將盤於37°C培養5小時。藉由在剩下的孔中添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)終止反應。藉由使用盤讀取器於515 nm讀取盤來測量吸光度。ARSA特異性活性係藉由將在5小時獲得的吸光度減去0分鐘時的吸光度乘以4-硝基兒茶酚(4-NC)標準曲線於515 nm的消光係數，然後除以藉由BCA測定測量的孔中的蛋白質量(mg)來確定。ARSA活性的結果表示為每五小時每毫克組織或每毫升血清產生的奈莫耳(nmol) 4-NC。 結果 臨床觀察
在研究期間未發現與AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)相關的臨床異常。 體重
媒劑處理的 Arsa -/- 小鼠開始研究時平均體重低於WT小鼠，且雄性在研究第21天開始而雌性在研究第84天開始，與年齡相符之媒劑處理的WT對照相比，表現出體重在統計學上顯著降低。在整個研究過程中，所有組的體重皆穩定，並且以四種劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 9GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)並不導致雄性或雌性 Arsa -/- 小鼠的體重的任何顯著波動(圖77)。 臨床評分 評估
臨床評分用於評估小鼠的臨床狀態，分數高於0表示臨床惡化。
正如在我們的 Arsa -/- 模式的自然歷史研究中所觀察到的，一項測量緊握反射、步態、震顫、脊柱後凸及毛皮品質的複合臨床評分盲法評估顯示，與WT對照相比，從研究第180天(10個月齡) Arsa -/- 小鼠臨床惡化。與年齡相符之媒劑處理的 Arsa -/- 小鼠相比，在所有劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 9GC)下，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至 Arsa -/- 小鼠導致嚴重度分數顯著降低。此結果表明，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致輕度症狀的 Arsa -/- 小鼠模式中表型的劑量依賴性減少(圖78)。 轉基因表現 及抗轉基因抗體 (ELISA)
藉由血清中及組織溶胞產物(腦、肝臟、心臟)中的酶活性測定以及藉由腦的福馬林固定石蠟包埋(FFPE)切片中的免疫染色(IHC)來測量轉基因表現。
在 Arsa -/- 媒劑對照中藉由免疫染色未測量到可檢測的ARSA蛋白(圖83)。雖然由於其他硫酸酯酶對人工受質的非特異性活性， Arsa -/- 動物具有可測量的酶活性水準，任何超過 Arsa -/- 媒劑對照的增加皆可歸因於AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的投予及hARSA轉基因表現，因為其他硫酸酯酶預期不會因治療而修飾。
與基線測量值相比，無論劑量如何，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的投予在研究第14天及研究第60天均未導致ARSA血清酶活性的顯著增加(圖79)。假設這可能是由於存在抗轉基因抗體，因為早在研究第14天就檢測到循環抗hARSA抗體(圖79)。
在腦中，與媒劑處理的 Arsa -/- 小鼠相比，以三種最高劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 10GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至 Arsa -/- 小鼠導致ARSA酶活性的顯著劑量依賴性增加。此外，這些劑量的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 10GC)將 Arsa -/- 小鼠中的平均ARSA酶活性增加至與媒劑處理的野生型對照相當的水準(圖80)。在肝臟及心臟，與媒劑處理的 Arsa -/- 小鼠相比，以二種最高劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)導致ARSA酶活性的顯著劑量依賴性增加(圖81及圖82)。正如預期，在雄性中肝臟中的水準高於雌性，這是由於雄性小鼠中AAV媒介的肝臟轉導的雄性素依賴性增強。此種現像在其他物種中尚未被報告。
對每組的動物子集(N=2/組)進行hARSA IHC，以定性地分析投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)或媒劑後腦中的hARSA蛋白表現概貌。在WT動物，由於抗體與鼠類ARSA的交叉反應，ARSA IHC顯示整個腦普遍存在ARSA表現(圖83)。在更高的放大倍率下，ARSA蛋白訊號在細胞質中呈點狀，與溶酶體定位一致。相較之下，媒劑處理的 Arsa -/- 小鼠在腦的任何區域均未顯示任何陽性ARSA染色，顯示出對於ARSA的免疫染色特異性(圖83)。
投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致hARSA IHC訊號的劑量依賴性增加。hARSA染色在注射部位(側腦室)附近特別強，並且在所有治療同齡群的大腦皮質、海馬迴及胼胝體中可見。在二組最高劑量組(1.3 x 10 11GC及4.5x 10 10GC；圖84)中，hARSA陽性染色的分布比兩組低劑量組更廣泛(圖85)，除了大腦皮質、海馬迴及胼胝體外，中腦及腦幹的細胞也有hARSA染色。在兩組最低劑量組(1.3 x 10 10GC及4.5x 10 9GC；圖85)中，hARSA陽性染色的分布主要限於海馬迴及大腦皮質中的較小區域。在更高的放大倍率下，hARSA蛋白表現在細胞質中呈點狀，分布與WT小鼠中見到的細胞定位相似。在神經纖維網(neuropil)中也可見到染色(圖84及圖85)。 臨床病理學 ( 臨床化學及血液學 ) 血清臨床化學
在評估的血清臨床化學參數中未觀察到與AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療相關的毒性。
在藉由AAV治療挽救的腎臟參數中觀察到 Arsa -/-小鼠的一些基因型相關性異常。在研究第180天，血清化學顯示，與媒劑處理的野生型對照相比，媒劑處理的 Arsa -/- 小鼠的血尿素氮(BUN)及鎂水準顯著增加。以三種最高劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、及1.3 x 10 10GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)顯著改善 Arsa -/- 小鼠BUN水準，恢復至野生型水準，且二種最高劑量(1.3 x 10 11GC及4.5 x 10 10GC)顯著改善鎂水準(圖86)。
與年齡相符之WT對照相比， Arsa -/- 小鼠的總蛋白及球蛋白水準輕微升高(*** p＜0.001)；這些參數沒有觀察到治療效果。
評估的其餘血清化學參數未顯示媒劑處理的 Arsa -/- 小鼠與野生型對照之間的任何統計學上顯著的差異。 血液學
在評估的血液學參數中未觀察到與AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療相關的毒性。 組織學 組織病理學，安全性讀數
研究之病理學部分的目的在評估AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)在 ARSA -/- (ARSA KO)小鼠腦室內(ICV)遞送的毒性。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)注射的小鼠在研究第0天投予四種劑量中的一種後，在研究第180天進行評估：1.3 x 10 11GC(高；第5組)、4.5 x 10 10GC (第6組)、1.3 x 10 10GC (第7組)、4.5 x 10 9GC (低；第8組)。為了評估是否存在與測試物相關的毒性，首先對來自高劑量治療之小鼠的所有器官進行評估。對於接受三種較低劑量的動物，僅對於在高劑量下有可疑所見的器官進行組織病理學評估。基線(第1-2組)及第180天(第3-4組) WT及ARSA KO小鼠用作對照。
在任何AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa -/- 小鼠中，沒有與測試物相關的大體組織變化的屍檢所見。在一些動物中發現顯微變化，其中大多數被認為是偶發的或與ARSA KO小鼠表型相關。與WT (等級1發生率3/15)及ARSA KO對照小鼠(等級1發生率2/9)相比，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)治療導致最小(等級1)至輕度(等級2)坐骨神經退化的發生率增加(等級1發生率34/39，等級2發生率1/39)。此一所見的原因及其與AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的明確關係尚不清楚。在GTP-207治療的小鼠的DRG中並未發現顯微異常，且觀察到背神經根內個別軸突的罕見變性(等級1發生率5/39)。 組織病理學，功效讀數
Arsa -/- 小鼠的組織病理學表型由腦及脊髓中神經元及寡樹突細胞中貯積物質的細胞質蓄積所組成。腦及脊髓的白質束亦呈現出空泡化(vacuolation)，這通常與繼發性軸突變性相關。這些所見在小腦及腦幹的白質及細胞核、以及額葉皮質的白質束中最為顯著。在整個脊髓的所有白質束中觀察到空泡化與軸突變性的證據，並且在外側束及腹側束中最為顯著。
對於多醣的過碘酸Schiff氏(PAS)染色用於進一步研究在 Arsa -/- 小鼠的CNS細胞中觀察到的貯積物質，但切片僅被PAS輕微染色，暗示該物質與多醣或醣脂不一致。對於髓鞘質的Luxol Fast Blue (LFB)染色證實存在擴張的髓鞘伴隨軸突變性；然而，沒有觀察到顯著的脫髓鞘。雖然功效並非本次評估的主要重點，以三種最高劑量(1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的小鼠脊髓中白質空泡化及貯積物質的發生率及嚴重度降低(評估所有劑量組以研究是否存在與測試物相關的DRG毒性。僅在評估的最高劑量(1.3 x 10 11GC)，腦中與表型相關的白質所見的發生率及嚴重度也降低。 溶酶體腔室免疫染色 (LAMP-1) 及星狀細胞增生
Arsa -/- 小鼠表型由腦、脊髓及坐骨神經中的溶酶體腔室擴張所組成，藉由LAMP-1免疫染色及陽性免疫組織化學訊號的自動全玻片定量來測量。
在4個月齡(基線)，與未處理的野生型對照相比，未治療的 Arsa -/- 小鼠證實溶酶體擴張，如腦(皮質、海馬迴、胼胝體、小腦及腦幹)、脊髓及坐骨神經中之LAMP-1染色面積比的增加所顯示。此顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)時，已經存在於 Arsa -/- 小鼠中的疾病相關病理學。
在研究第180天(10個月齡)，與媒劑處理的 Arsa -/- 對照相比，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa -/- 小鼠展現由檢查的幾個神經解剖區域的LAMP-1染色減少所表明之溶酶體功能異常的改善，包括腦[皮質、海馬迴、胼胝體]及脊髓[腰椎]。
與年齡相符之媒劑處理的對照相比，以三種最高劑量(1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至 Arsa -/- 小鼠導致腦海馬迴及胼胝體(白質)中溶酶體病理(LAMP-1免疫染色)的顯著改善(圖87)。此結果暗示，在被穩健轉導的區域中，低至1.3 x 10 10GC的劑量在CNS中的治療益處(如由ARSA免疫染色所推斷的)。重要的是，LAMP-1染色在 Arsa -/- 小鼠的基線時已經增加，表明以AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療後病理的逆轉。
在具有低水準 Arsa轉導的CNS區域，二種最高劑量之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(4.5 x 10 10GC或1.3 x 10 11GC)顯著改善大腦皮質的溶酶體病理(標準化LAMP-1免疫染色)；而高劑量(1.3 x 10 11GC)減少了腰椎脊髓中的LAMP-1病理(圖87)。ICV遞送部位遠端的CNS區域顯示低的甚至沒有明顯的 Arsa轉導(基於ARSA免疫染色)，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療後未表現出LAMP-1染色的減少。這些區域包括小腦、腦幹及脊髓的吻端區域(頸椎及胸椎節段)。在坐骨神經中，最高劑量的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.3 x 10 11GC)表現出溶酶體功能異常減少的趨勢，但差異在統計學上並不顯著)。 星狀細胞免疫染色 (GFAP)
Arsa -/- 小鼠表型由大腦及脊髓星狀細胞增生所組成，藉由GFAP免疫染色及免疫組織化學陽性訊號的自動全玻片定量來測量。
在4個月齡時(基線，第2組)，未治療的 Arsa -/- 小鼠展現星狀細胞增生，如由腦的某些區域(大腦皮質)及脊髓中增加的GFAP陽性面積比染色所示。此顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207)時，已經存在於 Arsa -/- 小鼠中的疾病相關病理學。與WT小鼠相比， Arsa -/- 小鼠的胼胝體、海馬迴及小腦沒有顯著的星狀細胞增生。
在研究第180天(10個月齡)，與媒劑處理的 Arsa -/- 對照相比，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的 Arsa -/- 小鼠展現星狀細胞增生顯著減少。在皮質中，與媒劑處理的 Arsa -/- 對照相比，三種最高劑量之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) (1.3 x 10 11GC、4.5x 10 10GC、及1.3 x 10 10GC)顯示出顯示GFAP陽性染色的評估組織百分比的顯著降低，而最高劑量(1.3 x 10 11GC)導致腰椎脊髓切片中GFAP染色面積在統計學上顯著減少(圖88)。 使用 LC-M S 的髓硫脂分析
進行液相層析–質譜(LC–MS)分析以量化血漿(在研究第170天收集)及屍檢(基線及研究第180天)收集的組織中的髓硫脂貯積。
在研究第170天，收集血漿樣本以確定AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)對髓硫脂類循環水準的影響。與年齡相符之媒劑處理的野生型對照的水準相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠顯示顯著較高水準的C16:0 (血漿中唯一可檢測的髓硫脂)。與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠相比，投予二種最高劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC)之AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致血漿中C16:0水準的劑量依賴性降低(圖89)。
在腦中，在AAV投予前的基線及研究第180天，與年齡相符之媒劑處理的野生型對照的水準相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中所分析的大多數髓硫脂物種皆較高。此顯示在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療四個月大的 Arsa -/- 小鼠時，CNS中存在髓硫脂貯積病理，與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的水準相比，以兩種最高劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致髓硫脂貯積的顯著矯正，幾個物種(C16:0、C18:0、C18:0-OH、C20:0-OH、C22、C22:0-OH、C22:1-OH及溶血髓硫脂)的水準下降。此外，與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠相比，在所有四種劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC)投予後，C20:0-OH、C22:0-OH、及C22:1-OH髓硫脂類物種的水準均得到顯著矯正(圖90)。
在脊髓中，與年齡相符之媒劑處理的野生型對照相比，在基線、AAV投予前及研究總結(第180天)時，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中分析的幾種髓硫脂物種較高。此顯示在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療時脊髓中存在貯積病理。與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的水準相比，投予最高劑量(1.3 x 10 11GC)的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致髓硫脂貯積的顯著矯正，C16:0及C18:0髓硫脂類水準降低。第二高劑量(4.5 x 10 10GC)亦顯示出降低髓硫脂水準的趨勢，儘管變化沒有達到統計顯著性(圖91)。
在肝臟中，檢測到的髓硫脂物種的數量相對少於腦中的。儘管如此，在基線(AAV投予前)及研究第180天時，與年齡相符之媒劑處理的野生型對照相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的肝臟髓硫脂水準顯著較高。與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的水準相比，投予二種最高劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC)之AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)導致髓硫脂貯積的矯正，幾種物種(C16:0、C18:0、C16:0-OH)的水準在統計學上顯著降低(圖92)。
在坐骨神經中，與年齡相符之媒劑處理的野生型對照相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠中檢測到的所有髓硫脂物種顯著較高(數據未顯示)。以所有測試劑量(1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 9GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)顯示矯正髓硫脂貯積的趨勢，然而與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的水準相比，差異在統計學上並不顯著。
在腎臟中，在基線(AAV投予前)及研究第180天時，與年齡相符之媒劑處理的野生型對照相比，媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的所有檢測到的髓硫脂物種顯著較高(圖93)。與媒劑處理的 Arsa –/– 小鼠的水準相比，投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)在投予1.3 x 10 11GC及4.5 x 10 9劑量後導致C22:0髓硫脂貯積矯正的趨勢，然而僅在4.5 x 10 10GC及1.3 x 10 10GC劑量顯示統計學上顯著的降低。
結果總結 ：●     在所有測試劑量：1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC下，經由ICV遞送至4個月大 Arsa -/- 小鼠之AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)投予耐受性良好。對體重增加、臨床觀察、血液檢查、存活沒有不良影響，且在組織病理學上並無與測試物相關的不良所見。 ●     該研究的最終時間點研究第180天(10個月齡)與我們的新穎 Arsa -/-模式輕度表型的發病同時發生，該發病由以盲法進行的複合評分確定，其中包括神經及一般健康參數。與年齡相符之媒劑處理的對照相比，以所有劑量(4.5 x 10 9GC、1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)投予AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致在 Arsa -/- 小鼠的表型顯著減少。此暗示在低至4.5 x 10 9GC (1.1 x 10 10GC/g腦)的劑量下，在一般健康及神經功能方面之治療益處的潛力。 ●     與年齡相符之媒劑處理的對照相比，以三種最高劑量(1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致 Arsa -/- 小鼠腦中ARSA活性之統計學上顯著的劑量依賴性增加。 ●     以所有劑量(4.5 x 10 9GC、1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)投予AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)在 Arsa -/- 小鼠的腦中誘導hARSA蛋白表現，如由IHC觀察到的，最靠近注射部位的表現水準最高，包括海馬迴、胼胝體及大腦尾端皮質，而ICV注射部位遠端未檢測到的區域(包括小腦及腦幹)的表現低。在ICV投予至成年小鼠腦後，此種表現概貌係被預期的。 ●     在研究第180天(10個月齡)在 Arsa -/-小鼠的腦及脊髓中、以及治療前(基線，4個月齡)的腦中觀察到以白質空泡化及軸突變性為特徵的髓鞘質病理。在三種最高測試劑量(1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的小鼠的脊髓及最高劑量(1.3 x 10 11GC)的腦中之白質所見的發生率較低且嚴重度降低；注意到對於腦僅評估最高劑量，因為分析的主要目的係檢測潛在的AAV相關毒性。由於在最高劑量的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後未觀察到不良所見，因此未檢查接受較低劑量的動物。 ●     與年齡相符之媒劑處理的對照相比，以三種最高劑量(1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致在 Arsa -/- 小鼠的海馬迴及胼胝體(白質)中溶酶體病理的顯著改善(升高的LAMP-1免疫染色正常化)。此觀察結果暗示，低至1.3 x 10 10GC (3.3 x 10 10GC/g腦)的劑量在AAV遞送後被穩健轉導的區域中之治療益處的潛力。重要的是，LAMP-1免疫染色在基線時已經增加，表明以AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療後現有的溶酶體擴大的逆轉。 ●     注射部位更遠端且具有較低的轉導水準的CNS區域(例如脊髓及尾端大腦皮質)在最高治療劑量(1.3 x 10 11GC或3.25 x 10 11GC/g腦)及兩種最高劑量(1.3 x 10 11GC [3.25 x 10 11GC/g腦]、及4.5 x 10 10GC [1.1 x 10 11GC g腦])後顯示出LAMP-1正常化的證據。 ●     與年齡相符之媒劑對照相比，以三種最高劑量(1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致 Arsa -/- 小鼠大腦皮質的神經發炎(藉由GFAP免疫染色檢測星狀細胞增生)顯著改善。此暗示在低至1.3 x 10 10GC (3.3 x 10 10GC/g腦)的劑量下，在降低神經發炎方面之治療益處的潛力。重要的是，於基線時已經存在GFAP增加，表明以AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療後病理的逆轉。與WT對照相比， Arsa -/- 小鼠中分析的其他腦區域並未表現出顯著的星狀細胞增生。 ●     如由LC/MS測量的，以所有劑量(4.5 x 10 9GC、1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 11GC) ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致 Arsa -/- 小鼠腦中幾種髓硫脂物種的顯著減少，證實貯積物質的減少、以及低至4.5 x 10 9GC (1.1 x 10 10GC / g腦)的劑量下的潛在治療益處。在投予最高劑量(1.3 x 10 11GC [3.3 x 10 11GC / g腦])後，脊髓中的髓硫脂貯積亦顯著減少。 ●     在周圍組織中，與年齡相符之媒劑處理的對照相比，以兩種最高劑量(4.5 x 10 10GC,或1.3 x 10 11GC)投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)導致 Arsa -/- 小鼠肝臟及心臟中ARSA活性水準顯著的劑量依賴性增加。第三高劑量(1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC / g腦])在肝臟中誘導ARSA活性增加的趨勢，這在雌性中比在雄性中更為明顯。然而，推測係由於報告的囓齒動物中藉由AAV的肝轉導的性別相關的變異性所致，組合性別組的變化並未達到顯著性。這暗示在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予至腦脊髓液(CSF)後，周圍器官之有意義的轉導的潛力，以及在以低至1.3 x 10 10GC的劑量ICV投予(3.3 x 10 10GC / g 腦)後，提供用於細胞的交叉矯正之ARSA酶的周圍來源的潛力。在測試的兩種最高劑量(4.5 x 10 10GC及1.3 x 10 11GC)後，周圍器官中ARSA活性增加導致肝臟及血漿中的髓硫脂水準顯著降低，且在測試的兩個中劑量(1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 10GC)下，腎臟中的髓硫脂降低。藉由以AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療，由BUN水準的升高來評估的 Arsa -/- 小鼠的腎功能障礙被劑量依賴性地改善。 ●     總之，ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至 Arsa -/- 小鼠後的最小有效劑量(MED)被確定為最低劑量4.5 x 10 9GC (相當於1.1 x 10 10GC / g腦重量)，因為此劑量顯著改善了藉由複合臨床評分評估的 Arsa -/- 小鼠的表型，在腦中產生可檢測水準的hARSA轉基因(藉由免疫染色檢測)，並顯著減少腦中的幾種髓硫脂物種。高3倍的劑量(1.3 x 10 10GC [3.3 x 10 10GC / g腦])表現出更廣泛的藥理作用，顯著減少腦中的神經發炎及溶酶體病理(分別藉由GFAP及LAMP-1免疫染色測量)，腦中ARSA活性的顯著增加且腦及腎臟中其他髓硫脂物種的顯著減少。 實施例 10- 非人類靈長類動物的毒理學研究
進行毒理學研究以評估AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(一種表現人類芳基硫酸酯酶A ( ARSA)的重組腺相關病毒(AAV)血清型hu68載體)在幼年非人類靈長類動物(NHP)進行腦大池內(ICM)投予後的安全性及耐受性。
幼年雄性及雌性恆河獼猴接受單次ICM投予媒劑 (鞘內最終調配緩衝液[ITFFB])或者劑量為3.0 x 10 12基因體拷貝(GC)(低劑量；3.3 x 10 10GC/g腦)、1.0 x 10 13GC (中劑量；1.1 x 10 11GC/g腦)、或3.0 x 10 13GC (高劑量；3.3 x 10 11GC/g腦)的AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)。來自各同齡群的動物在投予後90或180天進行安樂死。
生活中評估包括每天進行的臨床觀察、身體檢查、標準化神經學監測、感覺神經傳導研究(NCS)、體重、血液及腦脊髓液(CSF)的臨床病理學、血清循環中和抗體(NAb)的評估、載體藥物動力學及載體排泄的評估、以及CSF及血清中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)及針對轉基因產物的抗體(抗人類ARSA抗體)的評估。對動物進行屍檢，收取組織進行全面的組織病理學檢查，並測量T細胞對載體殼體及轉基因產物的反應。
分組後，每隻動物接受由對照物(ITFFB)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)所組成的下列處理之一的單次ICM投予： 1.)   ITFFB (對照物) 2.)   低劑量之GTP-207 (3.0 x 10 12GC；測試物) 3.)   中劑量之GTP-207 (1.0 x 10 13GC；測試物) 4.)   高劑量之GTP-207 (3.0 x 10 13GC；測試物)
在整個投予日期，盡可能地將表示為許多研究組別的動物的劑量投予日期(第0天)錯開。研究設計總結於下表。
表.組別名稱、劑量水準及投予途徑
組別 處理 劑量 (GC) 劑量 (GC/g腦) a 動物ID 性別 ROA 投予體積 (mL) 給藥日 屍檢日
1 ITFFB N/A N/A 19-030 M ICM 1.0 0 90±4
2 GTP-207 (低劑量) 3.0 x 10 12 3.3 x 10 10 18-223 F
18-226 F
19-033 M
3 GTP-207 (中劑量) 1.0 x 10 13 1.1 x 10 11 18-205 M
18-207 M
19-024 F
4 GTP-207 (高劑量) 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 18-225 F
18-228 F
19-023 M
5 ITFFB N/A N/A 19-034 F ICM 1.0 0 180±5
6 GTP-207 (低劑量) 3.0 x 10 12 3.3 x 10 10 18-218 F
18-220 F
18-222 F
7 GTP-207 (中劑量) 1.0 x 10 13 1.1 x 10 11 18-206 M
18-219 F
19-014 F
8 GTP-207 (高劑量) 3.0 x 10 13 3.3 x 10 11 18-215 F
19-015 M
19-028 M
a劑量基於幼年NHP的腦質量90 g按比例調整(Herndon et al., 1998)。 縮寫：GC，基因體拷貝；ICM，腦大池內；ID，識別號碼；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；N/A，不適用；NHP，非人類靈長類動物；ROA，投予途徑。
測試物及對照物投予 投予程序
在研究第0天，動物在給藥前被鎮靜。在投予對照物或測試物之前，將動物稱重並記錄生命徵象。提供止痛藥給動物。
然後以經由枕骨下穿刺進入腦大池的對照物(ITFFB)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的單次注射對動物給藥(ICM投予)，以螢光鏡確認。簡而言之，將麻醉的獼猴從動物收容空間轉移，並以側臥位放置在X光台上，頭部向前彎曲，以收集CSF並投藥進入腦大池。注射部位係無菌地準備。使用無菌技術，將1.0–3.5英寸18–23號Quincke脊椎穿刺針推進至枕骨下空間，直到觀察到CSF流動。在給藥前收集多至1.0 mL的CSF用於基線分析。針頭對準腦大池較寬的上間隙，以避免血液沾染及潛在的腦幹損傷。CSF收集後，將小口徑T型延長導管連接到脊椎穿刺針上，以便於給藥造影劑，然後給藥對照物或測試物。經由導管及脊椎穿刺針投予多至1.0 mL的造影劑。經由CSF回流驗證針頭位置並以螢光鏡將針頭可視化後，將含有對照物或測試物(相當於1.0 mL的體積加上注射器及連接器靜滯區的體積)的注射器連接到柔性連接器並在30±5秒鐘內注射。投予後，移除針頭，並直接按壓穿刺部位。 觀察 生存力評估 ( 籠內 )
依據SOP 7404，每天目視觀察動物的一般外觀或毒性徵象，包括但不限於神經徵象或嗜睡、痛苦及行為變化。在研究期間完成了NHP每日觀察表格7404-F1。任何異常情況皆告知臨床獸醫或指定人員及研究主任。治療僅在臨床獸醫或指定人員及研究主任批准後進行，除非緊急情況危及NHP或在無法及時聯繫臨床獸醫及/或研究主任的情況下對NHP進行人道安樂死。 生活中檢查 神經學監測
動物在不同時間點接受神經學監測。簡而言之，評估分為五個部分，評估以下內容：精神狀態、姿勢及步態、本體感覺、顱神經、及脊髓反射。每次評估的測試皆以相同的順序進行。評估員並未正式對治療組設盲；然而，評估員通常在評估時仍然不知道治療組。對於適用的每個評估類別給出數值分數並記錄(正常：1；異常：2；減少：3；增加：4；無：5；N/A：不適用)。 心理狀態
為了評估精神狀態，在檢查員操作之前，藉由注意動物如何與檢查員及環境互動，對NHP進行籠邊評估。除了呼吸特性及費力以及任何過度流淚或流涎外，還記錄了任何變化，例如抑鬱、遲鈍、迷失方向或昏迷行為。 姿勢及步態
為了評估姿勢及步態，在檢查員操作前，藉由觀察動物在籠子中的活動方式，對NHP進行籠邊評估。任何障礙，如共濟失調、輕癱、癱瘓、或蹣跚/跌倒/震顫/抽搐/動作不協調皆被記錄。檢查員亦觀察動物的姿勢、頭部位置(頭部傾斜、頭部或頸部轉動)、寬底站姿、棲息能力、震顫或無意識運動，並記錄任何異常。 本體感覺
本體感覺的評估係可選擇的，因為它們只能對受拘束的動物進行。藉由使動物站立在平坦的表面(諸如桌面)上，並將每隻後腳的背面(一次一個)翻轉到桌面上來評估本體感覺的定位。動物應立即糾正腳的位置，並記錄任何延遲的反應及/或未能糾正腳的位置。藉由將靈長類動物緩慢移向帶有窄沿(例如桌面)的平坦表面並讓後足的背面接觸該表面來評估視覺放置。靈長類動物應藉由將雙腳的足底面放在桌面上來反應。觸覺放置以與視覺放置相同的方式評估，除了靈長類動物的眼睛被檢查者的手遮住之外。 顱神經
顱神經評估係在籠中藉由利用擠壓背部機制進行的，或者在籠子外面坐在椅子上進行，同時藉由注意面部/頭部對稱性以及面部及顱部的肌肉張力來進行拘束。記錄任何異常。威嚇反射係藉由將訓練員的手伸向靈長類動物的每隻眼睛來評估，注意不要產生氣流或接觸靈長類動物臉部的任何部位。威嚇反射測試確定動物是否在檢查者的手接近面部時每隻眼睛皆眨眼，並記錄任何異常。檢查每隻眼睛的對稱性(位置、瞳孔大小及形狀)。使用透照器或筆燈，以雙手遮住眼睛5秒鐘，移開手，然後將光直接照射到眼睛中以評估瞳孔收縮來評估雙眼的瞳孔光反射。注意瞳孔反應的對稱性(收縮速度及整體收縮程度)。藉由將棉花棒接觸外眥然後接觸眼睛的內眥來評估雙眼的眼瞼反射。動物應在每次接觸時眨眼，並記錄任何異常。藉由以鑷子夾住鼻隔並確定動物是否對有害刺激有反應來評估鼻隔的感覺。評估坐在椅子上或手動拘束之動物的眼睛定位，在這些動物中鼻子可抬高，而眼睛保持在正常位置。當頭部輕輕左右移動時，眼睛應跟隨頭部的移動(眼球震顫)，並記錄任何異常。 脊髓反射
藉由評估靈長類動物的肌肉力量來評估脊髓神經/脊髓反射。如果手動拘束，藉由訓練員握住兩個後肢(每隻手一個)以評估靈長類動物抵抗肢體操作的能力來評估肌肉力量。如果進行籠邊評估，則藉由將玩具或其他適當的物體交給動物並讓其握在手中，同時檢查者繼續握住物體並拉回來評估肌肉力量。在各種情況下，動物抵抗檢查者行為的能力皆被記錄下來。藉由以止血鉗夾住每隻後腳並確定動物是否快速彎曲膝蓋並將其肢體向上拉向身體來評估縮回反射。記錄反應。藉由以棉花棒輕碰肛門周圍的皮膚，並評估動物是否有由周圍皮膚皺起所表明的外括約肌收縮來評估會陰反射。 感覺神經傳導 研究
神經傳導研究(NCS)，在研究步驟準則中亦稱為感覺神經傳導速度(NCV)測試。簡而言之，根據SOP 7807，使用Nicolet EDX®系統(Natus Neurology)及Viking®分析軟體，對左右側正中神經進行NCS以測量SNAP振幅及傳導速度。簡而言之，動物以氯胺酮/右美托咪定(dexmedetomidine)之組合鎮靜。將鎮靜的動物以側臥或背臥放置於帶有熱敷袋的手術台上以維持體溫。由於可能干擾電子訊號採集，因此未使用電子加熱裝置。刺激器探頭位於正中神經上方，陰極最靠近記錄部位。在第二指的遠端指骨(參考電極)及近端指骨(記錄電極)的水平處皮下插入兩個針電極，而接地電極放置在刺激探針(陰極)的近端。使用WR50 Comfort Plus Probe兒科刺激器(Natus Neurology)。引發的反應被差異放大並顯示在監視器上。初始採集刺激強度設置為0.0 mA，以確認無背景電子訊號。為了找尋最適刺激位置，將刺激強度增加至10.0 mA，並在探頭沿正中神經移動時產生一系列刺激，直到找到由最大明確波形確定的最適位置。將探頭保持在該最適位置，以步進式將刺激強度逐步增加到10.0 mA，直到峰值振幅反應不再增加。記錄最後三十個刺激反應並保存在軟體中。將最多10個最大刺激反應予以平均並報告用於正中神經。測量從記錄位置到刺激陰極的距離(cm)，並將其輸入至軟體中。使用反應的起始潛伏期及距離(cm)計算傳導速度。報告了傳導速度及SNAP振幅的平均值(圖94)。正中神經係測試雙側。儀器生成的所有原始數據皆作為研究文件的一部分保留下來。 轉基因產物表現 (ARSA 酶活性 )之評估
使用對硝基兒茶酚測定測量CSF及血清中的人類 ARSA酶活性。簡而言之，將經透析的血清(稀釋1:5，1份血清+4份稀釋劑；段落4.4.3.1)或未透析的CSF (稀釋1:2，1份CSF+1份稀釋劑)在基礎緩衝液(0.5 M乙酸鈉緩衝液，pH 5.0；10%氯化鈉；0.5 mM焦磷酸鈉)中稀釋，並將40 μL稀釋樣本加載至96孔盤的四個孔中(一式二份)。接下來，將40 μL受質(含10 mM 4-硝基兒茶酚硫酸鹽之基礎緩衝液)添加至樣本中，並藉由在四個孔中的兩個孔立即添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)終止反應。然後將盤於37°C培養5小時。藉由在剩下的孔中添加120 μL 1N NaOH (終止溶液)終止反應。藉由使用盤讀取器於515 nm讀取盤來測量吸光度。ARSA特異性活性係藉由將在5小時獲得的吸光度減去0分鐘時的吸光度乘以4-硝基兒茶酚標準曲線於515 nm的消光係數，然後除以藉由BCA測定測量的孔中的蛋白質量(mg)來確定(僅血清)。ARSA活性的結果表示為每五小時每毫克蛋白質的nmol(血清)或每五小時每毫升的nmol(CSF)。 針對轉基因產物之抗體 ( 抗人類 ARSA 抗體 ) 的評估
根據SOP 7009，藉由間接ELISA測量CSF及血清中針對人類ARSA蛋白的免疫球蛋白G (IgG)抗體。簡而言之，高結合聚苯乙烯ELISA盤在4°C下以在酸性DPBS中稀釋的≥1 μg/mL重組人類ARSA蛋白被覆隔夜。洗滌後，在室溫下以含2%牛血清白蛋白(BSA)之酸性DPBS將盤阻斷2小時，然後在室溫下將樣本培養1.5小時。CSF樣本以1:20稀釋於DPBS，血清樣本以1:1000稀釋於DPBS。洗滌後，以生物素化山羊抗人類IgG抗體及接合鏈球菌親生物素蛋白的HRP來檢測結合的抗人類ARSA抗體。使用TMB受質將盤顯影20分鐘。然後以2N硫酸終止反應，並於450 nm測量吸光度。 結果 死亡 率
所有動物皆存活到預定的屍檢時間點。 臨床觀察
在整個研究過程中每天監測動物。沒有可歸因於測試物投予的臨床異常。注意到數個與測試物投予無關的異常。如果需要，這些觀察結果及相關治療不會影響研究，因為症狀會隨著時間完全消退，且基於症狀及診斷，沒有任何觀察結果被懷疑與測試物相關。沒有任何觀察結果影響生命終點，除了在第28天的NCS時動物18-219 (1.0 x 10 13GC，第7組)展現左手第二指損傷外，這可能導致其左側的正中神經SNAP振幅降低。 神經學檢查
在基線及投予後第14、28、60、90、120、150及180天進行標準化神經學檢查。動物偶爾不配合檢查，排除了一些評估。然而，在每隻動物的大多數時間點評估了檢查的所有必需部分。沒有發現歸因於測試物的異常神經學徵象。
第90天及第180天的同齡群中，許多動物偶爾會在一些時間點展現縮回反射減少、消失或異常(延遲或增加)。此觀察被歸因於對該程序的焦慮或習慣，因為在大多數情況下，在神經學檢查期間沒有發現與抓握能力及/或其他測試參數相關的其他異常，並且與測試物或劑量依賴性並無明顯相關。在以下動物觀察到縮回反射減少、消失或異常(延遲或增加)：第14天的動物18-228 (GTP‑207；3.0 x 10 13GC；第4組)；第14、28、60及90天的動物18-205 (GTP-207；1.0 x 10 13GC；第3組)；第14及120天的動物19-015 (GTP-207；3.0 x 10 13GC；第8組)；第28天的動物18-207 (GTP-207；1.0 x 10 13GC；第3組)；第28及60天的動物19-024 (GTP-207；1.0 x 10 13GC；第3組)；第28、60、150及180天的動物18-206 (GTP-207；1.0 x 10 13GC；第7組)；第60天的動物18-225 (GTP-207；3.0 x 10 13；第4組)；第60及90天的動物19-034 (ITFFB；第5組)及動物18-218 (GTP-207；3.0 x 10 12GC；第6組)；第120天的動物19‑028 (GTP-207；3.0 x 10 13GC；第8組)；及第150天的動物18‑220 (GTP‑207；3.0 x 10 12GC；第6組)。
此外，第90天及第180天的同齡群中，幾隻動物在一些評估的時間點展現對鼻隔測試的反應降低或沒有反應。這些非典型反應被歸因於對檢查的焦慮或習慣，因為在神經學檢查中沒有發現其他異常及/或所有面部運動皆在正常範圍內。在以下動物觀察到對鼻隔測試的反應減少或消失：第14天的動物18-228 (GTP-207；3.0 x 10 13GC；第4組)；第14、60及90天的動物18-205 (GTP-207；1.0 x 10 13GC；第3組)；第28天的動物18-225 (GTP-207；3.0 x 10 13GC；第4組)；動物18-218 (GTP-207；3.0 x 10 12GC；第6組)、及動物18-222 (GTP-207；3.0 x 10 12GC；第6組)；第60及90天的動物19-034 (ITFFB；第5組)；第60、150及180天的動物18-206 (GTP-207；1.0 x 10 13GC；第7組)；第120天的動物19-028 (GTP-207；3.0 x 10 13GC；第8組)；及第180天的動物18-215 (GTP‑207；3.0 x 10 13GC；第8組)。 感覺神經傳導研究
在基線及之後每月對所有動物進行感覺神經傳導研究(NCS)，以測量雙側正中神經感覺神經動作電位(SNAP)振幅及傳導速度(圖95及圖96)。
在以下動物觀察到正中神經SNAP振幅從基線水準的雙側或單側降低，其超過正常個體動物的變異性，其值低於基線平均值的2個標準差：中劑量組的2/6的動物(1.0 x 10 13GC；動物18-205，第3組，第90天[雙側]；動物18-219，第7組，第28、60、90、120及150天[單側，左側])及高劑量組的2/6的動物(3.0 x 10 13GC；動物18‑225，第4組，第28天[雙側]、第60及90天[單側，右側]；動物19‑015，第8組，第28及90天[單側，左側]；圖95及圖96)。所有這些動物在屍檢分析的組織上，在背根神經節的三個節段中的至少兩個顯示出最小或輕度的神經元退化/壞死、以及嚴重度的範圍從輕度(等級2)至中度(等級3)及顯著(等級4)的脊髓背側軸突病變。對於兩隻第90天的同齡群動物，異常低的SNAP振幅與組織病理學所見的嚴重度之間存在相關性，動物18-205 (1.0 x 10 13GC，第3組)及動物18-225 (3.0 x 10 13GC，第4組)表現出最嚴重的脊髓背側軸突病變(分別高達等級3及等級4)、DRG神經根的軸突退化及神經內膜纖維化、以及正中神經輕度的(等級2)神經內膜纖維化。在第180天的同齡群動物中，儘管動物19-015 (3.0 x 10 13GC，第8組)在正中神經中具有等級1的神經內膜纖維化，異常低的SNAP振幅與組織病理學所見的嚴重度之間的相關性不太清楚。第180天的同齡群中的兩隻動物從研究第28天開始具有異常低的SNAP振幅且更長期的追蹤表現出時間依賴性改善的趨勢，到第120天數值回到正常範圍內(動物19-015，3.0 x 10 13GC，第8組)或到第180天數值回到正常範圍內(動物18-219，1.0 x 10 13GC，第7組)，儘管與基線相比，彼等仍然顯著下降。在第28天的NCS評估時，動物18-219 (1.0 x 10 13GC，第7組)亦展現左手第二指損傷，這可能導致在該損傷癒合時其左側的正中神經SNAP振幅降低。
綜上所述，當與組織病理學所見相關時，SNAP振幅降低可能歸因於與測試物相關的感覺神經元毒性。在整個研究過程中，SNAP振幅在動物間及動物內的變異性明顯，並且記錄針相對於神經的位置會影響SNAP振幅。在縱貫研究中經常觀察到SNAP振幅的變化，特別是在仍在生長的幼年動物中，因此可能從一個時間點到另一個時間點略微修改了解剖標記點，這是為什麼需要對與組織病理學數據之相關性(或缺乏相關性)進行明確解釋的原因。總體而言，SNAP振幅降低的3/4的動物與更嚴重的軸突病變(動物18-205及18-225)或神經內膜纖維化(動物19-015)相關，而1/4的動物具有較低值，其可歸因於非測試物相關的損傷(動物18-219)。
神經傳導速度通常受電極定位的影響較小，因此預期顯示大多數動物的變化較小(圖95及圖96)。然而，在以下動物，在超過一個時間點觀察到神經傳導速度從基線水準降低超過正常個體動物變異性：1/2的媒劑處理的動物(ITFFB，動物19-030，第1組，第28及60天)、低劑量組的5/6的動物(3.0 x 10 12GC；動物18-223，第28天；動物19-033，第60天[第2組]；動物18-218，第60及180天；動物18-220，第28-180天；動物18-222，第90、150及180天[第6組])、中劑量組的6/6的動物(1.0 x 10 13GC；動物18-205及動物18‑207，第28、60及90天；動物19-024，第28及60天[第3組]；動物18‑219，第28‑180天；動物19-014，第60天；動物18-206，第90天[第7組])、及高劑量組的6/6的動物(3.0 x 10 13GC；動物19-023，第28天；動物18-225，第28、60及90天；動物18-228，第28及90天[第4組]；動物18-215，第90及180天；動物19-015，第8組，第28-180天；動物19-028，第28、60、90、150及180天[第8組])。由於在各組中觀察到神經傳導速度降低，包括來自媒劑處理的對照組的一隻動物，且神經傳導速度降低與劑量組之間沒有明顯相關，因此這些所見不太可能與測試物相關。 體重
第90天及第180天的同齡群中的動物在測試物投予後及整個研究期間皆呈現出體重增加(圖97)。在一些動物中，在不超過兩個時間點觀察到短暫的體重減輕，包括在第7天的1/2的媒劑處理的對照及7/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的NHP、在第14天的1/2的媒劑處理的對照、在第28天的5/18的GTP-207治療的NHP、在第60天的1/18的GTP-207治療的NHP、在第90天的1/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的NHP、及在第180天的2/9的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的NHP。此外，4/18的GTP-207治療的NHP在二個時間點展現體重減輕，包括在第7及28天的1/18的動物、第7及90天的1/18的動物、第7及180天的1/18的動物、及第28及180天的1/18的動物。觀察到的短暫的重量減輕被認為與測試物無關。
在第7天，8/18的動物歷經體重從先前記錄的重量減輕，包括1/2的媒劑處理的對照(ITFFB；動物19-034 [-2.27%，第5組])、投予低劑量的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的2/6的動物(3.0 x 10 12GC；動物18-223 [-2.08%；第2組]及動物18-218 [-3.70%，第6組])、投予中劑量的2/6的動物(1.0 x 10 13GC；動物19-024 [-2.13%；第3組]及動物19-014 [-2.00%, 第7組])、及投予高劑量的3/6的動物(3.0 x 10 13GC；動物18-225 [-3.57%；第4組]、動物18-228 [-3.17%；第4組]、及動物19-015 [-5.88%，第8組])。對於一些動物，這種在治療後的前7天的體重減輕可藉由觀察食慾下降(動物18-223、動物19-024、動物19-015及動物19-014)、間歇性軟便(動物19-014)、或皮膚刺激(動物18-228)來解釋。對於其餘的動物(動物19-034、18-218及18-225)，並未注意到導致所觀察到的暫時性體重減輕的臨床症狀。
在第14天，1/2的媒劑處理的對照(ITFFB；動物19-030 [-2.08%；第1組])呈現出重量從之前記錄之重量減輕，並沒有注意到導致所觀察到的暫時性體重減輕的臨床症狀。在補充餵養的研究剩餘時間裡，動物的體重持續增加。
在第28天，5/18的動物歷經體重從先前記錄的重量減輕，包括投予低劑量的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的2/6的動物(3.0 x 10 12GC；動物18-033 [-1.72%；第2組]及動物18-220 [-10.29%，第6組])、投予中劑量的2/6的動物(1.0 x 10 13GC；動物18-207 [-1.64%；第3組]及動物18-206 [-2.41%，第7組])、及投予高劑量的1/6的動物(3.0 x 10 13GC；動物18-225 [-3.57%；第4組]。動物18-220在第28天的體重減輕-10.29%被研究獸醫注意到為異常值，並且可能是記錄時筆誤的結果，因為動物在第14天的體重與在第60天相似。觀察到動物18-207此時正在經歷生長陡增，這可能與觀察到的短暫的體重減輕相關。第22天，動物18-206的右腳卡在籠子裡，導致明顯腫脹及幾處表面擦傷，這可能與第28天觀察到的後續體重減輕相關，也可能無關。對於動物19-033及18-225，並未注意到導致所觀察到的暫時性體重減輕的臨床症狀。
在第60天，投予高劑量之AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的1/6的動物(3.0 x 10 13GC；動物19-028 [-2.00%；第8組])表現出體重從先前記錄之重量減輕，但不歸因於任何臨床症狀。
在第90天，投予高劑量之AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的1/6的動物(3.0 x 10 13GC；動物18-228 [-1.43%；第4組])表現出體重從先前記錄之重量減輕，但不歸因於任何臨床症狀。
在第180天，投予低劑量之AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的1/6的動物(3.0 x 10 12GC；動物18-218 [-0.31%；第6組])及投予中劑量的1/6的動物(1.0 x 10 13GC；動物18-206 [-0.61%；第7組])展現體重從先前記錄之重量減輕，但不歸因於任何臨床症狀。
儘管以上討論了體重的短暫減少，但在適用的研究期間，所有動物在所有後續時間點繼續增加及/或保持體重。 血液學、凝血及臨床化學 ( 血液及腦脊髓液 ) 血液
在血液CBC、凝血研究或血清化學檢測組(serum chemistry panel)中未發現與測試物相關的異常。觀察到數個與測試物投予無關的輕微異常，這些異常在臨床上被認為是無關緊要的。 血液學 ( 全血細胞計數 )
基於白血球相數據的分析，一些動物在研究期間呈現白血球增多症。動物18-219、18-207及18-206在整個研究過程中的不同時間點呈現白血球增多症，其與測試物無關並且歸因於各種傷口(18-219、18-207、18-206)及/或月經(18-219)。動物18-223在基線及研究第7、15、28及62天呈現白血球增多症，這些時間點大部分被歸類為淋巴細胞性白血球增多症。在此情況下，白血球增多症為輕度的，很可能是由於個體差異所致，因為它在基線時首次被注意到。動物18-226、18-205、18‑225、18-228、18-218、18-222、19-014及18-215在不同時間點呈現白血球增多症，其與籠側的臨床徵象不對應。所有白血球相變化本質上皆為輕度的，並可能在臨床上並不顯著。血液檢查異常似乎與劑量組無關。
血液相數據分析顯示，動物子集呈現輕度的相對紅血球增多症或血小板增多症，這可能繼發於由於血管內液體流失或腎上腺素媒介的脾臟收縮引起的血液濃縮。此外，動物18‑223、18-225及19-030在所有時間點均呈現輕度偏低的平均紅血球血紅素，這可能是由於個體差異所致，因為它在基線時就首次被注意到。動物子集呈現略微超出參考範圍的低色素紅血球(平均紅血球血紅素濃度降低)，這可能與個體差異相關或繼發於再生過程。最後，動物18-220從測試物投予前的第0天開始呈現間歇性輕微血小板減少症，這與止血受損的任何臨床徵象無關，可能與個體差異、人為產物(即在收集管的凝血塊)或脾臟阻斷(splenic sequestration)相關。總而言之，從上面強調的血液相分析中注意到的所有異常皆為輕微的，並且在臨床上被認為是微不足道的。 血清臨床化學
總而言之，本研究中所有動物的AST(肝臟酵素)均不顯著。動物沒有顯示肝毒性的臨床徵象，總體而言，ALT的任何升高皆非常輕微，許多處於基線或第0天(圖98)。暫時性升高的原因無法明確確定，但差異包括繼發於發炎(細菌、病毒或真菌的)、先天性狀況(即微血管發育不良)、肌肉創傷或測試物投予的輕度肝細胞損傷。在第180天的同齡群中第28天記錄到的輕度自限性ALT升高可能與測試物相關，因為在3/3的投予高劑量的動物(3.0 x 10 13GC，動物18-215、19-015及19-028)及1/3的投予中劑量的動物(1.0 x 10 13GC，動物18-219)中觀察到，且這個時間點與可能的對非自身轉基因及/或AAV殼體的適應性T細胞免疫反應相吻合。如ELIPSOT所示，在第28天具有輕度短暫的ALT升高的4隻動物對非自身轉基因產物具有陽性T細胞反應。中劑量組中的兩隻動物(1.0 x 10 13GC，動物18-206及19-014)在第28天沒有升高的ALT值，此時沒有對hARSA的IFN-γ T細胞反應。所有投予低劑量的第180天的同齡群動物(3.0 x 10 12GC，動物18‑218、18-220及18-222)在第28天沒有升高的ALT值；雖然這些動物在第28天具有對hARSA的IFN-γ T細胞反應，這些動物在此時間點的最高反應平均值(83.7個斑點形成單位)遠低於中劑量組及高劑量組中在第28天ALT值升高的四隻動物的對應值(317.3個斑點形成單位)。
在一部分動物中觀察到血糖短暫的升高，其可能與測試或對照物投予無關，因為這些異常中的許多發生在基線或第0天，且可能與用於鎮靜動物的α-2腎上腺素性藥物相關，該藥物亦已知會引起高血糖症。其他動物出現間歇性低血糖症，其中一些出現在基線或第0天，這表明此與測試物無關。那些在其他時間點為高血糖的，可能是由於幼年低血糖症，這被認為是由於肝臟未成熟而發生的，且經常在低體重的幼年動物中觀察到。
在本研究的整個過程中，許多動物呈現血清鹼性磷酸酶(ALP)的升高。ALP有多種同功型，包括肝臟、腎臟及骨骼。雖然不能排除肝膽或腸道疾病導致的ALP增加，但由於測試系統的年齡，這些變化很可能是生理性的。由於酶的骨骼同功型的高水準，在年輕的生長中的動物，ALP值可能比成年動物高10倍。許多動物亦具有磷的升高，這也可能是由於繼發於骨骼生長而從骨骼釋放所致。
多隻動物在不同時間點CPK升高。升高涉及CPK的骨骼肌同功型，可能繼發於鎮靜或靜脈穿刺期間的輕度肌肉創傷。
上面強調的化學檢測組中的所有異常，包括那些沒有明確討論的異常，皆為輕度的、短暫的，並且被認為在臨床上不重要，且可能是正常個體差異的結果，但是不能明確排除繼發於測試物投予的輕度變化。 凝血
從這項研究中收集的凝血概貌數據顯示，有證據表明樣本的一部分存在溶血，在一些情況下還存在血清混濁，這可能導致D-二聚體的升高。
動物19-033及19-024分別在研究第28天及第60天具有延長的PT值。對於動物19-033，此時間點亦具有纖維蛋白原、D-二聚體及FDP值的異常，並且該樣本觀察到溶血。此動物在任何其他時間點皆沒有臨床相關的異常，且注意到的升高可能是由於樣本的溶血。動物18-215在研究第185天的APTT亦有輕度增加。這些動物皆沒有顯示與凝血病變相關的任何臨床徵象的證據，且到下一個研究時間點凝血時間恢復到正常參考範圍內。
動物18-228在第二個基線時間點的纖維蛋白原、D-二聚體及FDP值升高，樣本被報告為溶血。此動物在任何其他時間點皆沒有臨床相關的異常，且注意到的升高可能是由於樣本的溶血。 腦脊髓液
除了一些動物中無症狀輕度短暫的CSF白血球增加外，在CSF臨床病理學上沒有發現與測試物相關的異常。 血液學 ( 細胞計數 )
當在CSF樣本中觀察到＞20個紅血球(RBC)/μL時(由於在放置脊椎穿刺針期間無意接觸皮下或硬腦膜血管而導致血液沾染)、及當CSF中每RBC的WBC比率低於血液中時，細胞增多症可能與血液稀釋相關。值得注意的是，4/18的GTP-207治療的動物呈現主要由淋巴細胞所組成的細胞增多症，其可能繼發於血液稀釋(≥6 白血球/µL CSF且＞20 RBC/μL，以及CSF中的WBC對RBC的比率低於血液中的)，包括低劑量組中的2/6的動物(3.0 x 10 12GC；動物18-220 [第6組，第60天]及動物19-033 [第2組，第28天])、中劑量組中的1/6的動物(1.0 x 10 13GC；動物18-205 [第3組，第7天])及高劑量組中的1/6的動物(動物19-023 [第4組，第90天])。在評估的任何時間點，在2/2的媒劑處理的對照中未觀察到細胞增多症(圖99)。
不能歸因於血液稀釋之主要由淋巴細胞所組成的輕度細胞增多症(≥6個白血球/µL CSF及≤20個RBC/µL，或大於20個RBC及CSF中的WBC對RBC之比率高於血液中的)發生在12/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物，包括低劑量組的4/6的動物(3.0 x 10 12GC；動物19-033 [第2組，第90天]、動物18‑223 [第2組，第28及60天]、動物18-220 [第6組，第28天]及動物18-218 [第6組，第28天])、中劑量組的3/6的動物(1.0 x 10 13GC；動物19‑024 [第3組，第28及60天]、動物18-205 [第3組，第14天]、及動物18-219 [第7組，第28天])、及高劑量組的5/6的動物(3.0 x 10 13GC；動物18-225 [第4組，第28天]、動物19-023 [第4組，第28天]、動物18-215 [第8組，第28、60、90、150天]、動物19‑015 [第8組，第28天]及動物19-028 [第8組，第28天])。在這些AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中，不能歸因於血液稀釋的CSF白血球計數峰值範圍為6–40個細胞/µL，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予後28–60天觀察到白血球計數峰值。由於在評估的任何時間點，在2/2的媒劑處理的對照中未觀察到細胞增多症，因此不能歸因於血液稀釋的輕度CSF細胞增多症被認為與測試物相關。在所有情況下，CSF細胞增多症皆為自限性的，與臨床後遺症無關。此外，劑量與不能歸因於血液沾染的細胞增多症之間似乎沒有任何相關性。這些觀察結果與過去在鞘內投予載體的NHP中所觀察到的CSF白血球計數的輕度短暫的增加一致，尚未觀察到有不良影響。 臨床化學
在研究期間，在任何動物中均未觀察到CSF總蛋白或葡萄糖異常。 針對 AAVhu68 殼體之中和抗體的存在
在基線時，在研究中4/20的動物的血清中可檢測到預先存在的針對AAVhu68殼體的NAb，包括1/2的媒劑處理的對照及3/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)治療的NHP。
第1組對照動物19-030 (ITFFB)的基線NAb效價為160，第2組動物19-033 (低劑量，3.0 x 10 12GC)也是如此。第3組動物19-024 (中劑量，1.0 x 10 13GC)及第6組動物18-222 (低劑量，3.0 x 10 12GC)的基線NAb效價均為40。研究中的其餘動物(16/20，80%)的基線NAb效價低於檢測極限(＜5)。
在媒劑處理的對照中，整個研究過程中觀察到基線NAb效價的變化極小甚至沒有變化。在基線時對預先存在的AAVhu68 NAb呈陰性的動物(動物19-034，第5組，ITFFB)直到第180天的屍檢的整個研究過程中對AAVhu68 NAb保持陰性。對預先存在的AAVhu68 Nab呈陽性的媒劑處理的對照(動物19-030，第1組，ITFFB)的NAb效價，在第28天從基線時的效價160下降到效價40並在第90天的屍檢中保持在該水準。
在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中，到第28天時，在18/18的動物中觀察到NAb對AAVhu68殼體的反應。對所有投予GTP-207的動物，通過在第90天或第180天的屍檢檢測到AAVhu68 NAb，大多數動物的峰值反應發生在第28天或第90天，隨後NAb效價降低或維持至屍檢時。一般而言，NAb反應的強度及動力學在所有劑量組中皆相似，具有不等變異數(unequal variances)的兩個樣本t檢定證明，在任何研究的評估天數中，任何劑量組之間的NAb效價在統計學上沒有顯著差異( p ≥0.05)。在投予載體之前存在之預先存在的AAVhu68 NAb，可能對投予低劑量AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)的動物(3.0 x 10 12GC；動物19-033，第2組；動物18-222，第6組)產生影響，與接受相同載體劑量的沒有預先存在之NAb的動物相比，導致NAb反應之更高的強度及/或更快速的動力學。
NAb對AAVhu68殼體的反應與異常臨床觀察或血液學、凝血及血清化學參數的變化無關。在整個研究過程所收集的血清中NAb皆對AAVhu68殼體反應。 T 細胞對 AAV 殼體及轉基因產物的反應
在研究期間，4/20的NHP對殼體(AAVhu68)或轉基因產物(人類ARSA)沒有展現IFN-γ T細胞反應。這些無反應者包括2/2的媒劑處理的對照及2/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207)治療的動物。分別通過第90天及第180天的屍檢，兩隻媒劑處理的無反應者(ITFFB；動物19-030，第1組及動物19-034，第5組)仍然對T細胞反應呈陰性。在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中，中劑量組的1/6的無反應者(1.0 x 10 13GC；動物18‑206，第7組)通過第180天的屍檢仍然對T細胞反應呈陰性，高劑量組的1/6的無反應者(3.0 x 10 13GC；動物19-023，第4組)保持陰性到第90天。
在研究期間，16/20的NHP展現對殼體及/或轉基因產物的IFN-γ T細胞反應。所有這些反應者皆為AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物，包括低劑量組的6/6的動物(3.0 x 10 12GC，第2及6組)、中劑量組的5/6的動物(1.0 x 10 13GC，第3及7組)、及高劑量組的5/6的動物(3.0 x 10 13GC，第4及8組)。
關於觀察到的反應類型，T細胞對轉基因產物的反應比對殼體的反應更為普遍。在16/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中展現T細胞反應，15/16的動物僅對轉基因產物有反應，1/16的對轉基因產物及殼體兩者皆有反應。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物均未展現僅對殼體的T細胞反應。
關於反應的強度，T細胞對殼體的反應強度低(每百萬細胞63–65個斑點形成單位[SFU])，發生在高劑量組的單一隻動物中(3.0 x 10 13GC，動物18-225，第4組)。對比之下，T細胞對轉基因產物的反應強度更高(每百萬細胞58–1703 SFU)，一些細胞群展現更大的反應。具體而言，在肝淋巴細胞中T細胞對轉基因產物的反應比PBMC及其他組織特異性淋巴細胞群的反應強度更高。與低劑量組(4.5 x 10 12GC)的反應相比，肝淋巴細胞的T細胞對轉基因產物的反應在中劑量組(1.5 x 10 13GC)及高劑量組(4.5 x 10 13GC)中強度也通常更高。
關於反應的普遍性、動力學及強度，T細胞對轉基因產物的反應似乎在所有劑量組中具有相似的普遍性。在低劑量組(3.0 x 10 12GC，第2組及第6組)及中劑量組(1.0 x 10 13GC，第3組及第7組)中，在第90天時的PBMC及組織特異性淋巴細胞中T細胞對轉基因產物的反應通常比在第180天更普遍。值得注意的是，在所有劑量組中，在第28天(14/18的AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物)觀察到PBMC中T細胞反應的普遍性高於第90天或第180天的屍檢。
預先存在的針對殼體的NAb似乎沒有影響T細胞針對殼體的反應，因為在研究期間，沒有任何(0/3)在基線時具有針對殼體的預先存在之NAb的GTP-207治療的動物對殼體產生T細胞反應(3.0 x 10 12GC，動物19‑033 [第2組]及動物18-222 [第6組]；1.0 x 10 13GC，動物19-024 [第3組])。
T細胞對殼體及轉基因產物的反應與異常臨床觀察或血液學、凝血及血清化學參數的變化無關，除了第28天短暫的ALT升高及抗轉基因產物T細胞反應之間可能存在關係。 大體病理 所見
沒有觀察到與測試物相關的大體所見。所有大體所見皆被認為是偶發的或與程序相關的屍檢。器官重量及器官對體重的比率在測試物種的預期值及個體間變異性之內。 組織病理學 所見
主要在DRG及三叉神經節(TRG)的周圍神經系統的感覺神經元內觀察到與測試物相關的所見。DRG/TRG的所見由神經元變性/壞死所組成。在脊髓及周圍神經的背側白質束中觀察到繼發性軸突變性(即軸突病變)，它們分別含有來自DRG神經元的中樞及周圍軸突。
總體而言，在所有AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)治療組的DRG中觀察到最小至輕度感覺神經元變性的所見。不太常見的是，在GTP-207治療組的TRG中觀察到神經元變性，嚴重度較低(最小)。對於DRG，分析每隻動物的三個節段(頸椎、胸椎、腰椎)，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中總共有54個DRG節段。分別有39% (21/54)及7% (4/54)的DRG節段被報告最小(等級1)及輕度(等級2)之神經元變性，而54% (29/54)的DRG並未顯示神經元變性。對於TRG，評估每隻動物的一個節段，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中總共有18個TRG節段。有44% (8/18)的TRG節段被報告最小(等級1)之神經元變性，而56% (10/18)的TRG並未顯示神經元變性。為了進一步評估向中樞及周圍伸出軸突的DRG神經元的變性，在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中，對每隻動物的三個脊髓節段(頸椎、胸椎、腰椎)進行總共54個脊髓節段的評估，且在AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中，對每隻動物的8條周圍神經(右及左側近端正中神經、遠端正中神經、坐骨神經、腓神經及脛神經)進行總共144條周圍神經的評估。
下文討論本研究中觀察到的DRG/TRG所見的發生率及累積嚴重度、以及相關的繼發性軸突病變之總結。
DRG/TRG 神經元變性。與測試物相關的組織病理學所見由DRG (其向中樞伸出軸突至脊髓的背側白質束中，並向周圍伸出軸突至周圍神經)及/或TRG內的神經元細胞體變性所組成。神經元變性的特徵在於中央染色質溶解、細胞質嗜伊紅球過多及嗜神經細胞作用(neuronophagia)。亦觀察到衛星細胞堆積(satellitosis)及單核細胞浸潤周圍及浸潤神經元細胞體。在更嚴重的情況下，觀察到神經節含有緻密、增殖的衛星細胞結節，但缺乏中央神經元細胞體。觀察到的最高嚴重度在DRG中為等級2 (輕度)，在TRG中為等級1(最小)。
在第90天，跨劑量組觀察到DRG/TRG內神經元變性的發生率及累積嚴重度的劑量依賴性增加。在低劑量組(3.0 x 10 12GC；2/3的動物，4/12的神經節，第2組)中觀察到最低的發生率及累積嚴重度(最小，等級1)。在中劑量組(1.0 x 10 13GC；3/3的動物，6/12的神經節，第3組)中觀察到更高的發生率及累積嚴重度(最小到輕度，等級1至等級2)，其次在高劑量組(3.0 x 10 13GC；3/3的動物，10/12的神經節，第4組)中觀察到最高發生率及累積嚴重度(最小到輕度，等級1至等級2)。在具有輕度(等級2)神經元變性的動物的DRG神經根中也觀察到輕度(等級2)至顯著(等級3)的神經內膜纖維化，包括中劑量組的2/3的動物(1.0 x 10 13GC，2/3的動物；動物19-024、動物18-205；第3組)及高劑量組的一隻動物(3.0 x 10 13GC，1/3的動物，動物18-225；第4組)。在一些動物(動物18-205及動物18-225)中，伴隨神經內膜纖維化的更高嚴重度的DRG退化與NCS評估中SNAP振幅的降低相關。
在第180天，DRG/TRG神經元變性的發生率及嚴重度並未出現劑量依賴性，因為在低劑量(3.0 x 10 12GC，3/3的動物，4/12的神經節，第6組)、中劑量(1.0 x 10 13GC，2/3的動物，5/12的神經節，第7組)及高劑量(3.0 x 10 13GC；2/3的動物，4/12的神經節，第8組)中觀察到相對相似的發生率及嚴重度(最小，等級1級)。
跨時間點比較，DRG/TRG神經元變性的發生率及嚴重度在第180天與第90天的低劑量(3.0 x 10 12GC)相似，且與第90天的中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)相比，在第180天降低。此一觀察結果暗示，從第90天到第180天，DRG/TRG的所見沒有進展或可能部分消退。
在第90天及第180天的屍檢同齡群中觀察到的個體DRG/TRG退化嚴重度分數顯示於圖100中。
脊髓軸突變性。DRG退化導致頸椎、胸椎及腰椎脊髓的背側白質束的繼發性軸突病變。軸突病變在顯微鏡下與軸突變性一致。該測試物相關的軸突變性的特徵在於擴張的髓鞘，伴隨或不伴隨骨髓巨噬細胞(myelomacrophage)及/或軸突碎片。脊髓軸突病變的嚴重度通常較低，大多數所見的範圍從最小(等級1)至輕度(等級2)。在第90天，在中劑量組的2/3的動物(1.0 x 10 13GC；動物18-205、動物19-024；第3組)觀察到中度(等級3)軸突病變，及在高劑量組的單一隻動物(3.0 x 10 13GC，1/3的動物；動物18-225；第4組)觀察到顯著(等級4)的軸突病變。
在第90天，脊髓軸突病變的嚴重度為劑量依賴性的，在低劑量(3.0 x 10 12GC)下從最小(等級1)增加到輕度(等級2)，在中劑量(1.0 x 10 13GC)為最小(等級1)至中度(等級3)，在高劑量組(3.0 x 10 13GC)為最小(等級1)至顯著(等級4)。然而，脊髓軸突病變的發生率似乎沒有劑量依賴性，因為發生率在低劑量(3.0 x 10 12GC；8/9的節段，第2組)、中劑量(1.0 x 10 13GC；9/9的節段，第3組)、及高劑量(3.0 x 10 13GC；9/9的節段，第4組)組之間相似。第90天軸突病變的嚴重度通常與動物18-205 (中劑量1.0 x 10 13GC；第3組)及18-225 (高劑量3.0 x 10 13GC；第4組)的中正中神經SNAP振幅的異常降低相關，分別表現出等級為3(中等)及4(顯著)之更嚴重的嚴重度。
在第180天，軸突病變的發生率在低劑量組(3.0 x 10 12GC；第6組，2/3的動物，5/9的節段)及中劑量組(1.0 x 10 13GC；第7組，2/3的動物，6/9的節段)之間相似，並在高劑量組(3.0 x 10 13GC；第8組，3/3的動物，9/9的節段)中最高。劑量組之間軸突變性的嚴重度相似，從最小(等級1)至輕度(等級2)。
跨時間點比較，從第90天至第180天在中劑量組(在第3組從最小至中度到在第7組從最小至輕度；1.0 x 10 13GC)及高劑量組(在第4組從最小至顯著到在第8組從最小至輕度；3.0 x 10 13GC)中觀察到背側白質束軸突變性的嚴重度的時間依賴性降低。跨第90天及第180天的時間點，低劑量組(3.0 x 10 12GC；第2及6組)及中劑量組(1.0 x 10 13GC；第3及7組)的軸突病變發生率也降低，表明時間依賴性消退。這些所見至少表明從第90天到第180天，背側白質束軸突變性並無進展。在第90天及第180天的屍檢同齡群中觀察到脊髓軸突病變的嚴重度分數(圖101)。有趣的是，與第90天的同齡群動物不同，第180天的同齡群中正中神經SNAP振幅降低的兩隻動物顯示與DRG及對應的軸突中的組織學所見沒有明顯相關性。鑑於SNAP值在第90天後呈上升趨勢，並在第150天(動物19-015)或第180天(動物18-219)恢復到此動物同齡群的正常範圍內之事實，這支持了DRG相關所見的可能的時間依賴性消退的假設。如前所述，動物18-219在第28天左手第二指受損傷，這也可能導致在該損傷癒合時其左側的正中神經SNAP振幅降低。
在第90天及第180天的屍檢同齡群中觀察到的個體脊髓軸突病變嚴重度分數顯示於圖101中。
周圍神經的軸突病變。DRG退化導致周圍神經(近端及遠端正中神經、坐骨神經、腓骨神經及脛神經)的繼發性軸突病變，這與在顯微鏡下的軸突變性一致。這種軸突變性在特徵上類似於先前描述的具有可變相關的單核細胞浸潤的軸突變性。周圍神經軸突變性通常為雙側的，但在給定的部分內是可變的。
在第90天，未觀察到明顯的周圍神經軸突變性的劑量反應。各劑量組的嚴重度範圍從最小到輕度；然而，與低劑量組(3.0 x 10 12GC；第2組，3/3的動物，16/30的節段)及高劑量組(3.0 x 10 13GC；第4組，3/3的動物，17/30的節段)相比，中劑量組(1.0 x 10 13GC；第3組，3/3的動物，21/30的節段)的發生率增加。
在第180天，周圍神經軸突變性的嚴重度在所有劑量組中皆為最小的。發生率呈劑量依賴性增加，低劑量組最低(3.0 x 10 12GC；第6組，2/3的動物，2/30的節段)，中劑量組輕微增加(1.0 x 10 13GC；第7組，3/3的動物，7/30的節段)，而高劑量組最高(3.0 x 10 13GC；第8組，3/3的動物，17/30的節段)。
比較不同時間點，觀察到從第90天到第180天，低劑量組及中劑量組的周圍神經軸突變性發生率的時間依賴性降低。高劑量組第90天及第180天時間點之間的發生率相似。此外，從第90天(最小[等級1]至輕度[等級2 級])到第180天(最小[等級1])，所有劑量的嚴重度均有時間依賴性降低。這些所見至少暗示從第90天到第180天周圍神經軸突變性沒有進展，並且可能消退。
在第90天時，在中劑量組(1.0 x 10 13GC；第3組，2/3的動物，7/30的節段)及高劑量組(3.0 x 10 13GC；第4組，1/3的動物，10/30的節段)的周圍神經中零星觀察到最小(等級1)至輕度(等級2)神經內膜纖維化。在第180天，高劑量組的一隻動物(動物19-015，3.0 x 10 13GC，第8組，2/30的節段)出現最小的嚴重度(等級1)，表明中劑量組及高劑量組的時間依賴性下降。神經內膜纖維化被認為繼發於軸突損傷，並且通常與更嚴重的軸突變性相關。它通常與正中神經SNAP振幅的異常降低相關，因為具有正中神經的神經內膜纖維化的3/3的動物表現出降低的SNAP振幅(動物18-205、18-225及19-015)。
在第90天及第180天的屍檢同齡群中觀察到的個體周圍神經軸突病變嚴重度分數顯示於圖102中。
從第90天及第180天的同齡群中，在所有劑量組的至少一個周圍神經中觀察到單核細胞浸潤，主要由淋巴細胞、漿細胞及很少的巨噬細胞構成。雖然已報告周圍神經中的單核細胞浸潤為非人類靈長類動物的背景，第90天的同齡群的中劑量組(1.0 x 10 13GC；第3組，3/3的動物，15/30的節段，16/150的累積嚴重度分數)的發生率及嚴重度顯著增加，被認為與AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)相關，並與軸突變性的最高發生率/累積嚴重度一致(1.0 x 10 13GC；第3組，3/3的動物，21/30的節段，28/150的累積嚴重度分數)。低劑量組及高劑量組的第90天(3.0 x 10 12GC，第2組，2/3的動物，6/30的節段，6/150的累積嚴重度分數；3.0 x 10 13GC；第4組，2/3的動物，2/30的節段，2/150的累積嚴重度分數)及第180天(3.0 x 10 12GC，第6組，2/3的動物，4/30的節段，4/150的累積嚴重度分數；3.0 x 10 13GC，第8組，2/3的動物，4/30的節段，4/150的累積嚴重度分數)的發生率及嚴重度(大部分為最小的，很少為輕度的)被認為是相對相似的。從第90天到第180天的中劑量觀察到周圍神經浸潤顯著減少，暗示中劑量組從第90天(1.0 x 10 13GC；第3組，3/3的動物，15/30的節段，16/150的累積嚴重度分數)到第180天(1.0 x 10 13GC；第7組，1/3的動物，1/30的節段，1/150的累積嚴重度分數)的周圍神經浸潤消退。
注射部位的所見。在第90天，ICM注射/CSF收集部位(及周圍區域)的GTP-207相關所見在所有劑量之GTP-207治療的動物中相似，包括骨骼肌及/或脂肪組織的輕度(等級2)至中度(等級3)單核細胞浸潤伴隨或不伴隨相關的肌纖維變化(例如，變性及/或再生)及很少的最小(等級1)間質纖維化。在對照動物中觀察到最小(等級1)骨骼肌纖維再生及中度(等級3)亞急性出血，並且由於缺乏細胞反應，這可能與屍檢前CSF收集程序相關。第4組的單一隻動物(3.0 x 10 13GC；動物18-225)中的最小表層血管周圍真皮浸潤被認為是偶發的。
在第180天，在所有劑量的ICM注射/CSF收集部位觀察到類似但較不嚴重的GTP-207相關所見，骨骼肌及/或脂肪組織的範圍從最小(等級1)到輕度(等級2)的單核細胞浸潤，沒有明顯的肌纖維變化或纖維化。從第90天到第180天，這些所見的嚴重度降低表明正在消退。
腦部所見。在17/18的測試物給藥動物及1/2的對照物給藥動物的腦膜中觀察到最小(等級1)至輕度(等級2)的單核細胞浸潤。劑量對發生率或嚴重度沒有影響。這可能表示背景所見或與程序相關的所見。在5/18的測試物給藥動物及1/2的對照物給藥動物的腦實質中觀察到零星的最小(等級1)單核細胞浸潤。 載體藥物動力學及排泄
在CSF及周邊血液中可檢測到AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA，CSF及周邊血液中的平均峰值濃度通常與劑量相關(圖103)。在CSF中，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA的濃度在第一個評估時間點(第7天)後迅速下降，到第60天時在所有動物中皆檢測不到。在血液中，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA濃度比在CSF中下降得更慢，這可能歸因於周邊血液細胞的轉導。在大多數動物中直到第90天皆可觀察到血液中可檢測水準的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA，到第180天沒有AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA可檢測到。
投予後第5天可在尿液及糞便中檢測到AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA，平均峰值濃度與劑量相關(圖107)。在糞便及尿液中，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA到投予後第60天在所有動物中皆檢測不到。 轉基因產物表現之評估
評估血清及CSF中轉基因產物表現(ARSA酶活性)(圖105)。應注意的是，歸因於對外來人類轉基因產物的NHP抗體反應，可測量的轉基因產物活性迅速喪失，預期該分析會變得複雜。
到AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207)投予後評估的第一個時間點，所有劑量組的大多數動物的血清及CSF中皆可檢測到ARSA酶活性(第14天的血清，第7天的CSF；圖105)。在血清中，在評估的第一個時間點(第14天)觀察到ARSA酶活性的劑量依賴性增加，在低劑量(3.0 x 10 12GC)、中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)的GTP-207下，分別比媒劑處理的對照水準增加約2.3倍、3.5倍及4.6倍(圖106)。正如預期，第14天後觀察到血清中ARSA酶活性的快速下降(圖105)，這與第28天時血清中抗人類ARSA抗體的表現相關(圖107)。在CSF中，在評估的第一個時間點(第7天)亦觀察到ARSA酶活性的劑量依賴性增加，在低劑量(3.0 x 10 12GC)、中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)的GTP-207下，分別比媒劑處理的對照水準增加約1.7倍、2.5倍及3.1倍(圖106)。如在血清中觀察到的，第14–28天後CSF中的ARSA酶活性迅速下降(圖105)，這與到第28天時CSF中抗人類ARSA抗體的表現相關(圖107)。
預先存在的對AAVhu68殼體的NAb的存在(由圖106中的填充形狀表示)似乎不影響CSF中的ARSA酶活性，支持在MLD疾病病患的目標器官系統(CNS及PNS)中達到治療性轉基因表現的潛力，無論NAb狀態如何。
結果總結： ●     在評估的所有劑量下ICM投予AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)均耐受性良好。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)對臨床及行為徵象、體重或神經及身體檢查沒有產生不良影響。沒有與GTP-207投予相關的血液及CSF臨床病理學異常，除了無症狀輕度短暫的CSF白血球增加，以及一些動物在第28天血清ALT最小自限性增加外，無需治療即可消退。 ●     AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)投予導致主要背根神經節(DRG)及三叉神經節(TRG)感覺神經元的最小至輕度變性，從而導致相關的中樞及周圍軸突的繼發性變性(軸突病變)。DRG病灶存在於大多數動物中，嚴重度從最小到輕度，而繼發性脊髓背側軸突病變的嚴重度從最小到顯著。在第90天，注意到DRG相關所見的發生率及嚴重度的劑量依賴性增加。在第180天，DRG相關所見的發生率及嚴重度並非劑量依賴性的，並相對低於第90天，這暗示這些所見沒有進展，或者它們在兩個屍檢時間點之間已部分消退。 ●     在三隻動物中(兩隻來自第90天，一隻來自第180天的同齡群)，組織病理學所見中所注意到的DRG相關異常係與正中神經SNAP振幅從基線水準降低超過正常個體動物變異性相關。早在第28天就可觀察到振幅降低，於更長期的追蹤，動物從第150天到第180天有改善的趨勢，這暗示該所見在兩個屍檢時間點之間沒有進展或部分消退，如由組織病理學所暗示的。 ●     到評估的第一個時間點(CSF第7天及血清第14天)時，在所有劑量組的動物中皆可檢測到CSF及血清中的轉基因表現(即ARSA酶活性)。在血清中，在第14天觀察到ARSA酶活性的劑量依賴性增加，在低劑量(3.0 x 10 12GC)、中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)分別比媒劑處理的對照水準增加約2.3倍、3.5倍及4.6倍。在CSF中，在第7天ARSA酶活性在低劑量(3.0 x 10 12GC)、中劑量(1.0 x 10 13GC)及高劑量(3.0 x 10 13GC)分別比媒劑處理的對照水準高約1.7倍、2.5倍及3.1倍。CSF中的轉基因產物表現不受預先存在的對載體殼體的NAb的存在的影響，支持在MLD疾病病患的目標器官系統(CNS及周圍神經系統[PNS])中達到治療活性的潛力，而不管NAb狀態如何。然而，觀察到可測量的轉基因產物活性迅速喪失，其可歸因於CSF及血清中NHP抗體對外來人類轉基因產物的反應。這種對外來人類轉基因產物的體液反應與異常臨床或組織病理學所見無關。 ●     AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)對幼年NHP的ICM投予導致CSF及血液中的載體分布，CSF及周邊血液中的平均峰值濃度與劑量相關。 ●     AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體排泄的評估證明，投予後5天尿液及糞便中可檢測到載體去氧核糖核酸(DNA)。在糞便及尿液中，到投予後第60天，AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體DNA在所有動物中皆檢測不到。 ●     在屍檢時，在大多數AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)治療的動物(16/18)的周邊血液單核細胞(PBMC)及/或組織淋巴細胞(肝臟、脾臟、骨髓、淋巴結)中可檢測到T細胞對人類轉基因產物的反應。與僅在1/18的動物中發現的T細胞對載體殼體的反應相比，T細胞對人類轉基因產物的反應更頻繁且強度更高。PBMC中T細胞對轉基因的反應大多為短暫的，在第28天(14/18的動物)具有高於終點時間點(5/18的動物)的普遍性。T細胞對載體殼體或人類轉基因產物的反應通常與任何異常臨床或組織病理學所見無關。在3隻高劑量及1隻中劑量動物中，第28天的短暫的抗轉基因T細胞反應與第28天的短暫的ALT升高之間可能存在關聯。 ●     在基線時，在3/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)治療的動物的血清中可檢測到預先存在的對載體殼體的NAb，隨後到第28天在18/18的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療的動物中觀察到NAb對AAVhu68殼體的反應。預先存在的對載體殼體的NAb與T細胞對殼體的反應無關，並與任何異常臨床或組織病理學所見無關。 ●     在沒有劑量限制性毒性下，評估的最高劑量(3.0 x 10 13GC [3.3 x 10 11GC/g腦])被認為是最大耐受劑量(MTD)。由於所有劑量組均存在無症狀的感覺神經元病灶，因此未定義NOAEL。 實施例 11- 非臨床腺相關病毒研究中的感覺神經元毒性
為了減少出現在AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG毒理學研究中的DRG感覺神經元的最小至輕度無症狀變性，構築包括drg脫靶miRNA序列的載體基因體。將rAAV載體基因體從5’到3’構築為CB7啟動子、工程化的hARSA編碼序列、四個連續的miRNA183、及rBG poly A，該四個連續的miRNA183(其具有AGTGAATTCTACCAGTGCCATA之序列，SEQ ID NO：20)被間隔子隔開，且每個間隔子皆獨立選自(A)GGAT；(B)CACGTG；或(C)GCATGC中的一或多者。此載體基因體被稱為AAV.CB7.CI.hARSAco. miRNA183.rBG，而包含此載體基因體及AAVhu68殼體的rAAV被稱為AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.miRNA183. rBG。類似於實施例1中所述的方法，進行包含此載體基因體的rAAV載體的生產。使用實施例2-10所述的方法及模式測試AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.miRNA183. rBG的功效及毒性。 實施例 12- 首次人類試驗
於具有由ARSA酶缺乏所引起的早發性(嬰兒晚期或少年早期)MLD的小兒病患(≥4個月齡)，藉由ICM單次注射投予而進行AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的1/2期、多中心、開放式、單臂劑量遞增研究。評估安全性及耐受性、藥效學、及臨床功效超過2年，且所有對象在AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG投予後追蹤5年，以進行安全性及耐受性、藥效學、疾病進展、及臨床結果的長期評估。
該研究由篩選階段所構成，該篩選階段用以確定每個潛在對象的資格，從大約第–35日到第–1日。在確認對象的資格以及父母/監護人讓孩子參與此研究的意願後，對象將接受基線評估，其包括腦部MRI、用以收集CSF之LP、抽血、尿液收集、生命徵象、ECG、身體檢查、神經學檢查、及臨床評估。於第–1日及第0日進行基線評估，並在基線時投予AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG之前重新確認資格。
在治療期，第0日早上允許對象入院。對象於第0日接受AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的單次ICM劑量，並在給藥後至少24小時留在醫院觀察。隨後的研究訪視發生在給藥後第7日、第14日、第30日、3個月、及6個月，然後在給藥後的前2年每6個月一次。於接下來的額外3年，長期追蹤(LTFU)訪視以每12個月一次的頻率進行，直至給藥後5年。
以如下所示的劑量水準之一來投予單一劑量之AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG。
同齡群1(低劑量)：依序納入三名合格對象(對象#1–3)，並投予低劑量的AAV.CB7.CI.hARSAco. rBG，在第一名及第二名對象之間有4週的安全觀察期。若未觀察到SRT，則在對同齡群1中的第三名對象投予AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG後4週，由安全委員會評估所有可用的安全性數據。
同齡群2(高劑量)：依序納入三名合格對象(對象#4–6)並投予高劑量的AAV.CB7.CI.hARSAco. rBG，在第四名及第五名對象之間有4週的安全觀察期。若未觀察到SRT，則安全委員會在對象#6被投予AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG後 4週評估所有可用的安全數據，包括來自同齡群1中對象的安全數據。
同齡群3(MTD，最大耐受劑量)：在安全委員會的正面建議下，另外6位對象(對象#7–12)被納入並以MTD投予單次ICM劑量AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG。對此同齡群中對象的給藥，每個對象之間並未以4週安全觀察期錯開。
高劑量組或低劑量同齡群共納入9名對象，總共12名對象(橫跨所有劑量)。應用安全裕度，以便為人類對象選擇的高劑量為NHP中等效MTD的30–50%。低劑量通常比選擇的高劑量少2–3倍，前提是其為超過動物研究中等效的按比例調整的MED的劑量。據理解，若可耐受則較高的劑量被預期為有利的。
由於早發性MLD係以一旦出現症狀後非常快速的病程為特徵，因此基於調查員對該主題的利益-風險評估，進行的研究被允許於同齡群1(低劑量)及同齡群2(高劑量)之第1位病患給藥後30日同時納入對象。於此種情況，同齡群中第二及第三位病患之間的給藥窗口(dosing window)至少為24小時，以觀察病患的急性毒性、過敏反應、及與程序相關的事件。鑑於此疾病的罕見性，兩位對象同時出現以進行治療的可能性被認為較低。提議的方法的基本原理為：因為病患經歷的快速疾病進展，錯過治療窗口的風險將超過在此同齡群中下一位病患給藥之前延長安全性追蹤的潛在利益。於病患在納入與治療之間經歷重大疾病進展這樣的情形被引述作為某些以HSC-GT治療的早發性MLD病患觀察到的不良結果的可能原因(Sessa et al., 2016)，強調了需要及時鑑別及治療處於疾病快速進展風險中的病患。
具有由ARSA酶缺乏引起的早發性(嬰兒晚期或少年早期)MLD的小兒病患(≥4個月齡)，表示未滿足需求最高的族群。被納入吾人提議的FIH試驗的彼等MLD病患可能具有0/0(兩個無效的ARSA對偶基因，沒有產生可檢測的功能性酶)或0/R(異型接合性(Heterozygosity)，其中一個無效的ARSA對偶基因及一個「殘餘的」ARSA對偶基因(R)編碼具有殘餘的功能活性的酶，其仍然可降解少量的髓硫脂)基因型。彼等顯示出破壞性的病程，具有運動及認知障礙均快速且可預測地下降，導致在發病數年內死亡。大多數早發性的病患無法使用改善病程進展的治療(disease-modifying treatment)。造血幹細胞移植(HSCT)未於此族群中提供益處，而造血幹細胞與基因療法(HSC-GT)為一種僅對症狀發生前的病患有效的研究性治療，此等病患佔早發性族群的少部分。
主要終點評估AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的安全性及耐受性。次要或探索性終點包括藥物動力學及藥效學性質(轉基因表現、生物標記活性、及成像參數)及臨床功效結果(粗大及精細動作功能、認知及語言發展、神經學檢查所見、行為及里程碑發展、以及父母報告的結果及生活品質評估)。選擇療效終點及追蹤時程以測量疾病進展的預防或穩定化。
因此，於吾人提議的FIH試驗中對膽囊病理進行監測，作為安全訊號及探索性終點兩者。
通過評估下列而評估在單次ICM劑量投予後的24個月內AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的安全性及耐受性：AE及SAE、生命徵象及身體檢查、神經學檢查、心電圖(ECG)、感覺神經傳導研究(用於評估DRG毒性)、實驗室評估(血清化學、血液學、凝血研究、肝功能測試[LFT]、尿液分析、以及CSF化學及細胞學)、及/或載體及轉基因產物的免疫原性。
為了評估AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG在治療後2年內對粗大動作功能的影響，藉由異染性白質失養症的粗大動作功能分類(GMFC-MLD)進行測量。
AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG功效的其它量度包括以下： 基於以下終點評估AAV.CB7.CI.hARSACO.RBG單次ICM劑量投予後超過2年的藥效學及生物活性：CSF及血清中ARSA的水準； 藉由評量下列以評估AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG在單次ICM投予後2年內的功效：粗大動作功能評量(GMFM)、神經-認知(藉由貝萊嬰兒發展量表[BSID‑III]、魏氏兒童智力量表第五版[WISC-V]所測量的總智商[IQ]及子域智商)、存活、神經學臨床檢查(NCE)、尺神經、腓深神經、正中神經、腓腸神經之NCV、藉由達成的年齡、喪失的年齡及保持或獲得動作里程碑的兒童的百分比所評估的動作里程碑達成(如世界衛生組織[WHO]基準所定義)； 藉由評量下列以進一步評估AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG在投予單次ICM劑量後的2年內的功效：由癲癇發作日記獲得的癲癇發作的發病年齡及頻率、文蘭適應行為量表第三版(Vineland‑III)、藍斯基表現指數、兒童生活品質量表(PedsQL及PedsQL-IS)、照護者/父母的生活品質； 藉由評量下列以進一步評估AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG在單次ICM劑量投予後2年內的藥效學作用：藉由MRI測量的CNS髓鞘化(脫髓鞘負荷及樣式)及白質萎縮、藉由質子磁振頻譜(MRS)測量的神經元代謝物N-乙醯天冬胺酸(NAA)、肌醇(mI)、膽鹼(Cho)及乳酸鹽(Lac)水準、CSF髓硫脂及溶血髓硫脂水準、視覺誘發電位(VEP)、腦幹聽覺誘發反應(BAER)、膽囊壁增厚之超音波評估。
納入基準包括以下： (i)基於低於正常範圍的ARSA活性之MLD的生化及分子診斷的記錄，以及兩種導致疾病的ARSA對偶基因之鑑定，已知或新穎的突變之任一者。於新穎突變的情形，24小時尿液收集必須顯示出升高的髓硫脂水準； (ii)≥4個月齡； (iii)症狀發生前的對象必須具有下列任一者： 患MLD的年長兄弟姊妹(指示病例)，其症狀發作年齡＜7歲。基於指示病例的症狀發作年齡及其ARSA基因型，對象被分類為嬰兒晚期、少年早期或嬰兒中晚期/少年早期，如下所示：嬰兒晚期：指示病例的症狀發作≤30個月齡及典型的基因型 0/0；少年早期：指示病例的症狀發作＞30個月齡且＜7歲，具有典型的基因型0/R；嬰兒中晚期/少年早期：指示病例的症狀發作＜7歲，但不能明確地將指示病例特徵化為嬰兒晚期或少年早期；或 若於症狀發生前的兒童被診斷為MLD且無患病的年長兄弟姊妹(例如，偶發或經由新生兒篩檢(當可取得時))，可用數據的總體強烈暗示對象具有MLD的早發性變異型，可能受益於基因療法，且對象年齡小於7歲，然後經過試驗委託者醫療監督人員(Sponsor Medical Monitor)的討論及核准後，該對象才被視為符合資格； (iv)有症狀的嬰兒晚期對象只要其具有表現為下列的MLD的輕度臨床或神經學表現，則為符合資格： 動作里程碑之預期達成的延遲，例如延遲達成獨立站立或行走(＞WHO里程碑範圍的第95個百分位數) 及/或 NCE的輕度異常，包括但不限於音調提高、痙攣或反射增強(hyperreflexia)。若對象已達成獨立行走，則輕度共濟失調的徵象為可接受的，前提是對象可獨立行走至少10步； (v)有症狀的少年早期對象若在NCE上有輕度/中度異常，則為有資格，包括但不限於：音調提高、痙攣、反射增強或不需要步行輔助設備的輕度步態異常； (vi)父母/監護人簽署並註明日期的知情同意書。
排除基準包括以下： 達成的動作里程碑的退化證據； 需要步行輔助設備之能夠步行的對象； 基於總IQ＜70的認知能力缺陷的EJ MLD對象； 在研究者之意見下，可能會混淆研究結果的解釋之任何不可歸因於MLD的臨床上顯著的神經認知缺陷； 人類免疫不全病毒(HIV)或C型肝炎(HepC)的測試結果陽性的病患； 在研究者之意見下，會使對象處於過度風險下、或者會干擾研究產品安全性或功效結果的評估與解釋之任何當前或先前的狀況或身體檢查或實驗室測試所見； ICM投予程序的任何禁忌症，包括螢光成像的禁忌症； MRI或LP的任何禁忌症； 在篩選前4週內或該臨床研究中使用的研究產品的5個半衰期內，參加利用研究產品之任何其它臨床研究；以時間較長者為準； 曾經歷過同種異體的HSCT並有供予者來源的殘餘細胞的證據； 先前的基因療法。
投予途徑及程序詳細描述於下。
於第0日，將AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG作為單一劑量投予至住院對象，其係經由即時CT導引的枕骨下注射到腦大池中。
於第0日，藉由與研究相關的研究藥房製備含有5.6mL的適當的效價之AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG的注射器，並將其遞送至手術室。
研究藥物投予前，先將對象麻醉，插管，然後使用無菌技術將注射部位準備好並蓋布。進行LP以移除預定體積的CSF，然後IT注射碘化造影劑，以幫助將腦大池的相關解剖學結構可視化。可於插入針頭之前或期間投予IV造影劑，以替代IT造影劑。使用IV或IT造影劑的決定由執行該程序的介入醫師裁量。於CT螢光鏡的導引下，將一根脊椎穿刺針(22–25 G)推進到腦大池中。較大的導引針可用於輔助放置針頭。確認針頭放置後，將延伸套件連接到脊椎穿刺針上，並以CSF填充。基於介入醫師的裁量，可將含有造影劑的注射器連接至延伸套件，並注入少量以確認針頭在腦大池中的放置。確認針頭放置後，將含有AAV.CB7.CI.hARSAco. rBG的注射器連接到延伸套件。耗費1–2分鐘緩慢注入注射器中的內容物，而遞送5.0 mL的體積。
進行安全評估，包括不良事件(AE)及嚴重不良事件(SAE)的收集、身體及神經檢查、生命徵象、臨床實驗室測試(血清化學、血液學、凝血、LFT、尿液分析)、ECG、神經傳導研究、及CSF細胞學及化學(細胞計數、蛋白質、葡萄糖)。在同齡群1中的前三個對象之後及同齡群2中的前三個對象之後進行安全性評估。
對次要及探索性終點進行統計比較。對每位對象，將每個時間點的測量值與基線值進行比較，以及與來自年齡相符的健康對照的數據及來自具有可比較的同齡群特徵的MLD病患的自然史數據(適用於每個終點)進行比較。
所有數據皆呈示於對象的數據列表中。使用頻率及百分比而匯總類別變數，並使用描述性統計而匯總連續變數(非遺漏觀測值的數量、平均值、標準差、中位數、最小值、及最大值)。適當呈現圖形顯示。 實施例 13-AAVhu68+ 去醯胺化
分析AAVhu68的修飾。簡而言之，使用與此研究無關的載體基因體生產AAVhu68載體，各個均於293細胞中使用習用的三重轉染法而生產。有關此等技術的一般說明，參見例如Bell CL, et al., The AAV9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice. J Clin Invest. 2011;121:2427–2435。簡而言之，編碼待包裝序列(表現自雞β-肌動蛋白啟動子的轉基因、來自猴病毒40(SV40)晚期基因的內含子及poly A)且兩側為AAV2反向末端重複序列的質體，係藉由與編碼AAV2 rep基因及AAVhu68 cap基因的質體以及腺病毒輔助質體(pAdΔF6)之HEK293細胞的三重轉染而被包裝。可使用CsCl梯度離心而純化所生成的AAV病毒顆粒，濃縮並冷凍以備之後使用。
變性及烷基化：於100 µg解凍的病毒製劑(蛋白質溶液)中，添加2 µl之1M二硫蘇糖醇(DTT)及2µl之8M胍鹽酸鹽(GndHCl)，並在90 oC下培養10分鐘。使溶液冷卻至室溫，然後添加5µl新鮮製備的1M碘乙醯胺(IAM)，並於黑暗中於室溫培養30分鐘。30分鐘後，藉由添加1 µl之1M DTT淬滅烷基化反應。
消化：在變性的蛋白質溶液中，以將最終GndHCl濃度稀釋至800 mM的體積來添加20 mM碳酸氫銨，pH 7.5-8。添加胰蛋白酶溶液以使胰蛋白酶與蛋白質的比率為1:20，並於37°C下培養隔夜。消化後，添加TFA至最終濃度0.5%，以淬滅消化反應。
質譜分析：藉由UHPLC-MS/MS分析大約1微克之合併的消化混合物。LC係在UltiMate 3000 RSLCnano系統(Thermo Scientific)上進行。移動相A為具有0.1%甲酸的MilliQ水。移動相B為具有0.1%甲酸的乙腈。LC梯度係耗費15分鐘由4% B升至6% B，然後以25分鐘升至10% B(共40分鐘)，然後以46分鐘升至30% B(共86分鐘)。樣本直接加載至管柱。管柱尺寸為75 cm x 15 um I.D.並裝有2微米C18介質(Acclaim PepMap)。LC與四極Orbitrap質譜儀(Q-Exactive HF，Thermo Scientific)經由使用離子源的nanoflex電噴灑游離而連接。將該管柱加熱至35℃，並施加2.2 kV的電噴灑電壓。質譜儀係按程序進行以自前20個離子獲取串聯式質譜。完整的MS解析度為120,000，MS/MS解析度為30,000。歸一化碰撞能量(normalized collision energy)設為30，自動增益控制設為1e5，最大填充MS設為100 ms，最大填充MS/MS設為50 ms。
數據處理：質譜儀RAW數據檔案係藉由BioPharma Finder 1.0(Thermo Scientific)分析。簡而言之，所有搜索皆要求10 ppm的前驅物質量耐受性、5ppm的片段質量耐受性、胰蛋白酶切割最多1個漏失切割、半胱胺酸烷基化的固定修飾、甲硫胺酸/色胱酸氧化的可變修飾、天冬醯胺酸/麩醯胺酸去醯胺化、磷酸化、甲基化、及醯胺化。
於下表中，T係指胰蛋白酶，C係指胰凝乳蛋白酶。
修飾AAVhu68
酶 T T T T C C C C T T T
涵蓋% 93.6 92 93.1 92.5 90.2 89.7 91.1 88.9 98.9 97 94.6 92.4
+去醯胺化(Deamid)
~N35
N57+Deamid 87.6 95.5 89.3 88.2 90.5 96.3 86.4 84.8 100.0 100.0 99.0 92.7
N66+Deamid 4.7
N94+Deamid 11.3 10.9 11.0 5.3 11.6 10.4 10.8 5.6 5.0 11.1 5.4 16.0
N113+Deamid 1.8
~N253+Deamid 17.7 22.0 21.1 15.0 17.0 22.6 20.5 15.6 4.2 5.5
Q259+Deamid 35.2 25.6 21.0 35.4 26.3 20.9 9.2
~N270+Deamid 16.4 25.1 23.2 16.6 15.9 24.9 23.5 16.1 0.2
~N304+Deamid 2.6 2.9 2.8 1.3 2.5 2.8 2.9 1.3 16.6 10.3
~N314+Deamid 6.5
N319+Deamid 0.3 2.8 2.8 0.2 2.9 2.8 0.2
N329+Deamid 72.7 85.6 89.1 86.8 71.0 87.2 88.7 84.7 85.5 79.4 78.9 91.8
N336+Deamid 30.8 9.3 100.0 31.0 9.2 95.7
~N409+Deamid 21.3 22.9 23.9 24.0 22.0 23.4 24.7 24.2
N452+Deamid 98.8 99.7 99.2 100.0 98.9 97.3 98.1 95.2 98.2 68.7 67.4 49.4
N477+Deamid 4.4 4.3 4.3 2.6 4.5 4.4 4.3 2.6 0.8
N512+Deamid 97.5 97.9 95.3 95.7 92.2 91.8 99.2 96.1 99.7 98.2 87.9 75.7
~N515+Deamid 8.2 21.0 16.0 8.3 21.0 16.5 0.0 2.5 3.0 15.1
~Q599+Deamid 4.0 15.4 10.1 13.6 4.0 15.5 10.0 13.8 15.8
N628+Deamid 5.3 5.6 5.4 0.0 5.4 0.0
N651+Deamid 0.9 1.6 1.6 0.5
N663+Deamid 3.4 3.5 3.7 3.4 0.0 3.4 3.6
N709+Deamid 0.6 0.8 20.2 0.6 0.6 0.8 19.8 0.6 0.3 1.3 0.1 0.2
N735 25.0 42.7 21.7
+乙醯化(Ac):
K332+Ac 100.0
~K693+Ac 13.0 13.5
~K666+Ac 93.8
~K68+Ac 59.2
+異構化(Iso):
D97+Iso 0.5 0.4 0.4 0.2 0.5 0.4 0.2
D107+Iso 0.3 0.3 0.3
D384+Iso 0.8 0.9
+磷酸化(Phos)
S149+Phos 5.8 5.7 5.2 9.8 5.7 5.9 5.2 9.9
~S499+Phos 30.6
~T569+Phos 0.9
~S586+Phos 3.6
+氧化
~W23+Oxi 4.7 5.5 4.8 5.5
W247+Oxi 1.5 0.4 0.7 1.4
W247+Oxi為犬尿胺酸(kynurenine) 0.1 0.1
W306+Oxi 0.7 0.9 1.6 1.8 0.7 1.0 1.6 1.8
W306+氧化為犬尿胺酸 0.3 0.3
M404+Oxi 0.1 0.2 0.1 0.2
M436+Oxi 4.9 10.2 23.0 4.8 10.2 22.6
~M518+Oxi 29.9 1.5 10.6 29.9 1.5 10.5
~M524+Oxi 18.8 31.6 52.7 18.4 31.1 52.5 14.2
M559+Oxi 19.0 21.6 19.6 20.9 19.6 21.3 20.1 20.9
~M605+Oxi 12.2 15.2 12.8 14.8
W619+Oxi 1.0 0.6 1.5 1.0 0.6 1.5
W619+氧化 20.3
~M640+Oxi 23.5 64.2 24.6 22.4 21.1 25.6
W695+Oxi 0.3 0.4 0.4 0.3 0.4 0.4
+醯胺化
~D297+醯胺化 72.9 73.3
於AAVhu68殼體蛋白質的情形，通常顯示4個殘基(N57、N329、N452、N512)去醯胺化水準＞70%，且於不同批次中多數情形＞90%。其它天冬醯胺酸殘基(N94、N253、N270、N304、N409、N477及Q599)於各個批次中亦顯示出高達約20%的去醯胺化水準。最初使用胰蛋白酶消化物而鑑定去醯胺化水準，並以胰凝乳蛋白酶消化物驗證。
對成年恆河獼猴進行AAVhu68.CB7.CI.eGFP. WPRE.rBG(3.00 x 10 13GC)的ICM投予，並於28日後進行屍體剖檢以評估載體的轉導。於腦的廣泛區域中觀察到AAVhu68之轉導。如此，AAVhu68殼體提供於CNS中交叉矯正的可能性。
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本說明書中引用的所有文件皆藉由引用併入本文，如優先權文件美國專利臨時申請號63/341,636 (2022年5月13日申請)；美國專利臨時申請號63/331,367 (2022年4月15日申請)及美國專利臨時申請號63/297,958 (2022年1月10日申請)。雖然已經參考特定具體實施例描述了本發明，但是應當理解，可在不脫離本發明的精神的情況下進行修改。此類修改旨在落入後附之申請專利範圍的範疇內。
無
圖1提供工程化的hARSA編碼序列(SEQ ID NO：1，即，SEQ ID NO：3之nt 7至nt 1527及SEQ ID NO：5之nt 1968至nt 3488)。 圖2提供AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG載體基因體的線性圖譜。該載體基因體係為了在普遍存在之CB7啟動子的控制下表現工程化的版本的人類ARSA (hARSAco)。CB7係一種雜合啟動子元件，至少包含一個CMV IE強化子及一個雞BA啟動子。ARSA，芳基硫酸酯酶A；BA，β-肌動蛋白；CMV IE，巨細胞病毒立即早期；ITR，反向末端重複序列；PolyA，多腺苷酸化；及rBG，兔β-球蛋白。 圖3提供稱為pENN.AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG. KanR的順式質體的線性圖譜。BA，β-肌動蛋白；bp，鹼基對；CMV IE，巨細胞病毒立即早期；hARSAco，人類芳基硫酸酯酶A (工程化的)；ITR，反向末端重複序列；KanR，康黴素(kanamycin)抗性；Ori，複製起始序列；PolyA，多腺苷酸化；rBG，兔β-球蛋白。顯示一種載體基因體，其在線性分子的各端皆有一個130-bp的反轉導向(flop-oriented)AAV-ITR序列，從完整的145-bp ITR末端縮短15 bp。包封於AAV殼體中的AAV.CB7.CI.hARSAco.rBG載體基因體可包含完整的145-bp ITR，而非130-bp ITR。 圖4提供反式質體pAAV2/hu68.KanR之線性映射圖。AAV2，腺相關病毒血清型2；AAVhu68，腺相關病毒血清型hu68；bp，鹼基對；Cap，殼體；KanR，康黴素抗性；Ori，複製起始序列；Rep，複製酶。 圖5A及圖5B提供一種腺病毒輔助質體pAdDeltaF6(KanR)。圖5A顯示從親代質體pBHG10通過中間體pAdΔF1及pAdΔF5而衍生至輔助質體pAdΔF6。圖5B顯示pAdΔF6中的胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因被康黴素抗性基因取代以產生pAd∆F6(Kan)。 圖6提供用於生產AAVhu68.hARSAco載體的製造過程流程圖。AAV，腺相關病毒；AEX，陰離子交換；CRL，Charles River Laboratories；ddPCR，液滴數位聚合酶連鎖反應；DMEM，杜爾貝寇氏改良的伊戈培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium)；DNA，去氧核糖核酸；FFB，最終調配緩衝液；GC，基因體拷貝；HEK293，人類胚胎腎臟293細胞；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；PEI，聚乙亞胺(polyethylenimine)；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TFF，切向流過濾；USP，美國藥典；WCB，工作細胞庫。 圖7提供AAVhu68.hARSAco載體的製造過程流程圖。Ad5，腺病毒血清型5；AUC，分析型超速離心；BDS，原料藥物質；BSA，牛血清白蛋白；CZ，Crystal Zenith；ddPCR，液滴數位聚合酶連鎖反應；E1A，早期區1A(基因)；ELISA，酵素結合免疫吸附分析；FDP，填充的藥品；GC，基因體拷貝；HEK293，人類胚胎腎臟293細胞；ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；KanR，康黴素抗性(基因)；MS，質譜分析；NGS，次世代定序；qPCR，定量聚合酶連鎖反應；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳；TCID 50，50%組織培養感染劑量；UPLC，超高效液相層析；USP，美國藥典。 圖8顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑之小鼠腦中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。在第0天，C57BL/6J (WT)小鼠被ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)或對照物(PBS[媒劑])。在第21天的屍檢中，收集腦用於ARSA酶活性測定以評估轉基因產物表現。誤差槓表示標準差。 圖9顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑之小鼠血清中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。在第0天，C57BL/6J (WT)小鼠被ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)或對照物(PBS[媒劑])。在第7天及在第21天屍檢中，收集血清用於ARSA酶活性測定以評估轉基因產物表現。誤差槓表示標準差。 圖10顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑之小鼠肝臟中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。在第0天，C57BL/6J (WT)小鼠被ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)或對照物(PBS[媒劑])。在第21天的屍檢中，收集肝臟用於ARSA酶活性測定以評估轉基因產物表現。誤差槓表示標準差。 圖11顯示在ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)或媒劑後，小鼠血清中針對轉基因產物的抗體(抗人類ARSA抗體)。在第0天，C57BL/6J (WT)小鼠被ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)或對照物(PBS[媒劑])。在第7天及在第21天屍檢時，收集血清，並藉由ELISA測量針對轉基因產物的抗體(抗人類ARSA抗體)。誤差槓表示標準差。 圖12顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG或媒劑之小鼠腦中，於神經元及寡樹突細胞中的轉基因產物表現(HA IF)。在第0天，C57BL/6J (WT)小鼠被ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG (1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)或對照物(PBS[媒劑])。在載體投予後第21天，對小鼠進行屍檢，並收集腦組織。對組織進行切片及免疫染色以使人類ARSA (綠色；抗HA抗體)及寡樹突細胞(紅色：抗OLIG2抗體)可視化。腦皮質的代表性影像以20倍放大倍率顯示，曝光500 ms。裁切及放大視圖(底行)顯示來自表現ARSA的皮質下白質的寡樹突細胞。 圖13顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG或媒劑之小鼠血清中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。在第0天，C57BL/6J (WT)小鼠被ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG (1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)或對照物(PBS[媒劑])。在第7天及在第21天屍檢中，收集血清用於ARSA酶活性測定以評估轉基因產物表現。誤差槓表示標準差。 圖14顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG或媒劑之小鼠肝臟中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。在第0天，C57BL/6J (WT)小鼠被ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG (1.0 x 10 10GC或1.0 x 10 11GC)或對照物(PBS[媒劑])。在第21天的屍檢中，收集肝臟用於ARSA酶活性測定以評估轉基因產物表現。誤差槓表示標準差。 圖15顯示ICM AAV投予後NHP的體重。成年NHP (N=2)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC。在指定的時間點測量體重。 圖16顯示ICM AAV投予後NHP的CSF白血球計數。成年NHP (N=1雌性RA2397及N=1雄性RA2477)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC。在指定的時間點評估CSF白血球計數。虛線表示恆河獼猴淋巴細胞增多症(lymphocytic pleocytosis)的截止閾值(≥6 WBC/μL CSF)。 圖17A及17B顯示ICM AAV投予後，NHP的腦脊髓液(CSF)及血清中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。成年NHP (N=2)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC。在指定的日期藉由ARSA酶活性測定而測量CSF及血清中的轉基因產物表現。 圖18顯示在ICM AAV投予後在NHP組織中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。成年NHP (N=1雌性RA2397，N=1雄性RA2477)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC。來自一項非相關之研究的兩隻動物係靜脈內地接受編碼綠色螢光蛋白(GFP)之AAV9 (RA2172，雌性)或AAV9-PHPB (RA2145，雄性)(2.0 x 10 13GC/Kg)，被包括作為恆河獼猴中ARSA活性之內源性水準的對照。在第21天屍檢時收集的指定組織中，藉由ELISA測量人類ARSA蛋白。 圖19顯示在ICM AAV投予後在NHP的脊髓及周圍神經中的轉基因產物表現(HA標籤IHC)。成年恆河獼猴接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC (N=2)。在第21天屍檢時收集神經系統組織，使用辨識血球凝集素(HA)標籤的抗體進行IHC染色(棕色沉澱物)。顯示來自動物RA2397之AAV治療的恆河獼猴的背根神經節(DRG)、脊髓運動神經元及周圍神經的代表性影像。 圖20A及圖20B顯示ICM AAV投予後，NHP的三叉神經節(TRG)及周圍神經中的轉基因產物表現(HA標籤IF)。成年恆河獼猴接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco-HA.rBG，劑量為3.0 x 10 13GC (N=2)。在第21天屍檢時收集神經系統組織，使用辨識HA標籤的抗體進行IF染色(紅色染色)。顯示代表性影像(圖20A)來自另一研究之未處理的年齡相符之恆河獼猴的正中神經切片與本研究中的AAV治療之動物RA2397、及(圖20B) RA2397恆河獼猴的TRG及周圍神經。 圖21顯示ICM AAV投予後NHP的體重。成年NHP (N=2/組)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)。在指定的時間點測量體重。 圖22顯示ICM AAV投予後NHP的CSF白血球計數。成年NHP (N=2/組)接受單次ICM投予AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)。在指定的時間點評估CSF白血球計數。 圖23A及23B顯示ICM AAV投予後，NHP中的DRG及脊髓病理學所見(finding)。成年NHP (N=2/組)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)。在屍檢時收集DRG及脊髓組織(頸椎、胸椎及腰椎)並進行組織病理學評估。對於各DRG節段的神經元細胞體變性伴隨單核細胞浸潤的所見及脊髓背側白質束中軸突病變(axonopathy)的所見被分配以下的嚴重度分數：等級1=最小，等級2=輕度，等級3=中度，等級4=顯著；等級5=嚴重。 圖24A及24B顯示ICM AAV投予後，NHP的CSF及血清中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。成年NHP (N=2/組)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)。在指定的研究日，藉由ELISA測量CSF及血漿中的人類ARSA蛋白。 圖25A及25B顯示ICM AAV投予後在NHP的CSF及血清中的針對轉基因產物的抗體(抗人類ARSA抗體)。成年NHP (N=2/組)接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)。在指定的研究日，藉由ELISA測量CSF及血清中的抗人類ARSA抗體。 圖26顯示ICM AAV投予後NHP腦中的轉基因產物表現(人類ARSA免疫組織化學)。成年食蟹獼猴接受單次ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=2)。未處理之年齡相符的食蟹獼猴作為對照(N=2)。治療後42±2天對動物進行屍檢，獲得腦，使用辨識人類ARSA之抗體進行IHC(棕色沉澱物)。顯示一隻AAV治療之動物的腦皮質、海馬迴、視丘及小腦切片的代表性影像(右圖)，以及用於訊號比較之未處理的對照的切片(左圖)。 圖27顯示ICM AAV投予後NHP之脊髓及背根神經節中的轉基因產物表現(人類ARSA免疫組織化學)。成年食蟹獼猴接受單次ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=2)。未處理之年齡相符的食蟹獼猴作為對照(N=2)。治療後42±2天對動物進行屍檢，獲得頸椎、胸椎及腰椎脊髓及DRG之切片，使用辨識人類ARSA之抗體進行IHC(棕色沉澱物)。顯示一隻AAV治療之動物的切片的代表性影像(右圖)，以及用於訊號比較之未處理的對照的切片(左圖)。 圖28A及28B顯示未治療之Arsa–/–小鼠的體重。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每月測量體重，直至約9個月齡(第3–4組)或約15個月齡(第1–2組)時進行屍檢。數據表示為平均值±標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析(2-way ANOVA)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖29顯示AAV-GAL3ST1處理之Arsa–/–小鼠的體重。在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理之成年(約3個月大)雄性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=5，第5組)。亦包括年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=6，第6組)。每月測量一次體重，直到約9個月齡時進行屍檢。數據表示為平均值±標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，**p＜0.01。 圖30顯示未治療之Arsa–/–小鼠的臨床評分評估。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每隔一週對每隻動物進行標準化臨床評估，直至在研究第27週(研究第180天；第3組及第4組)或研究第52週(研究第360天；第1組及第2組)進行屍檢。呈現(A)在整個研究過程中所有動物的平均臨床分數、及(B)研究第28週與研究第52週之個別動物的臨床分數的比較。誤差槓表示標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖31顯示AAV-GAL3ST1處理之Arsa–/–小鼠的臨床評分評估。在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理之成年(約3個月大)雄性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=5，第5組)。亦包括年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=6，第6組)。每隔一週對每隻動物進行標準化臨床評估，直至在研究第27週(研究第180天)進行屍檢。數據表示為平均分數±標準差。 圖32顯示未治療之Arsa–/–小鼠的窄沿測試(ledge test)。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每隔一週對每隻動物進行窄沿測試，直至在研究第27週(研究第180天；第3組及第4組)或研究第52週(研究第360天；第1組及第2組)進行屍檢。數據表示為平均分數±標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖33顯示AAV-GAL3ST1處理之Arsa–/–小鼠的窄沿測試。在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理之成年(約3個月大)雄性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=5，第5組)。亦包括年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=6，第6組)。每隔一週對每隻動物進行窄沿測試，直至在研究第27週(研究第180天)進行屍檢。數據表示為平均分數±標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，**p＜0.01。 圖34A–圖34B顯示未治療之Arsa–/–小鼠的RotaRod分析。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每月對每隻動物進行RotaRod評估，直至在研究第180天(第3組及第4組)或研究第360天(第1組及第2組)進行屍檢。呈現(A)在整個研究過程中所有動物的平均落下潛伏期(latency to fall)、及(B)在研究第360日(僅第1組及第2組)的平均落下潛伏期。誤差槓表示標準差。 圖35顯示AAV-GAL3ST1處理之Arsa–/–小鼠的RotaRod分析。在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理之成年(約3個月大)雄性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=5，第5組)。亦包括年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=6，第6組)。每月對每隻動物進行RotaRod評估，直至在研究第180天進行屍檢。數據表示為每組中所有動物的平均落下潛伏期±標準差。 圖36A及36B顯示未治療之Arsa–/–小鼠測量支撐基礎(base of support)的窄道步態分析(catwalk gait analysis)。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每60天對小鼠進行步態分析，使用CatWalk XT系統測量支撐基礎。呈現(圖36A)前肢的平均支撐基礎及(圖36B)後肢的平均支撐基礎。數據表示為平均值±平均值的標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05，****p＜0.0001。 圖37顯示未治療之Arsa–/–小鼠測量步頻(cadence)的窄道步態分析。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每60天對小鼠進行步態分析，使用CatWalk XT系統測量步頻。數據表示為平均值±平均值的標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05。 圖38顯示未治療之Arsa–/–小鼠測量步序(step sequence)的窄道步態分析。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每60天對小鼠進行步態分析，使用CatWalk XT系統測量步序。數據表示為平均值±平均值的標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05。 圖39顯示未治療之Arsa–/–小鼠測量步幅的窄道步態分析。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每60天對小鼠進行步態分析，使用CatWalk XT系統測量各肢體(右前、右後、左前、及左後)的步幅。數據表示為平均值±平均值的標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，**p＜0.01。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，****p＜0.0001。 圖40顯示未治療之Arsa–/–小鼠測量最大接觸面積的窄道步態分析。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。每60天對小鼠進行步態分析，使用CatWalk XT系統測量各肢體(右前、右後、左前、及左後)的最大接觸面積。數據表示為平均值±平均值的標準差。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05。 圖41顯示未治療之Arsa–/–小鼠腦中的溶酶體相關膜蛋白1 (LAMP-1) IHC。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。小鼠在約9個月齡或約15個月齡時進行屍檢。將腦收集、切片及染色以評估溶酶體貯積病灶(LAMP-1 IHC；棕色沉澱物)。呈現皮質、小腦及腦幹的代表性影像。 圖42A及42B顯示未治療之Arsa–/–小鼠腦及脊髓中LAMP-1陽性區域的量化。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。小鼠在約9個月齡或約15個月齡時進行屍檢。將腦及脊髓收集、切片及染色以評估溶酶體貯積病灶(LAMP-1 IHC)。使用影像分析軟體量化LAMP-1陽性區域的百分比。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖43顯示未治療之Arsa–/–小鼠腦中的GFAP IHC。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。小鼠在約9個月齡或約15個月齡時進行屍檢。將腦收集、切片及染色以評估星狀細胞增生(astrogliosis)/神經發炎(GFAP IHC；棕色沉澱物)。呈現皮質、海馬迴、小腦、腦幹及脊髓的代表性影像。 圖44A及44B顯示未治療之Arsa–/–小鼠腦及脊髓中神經膠原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性區域的量化。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。小鼠在約9個月齡或約15個月齡時進行屍檢。將腦及脊髓收集、切片及染色以評估星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC)。使用影像分析軟體量化GFAP陽性區域的百分比。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05。 圖45顯示未治療之Arsa–/–小鼠的腦及腎臟中藉由艾爾遜藍(Alcian blue)染色之髓硫脂貯積的組織學評估。在研究第0天，未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。小鼠在約9個月齡或約15個月齡時進行屍檢。將腦及腎臟收集、切片並染色以評估髓硫脂貯積(艾爾遜藍染色；藍色沉澱)。呈現第1組及第2組小鼠之皮質及腎臟的代表性影像。箭頭表示腦中的髓硫脂沉積物。 圖46顯示AAV-GAL3ST1處理之Arsa–/–小鼠的腎臟、腦、坐骨神經及脊髓中藉由艾爾遜藍染色之髓硫脂貯積的組織學評估。在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理之成年雄性Arsa–/–小鼠(約3個月大)被納入自然史研究(N=5，第5組)。亦包括年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=6，第6組)。在約9個月齡時進行屍檢。將腎臟、坐骨神經、腦及脊髓收集、切片並染色以評估髓硫脂貯積(艾爾遜藍染色；藍色沉澱)。呈現第5組及第6組小鼠的代表性影像。 圖47A–47C顯示來自未治療之Arsa–/–小鼠及AAV-GAL3ST1處理之Arsa–/–小鼠腦組織中的髓硫脂分析。在研究第0天，未治療之成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)，且包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J野生型小鼠(WT)作為對照(N=13，第2組；N=10第4組)。此外，在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理的成年(2–3個月大)雄性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=5，第5組)，且包括年齡相符的雄性C57BL/6J野生型小鼠(WT AAV-GAL3ST1處理的)作為對照(N=6，第6組)。在約9個月齡(第3-6組)或約15個月齡(第1-2組)時對小鼠進行屍檢，並將動物子集(N=9，來自第1組；N=3，來自第2組；N=6，來自第3組；N=2，來自第4組；N=5，來自第5組；N=2，來自第6組)藉由LC/MS評估腦中的髓硫脂貯積。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，**p＜0.01，***p＜0.001。 圖48A及48B顯示未治療的Arsa–/–小鼠及AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠腎臟中的髓硫脂分析。在研究第0天，未治療之成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)，且包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J野生型小鼠(WT)作為對照(N=13，第2組；N=10第4組)。此外，在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理的成年(2–3個月大)雄性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=5，第5組)，且包括年齡相符的雄性C57BL/6J野生型小鼠(WT AAV-GAL3ST1處理的)作為對照(N=6，第6組)。在約9個月齡(第3-6組)或約15個月齡(第1-2組)時對小鼠進行屍檢，並將動物子集(N=9，來自第1組；N=3，來自第2組；N=6，來自第3組；N=2，來自第4組；N=5，來自第5組；N=2，來自第6組)藉由LC/MS評估腎臟中的髓硫脂貯積。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。 圖49A至49C顯示未治療的Arsa–/–小鼠及AAV-GAL3ST1處理的Arsa–/–小鼠肝臟中的髓硫脂分析。在研究第0天，未治療之成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)，且包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J野生型小鼠(WT)作為對照(N=13，第2組；N=10第4組)。此外，在研究第0天，AAV-GAL3ST1處理的成年(2–3個月大)雄性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=5，第5組)，且包括年齡相符的雄性C57BL/6J野生型小鼠(WT AAV-GAL3ST1處理的)作為對照(N=6，第6組)。在約9個月齡(第3-6組)或約15個月齡(第1-2組)時對小鼠進行屍檢，並將動物子集(N=9，來自第1組；N=3，來自第2組；N=6，來自第3組；N=2，來自第4組；N=5，來自第5組；N=2，來自第6組)藉由LC/MS評估肝臟中的髓硫脂貯積。基於使用Sidak多重比較檢定的二因子變異數分析，*p＜0.05，**p＜0.01。 圖50顯示藉由西方印漬法及酶活性之未治療的 Arsa–/–小鼠組織中內源性ARSA蛋白的評估。使用來自每個ARSA品系的一個同基因型組合(ARSA KO)及一個WT同窩仔畜的腦組織溶胞產物，以使用西方印漬法評估ARSA蛋白(抗ARSA/ASA抗體[EPR11039] (ab174844)，Abcam，1:1000，54 kDa)。結果證實，包括品系407047 (以紅色醒目顯示)在內的基因剔除動物中不存在54kDa ARSA蛋白。HSP 90α/β (SC-13119，Santa Cruz Biotechnology，1:5000，90 kDa)用作加載對照(loading control)。未治療的成年(約3個月大)雄性及雌性Arsa–/–小鼠被納入自然史研究(N=10，第1組；N=8，第3組)。包括年齡相符之雄性及雌性C57BL/6J野生型小鼠(WT)作為對照(N=13，第2組；N=10，第4組)。在4個月齡時(研究第128天)，對第3組及第4組中各N=2隻動物進行屍檢，以評估血清及組織(腦、脊髓、肝臟、腎臟、脾臟)中的ARSA酶活性。在此基於對硝基兒茶酚的測定中，在存在(非特異性活性)及不存在(總活性)硝酸銀(一種ARSA抑制劑)的情況下測量組織樣本中的活性。特定的ARSA活性，排除由組織中存在的其他硫酸酯酶引起的酶活性，係藉由從總活性值中減去非特異性者來確定。數據表示為平均值±標準差。 圖51顯示皮質及海馬迴中的LAMP-1 IHC。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207；N=2)或PBS(媒劑，N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠以PBS (媒劑)處理並被包括作為對照(N=1)。在第30天對小鼠進行屍檢。以每組N=1隻，將腦收集、切片及染色以評估溶酶體貯積病灶(LAMP-1 IHC；棕色沉澱物)。呈現皮質及海馬迴中LAMP-1 IHC的代表性影像。 圖52顯示小腦及腦幹中的LAMP-1 IHC。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS(媒劑，N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠以PBS (媒劑)處理並被包括作為對照(N=1)。在第30天對小鼠進行屍檢。以每組N=1隻，將腦收集、切片及染色以評估溶酶體貯積病灶(LAMP-1 IHC；棕色沉澱物)。呈現小腦及腦幹中LAMP-1 IHC的代表性影像。 圖53顯示皮質及海馬迴中的GFAP IHC。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS(媒劑，N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠以PBS (媒劑)處理並被包括作為對照(N=1)。在第30天對小鼠進行屍檢。以每組N=1隻，將腦收集、切片及染色以評估星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC；棕色沉澱物)。呈現皮質及海馬迴中GFAP IHC的代表性影像。 圖54顯示小腦及腦幹中的GFAP IHC。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS(媒劑，N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠以PBS (媒劑)處理並被包括作為對照(N=1)。在第30天對小鼠進行屍檢。以每組N=1隻，將腦收集、切片及染色以評估星狀細胞增生/神經發炎(GFAP IHC；棕色沉澱物)。呈現小腦及腦幹中GFAP IHC的代表性影像。 圖55顯示皮質及海馬迴中的轉基因產物表現(人類ARSA免疫組織化學)。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠以PBS (媒劑)處理並被包括作為對照(N=1)。在第30天對小鼠進行屍檢。以每組N=1隻，將腦收集、切片及染色以評估ARSA蛋白表現(ARSA IHC；棕色沉澱物)。呈現皮質及海馬迴中人類ARSA IHC的代表性影像。 圖56顯示小腦及腦幹中的轉基因產物表現(人類ARSA免疫組織化學)。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠以PBS (媒劑)處理並被包括作為對照(N=1)。在第30天對小鼠進行屍檢。以每組N=1隻，將腦收集、切片及染色以評估ARSA蛋白表現(ARSA IHC；棕色沉澱物)。呈現小腦及腦幹中人類ARSA的代表性影像。 圖57顯示肝臟及心臟中的轉基因產物表現(人類ARSA免疫組織化學)。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠以PBS (媒劑)處理並作為對照(N=1)。在第30天對小鼠進行屍檢。以每組N=1隻，將肝臟及心臟收集、切片及染色以評估ARSA蛋白表現(ARSA IHC；棕色沉澱物)。呈現肝臟及心臟中人類ARSA IHC的代表性影像。 圖58顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之腦組織的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS(媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集腦並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖59顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之坐骨神經組織的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集坐骨神經並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖60顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之肝臟組織的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集肝臟並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖61A至61C顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之脾臟組織的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集脾臟並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖62顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之腎臟組織的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集腎臟並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖63顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之心臟組織的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集心臟並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖64顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之四頭肌組織的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集四頭肌並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖65A及65B顯示對來自 Arsa –/– 小鼠及野生型對照小鼠之血漿的髓硫脂分析。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG(GTP-207，N=2)或PBS (媒劑，N=1)。包括未治療之年齡相符的雄性C57BL/6J (野生型)小鼠作為對照(N=1)。在第30天以每組N=1隻對小鼠進行屍檢，收集血漿並藉由LC/MS評估髓硫脂貯積。 圖66顯示在 Arsa –/– 及野生型對照小鼠之組織中的ARSA酶活性。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) (N=2)或PBS (媒劑；N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠亦投予PBS (媒劑)並被包括作為對照(N=2)。在第30天對小鼠進行屍檢，並測量組織(腦、心臟、脊髓、肝臟、腎臟、脾臟)中的ARSA酶活性。 圖67顯示在 Arsa –/– 及野生型對照小鼠之血清中的ARSA酶活性。在研究的第0天，成年雄性 Arsa –/– 小鼠接受單次ICV注射劑量4.5 x 10 10GC的AAVhu68. CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207) (N=2)或PBS (媒劑；N=1)。年齡相符之雄性C57BL/6J (野生型)小鼠亦投予PBS (媒劑)並被包括作為對照(N=2)。在第30天對小鼠進行屍檢，並測量血清中的ARSA酶活性。 圖68顯示存活率。在7天之前(第–7天)(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，動物接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示死亡事件(僅非預定的)。將每組與 Arsa –/– PBS對照進行比較的對數秩(Mantel-Cox)檢定，*p＜0.05。 縮寫 ：LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)。 圖69顯示體重。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示平均值與平均值的標準差。 縮寫：BL，基線；LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)。 圖70顯示臨床評分評估。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示平均臨床分數與平均值的標準差。基於將每組與 Arsa –/– PBS對照進行比較的混合效應模型，***p＜0.001，****p＜0.0001。 縮寫：BL，基線；LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)。 圖71顯示窄沿測試。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，牠們接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示平均窄沿測試分數與平均值的標準差。基於將每組與 Arsa –/– PBS對照進行比較的混合效應模型，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。 縮寫：BL，基線；LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)；ns，不顯著。 圖72顯示RotaRod分析。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示以秒鐘為單位之平均之加快的RotaRod落下潛伏期與平均值的標準差。基於將每組與 Arsa –/– PBS對照進行比較，然後在每個時間點進行多重比較測試的混合效應模型，**p＜0.01，****p＜0.0001。 縮寫：BL，基線；LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)；ns，不顯著。 圖73顯示窄道步態分析，支撐基礎。在第–7天(基線)，納入4-5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示以cm為單位之後肢的平均支撐基礎與標準差。基於將每組與 Arsa –/– 媒劑處理的對照進行比較的二因子變異數分析與事後多重比較Dunnett檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。 縮寫：BL，基線；LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)。 圖74A及74B顯示窄道步態分析，期間(圖74A)及平均速度(圖74B)。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示平均期間(s)或速度(cm/s)與標準差。基於將每組與 Arsa –/– PBS對照進行比較的二因子變異數分析與事後多重比較Dunnett檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖75顯示窄道步態分析，步幅。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示平均步幅(cm)與標準差。基於將每組與 Arsa –/– PBS對照進行比較的二因子變異數分析與事後多重比較Dunnett檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。 縮寫：BL，基線；LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)。 圖76A顯示轉基因產物表現–腦(左圖)、肝臟(中間)及心臟(右圖)中的ARSA酶活性。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。數據點顯示平均ARSA酶活性與平均值的標準差。 縮寫：LD，低劑量(1.3 x 10 10GC)；MD，中劑量(4.5 x 10 10GC)；HD，高劑量(1.3 x 10 11GC)；4NC，從4-硝基兒茶酚硫酸鹽人工受質中釋放的4-硝基兒茶酚。 圖76B顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠腦中髓硫脂類的定量。在第–7天(基線)，納入4–5個月大之 Arsa –/– 小鼠或野生型小鼠。在第0天，小鼠接受AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)之3種劑量中的1種或接受PBS作為媒劑對照(每組N=5隻雄性及5隻雌性)。在屍檢時，對腦組織進行處理用於LC-MS分析，以確定AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療對髓硫脂物種貯積的影響(左，腦C16:0；右，腦C18:0)。槓表示組平均。單因子變異數分析(1-way ANOVA)及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，***p＜0.001。 圖77A及77B顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco. rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠的體重。圖77A顯示雄性體重。圖77B顯示雌性體重。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/-小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(鞘內最終調配緩衝液(intrathecal final formulation buffer，ITFFB))作為對照。動物每週稱重一次。誤差槓表示平均值的標準差。二因子變異數分析後進行 Dunnett多重比較檢定，α為0.05 (每組與 Arsa -/-媒劑對照比較)：在雄性中在研究第21天(*p=0.02)與研究第180天(****p＜0.0001)之間以及在雌性中研究第84天(*p=0.03)與研究第180天之間(****p＜0.0001)，WT媒劑組與 Arsa ‑/-媒劑組在統計學上有差異。 圖78顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/-小鼠的臨床評分評估。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在基線、研究第90天及研究第180天，由盲法操作員對每隻動物進行標準化臨床評估。數據為來自五個測量參數的累積缺陷分數的平均值+/-標準差。與媒劑處理的 Arsa -/- 組比較之二因子變異數分析及事後Dunnett多重比較檢定，**** p＜0.0001。 圖79A及79B顯示投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠血清中的轉基因表現及抗轉基因抗體。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在基線、研究第14天及研究第60天收集血清用於分析ARSA酶活性，以使用4-硝基兒茶酚硫酸鹽受質評估轉基因表現(圖79A)，並用於藉由ELISA分析抗hARSA抗體(圖79B)。數據為平均值+/-標準差。二因子變異數分析及事後多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑組比較)，****p＜0.0001。 縮寫：ITFFB，鞘內最終調配緩衝液；4-NC，4-硝基兒茶酚。 圖80顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠腦中的轉基因表現。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、或1.3 x 10 10GC、4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。第1組及第2組的小鼠在研究第0天(基線)進行屍檢，第3至8組的小鼠在研究第180 +/- 5天進行屍檢。從小鼠收集腦，並測定吻端(rostral)腦組織的ARSA酶活性，以評估轉基因表現(產生的4-NC/mg組織/5小時)。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/-媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。 圖81顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠肝臟中的轉基因表現。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，收集肝臟部分，並測定ARSA酶活性，以評估轉基因表現(產生的4‑NC/mg組織/5小時)。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/-媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01。 圖82顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠心臟中的轉基因表現。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，收集心臟部分，並測定ARSA酶活性，以評估轉基因表現(產生的4‑NC/mg組織/5小時)。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01，****p＜0.0001。 圖83顯示投予媒劑之WT及 Arsa -/- 小鼠腦中的hARSA IHC。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(研究第180 +/- 5天)時，收集將腦的尾端(caudal)部分並進行處理用於每組動物的子集中的hARSA IHC (僅定性分析)。來自媒劑處理之WT及 Arsa -/- 小鼠的hARSA IHC的代表性影像。上圖：第3組-WT媒劑。下圖：第4組- Arsa -/- 媒劑。腦的吻端部分缺失，因為其係收集用於生化分析。 圖84顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(第5組及第6組)的 Arsa -/- 小鼠腦中的hARSA IHC。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC或4.5 x 10 10GC(研究第0天)。在屍檢(研究第180+/-5天)時，收集腦的尾端部分並進行處理用於hARSA IHC。來自投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之 Arsa -/- 小鼠的hARSA IHC的代表性影像。上圖：第5組– Arsa -/- 1.3 x 10 11GC。下圖：第6組- Arsa -/- 4.5 x 10 10GC。腦的吻端部分缺失，因為其係收集用於生化分析。 圖85顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(第7組及第8組)的 Arsa -/- 小鼠腦中的hARSA IHC。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 10GC或4.5 x 10 9GC(研究第0天)。在屍檢(研究第180 +/- 5天)時，收集腦的尾端部分並進行處理用於hARSA IHC。來自投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)之 Arsa -/- 小鼠的hARSA IHC的代表性影像。上圖：第7組 ‑ Arsa -/- 1.3 x 10 10GC。下圖：第8組 - Arsa -/- 4.5 x 10 9GC。腦的吻端部分缺失，因為其係收集用於生化分析。 圖86A及86B顯示投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠中的血尿素氮(BUN；圖86A)及鎂(Mg；圖86B)的水準。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢時(在基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180天)收集血清以評估BUN及鎂 (Mg)的水準，作為血清化學檢測組(serum chemistry panel)的一部分。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。 圖87顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠的腦、脊髓及坐骨神經中LAMP-1 IHC的定量評分。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，收集腦的尾端部分並進行處理用於LAMP-1 IHC。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.0001。 圖88顯示在投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠的腦及脊髓中GFAP IHC的定量評分。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/-小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，收集腦的尾端部分並進行處理用於GFAP IHC。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。 圖89顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠血漿中髓硫脂C16:0的定量。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在研究第170天，收集血漿並使用LC‑MS分析髓硫脂C16:0。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，***p＜0.001，****p＜0.001。 圖90顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠腦中髓硫脂類的定量。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，處理吻端腦組織用於LC-MS分析以確定AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療對多種髓硫脂物種貯積的影響。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.001。 圖91A及91B顯示投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠脊髓中髓硫脂類的定量。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，收集並處理脊髓以評估AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療對多種髓硫脂物種貯積的影響。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，****p＜0.001。 圖92A至92C顯示投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠肝臟中髓硫脂類的定量。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，收集一塊肝臟並用於LC-MS分析以確定AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)治療對多種髓硫脂物種貯積的影響。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.001。 圖93顯示投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)或媒劑的 Arsa -/- 小鼠腎臟中髓硫脂類的定量。在4個月齡時，對 Arsa -/- 小鼠ICV投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為1.3 x 10 11GC、4.5 x 10 10GC、1.3 x 10 10GC、或4.5 x 10 9GC (研究第0天)。對年齡相符之 Arsa -/- 小鼠及WT小鼠ICV投予媒劑(ITFFB)作為對照。在屍檢(基線研究第0天(第1組及第2組)或研究第180 +/- 5天)時，收集一個腎臟並用於LC-MS分析以確定AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療對多種髓硫脂物種貯積的影響。槓表示組平均。單因子變異數分析及事後Dunn多重比較檢定(每組與 Arsa -/- 媒劑比較)，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.001。 圖94顯示典型的感覺神經動作電位波形。從健康NHP的第二指記錄的典型正中神經SNAP。藉由將刺激陰極與第二指處的記錄部位之間的物理距離除以起始潛伏期(onset latency) (即刺激與SNAP起始之間的時間)來計算感覺神經傳導速度。SNAP振幅計算為SNAP起始時的電壓與SNAP峰值的電壓差。縮寫：NHP，非人類靈長類動物；SNAP，感覺神經動作電位。 圖95A及95B分別顯示在ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(第90天的同齡群)後，NHP中的感覺神經動作電位(SNAP)振幅及神經傳導速度。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在BL及第28±3天、第60±3天及第90±4天進行感覺神經傳導測試。呈現左右側正中神經的SNAP振幅及傳導速度。陰影區域(SNAP振幅為8.5–58.4 µV，速度為40.3–53.5 m/s)表示研究中所有動物基線平均值的兩個標準差範圍內的值。 圖96A及96B分別顯示在ICM投予AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)(第180天的同齡群)後，NHP中的SNAP振幅及神經傳導速度。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在BL及第28±3天、第60±3天、第90±4天、第120±4天、第150±4天、及第180±5天進行感覺神經傳導測試。呈現左右側正中神經的SNAP振幅及傳導速度。陰影區域(SNAP振幅為8.5–58.4 µV，速度為40.3–53.5 m/s)表示研究中所有動物基線平均值的兩個標準差範圍內的值。 圖97A及97B顯示在90天的同齡群(圖97A)或180天的同齡群(圖97B)中，ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後NHP的體重。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在BL及第0天、第7±1天、第14±2天、第28±3天、第60±3天、第90±4天、第120±4天、第150±4天及第180±5天監測體重。 圖98A及98B顯示在90天的同齡群(圖98A)或180天的同齡群(圖98B)中，ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後NHP的丙胺酸轉胺酶水準。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在BL及第0天、第7±1天、第14±2天、第28±3天、第60±3天、第90±4天、第120±4天、第150±4天及第180±5天收集血清。測量丙胺酸轉胺酶(ALT)水準。 圖99A及99B顯示在90天的同齡群(圖99A)或180天的同齡群(圖99B)中，ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後NHP腦脊髓液中的白血球計數。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在第0天、第7±1天、第14±2天、第28±3天、第60±3天、第90±4天、第120±4天、第150±4天及第180±5天收集CSF。白血球被量化為每μl CSF的WBC數量。 圖100A至100C顯示在ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至NHP後，在90天的同齡群(圖100A)、180天的同齡群(圖100B)中的DRG/TRG神經元變性嚴重度分數；圖100C顯示第90天及第180天的同齡群。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在第90天或第180天屍檢的所有ITFFB及AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)處理的動物的嚴重等級分數係以在每個DRG節段(頸椎、胸椎及腰椎)及在TRG中之神經節中神經元變性/壞死的所見來呈現。對於每個DRG節段及TRG，分配以下分數：嚴重等級1=最小，嚴重等級2=輕度，嚴重等級3=中度，嚴重等級4=顯著；嚴重等級5=嚴重。基於Kruskal-Wallis檢定，然後Dunn多重比較檢定，*p＜0.05。 圖101A至101C顯示在ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至NHP後，在90天的同齡群(圖101A)、180天的同齡群(圖101B)中的脊髓軸突病變嚴重度分數；圖101C顯示第90天及第180天的同齡群。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在第90天或第180天屍檢的所有ITFFB及AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)處理之動物的嚴重等級分數係呈現為脊髓背側白質束(頸椎、胸椎及腰椎節段)的軸突病變。對於每個所見，分配以下分數：嚴重等級1=最小，嚴重等級2=輕度，嚴重等級3=中度，嚴重等級4=顯著；嚴重等級5=嚴重。基於將每個GTP-207治療組與媒劑處理的對照組進行比較的Kruskal-Wallis檢定，然後比較Dunn檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，及****p＜0.0001。 圖102A至102C顯示在ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)至NHP後，在90天的同齡群(圖102A)、180天的同齡群(圖102B)中的周圍神經軸突病變嚴重度分數；圖102C顯示第90天及第180天的同齡群。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在第90天或第180天屍檢的所有ITFFB及AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)處理之動物的嚴重等級分數係呈現為在周圍神經(左右側近端正中神經、遠端正中神經、腓神經、坐骨神經及脛神經–每隻動物8條神經及10個分數)中的軸突病變。對於每個所見，分配以下分數：嚴重等級1=最小，嚴重等級2=輕度，嚴重等級3=中度，嚴重等級4=顯著；嚴重等級5=嚴重。基於將每個AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)治療組與媒劑處理的對照組進行比較的Kruskal-Wallis檢定，然後多重比較Dunn檢定，*p＜0.05，**p＜0.01，及****p＜0.0001。 圖103A及103B顯示在ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後，以藉由測量NHP之腦脊髓液(CSF)及血清(血液)中的載體基因體DNA濃度所確定的載體藥物動力學。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在第0天、第7±1天、第14±2天、第28±3天、第60±3天、第90±4天、及第180±5天收集CSF及血液。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體基因體藉由TaqMan qPCR進行量化。虛線表示該測定的LOD (CSF：25個拷貝/12 μL；血液：50個拷貝/μg DNA)。 圖104A及104B顯示在ICM投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)後，以使用載體基因體DNA濃度測量的NHP的尿液(圖104A)及糞便(圖104B)中的載體排泄。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在BL及第5±2天、第28±3天、第60±3天、第90±4天、第120±4天、第150±4天及第180±5天收集尿液及糞便。AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)載體基因體藉由TaqMan qPCR進行量化。虛線表示該測定的LOD (尿液：25個拷貝/12 μL；糞便：50個拷貝/μg DNA)。 圖105A及105B顯示ICM投予AAVhu68.CB7. CI.hARSAco.rBG (GTP-207)後，NHP的血清(圖105A)及腦脊髓液(CSF，圖105B)中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在指定的日期收集血清及CSF，並分析轉基因產物表現(ARSA酶活性)。誤差槓表示標準差。 圖106A及106B顯示ICM投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)後，NHP的血清(第14天；圖106A)及腦脊髓液(圖106B，第7天)中的轉基因產物表現(ARSA酶活性)。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。分析第14天收集的血清及第7天收集的CSF中轉基因產物表現(ARSA酶活性)。空心形狀表示在處理時血清循環的針對載體殼體的NAb呈陰性的動物，而陰影單元表示在處理時血清循環的針對載體殼體的NAb呈陽性的動物。誤差槓表示標準差。 圖107A及107B顯示ICM投予AAVhu68.CB7.CI. hARSAco.rBG (GTP-207)後，在NHP之血清及腦脊髓液中針對轉基因產物的抗體(抗人類ARSA抗體)。幼年NHP接受單次ICM投予媒劑(ITFFB；N=1/組)或AAVhu68.CB7.CI.hARSAco.rBG (GTP-207)，劑量為3.0 x 10 12GC (低劑量)、1.0 x 10 13GC (中劑量)、或3.0 x 10 13GC (高劑量)(N=3/組)。在指定的日期收集CSF及血清，並藉由ELISA測量針對轉基因產物的抗體(抗人類ARSA抗體)。誤差槓表示標準差。
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無。

Claims (14)

  1. 一種用於治療異染性白質失養症或與芳基硫酸酯酶A (ARSA)基因突變相關之疾病的醫藥組成物，該組成物包含： 重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAVhu68殼體及載體基因體，該載體基因體包含：5’ AAV反向末端重複序列(ITR)、含有CMV IE強化子及CB啟動子之CB7啟動子、及可操作地連接至調節序列的編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A (hARSA)之核酸序列、polyA訊息、及3’ AAV ITR，該調節序列包含引導hARSA表現之CB7啟動子，其中該hARSA編碼序列包含SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 1至nt 1521的序列、或與編碼功能性hARSA之序列至少95%至99.9%相同之序列；及 至少一種水性緩衝液、至少一種載劑、至少一種賦形劑及/或至少一種防腐劑， 該組成物以單一治療劑量經由鞘內投予遞送。
  2. 如請求項1之醫藥組成物，其中該調節元件進一步包含Kozak序列、內含子、另外的強化子、及/或TATA訊息中的一種或多種。
  3. 如請求項1或2之醫藥組成物，其中該hARSA編碼序列為SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組成物，其中該載體基因體包含5’ AAV ITR、具有SEQ ID NO：28之序列的表現匣、及3’ AAV ITR。
  5. 如請求項1至4中任一項之醫藥組成物，其中該AAV 5’ ITR具有SEQ ID NO：25之序列及/或該AAV 3’ ITR具有SEQ ID NO：26之序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之醫藥組成物，其中該載體基因體包含SEQ ID NO：5之nt 1至nt 3883 (SEQ ID NO：27)。
  7. 如請求項1至6中任一項之醫藥組成物，其中該AAVhu68殼體係由編碼SEQ ID NO：7之胺基酸序列的序列所產生。
  8. 如請求項1至5中任一項之醫藥組成物，其中該組成物包含：人工腦脊髓液，該人工腦脊髓液包含緩衝食鹽水、及鈉、鈣、鎂、鉀中的一種或多種或者其混合物；及界面活性劑，其中該界面活性劑可選擇地以醫藥組成物之0.0005%至約0.001%存在，及/或其中該組成物之pH之範圍為6.5至8.5。
  9. 如請求項1至8中任一項之醫藥組成物，其中該組成物適用於腦大池內注射(ICM)或腦室內投予。
  10. 如請求項1至8中任一項之醫藥組成物，其中該單一劑量包含3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量至3.5 x 10 11GC/公克腦質量。
  11. 如請求項10之醫藥組成物，其中該劑量為： (a)約3.3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量； (b)約1.1 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量；或 (c)約3.3 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量。
  12. 一種rAAV.hARSA於製造用於治療性治療異染性白質失養症或與芳基硫酸酯酶A (ARSA)基因突變相關之疾病的藥物之用途，該藥物在對病患鞘內投予包含3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量至3.5 x 10 11GC/公克腦質量的單一劑量後有效。
  13. 如請求項12之用途，其中該劑量為： (a)約3.3 x 10 10基因體拷貝(GC)/公克腦質量； (b)約1.1 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量；或 (c)約3.3 x 10 11基因體拷貝(GC)/公克腦質量。
  14. 如請求項11或12之用途，其中該rAAV包含AAVhu68殼體及載體基因體，該載體基因體包含：5’ AAV反向末端重複序列(ITR)、含有CMV IE強化子及CB啟動子之CB7啟動子、及可操作地連接至調節序列的編碼功能性人類芳基硫酸酯酶A (hARSA)之核酸序列、polyA訊息、及3’ AAV ITR，該調節序列包含引導hARSA表現之CB7啟動子，其中該hARSA編碼序列包含SEQ ID NO：1之核苷酸(nt) 1至nt 1521的序列、或與編碼功能性hARSA之序列至少95%至99.9%相同之序列。
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