TW202246513A - Ｃｌｎ３多核苷酸的腺相關病毒遞送 - Google Patents

Abstract

本揭露關於神經性類蠟脂褐質病蛋白3（CLN3）多核苷酸的重組腺相關病毒（rAAV）遞送。本揭露提供了rAAV和使用rAAV進行神經性類蠟脂褐質病或CLN3-Batten病的CLN3基因療法之方法。

Description

CLN3多核苷酸的腺相關病毒遞送

本申請要求於2021年2月5日提交的美國臨時申請案號63/146,110以及於2021年9月27日提交的美國臨時申請案號63/248,756的權益，將其全部內容藉由引用以其全文併入本文。

本申請包含作為揭露內容的單獨部分的電腦可讀形式的序列表（文件案名：AT21-001_Sequence Listing.txt；2021年9月27日創建的26,629位元組ASCII文字文件），將其藉由引用以其全文併入本文。

本揭露關於神經性類蠟脂褐質病蛋白3（CLN3）多核苷酸的重組腺相關病毒（rAAV）遞送。本揭露提供了rAAV和使用rAAV進行神經性類蠟脂褐質病（NCL）或CLN3-Batten病的CLN3基因療法之方法。

神經性類蠟脂褐質病（NCL）係一組嚴重的神經退化性疾病。

CLN3基因的突變導致青少年NCL或CLN3-Batten病（Kitzmü等人, Human Molecular Genetics [人類分子遺傳學] 2008; 17(2):303-312；Munroe等人, Am J Hum Genet. [美國人類遺傳學雜誌] 1997;61:310-316），其也稱為Spielmeyer-Sjogren-Vogt病。突變干擾了溶酶體貯積物清除過程。目前，已經描述了67種致病突變。然而，85%的患者對於導致外顯子7和外顯子8缺失的1.02 kb缺失係純合的。在患者中發現的CLN3突變主要導致蛋白（battenin）豐度或功能降低。

CLN3-Batten病的典型發病年齡在4-7歲之間，伴有隱匿但快速進展的視力喪失。患有青少年NCL的兒童在幾個月內從視力正常變為失明，但在幾年後仍能保持明暗知覺。認知和運動能力下降通常緊隨其後（7-10歲），伴隨著行為問題如攻擊性（8-10歲），然後係癲癇發作（10-12歲）。Parkinson氏病特徵在11-13歲之間發展。據報導，在疾病晚期的個體中存在心臟傳導異常。受CLN3-Batten病影響的個體的表型變異性很高，但所有個體都有低視力或進行性失明的共同點。此外，已在82名患者中驗證的統一Batten病評定量表（UBDRS）的生理子量表顯示每年穩定且可測量的下降2.86分（2.27-3.45，p＜0.0001）。從症狀開始到生命結束的平均存活期通常為15年。

為了減輕疾病，CLN3-Batten病的治療措施覆蓋面廣。該等治療措施包括靶向AMPA受體的藥物療法（如EGIS-8332和他侖帕奈），允許通讀過早終止突變的藥物，幫助分解積累的貯積物質（半胱胺酸/半胱胺）的藥物，以及甚至免疫抑制療法（黴酚酸酯、普賴蘇穠）。酶替代療法和幹細胞療法也得到了評估。雖然已經研究了許多治療方法，但很少在臨床環境中進行評估。目前還沒有一種治療方法可以延緩進展或治癒疾病。患者和家庭依靠治療來減輕症狀和姑息治療。

Cln3 ^Δex7/8小鼠模型係於21世紀初創建的，用於模擬CLN3-Batten病患者中最常見的致病突變：從CLN3基因中消除了外顯子7和8的約1 kb突變（Cotman等人, Hum Mol Genet. [人類分子遺傳學]2002; 11(22):2709-2721；Mole等人, Eur J Paediatr Neurol. [歐洲兒科神經病學雜誌]2001; 5:7-10）。該突變在85%的患者中以純合方式被發現，在另外15%的患者中作為雜合突變與其他等位基因上的點突變相組合。外顯子喪失預計會產生移碼突變，導致截短的蛋白產物活性喪失或降低（Lerner等人, Cell. [細胞]1995年9月22日; 82(6):949-57；Kitzmüller等人, Hum Mol Genet. [人類分子遺傳學]2008年1月15日; 17(2):303-12）。在他們最初的研究中，Cotman等人證明了CLN3 ^{Δex7/ 8}小鼠模型成功地概括了CLN3病的幾個方面。CLN3 ^Δex7/8動物在不同時間點在神經系統中積累了自發螢光貯積物質和ATP合酶亞基C，並從10個月大時開始在腦中表現出星狀細胞反應性。隨後的研究詳細描述了小腦中麩胺酸受體功能的改變，這與加速轉棒測定中的運動缺陷相對應（Cotman等人, Hum Mol Genet. [人類分子遺傳學]2002; 11(22):2709-2721）。從行為學角度來看，Cln3 ^Δex7/8小鼠在幼年和成熟時間點均有特徵性表現，其中在新生和年輕成年小鼠中觀察到神經發育運動延遲，並且在10-12個月大時觀察到步態和後肢緊握缺陷（Cotman等人., Hum Mol Genet. [人類分子遺傳學]2002; 11(22):2709-2721；Osório等人, Genes Brain Behav. [基因、大腦與行為]2009年4月; 8(3): 337-345）。與12個月大的對照相比，CLN3 ^Δex7/8小鼠似乎沒有功能性視覺損傷，但存在輕微的生存缺陷（Cotman等人, Hum Mol Genet. [人類分子遺傳學]2002; 11(22):2709-2721；Seigel等人, Mol Cell Neurosci. [分子與細胞神經科學]2002年4月; 19(4):515-27）。綜上所述，攜帶最常見人類突變的Cln3 ^Δex7/8小鼠模型表現出與CLN3-Batten病一致的許多細胞和行為變化，使其成為療法的合適模型。

因此，本領域仍然需要用於CLN3-Batten病的治療。

本文提供了用於使用重組AAV在受試者中治療CLN3-Batten病之方法和組成物。

本文提供了編碼CLN3多肽的重組腺相關病毒9（rAAV9），其包含rAAV9基因組，該rAAV9基因組以5'到3'順序包含：P546啟動子和編碼CLN3多肽的多核苷酸。在一些實施方式中，rAAV9基因組包含自身互補型基因組（scAAV9）。在一些實施方式中，P546啟動子包含SEQ ID NO: 3的序列。在一些實施方式中，rAAV9基因組包含單股基因組。本文揭露的rAAV在國際申請PCT/2020/016542和美國臨時申請案號62/800,911中進行了描述，將兩者均藉由引用以其全文併入本文。

提供了編碼SEQ ID NO: 1中所示的CLN3多肽的自身互補型重組腺相關病毒9（scAAV9）。在一些實施方式中，scAAV9基因組進一步包含反向末端重複序列。因此，在一些實施方式中，scAAV9之基因組以5'到3'順序包含：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3序列的P546啟動子、編碼SEQ ID NO: 1中所示的CLN3多肽的多核苷酸和第二AAV反向末端重複序列。

在一些實施方式中，scAAV9基因組進一步包含SV40內含子。在一些實施方式中，SV40內含子以5'到3'順序如下定位於scAAV9基因組內：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、SV40內含子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸和第二AAV反向末端重複序列。

在一或多個實施方式中，scAAV9基因組進一步包含牛生長激素多腺苷酸化多A序列。在一些實施方式中，牛生長激素多腺苷酸化多A序列以5'到3'順序如下定位於scAAV9基因組內：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸、牛生長激素多腺苷酸化多A序列和第二AAV反向末端重複序列。

在一或多個實施方式中，scAAV9基因組包含與SEQ ID NO: 4至少90%相同的多核苷酸序列。在一或多個實施方式中，編碼CLN3多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 2至少90%相同。

在一些實施方式中，組成物的治療有效量能夠逆轉疾病進展。在一些實施方式中，能夠逆轉進展的劑量係足以緩和、減輕、穩定、逆轉或減緩疾病進展，減輕副作用，或以其他方式減少疾病的病理或表型後果的組成物之量。

用於治療受試者之方法、藥物或組成物能夠逆轉疾病進展，包括以下中一或多項：(a) 減少或減緩自發螢光貯積物質的溶酶體積累，(b) 減少或減緩ATP合酶亞基C的溶酶體積累，(c) 減少或減緩神經膠質細胞活化（星狀細胞和/或小神經膠質細胞活化），(d) 減少或減緩星形細胞增生，(e) 減少或減緩MRI測量的腦容量損失，(f) 減少或減緩癲癇發作，以及 (g) 用於評估CLN3 Batten病的進展和/或改善的量表（例如，統一Batten病評定系統（UBDRS）評估量表或Hamburg運動和語言量表）中一或多項的穩定、進展減少或減緩、或改善，與投與該組成物之前的受試者或未治療的CLN3-Batten病患者進行比較。

在一些實施方式中，組成物的治療有效量在約1 x 10 ¹²至約1 x 10 ¹⁵vg、約6 x 10 ¹³至約4 x 10 ¹⁴vg、約1.2 x 10 ¹⁴至約4 x 10 ¹⁴或約2 x 10 ¹⁴至約4 x 10 ¹⁴vg的scAAV9基因組的範圍內。在一些實施方式中，組成物的治療有效量為約3 x 10 ¹³vg。在一些實施方式中，組成物的治療有效量為約6 x 10 ¹³vg。在一些實施方式中，組成物的治療有效量為約3 x 10 ¹⁴vg。

在所提供的任何方法中，通過選自由鞘內、腦池內、腰椎穿刺、顱內、腦室內、實質內、靜脈內及其組合組成之群組的途徑投與組成物、rAAV9、ssAAV9、scAAV9和/或核酸分子。在一些實施方式中，鞘內途徑包括小腦延髓池內（ICM）途徑。在一些實施方式中，通過腦池內途徑投與組成物。在一些實施方式中，通過腰椎穿刺途徑投與組成物。在一些實施方式中，通過顱內途徑投與組成物。

在一些實施方式中，將組成物遞送至腦或脊髓。因此，在一些實施方式中，將組成物或藥物遞送至腦或脊髓係指將組成物遞送至腦幹，或可遞送至小腦，或可遞送至視覺皮質，或可遞送至運動皮質。此外，在一些實施方式中，遞送至腦或脊髓的組成物係指遞送至神經細胞、神經膠質細胞或兩者的組成物。在一些實施方式中，遞送至腦或脊髓的組成物包括遞送至神經系統細胞，如神經元、下運動神經元、小神經膠質細胞、寡樹突細胞、星狀細胞、施旺氏細胞或其組合。

在一些實施方式中，組成物不包含非離子低滲造影劑（例如碘苯六醇）。

在一些實施方式中，組成物包含非離子低滲造影劑。例如，組成物包含非離子低滲造影劑，該造影劑選自由碘比醇、碘苯六醇、碘美普爾、碘巴美度、碘噴托、碘普羅胺、碘佛醇、碘昔蘭及其組合組成之群組。

在一些實施方式中，可以使用治療有效的程序製備和投與組成物，包括在遞送給受試者之前將scAAV9基因組與造影劑混合。在另一個實施方式中，順序遞送scAAV9基因組和造影劑。

在一些實施方式中，在投與本文揭露的rAAV9、ssAAV9或scAAV或核酸分子後，可將受試者保持在特倫德倫伯格臥位（Trendelenberg position）。

在一或多個實施方式中，該方法進一步包括向受試者投與脊髓造影劑以用於CT掃描輔助的小腦延髓池內（ICM）枕下投與。在一些實施方式中，脊髓造影劑不包括非離子低滲造影劑。

在一或多個實施方式中，治療導致以下中一或多項的穩定、進展減少、或改善：UBDRS子量表評分、認知功能、神經心理功能、疾病嚴重程度、兒科生活質量和步態。在一些實施方式中，受試者的UBDRS生理損傷評分之平均數年變化率小於未治療的受試者的情況。

本文中的標題係為了方便讀者，並非旨在限制。

在此使用「可以」是為了描述申請專利範圍中包括的各種實施方式，而不是為了指示申請專利範圍之範圍的不確定性。

本揭露提供了用於治療CLN3-Batten病之方法和產物。該等方法涉及使用rAAV作為基因遞送載體向受試者遞送CLN3多核苷酸。

腺相關病毒（AAV）係複製缺陷型小病毒，其單股DNA基因組長度為約4.7 kb，包括145個核苷酸反向末端重複序列（ITR），並且可用於指代病毒本身或其衍生物。除非另有規定，術語涵蓋了所有亞型和天然存在的和重組的形式。AAV有多種血清型。AAV的血清型各自與特定的分支有關，其成員在血清學和功能上具有相似性。因此，AAV也可由分支提及。例如，AAV9序列稱為「分支F」序列（Gao等人, J. Virol.[病毒學雜誌], 78: 6381-6388 (2004)）。本揭露考慮使用特定分支內的任何序列，例如分支F。AAV血清型的基因組的核苷酸序列係已知的。例如，在GenBank登錄號NC_002077中提供了AAV-1之完整基因組；在GenBank登錄號NC_001401和Srivastava等人, J. Virol.[病毒學雜誌], 45: 555-564 {1983)中提供了AAV-2之完整基因組；在GenBank登錄號NC_1829中提供了AAV-3之完整基因組；在GenBank登錄號NC_001829中提供了AAV-4之完整基因組；在GenBank登錄號AF085716中提供了AAV-5基因組；在GenBank登錄號NC_00 1862中提供了AAV-6之完整基因組；在GenBank登錄號AX753246和AX753249中提供了至少部分AAV-7和AAV-8基因組；在Gao等人, J. Virol.[病毒學雜誌], 78: 6381-6388 (2004)中提供了AAV-9基因組；在 Mol. Ther.[分子治療] , 13(1): 67-76 (2006)中提供了AAV-10 基因組；在 Virology[病毒學] , 330(2): 375-383 (2004)中提供了AAV-11基因組；在Genbank登錄號DQ813647中提供了AAV-12基因組的部分；在Genbank登錄號EU285562中提供了AAV-13基因組的部分。參見美國專利9,434,928中提供了AAV rh.74基因組的序列，將其藉由引用併入本文。在Choudhury等人 , Mol. Ther.[分子治療] , 24(7): 1247-1257 (2016)中提供了AAV-B1基因組的序列。ITR中包含指導病毒DNA複製（rep）、封裝/包裝和宿主細胞染色體整合的同側作用序列。三個AAV啟動子（根據相對圖譜位置命名為p5、p19和p40）驅動編碼rep和cap基因的兩個AAV內部開讀框的表現。兩個rep啟動子（p5和p19）與單個AAV內含子（核苷酸2107和2227處）的差異剪接結合，導致rep基因產生四種rep蛋白（rep 78、rep 68、rep 52和rep 40）。Rep蛋白具有多種酶特性，該等特性最終負責複製病毒基因組。cap基因由p40啟動子表現，並且它編碼三種殼體蛋白VP1、VP2和VP3。AAV9的殼體蛋白VP1的胺基酸序列在本文中提供為SEQ ID NO: 10。可變剪接和非一致翻譯起始位點負責三種相關殼體蛋白的產生。單個共有多腺苷酸化位點定位於AAV基因組的圖譜位置95。關於AAV的生命週期和遺傳學，請參見Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology[微生物學和免疫學最新論題] , 158: 97-129 (1992)。

AAV具有獨特的特徵，使其成為有吸引力的載體，用於向細胞遞送外源DNA，例如在基因療法中。培養細胞的AAV感染係非細胞病變的，並且人和其他動物的自然感染係隱匿性和無症狀的。此外，AAV感染許多哺乳動物細胞，使其有可能在體內靶向許多不同的組。此外，AAV轉導緩慢分裂和非分裂細胞，並且可以作為轉錄活性核游離基因體（染色體外元件）在該等細胞的整個生命週期內持續存在。天然AAV前病毒基因組作為質體中的選殖DNA具有感染性，這使得構建重組基因組成為可能。此外，由於指導AAV複製、基因組封裝和整合的信號包含在AAV基因組的ITR中，基因組內部約4.3 kb的部分或全部（編碼複製和結構殼體蛋白，rep-cap）可被外源DNA替換，如含有啟動子的基因盒、目的DNA和多腺苷酸化信號。在一些情況下，rep和cap蛋白以反式形式提供。AAV的另一個顯著特徵係它係非常穩定和活躍的病毒。它很容易承受滅活腺病毒的條件（56°C至65°C，持續數小時），使AAV的冷保存不那麼關鍵。AAV甚至可以被凍乾。最後，AAV感染的細胞對重複感染沒有抵抗力。

如本文所用，術語「AAV」係指野生型AAV病毒或病毒顆粒。術語「AAV」、「AAV病毒」和「AAV病毒顆粒」在本文中互換使用。術語「rAAV」係指重組AAV病毒或重組感染性封裝病毒顆粒。術語「rAAV」、「rAAV病毒」和「rAAV病毒顆粒」在本文中互換使用。

術語「rAAV基因組」係指衍生自經過修飾的天然AAV基因組的多核苷酸序列。在一些實施方式中，rAAV基因組已被修飾以去除天然cap和rep基因。在一些實施方式中，rAAV基因組包含內源性5’和3’反向末端重複序列（ITR）。在一些實施方式中，rAAV基因組包含來自與AAV基因組來源的AAV血清型不同的AAV血清型的ITR。在一些實施方式中，rAAV基因組包含藉由反向末端重複序列（ITR）在5'和3'末端兩側的目的轉基因（例如，編碼CLN3的多核苷酸）。在一些實施方式中，rAAV基因組包含「基因盒」示例性基因盒如圖1A所示，並且其核酸序列為SEQ ID NO: 4。rAAV基因組可為自身互補型（sc）基因組，在本文中稱為「scAAV基因組」  可替代地，rAAV基因組可為單股（ss）基因組，其在本文中稱為「ssAAV基因組」

術語「scAAV」係指包含自身互補型基因組的rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。術語「ssAAV」係指包含單股基因組的rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。

本文提供的rAAV基因組可包含編碼CLN3多肽的多核苷酸。CLN3多肽包含SEQ ID NO: 1中所示的胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO: 1中所示的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的多肽，並且其編碼具有CLN3活性的多肽（例如，以下中至少一項：如與例如治療前患者相比，增加治療時患者體內溶酶體自發螢光貯積物質的清除，減少ATP合酶亞基C的溶酶體積累，並減少星狀細胞和小神經膠質細胞的活化）。

如本文所用，「能夠逆轉疾病進展的劑量」係指如下量，該量足以緩和、減輕、穩定、逆轉或減緩疾病進展，減輕副作用，或以其他方式減少疾病的病理或表型後果，包括以下中一或多項： (a) 減少或減緩自發螢光貯積物質的溶酶體積累， (b) 減少或減緩ATP合酶亞基C的溶酶體積累， (c) 減少或減緩神經膠質細胞活化（星狀細胞和/或小神經膠質細胞活化）， (d) 減少或減緩星形細胞增生， (e) 減少或減緩MRI測量的腦容量損失， (f) 減少或減緩癲癇發作，以及 (g) UBDRS評估量表中一或多項的穩定、進展減少或延遲、或改善，其中該減少、穩定或改善係與投與該組成物之前的該受試者或未治療的CLN3-Batten病患者進行比較。

在一些情況下，本文提供的rAAV基因組包含編碼CLN3多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸具有SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同並編碼具有CLN3活性的多肽的多核苷酸（例如，以下中至少一項：如與例如與治療前患者相比，增加治療時患者體內溶酶體自發螢光貯積物質的清除，減少ATP合酶亞基C的溶酶體積累，並減少星狀細胞和小神經膠質細胞的活化）。

在一些實施方式中，本文提供的rAAV基因組包含如下的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼具有CLN3活性的多肽，並且在嚴格條件下與SEQ ID NO: 2的核酸序列或其補體雜交。術語「嚴格」用於指本領域中通常理解為嚴格的條件。雜交強度主要由溫度、離子強度和變性劑（如甲醯胺）之濃度決定。用於雜交和洗滌的嚴格條件之實例包括但不限於65°C-68°C的0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉，或42°C的0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉和50%甲醯胺。參見，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [分子選殖：實驗室手冊], 第二版, 冷泉港實驗室（紐約冷泉港1989）。

在一些實施方式中，本文提供的rAAV基因組包含編碼CLN3多肽的多核苷酸兩側的一或多個AAV ITR。CLN3多核苷酸與轉錄控制元件（包括但不限於啟動子、增強子和/或多腺苷酸化信號序列）操作性連接，該等元件在靶細胞中係功能性的以形成基因盒。啟動子之實例係P546啟動子和雞β肌動蛋白啟動子。本文考慮的其他啟動子包括但不限於猿猴病毒40（SV40）早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）、人類免疫不全病毒（HIV）長末端重複序列（LTR）啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、EB病毒（Epstein-Barr virus）即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子以及人基因啟動子（如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延長因子-1a啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動子）。本文提供了SEQ ID NO: 3中所示的P546啟動子序列，以及與SEQ ID NO: 3中所示的核苷酸序列至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的啟動子序列，它們係具有P546轉錄促進活性的啟動子。轉錄控制元件之其他實例係組織特異性控制元件，例如，允許在神經元內或星狀細胞內特異性表現的啟動子。實例包括神經元特異性烯醇酶和神經膠質纖維酸性蛋白啟動子。還考慮了誘導型啟動子。誘導型啟動子之非限制性實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、助孕酮啟動子和四環素調控啟動子。該基因盒還可包括內含子序列，以促進在哺乳動物細胞中表現的CLN3 RNA轉錄物的處理。這種內含子之一個實例係SV40內含子。

「包裝」係指導致AAV顆粒的組裝和封裝的一系列細胞內事件。

術語「生產」係指藉由包裝細胞生產rAAV（感染性、封裝rAAV顆粒）的過程。

AAV「rep」和「cap」基因分別係指編碼腺相關病毒複製和封裝蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中稱為AAV「包裝基因」

AAV的「輔助病毒」係指允許AAV（例如野生型AAV）被哺乳動物細胞複製和包裝的病毒。本領域已知多種此類AAV輔助病毒，包括腺病毒、皰疹病毒和痘病毒，如牛痘。儘管亞群C的5型腺病毒係最常用的，但腺病毒可能包含許多不同的亞群。人、非人哺乳動物和鳥類起源的許多腺病毒均為已知的，並且可以從ATCC等保存機構獲得。皰疹家族的病毒包括，例如，單純皰疹病毒（HSV）和EB病毒（EBV），以及巨細胞病毒（CMV）和假狂犬病病毒（PRV）；也可從ATCC等保存機構獲得。

「輔助病毒功能」係指輔助病毒基因組中編碼的功能，其允許AAV複製和包裝（結合本文所述之複製和包裝的其他要求）。如本文所述，「輔助病毒功能」可以藉由多種方式提供，包括藉由提供輔助病毒或例如以反式方式向產生細胞提供編碼一或多種所需功能的多核苷酸序列。

本文提供的rAAV基因組缺乏AAV rep和cap DNA。本文考慮的rAAV基因組（例如，ITR）中的AAV DNA可以來自任何適合於衍生重組病毒的AAV血清型，包括但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74和AAV-B1。如上所述，各種AAV血清型的基因組之核苷酸序列係本領域已知的。還考慮了帶有殼體突變的rAAV。參見，例如，Marsic等人 , Molecular Therapy[分子療法] , 22(11): 1900-1909 (2014)。本文還考慮了修飾的殼體，並包括具有各種翻譯後修飾（如糖基化和脫醯胺化）的殼體。在本文提供的rAAV殼體中考慮了天冬醯胺或麩醯胺酸側鏈的脫醯胺作用導致天冬醯胺殘基轉化為天冬胺酸或異天冬胺酸殘基，並且麩醯胺酸轉化為麩胺酸或異麩胺酸。參見，例如，Giles等人, Molecular Therapy [分子療法], 26(12): 2848-2862 (2018)。本文中的修飾殼體還被考慮包含將rAAV定向到需要治療的受影響組織和器官的靶向序列。

本文提供的DNA質體包含本文所述之rAAV基因組。可將DNA質體轉移到允許感染AAV輔助病毒（例如，腺病毒、E1缺失腺病毒或皰疹病毒）的細胞中，以將rAAV基因組組裝成帶有AAV9殼體蛋白的感染性病毒顆粒。產生rAAV顆粒的技術係本領域的標準技術，其中將要包裝的AAV基因組、rep和cap基因以及輔助病毒功能提供給細胞。rAAV顆粒的生產需要以下組分存在於單個細胞（本文稱為包裝細胞）內：rAAV基因組、與rAAV基因組分離（即不在rAAV基因組中）的AAV rep和cap基因，以及輔助病毒功能。AAV rep和cap基因可以來自可衍生重組病毒的任何AAV血清型，並且可能來自與rAAV基因組ITR不同的AAV血清型。假型rAAV的產生在例如WO 01/83692中揭露，將其藉由引用以其全文併入本文。在各種實施方式中，可修飾AAV殼體蛋白以增強rAAV的遞送。對殼體蛋白的修飾在本領域中係眾所周知的。參見例如US 2005/0053922和US 2009/0202490，將其揭露內容藉由引用以其全文併入本文。

產生包裝細胞之方法係產生如下細胞系，該細胞系能穩定表現rAAV生產所需的所有組分。例如，包含缺乏AAV rep和cap基因的rAAV基因組、與rAAV基因組分離的AAV-rep和cap基因的質體（或多個質體）以及諸如新黴素抗性基因的可選擇標記可整合到細胞的基因組中。可以藉由諸如GC加尾等程式（Samulski等人, 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA [美國國家科學院院刊S6], 79:2077-2081），添加含有限制性內切酶切割位點的合成連接子（Laughlin等人, 1983, Gene [基因], 23:65-73）或藉由直接平端連接（Senapathy和Carter, 1984, J. Biol. Chem. [生物化學雜誌], 259:4661-4666），將rAAV基因組引入細菌質體中。然後可以用輔助病毒如腺病毒感染包裝細胞系。該方法的優點係細胞係可選擇的，適合大規模生產rAAV。合適方法之其他非限制性實例採用腺病毒或桿狀病毒而不是質體來將rAAV基因組和/或rep和cap基因引入包裝細胞。

rAAV顆粒產生的一般原則在例如Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology [生物技術近期述評], 1533-539；以及Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol. [微生物學與免疫學的當前課題], 158:97-129中進行了綜述。各種方法描述於Ratschin等人, Mol. Cell. Biol. [分子細胞生物學] 4:2072 (1984)中；Hermonat等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國科學院院刊], 81:6466 (1984)；Tratschin等人, Mo1. Cell. Biol. [分子細胞生物學] 5:3251 (1985)；McLaughlin等人, J. Virol. [病毒學雜誌], 62:1963 (1988)；以及Lebkowski等人, 1988 Mol. Cell. Biol. [分子細胞生物學], 7:349 (1988)。Samulski等人（1989, J. Virol. [病毒學雜誌], 63:3822-3828）；美國專利案號5,173,414；WO 95/13365和相應的美國專利案號5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441（PCT/US96/14423）；WO 97/08298（PCT/US96/13872）；WO 97/21825（PCT/US96/20777）；WO 97/06243（PCT/FR96/01064）；WO 99/11764；Perrin等人 (1995) Vaccine [疫苗] 13:1244-1250；Paul等人 (1993) Human Gene Therapy [人類基因療法] 4:609-615；Clark等人 (1996) Gene Therapy [基因療法] 3:1124-1132；美國專利案號5,786,211；美國專利案號5,871,982；和美國專利案號6,258,595。將前述文件藉由引用以其全文併入本文，特別強調文件中與rAAV顆粒產生有關的那些部分。

本文進一步提供了產生感染性rAAV顆粒的包裝細胞。在一個實施方式中，包裝細胞可為穩定轉化的癌細胞，如HeLa細胞、293細胞和PerC.6細胞（同源293系）。在另一個實施方式中，包裝細胞可為未轉化癌細胞的細胞，如低代293細胞（用腺病毒E1轉化的人胎腎細胞）、MRC-5細胞（人胎成纖維細胞）、WI-38細胞（人胎成纖維細胞）、Vero細胞（猴腎細胞）和FRhL-2細胞（恆河猴胎肺細胞）。

本文還提供了包含本揭露之rAAV基因組的rAAV（例如，感染性的包裹的rAAV顆粒）。rAAV的基因組缺乏AAV rep和cap DNA，即，rAAV基因組的ITR之間沒有AAV rep或cap DNA。rAAV基因組可為自身互補型（sc）基因組。具有sc基因組的rAAV在本文中稱為scAAV。rAAV基因組可為單股（ss）基因組。具有單股基因組的rAAV在本文中稱為ssAAV。

本文提供的示例性rAAV係名為「scAAV9.P546.CLN3」的scAAV。scAAV9.P546.CLN3包含在截短的甲基CpG結合蛋白2（MeCP2）啟動子控制下的人CLN3 cDNA，該啟動子在本文中稱為P546啟動子（SEQ ID NO: 3）。scAAV基因組還包含SV40內含子（人CLN3 cDNA的上游）和牛生長激素多腺苷酸化（BGH多A）終止子序列（人CLN3 cDNA的下游）。該scAAV9.P546.CLN3基因盒的序列示於SEQ ID NO: 4中。在一些實施方式中，scAAV9.P546.CLN3基因盒序列包含與SEQ ID NO: 4中所示的核苷酸序列至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93% 、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同的多核苷酸。scAAV基因組包裝在AAV9殼體中，並且包括AAV2 ITR（一個ITR在P546啟動子上游，另一個ITR在牛生長激素（BGH）多A終止子序列下游）。

在一些實施方式中，scAAV9基因組以5'到3'順序包含：包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的P546啟動子和編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸。在一些實施方式中，scAAV9基因組進一步包含反向末端重複序列，該反向末端重複序列以5'到3'順序如下定位：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸和第二AAV反向末端重複序列。在一些實施方式中，scAAV9基因組進一步包含SV40內含子，SV40內含子以5'到3'順序如下定位：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、SV40內含子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸和第二AAV反向末端重複序列。在一些實施方式中，scAAV9基因組進一步包含牛生長激素多腺苷酸化多A序列，牛生長激素多腺苷酸化多A序列以5'到3'順序如下定位：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸、牛生長激素多腺苷酸化多A序列和第二AAV反向末端重複序列。

rAAV可藉由本領域標準方法純化，例如藉由柱層析法或氯化銫梯度法。從輔助病毒中純化rAAV之方法在本領域係已知的，並且可以包括例如Clark等人 , Hum. Gene Ther.[人類基因治療], 10(6): 1031-1039 (1999)中揭露的方法；Schenpp和Clark, Methods Mol. Med.,69 :427-443 (2002)；美國專利案號6,566,118和WO 98/09657。

還提供了包含rAAV的組成物。組成物包含編碼CLN3多肽的rAAV。組成物可包括編碼不同目的多肽的兩個或多個rAAV。在一些實施方式中，rAAV係scAAV或ssAAV。

本文提供的組成物包含rAAV和一或多種藥學上可接受的賦形劑。可接受的賦形劑對受體無毒，並且較佳的是在使用的劑量和濃度下係惰性的，並且包括但不限於緩衝液，如磷酸鹽[例如，磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）]、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單糖、雙糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；形成鹽的相對離子，如鈉；和/或非離子界面活性劑，如Tween、共聚物（如泊洛沙姆188）、普朗尼克（例如，Pluronic F68）或聚乙二醇（PEG）。本文提供的組成物可包含藥學上可接受的包含非離子低滲化合物（如碘比醇、碘苯六醇、碘美普爾、碘巴美度、碘噴托、碘普羅胺、碘佛醇或碘昔蘭）的水性賦形劑，其中包含非離子低滲化合物的該水性賦形劑可具有以下一或多個特徵：約180 mgI/mL，藉由蒸汽壓滲透壓測定法得到的約322 mOsm/kg水的滲透壓，約273 mOsm/L的滲透壓，在20°C時約2.3 cp和在37°C時約1.5 cp的絕對黏度，以及在37°C時約1.164的比重。示例性組成物包含約20%至約40%的非離子低滲化合物或約25%至約35%的非離子低滲化合物。示例性組成物包含在20 mM Tris（pH8.0）、1 mM MgCl ₂、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188和約20%至約40%非離子低滲化合物中配製的scAAV或rAAV病毒顆粒。另一示例性組成物包含在1X PBS和0.001%普朗尼克F68中配製的scAAV。在一些實施方式中，組成物不包含非離子低滲造影劑。在一些實施方式中，可以使用治療有效的程序製備和投與組成物，包括在遞送給受試者之前將scAAV9基因組與造影劑混合。在另一個實施方式中，順序遞送scAAV9基因組和造影劑

以本揭露的方法投與的rAAV劑量將根據例如特定rAAV、投與模式、投與時間、治療目標、個體和被靶向的一或多種細胞類型而變化，並且可以藉由本領域標準方法來確定。劑量可以以病毒基因組（vg）為單位表現。本文考慮的劑量包括約1x10 ¹¹、約1x10 ¹²、約1x10 ¹³、約1.1x10 ¹³、約1.2x10 ¹³、約1.3x10 ¹³、約1.5x10 ¹³、約2x10 ¹³、約2.5x10 ¹³、約3x10 ¹³、約3.4x10 ¹³、約3.5x10 ¹³、約4x10 ¹³、約4.5x10 ¹³、約5x10 ¹³、約6x10 ¹³、約1x10 ¹⁴、約1.2x10 ¹⁴、約2x10 ¹⁴、約3x10 ¹⁴、約4x10 ¹⁴、約5x10 ¹⁴、約1x10 ¹⁵至約1x10 ¹⁶或更多的總病毒基因組。還考慮了約1x10 ¹¹至約1x10 ¹⁵vg、約1x10 ¹²至約1x10 ¹⁵vg、約1x10 ¹²至約1x10 ¹⁴vg、約1x10 ¹³至約6x10 ¹⁴vg、約6x10 ¹³至約4x10 ¹⁴vg、約1.2x10 ¹⁴至約4x10 ¹⁴vg和約2x10 ¹⁴vg至約4x10 ¹⁴vg的劑量。本文示例的一種劑量為3x10 ¹³vg。本文示例的另一劑量為6x10 ¹³vg。本文示例的另一劑量包括1.2x10 ¹⁴vg。本文示例的另一劑量包括2 x10 ¹⁴vg。本文示例的另一劑量包括3x10 ¹⁴vg。本文示例的另一劑量包括4x10 ¹⁴vg。

提供了用rAAV轉導靶細胞（包括但不限於神經系統細胞、神經或神經膠質細胞）之方法。神經系統的細胞包括神經元、下運動神經元、小神經膠質細胞、寡樹突細胞、星狀細胞、施旺氏細胞或其組合。

術語「轉導」用於指經由本揭露的複製缺陷型rAAV在體內或體外向靶細胞投與/遞送CLN3多核苷酸，從而導致受體細胞表現功能性多肽。用本揭露的rAAV轉導細胞導致由rAAV編碼的多肽或RNA的持續表現。因此，本揭露提供了藉由鞘內、腦池內、腰椎穿刺、顱內、腦室內、實質內、靜脈內及其組合向受試者投與/遞送編碼CLN3多肽的rAAV之方法。鞘內遞送係指遞送至腦或脊髓蛛網膜下的空間中。在一些實施方式中，鞘內投與係經由腦池內投與。在一些實施方式中，鞘內投與係通過小腦延髓池內（ICM）投與。在一些實施方式中，小腦延髓池內（ICM）投與係在顱頸交界處。在一些實施方式中，小腦延髓池內（ICM）投與係在枕下區域。

本文示例了鞘內投與。該等方法包括用本文所述之一或多種rAAV轉導靶細胞（包括但不限於神經和/或神經膠質細胞）。在一些實施方式中，將包含編碼CLN3多肽的多核苷酸的rAAV病毒顆粒投與或遞送至患者的腦和/或脊髓。在一些實施方式中，將多核苷酸遞送至腦。考慮用於遞送的腦區域包括但不限於運動皮質、視覺皮質、小腦和腦幹。在一些實施方式中，將多核苷酸遞送至脊髓。在一些實施方式中，將多核苷酸遞送至神經元或下運動神經元。在一些實施方式中，將多核苷酸遞送至神經和神經膠質細胞。在一些實施方式中，神經膠質細胞係小神經膠質細胞、寡樹突細胞或星狀細胞。在一些實施方式中，將多核苷酸遞送至施旺氏細胞。

在本文提供的方法的一些實施方式中，在投與rAAV（例如，約5、約10、約15或約20分鐘）後，將患者保持在特倫德倫伯格臥位（低頭位置）。例如，患者可在低頭位置傾斜約1度至約30度、約15度至約30度、約30度至約60度、約60度至約90度或約90度至約180度）。

本文提供的方法包括將有效劑量或有效多劑量的包含本文提供的rAAV的組成物投與給有需要的受試者（例如，動物，包括但不限於人類患者）之步驟。如果在發生CLN3-Batten病之前投與該劑量，則投與係預防性的。如果在CLN3-Batten病發展後投與該劑量，則投與係治療性的。有效劑量係緩解（消除或減少）至少一種與疾病相關症狀、減緩或防止疾病進展、減少疾病程度、導致疾病緩解（部分或全部）和/或延長存活期的劑量。與治療前的受試者相比或與未治療的受試者相比，本文提供的方法導致用於評估CLN3 Batten病的進展和/或改善的量表（例如，統一Batten病評定系統（UBDRS）或Hamburg運動和語言量表）中一或多項的穩定、進展減少、或改善。UBDRS評估量表（如Marshall等人, Neurology. [神經學] 2005 65(2):275-279中所述）[包括UBDRS生理評估量表、UBDRS癲癇發作評估量表、UBDRS行為評估量表、UBDRS能力評估量表、UBDRS症狀發作順序和UBDRS臨床總體印象（CGI）]；兒科生活質量（PEDSQOL）量表、運動功能、語言功能、認知功能和存活期。與治療前的受試者相比，或與未治療的受試者相比，本文提供的方法可能導致以下中的一或多項：減少或減緩自發螢光貯積物質的溶酶體積累，減少或減緩ATP合酶亞基C的溶酶體積累，減少或減緩神經膠質細胞活化（星狀細胞和/或小神經膠質細胞活化）；減少或減緩星形細胞增生，並且顯示減少或減緩MRI測量的腦容量損失。

在一或多個實施方式中，治療導致以下中一或多項的穩定、進展減少、或改善：UBDRS子量表評分、認知功能、神經心理功能、疾病嚴重程度、兒科生活質量和步態。在一些實施方式中，受試者的UBDRS生理損傷評分的平均數年變化率小於未治療的受試者的情況。

還提供了組合療法。如本文所用，組合包括同時治療或順序治療。特別考慮了本文描述的方法與標準醫學治療之組合。此外，特別考慮了用於根據本發明使用 - 同時治療或順序治療的組成物之組合（例如，本文揭露的scAAV9.P546.CLN3和造影劑之組合）。

雖然考慮了在出生後遞送給有需要的受試者，但也考慮了子宮內遞送給胎兒。 實例

儘管以下實例描述了具體實施方式，但應理解，熟悉該項技術者將想到變化和修改。因此，只有請求項中出現的此類限制才應加於本發明之上。

在該等實例中，產生了攜帶在P546啟動子控制下的CLN3 cDNA的自身互補型AAV（命名為scAAV9.P546.CLN3）。P546啟動子係MeCP2啟動子的截短版本，允許轉基因在神經元和星狀細胞中以中等水平表現。在CLN3 ^Δex7/8敲入小鼠模型中測試了該基因療法載體的療效，該模型攜帶在人類患者中發現的最常見突變。在CLN3 ^Δex7/8敲入小鼠模型、野生型小鼠、非人靈長類動物和人類患者受試者中體內評估了scAAV9.P546.CLN3的安全性和療效。來自小鼠和非人靈長類動物的數據清楚地證明星狀細胞和神經元在整個腦和脊髓中的有效轉導，包括深部腦結構，如視丘、海馬、紋狀體、杏仁核、髓質和小腦。 實例1 scAAV9.P546.CLN3的產生

由美國歐陸基因組學公司（Eurofin Genomics）合成在兩個Not1限制性位點之間包括人 CLN3（SEQ ID NO: 2）的開讀框的DNA，然後插入到基於雙股AAV2-ITR的生產質體中。圖1顯示了質體構建體之示意圖，其顯示了插入AAV2 ITR之間的CLN3 DNA [5' ITR已如前所述在McCarty等人, Gene Therapy [基因療法] 8:1248-1254 (2001)中進行了修飾以生成scAAV]。質體構建體還包括P546啟動子、SV40嵌合內含子和牛生長激素（BGH）多腺苷酸化信號。圖14提供了scAAV9.P546.CLN3基因盒之核酸序列。圖15提供了全長scAAV.P546.CLN3之核酸序列。

scAAV9.P546.CLN3係在HEK293細胞中在cGMP條件下藉由瞬時三質體轉染程序使用基於雙股AAV2-ITR的生產質體、如前所述編碼Rep2Cap9序列的質體[Gao等人 , J. Virol.[病毒學雜誌], 78: 6381-6388 (2004)]以及腺病毒輔助質體pHelper（斯特拉塔根（Stratagene），加利福尼亞州聖克拉拉市）產生的。藉由兩個氯化銫密度梯度純化步驟純化病毒，用PBS進行透析並用0.001%普朗尼克F68配製以防止病毒聚集並在4°C下儲存。使用Taq-Man技術藉由定量PCR對所有scAAV製劑進行滴定。藉由4%-12%十二烷基硫酸鈉-丙烯醯胺凝膠電泳和銀染色（英傑公司（Invitrogen），加利福尼亞州卡爾斯巴德市）評估scAAV的純度。 實例2 CSF 遞送的 scAAV9.P546.CLN3 在 CLN3 ^∆ex7/8 小鼠中的長期療效研究 細胞靶向和表現

為了確認病毒引入的人CLN3在小鼠中的表現和生物分佈 ，將scAAV9.P546.CLN3配製在1 x PBS和0.001%普朗尼克F68中或配製在20 mM Tris（pH 8.0）、1 mM MgCl ₂、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188中，並且在出生後36小時內通過腦室內（ICV）注射投與給CLN3 ^∆ex7/8小鼠，並且在不同時間點監測表現。注射等體積PBS的野生型與CLN3 ^∆ex7/8小鼠作為對照。使用NCH病毒載體核心效價的有效投與劑量為2.2 x 10 ¹⁰vg/小鼠。

為了獲得詳細的腦生物分佈圖，使用RNAscope原位雜交技術特異性鑒定腦、頸段脊髓、胸段脊髓和腰段脊髓中的人CLN3 mRNA。該技術涉及使用與特定探針原位雜交的RNA來僅檢測由scAAV9編碼的人轉基因。在注射後4個月和6個月觀察到強烈信號，特別是在注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^∆ex7/8小鼠的皮質（區域A-C）中，而在注射PBS的對照中沒有信號。分析證明AAV9遞送的CLN3轉基因在不同的腦區域以足夠的水平表現，包括皮質、視丘、後腦、小腦和脊髓。在小腦，Purkinje神經元的信號尤其強烈。在4個月和6個月時，通過反轉錄PCR在腦和脊髓的所有區域也檢測到轉基因表現（圖2）。

綜上所述，對來自CLN3 ^∆ex7/8小鼠的組織進行的反轉錄PCR數據和RNAscope分析證實，在注射後長達6個月，單次ICV注射scAAV9.P546.CLN3導致在整個腦和脊髓中成功靶向和表現人CLN3。這證實了ICV介導的scAAV9向特異性靶向細胞的有效性，該等細胞不成比例地參與CLN3-Batten病的發病機制。CLN3 ^∆ex7/8小鼠模型中的表現數據在使用相同引物通過定量RT-PCR檢測人轉基因的野生型小鼠研究中得到進一步證實。 遞送 scAAV9.P546.CLN3 後的病理學改善自發螢光貯積物質（ASM）的積累

自發螢光貯積物質（ASM）的積累係Batten病進展的標誌性組織學標記（Mole等人, Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis.2015; 1852(10):2237-2241；Cotman等人, Clin Lipidol. [臨床痔瘡學]2012年2月；7(1):79-91；Seehafer等人, Neurobiol Aging. [老年神經生物學]2006; 27:576-588）。ASM的積累係多種形式Batten病疾病進展的有力指標（Bosch等人, J Neurosci. [神經科學雜誌]2016; 36(37):9669-9682；Morgan等人, PLoS One. [公共科學圖書館]2013;8(11):e78694）。本文考慮了ASM的減少用作成功治療的指標。作為CLN3-Batten病最早可檢測到的疾病表現之一，ASM已經在2個月大的CLN3 ^∆ex7/8小鼠的許多腦區域中可見（圖3）。

螢光像素面積的自動定量證實，在2個月大的注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^∆ex7/8小鼠中，體感皮質和視丘中積累的ASM顯著減少。由於在這個早期時間點，在PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠中觀察到運動皮質和視覺皮質中ASM積累的更高變異性，這兩個區域的分析統計能力較低。在注射後4個月和6個月，與PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠相比，所有四個腦區域都顯示出ASM積累的顯著減少（圖4）。當將注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^∆ex7/8小鼠與野生型動物進行比較時，在注射後4個月，在注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^∆ex7/8小鼠的體感和視覺皮質中發現ASM水平略高，而野生型和scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠在運動皮質和視丘中沒有發現顯著差異。在注射後6個月，野生型和scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠的所有區域都顯示出相當低的ASM水平，與PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠相比要低得多，證實了長期持久且高效地減少ASM積累（p ≤0.0001）。（每組N = 10），在PBS和scAAV9.P546.CLN3治療的動物之間，除注射後4個月（p ≤ 0.001）視覺皮質和注射後6個月運動皮質（p ≤ 0.001）外所有情況p ≤ 0.0001。 粒線體蛋白ATP合酶亞基C的積累

分析野生型和CLN3 ^∆ex7/8的注射PBS或注射scAAV9.P546.CLN3的小鼠的腦組織中ATP合酶亞基C的積累。在健康的個體中，該蛋白係粒線體膜中呼吸鏈的一部分，但在患有Batten病的患者中，蛋白在溶酶體中積累（Palmer等人, Am J Med Genet. [美國醫學遺傳學雜誌] 1992；42(4):561-567）。在CLN3 ^∆ex7/8小鼠中，與野生型動物相比，4個月大時視丘腹後內側核和腹後外側核（VPM/VPL區，在NCL小鼠模型中早期經常受到影響的腦區域）中亞基C積累明顯（Morgan等人, PLoS One. [公共科學圖書館]2013;8(11):e78694；Pontikis等人, Neurobiol Dis. [疾病神經生物學]2005; 20(3):823-836）。雖然未治療的動物在體感皮質和視丘的VPM/VPL區域中積累的ATP合酶sub C方面具有強烈的信號，但在注射後4個月和6個月，scAAV9.P546.CLN3治療的動物展示了與野生型動物相當的最小信號（圖5）（PBS和scAAV9.P546.CLN3治療的動物之間的p≤ 0.0001）。 神經膠質細胞和星狀細胞活化

除了貯積物質的異常積累和ATP合酶sub C的積累之外，人類患者和動物模型中的疾病進展的其他組織學標記包括星狀細胞和小神經膠質細胞的活化（Cotman等人, Hum Mol Genet. [人類分子遺傳學]2002; 11(22):2709-2721；Morgan等人, PLoS One. [公共科學圖書館]2013; 8(11): e78694；Pontikis等人, Neurobiol Dis. [疾病神經生物學]2005; 20(3):823-836；Palmer等人, Am J Med Genet. [美國醫學遺傳學雜誌]1992; 42(4):561-567）。特別地，反應性小神經膠質細胞能夠釋放促炎介質，如IL1-β26，這可能是CLN3-Batten病的後期神經元細胞死亡的關鍵原因。藉由在4和6個月的時間點染色膠質纖維酸性蛋白（GFAP），在VPM/VPL視丘和體感皮質切片中鑒定活化的星狀細胞。對於體感皮質，在體感皮質皮層IV內的桶場皮質中進行定量。注射後6個月的代表性圖像如圖6所示。

治療後4和6個月的GFAP陽性面積的定量顯示，與注射PBS的CLN3 ^∆ex7/8小鼠（圖6）相比，注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^∆ex7/8小鼠中的星狀細胞活化顯著減少。雖然，與PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠相比，在該等腦區域中注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^∆ex7/8小鼠的GFAP染色水平遠低得多，在所分析的大多數區域，在注射後4個月和6個月，它們都保持在野生型水平以上。

使用抗CD68染色作為活化小神經膠質細胞的標記在VPM/VPL和體感皮質切片中測定神經膠質細胞活化。CD68係溶酶體蛋白，其在具有促炎症功能（如吞噬）的細胞中上調（Seehafer等人, J Neuroimmunol. [神經免疫學雜誌]2011; 230:169-172）。類似於用星狀細胞觀察到的內容，與4個月後注射PBS的CLN3 ^∆ex7/8小鼠相比，注射AAV9的CLN3 ^∆ex7/8小鼠的VPM/VPL和體感皮質區域的神經膠質細胞活化顯著降低（圖7）。在體感皮質，使用scAAV9.P546.CLN3治療將CD68染色降低到與野生型小鼠相當的水平。在6個月的時間點，與VPM/VPL區域中PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠相比，scAAV9.P546.CLN3治療的CD68染色水平沒有顯著改善，但仍在scAAV9.P546.CLN3治療的小鼠的體感皮質中的反應性膠質顯著減少（圖7）。 遞送 scAAV9.P546.CLN3 後的行為改善

在人CLN3-Batten病患者中，與如CLN3-Batten病（嬰兒晚期Batten病）等早發疾病變體相比，運動和認知功能不全等神經功能缺損變得明顯要晚得多，這可能是由於截短的CLN3蛋白的殘餘功能（Kitzmüller等人, Hum Mol Genet. [人類分子遺傳學]2008年1月15日; 17(2):303-12）。這種表型延遲也存在於CLN3 ^∆ex7/8小鼠模型中。在scAAV9.P546.CLN3的療效研究中，從2個月大開始，每隔2個月持續一次，小鼠接受了一系列行為測試範例，包括加速轉棒測定和爬桿以測試運動功能和協調性，以及用於評估學習和記憶的莫氏水迷津。目前，動物在注射後已被跟蹤10個月，研究正在進行中。以前對該小鼠模型進行描述的出版物指示，神經發育行為的初始延遲，隨後係歸一化，後來在10-12個月大時開始下降（Osório等人, Genes Brain Behav. [基因、大腦與行為]2009年4月; 8(3): 337-345）。

轉棒分析顯示在注射後長達18個月野生型和PBS或治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠之間沒有統計學上的顯著差異。

每2個月進行一次轉棒測定。將小鼠放在加速輪子上，並測量它們跌落的時間。在每個時間點，早上訓練小鼠，並且下午4小時後進行測試。與之前公佈的數據不同，在注射後長達18個月，觀察到野生型小鼠和PBS CLN3 ^∆ex7/8小鼠的性能沒有顯著差異（Bosch等人, J Neurosci. [神經科學雜誌]2016; 36(37): 9669-9682）。然而，雌性WT小鼠與PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠在注射後2個月觀察到跌落潛伏期（latency to fall）的顯著差異。與以前的數據相比，該差異很可能在於測試方案的設計和/或住房中的環境因素。該研究中使用的當前方案僅在每個時間點一天測試動物，而先前公佈的數據在4天的時間跨度內重複測試。此外，與之前公佈的數據相比，本研究中使用的方案以稍低的起始速度（36 rpm與40 rpm）進行，並且在上午訓練和下午測試期間之間的時間間隔更長（休息4小時與休息2小時）。此外，上午的訓練設置也不同：在之前的研究中，只在早上訓練小鼠在以恒定5 rpm旋轉的輪子上旋轉5分鐘，而當前的研究中，使用與下午測試中應用的相同的設置對動物進行訓練，這導致輪子每2秒加速0.3 rpm。總之，在注射後長達18個月，與野生型動物（圖8，頂部圖）相比，在所述設置下，在未治療或scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠中未觀察到抓住加速轉棒輪子的能力不足。

莫氏水迷津分析顯示，在注射後2、4、16和18個月，野生型和CLN3 ^∆ex7/8小鼠之間存在統計學顯著差異。

在莫氏水迷津測試中，動物被放置在裝有隱藏平臺的充滿水的池中。訓練後，動物使用環境線索尋找隱藏平臺的時間被測量為學習和記憶能力的標誌。在注射後2個月和4個月，觀察到野生型動物與PBS或scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠之間的統計學差異，指示在疾病的這個時間點，學習和記憶受損而可被該測試測量到，導致動物發現隱藏平臺有潛伏期。此外，在16個月和18個月時，野生型和PBS或scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠之間觀察到更顯著的潛伏期統計學差異（圖9，左上圖）。16個月時增加的潛伏期也與PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠的游泳速度增加相關（圖9，右上圖）。此外，當按性別分開時，在16個月和18個月時，雄性野生型動物和scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠之間觀察到潛伏期統計學差異（圖9，左中圖），而scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8雄性小鼠游泳速度在16個月時顯著降低（圖9，右中圖）。與18個月時野生型或PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8動物相比，scAAV9.P546.CLN3治療的雌性CLN3 ^∆ex7/8小鼠顯示出顯著增加的潛伏期（圖9，左下圖），而PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8雄性小鼠在16個月時游泳速度顯著增加（圖9，右下圖）。

爬桿測定顯示，與注射PBS的動物相比，scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8的性能有所提高。

爬桿測試測量了當小鼠面朝上放置在立桿上時，小鼠在立桿上轉身所需的時間，以及當面朝下放置在桿上時下降的時間。此外，有時還測量在試圖轉彎或下降時從桿上跌落的次數。該測試評估了協調和平衡能力。

在注射後10和12個月，與PBS治療的動物相比，scAAV9.P546.CLN3動物下降速度顯著更快（圖10，左上圖）。PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8動物在注射後10個月和12個月下桿的時間存在統計學顯著差異，而野生型和scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8無法區分（圖10，左上圖）。關於動物從面朝上位置轉向面朝下所需的時間，發現了兩個統計學顯著差異。在2個月和16個月大時，與scAAV9.P546.CLN3和PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠相比，野生型動物的轉身顯著更快。與雌性小鼠（圖10，左下圖）相比，雄性小鼠（圖10，左中圖）的這種差異更為明顯，而與野生型相比，雄性小鼠沒有差異。2個月和16個月的時間點係在研究組之間觀察到該參數差異的唯一時間點（圖10，左上圖）。

在從桿墜落的平均次數中還觀察到了其他統計學顯著差異，其中PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8雄性小鼠和雌性小鼠與野生型和scAAV9.P546.CLN3治療的動物相比更頻繁地墜落（圖11）。頂部圖：在第2個月發現scAAV9.P546.CLN3治療的動物和PBS治療的動物之間的跌落次數有顯著差異。在注射後16個月，野生型和PBS治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠之間也觀察到統計學顯著差異。中部圖：僅雄性。PBS治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠比其他治療組更頻繁地從桿墜落，在注射後16個月具有最大的統計學意義。底部圖：雌性小鼠在注射後8個月的跌落差異顯著，但在整個研究期間這種趨勢係明顯的。對於每個治療組（5M/5F），N = 5。有趣的是，在整個18個月期間，從桿墜落的差異都存在，並且在早期時間點（4個月）以及8個月和16個月時具有統計學意義。在8個月時，差異僅在雌性小鼠中具有統計學意義，但在雄性小鼠中也存在明顯的趨勢，並且在注射後16個月的雄性小鼠中具有統計學意義。一般來說，PBS治療的CLN3 ^∆ex7/8雄性小鼠比其他治療組更頻繁地從桿墜落。

總之，有強有力的證據表明，用scAAV9.P546.CLN3治療CLN3 ^∆ex7/8小鼠防止ASM物質以及ATP合酶亞基C的積累，這兩者均為CLN3-Batten病進展的主要標誌。該等數據與神經膠質細胞活化（星狀細胞和小神經膠質細胞）的強烈減少相關。儘管在病程早期，行為表型改善的第一個趨勢正在變得明顯：與PBS治療的動物相比，scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^∆ex7/8小鼠更有能力從立桿下降，因為它們移動得更快並且墜落的頻率更低。總之，該等數據支持scAAV9.P546.CLN3基因療法作為該疾病的治療策略。 實例3 scAAV9.P546.GFP在小鼠中的表現研究

P546啟動子允許轉基因以與雞-β-肌動蛋白（CBA）啟動子類似的方式在整個CNS中表現。為了在兩個啟動子之間進行並排比較，在出生後第1天，以5 x 10 ¹⁰/動物的病毒基因組給小鼠注射在1x PBS和0.001%普朗尼克F68或20mM Tris（pH 8.0）、1 mM MgCl ₂、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188中配製的scAAV9.CB.GFP或scAAV9.P546.GFP。3週後處死動物，並將腦直接置於螢光解剖顯微鏡下。從螢光圖像中，很明顯GFP分佈相似，但與接受scAAV9.CB.GFP的動物相比，接受scAAV9.P546.GFP的動物的螢光水平較低，證實了與CBA啟動子相比，P546啟動子導致轉基因的表現水平更適中。

另一隻小鼠被注射scAAV9.P546.GFP並存活200天。200天後，處死動物，對全腦矢狀切片進行GFP表現染色。甚至在注射後200天，在整個腦中都觀察到了GFP轉基因的廣泛表現，包括皮質、海馬、中腦、髓質、杏仁核和小腦，進一步指示P546啟動子係CNS基因療法的良好候選者。

來自不同組織和腦區的西方墨點法數據進一步支持了來自GFP螢光和GFP免疫螢光染色的數據。在用scAAV9.P546.GFP（n=3）治療的小鼠中，使用Liquor System在注射後三週用螢光西方墨點法技術很容易檢測到GFP表現，而在用作對照的PBS注射的動物中未檢測到條帶（n=1）。轉基因表現在全腦裂解物以及區域特異性裂解物中很明顯，包括皮質、髓質、中腦、海馬、小腦和脊髓。

此外，在心臟和肝臟中也證實了GFP表現，而肺和脾臟幾乎沒有轉錄物表現（圖12）。scAAV9.P546.GFP的西方墨點法數據與來自小鼠和非人靈長類動物安全性研究的表現數據一致，其中發現了非常相似的表現譜。此外，腦和周圍器官中的這種表現模式與scAAV9.CB.GFP發現的模式相當。

總之，使用免疫染色和西方墨點法技術在小鼠中進行的廣泛表現分析指示，與強CBA啟動子相比，P546啟動子在整個神經系統中導致非常相似且持久的表現譜，同時允許更溫和的表現水平。 實例4 scAAV9.P546.CLN3在非人靈長類動物中的表現研究

將單劑量的3.4x10 ¹³vg scAAV9.P546.CLN3配製在lx PBS和0.001%普朗尼克F68中，並投與於三隻3-4歲食蟹猴。

對於注射了scAAV9.P546.CLN3的食蟹猴腦組織中的靶向分析，使用對人CLN3轉基因特異且不與內源性非人靈長類CLN3 RNA交叉反應的引物在RNA水平上分析靶向性。在注射12週處死的一隻食蟹猴的不同腦區組織中的反轉錄定量PCR顯示人CLN3在脊髓、皮質、視丘、紋狀體、小腦和視網膜的所有水平中的表現，進一步強調scAAV9的廣泛覆蓋範圍和轉錄物在整個腦和脊髓中的P546啟動子表現（圖13）。值得注意的是，用於檢測載體衍生的人CLN3的引物不會與內源性NHP CLN3轉錄物發生交叉反應。因此，歸一化係針對在腰段脊髓中發現的載體衍生的CLN3 RNA水平進行的，該水平設置為1而不是注射鹽水或未注射的動物，因為歸一化到零係不可能的。肌動蛋白被用作歸一化基因。

總之，來自非人靈長類動物的數據證明，單次腰椎鞘內注射後，scAAV9具有通過神經系統傳播並到達CNS大區域的高潛力。值得注意的是，通過鞘內注射scAAV9.P546.CLN3治療的所有非人靈長類動物都很好地耐受了治療，並且在注射後長達6個月的任何時間點，在任何動物中均未觀察到不良反應。 實例5 Cln3 ^Δ7/8 小鼠模型的其他研究

如實例2中所述，在出生後第1天通過腦室內（ICV）注射對野生型（WT）和 Cln3 ^∆7/8 小鼠給予PBS、scAAV9.p546.CLN3或scAAV9.CB.CLN3基因療法。在該研究中，給小鼠投與5x10 ¹⁰vg/動物（4 μL體積）。

選擇注射方法和時間以針對與CLN3-Batten病患者相關的特定神經元群體。在手術過程中通過低溫對動物進行鎮靜，監測直至完全恢復，並如前所述進行基因分型（參見Morgan等人 PLoS One[公共科學圖書館] 8；以及Laboratory, TJ Protocol 18257: Standard PCR Assay [實驗室TJ方案18257：標準PCR測定]）。

使用GraphPad Prism進行統計分析，細節在圖例中注明。一般而言，採用雙因素ANOVA和適當的事後檢驗，並使用ROUT方法去除異常值，Q=0.1-1%。如果合適，使用非配對t檢驗。 hCLN3轉錄物在腦中的表現和分佈

進行定量PCR以測量治療的小鼠腦中的hCLN3轉錄物。如前所述生成總RNA和cDNA（參見Cain等人 Mol Ther.[分子治療], 2019）。將2^-δ-δ Ct方法用於計算人CLN3轉錄物的相對基因表現，該轉錄物歸一化為 Gapdh（作為管家控制）。 hCLN3正向引物序列：CGCTAGCATCTCATCAGGCCTTG（SEQ ID NO: 11）； hCLN3反向引物序列：AGCATGGACAGCAGGGTCTG（SEQ ID NO: 12）。

如圖16所示，如藉由qPCR測量的，scAAV9.p546.CLN3治療導致24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠大腦皮質和脊髓中hCLN3轉錄物表現水平增加。因此，單次新生兒ICV投與scAAV9.p546.CLN3導致hCLN3持續且靶向性良好的表現。

此外，還進行了RNAscope以檢測治療的小鼠腦中的CLN3轉錄物。對小鼠進行CO ₂安樂死並用PBS灌注心臟。收集腦並將其放置在1 mm矢狀腦塊上。在中線和中線右側3 mm處對腦進行切片。用-50°C異戊烷將3 mm矢狀切片快速冷凍，然後在低溫恒溫器上以16 μm切片並放置在載玻片上。然後根據製造商建議的方案（ACDBio手冊320293和320513）處理載玻片。將切片用人特異性CLN3探針（ACDBio登錄號470241）標記，該探針由CLN3基因區域中的20個雙Z對組成，小鼠和人CLN3之間幾乎沒有同源性（區域631-1711）。將載玻片使用RNAscope Fluorescent Multiplex Kit（ACDBio目錄號320850）使用Amp 4-FL-AltC進行螢光標記，該Amp 4-FL-AltC用550 nm螢光團標記 hCLN3探針，將載玻片用DAPI複染以標記細胞核。使用抗褪色安裝介質（Dako Faramount，安捷倫公司（Agilent）），將組織切片安裝在蓋玻片下的載玻片上。將載玻片在成像前儲存在黑暗中。使用帶有NIS-Elements Advanced Research軟體（v4.20）的Nikon NiE顯微鏡對切片進行成像和分析。

如圖17所示，如藉由RNAscope（紅色螢光）測量的，scAAV9.p546.CLN3治療在達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠的整個腦中產生穩定的hCLN3轉錄物的圖像。定量PCT和RNAscope測定證實了單次新生兒ICV投與scAAV9.p546導致hCLN3持續且靶向性良好的表現。scAAV9.p546.CLN3基因療法增加了達到24個月大時整個腦和脊髓中 hCLN3基因的表現。 經典的Batten病病理學

為了確定投與scAAV9.p546.CLN3是否可以防止 Cln3 ^Δ7/8 小鼠腦中的經典的Batten病病理學，在ICV投與後檢查貯積物質積累（ASM）和神經膠質反應性。野生型和 Cln3 ^Δ7/8 小鼠被CO ₂安樂死，灌流PBS，並且將組織用4% PFA固定。在50 μm（Leica VT10008）的振動切片機上對固定的腦進行切片。將切片用標準免疫螢光和DAB染色方案處理。初級抗體包括抗CD68（AbD Serotec，MCA1957；1:2000）、抗GFAP（Dako，Z0334；1:8000）和抗ATP合酶亞基C（艾博抗公司（Abcam），ab181243，1:1000）。二級抗體包括抗大鼠和抗兔生物素化抗體（載體實驗室（Vector Labs），BA-9400；1:2000）。使用Aperio載玻片掃描顯微鏡在20X下對切片進行成像和分析。從視丘的VPM/VPL和體感皮質的2/3層中提取圖像，並從每隻動物的多個組織中拍攝多張圖像。使用ImageJ中的閾值分析來量化免疫反應性的總面積。

圖18證明scAAV9.p546.CLN3治療防止和減少達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠腦兩個區域的ASM積累。圖19證明scAAV9.p546.CLN3治療通常防止達到24個月大的Cln3 ^Δ7/8 小鼠腦的兩個區域中大量亞基C積累（ASM的成分）。圖20證明scAAV9.p546.CLN3治療通常防止達到24個月大的Cln3 ^Δ7/8 腦的兩個區域中的星狀細胞活化（GFAP+）。圖21證明scAAV9.p546.CLN3治療防止達到24個月大時Cln3 ^Δ7/8 腦的兩個區域中一些小神經膠質細胞活化（CD68+）（取決於時間點）。因此，scAAV9.p546.CLN3防止 Cln3 ^Δ7/8 小鼠腦中經典的Batten病病理學，包括貯積物質積累和膠質反應性。圖22證明scAAV9.CB.CLN3治療在防止6個月和12個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠中各種Batten病的病理方面類似地有效。

此外，用scAAV9.p546.CLN3治療沒有導致任何紅血球（CBC）異常或白血球（WBC）異常，如ICV投與後長達24個月所測量的。圖23提供了以下CBC參數的數據：RBC計數、血紅素、紅血球壓積、平均紅血球體積、平均紅血球血紅素、平均紅血球血紅素濃度、RBC分佈、血小板計數和平均血小板體積。圖24提供了以下WBC參數的數據：WBC計數、淋巴球數百分比、單核細胞百分比、顆粒性白血球百分比。

scAAV9.p546.CLN3基因療法防止Cln3 ^{Δ7/ 8} 小鼠達到24個月大時CLN3-Batten病的許多細胞特徵，包括ASM、亞基C、GFAP和CD68表現。此外，scAAV9.CB.CLN3基因療法防止Cln3 ^Δ7/8 小鼠達到24個月大時CLN3-Batten病的許多細胞特徵，包括ASM、亞基C、GFAP和CD68表現。 實例6 Cln3 ^Δ7/8 小鼠模型中基於性別的組織病理學分析

如實例2中所述，在出生後第1天通過腦室內（ICV）注射對野生型（WT）和Cln3 ^{Δ7/ 8} 小鼠給予PBS、scAAV9.p546.CLN3或scAAV9.CB.CLN3基因療法。在該研究中，給小鼠投與5x10 ¹⁰vg/動物（4 μL體積）。

野生型和 Cln3 ^Δ7/8 小鼠被CO ₂安樂死，灌流PBS，並且將組織用4% PFA固定。在50 μm（Leica VT10008）的振動切片機上對固定的腦進行切片。將切片用標準免疫螢光和DAB染色方案處理。初級抗體包括抗CD68（AbD Serotec，MCA1957；1:2000）和抗ATP合酶亞基C（艾博抗公司，ab181243，1:1000）。二級抗體包括抗大鼠和抗兔生物素化抗體（載體實驗室，BA-9400；1:2000）。使用Aperio載玻片掃描顯微鏡在20X下對切片進行成像和分析。從以下區域提取圖像：海馬的CA2/CA3區域、海馬齒狀迴的多形層、基底外側杏仁核、韁、視丘網狀核、視丘腹後外側/腹後內側核、視丘背內側和中線下區域、梨狀皮質、脾後皮質和體感皮質的2/3層，並從每隻動物身上拍攝多個組織的多個圖像。使用ImageJ中的閾值分析來量化免疫反應性的總面積。

圖25證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月大時在海馬的CA3區域中顯示出不同水平的SubC積累。在12個月大時，治療的雌性Cln3 ^Δ7/8小鼠積累的SubC顯著多於野生型，而治療的雄性小鼠積累的SubC與野生型沒有差異。然而，在分析的任何其他時間點都沒有看到這種差異。

圖26證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在多個時間點在梨狀皮質（PIRC）中顯示出細微的不同水平的SubC積累。在12個月大時，治療的雌性突變型CLN3小鼠比野生型積累了顯著更多的SubC，且AAV治療不防止在PBS突變水平以下的積累，而治療的雄性小鼠的SubC積累與野生型沒有差異。然而，在分析的任何其他時間點沒有看到這種相關性，並且與18個月大時的調查結果不一致，其中治療的雌性小鼠中的SubC積累沒有顯著不同於野生型，並且顯著低於未治療的突變型小鼠。在18個月大時，治療的雄性小鼠體內的SubC積累顯著高於WT水平。

圖27證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在多個時間點在丘腦網狀核（RTN）中顯示出不同水平的SubC積累。在6個月大時，治療的雌性突變型CLN3小鼠積累的SubC顯著多於野生型，而治療的雄性小鼠積累的SubC與野生型沒有差異。在12個月大時，治療的雄性小鼠仍處於野生型水平，而治療的雌性小鼠的SubC顯著高於野生型和未治療的突變型小鼠。雌性的治療的和未治療的突變體之間的這種差異在18個月時不存在，其中SubC顯著高於WT，但顯著低於雄性和雌性未治療的突變體。

圖28證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月時在體感皮質中顯示出不同水平的SubC積累。在12個月大時，與未治療的突變型雌性小鼠相比，用AAV治療並沒有減少SubC的積累，而治療的雄性小鼠中SubC的積累被阻止並且與野生型沒有區別。然而，在分析的任何其他時間點都沒有看到這種差異。

圖29證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月時在視丘的VPM/VPL中顯示出不同水平的SubC積累。在6個月大時，治療的雌性小鼠積累的SubC顯著少於未治療的突變型雌性小鼠，但顯著多於野生型雌性小鼠。這種差異持續了12個月和18個月，在分析的任何時間點野生型和治療的雄性小鼠之間沒有差異。

圖30證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月時在基底外側杏仁核（BLA）中顯示出不同水平的SubC積累。在12個月大時，AAV並不能顯著防止治療的雌性動物體內的SubC積累。在18個月時，治療的雌性小鼠中的SubC積累仍顯著高於野生型，但低於未治療的雌性小鼠。到18個月時，治療的雄性小鼠也開始比野生型有顯著更多的SubC，這與雌性小鼠群體中的情況相似。

圖31證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月和18個月時在齒狀迴（DG）的多形層中顯示出不同水平的SubC積累。在12個月大時，治療的雌性小鼠似乎比野生型雌性小鼠和未治療的突變型雌性小鼠積累了更多的SubC。原始圖像（未顯示）顯示，齒狀迴的多形層周圍有一層變暗的顆粒細胞層，這可能會影響閾值結果。這種變暗僅出現在該組中，並且僅在12個月的時間點出現。雌性小鼠在18個月時也不再出現這種增加。然而，在18個月時，治療的雄性小鼠開始比野生型雄性小鼠有更多的SubC積累。

圖32證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月和18個月時在韁中顯示出不同水平的SubC積累。在12個月大時，治療的雌性小鼠積累的SubC顯著少於未治療的突變型雌性小鼠，但顯著多於野生型雌性小鼠。這種差異也出現在18個月時，在分析的任何時間點野生型和治療的雄性小鼠之間沒有差異。

圖33證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月和18個月時在背內側核中顯示出不同水平的SubC積累。在12個月大時，治療的雌性小鼠積累的SubC顯著少於未治療的突變型雌性小鼠，但顯著多於野生型雌性小鼠。這種差異也出現在18個月時，在分析的任何時間點野生型和治療的雄性小鼠之間沒有差異。

圖34證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在壓後皮質（RSC）中顯示出SubC積累水平沒有差異。在分析的任何時間點，野生型和治療過的雄性小鼠之間沒有差異。

圖35證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在6個月時在體感皮質（S1BF）中顯示出不同水平的活化小神經膠質細胞（CD68 ⁺）。在6個月大時，與野生型和未治療的雌性小鼠相比，治療的雌性小鼠小神經膠質細胞活化增加，治療的雄性小鼠高於野生型但低於未治療的雄性小鼠。在12個月和18個月大時沒有發現性別差異。

圖36證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在視丘的VPM-VPL中顯示出不同水平的小神經膠質細胞活化。在6個月大時，與野生型和未治療的雌性小鼠相比，治療的雌性小鼠小神經膠質細胞活化增加，治療的雄性小鼠高於野生型但低於未治療的雄性小鼠。這種差異也出現在12個月時。在18個月大的雌性群體中也可以看到同樣的情況。然而，在這個時間點，治療的雄性小鼠與野生型沒有顯著差異。

圖37證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在背內側核（MD）中顯示出不同水平的活化小神經膠質細胞（CD68 ⁺）。在6個月大時，與野生型和未治療的雌性小鼠相比，治療的雌性小鼠小神經膠質細胞活化增加，治療的雄性小鼠高於野生型但與未治療的雄性小鼠沒有區別。在12個月和18個月大時，治療的雄性小鼠小神經膠質細胞活化高於野生型而低於未治療的雄性小鼠，而治療似乎對雌性小鼠沒有影響。

圖38證明基於性別，用scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在中線下核（SM）中顯示出不同水平的活化小神經膠質細胞。在6個月大時，與野生型和未治療的雌性小鼠相比，治療的雌性小鼠小神經膠質細胞活化增加，而治療的雄性小鼠與未治療的雄性小鼠沒有顯著差異，兩者都比野生型具有更多的活化。到12個月時，治療似乎對任何性別的小神經膠質細胞活化程度都沒有影響。到18個月時，治療的雄性小鼠小神經膠質細胞活化降低至野生型水平，而治療的雌性小鼠仍保持與未治療的雌性小鼠相同的活化程度。

上述數據表明，scAAV9.p546.CLN3治療的動物在 Cln3 ^Δ7/8 小鼠腦的幾個區域中具有與ATP合酶亞基C積累和CD68 ⁺小神經膠質細胞活化相關的基於性別的不同病理學。基於不同性別的病理差異似乎更具雌性特異性。12個月的時間點係大多數差異最為一致的時間點，許多差異僅在12個月時出現，到18個月時不再出現。 實例7 scAAV9.P546.CLN3在非人靈長類動物中的表現研究

以2.5 × 10 ¹⁰vg scAAV9.P546.CLN3/動物的劑量進行小鼠療效研究（n=5治療的和n=5未治療的）。與未治療的動物相比，治療的動物在防止腦中蠟樣質脂褐質積累方面表現出高效。基於已建立的目標參與，劑量2.5 × 10 ¹⁰vg被確定為最小有效劑量（MED）。

一項非人靈長類動物（食蟹猴）的安全性和生物分佈研究進行了26週。將動物用1 × 10 ¹³、3 × 10 ¹³或6 × 10 ¹³vg/動物的scAAV9.P546.CLN3治療。所有劑量水平均耐受良好，無顯著後遺症。根據研究結果，在食蟹猴中通過腰椎穿刺（LP）或大腦池內（ICM）單次投與後，未觀察到的不良反應水平（NOAEL）被確定6 x 10 ¹³vg/動物，因此可以建立暴露邊際（MOE）。

人類受試者的給藥方案可以根據平均腦質量和腦脊液（CSF）體積的近似值在種類之間進行縮放。幼年至成年小鼠的腦質量約為0.4-0.5 g，食蟹猴非人靈長類動物的腦質量約為70 g，4歲及以上的人類受試者的腦質量約為1200 g（Kandel等人 2000; Rengachary和Ellenbogen 2005; Dekaban和Sadowsky 2000）。到10歲時，人類受試者的腦已經完全發育（約1400 g腦質量），具有成熟的神經元和神經膠質網路（Kandel等人 2000；Rengachary和Ellenbogen 2005；Dekaban和Sadowsky 2000）。類似地，4歲受試者的腦脊液（CSF）體積約為125 mL，而5歲及以上受試者的CSF體積為150 mL，與成人相似。食蟹猴NHP的大約CSF體積為約11-12 mL（SD: 1.1 -1.6）（Kazuhito等人 2014; Ballesteros 2020）。因此，人體劑量可為3 x 10 ¹⁴vg，轉化為3倍的MOE。

綜上所述，物種之間大於10倍的腦質量和CSF體積差異允許推斷最大人體劑量在5到10倍之間，以確保劑量係安全的並且有可能是有效的。表1總結了基於腦質量和CSF體積從小鼠和NHP推斷人類受試者。

表1：劑量方案：從小鼠和NHP推斷人類受試者

小鼠最低有效劑量 (MED) a/ 動物	NHP 毒性研究 b 劑量： vg/ 動物	人體總劑量 (vg) c
2.5 x 10 10vg		1.2 x e 14vg（MED）
	1 x 10 13vg	[(1 x 10 13vg / 70g) x 1200g] = 1.7 x 10 14vg
	3 x 10 13vg	[(3 x 10 13vg / 70g) x 1200g] = 5.1 x 10 14vg
	6 x 10 13vg	[(6 x 10 13vg / 70g) x 1200g] = 1 x 10 15vg

^a投與途徑：ICV； ^B非靈長類研究：投與途徑：LP或ICM； ^c1200 g係指人的腦質量

將6 x 10 ¹³vg/動物的NOAEL與約70 g的腦質量推斷至腦質量約為1200 g的兒童（≥ 4歲），人體總劑量將等於1 x 10 ¹⁵vg。基於此，可以用3 x 10 ¹⁴vg劑量的scAAV9.P546.CLN3治療人類患者。 實例8 青少年神經性類蠟脂褐質病的開放標籤、1/2a期AAV9-CLN3基因轉移臨床試驗

CLN3基因的突變會導致青少年CLN3 Batten病或青少年神經性類蠟脂褐質病（JNCL），這係嚴重的神經退化性疾病，兒童期（4至7歲）發病，導致失明、運動障礙、學習困難、癲癇，最終在20至30歲之間死亡（參見Schulz A等人 Biochimic et Biophysica Acta.2013; 1832 (11):1801-1806）。目前，沒有針對JNCL的療法。因為致病性 CLN3突變主要導致由 CLN3編碼的功能性蛋白的損失或水平降低，有前景的治療方法係經校正的 CLN3基因的基因轉移，其導致功能性蛋白的產生（參見Munroe PB等人 Am J Hum Genet.[美國人類遺傳學雜誌]1997; 61(2):310-316）。

這係一項包括低劑量和高劑量組群的開放標籤、劑量升級、1/2a期研究（圖39）。高劑量群組的給藥時間比低劑量組群晚≥ 6週，以便對低劑量組群進行安全性審查。將scAAV9.P546.CLN3鞘內遞送給患有CLN3-Batten病的人類患者。

安全性評估包括劑量限制毒性、不良事件（AE）、生命徵象、生理和神經系統檢查、血液和尿液實驗室參數、心電圖、免疫學評估和病毒脫落。

採用統一Batten病評定量表（UBDRS）測量疾病進展，並且使用兒科生活質量（PEDSQOL）量表測量治療對生活質量的影響，以及延長存活期的可能性。

UBDRS係專門為監測JNCL的疾病進展而開發的，包括身體、行為、癲癇發作和能力子量表。該研究的主要療效評估係UBDRS生理子量表（表1），其在基線、第30天和第3、6、9、12、18、24、30和36個月進行。結果報告為描述性數據，並且沒有對該分析進行統計分析。

[表1].UBDRS生理子量表

類別	項目	評分
視力	•     視敏度		•     每項評分0-4 0=正常 4=嚴重受損 •     雙側項目分別計分（共28項） •     最高總分=112 •     評分越高指示生理損傷越大
運動	•     步態 •     手叩擊（雙側） •     腳跟踩踏（雙側）	•     後沖拉力測試 •     指鼻辨距不良
睡覺	•     肌陣攣
語音	•     語音清晰度 •     舌頭突出	•     異常的重複語音
張力	•     頸部張力 •     臂部張力（雙側） •     腿部張力（雙側）	•     上肢最大肌張力障礙（雙側） •     手臂力量（雙側） •     腿部力量（雙側）
異常運動	•     闌尾舞蹈病 •     休息性震顫 •     動作性震顫	•     正常的自發運動 •     運動抽動或刻板動作

在實例1所述之cGMP條件下，用於臨床試驗的scAAV由全國兒童醫院臨床製造廠利用HEK293細胞的三重轉染方法生產。將scAAV9.P546.CLN3配製在20 mM Tris（pH8.0）、1 mM MgCl2、200 mM NaCl和0.001%泊洛沙姆188中。

在研究中招募了四個患者，並接受了含有scAAV9.p546.CLN3的配製物的單次注射，其由藉由腰椎穿刺插入棘突間進入腰鞘囊（lumbar thecal sac）的蛛網膜下腔空間的鞘內導管一次性投與。

根據每個患者的定量PCR，第一組群（n=3）接受的一次性基因轉移劑量為6 x 10 ¹³vg總scAAV。每個受試者的招募之間至少有四週的時間，以便審查第30天的基因轉移後安全性數據。在第二組中，由於在注射後一個月對第一組群中的最後一名受試者進行評估後，未發現安全性問題，因此又招募了一或多個受試者。根據每個患者的定量PCR，組群2（n=1）接受1.2 x 10 ¹⁴vg總scAAV的遞增劑量。從第1組群完成到第2組群開始，至少有六週的時間間隔，以便從五個時間點（第1天、第2天、第7天、第14天和第21天）審查安全性分析，以及在給下一名受試者服用前進行DSMB審查。

招募的受試者的人口統計學和基線特徵資訊如表2所示。

[表2].人口統計和基線特徵

劑量	受試者	性別	基因型	種族	招募年齡（月）	症狀發作的年齡（月）	研究中的持續時間（月）
低	1	M	CLN3中的1-kb缺失（純合）	白種人	114	72	20.7
低	2	F	CLN3中的1-kb缺失（純合）	白種人	71	36	15.6
低	3	M	CLN3中的1-kb缺失（純合）	白種人	105	36	16.8
高	4	M	CLN3中的1-kb缺失（純合）	白種人	120	79	8.7

如圖39和表2所示，選擇參與的患者來自≥3至＜11歲，根據基因型診斷為CLN3疾病，在接受治療之前未接受其他治療。 安全性結果

安全性係基於臨床依據並藉由檢查安全性標籤進行評估的。在篩選時；第7、14、21和30天；以及第3、6、9、12、18、24、30和36個月，對患者進行評估。

報告了總共83例治療引起的AE。表3中報告在≥1名患者中發生的AE。大多數AE為輕度或中度，並且與scAAV9.p546.CLN3無關。四例AE被認為與scAAV9.p546.CLN3有關；所有均為在沒有後遺症的情況下消退的肝酶升高。有2例嚴重的AE，其中1例被視為scAAV9.p546.CLN3有關（丙胺酸胺基轉移酶水平升高，3級），並在3個月後在類固醇治療的情況下消退。其他嚴重的AE係2級癲癇發作，被認為與治療無關，而是與疾病有關。

沒有因AE而停藥的情況。無4級或5級（死亡）AE。

[表3].在≥1名患者中發生的不良事件

不良事件（首選術語）	患者， n	事件， n
嘔吐	4	9
頭痛	4	6
噁心	3	3
呼吸系統障礙	2	4
背疼	2	2
咳嗽	2	2
肝酶增加	2	2
皮疹	2	2
竇性心律過緩	2	2

療效結果

將療效數據與青少年CLN3 Batten患者的可用自然史數據進行比較。篩選時，參與者的UBDRS評分≤7並且能夠獨立行走≥50英尺。圖40A-40C提供了使用低劑量載體基因組（6 x 10 ¹³vg）治療的受試者隨時間變化的UBDS生理損傷評分和UBDS能力與實際視力評分。直至第12個月或第15個月，記錄了3名低劑量患者的UBDRS生理損傷評分。圖4D提供了使用高劑量載體基因組（1x10 ¹⁴vg）治療的受試者隨時間變化的UBDS生理損傷評分和UBDS能力與實際視力評分。直至第3個月，對唯一的高劑量患者進行了UBDRS評估。圖41顯示了基於圖40A-40D的中期臨床數據分析。3名低劑量受試者UBDRS生理損傷評分的平均數（SD）年變化率為0.07（3.33）（圖41）。相比之下，82個JNCL患者的病史自然史研究預測每年平均增加2.86點（95% CI: 2.27-3.45）（參見Kwon JM等人 Neurology. [神經學]2011; 77(20): 1801-1807）。樣本量不是通過統計證明確定的。根據對青少年CLN3 Batten患者自然史組群中疾病進展的分析（見Kwon），與未治療的患者的預期增加約8.6分相比，基因轉移的療效預計會導致UBDRS生理子量表在3年內的增加較小。如果後來實施了更高劑量，可採用方差分析或t檢驗來比較低劑量或高劑量對人群的影響。Kaplan-Meier圖可用於分析疾病進展趨勢和生存曲線。

根據病史自然史研究，3名低劑量受試者的UBDRS生理損傷評分的平均數年變化率顯著低於未治療的患者的預期（0.07與2.86），表明疾病穩定的潛在早期跡象。此外，中期臨床試驗結果表明患者對scAAV9.CLN3的耐受性普遍良好。

將在所有患者完成三年研究後評估療效的主要分析。確定療效的基礎將是基於專門針對CLN3-Batten病開發的完善的統一Batten病評定量表（UBDRS）穩定或減少疾病進展。三年研究期結束後，將根據FDA指南每年對患者進行為期5年的監測。 實例9 scAAV9.P546.CLN3基因療法的臨床試驗-II

可設計一項開放標籤、劑量遞增（2組群）研究，以評估包含載體基因組遞送的CLN3基因轉移的配製物在診斷為CLN3-Batten病的受試者中的安全性和潛在療效。與來自自然史組群的未治療的受試者相比，受試者可能≥4歲。載體基因組治療的主要療效可以使用統一Batten病評定量表（UBDRS）生理子量表評分來測量，該評分測量21個項目的疾病進展，包括運動、力量、步態、平衡、言語和視力。在每個類別中，評分範圍從0（被認為正常或無損傷）到4（被認為完全受損或無法發揮作用）。每個受試者的基線UBDRS生理子量表評分可能等於或大於10到小於或等於40。受試者可能能夠獨立行走至少5米或更多。受試者可能沒有心血管疾病、呼吸系統疾病、代謝疾病、脊髓的頸段和腰段部的椎骨解剖畸形、急性和嚴重感染的主要合併症。受試者可能沒有其他形式的batter病和神經退化疾病。受試者過去可能沒有接受過生物和/或非生物研究產品。患者可能對ICM枕下注射和/或腰椎穿刺沒有任何禁忌症。次要結果可評估認知功能（WPPSI-IV、WISC-V、WAIS IV）、神經心理功能（Vineland 3、CBCL、ABCL）、疾病嚴重程度（CLN3SS、腦MRI體積測量）、兒科生活質量（PedsQL、EQ-5D-5L、EQ-5D-Y）和步態（Zeno™ Walkway）從基線到36個月的變化。

可以在所有患者完成三年研究後評估療效的主要分析。確定療效的基礎可為基於專門針對CLN3-Batten病開發的完善的統一Batten病評定量表（UBDRS）穩定或減少疾病進展。可以在載體基因組治療的受試者和自然史組群中未治療的受試者之間比較36個月時UBDRS生理子量表評分下降率的主要療效終點。三年研究期結束後，可根據FDA指南每年對患者進行為期5年的監測。

該載體基因組可包含自身互補型重組腺相關病毒9（scAAV9），其已經被基因修飾以表現人CLN3基因。該載體基因組可能僅包含表現CLN3轉基因所需的最少元素，包括AAV2反向末端重複序列、P546啟動子（MECP2啟動子的截短版本）、人CLN3 cDNA和SV40多A信號。可替代地，載體基因組包含編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的序列，其中scAAV9的基因組以5'到3'順序包含：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸和第二AAV反向末端重複序列。

配製物可包含20 mM Tris（pH 8.0）、1 mM氯化鎂（MgCl ₂）和含有0.005%泊洛沙姆188的200 mM氯化鈉（NaCl）。載體基因組可以在具有0.25 mL配製物的小瓶中提供，標稱濃度為2.0 × 10 ¹³vg/mL至≥ 6.0 × 10 ¹³vg/mL。可替代地，載體基因組可以在具有0.25 mL配製物的小瓶中提供，標稱濃度為≥ 6.0 × 10 ¹³vg/mL。

該研究可以包括藉由小腦延髓池內（ICM）枕下注射向參與者單次投與在5 mL配製物中的3.0 x 10 ¹⁴載體基因組（vg）的一次性注射。

由載體基因組介導的基因轉移可以為細胞提供校正的CLN3基因，從而產生功能性CLN3蛋白並防止蠟樣質脂褐質和三磷酸腺苷（ATP）合酶亞基C在整個CNS中的異常積累。這也可以減少異常的星狀細胞和神經膠質細胞活化，並且可以減輕疾病的神經和軀體表現。

在用載體基因組治療前一天，可以每天以1 mg/kg體重至2 mg/kg體重向受試者投與全身性皮質類固醇，總共30天。可替代地，在用載體基因組治療前一天，可以以每天10 mg至20 mg的劑量向受試者投與全身性皮質類固醇，總共30天。可替代地，在用載體基因組治療前一天，可以以每天1 mg/kg體重向受試者投與全身性皮質類固醇，總共30天。

在可行的情況下，受試者的疫苗接種時間表以適應載體基因組注射之前和之後同時投與的糖皮質激素。某些疫苗，如MMR和水痘，可能禁用於具有顯著免疫抑制性糖皮質激素劑量的受試者（即每天接受20 mg或2 mg/kg體重的普賴鬆或等效藥物≥ 2週）。可能不排除季節性呼吸道融合細胞（RSV）預防。

載體基因組投與可能會升高轉胺酶，這可能很嚴重。具體而言，預先患有肝損傷或急性肝病毒感染的受試者可能處於肝損傷的較高風險中。藉由臨床檢查和實驗室檢測（AST、ALT、總膽紅素、凝血酶原時間），可以在基線和30天全身性皮質類固醇治療結束時進行肝功能測試。第一個月每週進行一次肝功能檢查，第二個月和第三個月每隔一週進行一次肝功能檢查，直到結果不顯著（臨床檢查正常，總膽紅素和凝血酶原結果，以及ALT和AST水平低於2 × ULN）。血小板計數血液測試也可以在基線進行，然後在第一個月每週進行一次，然後在第二個月和第三個月每隔一週進行一次，直到血小板計數恢復到基線。

含有載體基因組的小瓶可能是略微不透明、無色至淡白色的溶液。小瓶可儲存在≤ -60°C的冰箱中直至使用。可以將小瓶解凍30分鐘以達到室溫。在注入之前，可以檢查小瓶的顆粒物質和/或變色。

在投與載體基因組之前，可對受試者視需要投與脊髓造影劑，用於CT掃描輔助的小腦延髓池內（ICM）枕下遞送載體基因組。脊髓造影劑可包括非離子低滲造影劑。脊髓造影劑可不包括非離子低滲造影劑。可以將受試者置於側臥位並在標準護理下進行全身麻醉。脊髓穿刺針可經皮插入脊柱L3-L5之間的蛛網膜下腔。大約5 mL的CSF可以被抽取到帶有螺旋蓋的聚丙烯管中。提取的CSF可能不會被退回。使用脊髓穿刺針，可以將脊髓造影劑注入蛛網膜下腔。可通過圖像引導的外側或中線經皮枕下注射（C1頸椎後脊柱弓上方），將脊髓穿刺針插入小腦延髓池，直到獲得5 mL透明CSF。載體基因組可以通過脊髓穿刺針被遞送至小腦延髓池內（ICM）枕下區域。載體基因組可以以大約每1分鐘1 mL的速率被遞送至小腦延髓池內（ICM）枕下區域。

某些抗精神病藥物可能被禁止與成像造影劑一起使用。可以考慮至少提前48小時停用包括啡噻𠯤在內的抗精神病藥物（例如，氯丙𠯤、丙氯拉𠯤和異丙𠯤）。

如果受試者在治療前或治療期間自然暴露後產生抗AAV9抗體，則受試者可能對治療有不同的反應。抗體形成的檢測可能高度依賴於測定的靈敏度和特異性。此外，測定中抗體（包括中和抗體）陽性的發生率可能受多種因素影響，包括測定方法、樣本處理、樣本採集時間、伴隨藥物和潛在疾病。因此，可以藉由ELISA和IFN-γ分泌評估受試者的總抗AAV9和抗CLN3抗體。可以藉由ELISpot測量T細胞對AAV9和CLN3肽的反應。可在第-30天至第-2天（篩選/基線）進行免疫原性評估，在第7、14、21和30天進行後續現場跟蹤（跟蹤3至6）以及在第6、9、12、18和24個月進行後續現場跟蹤（跟蹤7至10、跟蹤12和跟蹤14）。

投與後，可以監測受試者新的或惡化的心臟異常，該等異常可能指示結構或功能的變化，包括但不限於心律不整，如心跳過速或心跳過慢、心房腔失調症候群、左心室肥大和傳導異常。

可以在多個時間點研究ICM注射載體基因組後的載體脫落。具體而言，可以在基線、ICM投與後的第二天（第1天）、第3天、第7天、每週至第30天、每月至第6個月以及此後每3個月收集血液、唾液、尿液和糞便的樣本。當至少連續3個陰性樣本顯示陰性結果時，可以停止樣本採集和測試。

受試者可能不會被同時給予免疫調節治療以治療急性（如急性呼吸道感染或急性肝炎）或不受控制的慢性（如慢性活動性B型肝炎）的活動性感染。

雖然在本文已經顯示和描述了本發明之較佳的實施方式，但對於熟悉該項技術者而言將明顯的是，此類實施方式僅藉由舉例的方式來提供。在不背離本發明的情況下，熟悉該項技術者現在將想到許多變化、改變和替換。應當理解的是，可以採用本文所述之實施方式的各種替代方案。意圖在於，以下請求項限定本發明之範圍，並且由此覆蓋該等請求項及其等同物範圍內的方法和結構。

將本申請中提及的所有文件均藉由引用以其全文併入本文。

無

[圖1]提供了（圖1A）scAAV9.P546.CLN3基因盒和（圖1B）用於產生scAAV9.P546.CLN3的質體構建體pAAV.P546.CLN3.KAN之示意圖。在P546啟動子的控制下，將人CLN3 cDNA插入源自AAV2的反向末端重複序列（ITR）結構之間。SV40內含子（人CLN3 cDNA的上游）和牛生長激素多腺苷酸化（BGH多A）終止子序列（人CLN3 cDNA的下游）有助於mRNA加工和增強轉基因表現。質體構建體pAAV.P546.CLN3.KAN的序列示於SEQ ID NO: 5。基因組被包裝在AAV9殼體蛋白中；

[ 圖 2]提供了顯示注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^Δex7/8小鼠中存在人CLN3轉錄物之圖像；

[ 圖 3]提供了顯示注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^Δex7/8小鼠在注射後2個月ASM積累的早期減少之圖。所示的所有圖表上的y軸代表ASM積累的總面積。黑條代表野生型小鼠（WT-PBS），淺灰色條代表注射PBS的CLN3 ^Δex7/8小鼠，並且深灰色小鼠代表注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^Δex7/8小鼠；

[ 圖 4]提供了注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^Δex7/8小鼠之圖表，其顯示在注射後4個月和6個月，在各個腦區的ASM積累大大減少：在注射PBS的野生型小鼠（「WT」）、注射PBS的CLN3 ^Δex7/8（「CLN3」）和注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^Δex7/8（「CLN3-AAV」）中，A=運動皮質，B=體感皮質，C=視覺皮質，D=視丘，E=後腦，F=小腦和G=脊髓；

[ 圖 5]提供的圖像和圖表證明了scAAV9.P546.CLN3的ICV投與減少了4個月和6個月大的CLN3 ^Δex7/8小鼠的腦中粒線體蛋白ATP合酶亞基C的異常溶酶體積累。頂部分圖提供了在6個月時間點對ATP合酶亞基C染色並用DAB染色視覺化的冷凍組織切片之代表性圖像。下部分圖中的圖表提供了在注射PBS的WT（「WT」）、注射PBS的CLN3 ^Δex7/8（「CLN3」）和注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^Δex7/8（「CLN3-AAV」）小鼠中注射後4個月（4M）和6個月（6M）的體感桶場皮質1區（somatosensory 1 barrel field of the cortex，S1BF）以及注射後4個月和6個月的腹後內側/腹後外側核（VPM/VPL）的亞基C積累的定量。N = 5，未治療的CLN3 ^Δex7/8和scAAV9.P546.CLN3治療的動物以及野生型動物之間的p≤0.0001。注射後4個月和6個月的SIBF中野生型和治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠之間的p≤0.5；

[ 圖 6]提供了ICV投與scAAV9.P546.CLN3減少了4個月和6個月大的CLN3 ^Δex7/8小鼠腦中的星形細胞增生之圖像和圖表。頂部：針對GFAP染色（作為活化星狀細胞的標記）並用DAB染色視覺化的固定組織切片之代表性圖像（6個月時間點）。底部：注射PBS的WT（「WT」）、注射PBS的CLN3 ^Δex7/8（「CLN3」）和注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^Δex7/8（「CLN3-AAV」）小鼠中注射後4個月和6個月的GFAP陽性面積的定量。每組和每個時間點N = 5。S1BF = 桶場皮質。VPM/VPL = 腹後內側/腹後外側核；

[ 圖 7]提供了ICV投與scAAV9.P546.hCLN3減少了4個月和6個月大的CLN3 ^Δex7/8小鼠腦中的小神經膠質細胞活化之圖像和圖表。頂部：針對CD68染色（作為活化小神經膠質細胞的標記）並用DAB染色視覺化的固定組織切片之代表性圖像（6個月）。底部：注射PBS的WT（「WT」）、注射PBS的CLN3 ^∆ex7/8（「CLN3」）和注射scAAV9.P546.CLN3的CLN3 ^∆ex7/8（「CLN3-AAV」）小鼠中注射後4個月和6個月的CD68陽性面積的定量。每組和每個時間點N = 5。S1BF = 桶場皮質。VPM/VPL = 腹後內側/腹後外側核；

[ 圖 8]提供了顯示在注射後長達18個月，野生型和PBS或治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠的轉棒分析之圖像。兩種性別的所有小鼠（頂部圖）、僅雄性（中部圖）、僅雌性（底部圖）；

[ 圖 9]提供了顯示野生型和PBS或scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^Δex78小鼠在達到18個月大時的莫氏水迷津性能之圖表。所有小鼠（頂部圖）、僅雄性（中部圖）、僅雌性（底部圖）；

[ 圖 10]提供了顯示scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠和PBS治療的小鼠在爬桿測定中的性能之圖表。爬桿測定中，將小鼠面朝上放在立桿上，隨著跌落次數的增加，它們轉身和下降的時間測量平衡和敏捷性。所有小鼠（頂部圖）、僅雄性（中部圖）、僅雌性（底部圖）；

[ 圖 11]提供了顯示與PBS治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠相比，scAAV9.P546.CLN3治療的CLN3 ^Δex7/8小鼠從立桿上跌落的次數較少之圖表。將小鼠面朝上放在立桿上，並測量試圖轉身時跌落的次數，以度量平衡和敏捷性。所有小鼠（頂部圖）、僅雄性（中部圖）、僅雌性（底部圖）；

[ 圖 12]提供了顯示注射scAAV9.P546.GFP三週後在不同腦區以及小鼠周圍組織中對GFP蛋白進行免疫螢光西方墨點法檢測之圖；

[ 圖 13]提供了顯示在腰椎鞘內注射3 x 10 ¹³vg scAAV9.P546.CLN3 12週後在四歲食蟹猴不同腦區中人CLN3表現的反轉錄定量PCR之圖表。相對於腰段脊髓4-7中的CLN3蛋白的水平，將該等值歸一化；

[圖14]提供了scAAV9.P546.CLN3基因盒的核酸序列（SEQ ID NO: 4）。AAV2 ITR核酸序列為斜體（5’ITR如SEQ ID NO: 6所示，並且3’ITR如SEQ ID NO: 9所示），P546啟動子核酸序列（SEQ ID NO: 3）用單線底線，SV40內含子核酸序列（SEQ ID NO: 7）用雙線底線，人CLN3 cDNA序列（SEQ ID NO: 2）的核酸序列用粗體表示，BGH多A終止子（SEQ ID NO: 8）的核酸序列用虛線底線；

[圖15]提供了全長scAAV.P546.CLN3（SEQ ID NO: 5）的核酸序列；

[ 圖 16]提供的數據證明了如藉由qPCR測量的，scAAV9.p546.CLN3治療導致達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠大腦皮質和脊髓中hCLN3轉錄物表現水平增加。平均值 ± SEM，每個月的普通單因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[ 圖 17]提供了顯示如藉由RNAscope（紅色螢光）測量的，scAAV9.p546.CLN3治療在達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠的整個腦中產生穩定的hCLN3轉錄物之圖像。以20X拍攝的圖像；

[ 圖 18]提供的數據證明scAAV9.p546.CLN3治療防止和減少達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠腦兩個區域的ASM積累。平均值 ± SEM，每個月的普通單因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍攝的圖像；

[ 圖 19]提供的數據證明scAAV9.p546.CLN3治療防止達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠腦的兩個區域中大量亞基C積累（ASM的成分）。平均值 ± SEM，每個月的普通單因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍攝的圖像；

[ 圖 20]提供的數據證明scAAV9.p546.CLN3治療防止達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 腦兩個區域中星狀細胞活化（GFAP ⁺）。平均值 ± SEM，每個月的普通單因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍攝的圖像；

[ 圖 21]提供的數據證明scAAV9.p546.CLN3治療防止達到24個月大時 Cln3 ^Δ7/8 腦的兩個區域中一些小神經膠質細胞活化（CD68 ⁺）（取決於時間點）。平均值 ± SEM，每個月的普通單因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。以20X拍攝的圖像；

[ 圖 22]提供的數據證明scAAV9.CB.CLN3治療在防止6個月和12個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠中各種Batten病的病理方面類似地有效。平均值 ± SEM，普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[ 圖 23]提供的數據證明測量到達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 沒有紅血球異常。平均值 ± SEM，普通雙因素ANOVA；

[ 圖 24]提供的數據證明測量到達到24個月大的 Cln3 ^Δ7/8 小鼠沒有白血球異常。平均值 ± SEM，普通雙因素ANOVA；

[圖25]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3治療的小鼠在12個月大時在海馬的CA3區域中顯示出不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖26]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在多個時間點在梨狀皮質（PIRC）中顯示出細微的不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖27]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在多個時間點在丘腦網狀核（RTN）中顯示出不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖28]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在12個月時在體感皮質中顯示出不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖29]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在12個月時在視丘的VPM/VPL中顯示出不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖30]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在12個月時在基底外側杏仁核（BLA）中顯示出不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖31]提供了基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在12個月和18個月時在齒狀迴（DG）的多形層中顯示出不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖32]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在12個月和18個月時在韁（Hab）中顯示出不同水平的SubC積累。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖33]提供了證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在12個月和18個月時在背內側核（MD）中顯示出不同水平的SubC積累的數據。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖34]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在壓後皮質（RSC）中顯示出SubC積累水平沒有差異。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[ 圖 35]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在6個月時在體感皮質（SlBF）中顯示出不同水平的活化小神經膠質細胞（CD68 ⁺）。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[ 圖 36]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在視丘的VPM-VPL中顯示出不同水平的小神經膠質細胞（CD68 ⁺）活化。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[ 圖 37]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在背內側核（MD）中顯示出不同水平的活化小神經膠質細胞（CD68 ⁺）。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[ 圖 38]證明基於性別，scAAV9.p546.CLN3小鼠在中線下核（Submedial Nucleus，SM）中顯示出不同水平的活化小神經膠質細胞（CD68 ⁺）。平均值 ± SEM，採用Tukey事後檢驗的普通雙因素ANOVA，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001；

[圖39]顯示了包括低劑量和高劑量CLN3患者組群的開放標籤、劑量升級、1/2a期研究的研究設計。

[圖40A-40D]提供了隨時間變化的UBDS生理損傷評分和UBDS能力與實際視力評分；並且

[圖41]顯示三種低劑量受試者中UBDRS生理損傷評分的平均數（SD）年變化率為0.07（3.33）。相比之下，82個JNCL患者的病史自然史研究預測每年平均增加2.86分（95% CI: 2.27-3.45）。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (26)

1. 一種治療受試者的CLN3-Batten病之方法，該方法包括向該受試者投與治療有效量的組成物，該組成物包含編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的自身互補型重組腺相關病毒9（scAAV9），其中該scAAV9基因組以5'到3'順序包括：包含SEQ ID NO: 3的核苷酸序列的P546啟動子和編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸。
2. 如請求項1所述之方法，其中該scAAV9基因組進一步包含反向末端重複序列，該反向末端重複序列以5'到3'順序如下定位：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸和第二AAV反向末端重複序列。
3. 如請求項1至2所述之方法，其中該scAAV9基因組進一步包含SV40內含子，該SV40內含子以5'到3'順序如下定位：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、SV40內含子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸和第二AAV反向末端重複序列。
4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中該scAAV9基因組進一步包含牛生長激素多腺苷酸化多A序列，該牛生長激素多腺苷酸化多A序列以5'到3'順序如下定位：第一AAV反向末端重複序列、包含SEQ ID NO: 3的序列的P546啟動子、編碼SEQ ID NO: 1的CLN3多肽的多核苷酸、牛生長激素多腺苷酸化多A序列和第二AAV反向末端重複序列。
5. 如請求項1至4中任一項所述之方法，其中該scAAV9基因組包含與SEQ ID NO: 4至少90%相同的多核苷酸序列。
6. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中該編碼CLN3多肽的多核苷酸與SEQ ID NO: 2至少90%相同。
7. 如請求項1至6中任一項所述之方法，其中該組成物的治療有效量能夠逆轉疾病進展。
8. 如請求項7所述之方法，其中能夠逆轉該疾病進展的該組成物的治療有效量係足以緩和、減輕、穩定、逆轉或減緩該疾病的進展、減輕副作用或以其他方式減少該疾病的病理或表型後果的該組成物的量。
9. 如請求項1至8中任一項所述之方法，其中該組成物的治療有效量能夠滿足以下中的一或多項： (a) 減少或減緩自發螢光貯積物質的溶酶體積累， (b) 減少或減緩ATP合酶亞基C的溶酶體積累， (c) 減少或減緩神經膠質細胞活化（星狀細胞和/或小神經膠質細胞活化）， (d) 減少或減緩星形細胞增生， (e) 減少或減緩MRI測量的腦容量損失， (f) 減少或減緩癲癇發作，以及 (g) UBDRS評估量表中一或多項的穩定、進展減少或延遲、或改善，其中該減少、穩定或改善係與投與該組成物之前的該受試者或未治療的CLN3-Batten病患者進行比較。
10. 如請求項1至9中任一項所述之方法，其中該組成物的治療有效量在約1 x 10 ¹²至約1 x 10 ¹⁵vg、約6 x 10 ¹³至約4 x 10 ¹⁴vg、約1.2 x 10 ¹⁴至約4 x 10 ¹⁴或約2 x 10 ¹⁴至約4 x 10 ¹⁴vg的該scAAV9基因組之範圍內。
11. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中該組成物的治療有效量係約3 x 10 ¹³vg或約6 x 10 ¹³vg的該scAAV9基因組。
12. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中該組成物的治療有效量係約2x10 ¹⁴vg至約4x10 ¹⁴vg的該scAAV9基因組。
13. 如請求項11所述之方法，其中該組成物的治療有效量係約3x10 ¹⁴vg的該scAAV9基因組。
14. 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中該組成物通過選自由鞘內、腦池內、腰椎穿刺、顱內、腦室內、實質內、靜脈內及其組合組成之群組的途徑投與。
15. 如請求項1至14中任一項所述之方法，其中將該組成物遞送至腦或脊髓，遞送至腦或脊髓包括遞送至腦幹、小腦、視覺皮質、運動皮質、神經細胞、神經膠質細胞、下運動神經元、小神經膠質細胞、寡樹突細胞、星狀細胞、施旺氏細胞或其組合。
16. 如請求項1至15中任一項所述之方法，其中該組成物不包含非離子低滲造影劑。
17. 如請求項1至15中任一項所述之方法，其中該組成物包含非離子低滲造影劑。
18. 如請求項17所述之方法，其中該非離子低滲造影劑選自由碘比醇、碘苯六醇、碘美普爾、碘巴美度、碘噴托、碘普羅胺、碘佛醇、碘昔蘭及其組合組成之群組。
19. 如請求項1至18中任一項所述之方法，其中該鞘內途徑包括小腦延髓池內（ICM）途徑。
20. 如請求項1至19中任一項所述之方法，其中藉由在遞送給該受試者之前將該scAAV9基因組與該造影劑混合來形成該組成物。
21. 如請求項20所述之方法，其中順序遞送該scAAV9基因組和該造影劑。
22. 如請求項1至21中任一項所述之方法，該方法進一步包括在投與該scAAV9基因組後，將該受試者置於特倫德倫伯格臥位。
23. 如請求項1至22中任一項所述之方法，其中該方法進一步包括向該受試者投與脊髓造影劑以用於CT掃描輔助的小腦延髓池內（ICM）枕下投與。
24. 如請求項23所述之方法，其中該脊髓造影劑不包含非離子低滲造影劑。
25. 如請求項1至24中任一項所述之方法，其中該治療導致以下中一或多項的穩定、進展減少、或改善：UBDRS子量表評分、認知功能、神經心理功能、疾病嚴重程度、兒科生活質量和步態。
26. 如請求項1至25中任一項所述之方法，該受試者的UBDRS生理損傷評分的平均數年變化率小於未治療的受試者的情況。

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