JP2022523766A - Ｇｒｎ関連成人発症性神経変性の治療のための組換えアデノ随伴ウイルス - Google Patents

Abstract

プログラニュリン（ＰＧＲＮ）関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの、グラニュリン（ＧＲＮ）ハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性の治療における使用に好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、（ａ）アデノ随伴ウイルス１カプシド、および（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムを含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。また、グラニュリン（ＧＲＮ）ハプロ不全によって引き起こされるＰＧＲＮ－ＦＴＤおよび他の成人発症性神経変性を有するヒト患者を治療するための方法も提供され、当該方法は、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含み、当該ｒＡＡＶは、当該ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムをさらに含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、および当該プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。【選択図】

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月２２日に出願された米国仮出願第６２／８０９，３２９号、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２３，８１２号、および２０２０年２月２日に出願された米国仮出願第６２／９６９，１０８号の利益および優先権を主張し、これらは、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、致命的な神経変性疾患であり、典型的には、人生の６０代または７０代に現れ、実行機能、行動、発話、または言語理解の障害を伴う。これらの症状は、前頭皮質および側頭皮質に影響を及ぼす脳萎縮の特徴的なパターンに関連している。患者は、普遍的に進行性の経過を示し、症状の発症からの平均生存期間は８年である（Ｃｏｙｌｅ－Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ ＩＴ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１６；８６（１８）：１７３６－４３）。

ＦＴＤは、高度に遺伝性であり、患者の約４０％が陽性の家族歴を有する（Ｒｏｈｒｅｒ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００９；７３（１８）：１４５１－６．）。５～１０％のＦＴＤ患者では、遍在性のリソソームタンパク質であるプログラニュリン（ＰＧＲＮ）をコードするグラニュリン（ＧＲＮ）遺伝子において、病原性の機能喪失変異が特定され得る（Ｒｏｈｒｅｒ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００９；７３（１８）：１４５１－６）。ＧＲＮ変異の保因者は、急速かつ広範囲の脳萎縮を示し、進行性核上性麻痺、基底核症候群、パーキンソン病、レビー小体を伴う認知症、またはアルツハイマー病などの他の神経変性疾患の臨床的特徴を呈し得る（Ｌｅ Ｂｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００８；１３１（３）：７３２－４６．）。ＧＲＮ変異は、常染色体優性形態で遺伝し、７０歳までに９０％を超える浸透率を有する（Ｇａｓｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００６；１５（２０）：２９８８－３００１）。単一のＧＲＮ変異の遺伝は、ＦＴＤおよび他の遅発性神経変性疾患を引き起こすが、ホモ接合性の機能喪失変異を有する患者は、人生のずっと早い時期に神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ、バッテン病）を呈し、ニューロンのリソソーム内の自己蛍光物質（リポフスチン）の蓄積、急速な認知低下および網膜変性を特徴とする（Ｓｍｉｔｈ Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１２；９０（６）：１１０２－７）。ＧＲＮ変異に対してヘテロ接合の患者は、症状の発症がずっと遅延するが、最終的に、ＮＣＬ患者と同一の脳および網膜におけるリソソーム蓄積病変を発症し、同様に、進行性神経変性を経験する（Ｗａｒｄ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１７；９（３８５）、Ｇｏｔｚｌ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ．２０１４；１２７（６）：８４５－６０）。プログラニュリンは、最近、リソソームの酸性化を促進し、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）を含むリソソームプロテアーゼのシャペロンとして機能することによって、リソソーム機能において重要な役割を果たすことが見出された（Ｂｅｅｌ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７ Ａｕｇ １；２６（１５）：２８５０－２８６３、Ｔａｎａｋａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１７；２６（５）：９６９－８８）。ＣＴＳＤをコードする遺伝子の変異もまた、ＮＣＬ表現型をもたらし、欠損したリソソームプロテアーゼ活性に関連する一般的な病態生理を支持している（Ｓｉｉｎｔｏｌａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ：ａ ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００６；１２９（Ｐｔ ６）：１４３８－４５）。

現在、ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性の疾患を修飾する療法は存在しない。疾病管理は、疾患に関連する行動、認知、および／または運動の症状を低減することを目的とした支持ケアおよび適応症外治療を含む（Ｔｓａｉ ａｎｄ Ｂｏｘｅｒ，２０１６，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１３８ Ｓｕｐｐｌ １：２１１－２１）。さらに、認知症の家族歴のある個人をスクリーニングすることによって、より多くの患者がより早い段階で到達する可能性があるが、現在、治療の欠如を考慮して適応されていない。したがって、この疾患スペクトルは、満たされていない医療ニーズの高い領域を表している。

必要とされているものは、ＧＲＮハプロ不全に関連する成人発症性神経変性疾患およびそれに関連する症状のための治療である。

プログラニュリン（ＰＧＲＮ）関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）およびＧＲＮハプロ不全に関連する他の成人発症性神経変性疾患によって引き起こされる神経変性の治療に使用するための好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、アデノ随伴ウイルス１カプシドと、ＡＡＶカプシドにパッケージングされるベクターゲノムとを含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ヒトプログラニュリンをコードするコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、ヒトＰＧＲＮコード配列、およびその発現を指示する調節エレメント、ならびにＡＡＶ ５’ＩＴＲを含む。

水性液体および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含む医薬組成物も提供される。特定の実施形態では、水性液体は、髄腔内投与に好適な界面活性剤を含む人工脳脊髄液を含む。

ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされるプログラニュリン関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）神経変性または他の成人発症性神経変性疾患を有するヒト患者を治療する方法が提供される。本方法は、ヒトプログラニュリンのコード配列を含むｒＡＡＶを、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含む。アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージされるベクターゲノムをさらに含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。

ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされるＰＧＲＮ－ＦＴＤまたは他の成人発症性神経変性疾患を有するヒト患者の治療方法で使用するためのｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮが提供される。本方法は、上衣細胞を標的とするヒトプログラニュリンをコードするアデノ随伴ウイルス１カプシドを有するｒＡＡＶを、ＣＮＳに投与することを含む。ｒＡＡＶ１は、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムをさらに含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、上衣細胞においてプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。一実施形態では、分泌可能なヒトプログラニュリンは、ｒＡＡＶ１遺伝子療法の送達後に発現される。

ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされるプログラニュリン関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）神経変性または他の成人発症性神経変性疾患に関連する脳病変を有するヒト患者を治療するための方法が提供される。本方法は、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージされるベクターゲノムをさら
に含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。

特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、（ａ）脳病変の減少の予測因子として網膜蓄積病変の減少について患者を非侵襲的に評価すること、（ｂ）磁気共鳴画像法を行って脳体積を評価すること、および／または（ｃ）ＣＳＦ中のプログラニュリン濃度の濃度を測定することをさらに含み得る。

本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。

ＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮベクターゲノムの線形マップである。ＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧベクターゲノムは、遍在性ＣＢ７プロモーターの制御下でヒトＰＧＲＮのコード配列を含み、これは、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターとの間のハイブリッドで構成される。略語：ＢＡ：β－アクチン、ｂｐ：塩基対、ＣＭＶ ＩＥ：サイトメガロウイルス最初期、ＩＴＲ：逆位末端反復、ＰｏｌｙＡ：ポリアデニル化、ｒＢＧ：ウサギβ－グロビン。 ベクターゲノムを担持するシスプラスミドの線形ベクターマップである。 ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるリポフスチン蓄積およびヘキソサミニダーゼ活性の自然歴を提供する。ＧＲＮ^－／－マウス（ＫＯ）またはＧＲＮ＋／＋（ＷＴ）対照は、示された齢で犠牲になった（ｎ＝１０^／時点）。未染色の脳切片を、海馬、視床、および前頭皮質における自己蛍光物質（リポフスチン）について画像化し、リポフスチン沈着物を３人の盲検レビュアによって定量化および平均化した（図３Ａ～図３Ｃ）。リポフスチンの数は、関心領域の総面積に対して表される。ヘキソサミニダーゼ活性は、脳試料において測定され、総タンパク質濃度に対して正規化された（図３Ｄ）。値は、野生型対照に対する比率で表される。 ＡＡＶ媒介性ＰＧＲＮ発現による、若い成体ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるリソソーム病理の矯正を示す。ＧＲＮ^－／－マウス（ＫＯ）またはＧＲＮ^＋／＋（ＷＴ）対照を、２ヶ月齢でビヒクル（ＰＢＳ）またはヒトＰＧＲＮ（１０^１１ＧＣ）を発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターの単回ＩＣＶ注入で処置した（群あたりｎ＝１０）。動物は、注入６０日目に犠牲にされ、ＥＬＩＳＡによって、ＣＳＦ（図４Ａ）および脳の前頭葉（図４Ｂ）におけるヒトＰＧＲＮを測定した。ヘキソサミニダーゼ活性は、脳試料で測定された（図４Ｃ）。脳ＰＧＲＮ濃度およびＨｅｘ活性は、総タンパク質に対して正規化された。海馬、視床、および前頭皮質における自己蛍光物質（リポフスチン）について、未染色の脳切片を撮像した。海馬、視床、および前頭皮質におけるリポフスチン沈着物は、盲検レビュアにより定量化された（図４Ｄ～図４Ｇ）。リポフスチン数は、高倍率視野ごとに表される。ＫＯ＋ＰＢＳ海馬（ｎ＝８）を除き、群あたりｎ＝１０。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定。ヘキソサミニダーゼ活性は、血清中で測定された（図４Ｇ）。 ヒトＰＧＲＮのＡＡＶ媒介性発現による、加齢ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるリソソーム病理の矯正を示す。生後７ヶ月で、ＧＲＮ^－／－マウス（ＫＯ）またはＧＲＮ^＋／＋（ＷＴ）対照を、ビヒクル（ＰＢＳ）またはヒトＰＧＲＮ（１０^１１ＧＣ）を発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターの単回ＩＣＶ注入で処置した。動物は、注入４ヶ月後に犠牲にされた。ヘキソサミニダーゼ活性は、脳試料において測定され（図５Ａ）、リポフスチン沈着物は、盲検レビュアによって、海馬、視床、および皮質において定量化された（図５Ｂ～図５Ｄ）。リポフスチン数は、高倍率視野ごとに表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定。 ＡＡＶ媒介性ＰＧＲＮ発現による、加齢ＧＲＮ^－／－マウスにおける脳ミクログリオーシスの矯正を示す。生後７ヶ月で、ＧＲＮ^－／－マウス（ＫＯ）またはＧＲＮ^＋／＋（ＷＴ）対照を、ビヒクル（ＰＢＳ）またはヒトＰＧＲＮ（１０^１１ＧＣ）を発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターの単回ＩＣＶ注入で処置した。動物は、注入４ヶ月後に犠牲にされ、脳切片は、ＣＤ６８について染色された。海馬、視床、および前頭皮質の画像におけるＣＤ６８陽性領域は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、盲検レビュアによって定量化された（図６Ａ～図６Ｃ）。領域は、高倍率視野ごとに表される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの多重比較検定。 ＡＡＶ送達後のアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるヒトＰＧＲＮ発現を示す。試験０日目、成体アカゲザルに、ニワトリベータアクチンプロモーターからヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶ１、ＡＡＶ５、またはＡＡＶｈｕ６８ベクター（３×１０^１３ＧＣ）を、ＩＣＭ注入によって投与した（ベクターあたりｎ＝２）。２匹の追加のマカクに、ユビキチンＣプロモーター（ＡＡＶｈｕ６８ Ｖ２）からｈＰＧＲＮを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターを投与した。透視ガイダンス下、ＩＣＭ注入を行った。蛍光透視による針の配置および造影剤のＣＳＦリターン注入を確認した後、大槽内の分布が示された。その後のベクター注入では、造影剤の変位が明らかであった。ヒトＰＧＲＮを、処置されたマカク（図７Ａ）および健康な成人ヒト対象（図７Ｂ）のＣＳＦ、ならびに処置されたマカクの血清（図７Ｃ）において、ＥＬＩＳＡによって測定した。図７Ａおよび図７Ｂでは、点線は、ＣＳＦ中１：５に希釈されたｈＰＧＲＮの定量下限を指す。 ベクター処置非ヒト霊長類におけるヒトＰＧＲＮに対する免疫応答を示す。ニワトリベータアクチンプロモーターまたはユビキチンＣプロモーター（ＡＡＶｈｕ６８ Ｖ２）からヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶ１、ＡＡＶ５またはＡＡＶｈｕ６８ベクター（３×１０^１３ＧＣ）のＩＣＭ投与後、ＣＳＦを、化学検査および細胞診断の分析のために、毎週採取した。白血球数の増加（主に小リンパ球）は、ほとんどの動物において明らかであった（図８Ａ）。ヒトＰＧＲＮに対する抗体応答を、ＡＡＶｈｕ６８またはＡＡＶ１で処置された動物のＣＳＦ（図８Ｂ）および血清（図８Ｃ）において、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＡＡＶ５で処置された動物由来の血清またはＣＳＦの試料では、ヒトＰＧＲＮに対する抗体を評価しなかった。 非ヒト霊長類へのＡＡＶ１およびＡＡＶｈｕ６８ベクターのＩＣＭ投与後の脳形質導入のレベルを示す。成体アカゲザルに、ニワトリベータアクチンプロモーターからＧＦＰを発現する３ｘ１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８（ｎ＝２）またはＡＡＶ１（ｎ＝２）ベクターを、ＩＣＭ注入によって投与した。ベクター投与の２８日後、動物を剖検し、脳の右半球の５つの領域の切片を、ＧＦＰ免疫組織化学またはＧＦＰおよびＤＡＰＩの染色による免疫蛍光によって分析した。特定の細胞型（ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、およびＯｌｉｇ２）のマーカーによる共染色で、形質導入された、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの定量を可能にした。すべてのサンプリングされた脳領域について、各細胞型の平均形質導入を計算した。エラーバー＝５つの切片のＳＥＭ。 非ヒト霊長類へのＡＡＶ１（動物ＩＤ１８２６および２０６８）およびＡＡＶｈｕ６８（動物ＩＤ１５１８および２０７６）ベクターのＩＣＭ投与後の、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトの形質導入の割合を示す表を提供する。試験０日目、成体アカゲザルに、ニワトリベータアクチンプロモーターからＧＦＰを発現する３×１０^１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８（ｎ＝２）またはＡＡＶ１（ｎ＝２）ベクターを、ＩＣＭ注入によって投与した。ベクター投与の２８日後、動物を剖検し、脳の右半球の５つの領域の切片を、特定の細胞型（ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、およびＯｌｉｇ２）に対する共染色によるＧＦＰ免疫蛍光によって分析した。各細胞型の全細胞および各型のＧＦＰ発現細胞の数を、ＨＡＬＯソフトウェアを使用して定量した。各領域について、形質導入された各細胞型の割合を示す。一部の動物については、領域５からの２つの切片を分析した。 非ヒト霊長類における正中感覚神経伝導検査の結果を示す。Ｙ軸は、３つの異なる用量（３×１０^１２ＧＣ、１×１０^１３ＧＣ、もしくは３×１０^１３ＧＣのｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮまたはビヒクル対照）の投与後に、経時的（ｘ軸）に測定された開始からのピーク振幅（ピーク潜時）までの潜時を表す。 ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮによる処置９０日後の、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における後根神経節（ＤＲＧ）、正中神経、および脊髄（ＳＣ）の神経病理学的研究の結果を示す。 ベクター生成のための製造プロセスのフロー図を示す。略語：ＡＥＸ：アニオン交換、ＣＲＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｄｄＰＣＲ：デジタルドロップレットポリメラーゼ連鎖反応、ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＦＦＢ：最終製剤緩衝液、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＰＥＩ：ポリエチレンイミン、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＦＦ：接線流濾過、ＵＳＰ：米国薬局方、ＷＣＢ：作業用細胞バンク。 ベクター製剤のための製造プロセスのフロー図を示す。ＧＴＰ－２０５医薬品を生産するための製造プロセス。略語：Ａｄ５：アデノウイルス血清型５、ＡＵＣ：分析用超遠心分離、ＢＤＳ：バルク原薬、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＣＺ：Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ、ｄｄＰＣＲ：ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応、Ｅ１Ａ：初期領域１Ａ（遺伝子）、ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ、ＦＤＰ：最終製剤、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性（遺伝子）、ＭＳ：質量分析、ＮＧＳ：次世代配列決定、ｑＰＣＲ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＣＩＤ５０５０％組織培養感染量、ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィ、ＵＳＰ：米国薬局方。

プログラニュリン（ＰＧＲＮ）関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの、ＧＲＮ－ハプロ不全に関連する神経変性状態の治療における使用に好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、およびそれらを含む組成物が提供される。特定の好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、アデノ随伴ウイルス１カプシドと、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムとを含み、ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、ヒトＰＧＲＮコード配列、およびその発現を指示する調節エレメント、ならびにＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。水性液体および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含む医薬組成物も提供される。特定の実施形態では、水性液体は、髄腔内投与に好適な界面活性剤を含む人工脳脊髄液を含む。また、ＰＧＲＮ－ＦＴＤを有するヒト患者を治療するための方法、および／またはＰＧＲＮ－ＦＴＤに関連する脳病変を有する患者を治療するための方法も提供される。特定の実施形態では、患者のミクログリオーシスを治療または低減するための方法が提供される。本方法は、ｒＡＡＶ．ＰＧＲＮを、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、（ａ）脳病変の減少の予測因子として網膜蓄積病変の減少について患者を非侵襲的に評価すること、（ｂ）磁気共鳴画像法を行って脳体積を評価すること、および／または（ｃ）ＣＳＦ中のＰＧＲＮ濃度の濃度を測定することによって、治療をモニタリングすることをさらに含み得る。任意選択的に、血漿中のＰＧＲＮの濃度を測定してもよい。

本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ．ｈＰＧＲＮ」または「ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮ」は、調節配列の制御下でヒトプログラニュリンのコード配列を含むベクターゲノムをその中に有するＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルスを指すために使用される。特定のカプシドの種類が特定されてもよく、例えば、ＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮは、ＡＡＶ１カプシドを有する組換えＡＡＶを指し、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＰＧＲＮは、ＡＡＶｈｕ
６８カプシドを有する組換えＡＡＶを指し、ＡＡＶ５．ｈＰＧＲＮは、ＡＡＶ５カプシドを有する組換えＡＡＶを指す。

「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、およびＡＡＶカプシド内にパッケージされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子または機能的ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を欠き、子孫を生成することができないため、「複製欠陥ウイルス」または「複製欠陥ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子および調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’および３’最末端に位置する。

本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の実施例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、または完全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能またはトランス相補ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。さらに、他のＩＴＲが使用され得る。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する制御配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。

治療用タンパク質およびコード配列：
ｒＡＡＶは、ヒトプログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）タンパク質またはそのバリアントのコード配列を含み、ｈＰＧＲＮの生物学的機能のうちの１つ以上を行う。このタンパク質のコード配列は、中枢神経系（ＣＮＳ）における発現のためにベクターゲノムへと操作される。

ＨｕＰＧＲＮ１は、最も一般的に、配列番号１に再現されるＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ＿００２０７８の５９３アミノ酸の配列を特徴とする。この配列は、分泌プログラニュリンタンパク質またはアミノ酸１８～約５９３を含む分泌グラニュリンと共に１～１７位にシグナルペプチドを有する。このタンパク質は、配列番号１の番号付けを参照して、グラニュリン１（別名グラニュリンＧ：約ａａ５８約アミノ酸１１３）、グラニュリン２（約アミノ酸１２３～約１７９）、グラニュリン３（約アミノ酸２０６～約アミノ酸２６１）、グラニュリン４（約アミノ酸２８１～約アミノ酸３３６）、グラニュリン５（約アミノ酸３６４～約アミノ酸４１７）、グラニュリン６（約アミノ酸４４２～約アミノ酸４９６）、およびグラニュリン７（約アミノ酸５１８～約アミノ酸５７３）の８つの鎖に切断され得る。特定の実施形態では、天然シグナルペプチドの代わりに、異種シグナルペプチドで置換され得る。しかしながら、他の実施形態は、外因性シグナルペプチド（例えば、ヒトＩＬ２リーダー）を有するプログラニュリンを包含し得る。また、例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。したがって、プログラニュリンおよび／またはその断片を含む融合タンパク質が企図される。かかる融合タンパク質は、互いと様々な組み合わせで活性ＧＲＮ（例えば、ＧＲＮ１、２、３、４、４、６、または７）のうちの１つ以上を包含してもよく、あるいはこれらのペプチドのうちの１つ以上を、全長ＰＧＲＮまたは別のタンパク質もしくはペプチド（例えば、別の活性タンパク質もしくはペプチド、および／またはヒトＰＧＲＮに対して外因性のシグナルペプチド）と組み合わせてもよい。

ベクターゲノムは、このタンパク質のコード配列を担持し、ヒト細胞において（特に、
中枢神経系において）タンパク質を発現するように操作される。特定の実施形態では、コード配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００２０８７．３に見出され、配列番号２に再現される。

特定の実施形態では、コード配列は、配列番号３に提供される。特定の他の実施形態は、配列番号３と９５％～９９．９％または１００％同一性のコード配列を包含し、それらの間の値を含む。一部の実施形態では、コード配列は、より良い治療転帰（例えば、哺乳動物細胞における発現増強）のためにコドン最適化される。同一性は、シグナル（リーダー）配列を有する全長プログラニュリンのコード配列にわたって、シグナル（リーダー）配列を有さないプログラニュリンにわたって、または本明細書に定義される融合タンパク質のコード配列の長さにわたって評価され得る。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号３に提供される。特定の他の実施形態は、配列番号４と９５％～１００％未満同一性のコード配列を包含する。同一性は、シグナル（リーダー）配列を有する全長プログラニュリンのコード配列にわたって、シグナル（リーダー）配列を有さないプログラニュリンにわたって、または本明細書に定義される融合タンパク質のコード配列の長さにわたって評価され得る。

好適には、これらのコード配列は、全長プログラニュリンをコードする。しかしながら、他の実施形態は、異種シグナルペプチド（例えば、ヒトＩＬ２リーダー）を有する活性グラニュリン鎖を包含し得る。また、例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａを参照されたい。

特定の実施形態では、ヒトＰＧＲＮのコード配列（例えば、配列番号３もしくは配列番号４）の断片、またはそれと約９５％～９９．９％もしくは１００％同一の配列を利用してもよい。かかる断片は、活性ヒトＧＲＮ（ａａ１８～５９３）、または活性ヒトＧＲＮと共に異種シグナルペプチドを含む融合ペプチドをコードし得る。特定の実施形態では、活性ＧＲＮ（例えば、ＧＲＮ１、２、３、４、４、６、または７）のうちの１つ以上のコード配列のうちの１つ以上は、互いに様々な組み合わせでベクターゲノムに含まれ得るか、またはこれらのペプチドのうちの１つ以上は、全長ＰＧＲＮもしくは別のコード配列と組み合わせられ得る。

理論に束縛されることを意図するものではないが、ＣＮＳの細胞のサブセット（例えば、上衣細胞）におけるＡＡＶ媒介性ＰＧＲＮ発現は、分泌されたタンパク質のデポ（ｄｅｐｏｔ）を提供すると考えられる。分泌ＰＧＲＮタンパク質（および／または１つ以上のＧＲＮ）は、ソーティリンまたはマンノース－６－リン酸受容体を介して他の細胞に取り込まれ、その後、リソソームに輸送される。特定の実施形態では、分泌タンパク質は、プログラニュリンである。特定の実施形態では、分泌タンパク質は、グラニュリンである。特定の実施形態では、分泌タンパク質は、プログラニュリンおよびグラニュリンの混合物を含む。

特定の実施形態では、プログラニュリンのコード配列に加えて、別の非ＡＡＶコード配列、例えば、目的のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物を含んでもよい。有用な遺伝子産物としては、ｍｉＲＮＡも含まれる。ｍｉＲＮＡおよび他の低分子干渉核酸は、標的ＲＮＡ転写産物の切断／分解または標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制を介して遺伝子発現を制御する。ｍｉＲＮＡは、典型的には、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現される。ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を通してそれらの活性を示す。これらの内因性発現ｍｉＲＮＡはヘアピン前駆体を形成し、その後、ｍｉＲＮＡ二本鎖に、さらに「成熟」一本鎖ｍｉＲＮＡ分子に処理される。この成熟ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡとの相補性に基づいて
、例えば、３′ＵＴＲ領域内の標的ｍＲＮＡの標的部位を特定する、多タンパク質複合体ｍｉＲＩＳＣを誘導する。

特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節（ｄｒｇ）におけるｈＰＧＲＮの発現を抑制する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つのタンデム反復を含み、少なくとも２つのタンデム反復は、少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、同じまたは異なり得る少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、タンデムｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であるか、または１～１０個の核酸のスペーサーによって分離されており、当該スペーサーは、ｍｉＲＮＡ標的配列ではない。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列があり、ｈＰＧＲＮコード配列の３’に位置する。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＰＧＲＮコード配列の３’末端から２０ヌクレオチド以内である。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡタンデム反復の第１の開始は、ｈＰＧＲＮコード配列の３’末端から少なくとも１００ヌクレオチドである。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡタンデム反復は、２００～１２００ヌクレオチド長を含む。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列があり、ｈＰＧＲＮコード配列の５’に位置する。特定の実施形態では、少なくとも２つのｄｒｇ特異的ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｈＰＧＲＮコード配列の５’および３’の両方に位置する。特定の実施形態では、発現カセットｍＲＮＡまたはＤＮＡプラス鎖の少なくとも第１のｍｉＲＮＡ標的配列および／または少なくとも第２のｍｉＲＮＡ標的配列は、（ｉ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（ｍｉＲ１８３、配列番号：３２）、（ｉｉ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号：３３）、（ｉｉｉ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号：３４）、および（ｉｖ）ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号：３５）から選択される。特定の実施形態では、２つ以上の連続したｍｉＲＮＡ標的配列は、連続しており、スペーサーによって分離されていない。特定の実施形態では、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は、スペーサーによって分離されており、各スペーサーは、独立して、（Ａ）ＧＧＡＴ、（Ｂ）ＣＡＣＧＴＧ、または（Ｃ）ＧＣＡＴＧＣのうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置するスペーサーは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’および／または最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置し得る。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列間のスペーサーは同じである。２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号、および２０２０年２月１２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。

ＡＡＶ１
クレードＦ由来のＡＡＶｈｕ６８は、ＣＮＳ内でｈＰＧＲＮを標的化および発現するベクターを生成するために使用することができる。しかしながら、ＡＡＶ１媒介性ＰＧＲＮ送達は、同等の血漿中濃度が観察されたにもかかわらず、予想外に、ＡＡＶｈｕ６８よりもＣＮＳにおける優れたＰＧＲＮ発現を提供することが観察された。本発明者らは、ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮの髄腔内送達が、本明細書に記載される療法のための魅力的な送達経路であることを発見した。したがって、特に望ましい実施形態では、ＡＡＶ１カプシドが選択される。

特定の実施形態では、組成物が提供され、髄腔内注入に好適な水性液体と、上衣細胞を優先的に標的とするＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶのストックとを含み、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達のためのＰＧＲＮコード配列を有するベクターゲノムをさらに含む。特定の実施形態では、組成物は、大槽への（大槽内）後頭下注入用に製剤化される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによるｒ
ＡＡＶ注入を介して投与される。特定の実施形態では、患者に、単回用量の組成物を投与する。

ＡＡＶ１カプシドは、ＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、およびＡＡＶ ｖｐ３タンパク質を有するカプシドを指す。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドは、約１：１：１０の所定の比率のＡＡＶ ｖｐ１タンパク質、ＡＡＶ ｖｐ２タンパク質、およびＡＡＶ ｖｐ３タンパク質で構成され、６０個の総ｖｐタンパク質のＴ１正二十面体カプシドに組み立てられる。ＡＡＶ１カプシドは、ゲノム配列をパッケージングして、ＡＡＶ粒子（例えば、ゲノムがベクターゲノムである組換えＡＡＶ）を形成することができる。典型的には、最も長いｖｐタンパク質（すなわち、ＶＰ１）をコードするカプシド核酸配列は、ＡＡＶ１カプシドを有するｒＡＡＶの産生中にトランスで発現される。例えば、米国特許第６，７５９，２３７号、米国特許第７，１０５，３４５号、米国特許第７，１８６，５５２号、米国特許第８，６３７，２５５号、および米国特許第９，５６７，６０７号に記載されている（これらは、参照により本明細書に援用される）。

カプシドのコード配列は、最終的に組み立てられたｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮには存在しない。しかしながら、かかる配列は、組換えＡＡＶの産生に利用される。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドのコード配列は、配列番号２６の全長ＡＡＶ１ ＶＰ１タンパク質、またはそのＶＰ２領域もしくはＶＰ３領域をコードする任意の核酸配列である。例えば、米国特許第６，７５９，２３７号、米国特許第７，１０５，３４５号、米国特許第７，１８６，５５２号、米国特許第８，６３７，２５５号、および米国特許第９，５６７，６０７号を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドのコード配列は、配列番号２５である。一部の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドは、翻訳後修飾を伴うかまたは伴わない配列番号２５のコード配列から産生されるタンパク質である。しかしながら、このコード配列のバリアントは、操作され得、かつ／または他のコード配列は、ＡＡＶ１ ＶＰ１、ＡＡＶ１ ＶＰ２、および／またはＡＡＶ ＶＰ３のアミノ酸配列を使用して、所望の発現系のために逆翻訳され得る。

特定の実施形態では、カプシドを有する組換えＡＡＶ１を含む組成物は、配列番号２６に再現されるＡＡＶ１ ＶＰ１の一次配列の番号付けに基づいて、ＡＡＶ１が、高度に脱アミド化された５つのアミノ酸（Ｎ５７、Ｎ３８３、Ｎ５１２、およびＮ７１８）を含む。

特定の実施形態では、ＡＡＶ１は、質量分析を使用して決定されたカプシド中のＶＰタンパク質の総量に基づいて、以下の表で定義されるように脱アミド化されたＶＰアイソフォームの異種集団のカプシド組成によって特徴付けられる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、質量分析を使用して決定される、以下に提供される範囲で、以下の位置のうちの１つ以上で修飾される。残基番号は、配列番号２６に再現される公開されたＡＡＶ１配列に基づく。

好適な修飾には、脱アミド化標識された上記段落に記載の修飾が含まれ、本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、以下の位置、またはＮに続くグリシンのうちの１つ以上は、本明細書に記載されるように修飾される。特定の実施形態では、５７位、３８３位、５１２位、および／または７１８位のＮに続くグリシンが保存されている（すなわち、未修飾のままである）ＡＡＶ１変異が構築される。特定の実施形態では、前文で示した４つの位置のＮＧは、天然配列で保存される。残基番号は、配列番号２６に再現される公開されたＡＡＶ１ ＶＰ１に基づく。特定の実施形態では、人工ＮＧは、上の表で特定される位置のうちの１つとは異なる位置に導入される。

ｒＡＡＶベクター
上述のように、ＡＡＶ１カプシドを有する組換えＡＡＶは、ＦＴＤの治療のための本明細書に記載される好ましいベクターである。特定の実施形態では、例えば、以下の実施例
では（例えば、ＡＡＶｈｕ６８またはＡＡＶ５）、他のＡＡＶカプシドを使用して、ｒＡＡＶが生成され得る。特定の実施形態では、ＡＡＶ１カプシドが選択され得、ｈＰＧＲＮのコード配列を含むベクターゲノムの要素のうちの１つ以上が置換され得る。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＷＯ２０１８／１６０５８２で定義されるカプシドを指す（参照により本明細書に援用される）。本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有し、配列番号３１のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列（配列番号３０）、および任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２の固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）からのカプシドを発現する産生システムで産生される。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有し、配列番号３１の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号３０の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を含まない配列番号３１のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号３０の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を含まない配列番号３１のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号３０のｎｔ４１１～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶ５カプシドは、配列番号２９の予測されたアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＡＡＶ５カプシドは、配列番号２８の核酸配列から発現される。

ＡＡＶカプシドにパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でもトランス遺伝子、およびその調節配列、およびＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から構成される。一本鎖ＡＡＶおよび自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に連結される。

ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’および３’逆位末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；ａｎ
ｄ Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素が５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列である。Ｄ配列および末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ ５’および３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、シュードタイプであると称され得る。しかし、これらの要素の他の構成も好適であり得る。

組換えＡＡＶベクターについて上述した主要要素に加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にするような様式で導入遺伝子と作動可能に連結される必要な従来の制御要素も含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。

調節制御要素は、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、または生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに使用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリベータアクチンプロモーターから選択され得る。プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の適切なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。代替的には、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分断される。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータアクチンイントロンをさらに含む。他の好適なイントロンとしては、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、国際公開第ＷＯ２０１１／１２６８０８号に記載されている。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定化させ得る。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され
得る（例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９を参照されたい）。

一実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ヒトＰＧＲＮのコード配列、またはそれらを含む融合タンパク質、ポリＡ、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ヒトＰＧＲＮのコード配列、またはそれらを含む融合タンパク質、ポリＡ、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、プロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ｈｕＰＧＲＮコード配列、ポリＡ、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＥＦ１ａプロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なプロモーター、ｈｕＰＧＲＮ、ＳＶ４０ポリＡ、およびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＵｂＣプロモーター、任意選択的なエンハンサー、任意選択的なイントロン、ｈｕＰＧＲＮ、ＳＶ４０ポリＡ、およびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、ｈｕＰＧＲＮ、ＳＶ４０ポリＡ、およびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ、ＣＢ７プロモーター、イントロン、ｈｕＰＧＲＮ、ウサギβグロビンポリＡ、およびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲである。例えば、配列番号２２（ＥＦ１ａ．ｈｕＰＧＲＮ．ＳＶ４０）、配列番号２３（ＵｂＣ．ＰＩ．ｈｕＰＧＲＮ．ＳＶ４０）、または配列番号２４（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ１．ｒＧＢ）を参照されたい。ｈｕＰＧＲＮのコード配列は、本明細書で定義される配列から選択される。例えば、配列番号３もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、または配列番号４もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、あるいは本明細書に定義されるその断片を参照されたい。以下の実施例で使用されるベクターエレメントの例示的な配列は、例えば、配列番号６（ウサギグロビンポリＡ）、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号７および８）、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター（配列番号９）、ＣＢプロモーター（配列番号１０）、キメライントロン（配列番号１１）、ＵｂＣプロモーター（配列番号１２）、ＥＦ－１ａプロモーター（配列番号１７）、イントロン（配列番号１３）、およびＳＶ４０後期ポリＡ（配列番号１４）で提供される。ベクターゲノムの他の要素またはこれらの配列上のバリエーションは、本発明の特定の実施形態について、ベクターゲノムに対して選択され得る。

ベクター産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製およびパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／または当業者によって容易に設計することができる。

ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたい（これら
の各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。導入遺伝子をビリオンにパッケージするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。

一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを産生するために、その上に運ばれる免疫グロブリン構築物配列をパッケージング宿主細胞に導入する遺伝要素（例えば、シャトルプラスミド）に操作される。一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。代替的には、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成するために、またはインビトロでの抗体の混合物の産生のために使用され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。

用語「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。かかるカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列を含んでいなくてもよく、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージングされたゲノム配列のみを含んでいてもよい。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。

本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、およびｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。

一実施形態では、組換えＡＡＶを産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でＡＡＶカプシドタンパク質を発現する核酸、ＡＡＶカプシド中にパッケージするのに好適な核酸分子、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノム、および宿主細胞中の産物の発現を指示する配列と作動可能に連結される遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列、ならびに組換えＡＡＶカプシドへの核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）で構成される。

典型的には、ｒｅｐ機能は、ベクターゲノムに隣接するＩＴＲを提供するＡＡＶと同じＡＡＶソースに由来する。本明細書の実施例では、ＡＡＶ２ ＩＴＲを選択し、ＡＡＶ２
ｒｅｐを使用する。コード配列は、配列番号２７に再現される。任意選択的に、他のｒ
ｅｐ配列または別のｒｅｐソース（および任意選択的に別のＩＴＲソース）が選択されてもよい。例えば、ｒｅｐは、これらに限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、またはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、およびｒｅｐ４０／５２、もしくはそれらの断片であり得る。任意で、ｒｅｐおよびｃａｐ配列は、細胞培養物中の同じ遺伝子要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーが存在し得る。これらのＡＡＶまたは変異ＡＡＶカプシド配列のいずれかは、宿主細胞中でそれらの発現を指示する外因性制御性調節配列の調節下にあり得る。

一実施形態では、細胞は、適切な細胞培養（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、生成されたプラスミドは、ＡＡＶゲノムおよび目的の遺伝子をコードするＡＡＶのシス－プラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶのトランス－プラスミド、ならびにアデノウイルスのヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ベクターを含む細胞および培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮの製造プロセスは、プラスミドＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを伴う。単一バッチまたは複数バッチは、ＰＡＬＬ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターで、ＨＥＫ２９３細胞のＰＥＩ媒介性三重トランスフェクションによって産生される。回収したＡＡＶ材料は、可能な場合、使い捨ての閉鎖型バイオプロセッシングシステムにおいて、清澄化、ＴＦＦ、アフィニティクロマトグラフィ、およびアニオン交換クロマトグラフィによって順次精製される。

回収されたベクターを含む細胞および培養培地は、本明細書では、粗細胞回収物と称される。さらに別のシステムでは、遺伝子治療ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい（各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これらおよび他のＡＡＶ生産システムの製造および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、および７，４３９，０６５（これらは、参照により本明細書に援用される）。

粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、および／またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの、追加の方法ステップに供される。

２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィ精製、続いて、アニオン交換樹脂
クロマトグラフィを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号にさらに詳細に記載されている（これは、参照により本明細書に援用される）。ＡＡＶ８の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、およびｒｈ１０の精製方法：２０１６年１２月９日に出願され、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」と題する国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号（２０１５年１２月１１日にも出願されている）、ならびにＡＡＶ１の精製方法：２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号、２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」は、すべて参照により本明細書に援用される。

空および充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線型方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで除算して、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って、次いで１００を掛けることよって、空粒子のパーセンテージを得る。

一般に、空のカプシドおよびパッケージされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、本方法は、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供し、次いで、試料材料が分離するまでゲルを泳動し、ナイロンまたはニトロセルロースの膜（好ましくは、ナイロン）にゲルをブロットすることを含む。抗ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質に結合する一次抗体、好ましくは、抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法が使用され、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列
に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。

一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテアーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度で（例えば、約３７℃～約５０℃）より長い時間にわたって（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度で（例えば、最高約６０℃）より短い時間にわたって（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。

追加的に、または代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

簡潔に言うと、パッケージされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ粒子をゲノム欠損ＡＡＶ中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶウイルス粒子およびＡＡＶカプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィに供することを含み、ＡＡＶウイルス粒子およびＡＡＶ中間体は、高ｐＨで平衡化された強力アニオン交換樹脂に結合され、約２６０および約２８０で紫外吸光度のために溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供される。ｐＨは、選択されたＡＡＶに応じて調整され得る。例えば、ＷＯ２０１７／１６０３６０（ＡＡＶ９）、ＷＯ２０１７／１００７０４（ＡＡＶｒｈ１０）、ＷＯ２０１７／１００６７６（例えば、ＡＡＶ８）、およびＷＯ２０１７／１００６７４（ＡＡＶ１）を参照されたい（これらは、参照により本明細書に援用される）。この方法では、ＡＡＶ完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が感染ポイントに到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィステップのために、透析濾過された産物を、ＡＡＶ２血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉する。

組成物
本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮストック（例えば、ｒＡＡＶス
トック）、および任意選択的な担体、賦形剤および／または防腐剤を含む組成物が提供される。ｒＡＡＶストックは、同じである複数のｒＡＡＶベクターを指し、例えば、濃度および用量単位の考察において以下に記載される量である。

特定の実施形態では、組成物は、プログラニュリン関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を治療する際の使用に好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であるウイルスストックを含み、当該ｒＡＡＶは、（ａ）アデノ随伴ウイルス１カプシドと、（ｂ）ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、当該ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、ベクターゲノムと、を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ヒトＰＧＲＮのコード配列、およびポリアデニル化シグナルを含む。特定の実施形態では、イントロンは、ニワトリベータアクチンスプライスドナーおよびウサギβスプライスアクセプターのエレメントからなる。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲをさらに含み、これらは、ベクターゲノムのすべてのエレメントに隣接する。

ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮは、好ましくは生理学的に適合する担体に懸濁され、ヒト患者または非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは、約７．２８～約７．３２、または髄腔内送達の場合、約７．２～約７．４であるので、この範囲内のｐＨが望ましいが、静脈内送達の場合、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい場合がある。しかし、最も広い範囲内の他のｐＨ、およびこれらの部分範囲が、他の送達経路のために選択されてもよい。

特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、ポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８をさらに含んでもよく、これは、ＢＡＳＦから市販され、以前、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていた。水溶液は、７．２のｐＨまたは７．４のｐＨを有し得る。

別の実施形態では、製剤は、緩衝生理食塩水溶液を含み得、１ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、１．４ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．８ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、および０．００１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）１８８が含まれる。例えば、ｈａｒｖａｒｄａｐｐａｒａｔｕｓ．ｃｏｍ／ｈａｒｖａｒｄ－ａｐｐａｒａｔｕｓ－ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ－ｆｌｕｉｄ．ｈｔｍｌ．を参照されたい。特定の実施形態では、ハーバード緩衝液が好ましい。

他の実施形態では、製剤は、１つ以上の透過促進剤を含んでもよい。好適な透過促進剤の例としては、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含んでもよい。

別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含
む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。

任意選択的に、組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。

本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。詳細には、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などに封入化された送達のいずれかのために製剤化され得る。

一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意で、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。

好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８ ［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーについて）に続いて、３桁数字を用いて命名され、初めの２桁数字ｘ１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。

ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学
的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。任意選択的に、髄腔内投与以外の経路、例えば、所望の臓器（例えば、肝臓（任意選択的に肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の親の投与経路などを使用することができる。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。

ウイルスベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療上有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの範囲の、（体重が７０ｋｇの平均的な対象を治療するために）約１×１０^９～１×１０^１６ゲノムウイルスベクターの濃度（その範囲内のすべての整数または分数量を含み、好ましくは、ヒト患者に対して、１．０×１０^１２ＧＣ～１．０×１０^１４ＧＣ）を含む溶液である。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、または９×１０^９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、または９×１０^１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、または９×１０^１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、または９×１０^１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、または９×１０^１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１４、２×１０^１４、３×１０^１４、４×１０^１４、５×１０^１４、６×１０^１４、７×１０^１４、８×１０^１４、または９×１０^１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１×１０^１５、２×１０^１５、３×１０^１５、４×１０^１５、５×１０^１５、６×１０^１５、７×１０^１５、８×１０^１５、または９×１０^１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒト適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり１×１０^１０～約１×１０^１２ＧＣの範囲であり得る。

特定の実施形態では、用量は、約１×１０^９ＧＣ／ｇ脳質量～約１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量～約１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量～約３．３３×１０^１３ＧＣ／ｇ脳質量の範囲である。特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。特定の実施形態では、用量は、１．１×１０^１２ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。特定の実施形態では、用量は、３．３３×１０^１３ＧＣ／ｇ脳質量よりも低い。

特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約３×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約４×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である
。特定の実施形態では、用量は、約５×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約６×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約７×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約８×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約９×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約１×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約２×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。特定の実施形態では、用量は、約４×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量である。

特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～２×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約３×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。特定の実施形態では、用量は、ｒＡＡＶの約５×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲の均一用量として、ヒトに投与される。

一部の実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約１×１０^１３～８×１０^１４ＧＣの範囲にある量のＡＡＶを含み得る。一部の実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。一部の実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約３×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。一部の実施形態では、組成物は、投薬量単位で製剤化され、ｒＡＡＶの約５×１０^１３～１×１０^１４ＧＣの範囲にある量のｒＡＡＶを含み得る。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、単回用量で対象に投与される。特定の実施形態では、複数回の用量（例えば、２用量）が所望される。

任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター、好ましくはミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定することができる。任意で、治療目的で記載されるものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。

本明細書で使用される場合、用語「髄腔内送達」または「髄腔内投与」は、脊柱管への注入を介する、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔への注入による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であってもよく、または実質内送達を介してもよい。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内）後頭下注入を介して投与される。特定の実施形態では、患者は、単回用量で投与される。

本明細書で使用される場合、用語「大槽内送達」または「大槽内投与」は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、もしくは大槽内への直接注入による、または永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮのストックは、髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ；０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含む人工ＣＳＦ）中に製剤化さ
れる。バッチを凍結し、その後解凍し、必要に応じてプールし、標的濃度に調整し、０．２２μｍフィルターを通して滅菌濾過し、バイアルを充填する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの製剤緩衝液を含む懸濁液は、ｐＨ７．２～７．４に調整される。

一実施形態では、本明細書で提供されるｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの用量の送達のための容量は、当業者により決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよく、成人用に、より高容量が選択されてもよい。典型的には、新生児用の好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択されてもよい。幼児のためには、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択されてもよい。小児用に、最高約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーンおよびティーン世代のためには、最高約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で、髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量および投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとるために、投薬量を調整してもよく、そのような投薬量は、組換えベクターが利用されるための治療用途に応じて変化し得る。

特定の実施形態では、組成物は、ｒＡＡＶ．ＥＦ１ａ．ｈｕＰＧＲＮ．ＳＶ４０、ｒＡＡＶ．ＵｂＣ．ＰＩ．ｈｕＰＧＲＮ．ＳＶ４０、またはｒＡＡＶＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ１．ｒＧＢを含む。ｒＡＡＶカプシドがＡＡＶｈｕ６８、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ１である組成物は、以下の実施例に例示される。特に好ましい実施形態では、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１である。特定の実施形態では、ｈｕＰＧＲＮのコード配列は、本明細書で定義される配列から選択される。例えば、配列番号３もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、または配列番号４もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列、あるいは本明細書に定義されるその断片を参照されたい。以下の実施例で使用されるベクターエレメントの例示的な配列は、例えば、配列番号６（ウサギグロビンポリＡ）、ＡＡＶ ＩＴＲ（配列番号７および８）、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター（配列番号９）、ＣＢプロモーター（配列番号１０）、キメライントロン（配列番号１１）、ＵｂＣプロモーター（配列番号１２）、ＥＦ－１ａプロモーター（配列番号１７）、イントロン（配列番号１３）、およびＳＶ４０後期ポリＡ（配列番号１４）で提供される。

使用
本明細書で使用される場合、ＰＧＲＮハプロ不全は、欠乏したＰＧＲＮおよび／またはＧＲＮのレベルをもたらす、ＰＧＲＮ遺伝子の変異を有する患者を指す。ｒＡＡＶ１－ＰＧＲＮ療法の標的集団には、ＰＧＲＮハプロ不全を有する患者、および／またはその他の欠乏したＰＧＲＮまたはＧＲＮのレベルを有する患者が含まれる。特定の実施形態では、患者は、ＰＧＲＮ変異についてヘテロ接合である。さらに別の実施形態では、患者は、ＰＧＲＮ変異由来のホモ接合である。特定の実施形態では、患者は、本明細書で提供されるｒＡＡＶ１媒介性ｈＰＧＲＮ療法と組み合わせた免疫抑制レジメンが投与される。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮは、ＧＲＮハプロ不全を有する患者の治療に有用である。かかる患者は、ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性症と診断された可能性があるか、または症状前である可能性がある。ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮは、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内［ＩＣＭ］）後頭下注入を介して、単回用量として投与することができる。単回用量は、所定の用量レベルで投与される。ＮＨＰにおける単回ＩＣＭ注入により達成された優れた脳形質導入により、この投与経路が選択された。特定の実施形態では、ベクターのＩＣＭへの投与はまた、別の投与経路（例えば、側脳室への注入）と比較して、抗ＰＧＲＮ Ｔ細胞応答の低下をもたらす。一般的な手順では、ＩＣＭ注入（後頭下穿刺としても知られている）は、以前は腰椎穿刺によって置き換えられていた。しかしながら、他の投薬レベルおよび送達経路は、このｒＡＡＶ１媒介性ｈＰＧＲＮ療法と併せて選択および／または使用されてもよ
い。

特定の実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶ１媒介性療法は、ＧＲＮ変異を有しないヒト（ハプロ不全）に対して、およそ平均的で正常な生理学的レベルで、ＰＧＲＮ発現を提供し得る。しかしながら、治療は、ＰＧＲＮ発現の増加が正常レベルよりも低い場合であっても、治療効果を提供し得、正常な平均レベルの約４０％～９９％、例えば、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはこれらの間の他の値を提供する。特定の実施形態では、これは、治療前の患者の発現レベルを上回る、少なくとも５％～約７０％、またはそれ以上のＰＧＲＮレベルの増加から生じ得る。特定の実施形態では、治療は、ｒＡＡＶ１媒介性ｈＰＧＲＮの投与が、ＣＳＦ中のＰＧＲＮのレベルの上昇（例えば、正常レベルよりも１０倍～４０倍高い）をもたらす治療有効性を提供する。

特定の実施形態では、有効性は、ＣＳＦにおけるＰＧＲＮタンパク質のレベルの増加、および／または脳皮質の厚さの変化のうちの１つ以上によって評価される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ１媒介療法の有効性は、単回ＩＣＭ用量の投与後に評価され、長期生存、ならびにミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）、臨床全般印象変化（ＣＧＩ－Ｃ）、前頭葉機能検査（ＦＡＢ）、前頭側頭型認知症評価尺度（ＦＲＳ）、前頭葉性行動質問紙（ＦＢＩ）、統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）、言語流暢性検査、前頭側頭葉変性症の臨床認知症尺度評価項目合計（ＣＤＲ－ＦＴＬＤ ｓｂ）、および／または神経精神症状質問紙（ＮＰＩ）によって評価される臨床症状および日常機能の改善のうちの１つ以上によって測定される。特定の実施形態では、有効性は、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、タウ、リン酸化タウ、および炎症マーカーのＣＳＦレベルの改善、ならびに／またはＰＧＲＮの血漿中レベルの増加によって実証される。特定の実施形態では、有効性は、ミクログリオーシスのレベルの減少または逆転を測定することによって評価される。

特定の実施形態では、有効性は、ＧＲＮ患者に関連する臨床症状のうちの１つ以上の改善によって測定され、これには、例えば、行動上の欠陥（脱抑制、無気力、同情または共感の喪失、強迫的または常同的な行動、または口唇傾向）および認知上の欠陥（エピソード記憶または視覚空間スキルに重大な影響を及ぼさない実行機能の低下）が含まれる。

特定の実施形態では、改善は、いくつかの他のより非定型的な症状において観察され、精神医学的特徴（妄想、幻覚、および強迫行動）および／または他の認知障害（エピソード記憶障害、失行、および視空間機能障害）を含む、評価は、ＦＴＤＣ基準を使用して行われてもよく、前頭葉変性および／または側頭葉変性の徴候についての脳イメージング、臨床評価尺度（前頭側頭葉変性症の臨床認知症尺度［ＣＤＲ－ＦＴＬＤ］、前頭葉性行動質問紙［ＦＢＩ］、神経精神症状質問紙［ＮＰＩ］、および前頭側頭型認知症評価尺度［ＦＲＳ］など）での減少の評価、および最終的には、病原性ＧＲＮ変異を確認するための遺伝子検査を含む。脳脊髄液（ＣＳＦ）のバイオマーカーを使用してもよく、タウおよびアミロイド－β、ならびにアミロイドの陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングが含まれる。

特定の実施形態では、改善は、原発性進行性失語（ＰＰＡ）を有するＧＲＮ変異保因者において観察され、これは、発話および言語に関連する症状によって特徴付けられる。これらは、ＰＰＡの３つの臨床型である意味型ＰＰＡ（ｓｖＰＰＡ）、非流暢型ＰＰＡ（ｎｆｖＰＰＡ）、およびロゴペニック型ＰＰＡ（ｌｖＰＰＡ）を区別するメスラム基準に基づくガイドラインを使用して診断され得る（Ｇｏｒｎｏ－Ｔｅｍｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｐｈａｓｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｖａｒｉａｎｔｓ．”Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．７６（１１）：１００６－１４）。ｎｆｖＰＰＡは、発話を生成する能力の欠陥を呈
し、基本的な特徴としては、言語生成における失文法、努力性発話、および発話の失行が挙げられる。ｓｖＰＰＡは、単語の意味を理解する能力の欠陥を呈し、基本的な特徴としては、単語の呼称および単語の理解の障害が挙げられる。ｌｖＰＰＡは、会話中に適切な単語を見つけることが困難であることを特徴とするが、単語の理解の低下を伴わない。ｌｖＰＰＡの基本的主な特徴は、単語の想起および文の復唱の能力の欠陥である。ＧＲＮ変異保因者は、ｎｆｖＰＰＡで最も一般的であるが、ＰＰＡの臨床スペクトルにわたってより広範な症状を有する場合があり、「ＰＰＡ－特定不能（ｎｏｔ ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）」の診断をもたらす（Ｇｏｒｎｏ－Ｔｅｍｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｗｏｏｌｌａｃｏｔｔ ａｎｄ Ｒｏｈｒｅｒ，２０１６）。

ＧＲＮハプロ不全に関連する神経変性状態を有するヒト患者を治療する方法が提供される。特定の実施形態では、この状態は、プログラニュリン関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）である。本方法は、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を介して、プログラニュリンのコード配列を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージされるベクターゲノムをさらに含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。

プログラニュリンに関連する前頭側頭型認知症またはＧＲＮハプロ不全に関連する別の神経変性状態、に関連する脳病変を有するヒト患者を治療するための方法が提供される。本方法は、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を介して、プログラニュリンのコード配列を中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含み、当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムをさらに含み、当該ベクターゲノムは、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびプログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む。

特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、（ａ）脳病変の減少の予測因子として網膜蓄積病変の減少について患者を非侵襲的に評価すること、（ｂ）磁気共鳴画像法を行って脳体積を評価すること、および／または（ｃ）ＣＳＦ中のプログラニュリンの濃度を測定することによって、治療をモニタリングすることをさらに含み得る。任意選択的に、血漿中のプログラニュリン濃度を評価してもよい。

特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮ組成物の有効性は、主に認知的方法、主に行動的方法、または認知／他の方法のうちの１つ以上によって評価される。以下に、好適な評価について説明する。

主な認知評価には、言語流暢性検査、ＦＴＬＤの臨床認知症比率、またはミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）がある。言語流暢性検査は、各対象に同じ絵／写真を提示し、口頭での説明を求めることによって実施される可能性がある。説明中に、発話速度（単語／分）がカウントされ、記録され、最終的に定型発達の成人を反映する速度と比較される。ＣＤＲ－ＦＴＬＤは、古典的なＣＤＲの拡張版であり、歴史的に、アルツハイマー病のスペクトル障害の重症度を評価するために使用されている。この評価には、ＣＤＲの元の６つのドメイン（記憶、見当識、判断力と問題解決、社会適応、家庭状況と趣味、介護状況）、ならびに言語および行動という２つの追加のドメインが含まれ、ＦＴＬＤの低下を検出する際に、感度がより高くなる。「０」の評価は、正常な行動または言語を示し、「１」、「２」、または「３」のスコアは、軽度から重度の障害を示す。「評価項目合計（ｓｕｍ ｏｆ ｂｏｘｅｓ）」、または個々のドメインスコアの合計は、全体的な認知症の重症度を決定するために使用される。ＭＭＳＥは、臨床および研究の実践で広く使用されている１１問の全体的な認知評価である。質問としては、例えば、「今年は何年ですか？季節はいつですか？何日ですか？何曜日ですか？何月ですか？」と尋ねられ、正解ごと
に１ポイントが与えられ、質問ごとに最高得点が与えられる。総得点の上限は３０点で、２４点と２７点の２つのカットオフがある。これらのカットオフは、認知機能低下の指標である。

主な運動評価には、例えば、統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）が含まれる。ＵＰＤＲＳは、メンテーション、行動、日常生活の気分と活動など、パーキンソニズムに関連するいくつかのドメインの４２項目の４部構成の評価である。各項目は、典型的には、０（典型的には障害なしを示す）から４（典型的には最も重度の障害を示す）の範囲の評価尺度を含む。各部のスコアは、疾患の重症度を提供するために集計され、高スコアの１９９点は、最悪／最も完全な障害を示す。

主な行動評価としては、例えば、神経精神症状質問紙（ＮＰＩ）または前頭葉性行動質問紙（ＦＢＩ）が含まれる。ＮＰＩは、脳の障害を有する患者における精神病理の存在を解明するために使用される。当初、これはアルツハイマー病の集団で使用するために開発されたが、他の条件における行動の変化を評価するのに役立つ場合がある。この評価は、１０の行動ドメインと２つの自律神経領域で構成され、その中には、４つのスコア：頻度、重症度、総合的な負担、および介護者の負担がある。ＮＰＩの総スコアは、行動ドメインのドメインスコアを加算し、介護者負担のスコアを減算することによって得られる。ＦＢＩは、ｂｖＦＴＤに特に関連する行動および人格の変化を評価し、ＦＴＤと他の認知症間を区別することを目的とした２４項目の評価である。ｂｖＦＴＤと診断された患者は、一般に、これらのタイプの変化について十分な洞察を有していないため、これは、主介護者との対面面接として実施される。行動と人格に関連するいくつかの分野に焦点を当て、各質問を０（なし）から３（重度／ほとんどの場合）まで採点する。総スコアは、病気の重症度に関する洞察を提供し、経時的な変化を評価するために使用することができる。

他の／認知および運動評価の両方には、例えば、コロンビア自殺重症度評価尺度（Ｃ－ＳＳＲＳ）、臨床全般印象度変化（ＣＧＩ－Ｃ）、前頭葉機能検査（ＦＡＢ）、および／または前頭側頭型認知症評価尺度（ＦＤＲ）が含まれる。Ｃ－ＳＳＲＳは、自殺の念慮と行動を評価するための質問を通して、自殺念慮、念慮の強度、自殺行動を測定する３部構成の尺度である。この評価の結果は、尺度から直接取得される自殺行動致死率評価、自殺念慮スコア、および自殺念慮強度評価で構成される。０を超える念慮スコアは、評価ガイドラインに基づいて、介入の必要性を示し得る。強度評価は、０～２５の範囲であり、０は、自殺念慮の支持なしを表す。ＣＧＩ－Ｃは、３部の簡潔で広く使用されている評価のうちの１つであり、３項目で構成され、臨床医と観察者によって評価される。ＣＧＩ－Ｃは、改善が完全に治療によるものであるかどうかにかかわらず、研究への登録から始まり、１（非常に改善された）から７（非常に悪化した）の範囲の７段階で評価される。ＦＡＢは、前頭葉性遂行機能障害表現型認知症とアルツハイマー型認知症間の区別を補助するための簡易評価である。これは、軽度の痴呆患者（ＭＭＳＥ＞２４）において特に有用である。評価は、認知、運動、および行動の領域に対処する６部で構成され、総スコアが１８で、より高いスコアは、より良好なパフォーマンスを示す。ＦＤＲは、前頭側頭型認知症の患者のための簡易病期分類評価であり、経時的なＦＴＤサブタイプの疾患進行の差異を検出する。この簡単な面接は、主介護者と共に実施され、３０項目からなり、「起こらない」、「時々起こる」、または「常に起こる」に分類される。次いで、パーセンテージスコアが計算され、ロジットスコア（ｌｏｇｉｔ ｓｃｏｒｅ）、そして最終的には、重症度スコアに変換される。重症度スコアは、「非常に軽度」から「最重度」までの範囲である。

有効性の他の尺度としては、症状の発症後、診断時点からの生存期間の増加が挙げられ、有効性の尺度である。現在、ＧＲＮ変異によって引き起こされる神経変性と診断された患者の平均寿命は、症状の発症から７～１１年である。有効性の別の尺度は、標的集団に
おけるすべての臨床症状にわたって最も一般的に影響を受ける脳領域である内側前頭皮質および頭頂領域の厚さにおける萎縮の安定化および／または増加である。これは、ＭＲＩまたは他の画像診断技術を使用して評価することができる。さらに他の評価には、生化学的バイオマーカーが含まれる。ＣＳＦ中および血漿中のＰＧＲＮタンパク質のレベルは、ＡＡＶ形質導入の読み出しとして測定され、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの投与後、患者において増加することが予想される。他の実施形態では、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、タウ、リン酸化タウ、および他の炎症マーカーのＣＳＦレベルが評価される。特定の実施形態では、これらのバイオマーカーのレベルの調節および／または減少は、有効性と相関する。

以下の実施例は、ヘテロ接合ＧＲＮハプロ不全に関連する特定の状態の治療に焦点を当てているが、特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターおよび組成物は、他の疾患、例えば、神経セロイドリポフスチン症、癌（例えば、卵巣癌、乳癌、副腎癌、および／または膵臓癌）、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病、および代謝性疾患などのＧＲＮ遺伝子のホモ接合性変異に関連する疾患の治療に使用され得る。

本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。

「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、望ましくは、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、アミノ酸またはその断片に対して言及される場合、適切なアミノ酸の挿入または欠失を伴って別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてアミノ酸配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、もしくはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または少なくとも８アミノ酸長であるそれらの断片、もしくはより好ましくは、少なくとも１５アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。

「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。

一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列した」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶ整列を行う。整列は、公共のまたは市販のいずれかの様々な多重配列整列プログラムを用いて行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）と共に使用して決定することができる。「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたは整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ
ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。
したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％（±１０％、例えば、±１、±２、±３、±４、±５、±６、±７、±８、±９、±１０、またはそれらの間の値）の可変性を意味する。

本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、および「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性または安定であり得る。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得、そのカセットは、遺伝子要素（例えば、プラスミド）によりパッケージング宿主細胞に送達され得、ウイルスベクターのカプシド（例えば、ウイルス粒子）へパッケージされる。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのかかる発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的の遺伝子に連続している発現制御配列、およびトランスでまたは離れて作用して目的の遺伝子を制御する発現制御配列の両方を指す。

タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質または核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない、２つ以上の配列または部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、異なる遺伝子からコード配列の発現を指示するように配置された１つの遺伝子由来のプロモーターを有する。したがって、コード配列に関して、プロモーターは、異種性である。

本発明の文脈における「翻訳」という用語は、リボソームでのプロセスに関し、ｍＲＮＡ鎖は、アミノ酸配列の集合を制御して、タンパク質またはペプチドを生成する。

以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。

実施例１：材料および方法：
ベクター
操作されたヒトＰＧＲＮ ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルス初期エンハンサーを有するニワトリベータアクチンプロモーター、キメライントロン、およびウサギβグロビンポリアデニル化配列を含む発現構築物にクローニングした（図１）。第２の操作されたヒトＰＧＲＮ ｃＤＮＡを、ヒトユビキチンＣプロモーターを含む発現構築物にクローニングした。発現構築物は、ＡＡＶ２逆位末端反復に隣接した。アデノ随伴ウイルス血清型１、５およびヒト６８（ＡＡＶｈｕ６８）は、前述のようにＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションおよびイオジキサノール精製によって、この構築物から生成された（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１（１０）：１２５９－７１）。

動物手順
すべての動物プロトコルは、ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにより認可された。つがいのＧＲＮノックアウトマウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号０１３１７５）から購入し、コロニーをペンシルベニア大学で維持した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６（ストック番号０００６６４）は、対照として機能した。最初の研究では、２ヶ月齢のマウスをイソフルランで麻酔し、１×１０^１１ベクターゲノムコピー（ＧＣ）を５μＬの量で側脳室（ＩＣＶ）に注入した。注入６０日後、マウスを、ケタミン／キシラジン麻酔下、失血により安楽死させ、頚椎脱臼により、死亡を確認した。第２の研究では、マウスは、７ヶ月齢で処置され、１１ヶ月齢で犠牲にされた。剖検時に、血清を、心臓穿刺により採取し、ＣＳＦを、ポリエチレンチューブに連結された３２ゲージ針を用いて、後頭下穿刺により採取した。血清およびＣＳＦ試料を、ドライアイス上で即時凍結し、分析時まで－８０度で保存した。前頭皮質を、生化学用に回収し、ドライアイス上で即時凍結し、残りの脳は、組織学用に１０％のホルマリンで固定した。

３～４歳齢のアカゲザルを、Ｃｏｖａｎｃｅから購入した。ベクター投与のために、動物を筋肉内デクスメデトミジンおよびケタミンで鎮静し、１ｍＬの人工ＣＳＦ中の３×１０^１３ＧＣのＡＡＶベクターを、単回大槽内（ＩＣＭ）注入で投与した。針の配置は、前述のように、透視装置（ＯＥＣ９８００ Ｃ－Ａｒｍ，ＧＥ）を用いた脊髄造影法により検証した（Ｋａｔｚ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８ Ｏｃｔ；２９（５）：２１２－２１９）。動物は、バルビツール酸過剰投与により、安楽死させた。回収した組織を、ドライアイス上で即時凍結するか、または組織学用に１０％ホルマリンで固定した。

組織学および画像診断
マウスの脳を１０％ホルマリンで固定し、スクロース中で凍結保存し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、クリオスタットで切片化した。目的の領域の自己蛍光物質（リポフスチン）の低倍率画像を撮影した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、リポフスチン沈着物を盲検で定量した。非ヒト霊長類組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。スライドは、委員会認定の獣医病理学者（ＥＬＢ）によって審査された。ＧＦＰベクターで処置された動物の場合、脳切片を、ｏｌｉｇ２、ＧＦＡＰ、またはＮｅｕＮに対する抗体で染色した。すべての切片を、ＤＡＰＩおよびＧＦＰに対する抗体、続いて蛍光二次抗体で共染色した。スライドをＬｅｉｃａ Ａｐｅｒｉｏ Ｖｅｒｓａ ２００スライドスキャナーでスキャンし、ｅＳｌｉｄｅ Ｍａｎａｇｅｒからダウンロードして、ＨＡＬＯイメージングソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）で分析した。各動物について右半球の５つの領域をサンプリングし、各細胞型マーカーを用いて細胞を定量した。細胞を、以下の設定を調整することによって検出した：核検出タブの下で「最小核強度」、「核サイズ」、「核セグメンテーションアグレッシブネス」、および「最小核ラウンドネス」。次いで、個々の色素ごとに基準を定義して、細胞をさらに同定し、各マーカーの定量的な総細胞数を生成した。設定は、所望の細胞型の検出の感度および信頼性に基づいて経験的に決定された。一部の場合、細胞質におけるＮｅｕＮの検出などの設定は、マーカーの真の細胞内局在を反映しなかったが、より高い特異性および感度の検出を提供した。自動化された手段によって検出されたすべての細胞は、手動で検証された。ニューロンについては、「色素１」タブの下、「核陽性閾値」および「細胞質陽性閾値」を調整して、核および細胞質の両方に存在するＮｅｕＮを有する細胞のみを検出した。アストロサイトについては、ＤＡＰＩおよびＧＦＡＰマーカーを選択し、細胞の核および細胞質の両方に存在する場合、カウントに含めた。オリゴデンドロサイトについては、ＤＡＰＩとｏｌｉｇ２の両方が核に存在するが、細胞の細胞質には存在しない場合、細胞をカウントした。共局在については、同じ設定が使用されたが、ニューロンでは核、ならびにアストロサイトでは核および細胞質の両方で、ＧＦＰが追加の色素として含まれた。すべての選択されたマーカーを発現しなかった細胞は、核または細胞質の「マスク」機能を使用して「マスキング」することによって、生成される結果表から除外された。ｏｌｉｇ２と共局在するＧＦＰ陽性細胞が稀なため、形質導入されたオリゴデンドロサイトは手動でカウントした。場合によって、自己蛍光を示す血管または脈絡叢の一部は、「はさみ」ツールを使用して手動で、輪郭を描き、除外した。得られた値を、各細胞型マーカーのＧＦＰ陽性細胞の割合として表した。

ヘキソサミニダーゼ（Ｈｅｘ）アッセイのための試料調製
血清は、Ｈｅｘ活性アッセイに直接使用したが、脳試料は、溶解緩衝液（０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、０．９％のＮａＣｌ、ｐＨ４．０）中でホモジナイズした後、３回の凍結融解サイクルおよび遠心分離による清澄化を行った。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイによって決定した。Ｈｅｘの活性測定は、以前に記載されているように実行した（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１４；２２（１２）：２０１８－２７）。

ＥＬＩＳＡ
ヒトＰＧＲＮは、わずかな修正を加えて、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ＃ＤＹ２４２０）を使用して測定した。簡潔には、高結合ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に希釈された５ｕｇ／ｍｌのヒトＰＧＲＮ捕捉抗体で、４℃で一晩コーティングした。洗浄後、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で２時間プレートをブロッキングし、続いて、試料を１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で、ヒトおよび非ヒト霊長類のＣＳＦを１：５に希釈し、一方、マウスのＣＳＦ試料を１：４０に希釈した。脳試料を、総タンパク質濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように、溶解緩衝液に希釈した。結合した抗体は、ビオチン化マウス抗ヒトプログラニュリン抗体およびストレプトアビジン－ＨＲＰを用いて検出した。プレートを、テトラメチルベンジジン基質を使用して２０分間現像し、２Ｎの硫酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

中和抗体アッセイ
ＡＡＶｈｕ６８に対する中和抗体は、前述のように評価された（Ｃａｌｃｅｄｏ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００９；１９９（３）：３８１－９０）。

統計
野生型マウス、ＧＲＮノックアウトマウス、およびＡＡＶ処置ＧＲＮノックアウトマウスにおけるＨｅｘ酵素活性、リポフスチン数、およびＣＤ６８＋領域の比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて事後テューキーの多重比較検定を使用して行った。

実施例２：マウス疾患モデルにおけるヒトＧＲＮ導入遺伝子のＡＡＶ媒介性送達
ＣＢ７プロモーターおよびキメライントロンの制御下でヒトＰＧＲＮ（配列番号３）を発現するＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する組換えＡＡＶベクター（ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ）は、例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８２に記載されている公開された三重トランスフェクション技術を使用して産生された。

本発明者らは、ＧＲＮノックアウトマウスモデルにおけるヒトＧＲＮ導入遺伝子のＡＡＶ媒介性送達を評価した。ヘテロ接合のＧＲＮ変異のマウスは（ＧＲＮ^＋／－）、ＧＲＮ関連神経変性疾患の病理学的特徴を示さない。これは、おそらく、マウスの寿命では、ヒトにおいて数十年後に初めて現れるＧＲＮハプロ不全の後遺症の発生が不可能であるためである。対照的に、ＧＲＮ^－／－マウスにおける完全なＰＧＲＮ欠損では、ヒトにおけるＧＲＮハプロ不全のいくつかの初期の特徴（例えば、リソソーム機能の障害、自己蛍光リソソーム蓄積物質（リポフスチン）の蓄積、およびミクログリアの活性化）が再現されるが、ＧＲＮ^－／－マウスは、２歳齢まででさえニューロン損失が示さない（Ｌｕｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６５（４）：９２１－３５、Ｗａｒｄ ＭＥ，ｅｔ
ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１７ Ａｐｒ １２；９（３８５）：ｐｉｉ：ｅａａｈ５６４２）。ＧＲＮ^＋／－マウスおよびＧＲＮ^－／－マウスの両方とも、行動異常を示すことが報告されているが、所見は群間で一致していない（Ａｈｍｅｄ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；１７７（１）：３１１－２４、Ｗｉｌｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１２；２２８（１）：６７－７６、Ｇｈｏｓｈａｌ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ．２０１２；４５（１）：３９５－４０８、Ｆｉｌｉａｎｏ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｔｈｅ
ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３；３３（１２）：５３５２－６１、Ｙｉｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１０；２４（１２）：４６３９－４７）。同様に、一部の報告は、ＧＲＮ^－／－マウスにおける生存率の低下が示されたが、他の
報告では、ＧＲＮ^－／－マウスが、正常な寿命を有することが見出され、本発明者ら経験と一致した（Ａｈｍｅｄ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１０；１７７（１）：３１１－２４、Ｗｉｌｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２０１２；２２８（１）：６７－７６）。ＧＲＮ^－／－マウスは、明らかな神経変性または神経学的徴候を示さないが、ヒトにおけるＧＲＮハプロ不全との顕著な生化学的および組織学的類似性から、新規療法を評価するための潜在的に有益なモデルとなる。したがって、本発明者らは、ＧＲＮ^－／－マウスにおけるこれらの生化学的および組織学的所見に焦点を当てて分析を行った。

この研究の目的は、ヒトＧＲＮ遺伝子の脳への送達が、既存のリソソーム蓄積物質を排除し、ＧＲＮ^－／－マウスにおけるリソソーム機能を正常化することができるかどうかを評価することであった。リソソーム蓄積に応答して、細胞は、リソソーム酵素の発現を上方制御し、リソソーム蓄積症のバイオマーカーとして使用され得る（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１４；２２（１２）：２０１８－２７、Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１６；２４（２）：２０６－１６、Ｋａｒａｇｅｏｒｇｏｓ ＬＥ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９９７；２３４（１）：８５－９７）。我々は、異なる年齢のＧＲＮ^－／－およびＧＲＮ^＋／＋マウス、ならびに皮質、海馬、および視床におけるリポフスチン沈着物から、脳組織におけるリソソーム酵素ヘキソサミニダーゼの活性を評価した（図３Ａ～図３Ｄ）。ヘキソサミニダーゼ活性の上昇は、生涯を通して明らかであったが、リポフスチンは進行性の蓄積を示した。リポフスチンは、早くも２ヶ月齢で明らかであり、以前の所見と一致した（Ｋｌｅｉｎ ＺＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ２０１７；９５（２）：２８１－９６ ｅ６）。本発明者らの最初の研究は、天然分離株であるＡＡＶｈｕ６８に基づくＡＡＶベクターを用いて実施され、これは、クレードＦの分離株であるＡＡＶ９と密接に関連している。２～３ヶ月齢のＧＲＮ^－／－マウスを、ヒトＧＲＮを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターまたはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかの脳室内（ＩＣＶ）注入で処置した（群あたりＮ＝１０）。さらに、野生型マウスのコホートに、ビヒクル（Ｎ＝１０）を注入した。小規模の２ヶ月齢マウスでは、ＩＣＭ経路（ＮＨＰ研究および提案されたＦＩＨ臨床試験に使用されるＲＯＡである）を介してベクターを確実に投与することが困難になるため、ＩＣＶ ＲＯＡ（脳室のＣＳＦにＡＡＶベクターを直接注入することを伴う）を使用した。以前の研究では、この研究に選択された用量（１０^１１ＧＣ）でのＡＡＶｈｕ６８のＩＣＶ投与では、形質導入が注入された脳室近くの脳領域に限定されることが示され、小さな細胞集団によるＰＧＲＮの分泌によって、脳病変の全体的な改善が達成され得るかどうかを評価するための有用なシステムとなる。

ベクター投与の２ヶ月後、動物を安楽死させ、脳、ＣＳＦ、および血清を回収した。脳におけるヒトＰＧＲＮタンパク質レベルの定量化により、ＡＡＶ処置群における形質導入を確認した（図４Ａ～図４Ｆ）。ＰＧＲＮは、ＣＳＦ中の測定可能な分泌タンパク質であり、ヒトＧＲＮ変異保因者のＣＳＦ中で減少している（Ｌｕｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６５（４）：９２１－３５、Ｍｅｅｔｅｒ ＬＨ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｍｅｎｔ Ｇｅｒｉａｔｒ Ｃｏｇｎ Ｄｉｓ Ｅｘｔｒａ．２０１６；６（２）：３３０－４０）。したがって、本発明者らは、ＡＡＶ処置ＧＲＮ^／－マウスのＣＳＦにおけるＰＧＲＮタンパク質レベルを評価し、平均ＣＳＦ濃度が１４ｎｇ／ｍＬであることを明らかにしたが、一方、ビヒクル処置群では、ヒトＰＧＲＮは検出レベル未満であった（図４Ａ～図４Ｆ）。ＰＧＲＮの発現は、リソソーム酵素の発現の正常化を伴い、ＡＡＶ処置ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるＨｅｘ活性レベルが、ほぼ正常レベルに戻った（図４Ａ～図４Ｆ）。

ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるＰＧＲＮ発現を確認した後、ＰＧＲＮ発現が海馬、視床、および皮質におけるリポフスチン沈着物の数を減少させたかどうかを評価した。その目的で、未染色の固定脳切片をカバーガラスに載せ、盲検で自己蛍光リポフスチンを撮像した。ＡＡＶ処置ＧＲＮ^－／－マウスは、ビヒクル処置ＧＲＮ－／－マウスと比較して、すべての脳領域においてリポフスチンの減少を示し、同齢の野生型対照と同様のレベルを示した（図４Ａ～図４Ｆ）。

概念研究の最初の証明は、蓄積物質が脳に現れ始めたばかりの早い時期に、処置マウスにおいてＡＡＶ媒介性ＰＧＲＮ発現の治療活性を実証した。その後、より重篤な既存病態を有する高齢マウスにおける遺伝子導入の影響を評価した。この研究では、７ヶ月齢のＧＲＮ^－／－マウスは、ヒトＰＧＲＮまたはビヒクルを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターの単回ＩＣＶ注入を受け、１１ヶ月齢で犠牲になった。広範囲の脳リポフスチン沈着物（図５Ａ～図５Ｄ）に加えて、１１ヶ月齢のＧＲＮ^－／－マウスは、ＧＲＮ変異によって引き起こされるＦＴＤを有する患者（図６Ａ～図６Ｃ）と同様に、広範囲のミクログリオーシスを示した（Ａｈｍｅｄ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２００７ Ｆｅｂ １１；４：７）。ＧＲＮ遺伝子導入は、より若い動物における所見と同様に、老化マウスにおいて、脳Ｈｅｘ活性およびリポフスチン沈着物を減少させた（図５Ａ～図５Ｄ）。さらに、処置マウスの脳において、ミクログリアのサイズおよび数が正常化された（図６Ａ～図６Ｃ）。

併せると、ヒトＰＧＲＮを発現するＡＡＶベクターをＧＲＮ^－／－マウスの脳にＩＣＶ送達することで、リポフスチン凝集物が除去され、リソソーム酵素の活性がほぼ完全に正常化され、ＰＧＲＮ遺伝子送達によって、ＧＲＮ関連神経変性疾患の基礎となる病態生理の重要な側面が、効果的に修正され得ることを実証する。

実施例３：非ヒト霊長類におけるＡＡＶ媒介性ＧＲＮ遺伝子導入
ＧＲＮ^－／－マウスにおける所見は、ＡＡＶベクターのＣＳＦへの送達が、治療レベルのＰＧＲＮを産生し、ＰＧＲＮ欠乏に関連する生化学的および組織学的所見を予防または逆転させるのに十分な脳形質導入を達成できることを実証する。このアプローチをヒトに置き換えるために、臨床的に関連するベクター投与経路であるＩＣＭ送達を使用して、非ヒト霊長類で研究を実施した。大槽内への注入による髄腔内ＡＡＶ送達は、低侵襲性のアプローチであり、腰椎穿刺による投与よりも広範な脳形質導入をもたらす（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ＆ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２０１４；１：１４０５１）。３～１０歳のＮＨＰを利用したのは、この年齢が意図される成人患者集団を表すためである。アカゲザル（１群あたりＮ＝２）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、またはＡＡＶｈｕ６８ベクターのイメージガイドによる単回ＩＣＭ注入が投与され、これらのベクターは、ニワトリＢＡプロモーターおよびＣＭＶ ＩＥエンハンサー（ＣＢ７プロモーターと称される）の制御下で、ｈＰＧＲＮ（配列番号３）と称される導入遺伝子からヒトＧＲＮを発現する。さらなる群が、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）から発現される異なる操作導入遺伝子配列（ｈＰＧＲＮ ｖ２、配列番号４）を担持するＡＡＶｈｕ６８ベクターで処置された。ＣＳＦ中のヒトプログラニュリンのレベルは毎週測定され、注入の３５日後、組織病理学の分析のために、動物が犠牲になった。予備的な安全性分析が実施され、毎日のケージぎわでの観察、一連の身体検査、全血球数、血清化学パネル、ＣＳＦ化学検査および細胞診断、および脳および脊髄の顕微鏡評価を伴う完全な剖検が含まれた。以下の表に、処置群を要約する。

ベクター投与後のすべてのＮＨＰのＣＳＦにおいて、堅牢なＰＧＲＮ発現が検出された（図７Ａ）。ＡＡＶｈｕ６８ベクターで処置された２匹の動物は、健常なヒト対照のレベルよりも最大１０倍高いＣＳＦのヒトＰＧＲＮレベルを示し、ＧＲＮ^－／－マウスの脳におけるリソソーム異常を逆行させるレベルと類似していた。ＡＡＶ５処置は、ＡＡＶｈｕ６８とほぼ同等のＣＳＦ発現レベルをもたらした。ヒトＰＧＲＮの発現は、ＡＡＶ１ベクターで処置された動物において最大であり、正常なヒトレベルの４０倍超に達した。ＡＡＶｈｕ６８およびＡＡＶ１ベクターで処置されたＮＨＰ由来のＣＳＦおよび血漿の試料を、ヒトＰＧＲＮに対する抗体について試験した。４匹の動物は、すべて、ヒト導入遺伝子産物に対する抗体を発現し（図８Ａ～図８Ｃ）、研究の終了時の発現レベルの低下を説明し得る。ＣＳＦ中の抗ヒトＰＧＲＮ抗体の応答の開始は、導入遺伝子の発現レベルと相関し、ＡＡＶ１群では早い段階でピークに達した。

ＡＡＶのＩＣＭ送達は、すべての処置群で良好な耐容性を示した。毎日の観察、身体検査、全血球数、または血清化学パネルでは、処置関連の異常は確認されなかった。異種導入遺伝子を利用した他のＩＣＭ ＡＡＶ研究と同様に（Ｈｏｒｄｅａｕｘ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８；１０（７９－８８）、ＣＳＦ分析から、すべてのベクター血清型について、注入の７～２１日後に始まる無症候性リンパ球増加が明らかになり、導入遺伝子産物に対する抗体応答を反映した（図８Ａ～図８Ｃ）。ＣＳＦ細胞数は、ピークレベルから減少したが、ほとんどの動物について、剖検時も上昇したままであった。脳および脊髄の組織病理は、ＡＡＶ１およびＡＡＶｈｕ６８で処置された群について評価された。所見は、以前のＩＣＭ ＡＡＶ研究（Ｈｏｒｄｅａｕｘ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８；１０：７９－８８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８；１０：６８－７８）と同様であり、髄膜および脈絡叢において時折確認される最小限のリンパ球浸潤、ならびにいくつかの後根神経節（ＤＲＧ）および脊髄切片における感覚ニューロンおよびそれらに関連する軸索の変性を伴う。以前のＩＣＭ ＡＡＶ研究と同様に、感覚ニューロンの所見は、典型的には、重症度が最小限から軽度であり、臨床徴候を伴わなかった（Ｇｕｒｄａ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ：ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１６；２４（２）：２０６－１６、Ｈｏｒｄｅａｕｘ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８；１０：７９－８８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８；１０：６８－７８）。いずれの動物の脳実質においても、ベクター関連の異常は認められなかった。

非ヒト霊長類へのＡＡＶ１およびＡＡＶｈｕ６８ベクターのＩＣＭ投与後のＣＮＳ形質導
入の異なるパターン
本研究者らは、ＡＡＶ１ベクターで処置されたＮＨＰのＣＳＦにおける著しく高いＰＧＲＮ発現から、ＡＡＶ１、ＡＡＶ５、およびＡＡＶｈｕ６８ベクターの形質導入パターンの差異をさらに探求することにした。ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するＡＡＶ１、ＡＡＶ５、またはＡＡＶｈｕ６８ベクター（３×１０^１３ＧＣ、ベクターあたりｎ＝２）の単回ＩＣＭ注入がＮＨＰに投与された。脳形質導入の組織学的分析のために、注入の２８日後に動物が犠牲になった。

免疫組織化学では、ＡＡＶ１およびＡＡＶｈｕ６８ベクターで処置されＮＨＰの脳全体にわたって、散在的なパッチ状の形質導入が明らかになった（未掲載）。最小限の形質導入は、ＡＡＶ５ベクターを受けた動物の脳において顕著であった。ＡＡＶ１とＡＡＶｈｕ６８との間の形質導入における差異をより正確に特徴付けるために、複数の脳領域から回収された切片で形質導入細胞を定量化する半自動化方法を開発した。ＧＦＰおよび特定の細胞型のマーカーに対する蛍光標識抗体で染色された切片を使用して、ＮｅｕＮ、ｏｌｉｇ２、およびＧＦＡＰの染色、続いて各タイプのＧＦＰ発現細胞の定量によって、それぞれ、ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトの総数を定量した（図９、図１０）。ＡＡＶ１およびＡＡＶｈｕ６８は、それぞれ、調べたすべての領域で、各細胞型の１パーセント未満を形質導入した。ニューロンの形質導入は、２つのベクター間でほぼ同等であったが、ＡＡＶｈｕ６８は、わずかに多くのアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを形質導入したように見えた。

ＡＡＶ１で達成された劇的に高いＣＳＦのＰＧＲＮレベルを考慮すると、ＡＡＶ１およびＡＡＶｈｕ６８ベクターで観察されたほぼ同等の脳形質導入は、予想外であった。上衣細胞の形質導入は、ＡＡＶｈｕ６８で処置された動物およびＡＡＶ１で処置された動物ＲＡ１８２６の側脳室および第４脳室の複数の領域において、免疫組織化学によって評価された。興味深いことに、ＡＡＶ１処置動物（ＲＡ１８２６）からの複数の脳切片は、脳室系の一部を含み、脳室に沿って並ぶ上衣細胞の広範な形質導入を示したが、これは、ＡＡＶｈｕ６８処置動物のいずれにおいても観察されなかった（未掲載）。側脳室の前角、側角および後角と第４の脳室とを含む、すべてのサンプリングされた領域にわたって、平均４８％の上衣細胞が形質導入された。対照的に、ＡＡＶｈｕ６８ベクターを与えられた動物の同じ脳領域では、１～２％の上衣細胞のみが形質導入された。第２のＡＡＶ１処置動物において１つの側脳室の小さなセグメントのみが評価可能であり、約１％の上衣細胞の形質導入を示したものの、分析は、小さなサンプリング領域に限定された。これらの知見は、他の細胞型の形質導入が２つの血清型間で類似しているように見えることを考慮すると、ＡＡＶ１処置動物において高度に形質導入される上衣細胞が、ＣＳＦにおける高レベルのＰＧＲＮの供給源であり得ることを示唆する。分泌されたＰＧＲＮによって媒介される傍観者効果により、ＧＲＮ変異によって引き起こされるＦＴＤは、例外的に、ＡＡＶ遺伝子療法に適している。細胞外ＰＧＲＮはニューロンに取り込まれ得るため、ＡＡＶ１ベクターで達成される高いＣＳＦのＰＧＲＮレベル（明らかに、頑強な上衣細胞の形質導入によって媒介されている）により、ＡＡＶ１が、ＧＲＮ遺伝子療法のための理想的な選択肢となる。

実施例４：組換えＡＡＶ１．ＰＧＲＮ
ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮは、１）ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する導入遺伝子カセットをコードするＡＡＶシスプラスミド（ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ．ＫａｎＲと称される）、２）ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ１ ｃａｐの遺伝子をコードするＡＡＶトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲと称される）、および３）ヘルパーアデノウイルスプラスミド（ｐＡｄΔＦ６．ＫａｎＲと称される）を用いたＨＥＫ２９３細胞の三重プラスミドトランスフェクションによって生成される。ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮにパッケージングされたベクターゲノムのサイズは、４１２９塩基である。

Ａ．ＡＡＶベクターゲノムプラスミドの配列エレメント
シスプラスミド（ｐＥＮＮ．ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧ．ＫａｎＲ（ｐ４８６２）と称される）由来のベクターゲノムの線形マップは、図２を参照されたい。

シスプラスミドは、以下のベクターゲノム配列エレメントを含む：
１．逆位末端反復（ＩＴＲ）：ＩＴＲは、同一の逆相補配列であり、ＡＡＶ２（１３０塩基対［ｂｐ］、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１）は、ベクターゲノムのすべての要素に隣接する。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡの複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされるシス配列のみを表す。
２．ヒトサイトメガロウイルス最初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）：このエンハンサー配列は、ヒト由来のＣＭＶ（３８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３１０４．１）は、下流の導入遺伝子の発現を増加させる。
３．ニワトリβアクチンプロモーター（ＢＡ）：この遍在性プロモーター（２８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）を選択して、任意のＣＮＳ細胞型における導入遺伝子の発現を駆動させた。
４．キメライントロン（ＣＩ）：ハイブリッドイントロンは、ニワトリβアクチンスプライスドナー（９７３ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）およびウサギβグロビンスプライスアクセプターのエレメントを含む。イントロンは転写されるが、その両端のいずれかにある配列と合わせて、スプライシングによって成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から除去される。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡ輸送を促進し、それにより、翻訳のためのｍＲＮＡの一定レベルの蓄積を高めることが示されている。これは、遺伝子発現レベルの増加を意図した遺伝子ベクターにおいて共通の特徴である。
５．コード配列：ヒトＧＲＮ遺伝子の操作ｃＤＮＡは、ヒトＰＧＲＮ（ｈＰＧＲＮ）タンパク質をコードし、リソソーム機能および他の神経系の役割に関与する（１７８５ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００２０８７．３、５９３アミノ酸［ａａ］、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００２０７８）。
６．ウサギβグロビンのポリアデニル化シグナル（ｒＢＧ ＰｏｌｙＡ）：ｒＢＧ ＰｏｌｙＡシグナル（１２７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）は、ｃｉｓで導入遺伝子のｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化を促進する。このエレメントは、転写終結、新生転写物の３’末端での特異的切断事象、および長いポリアデニル鎖付加のためのシグナルとして機能する。

Ｂ．ＡＡＶ１トランスプラスミド：ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲ（ｐ００６９）
ＡＡＶ２／１トランスプラスミドは、ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲ（ｐ００６９）である。ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲプラスミドは、鎖長が８１１３ｂｐであり、ＡＡＶベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる４つの野生型ＡＡＶ２レプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲはまた、３つの野生型ＡＡＶ１ビリオンタンパク質カプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードし、ＡＡＶベクターゲノムを収容するためにＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）のビリオンシェルに組み立てられる。ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲに含まれるＡＡＶ１ ｃａｐ遺伝子は、サル源から単離された。

ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲ構築物を作製するために、ｐ５Ｅ１８（２／２）からの３．０キロ塩基（ｋｂ）断片、ｐＡＶ１Ｈからの２．３ｋｂ断片、およびｐ５Ｅ１８（２／２）からの１．７ｋｂ断片を組み込んで、ｐＡＡＶ２／１（ｐ０００１）を形成し、これは、アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）カセット（文献ではｐ５Ｅ１８［２／１］と称される）中にＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ１ ｃａｐを含む。このクローニング戦略では、ＡＡ
Ｖ ｐ５プロモーター（通常ｒｅｐ発現を駆動する）を、ｒｅｐの５’末端からｃａｐの３’末端へと移し、ｒｅｐの上流の切断型ｐ５プロモーターを残す。この切断型プロモーターは、ｒｅｐの発現を下方制御し、結果として、ベクター産生を最大化する役割を果たす（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７３（５）：３９９４－４００３）。

臨床製品の製造のためのｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲを生成するために、ｐＡＡＶ２／１の骨格配列におけるアンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子をカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子で置換した。トランスプラスミドのすべての構成部品は、直接配列決定によって検証された。

Ｃ．アデノウイルスヘルパープラスミド：ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）は、ペンシルベニア大学のＪａｍｅ Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ博士および同僚の研究室内で構築され、サイズは１５，７７４ｂｐである。このプラスミドには、ＡＡＶ複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１の機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって提供される）。しかしながら、このプラスミドには、他のアデノウイルスの複製遺伝子または構造遺伝子は含まれていない。プラスミドは、アデノウイルスＩＴＲなどの複製に重要なシスエレメントを含んでおらず、したがって、感染性のアデノウイルスが産生されることは予想されない。プラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。Ａｄ５に欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、かつアデノウイルスＤＮＡの量を削減した（３２ｋｂから１２ｋｂへ）。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子によって置換して、ｐＡｄｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を作製した。このプラスミドに残るＥ２、Ｅ４、およびＶＡＩのアデノウイルス遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞に存在するＥ１と共に、ＡＡＶベクター産生に必要である。ベクターは、図１３および図１４に示される以下のフローチャートに従って生成される。

最終生成物は、ＵＳＰ＜７９１＞によって決定される６．２～７．７の範囲のｐＨ、ＵＳＰ＜７８５＞によって決定される２６０～３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧、およびｄｄＰＣＲによって決定される２．５×１０^１３ＧＣ／ｍＬ以上のＧＣ力価を有する必要がある（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，（２０１４）．“Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｔｉｔｅｒｓ ｂｙ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．”Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５（２）：１１５－２５。

実施例５：ＧＲＮ^－／－マウスにおけるｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮの最小有効用量の特定

Ｇｒｎ^－／－マウスモデルにおけるＣＮＳ病変に対する、異なる用量のｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮの影響を、以下のように評価する。有効性は、疾患病態生理に直接関連する定量的アウトカム尺度として機能する脳の蓄積病理（リポフスチン）の減少の程度によって評価される。さらに、ＮＨＰ毒性試験で検出されない可能性のある疾患特異的な毒性を特定するために、全血球数および血清化学パネル用の最後の採血、ならびに標的臓器の組織病理が含まれる。マウスは、ＧＲＮハプロ不全を有する高齢の対象における疾患状態を再現するために、広範囲にわたるリポフスチン蓄積が存在する場合、５～６ヶ月齢で処置される。Ｇｒｎ^－／－マウスは、ＩＣＶ注入によって、４回用量のｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮ（１．３０ｘ１０^１１ＧＣ、４．４０ｘ１０^１０ＧＣ、１．３０ｘ１０^１０ＧＣ、または４．４０ｘ１０^９ＧＣ）またはビヒクル（ＩＴＦＦＢ［０．００１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含む人工ＣＳＦ］）のうちの１つを受ける（群あたりＮ＝１５）。ビヒクル（Ｎ＝１５）で処置されたＧｒｎ^＋／＋マウスは、正常な対照として機能する。処置９０日後、動物を犠牲にし、脳を回収し、切片化し、リポフスチン病変を定量する。ＭＥＤは、ビヒクル処置Ｇｒｎ^－／－マウスと比較して、脳蓄積病変の有意な減少を示す用量によって決定された。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、該当する場合、テューキーの多重比較検定（α＝０．０５）を使用して決定される。

実施例６：非ヒト霊長類における毒性試験
ｒＡＡＶ１．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＰＧＲＮ．ｒＢＧは、血清型ＡＡＶ１からなる非複製組換えアデノ随伴（ＡＡＶ）ベクターであり、これは、サイトメガロウイルスエンハンサーを有するニワトリベータアクチンプロモーターの制御下にある操作されたヒトプログラニュリン（ＰＧＲＮ）ｃＤＮＡと、ＡＡＶ血清型２逆位末端反復に隣接するウサギβグロビンポリアデニル化配列とを含み、髄腔内最終製剤緩衝液（ＩＴＦＦＢ）中で製剤化された。ｄｄＰＣＲ力価は、２．０４×１０^１３ＧＣ／ｍＬであった。ＩＴＦＦＢのｐＨをｐＨ７．４に調整して、試験物品生成物の溶解度を最大化した。対照物品は、投与日に調製した。希釈された物品は、同日の投薬まで、湿った氷上または２～８℃で保たれる。

ＩＣＭ投与後のｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮの毒性を調査するために、９０日間のＧＬＰ準拠安全試験を、成体アカゲザルで実施した。３～１０歳のＮＨＰをこの研究に利用したのは、この年齢が意図される成人ヒト患者集団を表すためである。ＩＣＭのＡＡＶ投与後、分泌された導入遺伝子産物が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与えるために、９０日間の評価期間を選択した。アカゲザルは、３つの用量レベル、計３．００×１０^１２ＧＣ、計１．００×１０^１３ＧＣ、もしくは計３．００×１０^１３ＧＣ（用量あたりＮ＝３）のうちの１つの用量レベルのｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮまたはビヒクル（ＩＴＦＦＢ、Ｎ＝２）を受けた。用量レベルは、脳質量によってスケールされた場合、計画された最小有効用量（ＭＥＤ）の試験で評価されたものと同等であるように選択された（マウスでは０．４ｇ、アカゲザルでは９０ｇを想定）。ベースラインの神経学的検査、臨床病理学（鑑別を伴う細胞数、臨床化学、および凝固パネル）、ＣＳＦ化学、およびＣＳＦ細胞学を行った。ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮまたはビヒクルの投与後、動物を苦痛および異常行動の徴候について毎日モニタリングした。

血液およびＣＳＦ臨床病理評価ならびに神経学的検査は、ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮまたはビヒクル投与後の３０日間は毎週、およびその後は３０日間毎に実施した。ベースラインおよびその後の３０日毎の時点で、抗ＡＡＶ１中和抗体（Ｎａｂ）、ならびにＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮ導入遺伝子産物に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）の酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって評価した。

ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮまたはビヒクル投与の９０日後、動物を安楽死させ、組織を回収し、網羅的な顕微鏡組織病理学的検査を行った。さらに、リンパ球は、剖検時にこれらの臓器内のカプシドおよび導入遺伝子産物の両方に反応するＴ細胞の存在を評価するために、肝臓、脾臓、および骨髄から採取される。

ベクターの体内分布は、組織試料中のｑＰＣＲによって評価される。また、血清およびＣＳＦの試料で、ベクターゲノムを定量する。ベクター排泄は、尿および糞便中で検出されたベクターゲノムの分析によって評価された。以前の研究では、ＩＣＭ投与後のベクター分布のパターンが用量非依存的であり、ベクター用量がより多いほど、ｑＰＣＲベースの生体分布アッセイで全体的なシグナルがより大きくなり、標的組織におけるベクターデポジションの検出において感度が最も高くなることが実証されていた。そのため、これらの分析は、最高用量コホートに対してのみ実施された（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１８ｂ）。

神経伝導速度の評価
動物は、ケタミン／デクスメデトミジンの組み合わせで鎮静された。鎮静化された動物を、横臥位または仰臥位で手術台に配置し、ヒートパックで体温を維持した。電子加温装置は、電気信号の取得に干渉する可能性があるため、推奨されなかった。

感覚神経伝導試験（ＮＣＳ）では、カソードが記録部位に最も近くになるように、刺激装置のプローブを正中神経上に配置し、２つの針電極を、第ＩＩ指の末節骨のレベル（参照電極）および基節骨のレベル（記録電極）で皮下に刺入し、一方、接地電極を刺激プローブ（カソード）の近位に配置した。小児刺激装置を使用した。誘発された応答を差次的に増幅し、モニターに表示した。初期取得刺激強度を０．０ｍＡに設定して、バックグラウンド電気信号の欠如を確認した。最適な刺激位置を見つけるために、刺激強度を１０．０ｍＡまで増加させ、プローブを正中神経に沿って移動させながら、決定的な波形によって判断される最適な位置が見つかるまで連発刺激を生成した。プローブを最適な位置に保ったまま、ピーク振幅応答が増えなくなるまで、刺激強度を段階的に徐々に上げた。各刺激応答を記録し、ソフトウェアに保存した。最大１０個の最大刺激を平均化し、正中神経について報告した。記録部位から刺激カソードまでの距離（ｃｍ）を測定し、ソフトウェアに入力し、応答の立ち上がり潜時と距離（ｃｍ）を使用して伝導速度を計算した。伝導速度と感覚神経活動電位（ＳＮＡＰ）振幅の平均値の両方が報告された。両側の正中神経を試験した。機器によって生成されたすべての生データは、治験資料の一部として保持された。

図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＮＨＰにおける正中感覚神経伝導検査の結果を示す。投与された用量では、正中感覚神経伝導への影響は観察されなかった。予備的組織学的分析は、主に、ＤＲＧ、ＴＲＧ、脊髄および末梢神経の背側白質路内の所見を示した（図１２Ａ～図１２Ｄ）。これらの所見は、ＤＲＧ／ＴＲＧ内のニューロン変性および脊髄および末梢神経の背側白質路内の軸索変性（すなわち、軸索障害）からなっていた。全体的に、これらの所見は、すべての処置群にわたって観察されたが、両方の時点で、中用量群および高用量群の個々の動物において、発生率および重症度がより高くなる傾向があった。

ＧＲＮ関連神経変性疾患の重症度を考慮すると、ｒＡＡＶ１．ＰＧＲＮのＩＣＭ投与のベネフィット／リスク特性が好ましいままであることが予想される。

実施例７：ヒト試験
ＧＲＮ遺伝子の変異によって引き起こされる成人発症性神経変性疾患を有する患者におけるｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの単回投与のヒト初回（ＦＩＨ）第１／２相用量漸増試験を実施する（以下の表を参照）。ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮは、ＧＲＮ遺伝子を置き換えるように設計される。このＦＩＨ試験は、安全性および耐容性を評価し、有効性に関する予備データを収集する。最大１２名の症候性ヘテロ接合性ＧＲＮ変異保因患者をｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮで治療し、最初に２年（２４ヶ月）の期間にわたって追跡し、投薬後５年間にわたって長期フォローアップを継続する。この試験は、登録用試験の開始を支持するデータを提供し、第１／２相最大耐容用量（ＭＴＤ）を利用する。この登録用試験は、疾患に関連する臨床転帰およびバイオマーカーに対するｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの効果を評価する。すべての試験は、ＧＲＮ関連神経変性疾患を有する成人患者における単回ＩＣＭ用量のｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの投与を含む。

投与経路および処置
ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮは、単回用量として、１日目に、大槽内へのＣＴガイドによる後頭下注入を介して対象に投与される。１日目に、５．６ｍＬの適切な力価でｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮを含むシリンジが、試験に関連する治験薬剤部（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ）によって調製され、処置室に送達される。

治験薬の投与の前に、対象は、麻酔され、挿管され、無菌技術を使用して、注入部位が準備され、覆布がかけられる。ＬＰを実施して、所定の体積のＣＳＦを除去し、その後、
ヨード造影剤を髄腔内（ＩＴ）注入して、大槽の関連する解剖学的構造の可視化を補助する。静脈内（ＩＶ）造影剤は、ＩＴ造影剤の代替物として、針穿刺の前またはその間に投与され得る。ＩＶまたはＩＴ造影剤を使用するかどうかの決定は、介入医の判断に委ねられる。透視ガイド下、脊髄針（２２～２５Ｇ）を大槽内に進める。針の配置を補助するために、より大きな誘導針を使用してもよい。針の配置を確認した後、エクステンションセットを脊椎針に取り付け、ＣＳＦで充填する。介入医の裁量で、造影剤を含有するシリンジを、エクステンションセットに接続してもよく、少量注入することで、大槽内に針が配置されていることを確認することができる。針の配置を確認した後、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮを含むシリンジをエクステンションセットに接続する。シリンジの内容物を１～２分かけてゆっくりと注入し、５．０ｍＬの容量を送達する。

有害事象（ＡＥ）の収集、身体検査／神経学的検査、バイタルサイン、臨床検査（血清化学、血液学、凝固、ＬＦＴ、尿検査）、ＥＣＧ、神経伝導試験、およびＣＳＦ細胞診および化学検査（細胞数、タンパク質、グルコース）を含む安全性評価は、治験スケジュールの示された時間に実施される。

安全性評価のための統計的比較は計画されていない。すべての結果は説明のみである。データを列挙し、要約表を作成する。

二次エンドポイントおよび探索的エンドポイントについて統計的比較を実施する。各時点での測定値を、各対象のベースライン値、ならびに各エンドポイントについて利用可能である場合、健康なボランティアおよび同等のコホート特性を有するＧＲＮ患者からの自然歴データと比較する。すべてのデータは、対象データ一覧に示されている。カテゴリー変数は、頻度およびパーセンテージを使用して要約され、連続変数は、記述統計量（非見逃し観察の数、平均値、標準偏差、中央値、最小値、および最大値）を使用して要約される。グラフ表示は、適切に提示される。

ＧＲＮハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性の初期臨床症状は、不均一である。この不均一性は、疾患の進行と共に現れる追加の症状を伴う様々な診断をもたらす。症状の発症後、典型的には、患者が急速に減少するため、神経変性のいずれかの診断を有する患者は、確定された病原性ヘテロ接合ＧＲＮ変異を有する限り、治療され得る。ＣＤＲ－ＦＴＬＤグローバルスコアを利用して、患者をスクリーニングしてもよい。この評価尺度は、ＦＴＬＤスペクトル診断を有する患者における疾患の重症度を評価するように設計されている。ＦＴＬＤ関連症状の他のＧＲＮ関連診断との重複、およびＣＤＲ－ＦＴＬＤグローバルスコア（記憶、見当識、判断力と問題解決、社会適応、家庭状況と趣味、介護状況、行動、および言語）で捉えられるドメインの数により、この尺度は診断に使用することができる。ＣＤＲ－ＦＴＬＤグローバルスコアが０．５（軽度の症状のある患者を含む）を超え１以下であれば、遺伝子療法の利益が最大化される可能性が高い神経変性の初期段階で、症状のある患者の治療が可能になるであろう。この初期段階で患者を治療することによって、その後の疾患進行の変化または安定化、および追加の症状の発症の遅延の検出が可能になる。しかしながら、この集団において、ＣＤＲ－ＦＴＬＤグローバルスコアが最低０．５という要件は、スケールが運動表現型の障害を捉えるように最適化されていないため、運動に特化した診断への参入を排除する。

この遺伝子治療は、生理学的レベルを上回るＰＧＲＮの発現をもたらさないことが予想される。非臨床ＮＨＰ研究におけるｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの用量（ＦＩＨ試験で使用される用量よりも多い）を使用すると、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮのＩＣＭ投与後、ＰＧＲＮが正常に近いレベルで血清中に発現することが見出された。ＦＩＨ試験に登録された対象は、当初、循環ＰＧＲＮレベルが正常値の約３０％であったため、循環血清ＰＧＲＮレベルが正常値に回復する可能性があると予想される。患者の血液検査は、全血球計数（ＣＢ
Ｃ）パネルを通してスクリーニングされ、患者は、５年間のフォローアップの時点で、脳および上位脊椎のガドリニウム造影剤を用いたＭＲＩを介して、腫瘍についてモニタリングされる。

安全性および耐容性を主要エンドポイントとして測定することに加えて、副次的および探索的有効性のエンドポイントを、最近の文献に基づき、またＧＲＮ関連の神経変性の研究を専門とする一流の臨床医と協議して、この研究のために選択した。これらのエンドポイントは、その後の登録用試験のための適切なエンドポイントを特定することを目的として、臨床転帰および疾患バイオマーカーを追跡する。

ＧＲＮ変異によって引き起こされる神経変性は最終的に死亡をもたらすため、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮが患者の生存に及ぼす影響は、本研究の有効性エンドポイントでもある。しかしながら、ほとんどの患者は、症状発症から７～１１年の平均寿命を有するため、研究期間および試料サイズは、生存上の利益を実証するのに十分ではない場合がある。

臨床症状および患者の日常機能に対するｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの効果を評価する。標的患者集団によって示される表現型が不均一であるために、臨床症状の範囲にわたって発現される症状の進行を捕捉する機能的尺度および臨床的尺度が用いられる。提案された研究は、経時的な変化を測定するためにＦＡＢ、ＦＲＳ、ＭＭＳＥ、ＣＧＩ－Ｃ、ＮＰＩ、およびＦＢＩを利用する。これらの尺度は、主に、疾患の様々な臨床症状の進行または安定化に関する情報を提供する、認知、言語、神経心理学的行動、および日常機能に関連する能力を測定する。ＵＰＤＲＳはまた、運動症状の変化を捉えるために含まれている。ＦＩＨでは、これらの有効性評価は、本質的に探索的であり、症状の減少を安定させるｒＡＡＶ．ｈＰＧＲＮの能力を経時的に捉えることを意図している。様々な臨床症状を有する患者の様々な臨床パラメータにわたるさらなる低下の速度に関するＦＩＨからのデータは、適切なエンドポイントの選択にさらに情報を提供し、登録用試験の臨床的に有意義な変化を定義するために使用される。

各臨床的尺度を、以下に簡単に説明する。
主に認知機能を測定する臨床的尺度
ＣＤＲ－ＦＴＬＤ：ＣＤＲ－ＦＴＬＤは、ＡＤスペクトル障害の重症度を評価するために歴史的に使用される古典的な臨床認知症評価（ＣＤＲ）尺度の拡張版である。この評価には、ＣＤＲのオリジナルな６つのドメイン（記憶、見当識、判断力と問題解決、社会適応、家庭状況と趣味、介護状況）が含まれる。それはまた、より高い感度でＦＴＬＤスペクトル患者の減少の検出を可能にする、言語および行動の２つの追加のドメインを含む。０の評価スコアは、正常な行動または言語を示し、１、２、または３のスコアは、軽度から重度の障害を示す。ＣＤＲ－ＦＴＬＤ評価項目合計（ＣＤＲ－ＦＴＬＤ ｓｂ）は、個々のドメインの合計を表し、全体的な認知症の重症度を決定するために使用される。

ＭＭＳＥ：ＭＭＳＥは、臨床および研究の実践で広く使用されている１１問の全体的な認知評価である。質問としては、例えば、「今年は何年ですか？季節はいつですか？何日ですか？何曜日ですか？何月ですか？」と尋ねられ、正解ごとに１ポイントが与えられ、質問ごとに最高得点が与えられる。総得点の上限は３０点で、２４点と２７点の２つのカットオフがある。これらのカットオフは、認知機能低下の指標である。

言語流暢性検査：提案されている探索的有効性のエンドポイントの１つではないが、言語流暢性検査は、ＦＩＨ試験全体を通して実施される。これは、同じ写真を各対象に提示し、口頭での説明を求めることによって実施される可能性がある。説明中に、発話速度（単語／分）がカウントされ、記録され、最終的に定型発達の成人を反映する速度と比較される。

主に運動機能を測定する臨床的尺度
ＵＰＤＲＳ：ＵＰＤＲＳは、精神状態、行動および気分、ならびに日常生活での活動など、パーキンソニズムに関連するいくつかのドメインの４２項目の４部構成の評価である。各項目には、０（障害なしを示す）から４（最も重度の障害を示す）の範囲の評価尺度が含む。各部のスコアは、疾患の重症度を提供するために集計され、高スコアの１９９点は、最悪／最も重度の障害を示す。

主に行動を測定する臨床的尺度
ＮＰＩ：ＮＰＩは、脳の障害を有する患者における精神病理の存在を解明するために使用される。当初、これはＡＤ集団で使用するために開発されたが、他の条件における行動変化を評価するのに役立つと考えられている。この評価は、１０の行動ドメインと２つの自律神経領域で構成され、その中には、４つのスコア：頻度、重症度、総合的な負担、および介護者の負担がある。ＮＰＩの総スコアは、行動ドメインのドメインスコアを加算し、介護者負担のスコアを減算することによって得られる。

ＦＢＩ：ＦＢＩは、ｂｖＦＴＤに特に関連する行動および人格の変化の２４項目の評価であり、ｂｖＦＴＤと他の認知症間を区別する。ｂｖＦＴＤと診断された患者は、一般に、これらのタイプの変化の認識がないため、これは、主看護者との対面面接として実施される。行動と人格に関連するいくつかの分野に焦点を当て、各質問を０（なし）から３（重度／ほとんどの場合）まで採点する。総スコアは、典型的には、病気の重症度と相関し、経時的な変化を評価するために使用することができる。

認知機能と運動機能の両方を測定する臨床的尺度
ＣＧＩ－Ｃ：ＣＧＩ－Ｃは、３部の簡潔で広く使用されている評価のうちの１つである。これは、３つの項目で構成され、臨床医によって評価される。ＣＧＩ－Ｃは、改善が完全に治療によるものであるかどうかにかかわらず、研究への登録から始まり、１（非常に改善された）から７（非常に悪化した）の範囲の７段階で評価される。

ＦＡＢ：ＦＡＢは、前頭葉性遂行機能障害表現型認知症とＡＤ型認知症間の区別を補助するための簡易評価である。これは、軽度の痴呆患者（ＭＭＳＥ＞２４）において特に有用である。この評価は、６部で構成され、認知、運動、および行動の領域に対処する。総スコアは１８、またはより高いスコアは、より良好なパフォーマンスを示す。

ＦＤＲ：ＦＤＲは、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）アブタイプ（すなわち、ｂｖＦＴＤ、またはＰＰＡサブタイプのいずれか）と診断された患者のための簡易病期分類評価である。ＦＤＲは、経時的なＦＴＤの疾患進行の差異を検出する。この簡単な面接は、主介護者と共に実施され、３０項目からなり、「起こらない」、「時々起こる」、または「常に起こる」に分類される。次いで、パーセンテージスコアが計算され、ロジットスコア（ｌｏｇｉｔ ｓｃｏｒｅ）、そして最終的には、重症度スコアに変換される。重症度スコアは、「非常に軽度」から「最重度」までの範囲である。

コロンビア自殺重症度評価尺度（Ｃ－ＳＳＲＳ）：Ｃ－ＳＳＲＳスコアは、ＦＩＨの探索的有効性エンドポイントではないが、この評価は、研究にわたって実施される。Ｃ－ＳＳＲＳは、自殺念慮、念慮の強度、および自殺行動を測定する３部構成の尺度である。この評価の結果は、尺度から直接取得される自殺行動致死率評価、自殺念慮スコア、および自殺念慮強度評価で構成される。０を超える念慮スコアは、評価ガイドラインに基づいて、介入の必要性を示し得る。強度評価は、０～２５の範囲であり、０は、自殺念慮の支持なしを表す。

追加の探索的エンドポイントとして、患者の生存率が評価される。しかし、ＧＲＮハプロ不全による神経変性と診断された患者は、症状の発症から７～１１年の平均寿命を有する。したがって、研究期間、試料サイズ、および疾患の初期段階である対象の包含は、生存上の利益を実証するのに十分ではない場合がある。

ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの投与は、ＧＲＮ関連ハプロ不全によって引き起こされる、主に前頭葉および側頭葉の皮質における萎縮（神経細胞の損失）の減少、および時間の経過に伴う全脳容積を安定化する。ＭＲＩは、内側前頭皮質および頭頂領域の厚さの変化を追跡するために使用され得る。

生化学的バイオマーカーも評価される。ＣＳＦ中および血漿中のＰＧＲＮタンパク質のレベルは、ＡＡＶ形質導入の読み出しとして測定され、ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの投与後、患者において増加する。神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、タウ、リン酸化タウ、および他の炎症マーカーのＣＳＦレベルも追跡される。ＮＦＬは、神経細胞の損失または損傷の一般的な指標と考えられる。タウおよびリン酸化タウは、ＡＤ、ＰＤ、およびいくつかの形態のＦＴＤで見られる病理に関連する。

患者の血液検査は、全血球計数（ＣＢＣ）パネルを通してスクリーニングされ、患者は、５年間のフォローアップの時点で、脳および上位脊椎のガドリニウム造影剤を用いたＭＲＩを介して、腫瘍についてモニタリングされる。

ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの単回投与は、投与後、安全でありかつ耐容性がある。ｒＡＡＶ１．ｈＰＧＲＮの単回投与は、臨床症状および患者の日常機能によって評価されるように、生存率を改善し、かつ／または疾患の進行を低減する。治療は、神経認知機能の消失を遅らせる。

（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下で、フリーテキストを含む配列について提供されている。

本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／８０９，３２９号、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／９２３，８１２号、および２０２０年２月２日に出願された米国仮特許出願第６２／９６９，１０８号は、それらの配列表と共に、それらの全体が参照により援用される。同様に、「１８－８６６３ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前で本明細書と共に提出された配列表、ならびにその中の配列およびテキストは、参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (36)

1. 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、
   （ａ）アデノ随伴ウイルス１由来のＡＡＶカプシドと、
   （ｂ）前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ヒトプログラニュリンのコード配列、および前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、ｒＡＡＶ。
2. 前記コード配列が、配列番号１のヒトプログラニュリンタンパク質をコードする、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
3. 前記プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、またはそれと少なくとも９５％～９９．９％同一の配列である、請求項１または２に記載のｒＡＡＶ。
4. 前記ベクターゲノムが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ヒトプログラニュリンのコード配列、およびポリアデニル化シグナルを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
5. 前記イントロンが、ニワトリベータアクチンスプライスドナーおよびウサギβスプライスアクセプターエレメントからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
6. 前記ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）が、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲであり、これらは、前記プログラニュリンのコード配列および調節配列に隣接する、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
7. 前記ベクターゲノムが、（ａ）ＥＦ－１ａプロモーターおよびＳＶ４０後期ポリＡ、（ｂ）ＵｂＣプロモーター、イントロン、およびＳＶ４０後期ポリＡ、または（ｃ）ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、およびウサギグロビンポリＡを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
8. 前記ベクターゲノムが、配列番号２４の配列を含む、請求項７に記載のｒＡＡＶ。
9. 医薬組成物であって、髄腔内投与に好適な水性液体と、ＧＲＮ－ハプロ不全によって引き起こされる神経変性の治療における使用に好適な組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）と、を含み、前記ｒＡＡＶが、
   （ａ）アデノ随伴ウイルス１由来のＡＡＶカプシドと、
   （ｂ）前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムであって、ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）、ヒトプログラニュリンのコード配列、および前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、ベクターゲノムと、を含む、医薬組成物。
10. 前記コード配列が、配列番号１のヒトプログラニュリンタンパク質をコードする、請求項９に記載の組成物。
11. 前記プログラニュリンのコード配列が、配列番号３、または配列番号３の少なくともアミノ酸１８～５９３に対して少なくとも９５％～９９．９％同一の配列である、請求項９または１０に記載の組成物。
12. 前記ベクターゲノムが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、前記ヒトプログラニュリンのコード配列、およびポリアデニル化シグナルを含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記イントロンが、ニワトリベータアクチンスプライスドナーおよびウサギβスプライスアクセプターエレメントからなる、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）が、ＡＡＶ２ ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ２ ３’ＩＴＲであり、これらは、前記プログラニュリンのコード配列および前記ベクターゲノムの前記調節配列に隣接する、請求項９～１３のいずれか一項に記載の組成物。
15. 前記ベクターゲノムが、（ａ）ＥＦ－１ａプロモーターおよびＳＶ４０後期ポリＡ、（ｂ）ＵｂＣプロモーター、イントロン、およびＳＶ４０後期ポリＡ、または（ｃ）ＣＢ７プロモーター、キメライントロン、およびウサギグロビンポリＡを含む、請求項９～１４のいずれか一項に記載の組成物。
16. 前記ベクターゲノムが、配列番号２４の配列を含む、請求項１５に記載のｒＡＡＶ。
17. 前記組成物が、界面活性剤を含む人工脳脊髄液を含む、請求項９～１６のいずれか一項に記載の組成物。
18. 前記界面活性剤が、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８である、請求項１７に記載の組成物。
19. ＧＲＮ－ハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性を有する患者の治療方法に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または請求項９～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
20. ＧＲＮ－ハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性を有する患者を治療するための医薬品の製造における、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）または請求項９～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
21. 前記組成物が、前記ｒＡＡＶの１ｘ１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３ｘ１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量が髄腔内に投与されるように製剤化される、請求項１９または２０に記載の使用。
22. 前記患者が、ヒト成人であり、前記ｒＡＡＶの１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの用量を投与される、請求項１９または２０に記載の使用。
23. 前記ｒＡＡＶまたは組成物が、（ａ）脳病変の減少の予測因子として網膜蓄積病変の減少について前記患者を非侵襲的に評価すること、（ｂ）磁気共鳴画像法を行って脳体積を評価すること、および／または（ｂ）前記ＣＳＦ中のプログラニュリン濃度の濃度を測定することのうちの１つ以上をさらに含むレジメンにおいて投与可能である、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の使用。
24. 前記プログラニュリンのコード配列を含む前記ｒＡＡＶが、脳室内送達を介して、または実質内送達を介して、髄腔内に送達される、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の使用。
25. 前記組成物が、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽内への（大槽内）後頭下注入を介して、単回用量として投与される、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の使用。
26. 前記患者が、プログラニュリン－前頭側頭型認知症を有する、請求項１９～２５のいず
    れか一項に記載の使用。
27. グラニュリン（ＧＲＮ）ハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性を有するヒト患者を治療する方法であって、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを含み、前記ｒＡＡＶが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムをさらに含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、および前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、方法。
28. グラニュリン（ＧＲＮ）ハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性を有するヒト患者を治療する方法であって、上衣細胞を標的とするアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムをさらに含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、および前記上衣細胞において前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、方法。
29. グラニュリンハプロ不全によって引き起こされる成人発症性神経変性に関連する脳病変を有するヒト患者を治療するための方法であって、アデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ１）のＡＡＶカプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を、中枢神経系に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされるベクターゲノムをさらに含み、前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ逆位末端反復、ヒトプログラニュリンのコード配列、および前記プログラニュリンの発現を指示する調節配列を含む、方法。
30. 前記患者が、請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶまたは請求項９～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記患者が、前記ｒＡＡＶの１×１０^１０ＧＣ／ｇ脳質量～３．３３×１０^１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量を、髄腔内に投与される、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記患者が、ヒト成人であり、前記ｒＡＡＶの１．４４×１０^１３～４．３３×１０^１４ＧＣの用量を投与される、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
33. （ａ）脳病変の減少の予測因子として、網膜蓄積病変の減少について前記患者を非侵襲的に評価すること、（ｂ）磁気共鳴画像法を行って脳体積を評価すること、および／または（ｃ）前記ＣＳＦ中のプログラニュリン濃度の濃度を測定することのうちの１つ以上をさらに含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記プログラニュリンのコード配列を含む前記ｒＡＡＶが、脳室内送達を介して、または実質内送達を介して、髄腔内に送達される、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ｒＡＡＶが、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽内への（大槽内）後頭下注入を介して、単回用量として投与される、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記患者が、プログラニュリン関連前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を有する、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の方法。

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