RU2796274C2

RU2796274C2 - Вирусные векторы на основе aav и пути их применения

Info

Publication number: RU2796274C2
Application number: RU2021118669A
Authority: RU
Inventors: Джеймс Майкл ХАТФИЛД; Роберт Эмиль ХОДЖ; Дуглас ФЕЛТНЕР; Джозеф БАЛЛЕЙДАЙЕР; Мэттью МЕРИДЖОЛИ; Брайан К. КАСПАР; Аллан Арман КАСПАР
Original assignee: Новартис Аг
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2023-05-22

Abstract

Группа изобретений относится к композиции и применению вирусных частиц, а именно к композиции, содержащей вирусные векторы на основе AAV9, и способу её применения для лечения пациентов со спинальной мышечной атрофией (SMA). Способ лечения спинальной мышечной атрофии (SMA) у пациента-человека включает интратекальное введение вирусного вектора на основе AAV9, содержащего полинуклеотид, кодирующий белок фактора выживания мотонейронов (SMN). Фармацевтическая композиция для интратекального введения для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA) содержит вирусный вектор на основе AAV9, содержащий модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16S SV40, полинуклеотид, кодирующий белок фактора выживания мотонейронов (SMN), сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2. Осуществление группы изобретений обеспечивает улучшенное лечение SMA, включая SMA II и III типа, приводя к более легкому течению прогрессирования заболевания, прекращению прогрессирования заболевания и/или улучшению функционального развития. 3 н. и 38 з.п. ф-лы, 13 ил., 16 табл., 3 пр.

Description

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 62/773894, поданной 30 ноября 2018 года, и предварительной заявке на патент США № 62/835242, поданной 17 апреля 2019 года. Содержание данных заявок включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[2] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 12 ноября 2019 года, имеет название 14452_0025-00304_SL.txt, и ее размер составляет 14833 байт.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[3] Настоящее изобретение относится к композициям и путям применения вирусных частиц.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[4] Аденоассоциированный вирус (AAV) является представителем семейства Parvoviridae. Геном AAV содержит линейную однонитевую молекулу ДНК длиной примерно 4,7 тысячи оснований (т. о.), имеющую две главные открытые рамки считывания, кодирующие неструктурный Rep (репликационный) и структурный Cap (капсидный) белки. Кодирующие области AAV фланкируют две цис-действующие последовательности инвертированных концевых повторов (ITR), длиной примерно 145 нуклеотидов, с прерванными палиндромными последовательностями, которые могут складываться в шпилечные структуры, которые функционируют в качестве праймеров во время инициации репликации ДНК. В дополнение к их роли в репликации ДНК, как было показано, последовательности ITR выполняют роль в интеграции вируса, высвобождении из генома хозяина и инкапсидации вирусной нуклеиновой кислоты в зрелые вирионы (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).

[5] Существует несколько серотипов AAV, которые характеризуются тропизмом к различным тканям. Известные серотипы включают, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 и AAV11. AAV9 описан в патенте США № 7198951 и в Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004), которые настоящим включены посредством ссылки во всей своей полноте. Достижения в доставке AAV6 и AAV8 сделали возможной трансдукцию с помощью этих серотипов скелетных и сердечных мышц после простых системных внутривенных или внутрибрюшинных инъекций. См. Pacak et al., Circ. Res., 99(4): 3-9 (2006) и Wang et al., Nature Biotech. 23(3): 321-8 (2005). И все же использование AAV для нацеливания на типы клеток в пределах центральной нервной системе требовало хирургической интрапаренхимальной инъекции. См. Kaplitt et al., "Safety and tolerability of gene therapy with an adeno-associated virus (AAV) borne GAD gene for Parkinson's disease: an open label, phase I trial." Lancet, 369:2097-2105; Marks et al., "Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson's disease: a double-blind, randomized, controlled trial." Lancet Neurol 9:1164-1172; и Worgall et al., "Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2 adeno-associated virus expressing CLN2 cDNA." Hum Gene Ther, 19(5):463-74.

[6] Нуклеотидная последовательность генома AAV серотипа 2 (AAV2) представлена в Srivastava et al., J Virol, 45: 555-564 (1983), с исправлениями согласно Ruffing et al., J Gen Virol, 75: 3385-3392 (1994). В пределах ITR содержатся цис-действующие последовательности, управляющие репликацией (rep) вирусной ДНК, инкапсидацией/упаковкой и интеграцией в хромосому клетки-хозяина. Три промотора AAV (названные p5, p19 и p40 за их относительные местоположения на карте) управляют экспрессией двух внутренних открытых рамок считывания AAV, кодирующих гены rep и cap. Два промотора rep (p5 и p19) в сочетании с дифференциальным сплайсингом единственного интрона AAV (по нуклеотидам 2107 и 2227) приводят к образованию четырех белков rep (rep 78, rep 68, rep 52 и rep 40) на основе гена rep. Белки rep обладают свойствами нескольких ферментов, которые, в конечном итоге, ответственны за репликацию вирусного генома. Ген cap экспрессируется за счет промотора p40 и кодирует три капсидных белка VP1, VP2 и VP3. Получение трех родственных капсидных белков обусловлено альтернативным сплайсингом и неконсенсусными сайтами начала трансляции. Единственный консенсусный сайт полиаденилирования расположен в положении 95 на карте генома AAV. Обзор жизненного цикла и генетики AAV приведен в Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[7] Векторы, полученные из AAV, особенно привлекательны для доставки генетического материала, поскольку: (i) они способны инфицировать (трансдуцировать) широкий спектр неделящихся и делящихся типов клеток, включая мышечные волокна и нейроны; (ii) они лишены структурных генов вируса, за счет чего устраняются естественные ответы клетки-хозяина на вирусную инфекцию, например опосредованные интерфероном ответы; (iii) вирусы дикого типа никогда не были ассоциированы с какой-либо патологией у людей; (iv) в отличие от AAV дикого типа, которые способны интегрироваться в геном клетки-хозяина, дефектные по репликации векторы AAV обычно персистируют в виде эписом, тем самым ограничивая риск инсерционного мутагенеза или активации онкогенов; и (v) в отличие от других векторных систем, векторы на основе AAV не запускают выраженный иммунный ответ (см. ii), тем самым обеспечивая долгосрочную экспрессию терапевтических трансгенов (при условии, что продукты их генов не отторгаются).

[8] Самокомплементарные аденоассоциированные векторы (scAAV) представляют собой вирусные векторы, сконструированные из встречающегося в природе аденоассоциированного вируса (AAV) для использования в генной терапии. ScAAV называют "самокомплементарным" в связи с тем, что его кодирующая область была сконструирована для образования внутримолекулярной двухнитевой ДНК-матрицы. Ограничивающим скорость этапом для стандартного жизненного цикла генома AAV является синтез второй цепи, поскольку типичный геном AAV представляет собой однонитевую ДНК-матрицу. Однако это не относится к геномам scAAV. После инфицирования вместо ожидания клеточно-опосредованного синтеза второй нити, две комплементарные половины scAAV будут ассоциировать с образованием одного блока двухнитевой ДНК (dsDNA), который готов к немедленной репликации и транскрипции.

[9] Спинальная мышечная атрофия (SMA) представляет собой нейрогенетическое заболевание, вызванное утратой или мутацией гена фактора выживания мотонейронов 1 (SMN1) на хромосоме 5q13, что приводит к снижению уровней белка SMN и селективной дисфункции моторных нейронов. SMA представляет собой аутосомно-рецессивное заболевание раннего детства с частотой случаев 1: 10000 живорождений. Sugarman et al., "Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of >72400 specimens." European journal of human genetics, 20(1): 27-32. Все формы SMA наследуются по аутосомно-рецессивному типу и вызываются делециями или мутациями гена фактора выживания мотонейронов 1 (SMN1). У человека также имеется вторая почти идентичная копия гена SMN1, называемая SMN2. Оба гена SMN1 и SMN2 экспрессируют белок SMN, однако количество функционального полноразмерного белка, продуцируемого за счет SMN2, намного меньше (на 10-15%), чем количество такового, продуцируемого за счет SMN1. Хотя SMN2 не может полностью компенсировать утрату гена SMN1, пациенты с более легкими формами SMA обычно имеют большее число копий SMN2. Согласно большому раннему исследованию Feldkotter et al. 2 копии SMN2 были на 97% прогностическими для развития SMA I типа, 3 копии SMN2 были на 83% прогностическими для развития SMA II типа, а 4 копии SMN2 были на 84% прогностическими в отношении SMA III типа. Feldkotter et al., "Quantitative analyses of SMN1 and SMN2 based on real-time lightCycler PCR: fast and highly reliable carrier testing and prediction of severity of spinal muscular atrophy." American Journal of Human Genetics, 70(2): 358-368. Поскольку это процентное содержание не отражает возможное влияние мутаций-модификаторов, они могут занижать взаимосвязь между числом копий (в отсутствие генетического модификатора) и клиническим фенотипом. Среди 113 пациентов со SMA I типа 9 пациентов с одной копией SMN2 пережили <11 месяцев, 88/94 с двумя копиями SMN2 пережили <21 месяца, а 8/10 с тремя копиями SMN2 пережили 33-66 месяцев.

[10] SMA I типа является основной причиной младенческой смертности вследствие генетических заболеваний. Тяжесть заболевания и клинический прогноз зависят от числа копий SMN2. При наиболее распространенной и тяжелой форме (I тип) гипотония и прогрессирующая слабость распознаются в первые несколько месяцев жизни, что приводит к постановке диагноза к 6-месячному возрасту, а затем к смерти вследствие дыхательной недостаточности к двум годам. SMA I типа является основной генетической причиной младенческой смертности. Утрата мотонейронов при SMA I типа выражена в раннем постнатальном периоде (или может даже начаться в пренатальном периоде), и пациенты никогда не приобретают возможность самостоятельного сидения. Пациенты со SMA I типа, как правило, имеют 1 или 2 копии гена SMN2. В отличие от этого SMA II типа манифестирует в течение первых 18 месяцев, и дети, страдающие этим состоянием, могут сидеть без посторонней помощи, но никогда не ходят самостоятельно. Пациенты со SMA II типа, как правило, имеют 3 копии гена SMN2. Пациенты со SMA III типа приобретают возможность ходить без посторонней помощи. В категории III типа у пациентов с IIIa типом заболевание обычно начинается в возрасте <3 лет, в то время как у пациентов с IIIb типом заболевание начинается после 3 лет. Мотонейроны у пациентов со SMA II и III типа, по-видимому, адаптируются и компенсируются в процессе развития и сохраняются во взрослой жизни. Пациенты со SMA III типа, как правило, имеют 3 или 4 копии гена SMN2. Результаты различных нейрофизиологических исследований и исследований на животных показали раннюю утрату мотонейронов в эмбриональном и раннем постнатальном периодах. Swoboda et al., "Natural history of denervation in SMA: relation to age, SMN2 copy number, and function." Annals of neurology 57(5): 704-12; Le et al., "Temporal requirement for high SMN expression in SMA mice." Human molecular genetics, 20(18): 3578-91; Farrar et al., "Corticomotoneuronal integrity and adaptation in spinal muscular atrophy." Archives of neurology, 69(4): 467-73.

[11] Пациенты со SMA II и III типа характеризуются относительно стабильным клиническим течением. Кроме того, исследования показывают, что отличия исходов связаны с числом копий SMN2, которые позволяют мотонейронам адаптироваться и компенсироваться в ходе роста ребенка и сохраняться во взрослой жизни. Это отличает их от SMA I типа, при которой утрата мотонейронов выражена в раннем постнатальном периоде (или может даже начаться в пренатальном периоде, особенно у пациентов со SMA I типа, у которых заболевание проявляется в первые три месяца жизни). Было показано, что сверхэкспрессия SMN хорошо переносится как мышами, так и приматами, отличными от человека, а большое число копий SMN2 у человека не представляет риск (как видно у пациентов со SMA II, III и IV типа с большим числом копий SMN2). Вариантом терапии является повышение уровней SMN у пациентов со SMA, например SMA II и III типа.

[12] До сих пор усилия по разработке терапевтических средств для лечения SMA, например SMA II и III типа, были сосредоточены в первую очередь на способности низкомолекулярных соединений повышать уровни SMN. К ним относятся ингибиторы деацетилазы, такие как вальпроевая кислота, бутират натрия, фенилбутират и трихостатин А. Данные средства активируют промотор SMN2, что приводит к повышению уровня полноразмерного белка SMN на животных моделях SMA, с целью модификации фенотипа заболевания в сторону более легких симптомов, наблюдаемых у пациентов со SMA III типа. Riessland et al., "SAHA ameliorates the SMA phenotype in two mouse models for spinal muscular atrophy." Human molecular genetics, 19(8): 1492-506; Dayangac-Erden et al., "Carboxylic acid derivatives of histone deacetylase inhibitors induce full length SMN2 transcripts: a promising target for spinal muscular atrophy therapeutics." Arch Med Sci, 7(2): 230-4 2011.

[13] Клинические испытания с использованием некоторых из данных средств, в частности фенилбутирата, вальпроевой кислоты и гидроксимочевины, не привели к надлежащему клиническому эффекту. Darbar et al., "Evaluation of muscle strength and motor abilities in children with Type II and III spinal muscle atrophy treated with valproic acid." BMC Neurol, 11: 36; www.ClinicalTrials.gov. FDA недавно одобрило нусинерсен, лекарственное средство, представляющее собой антисмысловой олигонуклеотид (ASO), сконструированное для увеличения продуцирования белка SMN путем модуляции сплайсинга гена SMN2, за счет чего компенсируется исходный генетический дефект. Клинические исследования показали некоторый умеренный потенциал в улучшении двигательной функции; однако средство лечение должно вводиться ежеквартально в течение неопределенного срока посредством интратекальной инъекции, требует затяжного периода индукции перед достижением эффективности и характеризуется соображениями по безопасности, требующими клинического мониторинга. Соответственно, остается потребность в улучшенном лечении SMA, включая SMA II и III типа, с использованием альтернатив, таких как раскрытые в данном документе.

[14] В данном документе раскрыты композиции, содержащие вирусные векторы на основе AAV9, и способы их применения для лечения SMA, например, пациентов со SMA II типа и III типа. В некоторых вариантах осуществления способы включают интратекальную инъекцию вирусного вектора на основе AAV9, который обладает способностью модифицировать SMA, например фенотипы SMA II типа и III типа, например, приводя к более легкому течению прогрессирования заболевания, прекращению прогрессирования заболевания и/или улучшению функционального развития.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[15] В настоящем изобретении предусмотрены композиции и способы лечения SMA, например SMA II типа или III типа. Рекомбинантные вирусные векторы, например scAAV, экспрессирующий трансген SMN, раскрытый в данном документе, могут обеспечить терапевтический способ повышения уровней SMN. Поскольку трансген SMN имеет небольшие размеры, его можно эффективно упаковывать с помощью scAAV, что обеспечивает возможность более низких вирусных титров по сравнению с однонитевыми вирусными векторами на основе AAV из прототипа. Однако пациентам со SMA II и III типа зачастую ставят диагноз в более позднем возрасте, когда они потенциально могут быть слишком крупными, чтобы получать безопасную и эффективную внутривенную дозу rAAV, исходя из массы тела. Таким образом, интратекальное введение, при котором вирусный вектор на основе AAV доставляется по ту сторону гематоэнцефалического барьера непосредственно в спинномозговую жидкость, может обеспечить безопасный и эффективный альтернативный способ передачи более низких вирусных титров.

[16] В настоящем изобретении предусмотрен способ лечения SMA, например, спинальной мышечной атрофии (SMA) II типа или III типа, у пациента, нуждающегося в этом, включающий интратекальное введение вирусного вектора на основе AAV9, содержащего полинуклеотид, кодирующий белок фактора выживания мотонейронов (SMN), где вирусный вектор вводят в дозе, составляющей от приблизительно 1×10¹³ vg до 5×10¹⁴ vg. В одном таком варианте осуществления вирусный вектор на основе AAV9 содержит модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16S SV40, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2. В другом варианте осуществления полинуклеотид кодирует белок SMN под SEQ ID NO: 2. В другом варианте осуществления вирусный вектор на основе AAV9 содержит SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления возраст пациента на момент введения составляет шесть месяцев или больше. В других вариантах осуществления возраст пациента на момент введения составляет 24 месяца или меньше, необязательно от 6 месяцев до 24 месяцев. В других вариантах осуществления возраст пациента на момент введения составляет 60 месяцев или меньше, необязательно от 24 месяцев до 60 месяцев. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей от приблизительно 5,0×10¹³ vg до 3,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей до приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей до приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей до приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[17] В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, содержащей от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 9,9×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, содержащей от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 5,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, содержащей от приблизительно 5,0×10¹³ vg до 3,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, содержащей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, содержащей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, содержащей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[18] В некоторых вариантах осуществления у пациента имеются биаллельные нуль-мутации или инактивирующие делеции в SMN1, где необязательно мутации предусматривают делецию седьмого экзона SMN1. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеются три копии SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует замена c.859G>C в экзоне 7 по меньшей мере одной копии гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления пациента, нуждающегося в этом, определяют с помощью одного или нескольких геномных тестов. В некоторых вариантах осуществления начало заболевания у пациента проявляется до возраста приблизительно 12 месяцев. В некоторых вариантах осуществления на момент введения у пациента имеется способность сидеть без посторонней помощи в течение приблизительно 10 секунд или больше, но он не может стоять или ходить. В некоторых вариантах осуществления на момент введения у пациента имеется способность сидеть без посторонней помощи, например, как определено согласно критериям Многоцентрового исследования по разработке справочных показателей роста Всемирной организации здравоохранения (WHO-MGRS). В некоторых вариантах осуществления после введения у пациента имеется способность стоять без опоры в течение по меньшей мере приблизительно трех секунд, например, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, например, при оценке через приблизительно 1-24 месяца, например 12 месяцев, после введения. В некоторых вариантах осуществления после введения у пациента имеется способность ходить без посторонней помощи, например, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, например, при оценке через приблизительно 1-24 месяца, например приблизительно 12 месяцев, после введения. В некоторых вариантах осуществления после введения у пациента имеется способность сделать по меньшей мере пять шагов самостоятельно, например, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® при оценке через приблизительно 1-24 месяца, например приблизительно 12 месяцев, после введения. В некоторых вариантах осуществления у пациента наблюдается изменение после лечения по сравнению с измерением на исходном уровне на момент проведения лечения, например, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® при оценке через приблизительно 1-24 месяца, например приблизительно 12 месяцев, после введения.

[19] В некоторых вариантах осуществления после введения у пациента отсутствует тяжелый сколиоз, например, искривление позвоночника на ≥50°, видимое при рентгенологическом исследовании, при оценке через приблизительно 1-24 месяца, например приблизительно 12 месяцев, после введения. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует противопоказание для проведения спинномозговой пункции или интратекального введения средства терапии. В некоторых вариантах осуществления у пациента ранее не проводилась операция или процедура по исправлению сколиоза, и где необязательно у пациента не проводилась операция или процедура по исправлению сколиоза в течение от 6 месяцев до 3 лет, например в течение 1 года, после введения. В некоторых вариантах осуществления до и/или после введения у пациента отсутствует необходимость в применении инвазивной вспомогательной вентиляции легких. В некоторых вариантах осуществления в анамнезе у пациента до введения отсутствует самостоятельное стояние или ходьба. В некоторых вариантах осуществления до и/или после введения для кормления пациента не используется желудочный зонд. В некоторых вариантах осуществления на момент проведения лечения у пациента отсутствует активная вирусная инфекция (включая вирус иммунодефицита человека (HIV) или положительную серологическую реакцию на вирус гепатита B или C или вирус Зика). В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствовала тяжелая инфекция, не являющаяся легочной инфекцией/инфекцией дыхательных путей (например, пиелонефрит или менингит), в пределах четырех недель до введения. В некоторых вариантах осуществления до введения у пациента отсутствовало сопутствующее заболевание, например тяжелая почечная или печеночная недостаточность, известный эпизод судорожного расстройства, сахарный диабет, идиопатическая гипокальциурия или симптоматическая кардиомиопатия. В некоторых вариантах осуществления в анамнезе у пациента до введения отсутствовал бактериальный менингит или заболевание головного или спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления до введения у пациента отсутствует известная аллергия или гиперчувствительность к преднизолону или другим глюкокортикостероидам или вспомогательным веществам. В некоторых вариантах осуществления до введения у пациента отсутствует известная аллергия или гиперчувствительность к йоду или йодсодержащим продуктам. В некоторых вариантах осуществления пациент не принимает лекарственные средства для лечения миопатии или невропатии. В некоторых вариантах осуществления пациент не получает иммуносупрессорную терапию, плазмаферез, иммуномодуляторы, такие как адалимумаб, в течение 3 месяцев до введения.

[20] В некоторых вариантах осуществления до введения титры антител к AAV9 у пациента составляют 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100 или меньше, например, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA. В некоторых вариантах осуществления до введения у пациента наблюдается одно или несколько из следующего: уровни гамма-глутамилтрансферазы в менее чем приблизительно 3 раза превышают верхний предел нормы, уровни билирубина составляют менее приблизительно 3,0 мг/дл, уровни креатинина составляют менее приблизительно 1,0 мг/дл, уровни Hgb составляют приблизительно 8-18 г/дл, и/или количество лейкоцитов составляет менее приблизительно 20000 на мм³. В некоторых вариантах осуществления до введения пациент не получал исследуемый или одобренный составной продукт или средство терапии с целью лечения SMA. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 вводят вместе с контрастной средой, необязательно при этом контрастная среда предусматривает йогексол. В некоторых вариантах осуществления объем вводимой контрастной среды составляет приблизительно 1,0-2,0 мл, например приблизительно 1,5 мл, необязательно при этом контрастную среду смешивают с вирусным вектором на основе AAV9 перед введением, например за менее чем 24 часа, менее чем 12 часов, менее чем 6 часов, менее чем 5 часов, менее чем 4 часа, менее чем 3 часа, менее чем 2 часа, менее чем 1 час, менее чем 30 минут или непосредственно перед введением. В некоторых вариантах осуществления контрастную среду и вирусный вектор на основе AAV9 вводят последовательно, например, где сначала вводят (например, интратекально) контрастную среду, а вирусный вектор на основе AAV9 вводят (например, интратекально) после введения контрастной среды. В некоторых вариантах осуществления контрастную среду и вирусный вектор на основе AAV9 вводят последовательно, например, где сначала вводят (например, интратекально) вирусный вектор на основе AAV9, а контрастную среду вводят (например, интратекально) после введения вирусного вектора на основе AAV9. В вариантах осуществления, в которых вирусный вектор на основе AAV9 и контрастную среду вводят последовательно, введение вирусного вектора на основе AAV9 и контрастной среды осуществляют в пределах 2 часов, в пределах 1 часа, в пределах 45 минут, в пределах 30 минут, в пределах 15 минут, в пределах 10 минут или в пределах 5 минут друг от друга. В некоторых вариантах осуществления при этом общий объем вирусного вектора на основе AAV9 и контрастной среды, вводимых пациенту, не превышает приблизительно 10 мл, приблизительно 9 мл или приблизительно 8 мл. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает седацию или анестезию. В некоторых вариантах осуществления пациента помещают в положение Тренделенбурга во время и/или после введения вирусного вектора на основе AAV9. В некоторых вариантах осуществления пациента помещают в наклоненное положение с головой вниз под углом приблизительно 30° на приблизительно 10-60 минут, например приблизительно 15 минут, после введения вирусного вектора на основе AAV9.

[21] В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят пероральный стероид за по меньшей мере приблизительно 1-48 часов, например приблизительно 24 часа, до введения вирусного вектора на основе AAV9. В некоторых вариантах осуществления пациенту вводят пероральный стероид в течение по меньшей мере приблизительно 10-60 дней, например приблизительно 30 дней, после введения вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид вводят один раз в день. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид вводят два раза в день. В некоторых вариантах осуществления у пациента отслеживают уровни ALT и/или AST после введения вирусного вектора, и при этом пероральный стероид продолжают вводить после 30 дней до тех пор, пока уровни AST и/или ALT не станут ниже значения, в два раза превышающего верхний предел нормы, или ниже приблизительно 120 МЕ/л. В некоторых вариантах осуществления у пациента отслеживают уровни Т-клеточного ответа после введения вирусного вектора на основе AAV9, и при этом пероральный стероид продолжают вводить после 30 дней до тех пор, пока Т-клеточный ответ в образце от пациента, например в образце крови, не упадет ниже 100 пятнообразующих клеток (SFC) на 10⁶ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).

[22] В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид вводят в дозе, составляющей приблизительно 1 мг/кг.

[23] В некоторых вариантах осуществления дозу перорального стероида снижают после того, как уровни AST и ALT станут ниже значения, в два раза превышающего верхний предел нормы, или ниже приблизительно 120 МЕ/л. В некоторых вариантах осуществления снижение дозы включает ступенчатое изменение до приблизительно 0,5 мг/кг/день в течение 2 недель, а затем до приблизительно 0,25 мг/кг/день в течение еще 2 недель. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид вводят в течение 30 дней в дозе, составляющей приблизительно 1 мг/кг, а затем дозу снижают до 0,5 мг/кг/день в течение 2 недель, а затем до 0,25 мг/кг/день в течение еще 2 недель. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид представляет собой преднизолон или его эквивалент.

[24] В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения определяют с использованием Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® и/или Расширенной шкалы оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение пациенту второго терапевтического средства одновременно или последовательно с введением вирусного вектора на основе AAV9. В некоторых таких вариантах осуществления второе терапевтическое средство предусматривает средство для усиления мышц или нейропротектор. В других таких вариантах осуществления второе терапевтическое средство предусматривает антисмысловой олигонуклеотид или антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на SMN1 и/или SMN2. В некоторых вариантах осуществления второе терапевтическое средство предусматривает нусинерсен и/или стамулумаб. В некоторых вариантах осуществления при этом количество генома вирусного вектора на основе AAV9 измеряют с помощью ddPCR. В некоторых вариантах осуществления после введения титры антител к AAV9 у пациента составляют 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100 или выше, например, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и их отслеживают в течение приблизительно 1-8 недель или до тех пор, пока титры не уменьшаться ниже 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100. В некоторых вариантах осуществления после введения титры антител к AAV9 у пациента составляют 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100 или выше, например, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и ему вводят стероид, например преднизолон, до тех пор, пока титры не уменьшаться ниже 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100. В некоторых вариантах осуществления до введения количество тромбоцитов у пациента составляет более приблизительно 67000 клеток/мл, или более приблизительно 100000 клеток/мл, или более приблизительно 150000 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления после введения количество тромбоцитов у пациента составляет менее приблизительно 67000 клеток/мл, или менее приблизительно 100000 клеток/мл, или менее приблизительно 150000 клеток/мл, и его отслеживают в течение приблизительно 1-8 недель или до тех пор, пока количество тромбоцитов не увеличится до приблизительно 67000 клеток/мл, или более приблизительно 100000 клеток/мл, или более приблизительно 150000 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления после введения количество тромбоцитов у пациента составляет менее приблизительно 67000 клеток/мл, и его подвергают лечению с помощью переливания тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора на основе AAV9 у пациента имеется нормальная функция печени. В некоторых вариантах осуществления до введения уровни печеночной трансаминазы у пациента составляют менее приблизительно 8-40 Ед/л.

[25] В некоторых вариантах осуществления печеночная трансаминаза выбрана из AST, ALT и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 находится в фармацевтическом составе, подходящем для интратекального введения.

[26] В настоящем изобретении также предусмотрено применение вирусного вектора на основе AAV9 для лечения SMA, например спинальной мышечной атрофии (SMA) II типа или III типа, в соответствии со способами, описанными в данном документе.

[27] В настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая вирусный вектор на основе AAV9 и фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для интратекального введения, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16S SV40, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует белок SMN под SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе AAV9 содержит SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит контрастное средство. В некоторых вариантах осуществления контрастное средство присутствует в количестве, составляющем приблизительно 1,0-2,0 мл, например приблизительно 1,5 мл.

[28] В некоторых вариантах осуществления общий объем вирусного вектора на основе AAV9 и контрастной среды не превышает приблизительно 10 мл, приблизительно 9 мл или приблизительно 8 мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит дополнительное терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предназначена для применения в любом из способов лечения, описанных в данном документе.

[29] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой стандартную дозу, содержащую от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 9,9×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой стандартную дозу, содержащую от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 5,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой стандартную дозу, содержащую от приблизительно 5,0×10¹³ vg до 3,0×10¹⁴ vg.

[30] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой стандартную дозу, содержащую приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой стандартную дозу, содержащую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция представляет собой стандартную дозу, содержащую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[31] В некоторых вариантах осуществления для фармацевтической композиции предусмотрено по меньшей мере одно из следующего: (a) значение pH составляет приблизительно 7,7-8,3, (b) осмолярность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг, (c) содержит менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер, (d) содержит менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер, (e) геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл, (f) инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, (g) общий белок составляет приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg, (h) содержание Pluronic F-68 составляет приблизительно 20-80 ppm, (i) относительная эффективность составляет приблизительно 70-130%, (j) медиана выживаемости на мышиной модели с SMNΔ7 при дозе 7,5×10¹³ vg/кг составляет 24 дня или больше, (k) содержит менее приблизительно 5% пустых капсидов, (l) и общая чистота составляет приблизительно 95% или больше, и (m) уровень эндотоксина составляет приблизительно 0,13 ЕЭ/мл или меньше.

[32] В некоторых вариантах осуществления для фармацевтической композиции предусмотрено по меньшей мере одно из следующих условий: (а) содержит менее приблизительно 0,09 нг бензоназы на 1,0×10¹³ vg, (b) содержит менее приблизительно 30 мкг/г (ppm) цезия, (c) содержит приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188, (d) содержит менее приблизительно 0,22 нг BSA на 1,0×10¹³ vg, (e) содержит менее приблизительно 6,8×10⁵ пг остаточной плазмидной ДНК на 1,0×10¹³ vg, (f) содержит менее приблизительно 1,1×10⁵ пг остаточной hcDNA на 1,0×10¹³ vg, (g) содержит менее приблизительно 4 нг rHCP на 1,0×10¹³ vg, (h) pH составляет приблизительно 7,7-8,3, (i) осмолярность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг, (j) содержит менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер, (k) содержит менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер, (l) геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл, (m) инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg, (n) общий белок составляет приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg, (o) относительная эффективность составляет приблизительно 70-130%, и (p) содержит менее приблизительно 5% пустых капсидов.

[33] В некоторых вариантах осуществления способы или применение композиций, описанных в данном документе, приводят к улучшенному баллу согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит по сравнению с баллами до введения. В некоторых вариантах осуществления способы или применение композиций, описанных в данном документе, приводят к улучшенному баллу согласно третьему изданию Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® (шкала Бейли®-III) по сравнению с баллами до введения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[34] На фиг. 1 показана масса тела обработанных и контрольных мышей после введения AAV.

[35] На фиг. 2 показан первоначальный дизайн исследования для открытого исследования фазы I с введением однократной дозы младенцам и детям со SMA II типа или III типа. Пациенты получают AVXS-101 в исследовании безопасности со сравнением доз.

[36] На фиг. 3 показана каскадная диаграмма изменения относительно исходного уровня, с ранжированием от самого высокого до самого низкого значения согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE) у пациентов с SMA 2 типа, получивших дозу A (6,0×10¹³ vg; обозначены ромбиком) или дозу B (1,2×10¹⁴ vg) интратекального AVXS-101 при оценке после возраста 24 месяца. Результаты для пациентов возрастом от шести месяцев до двух лет на момент инфузии показаны серыми полосами; черные полосы указывают возраст от 2 до 5 лет на момент инфузии.

[37] На фиг. 4 показаны баллы HFMSE у отдельных пациентов со SMA 2 типа.

[38] На фиг. 5 показан ответ на лечение с помощью AVXS-101, измеренный посредством HFMSE, у пациентов возрастом от шести месяцев до пяти лет на момент лечения.

[39] На фиг. 6 показан ответ на лечение с помощью AVXS-101, измеренный посредством HFMSE, у пациентов возрастом от двух лет до пяти лет на момент лечения, которые получили дозу 1,2×10¹⁴ vg.

[40] На фиг. 7 показан график изменения баллов по HFMSE относительно исходного уровня до месяца 12 для всех пациентов возрастной группы ≥24 месяцев и <60 месяцев (первичный анализ PNCR) - выборка ITT.

[41] На фиг. 8 показан график изменения баллов по HFMSE относительно исходного уровня до месяца 12 для всех пациентов возрастной группы ≥24 месяцев и <60 месяцев (анализ чувствительности PNCR) - выборка ITT.

[42] На фиг. 9 показан график изменения балла мелкой моторики, определенного посредством Шкал Бейли® во время каждого визита после визита исходного уровня, относительно исходного уровня до срока 12 месяцев для всех пациентов возрастом <24 месяцев на момент введения дозы - выборка ITT.

[43] На фиг. 10 показан график изменения балла крупной моторики, определенного посредством Шкал Бейли® во время каждого визита после визита исходного уровня, относительно исходного уровня до срока 12 месяцев для всех пациентов возрастом <24 месяцев на момент введения дозы - выборка ITT.

[44] На фиг. 11 показан график изменения балла мелкой моторики, определенного посредством Шкал Бейли® во время каждого визита после визита исходного уровня, относительно исходного уровня до срока 12 месяцев для всех пациентов возрастом ≥24 и <60 месяцев на момент введения дозы - выборка ITT.

[45] На фиг. 12 показан график изменения балла крупной моторики, определенного посредством Шкал Бейли® во время каждого визита после визита исходного уровня, относительно исходного уровня до срока 12 месяцев для всех пациентов возрастом ≥24 и <60 месяцев на момент введения дозы - выборка ITT.

[46] На фиг. 13 показан изменения балла по HFMSE, определенного во время каждого визита после визита исходного уровня, относительно исходного уровня для всех пациентов возрастом <24 месяцев на момент введения дозы, которые продолжают участие в исследовании после достижения возраста 24 месяца - выборка ITT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[47] Чтобы лучше понять настоящее изобретение, в данном документе обсуждаются некоторые иллюстративные варианты осуществления. В дополнение к этому, чтобы облегчить понимание, обсуждаются определенные термины.

[48] В некоторых вариантах осуществления под "вектором" подразумевается любой генетический элемент, такой как плазмида, фаг, транспозон, космида, хромосома, вирус, вирион и т. д., который способен к репликации при ассоциации с надлежащими регуляторными элементами и который может переносить генные последовательности между клетками. Таким образом, термин включает среды-носители для клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы.

[49] В некоторых вариантах осуществления под "вектором на основе AAV" подразумевается вектор, происходящий из серотипа аденоассоциированного вируса, включая без ограничения AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 и AAV-9. У векторов на основе AAV могут быть полностью или частично удалены один или несколько генов AAV дикого типа, например, гены rep и/или cap, но сохраняются функциональные фланкирующие последовательности ITR. Функциональные последовательности ITR необходимы для высвобождения, репликации и упаковки вириона AAV. Таким образом, вектор на основе AAV определяется в данном документе как включающий по меньшей мере те последовательности, которые в цис-положении обеспечивают репликацию и упаковку (например, функциональные ITR) вируса. ITR не обязательно должны представлять собой нуклеотидные последовательности дикого типа и могут быть изменены, например, за счет вставки, делеции или замены нуклеотидов, при условии, что данные последовательности сохраняют функциональность в отношении освобождения, репликации и упаковки. В одном варианте осуществления вектор представляет собой вектор на основе AAV-9 с ITR, полученными от AAV-2. Также под "вектором на основе AAV" подразумевается белковая оболочка или капсид, которые обеспечивают эффективную среду-носитель для доставки векторной нуклеиновой кислоты в ядро клеток-мишеней.

[50] В некоторых вариантах осуществления под "scAAV" подразумевается самокомплементарный аденоассоциированный вирус (scAAV), который представляет собой вирусный вектор, сконструированный из встречающегося в природе аденоассоциированного вируса (AAV) для применения в генной терапии. scAAV называют "самокомплементарным" в связи с тем, что его кодирующая область была сконструирована для образования внутримолекулярной двухнитевой ДНК-матрицы.

[51] В некоторых вариантах осуществления под "рекомбинантным вирусом" подразумевается вирус, который был генетически изменен, например, за счет добавления или вставки гетерологичной конструкции нуклеиновой кислоты в частицу. "Рекомбинантный" может сокращаться до "r", например, rAAV может обозначать рекомбинантный AAV. Подразумевается, что используемый в данном документе термин "AAV" охватывает "рекомбинантный AAV" или "rAAV".

[52] В некоторых вариантах осуществления под "вирионом AAV" подразумевается полная вирусная частица, такая как частица вируса AAV дикого типа (wt) (содержащая геном в виде линейной однонитевой нуклеиновой кислоты AAV, ассоциированный с белковой оболочкой, представляющей собой капсид AAV). В этом отношении однонитевые молекулы нуклеиновой кислоты AAV любой комплементарного смысла, например "смысловые" или "антисмысловые" нити, могут быть упакованы в любой вирион AAV, и обе нити являются одинаково инфекционными.

[53] В некоторых вариантах осуществления термины "рекомбинантный вирион AAV", "вирион rAAV", "векторная частица на основе AAV", "полные капсиды" и "полные частицы" определяются в данном документе как инфекционный вирус с дефектом по репликации, содержащий белковую оболочку AAV, инкапсулирующую представляющую интерес гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая фланкирована с обеих сторон ITR AAV. Вирион rAAV продуцируется в подходящей клетке-хозяине, в которую были введены последовательности, определяющие вектор на основе AAV, хелперные функциональные элементы AAV и вспомогательные функциональные элементы. Следовательно, клетка-хозяин приобретает способность кодировать полипептиды AAV, которые обеспечивают упаковку вектора на основе AAV (содержащего представляющую интерес рекомбинантную нуклеотидную последовательность) в инфекционные частицы рекомбинантного вириона для последующей доставки гена.

[54] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно среднему специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте. В той части, в которой термины или обсуждение в ссылках противоречат настоящему изобретению, последнее имеет преимущественную силу.

[55] Используемые в данном документе формы единственного числа слова также включают форму множественного числа слова, если контекст явно не диктует иное, как пример, термин в единственном числе понимается как в единственном, так и во множественном числе. В качестве примера, "элемент" означает один или несколько элементов. Термин "или" будет означать "и/или", если конкретный контекст не указывает иное.

[56] Термин "содержащий" или такие варианты, как "содержит", будут пониматься как подразумевающие включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий. На протяжении всего настоящего описания фраза "состоящий из" или такие варианты, как "состоит из", будут пониматься как подразумевающие включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий и исключение любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий. На протяжении всего настоящего описания фраза "состоящий по существу из" или такие варианты, как "состоит по существу из", будут пониматься как подразумевающие включение указанного элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий и любого другого элемента, целого числа или стадии или группы элементов, целых чисел или стадий, которые существенно не влияют на основные и новые характеристики настоящего изобретения и/или формулы изобретения.

[57] "Приблизительно" можно понимать как значение в пределах +/-10%, например +/-10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% от указанного значения. При использовании в отношении процентного содержания "приблизительно" можно понимать как значение в пределах ±1% (например, "приблизительно 5%" можно понимать как значение в пределах 4% - 6%) или ± 0,5% (например, "приблизительно 5%" можно понимать как значение в пределах 4,5% - 5,5%). Если иное не очевидно из контекста, все числовые значения, представленные в данном документе, модифицированы с помощью термина "приблизительно". Все используемые в данном документе диапазоны охватывают крайние точки.

Вирусный вектор на основе rAAV

[58] В одном аспекте в данном документе раскрыты геномы rAAV. В некоторых вариантах осуществления геном rAAV содержит один или несколько ITR AAV, фланкирующих полинуклеотид, кодирующий полипептид SMN. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид функционально связан с элементами ДНК для регуляции транскрипции, например, с промоторной ДНК, одной или несколькими энхансерными ДНК и/или последовательности ДНК сигнала полиаденилирования, которые являются функциональными в клетках-мишенях, с образованием генной кассеты. Генная кассета может также содержать интронные последовательности для облегчения процессинга РНК-транскрипта при экспрессии в клетках млекопитающих.

[59] В некоторых вариантах осуществления в геномах rAAV, раскрытых в данном документе, отсутствуют ДНК rep и cap AAV. ДНК AAV в геномах rAAV (например, ITR) может быть получена от любого серотипа AAV, из которого может происходить рекомбинантный вирус, включая без ограничения такие серотипы AAV: AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 и AAV-11. Нуклеотидные последовательности геномов серотипов AAV известны из уровня техники. Например, полный геном AAV-1 представлен в GenBank под № доступа NC_002077; полный геном AAV-2 представлен в GenBank под № доступа NC 001401 и в Srivastava et al., Virol., 45: 555-564 (1983); полный геном AAV-3 представлен в GenBank под № доступа NC_1829; полный геном AAV-4 представлен в GenBank под № доступа NC_001829; геном AAV-5 представлен в GenBank под № доступа AF085716; полный геном AAV-6 представлен в GenBank под № доступа NC_00 1862; по меньшей мере части геномов AAV-7 и AAV-8 представлены в GenBank под №№ доступа AX753246 и AX753249 соответственно; геном AAV-9 представлен в Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); геном AAV-10 представлен в Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); и геном AAV-11 представлен в Virology, 330(2): 375-383 (2004).

[60] Используемая в данном документе векторная плазмида "pSMN" содержит полинуклеотид, кодирующий белок SMN, т. е. кассету экспрессии кДНК SMN, при этом кассета фланкирована последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) аденоассоциированного вируса, например, находящимися "слева" и "справа" от полинуклеотида, кодирующего ген SMN. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий SMN, представляет собой последовательность SMN человека, например, встречающуюся в природе последовательность SMN человека или ее изоформы, варианты или мутанты. В некоторых вариантах осуществления последовательности ITR представляют собой нативные, вариантные или модифицированные последовательности ITR AAV. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна последовательность ITR представляет собой нативную, вариантную или модифицированную последовательность ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления две последовательности ITR одновременно представляют собой нативные, вариантные или модифицированные последовательности ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления "левый" ITR представляет собой модифицированную последовательность ITR AAV2, которая обеспечивает возможность образования самокомплементарных геномов, а "правый" ITR представляет собой нативную последовательность ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления "правый" ITR представляет собой модифицированную последовательность ITR AAV2, которая обеспечивает возможность образования самокомплементарных геномов, а "левый" ITR представляет собой нативную последовательность ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления плазмида pSMN дополнительно содержит энхансер CMV/промотор гена бета-актина курицы ("CB"). В некоторых вариантах осуществления плазмида pSMN дополнительно содержит интрон вируса обезьян 40 (SV40). В некоторых вариантах осуществления плазмида pSMN дополнительно содержит терминационный сигнал полиаденилирования (поли-А) бычьего гормона роста (BGH). Иллюстративные последовательности, которые можно использовать в качестве одного или нескольких компонентов, обсуждаемых выше, показаны в таблице 1 ниже. В некоторых вариантах осуществления используются все последовательности, показанные в таблице 1 ниже. В некоторых вариантах осуществления "AVXS-101" представляет собой неограничивающий пример векторной конструкции, в которой используются все последовательности из таблицы 1 и попадающей в объем термина pSMN. Варианты осуществления данных векторов и способы их получения и очистки представлены, например, в PCT/US2018/058744, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[61] В некоторых вариантах осуществления вектор pSMN может содержать кассету экспрессии на основе кДНК SMN, модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16s SV40, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2. Модифицированные и немодифицированные ITR могут находиться в любой ориентации (т. е. в со стороны 5'- или 3'-конца) относительно кассеты экспрессии кДНК SMN.

Таблица 1. Обзор компонентов последовательности ДНК векторной конструкции AVXS-101 (все нуклеотидные положения начала и конца указаны относительно SEQ ID NO: 1).

	Положение начала	Положение конца	Размер (нт)	Описание	Неограничивающее описание потенциальных преимуществ
"Левый" мутантный ITR AAV2	1	106	106	Модификация "левого" ITR за счет удаления сайта концевого разрешения, чтобы обеспечить образование шпилечных структур генома	Не ограничиваясь какой-либо теорией, данный мутантный ITR может позволить самокомплементарному вектору второго поколения увеличить до максимума эффективность вектора, обеспечивая возможность снижения системных доз.
Энхансер CMV/ промотор CB	153	432	280	Часть энхансера немедленно-раннего гена цитомегаловируса CMV	Не ограничиваясь какой-либо теорией, он может обеспечить конститутивную экспрессию SMN на высоком уровне.
Энхансер CMV/ промотор CB	439	704	266	Коровый промотор CB
Интрон SV40	774	870	97	Интрон из SV40 (для увеличения накопления мРНК на стабильном уровне для трансляции)	Не ограничиваясь какой-либо теорией, он может обеспечить увеличенную экспрессию генов.
кДНК SMN человека	1003	1887	885	Модифицированная на основе последовательности под № доступа Genbank NM_017411	Не ограничиваясь какой-либо теорией, она может обеспечить экспрессию полноразмерного белка SMN.
Терминаци-онный сигнал поли-A BGH	1973	2204	232	Сигнал поли-A BGH	Не ограничиваясь какой-либо теорией, он может обеспечить поли-А мРНК SMN (сигнал терминации транскрипции) для эффективной экспрессии генов на высоком уровне.
"Правый" AAV2 ITR	2217	2359	143	Немодифицированный AAV2 ITR	Не ограничиваясь какой-либо теорией, этот ITR AAV2 в цис-положении может обеспечить как репликацию вирусной ДНК, так и упаковку генома вектора на основе AAV.

[62] В некоторых вариантах осуществления последовательность векторной конструкции инкапсидирована, например, в вирионы AAV9. В этих вариантах осуществления инкапсидация осуществляется в капсид нереплицирующегося рекомбинантного AAV9, способного доставлять стабильный функциональный трансген, например, полностью функциональный трансген SMN человека. В некоторых вариантах осуществления капсид состоит из 60 вирусных белков (VP1, VP2, VP3), например, в соотношении 1:1:10, полученных за счет альтернативного сплайсинга, так что VP2 и VP3 представляют собой две усеченные формы VP1, и все из них содержат общие С-концевые последовательности. В некоторых вариантах осуществления продукт технологического процесса, например лекарственный продукт, может предусматривать капсид нереплицирующегося рекомбинантного AAV9 для доставки стабильного полностью функционального трансгена SMN человека. В некоторых вариантах осуществления капсид состоит из 60 вирусных белков (VP1, VP2, VP3) в соотношении 1:1:10, полученных за счет альтернативного сплайсинга, так что VP2 и VP3 представляют собой две усеченные формы VP1, и все из них содержат общие C-концевые последовательности. Варианты осуществления данных векторных конструкций и способы их получения и очистки представлены, например, в PCT/US2018/058744, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[63] В различных вариантах осуществления последовательность ДНК векторной конструкции pSMN, например, векторной конструкции AVXS-101, содержит SEQ ID NO: 1:

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 50

ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg 100 gagtggaatt cacgcgtgga tctgaattca attcacgcgt ggtacctctg 150 gtcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 200 cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 250 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300 cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 350 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 400 tatgggactt tcctacttgg cagtacatct actcgaggcc acgttctgct 450 tcactctccc catctccccc ccctccccac ccccaatttt gtatttattt 500 attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg ggggggggcg 550 cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 600 gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt 650 atggcgaggc ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg 700 ggcgggagcg ggatcagcca ccgcggtggc ggcctagagt cgacgaggaa 750 ctgaaaaacc agaaagttaa ctggtaagtt tagtcttttt gtcttttatt 800 tcaggtcccg gatccggtgg tggtgcaaat caaagaactg ctcctcagtg 850 gatgttgcct ttacttctag gcctgtacgg aagtgttact tctgctctaa 900 aagctgcgga attgtacccg cggccgatcc accggtccgg aattcccggg 950 atatcgtcga cccacgcgtc cgggccccac gctgcgcacc cgcgggtttg 1000 ctatggcgat gagcagcggc ggcagtggtg gcggcgtccc ggagcaggag 1050 gattccgtgc tgttccggcg cggcacaggc cagagcgatg attctgacat 1100 ttgggatgat acagcactga taaaagcata tgataaagct gtggcttcat 1150 ttaagcatgc tctaaagaat ggtgacattt gtgaaacttc gggtaaacca 1200 aaaaccacac ctaaaagaaa acctgctaag aagaataaaa gccaaaagaa 1250 gaatactgca gcttccttac aacagtggaa agttggggac aaatgttctg 1300 ccatttggtc agaagacggt tgcatttacc cagctaccat tgcttcaatt 1350 gattttaaga gagaaacctg tgttgtggtt tacactggat atggaaatag 1400 agaggagcaa aatctgtccg atctactttc cccaatctgt gaagtagcta 1450 ataatataga acagaatgct caagagaatg aaaatgaaag ccaagtttca 1500 acagatgaaa gtgagaactc caggtctcct ggaaataaat cagataacat 1550 caagcccaaa tctgctccat ggaactcttt tctccctcca ccacccccca 1600 tgccagggcc aagactggga ccaggaaagc caggtctaaa attcaatggc 1650 ccaccaccgc caccgccacc accaccaccc cacttactat catgctggct 1700 gcctccattt ccttctggac caccaataat tcccccacca cctcccatat 1750 gtccagattc tcttgatgat gctgatgctt tgggaagtat gttaatttca 1800 tggtacatga gtggctatca tactggctat tatatgggtt ttagacaaaa 1850 tcaaaaagaa ggaaggtgct cacattcctt aaattaagga gaaatgctgg 1900 catagagcag cactaaatga caccactaaa gaaacgatca gacagatcta 1950 gaaagcttat cgataccgtc gactagagct cgctgatcag cctcgactgt 2000 gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 2050 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2100 attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 2150 ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 2200 gggagagatc gatctgagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 2250 tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 2300 gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag 2350 ggagtggcc 2359 (SEQ ID NO: 1).

[64] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность белка SMN, кодируемого плазмидой pSMN, например AVX101, содержит:

MAMSSGGSGGGVPEQEDSVLFRRGTGQSDDSDIWDDTALIKAYDKAVASFKHALKNGDICETSGKPKTTPKRKPAKKNKSQKKNTAASLQQWKVGDKCSAIWSEDGCIYPATIASIDFKRETCVVVYTGYGNREEQNLSDLLSPICEVANNIEQNAQENENESQVSTDESENSRSPGNKSDNIKPKSAPWNSFLPPPPPMPGPRLGPGKPGLKFNGPPPPPPPPPPHLLSCWLPPFPSGPPIIPPPPPICPDSLDDADALGSMLISWYMSGYHTGYYMGFRQNQKEGRCSHSLN (SEQ ID NO: 2).

[65] В некоторых вариантах осуществления капсидные белки AAV VP1, VP2, VP3 происходят из одного и того же транскрипта. Они имеют альтернативные сайты начала, но общий карбокси-конец. Ниже специфические аминокислотные последовательности VP1 показаны черным и жирным шрифтом. Аминокислотные последовательности, общие для VP1 и VP2, подчеркнуты и выделены курсивом. Аминокислоты, общие для всех трех капсидных белков, выделены жирным шрифтом и курсивом.

1 MAADGYLPDW LEDNLSEGIR EWWALKPGAP QPKANQQHQD NARGLVLPGY KYLGPGNGLD

61 KGEPVNAADA AALEHDKAYD QQLKAGDNPY LKYNHADAEF QERLKEDTSF GGNLGRAVFQ

121 AKKRLLEPLG LVEEAAK TAP GKKRPVEQSP QEPDSSAGIG KSGAQPAKKR LNFGQTGDTE

181 SVPDPQPIGE PPAAPSGVGS L ™ ASGGGAP VADNNEGADG VGSSSGNWHC DSQWLGDRVI

241 TTSTRTWALP TYNNHLYKQI SNSTSGGSSN DNAYFGYSTP WGYFDFNRFH CHFSPRDWQR

301 LINNNWGFRP KRLNFKLFNI QVKEVTDNNG VKTIANNLTS TVQVFTDSDY QLPYVLGSAH

361 EGCLPPFPAD VFMIPQYGYL TLNDGSQAVG RSSFYCLEYF PSQMLRTGNN FQFSYEFENV

421 PFHSSYAHSQ SLDRLMNPLI DQYLYYLSKT INGSGQNQQT LKFSVAGPSN MAVQGRNYIP

481 GPSYRQQRVS TTVTQNNNSE FAWPGASSWA LNGRNSLMNP GPAMASHKEG EDRFFPLSGS

541 LIFGKQGTGR DNVDADKVMI TNEEEIKTTN PVATESYGQV ATNHQSAQAQ AQTGWVQNQG

601 ILPGMVWQDR DVYLQGPIWA KIPHTDGNFH PSPLMGGFGM KHPPPQILIK NTPVPADPPT

661 AFNKDKLNSF ITQYSTGQVS VEIEWELQKE NSKRWNPEIQ YTSNYYKSNN VEFAVNTEGV

721 YSEPRPIGTR YLTRNL (SEQ ID NO: 3).

[66] В одном варианте осуществления капсидные белки AAV происходят из транскрипта, кодирующего аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3.

[67] В различных вариантах осуществления в данном документе раскрыты ДНК-плазмиды, содержащие геномы rAAV. ДНК-плазмиды переносятся в клетки, восприимчивые к инфицированию, с вирусом-помощником AAV (например, аденовирусом, аденовирусом с делецией E1 или герпесвирусом) для сборки генома rAAV в инфекционные вирусные частицы с капсидными белками AAV9. Методики для продуцирования частиц rAAV, при которых подлежащий упаковке геном AAV, гены rep и cap и функциональные элементы вируса-помощника обеспечиваются в клетке, доступны в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления в продуцирование rAAV вовлечены следующие компоненты, присутствующие в пределах одной клетки (обозначаемой в данном документе как упаковывающая клетка): геном rAAV, гены rep и cap AAV, отделенные от генома rAAV (т. е. не находящиеся в нем), и функциональные элементы вируса-помощника. Продуцирование псевдотипированного rAAV, например, раскрыто в WO 01/83692, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В различных вариантах осуществления капсидные белки AAV могут быть модифицированы для улучшения доставки рекомбинантного вектора. Модификации, вводимые в капсидные белки, в целом известны из уровня техники. См., например, US 2005/0053922 и US 2009/0202490, раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[68] Обзор общих принципов продуцирования rAAV изложен, например, в Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539; и Muzyczka, 1992, CUM Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129). Различные подходы описаны в Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hennonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988); и Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828); патенте США № 5173414; WO 95/13365 и соответствующем патенте США № 5658776; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250; Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615; Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132; патенте США № 5786211; патенте США № 5871982 и патенте США № 6258595. Кроме того, раскрытый в данном документе rAAV может быть получен, очищен, произведен и/или составлен в соответствии с раскрытием PCT/US2018/058744. Вышеперечисленные документы настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, при этом особый акцент делается на те разделы документов, которые относятся к получению, очистке, продуцированию, производству и составлению rAAV.

[69] В другом аспекте rAAV, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок SMN, такой как rAAV9, обсуждаемый в данном документе, упоминается как "rAAV с SMN". В некоторых вариантах осуществления геном rAAV с SMN содержит по порядку: первый ITR AAV2, промотор гена β-актина курицы с энхансером цитомегаловируса, интрон SV40, полинуклеотид, кодирующий SMN, последовательность сигнала полиаденилирования из бычьего гормона роста и второй ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий SMN, представляет собой ген SMN человека, например, изложенный под номером доступа в GenBank MN_000344.2, под № доступа в Genbank NM_017411 или представленный любой другой подходящей изоформой SMN человека или происходящий из них. Иллюстративная последовательность SMN включает следующую последовательность:

1 CCACAAATGT GGGAGGGCGA TAACCACTCG TAGAAAGCGT GAGAAGTTAC TACAAGCGGT

61 CCTCCCGGCC ACCGTACTGT TCCGCTCCCA GAAGCCCCGG GCGGCGGAAG TCGTCACTCT

121 TAAGAAGGGA CGGGGCCCCA CGCTGCGCAC CCGCGGGTTT GCTATGGCGA TGAGCAGCGG

181 CGGCAGTGGT GGCGGCGTCC CGGAGCAGGA GGATTCCGTG CTGTTCCGGC GCGGCACAGG

241 CCAGAGCGAT GATTCTGACA TTTGGGATGA TACAGCACTG ATAAAAGCAT ATGATAAAGC

301 TGTGGCTTCA TTTAAGCATG CTCTAAAGAA TGGTGACATT TGTGAAACTT CGGGTAAACC

361 AAAAACCACA CCTAAAAGAA AACCTGCTAA GAAGAATAAA AGCCAAAAGA AGAATACTGC

421 AGCTTCCTTA CAACAGTGGA AAGTTGGGGA CAAATGTTCT GCCATTTGGT CAGAAGACGG

481 TTGCATTTAC CCAGCTACCA TTGCTTCAAT TGATTTTAAG AGAGAAACCT GTGTTGTGGT

541 TTACACTGGA TATGGAAATA GAGAGGAGCA AAATCTGTCC GATCTACTTT CCCCAATCTG

601 TGAAGTAGCT AATAATATAG AACAGAATGC TCAAGAGAAT GAAAATGAAA GCCAAGTTTC

661 AACAGATGAA AGTGAGAACT CCAGGTCTCC TGGAAATAAA TCAGATAACA TCAAGCCCAA

721 ATCTGCTCCA TGGAACTCTT TTCTCCCTCC ACCACCCCCC ATGCCAGGGC CAAGACTGGG

781 ACCAGGAAAG CCAGGTCTAA AATTCAATGG CCCACCACCG CCACCGCCAC CACCACCACC

841 CCACTTACTA TCATGCTGGC TGCCTCCATT TCCTTCTGGA CCACCAATAA TTCCCCCACC

901 ACCTCCCATA TGTCCAGATT CTCTTGATGA TGCTGATGCT TTGGGAAGTA TGTTAATTTC

961 ATGGTACATG AGTGGCTATC ATACTGGCTA TTATATGGGT TTCAGACAAA ATCAAAAAGA

1021 AGGAAGGTGC TCACATTCCT TAAATTAAGG AGAAATGCTG GCATAGAGCA GCACTAAATG

1081 ACACCACTAA AGAAACGATC AGACAGATCT GGAATGTGAA GCGTTATAGA AGATAACTGG

1141 CCTCATTTCT TCAAAATATC AAGTGTTGGG AAAGAAAAAA GGAAGTGGAA TGGGTAACTC

1201 TTCTTGATTA AAAGTTATGT AATAACCAAA TGCAATGTGA AATATTTTAC TGGACTCTTT

1261 TGAAAAACCA TCTGTAAAAG ACTGGGGTGG GGGTGGGAGG CCAGCACGGT GGTGAGGCAG

1321 TTGAGAAAAT TTGAATGTGG ATTAGATTTT GAATGATATT GGATAATTAT TGGTAATTTT

1381 ATGGCCTGTG AGAAGGGTGT TGTAGTTTAT AAAAGACTGT CTTAATTTGC ATACTTAAGC

1441 ATTTAGGAAT GAAGTGTTAG AGTGTCTTAA AATGTTTCAA ATGGTTTAAC AAAATGTATG

1501 TGAGGCGTAT GTGGCAAAAT GTTACAGAAT CTAACTGGTG GACATGGCTG TTCATTGTAC

1561 TGTTTTTTTC TATCTTCTAT ATGTTTAAAA GTATATAATA AAAATATTTA ATTTTTTTTT

1621 A (SEQ ID NO: 4).

[70] Также предусмотрены консервативные нуклеотидные замены ДНК SMN (например, замена гуанина на аденин в положении 625 последовательности под номером доступа в GenBank NM_000344.2). В некоторых вариантах осуществления геном не содержит ДНК rep и cap AAV, то есть между ITR генома отсутствует ДНК rep или cap AAV. Предусматриваемые полипептиды SMN включают без ограничения полипептид SMN1 человека, изложенный в базе данных белков NCBI под номером NP_000335.1. В вариантах осуществления ДНК SMN содержит полинуклеотид, который кодирует полипептид SMN человека (например, белок SMN человека, идентифицированный номером доступа в Uniprot Q16637, изоформа 1 (Q16637-1)). Также предусматривается полипептид пластин-3 (PLS3), являющийся модификатором SMN1 [Oprea et al., Science 320(5875): 524-527 (2008)]. Последовательности, кодирующие другие полипептиды, можно использовать вместо ДНК SMN.

Фармацевтические композиции

[71] В различных вариантах осуществления вирусные частицы по настоящему изобретению (упоминаемые как вирусные частицы) могут обеспечиваться в фармацевтических композициях, подходящих для интратекального введения. Композиции могут обеспечиваться в виде составов, содержащих один или несколько неактивных ингредиентов и/или один или несколько дополнительных активных ингредиентов в дополнение к вирусным частицам. В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в виде составов, подходящих для интратекального введения субъекту-млекопитающему, например человеку, с использованием компонентов и методик, известных в данной области техники.

[72] В некоторых вариантах осуществления фармацевтический состав содержит: (а) вирусный вектор на основе AAV9, содержащий полинуклеотид, кодирующий белок фактора выживания мотонейронов (SMN), (b) Tris-буфер, (c) хлорид магния, (d) хлорид натрия и (e) полоксамер (например, полоксамер 188), где фармацевтическая композиция не содержит консервант. В одном варианте осуществления состава вирусный вектор на основе AAV9 дополнительно содержит модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16s SV40, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2. В одном варианте осуществления состава концентрация Tris-буфера составляет приблизительно 10-30 нМ, например приблизительно 20 мМ. В одном варианте осуществления pH состава составляет от приблизительно 7,7 до приблизительно 8,3, например приблизительно pH 8,0 (например, как измерено в соответствии с USP <791> (включенной посредством ссылки во всей своей полноте)). В одном варианте осуществления состава концентрация хлорида магния составляет приблизительно 0,5-1,5 мМ, например приблизительно 1 мМ. В одном варианте осуществления состава концентрация хлорида натрия составляет приблизительно 100-300 мМ, например приблизительно 200 мМ. В одном варианте осуществления состав содержит приблизительно 0,001-0,15% вес/объем полоксамера 188, например приблизительно 0,005% вес/объем полоксамера 188. В некоторых вариантах осуществления состав содержит приблизительно 1-8×10¹³ vg/мл, например приблизительно 1,9-4,2×10¹³ vg/мл вирусного вектора на основе AAV9. В некоторых вариантах осуществления состав содержит приблизительно 1-8×10¹³ vg/мл, и вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав содержит приблизительно 1,9-4,2×10¹³ vg/мл, и вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав содержит приблизительно 1-8×10¹³ vg/мл, и вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав содержит приблизительно 1,9-4,2×10¹³ vg/мл, и вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав содержит приблизительно 1-8×10¹³ vg/мл, и вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав содержит приблизительно 1,9-4,2×10¹³ vg/мл, и вирусный вектор на основе AAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[73] При составлении в виде раствора или суспензии система доставки может содержать приемлемый носитель, например водный носитель. Могут использоваться различные водные носители, например, вода, забуференная вода и/или солевой раствор. Состав также может содержать регулирующие тоничность средства, которые делают раствор изоосмотическим или изотоническим, например, NaCl, сахара, маннит и т. п. Состав также может содержать поверхностно-активные вещества для стабилизации композиции в отношении границ раздела фаз и напряжения сдвига, например полисорбат 20, полисорбат 80 и т. п. Состав может быть забуферен для поддержания оптимального pH и стабильности, например, с использованием ацетатного, сукцинатного, цитратного, гистидинового, фосфатного или Tris-буфера и т. п. Эти композиции можно стерилизовать с использованием методик стерилизации или можно проводить стерилизацию фильтрацией. Полученные водные растворы могут быть упакованы для применения в исходном состоянии или подвергнуты лиофилизации, при этом перед введением лиофилизированный препарат объединяют со стерильным раствором.

[74] Композиции, например фармацевтические композиции, могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, чтобы приблизиться к физиологическим показателям, например, средства для регулирования pH и буферные средства, средства для регулирования тоничности, смачивающие средства и т. п., например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат, триэтаноламинолеат и т. д. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит консервант. В некоторых других вариантах осуществления фармацевтическая композиция не содержит консервант.

[75] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция необязательно также содержит один или несколько дополнительных активных или неактивных компонентов, например контрастное средство (например, Omnipaque™ 180). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит вирусный вектор, содержащий полинуклеотид SMN, раскрытый в данном документе, а также содержит контрастное средство (например, Omnipaque™ или йогексол-содержащее средство). В некоторых таких вариантах осуществления контрастное средство предварительно смешивают с фармацевтической композицией. В некоторых других вариантах осуществления контрастное средство предварительно не смешивают с фармацевтической композицией. В некоторых вариантах осуществления контрастное средство смешивают с фармацевтической композицией непосредственно перед интратекальным введением. В некоторых вариантах осуществления контрастное средство (например, Omnipaque™, йогексол и т. п.) усиливает трансдукцию мотонейронов. В некоторых вариантах осуществления контрастное средство (например, Omnipaque™, йогексол и т. п.) помогает направлять интратекальную иглу в субарахноидальное пространство.

[76] В некоторых вариантах осуществления контрастную среду вводят в комбинации с вирусным вектором, содержащим полинуклеотид SMN, раскрытый в данном документе, где контрастную среду предварительно не смешивают или не составляют совместно с вирусным вектором перед введением. Например, в некоторых вариантах осуществления контрастную среду и вирусный вектор, содержащий полинуклеотид SMN, раскрытый в данном документе, вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления контрастную среду смешивают с вирусным вектором, содержащим полинуклеотид SMN, непосредственно перед введением в виде одного болюса.

[77] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть получена и очищена в соответствии со способами, известными в данной области техники, например описанными в PCT/US2018/058744, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит менее приблизительно 7% пустых капсидов (например, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% пустых капсидов или меньше или любое процентное содержание между этими значениями), например, при оценке с помощью, например, qPCR или ddPCR. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция характеризуется одним или несколькими из следующих отличительных признаков чистоты: содержит менее 0,09 нг бензоназы на 1,0×10¹³ vg, менее 30 мкг/г (ppm) цезия, приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188, менее 0,22 нг BSA на 1,0×10¹³ vg, менее 6,8×10⁵ пг остаточной плазмидной ДНК на 1,0×10¹³ vg, менее 1,1×10⁵ пг остаточной hcDNA на 1,0×10¹³ vg и менее 4 нг rHCP на 1,0×10¹³ vg.

[78] В различных вариантах осуществления фармацевтическая композиция сохраняет эффективность в диапазоне +/-20%, в диапазоне +/-15%, в диапазоне +/-10% или в диапазоне +/-5% от эталонного стандарта. В одном варианте осуществления эффективность оценивают относительно эталонного стандарта с использованием способов, описанных в Foust et al., Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274 (2010). Можно использовать любой подходящий эталонный стандарт. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция характеризуется эффективностью in vivo, как было протестировано на мышах SMAΔ7. В одном варианте осуществления тестируемая мышь, получившая дозу 7,5×10¹³ vg/кг, характеризовалась медианой выживаемости, составившей более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция характеризуется эффективностью, составляющей 50-150%, 60-140% или 70-130% от эталонного стандарта и/или подходящего контроля, при тестировании с помощью клеточного анализа in vitro.

[79] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит вирусные векторы на основе rAAV в концентрации от приблизительно 1×10¹³ vg/мл до 1×10¹⁵ vg/мл, например в диапазоне приблизительно 1-8×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV (например, AAV9)/мл в фармацевтической композиции являются функциональными. В некоторых вариантах осуществления остаточная плазмидная ДНК в фармацевтической композиции составляет 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1 X 10¹³ vg/мл или меньше. В некоторых вариантах осуществления концентрация бензоназы в фармацевтической композиции составляет менее 0,2 нг на 1,0×10¹³vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления концентрация бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фармацевтической композиции составляет менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления уровни эндотоксина в фармацевтической композиции составляют менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация цезия в фармацевтической композиции составляет менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm). В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция характеризуется pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция характеризуется осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция характеризуется инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰МЕ на 1,0 x10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция характеризуется относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля. В некоторых вариантах осуществления уровни общего белка в фармацевтической композиции составляют приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция характеризуется эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция соответствует требованиям комбинации из одного или нескольких (например, всех) предыдущих критериев.

[80] В данном документе в настоящем изобретении также предусмотрен набор для лечения SMA, например SMA II типа или III типа, у пациента, нуждающегося в этом, где набор содержит одну или несколько доз фармацевтической композиции, раскрытой в данном документе, например фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество или дозу вирусного вектора, содержащего полинуклеотид SMN, описанный в данном документе, и необязательно также содержащую один или несколько дополнительных активных или неактивных компонентов, например контрастное средство (например, Omnipaque™ 180), и инструкции по применению фармацевтического препарата или композиции. В некоторых вариантах осуществления набор содержит одну или несколько доз фармацевтической композиции, описанной в данном документе, например, фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество или дозу вирусного вектора, содержащего полинуклеотид SMN, описанный в данном документе, а также необязательно содержащую контрастное средство (например, Omnipaque™ или йогексол-содержащее средство).

[81] В некоторых вариантах осуществления набор содержит контрастное средство, предварительно смешанное в том же контейнере, что и фармацевтическая композиция. В некоторых вариантах осуществления набор содержит контрастное средство, обеспечиваемое в одном или нескольких контейнерах в наборе, и фармацевтическую композицию, обеспечиваемую в одном или нескольких дополнительных контейнерах. В некоторых вариантах осуществления контрастное средство смешивают с фармацевтической композицией перед интратекальным введением.

[82] В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько флаконов с фармацевтической композицией на основе вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон содержит фармацевтическую композицию на основе вирусного вектора в дозе (например, стандартной дозе), составляющей до или приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон с вирусным вектором (например, каждая стандартная доза) набора содержит фармацевтическую композицию в дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон с вирусным вектором (например, каждая стандартная доза) набора содержит фармацевтическую композицию в дозе, составляющей до или приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон с вирусным вектором (например, каждая стандартная доза) набора содержит фармацевтическую композицию в дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон с вирусным вектором (например, каждая стандартная доза) набора содержит фармацевтическую композицию в дозе, составляющей до или приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон с вирусным вектором (например, каждая стандартная доза) набора содержит фармацевтическую композицию в дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления концентрация фармацевтической композиции на основе вирусного вектора составляет приблизительно 0,1-5,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон содержит одну дозу вирусного вектора на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон содержит более одной дозы вирусного вектора на основе rAAV. В некоторых вариантах осуществления каждый флакон содержит менее одной дозы вирусного вектора на основе rAAV.

Пути применения вирусного вектора на основе rAAV9

[83] В различных вариантах осуществления в данном документе раскрыты способы доставки полинуклеотида пациенту, нуждающемуся в лечении SMA, например SMA II или III типа, включающие введение rAAV9 с геномом, содержащим полинуклеотид SMN в rAAV. В некоторых вариантах осуществления доставка представляет собой интратекальную доставку в центральную нервную систему пациента, предусматривающую введение rAAV9, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят с контрастным средством. В некоторых таких вариантах осуществления rAAV9 и контрастное средство вводят одновременно, например, в одной фармацевтической композиции. В других таких вариантах осуществления rAAV9 и контрастное средство вводят последовательно. Например, в некоторых вариантах осуществления сначала вводят контрастную среду, а rAAV9 вводят после введения контрастной среды. В некоторых вариантах осуществления сначала вводят rAAV9, а контрастную среду вводят после введения вирусного вектора на основе AAV9. В вариантах осуществления, где вирусный вектор на основе AAV9 и контрастную среду вводят последовательно, введение вирусного вектора на основе AAV9 и контрастной среды может осуществляться в пределах, например, приблизительно 2 часов, в пределах 1 часа, в пределах 45 минут, в пределах 30 минут, в пределах 15 минут, в пределах 10 минут или в пределах 5 минут друг от друга. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из контрастного средства и rAAV9 вводят интратекально. В некоторых вариантах осуществления как контрастное средство, так и rAAV9 (независимо от того, вводят ли их одновременно или последовательно) вводят интратекально.

[84] В некоторых вариантах осуществления контрастное средство представляет собой неионогенное низкоосмолярное контрастное средство. В некоторых вариантах осуществления контрастное средство может усиливать трансдукцию клеток-мишеней в центральной нервной системе пациента. В некоторых вариантах осуществления контрастное средство может помогать нацеливать доставку непосредственно в субарахноидальное пространство. В некоторых вариантах осуществления геном rAAV9 представляет собой самокомплементарный геном. В других вариантах осуществления геном rAAV9 представляет собой однонитевой геном.

[85] В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV доставляется интратекально в позвоночный канал или субарахноидальное пространство, за счет чего он достигает спинномозговой жидкости (CSF). В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV может диффундировать в пределах CSF в области, отдаленные от места доставки. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV доставляется в область головного мозга. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV доставляется в моторную кору и/или ствол головного мозга. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV доставляется в спинной мозг. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV доставляется в нижний мотонейрон. В вариантах осуществления настоящего изобретения rAAV9 используется для доставки вирусного вектора на основе rAAV в нервные и клетки глии. В некоторых вариантах осуществления клетка глии представляет собой клетку микроглии, олигодендроцит или астроцит. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 используется для доставки вирусного вектора на основе rAAV в шванновскую клетку.

[86] Титры подлежащего введению вирусного вектора на основе rAAV могут варьироваться в зависимости, например, от конкретного rAAV, способа введения, цели лечения, возраста и других характеристик индивидуума, подвергаемого лечению, а также типа(-ов) клеток, подлежащих нацеливанию Титр можно определять с помощью известных способов. Титры rAAV могут находиться в диапазоне от приблизительно 1×10⁶, приблизительно 1×10⁷, приблизительно 1×10⁸, приблизительно 1×10⁹, приблизительно 1×10¹⁰, приблизительно 1×10¹¹, приблизительно 1×10¹², приблизительно 1×10¹³, приблизительно 1×10¹⁴, приблизительно 1×10¹⁵, или более устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) на мл. Дозировки также могут быть выражены в единицах векторных геномов (vg). Геномный титр можно определить с применением ddPCR, как описано в настоящей заявке, в Lock et al., или с помощью любых других способов, известных в данной области техники. Дозировки также могут варьироваться, исходя из времени введения человеку. Данные дозировки rAAV могут варьироваться от приблизительно 1×10¹¹ vg/кг, приблизительно 1×10¹² vg/кг, приблизительно 1×10¹³ vg/кг, приблизительно 1×10¹⁴ vg/кг, приблизительно 1×10¹⁵ vg/кг, приблизительно 1×10¹⁶ vg/кг или более векторных геномов на килограмм массы тела у взрослого или новорожденного.

[87] В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей от 1,0×10¹³ vg до 9,9×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей от 5,0×10¹³ vg до 3,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей до 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей до 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей вплоть до 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[88] В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 9,9×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 5,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей от приблизительно 5,0×10¹³ vg до 3,0×10¹⁴ vg.

[89] В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[90] Дозу можно определять с помощью любого подходящего способа. Например, ПЦР с праймерами, специфическими в отношении вирусного вектора, может обеспечивать относительные измерения, тогда как qPCR может использоваться для меньших образцов и абсолютных измерений. В некоторых вариантах осуществления используется ddPCR. ddPCR представляет собой способ осуществления цифровой PCR, который основан на технологии с образованием капель в водно-масляной эмульсии. Baker et al., "Digital PCR hits its stride." Nature Methods, 9(6):541-544. Sykes et al., "Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution." Biotechniques, 13(3)444-449. Образец фракционируют на десятки тысяч капель, и ПЦР-амплификация молекул-матриц происходит в каждой отдельной капле. Отсутствует обязательная необходимость в построении стандартной кривую или наличии праймеров с высокой эффективностью амплификации, следовательно в ddPCR, как правило, не используется такое количество образца, как в традиционных методиках на основе ПЦР. Примеры коммерчески доступных устройств для ddPCR включают без ограничения устройство для ddPCR BioRad QX100 и систему для цифровой ПЦР RainDance Raindrop. В одном варианте осуществления дозу определяются с применением ПЦР. В другом варианте осуществления дозу определяются с применением qPCR. В другом варианте осуществления дозу определяются с применением цифровой капельной ПЦР (ddPCR). В некоторых вариантах осуществления применяют несколько способов. В некоторых вариантах осуществления с помощью способов на основе ПЦР выявляют и количественно определяют инкапсидированный вирусный геном AAV9 с применением специально разработанных праймеров и зондов, нацеленных на ген SMN. В других вариантах осуществления с помощью способов на основе ПЦР выявляют и количественно определяют инкапсидированный вирусный геном AAV9 с применением специально разработанных праймеров и зондов, нацеленных на промотор гена бета-актина курицы. В других вариантах осуществления с помощью способов на основе ПЦР выявляют и количественно определяют инкапсидированный вирусный геном AAV9 с применением специально разработанных праймеров и зондов, нацеленных на энхансер CMV. В других вариантах осуществления с помощью способов на основе ПЦР выявляют и количественно определяют инкапсидированный вирусный геном AAV9 с применением специально разработанных праймеров и зондов, нацеленных на последовательности ITR. В других вариантах осуществления с помощью способов на основе ПЦР выявляют и количественно определяют инкапсидированный вирусный геном AAV9 с применением специально разработанных праймеров и зондов, нацеленных на сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. В некоторых вариантах осуществления эффективность измеряют с применением подходящего клеточного анализа in vitro или животной модели in vivo. Например, эффективность или % функциональных вирусных частиц AAV с SMN можно определить с применением животной модели SMA, например, мыши с SMNΔ7, или количественного клеточного анализа с применением подходящей линии клеток, например, первичных нервных клеток-предшественников (NPC), выделенных из коры мышей SMAΔ7. В одном варианте осуществления эффективность оценивают в сравнении с эталонным стандартом с применением способов, описанных в Foust et al., Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274 (2010). Можно использовать любой подходящий эталонный стандарт. Кроме того, иллюстративные способы определения дозы, чистоты и процентного содержания функциональных вирусных векторов среди вирусных векторов на основе rAAV, раскрытых в данном документе, также представлены в раскрытии PCT/US2018/058744, включенного в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[91] Состав, содержащий вирусный вектор на основе rAAV, подлежащий введению, может варьироваться в зависимости, например, от способа интратекального введения, объема дозы и фармацевтического вспомогательного вещества. Grouls et al, "General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery." Spinal Drug Delivery, Chapter 15, Elsevier Science, Yaksh edition. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV можно вводить в терапевтическом составе, подходящем для интратекального введения. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV можно вводить интратекально в виде болюсной инъекции. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV можно вводить интратекально в виде медленной инфузии. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV может быть составлен в виде стерильного изотонического раствора лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV может быть составлен в солевом растворе. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV может быть составлен в искусственной CSF, например, в растворе Elliott's B. В некоторых вариантах осуществления терапевтический состав фильтруют перед введением.

[92] В различных вариантах осуществления способы и материалы, раскрытые в данном документе, показаны для лечения SMA и могут применяться для такого лечения, например, путем интратекального введения пациенту, у которого отсутствует функциональная копия SMN1. У человека также имеется вторая почти идентичная копия гена SMN, называемая SMN2. Lefebvre et al. "Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene." Cell, 80(1):155-65. Monani et al. "Spinal muscular atrophy: a deficiency in a ubiquitous protein; a motor-neuron specific disease." Neuron, 48(6):885-896. Оба гена SMN1 и SMN2 экспрессируют белок SMN, однако SMN2 содержит трансляционно молчащую мутацию в экзоне 7, что приводит к неэффективному включению экзона 7 в транскрипты SMN2. Таким образом, SMN2 продуцирует как полноразмерный белок SMN, так и усеченный вариант SMN без экзона 7, при этом усеченный вариант является преобладающей формой. В результате этого количество функционального полноразмерного белка, продуцируемого за счет SMN2, намного меньше (на 70-90%), чем продуцируемого за счет SMN1. Lorson et al. "A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy." PNAS, 96(11) 6307-6311. Monani et al, "A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2." Hum Mol Genet 8(7):1177-1183. Хотя SMN2 не может полностью компенсировать утрату гена SMN1, пациенты с более легкими формами SMA обычно имеют большее число копий SMN2. Lefebvre et al., "Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy." Nat Genet 16(3):265-269. Park et al., "Spinal muscular atrophy: new and emerging insights from model mice." Curr Neurol Neurosci Rep 10(2):108-117. У более 95% индивидуумов со SMA сохраняется по меньшей мере одна копия гена SMN2. Стоит учитывать, что число копий SMN2 не является единственным фенотипическим модификатором. В частности, сообщалось, что вариант c.859G>C в экзоне 7 гена SMN2 является положительным модификатором заболевания. Пациенты с данной конкретной мутацией характеризуются менее тяжелыми фенотипами заболевания. Prior et al., "A positive modified of spinal muscular atrophy in the SMN2 gene." Am J Hum Genet 85(3):408-413. В некоторых вариантах осуществления rAAV с SMN, раскрытый в данном документе, вводят пациентам со SMA II типа, имеющим более одной копии, более двух копий, более трех копий, более четырех копий или более пяти копий гена SMN2 и/или у которых отсутствует вариант c.859G>C в экзоне 7 гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления rAAV с SMN, раскрытый в данном документе, вводят пациентам со SMA III типа, имеющим более двух копий, более трех копий, более четырех копий или более пяти копий гена SMN2 и/или у которых отсутствует вариант c.859G>C в экзоне 7 гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления rAAV с SMN, раскрытый в данном документе, вводят интратекально пациентам со SMA II типа. В некоторых вариантах осуществления rAAV с SMN, раскрытый в данном документе, вводят интратекально пациентам со SMA III типа.

[93] SMA I типа (также называемая младенческой формой или болезнью Верднига-Гоффмана) представляет собой форму, при которой симптомы SMA присутствуют при рождении или в возрасте до 6 месяцев. При этом типе младенцы, как правило, имеют низкий мышечный тонус (гипотонию), слабый плач и затрудненное дыхание. У них зачастую возникают трудности с глотанием и сосанием, и они не достигают тех показателей развития ребенка, когда он может сидеть без посторонней помощи. У них зачастую проявляется один или несколько симптомов SMA, выбранных из гипотонии, задержки развития моторных навыков, плохого удержания головы, круглого положения плеч и гиперподвижности суставов. Как правило, у эти младенцев имеется две копии гена SMN2, по одной на каждой хромосоме 5. Более половины всех новых случаев SMA представляют собой SMA I типа. При SMA I типа приблизительно 80% пациентов имеют 1 или 2 копии гена SMN2.

[94] SMA II типа или промежуточная форма представляет собой форму, при которой SMA начинается в возрасте от 7 до 18 месяцев и прежде чем ребенок сможет самостоятельно стоять или ходить. Дети со SMA II типа обычно имеют по меньшей мере три гена SMN2, и приблизительно 82% пациентов со SMA II типа имеют 3 копии генов SMN2. SMA с поздним началом (также известная как SMA III и IV типа, легкая SMA, SMA взрослых и болезнь Кугельберга-Веландер) приводит к различным уровням слабости. SMA III типа начинается после 18 месяцев, и дети могут самостоятельно стоять и ходить, хотя им может требоваться помощь. Среди пациентов со SMA III типа приблизительно 96% имеют 3 или 4 копии генов SMN2. SMA IV типа начинается во взрослом возрасте, и люди обладают способностью к ходьбе на протяжении своего зрелого возраста. Люди со SMA III или IV типа обычно имеют от четырех до восьми генов SMN2, за счет которых может продуцироваться значительное количество полноразмерного белка SMN.

[95] В одном варианте осуществления rAAV, например векторы на основе rAAV9, раскрытые в данном документе, можно вводить интратекально для лечения SMA, например SMA II типа или III типа. Термины "лечить", "лечение" и другие родственные формы данного термина подразумевают стадию введения, например интратекально, эффективной дозы или множественных эффективных доз композиции, содержащей rAAV, раскрытого в данном документе, животному (включая человека), нуждающемуся в этом. Если дозу вводят до начала симптомов нарушения/заболевания, то введение является профилактическим. Если дозу вводят после развития нарушения/заболевания, то введение является терапевтическим. В вариантах осуществления эффективная доза представляет собой дозу, которая частично или полностью облегчает (т. е. устраняет или уменьшает) по меньшей мере один симптом, ассоциированный с нарушением/болезненным состоянием, подлежащими лечению, которая замедляет или предупреждает прогрессирование до нарушения/болезненного состояния, которая замедляет или предупреждает прогрессирование нарушения/болезненного состояния, которая снижает стадию заболевания, которая приводит к ремиссии (частичной или полной) заболевания и/или которая продлевает выживание. В данном документе изложены примеры болезненных состояний, предполагаемых для лечения.

[96] В одном варианте осуществления композицию на основе rAAV9 по настоящему изобретению вводят интратекально пациенту, нуждающемуся в лечении SMA, например SMA II типа или III типа.

[97] В некоторых вариантах осуществления возраст пациента составляет 0-72 месяца. В некоторых вариантах осуществления возраст пациента составляет 6-60 месяцев. В некоторых вариантах осуществления возраст пациента составляет 6-24 месяца. В некоторых вариантах осуществления возраст пациента составляет по меньшей мере 6 месяцев. В некоторых вариантах осуществления возраст пациента составляет более 24 месяцев.

[98] В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется одна или несколько мутаций, например нуль-мутация, в одной копии гена SMN1 (охватывающую любую мутацию, которая делает нефункциональным белок, кодируемый SMN1). В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется одна или несколько мутаций, например нуль-мутация, в двух копиях гена SMN1. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется одна или несколько мутаций, например нуль-мутация, во всех копиях гена SMN1. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется делеция в одной копии гена SMN1. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется делеция в двух копиях гена SMN1. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеются биаллельные мутации в SMN1, то есть либо делеция, либо замена в SMN1 в обоих аллелях хромосомы. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется по меньшей мере одна функциональная копия гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется по меньшей мере две функциональные копии гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется по меньшей мере три функциональные копии гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется по меньшей мере четыре функциональные копии гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеется по меньшей мере пять функциональных копий гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеются биаллельные нуль-мутации или делеции в SMN1 и имеется три копии SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует замена c.859G>C в экзоне 7 по меньшей мере одной копии гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления у пациента имеются биаллельные нуль-мутации или делеции в SMN1, имеются три копии SMN2 и отсутствует замена c.859G>C в экзоне 7 по меньшей мере одной копии гена SMN2. В некоторых вариантах осуществления генетическая последовательность гена SMN1 или SMN2 может быть определена, например, с помощью гибридизации, ПЦР-амплификации и/или частичного или полного секвенирования хромосомы или генома. В других вариантах осуществления генетическая последовательность и число копий гена SMN1 или SMN2 могут быть определены с помощью высокопроизводительного секвенирования. В некоторых вариантах осуществления генетическая последовательность и число копий гена SMN1 или SMN2 могут быть определены с помощью микроматричного анализа. В некоторых вариантах осуществления генетическая последовательность и число копий гена SMN1 или SMN2 могут быть определены с помощью секвенирования по Сэнгеру. В некоторых вариантах осуществления число копий гена SMN1 или SMN2 может быть определено с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

[99] В некоторых вариантах осуществления до лечения у пациента была диагностирована или одновременно диагностируется SMA, например SMA II типа или III типа, например, с помощью геномного теста, и/или теста двигательной функции, и/или физикального обследования. В некоторых вариантах осуществления SMA II типа или III типа диагностируется с помощью клинической оценки симптомов, например, с помощью CHOP INTEND, Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® или Расширенной шкалы оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE). В некоторых вариантах осуществления SMA II или III типа диагностируется при физикальном обследовании. В некоторых вариантах осуществления возраст пациента со SMA II типа, подлежащего лечению с помощью способов, раскрытых в данном документе, составляет менее 24 месяцев, 22 месяцев, 20 месяцев, 18 месяцев, 16 месяцев, 14 месяцев, 12 месяцев, 10 месяцев, 8 месяцев или 6 месяцев или любое значение между ними, или начало симптомов заболевания проявляется до этих моментов времени. В некоторых вариантах осуществления возраст пациента со SMA III типа, подлежащего лечению с помощью описанных в данном документе способов, составляет больше 12 месяцев, 14 месяцев, 16 месяцев, 18 месяцев, 20 месяцев, 22 месяцев или 24 месяцев или любое значение между ними, или начало симптомов заболевания проявляется после этих моментов времени В некоторых вариантах осуществления пациентов подвергают лечению до того, как у них появятся симптомы SMA II типа или III типа (например, один или несколько симптомов), и вместо этого то что пациент нуждается в лечении, определяют, например, с применением одного из генетических тестов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления пациентов подвергают лечению после того, как у них проявятся симптомы SMA II типа или III типа (например, один или несколько симптомов), например, как определенно с применением одного из тестов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления пациентов подвергают лечению до того, как у них проявятся симптомы SMA II типа или III типа. В некоторых вариантах осуществления SMA II типа или III типа диагностируют у пациентов на основании генетического тестирования до того, как у них появятся симптомы.

[100] В некоторых вариантах осуществления у пациента проявляется один или несколько симптомов SMA. Симптомы SMA могут включать гипотонию, задержку развития моторных навыков, плохое удержание головы, круглое положение плеч и гиперподвижность суставов. В некоторых вариантах осуществления плохое удержание головы определяют путем помещения пациента в положение сидя в позе "бабочки" с поддержкой на уровне плеч (спереди и сзади). Удержание головы оценивают по способности пациента держать голову в вертикальном положении. В некоторых вариантах осуществления наблюдают спонтанные движения, когда пациент находится в положении лежа на спине, и моторные навыки оценивают по способности пациента отрывать его локти, колени, руки и ноги от поверхности. В некоторых вариантах осуществления силу захвата пациента измеряют путем помещения пальца в ладонь пациента и подъема пациента до тех пор, пока его плечи не оторвутся от поверхности. Гипотонию и сила захвата измеряют по тому, насколько недолго/долго пациент сохраняет хватку. В некоторых вариантах осуществления удержание головы оценивают путем помещения головы пациента в положение максимально возможного поворота и измерения способности пациента повернуть голову обратно к срединной линии. В некоторых вариантах осуществления положение плеч можно оценить путем усаживания пациента с опорой для головы и туловища и наблюдения того, сгибает ли пациент локти или плечи, чтобы дотянуться до стимула, который помещен на уровне плеч на расстоянии вытянутой руки. В некоторых вариантах осуществления положение плеч также можно оценить путем помещения пациента в положение лежа на боку и наблюдения того, сгибает ли пациент локти или плечи, чтобы дотянуться до стимула, который помещен на уровне плеч на расстоянии вытянутой руки. В некоторых вариантах осуществления моторные навыки оценивают путем наблюдения того, сгибают ли пациенты свои бедра или колени, когда их ступни поглаживают, щекочут или щипают. В некоторых вариантах осуществления сгибание плеча, сгибание локтя, приведение бедра, сгибание шеи, разгибание головы, разгибание шеи и/или изгиб позвоночника можно оценивать с помощью известных клинических исследований, например CHOP INTEND. Другие симптомы SMA можно оценить с помощью известных клинических показателей, например, CHOP INTEND.

[101] В некоторых вариантах осуществления у пациента проявляется способность сидеть, но не ходить. В некоторых вариантах осуществления у пациента проявляется способность сидеть без посторонней помощи в течение 10 секунд или больше, но он не может стоять или ходить. В некоторых вариантах осуществления у пациента проявляется способность сидеть без посторонней помощи с поднятой головой в течение 10 секунд или больше, но он не может ходить или стоять. В некоторых вариантах осуществления у пациента проявляется способность сидеть без посторонней помощи, как определено согласно критериям Многоцентрового исследования по разработке справочных показателей роста Всемирной организации здравоохранения (WHO-MGRS).

[102] Не ограничиваясь какой-либо теорией, интратекальное введение может позволить лекарственным средствам обойти гематоэнцефалический барьер. Вследствие этого, в случае лекарственных средств, мишенью которых является центральная нервная система, прямая доставка путем интратекального введения может позволить снизить общую дозу и/или объем необходимой фармацевтической композиции (например, по сравнению с внутривенным введением), тем самым снижая риск гепатотоксичности. Кроме того, прямая доставка в субарахноидальное пространство может обеспечить более высокую эффективность трансдукции клеток центральной нервной системы, например нижних мотонейронов, клеток глии и т. п. Объем спинномозговой жидкости (CSF) в субарахноидальном пространстве может влиять на эффективную концентрацию дозы, выбранную для интратекальной доставки. Поскольку объем CSF у человека остается относительно постоянным после возраста приблизительно 3 года, дозу для пациента можно легче и единообразнее контролировать у разных пациентов. В некоторых вариантах осуществления интратекальное введение применяют для прохода через гематоэнцефалический барьер. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV9, раскрытый в данном документе, доставляется интратекально пациенту, нуждающемуся в этом, например, который идентифицирован как нуждающийся в лечении SMA II типа или III типа. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят инъекцией в позвоночный канал. В некоторых вариантах осуществления rAAV9 вводят инъекцией в субарахноидальное пространство. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV9 вводят инъекцией в стерильных условиях в палате детского отделения интенсивной терапии или других подходящих условиях (например, в блоке для интервенционных вмешательств, операционной, специальной процедурной комнате) с немедленным доступом к неотложной помощи в критических состояниях. В некоторых вариантах осуществления жизненно важные органы пациента контролируют через приблизительно 15 ± 5 минут в течение 4 часов и через час ± 15 минут в течение 24 часов после введения вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV9 не содержит консервант. В некоторых вариантах осуществления перед введением вирусного вектора на основе rAAV9 пациентам проводят седацию или вводят анестезию. В некоторых вариантах осуществления интратекальное введение вирусного вектора на основе rAAV9 можно проводить пациентам, помещенным в положение лежа на животе, коленно-грудное положение, боковое положение, положение Симса или положение лежа на боку. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV9 вводят в шприце или катетере. В некоторых вариантах осуществления катетер может быть введен в субарахноидальное пространство в межостистом промежутке L1-L2, L2-L3, L3-L4 или L4-L5. В некоторых вариантах осуществления выполняют люмбальную пункцию с забором до 10 мл, до 9 мл, до 8 мл, до 7 мл, до 6 мл, до 5 мл, до 4 мл, до 3 мл, до 2 мл или до 1 мл спинномозговой жидкости. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV9 вводят инъекций непосредственно в субарахноидальное пространство. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор на основе rAAV9 предварительно смешивают с подходящим ренгенографическим контрастным раствором (например, метризамидом, йопамидолом, йогексолом, йоверсолом, Omnipaque™ и т. д.) и вводят инъекцией непосредственно в субарахноидальное пространство. В некоторых вариантах осуществления контрастный раствор (например, метризамид, йопамидол, йогексол, йоверсол, Omnipaque™ и т. д.) вводят интратекально перед интратекальным введением вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления контрастный раствор вводят интратекально в пределах 2 часов, в пределах 1 часа, в пределах 45 минут, в пределах 30 минут, в пределах 15 минут, в пределах 10 минут или в пределах 5 минут до интратекального введения вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления контрастный раствор (например, метризамид, йопамидол, йогексол, йоверсол, Omnipaque™ и т. д.) вводят интратекально после интратекального введения вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления контрастный раствор вводят интратекально в пределах 2 часов, в пределах 1 часа, в пределах 45 минут, в пределах 30 минут, в пределах 15 минут, в пределах 10 минут или в пределах 5 минут после интратекального введения вирусного вектора на основе rAAV9.

[103] В некоторых вариантах осуществления объем вводимого контрастного средства составляет до приблизительно 0,5 мл, до приблизительно 1,0 мл, до приблизительно 1,5 мл, до приблизительно 2,0 мл или до приблизительно 2,5 мл. В некоторых вариантах осуществления общий вводимый объем (вирусный вектор на основе rAAV9 и контрастное средство) составляет не более приблизительно 5 мл, не более приблизительно 6 мл, не более приблизительно 7 мл, не более приблизительно 8 мл, не более приблизительно 9 мл или не более приблизительно 10 мл. В некоторых вариантах осуществления пациента помещают в другое положение после введения вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления пациента помещают в положение Тренделенбурга или в наклоненное положение с головой вниз под углом 20-40°, например 30°, после введения вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления пациента помещают в положение Тренделенбурга или в наклоненное положение с головой вниз под углом 30° на 10-30 минут, например приблизительно 15 минут, после введения вирусного вектора на основе rAAV9.

[104] В некоторых вариантах осуществления лечение является эффективным для предупреждения, уменьшения, облегчения, замедления и/или частичного или полного обращения развития одного или нескольких симптомов SMA, например SMA II типа или III типа. Эффективность способа лечения можно определить с применением различных тестов на моторные навыки до и после лечения. В частности, Шкала оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® представляет собой стандартную серию измерений, используемых для оценки развития младенцев и детей малого возраста. Bayley N. "Bayley Scales of Infant and Toddler Development." 3^rd edition, Harcourt Assessment Inc., 2006. В частности, компонент Шкала моторного развития в версии III (третье издание) Шкал Бейли® измеряет навыки крупной и мелкой моторики, такие как хватание, сидение, складывание башенки из кубиков и подъем по лестнице. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, сжаты ли его руки в кулаки большую часть времени. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, следят ли его глаза за движущимся человеком. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, пытается ли он/она намеренно положить свою руку в рот. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, держит ли он/она свои руки разжатыми большую часть времени, когда он/она не пытается выполнить задание. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, может ли он/она свободно поворачивать свое запястье из положения ладонью вниз в положение ладонью вверх при манипулировании небольшим предметом. В некоторых вариантах осуществления пациенту дают кубики и оценивают на предмет того, берет ли пациент кубики с использованием одной или двух рук, перекладывает ли кубик из руки в руку, захватывает ли кубик подушечкой большого пальца или кончиком пальца, и захватывает ли пациент кубик большим пальцем, частично противопоставленным другим пальцам. В некоторых вариантах осуществления пациенту дают еду в гранулах и оценивают, захватывает ли он/она кубик подушечкой большого пальца или кончиком пальца, и захватывает ли пациент кубик большим пальцем, частично противопоставленным другим пальцам. В некоторых вариантах осуществления пациенту дают книгу и оценивают на предмет того, пытается ли пациент перевернуть страницу или несколько страниц одновременно. В некоторых вариантах осуществления пациенту дают цветной мелок или карандаш и бумагу и оценивают на предмет того, берет ли пациент цветной мелок или карандаш ладонным хватом, обычным хватом тремя пальцами или хватом четырьмя пальцами при оставлении отметки на бумаге. В дополнительных вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, являются ли его/ее захваты зрелыми, контролируемыми и динамичными при оставлении отметки на бумаге. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, придерживает ли он/она бумагу на месте одной рукой, пока пишет или рисует другой.

[105] В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, делает ли он/она толчки своими руками или ногами несколько раз во время игры. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, может ли он/она периодически поднимать голову без поддержки. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, может ли он/она держать голову поднятой в течение по меньшей мере 3 секунд без поддержки. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, способен ли он/она сделать по меньшей мере 5 шагов с сохранением координации и равновесия. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, способен ли он/она сделать по меньшей мере 5 шагов с сохранением координации и равновесия в соответствии с элементом 43 шкалы Бейли®-III - Крупная моторика. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, имеется ли у него/нее способность стоять без посторонней помощи или опорной поверхности, и характеризуется ли он/она контролем положения тела по типу обратной связи. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают на предмет того, имеется ли у него/нее способность стоять без посторонней помощи в соответствии с элементом 40 Шкалы Бейли®-III - Крупная моторика. В некоторых вариантах осуществления считается, что пациент получил эффективное лечение, если у пациента достигается способность стоять без опоры через приблизительно 24 месяца, 12 месяцев, 9 месяцев или 6 месяцев после введения средства лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что пациент получил эффективное лечение, если у пациента достигается способность ходить без посторонней помощи, как определено при выполнении по меньшей мере пяти шагов самостоятельно, что демонстрирует координацию и равновесие, через приблизительно 24 месяца, 12 месяцев, 9 месяцев или 6 месяцев после введения средства лечения.

[106] Еще одним широко используемым показателем развития младенцев является Расширенная шкала оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE). O'Hagen et al., "An expanded version of the Hammersmith Functional Motor Scale for SMA II and III patients." Neuromuscul Disord, 17(9-10):693-7; Glanzman et al., "Validation of the Expanded Hammersmith Functional Motor Scale in spinal muscular atrophy type II and III." J Child Neurol, 26(12):1499-1507. Хотя Шкала оценки моторных функций больницы Хаммерсмит успешно работала при оценке способностей у индивидуумов со SMA, не способных к самостоятельному передвижению, в HFMSE представлено дополнительное приложение из 13 элементов, которое может успешно различать моторные навыки у индивидуумов со SMA II типа и III типа. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают по его/ее способности сидеть на стуле или на полу без опоры. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают по его/ее способности дотронуться рукой до своей головы, когда он/она сидит без опоры на стуле или на полу. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают по его/ее способности дотронуться обеими руками до своей головы, когда он/она сидит без опоры на стуле или на полу. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она перекатиться на бок в положении лежа. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она перекатиться из положения лицом вверх в положение лицом вниз или наоборот в положении лежа. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она лечь из положения сидя с сохранением контроля. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она приподняться на предплечья в положении лежа на животе. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она поднять голову вверх в положении лежа на животе. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она приподняться на прямые руки при счете до 3 в положении лежа на животе. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она перейти из лежачего в сидячее положение, не перекатываясь на живот. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она встать на руки и колени, удерживая голову поднятой при счете до 3. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она ползти вперед на четвереньках. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она поднять голову, лежа на спине со скрещенными на груди руками. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она стоять при счете до 3, опираясь одной рукой или не опираясь руками. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она ходить без посторонней помощи. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она прижать одно из колен к груди, лежа на спине. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она перейти из стойки на коленях в стойку на одном колене без использования рук. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она перейти в положение стоя из стойки на коленях без использования рук. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она перейти из положения стоя в положение сидя без использования рук. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она перейти из положения стоя в положение на корточках без использования рук. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она прыгнуть вперед на 12 дюймов из положения стоя. В некоторых вариантах осуществления пациента оценивают относительно того, может ли он/она пройти 4 ступеньки вверх или вниз без посторонней помощи или с помощью одного перила. В некоторых вариантах осуществления считается, что пациент получил эффективное лечение, если у пациента наблюдается увеличение оценки по HFMSE, составляющее 5-10 пунктов, например, увеличение, составляющее 8 пунктов, по сравнению с исходным уровнем через приблизительно 24 месяца, 12 месяцев, 9 месяцев или 6 месяцев после введения средства лечения. В некоторых вариантах осуществления считается, что пациент получил эффективное лечение, если у пациента наблюдается увеличение оценки по HFMSE, составляющее 9 пунктов, по сравнению с исходным уровнем через приблизительно 24 месяца, 12 месяцев, 9 месяцев или 6 месяцев после введения средства лечения. В некоторых вариантах осуществления считается, что пациент получил эффективное лечение, если у пациента наблюдается увеличение оценки по HFMSE, составляющее 10 баллов, по сравнению с исходным уровнем через приблизительно 24 месяца, 12 месяцев, 9 месяцев или 6 месяцев после введения средства лечения.

[107] В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения измеряется по изменениям в способностях к развитию. В некоторых вариантах осуществления измерение на исходном уровне проводят перед введением вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления измерение на исходном уровне предусматривает измерение компонентов мелкой и крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®. В некоторых вариантах осуществления измерение на исходном уровне предусматривает измерение элемента 43 (сделать по меньшей мере 5 шагов без посторонней помощи) компонентов крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®. В некоторых вариантах осуществления измерение на исходном уровне предусматривает измерение элемента 40 (стоять без опоры в течение по меньшей мере 3 секунд) компонентов крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®. В некоторых вариантах осуществления измерение на исходном уровне предусматривает проведение оценки пациента в соответствии с Расширенной шкалой оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE). В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения оценивают путем измерения элемента 43 (сделать по меньшей мере 5 шагов без посторонней помощи) компонентов крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® и сравнения с исходным уровнем. В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения оценивают путем измерения элемента 40 (стоять без опоры в течение по меньшей мере 3 секунд) компонентов крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® и сравнения с исходным уровнем. В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения оценивают путем проведения оценки пациента согласно HFMSE и сравнения с исходным уровнем до лечения. В некоторых вариантах осуществления исходный уровень устанавливают за счет измерений в пределах 30 дней до лечения. В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения оценивают в пределах 30 дней после лечения. В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения оценивают один раз в месяц в течение двенадцати месяцев после лечения. В некоторых вариантах осуществления оценки эффективности записывают на видео. В некоторых вариантах осуществления значимые показатели развития моторных навыков оценивают с помощью стандартного исследования показателей развития моторных навыков, показанного в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления эффективность лечения оценивают через по меньшей мере 12 месяцев после, через по меньшей мере 24 месяца после, через по меньшей мере 48 месяцев после, через по меньшей мере 72 месяца после или вплоть до 10 лет после лечения.

Таблица 2. Исследование показателей развития моторных навыков

Показатель развития - номер элемента в Шкале Бейли®	Критерии выполнения
Удержание головы - элемент №4 субтеста Крупная моторика	Ребенок держит голову поднятой в течение по меньшей мере 3 секунд без поддержки
Перекатывается со спины на бок - элемент №20 субтеста Крупная моторика	Ребенок поворачивается со спины и на правый бок, и на левый бок
Сидит без опоры - элемент №26 субтеста Крупная моторика	Ребенок сидит самостоятельно без опоры в течение по меньшей мере 30 секунд
Стоит с поддержкой - элемент №33 субтеста Крупная моторика	Ребенок поддерживает собственный вес в течение по меньшей мере 2 секунд
Ползает - элемент №34 субтеста Крупная моторика	Ребенок продвигается вперед по меньшей мере на 5 футов за счет ползания на четвереньках
Подтягивается, чтобы встать - элемент №35 субтеста Крупная моторика	Ребенок поднимается в положение стоя, используя стул или другой удобный предмет для опоры
Ходит с поддержкой - элемент №37 субтеста Крупная моторика	Ребенок ходит, совершая скоординированные движения в виде чередующихся шагов
Стоит самостоятельно - элемент №40 субтеста Крупная моторика	Ребенок стоит самостоятельно в течение по меньшей мере 3 секунд после того, как вы отпустили его руки
Ходит самостоятельно - элемент №43 субтеста Крупная моторика	Ребенок делает по меньшей мере пять шагов самостоятельно, демонстрируя координацию и равновесие

[108] В некоторых вариантах осуществления тестирование для оценки эффективности лечения не ограничивается Шкалами оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, Расширенной шкалой оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE) или Исследованием показателей развития моторных навыков, но может также включать другие тесты на моторные навыки, известные в данной области техники, включая без ограничения CHOP INTEND, TIMP, CHOP TOSS, Шкалы моторного развития Пибоди, тест оценки поведения новорожденных Бразелтона, оценку способностей хватания посредством интерактивного видео (ACTIVE) и измерения суммарных двигательных потенциалов действия (CMAP).

[109] Также предусматривается предварительный скрининг пациентов, подлежащих лечению, например, в соответствии со способами выявления SMA, например SMA II типа или III типа, раскрытыми в данном документе, а также введение средства лечения пациентам, идентифицированным в соответствии с критериями, раскрытыми в данном документе.

[110] AAV могут вызывать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. Вследствие этого часть потенциальных пациентов для применения генной терапии на основе AAV несут предсуществующие антитела к AAV. Jeune et al., "Pre-existing anti-Adeno-Associated Virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy." Hum Gene Ther Methods, 24(2):59-67. Boutin et al., "Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the healthy population: implications for gene therapy using AAV vectors." Hum Gene Ther, 21:704-712. Поскольку даже очень низкие уровни антител могут предотвращать успешную трансдукцию, предшествующие антитела к AAV являются серьезным препятствием для универсального применения генной терапии на основе AAV. В некоторых вариантах осуществления уровни титров антител к AAV9 определяют у пациента перед введением вирусного вектора на основе AAV, и пациент получает AAV путем интратекального введения, только если титры антител ниже порогового уровня. В некоторых вариантах осуществления уровни титров антител к AAV9 у пациента определяют с помощью иммунологического анализа связывания ELISA. В некоторых вариантах осуществления до введения средства лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют 1:100 или ниже, например, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA. В некоторых вариантах осуществления до введения средства лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют 1:50 или ниже, например, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA. В некоторых вариантах осуществления после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:100, например, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и за ними наблюдают в течение 1-8 недель или до тех пор, пока титры не уменьшатся ниже 1:100. В некоторых вариантах осуществления после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:100, например, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и за ними наблюдают в течение 1-8 недель или до тех пор, пока титры не уменьшатся ниже 1:50.

[111] В некоторых вариантах осуществления пациентам с высоким титром антител к AAV можно вводить одно или несколько иммуносупрессорных лекарственных средств. Например, титры антител к AAV могут снижать моноклональные антитела к CD20, такие как ритуксимаб, в комбинации с циклоспорином А. Mingozzi et al., "Pharmacological modulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV gene transfer for hemophilia B." Mol Ther, 20:1410-1416. В некоторых вариантах осуществления до или после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:100, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и его лечат одним или несколькими иммуносупрессорными лекарственными средствами, например стероидами, такими как преднизолон. В некоторых вариантах осуществления до или после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:50, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и его лечат одним или несколькими иммуносупрессорными лекарственными средствами, например стероидами, такими как преднизолон.

[112] В некоторых вариантах осуществления пациента с высоким титром антител к AAV можно подвергать плазмаферезу для истощения нейтрализующих антител до и/или после введения вектора. Monteilhet et al., "A 10 patient case report on the impact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associated virus (AAV) types 1, 2, 6, and 8." Mol Ther, 19(11):2084-2091. Во время плазмафереза у пациента отбирают кровь, и плазму и клетки крови разделяют посредством либо центрифугирования, либо фильтрации через полые волокна. Затем клетки крови возвращают пациенту вместе с либо обработанной плазмой, либо замещающей жидкостью, такой как 4,5% раствор человеческого альбумина в солевом растворе. Обычно терапевтический аферез используется для удаления нежелательных иммуноглобулинов, таких как антитела к AAV. В некоторых вариантах осуществления до или после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:100, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и пациента лечат с помощью плазмафереза. В некоторых вариантах осуществления до или после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:50, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и пациента лечат с помощью плазмафереза.

[113] Предсуществующие материнские антитела к AAV9 могут передаваться юному пациенту через грудное молоко или через плаценту внутриутробно. В некоторых вариантах осуществления до или после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:100, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и его переводят на кормление смесью. В некоторых вариантах осуществления до или после лечения титры антител к AAV9 у пациента составляют более 1:50, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA, и его переводят на кормление смесью.

[114] Состояние пациента можно отслеживать до и после введения средства лечения. В некоторых вариантах осуществления у пациента, получившего лечение на основе AAV, может наблюдаться низкое количество тромбоцитов или тромбоцитопения, которая представляет собой состояние, характеризующееся особенно низким количеством тромбоцитов. Тромбоцитопению можно обнаружить с помощью общего анализа крови с использованием разбавленного образца крови на гемоцитометре. Тромбоцитопению также можно обнаружить путем просмотра под микроскопом предметного стекла с препаратом крови пациента (мазок крови или мазок периферической крови). Нормальное количество тромбоцитов человека находится в диапазоне от 150000 клеток/мл до приблизительно 450000 клеток/мл.

[115] В некоторых вариантах осуществления до введения количество тромбоцитов у пациента составляет более приблизительно 67000 клеток/мл, или более приблизительно 100000 клеток/мл, или более приблизительно 150000 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления до введения количество тромбоцитов у пациента составляет ниже приблизительно 150000 клеток/мл, или ниже приблизительно 100000 клеток/мл, или ниже приблизительно 67000 клеток/мл, и его отслеживают в течение 1-8 недель или до тех пор, пока количество тромбоцитов не увеличится до более приблизительно 67000 клеток/мл, или более приблизительно 100000 клеток/мл, или более приблизительно 150000 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления, когда после введения вирусного вектора количество тромбоцитов составляет менее приблизительно 67000 клеток/мл, пациента можно лечить с помощью переливания тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора у пациента отсутствует тромбоцитопения. В некоторых вариантах осуществления после введения вирусного вектора у пациента наблюдается тромбоцитопения, и его отслеживают в течение приблизительно 1-8 недель или до тех пор, пока у него не будет отсутствовать тромбоцитопения. В некоторых вариантах осуществления после введения вирусного вектора у пациента наблюдается тромбоцитопения, и его подвергают лечению с помощью переливания тромбоцитов.

[116] Мониторинг состояния пациентов может также включать стандартные анализы крови, которые измеряют уровни одного или нескольких из тромбоцитов, электрофореза сывороточных белков, сывороточной гамма-глутамилтрансферазы (GGT), аспартаттрансаминазы (AST) и аланинаминотрансферазы (ALT), общего билирубина, глюкозы, креатинкиназы (CK), креатинина, азота мочевины крови (BUN), электролитов, щелочной фосфатазы и амилазы. Уровни тропонина I являются общим показателем здоровья сердца, и повышенные уровни отражают повреждение сердца или патологические состояния, связанные с сердцем. В некоторых вариантах осуществления уровни тропонина I отслеживают после введения вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора уровни тропонина I у пациентов могут составлять менее приблизительно 0,3, 0,2, 0,15 или 0,1 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора уровни тропонина I у пациентов могут составлять менее приблизительно 0,176 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления после введения вирусного вектора уровни тропонина I у пациентов могут составлять выше приблизительно 0,176 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления пациентам проводят кардиологический мониторинг после введения вирусного вектора до тех пор, пока уровни тропонина I не станут менее приблизительно 0,176 мкг/мл.

[117] Уровни аспартаттрансаминазы (AST) и аланинаминотрансферазы (ALT), а также общего билирубина являются общим показателем функции печени, в то время как уровень креатинин отслеживает функцию почек. Повышенные уровни AST, ALT или общего билирубина могут указывать на нарушение функции печени. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора у пациента имеется нормальная функция печени. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора уровни печеночной трансаминазы у пациента составляют менее приблизительно 8-40 Ед/л. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора уровень AST или ALT у пациента составляет менее приблизительно 8-40 Ед/л. В некоторых вариантах осуществления уровень гамма-глутамилтрансферазы (GGT) у пациента в менее чем 3 раза превышает верхний предел нормы, например, как определено с помощью клинических стандартов и способов, известных в данной области техники, например стандартов CLIA. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора уровень билирубина у пациента составляет менее приблизительно 3,0 мг/дл. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора уровни креатинина у пациентов составляют менее 1,8 мг/дл, менее 1,4 мг/дл или менее 1,0 мг/дл. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора уровни гемоглобина (Hgb) у пациентов составляют 8-18 г/дл. В некоторых вариантах осуществления до введения вирусного вектора количество лейкоцитов (WBC) у пациента составляет менее 20000 на мм³.

[118] В различных вариантах осуществления генная терапия с использованием векторов на основе AAV, описанных в данном документе, может приводить к антиген-специфическому Т-клеточному ответу на вектор на основе AAV, например, в течение 2-4 недель после переноса гена. Одним из возможных последствий такого антиген-специфического Т-клеточного ответа является клиренс трансдуцированных клеток и утрата экспрессии трансгена. В попытке ослабить иммунный ответ хозяина на терапию, основанную на AAV, пациенты могут получать иммуносупрессоры. В некоторых вариантах осуществления Т-клеточный ответ можно измерить с помощью анализа ELISPOT. В некоторых вариантах осуществления перед введением вектора Т-клеточный ответ составляет 100 пятнообразующих клеток (SFC) на 10⁶ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). В некоторых вариантах осуществления пациенты могут получать глюкокортикоиды перед введением вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления пациенты могут получать кортикостероид перед введением вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления пациенты могут получать пероральный стероид перед введением вирусного вектора. Примеры пероральных стероидов включают без ограничения преднизон, преднизолон, метилпреднизолон, триамцинолон, бетаметазон, дексаметазон и гидрокортизон. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид представляет собой преднизолон или содержит его.

[119] В некоторых вариантах осуществления пациенту начинают профилактическое введение стероида за по меньшей мере 12-48 часов, например, за по меньшей мере 24 часа до введения вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления пациент получает пероральный стероид в течение по меньшей мере 10-60 дней, например, по меньшей мере 30 дней, после введения вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид вводят один раз в день. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид вводят два раза в день. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид назначается в дозе, составляющей приблизительно 0,1-10 мг/кг, например, приблизительно 1 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления пероральный стероид назначается в дозе, составляющей приблизительно 0,1-10 мг/кг/день, например, приблизительно 1 мг/кг/день. В некоторых вариантах осуществления уровни AST и ALT отслеживают после введения вирусного вектора. В таких вариантах осуществления лечение пероральным стероидом осуществляют, когда уровни AST и ALT вдвое превышают верхний предел нормы, например, как определено с помощью клинических стандартов и способов, известных в данной области техники, или составляют более приблизительно 120 МЕ/л. В некоторых вариантах осуществления лечение пероральным стероидом осуществляют в течение более 30 дней и до тех пор, пока уровни AST и ALT вдвое превышают верхний предел нормы, например, как определено с помощью клинических стандартов и способов, известных в данной области техники, или до тех пор, пока уровни превышают приблизительно 120 МЕ/л. В некоторых вариантах осуществления лечение пероральным стероидом осуществляют в течение более 30 дней до тех пор, пока Т-клеточный ответ превышает 100 SFC на 10⁶ PBMC. В некоторых вариантах осуществления лечение пероральным стероидом осуществляют в течение более 30 дней до тех пор, пока Т-клеточный ответ не упадет ниже 100 SFC на 10⁶ PBMC. Во время длительного лечения кортикостероидами надпочечники естественным образом снижают продуцирование кортизола. Если резко прекратить лечение кортикостероидами, организме может испытывать дефицит кортизола. В некоторых вариантах осуществления, когда пациент получает пероральный стероид в течение по меньшей мере 30 дней, дозу стероида снижают медленно по графику. В некоторых вариантах осуществления дозу перорального стероида снижают, когда уровни AST и ALT станут ниже значения, в два раза превышающего верхний предел нормы, например, как определено с помощью клинических стандартов и способов, известных в данной области техники, или приблизительно 120 МЕ/л. В некоторых вариантах осуществления снижение дозы включает ступенчатое снижение до 0,5 мг/кг/день в течение приблизительно 2 недель, а затем до 0,25 мг/кг/день в течение еще приблизительно 2 недель. В некоторых других вариантах осуществления снижение дозы перорального стероида происходит на усмотрение врача. В некоторых вариантах осуществления образцы крови собирают и тестируют на сывороточные антитела к AAV9 с помощью ELISA, на сывороточные антитела к SMN с помощью ELISA или на гамма-интерферон (IFN-g) с помощью ELISpot.

[120] В данном документе также предусмотрены способы отбора пациентов, которые будут получать пользу от лечения, раскрытого в данном документе. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует противопоказание для проведения спинномозговой пункции или интратекального введения средства терапии. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует сколиоз или тяжелый сколиоз, например, определяемые искривлением позвоночника на ≥50°, видимым при рентгенологическом исследовании. В некоторых вариантах осуществления у пациента ранее не проводилась операция или процедура по исправлению сколиоза, и такая операция или процедура не запланирована или не ожидается в пределах 2 лет, в пределах 1 года или в пределах 6 месяцев от введения вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует необходимость в применении инвазивной вспомогательной вентиляции легких или желудочного зонда для кормления. В некоторых вариантах осуществления у пациента в анамнезе отсутствует самостоятельное стояние или ходьба. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует активной вирусной инфекции на момент введения вирусного вектора на основе rAAV9. В дополнительных вариантах осуществления эти вирусные инфекции включают без ограничения вирус иммунодефицита человека (HIV) или положительную серологическую реакцию на вирус гепатита В или С или вирус Зика. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует сопутствующее заболевание, например тяжелая почечная или печеночная недостаточность, известный эпизод судорожного расстройства, сахарный диабет, идиопатическая гипокальциурия или симптоматическая кардиомиопатия. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствуют тяжелые инфекции, не являющиеся легочными инфекциями или инфекциями дыхательных путей (например, пиелонефрит или менингит) в пределах четырех недель от введения вирусного вектора на основе rAAV9. В некоторых вариантах осуществления у пациента в анамнезе отсутствует бактериальный менингит, заболевание головного или спинного мозга. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует известная аллергия или гиперчувствительность к глюкокортикостероидам, например, преднизону или преднизолону, или их вспомогательным веществам. В некоторых вариантах осуществления у пациента отсутствует известная аллергия или гиперчувствительность к йоду или йодсодержащим продуктам. В некоторых вариантах осуществления пациент не принимает одновременно лекарственные средства для лечения миопатии или невропатии. В некоторых вариантах осуществления пациент не получает иммуносупрессорную терапию, плазмаферез, иммуномодуляторы, такие как адалимумаб, в пределах трех месяцев от введения вирусного вектора на основе rAAV9.

[121] В данном документе также предусмотрены виды комбинированной терапии. Используемая в данном документе комбинация включает как одновременное лечение, так и последовательные лечения. Комбинации способов могут включать добавление определенных стандартных средств медицинского лечения (например, рилузол при ALS) и/или комбинации с новыми видами терапии. Например, другие виды терапии SMA, которые можно использовать в раскрытых видах комбинированной терапии, включают антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), которые изменяют связывание с пре-мРНК и изменяют их паттерны сплайсинга. Singh. et al., "A multi-exon-skipping detection assay reveals surprising diversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes." Plos One, 7(11):e49595. В некоторых вариантах осуществления можно использовать нусинерсен (патенты США № 8361977 и US 8980853, включенные в данный документ посредством ссылки). Нусинерсен представляет собой одобренный ASO, который нацеливается на интрон 6, экзон 7 или интрон 7 пре-мРНК SMN2, модулирующий сплайсинг SMN2 для более эффективного продуцирования полноразмерного белка SMN. В некоторых вариантах осуществления способ лечения включает введение вирусного вектора на основе AAV9 в комбинации со средством для усиления мышц. В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ лечения включает введение вирусного вектора на основе AAV9 в комбинации с нейропротектором. В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ лечения включает введение вирусного вектора на основе AAV9 в комбинации с лекарственным средством на основе антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на SMN. В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ лечения включает введение вирусного вектора на основе AAV9 в комбинации с нусинерсеном. В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ лечения включает введение вирусного вектора на основе AAV9 в комбинации с лекарственным средством, ингибирующим миостатин. В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ лечения включает введение вирусного вектора на основе AAV9 в комбинации со стамулумабом. В некоторых вариантах осуществления раскрытый способ лечения включает введение вирусного вектора на основе AAV9 в комбинации с более чем одним дополнительным средством лечения.

[122] Раскрытые в данном документе вирусные векторы на основе rAAV могут быть получены в соответствии со способами получения и очистки, известными в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления способы очистки направлены на удаление загрязняющих веществ, происходящих из клеток-хозяев, и химических веществ, добавленных во время сбора вирусных векторов. В некоторых вариантах осуществления используются способы, раскрытые в PCT/US2018/058744, и данная публикация согласно PCT включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV в концентрации от приблизительно 1×10¹³ vg/мл до 1×10¹⁵ vg/мл, например, в диапазоне приблизительно 1-8×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV в дозе (например, стандартной дозе), составляющей от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 9,9×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV в дозе (например, стандартной дозе), составляющей от приблизительно 1,0×10¹³ vg до 5,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV в дозе (например, стандартной дозе), составляющей от приблизительно 5,0×10¹³ vg до 3,0×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV в дозе (например, стандартной дозе), составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV в дозе (например, стандартной дозе), составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV в дозе (например, стандартной дозе), составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[123] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV (например, AAV9)/мл, которые являются функциональными. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm). В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней.

[124] В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления при выполнении способа получения и/или очистки можно получать вирусные векторы на основе rAAV, которые могут быть составлены для введения и/или которые присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³vg. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления при выполнении способа получения и/или очистки можно получать вирусные векторы на основе rAAV, которые могут быть составлены для введения и/или которые присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления при выполнении способа получения и/или очистки можно получать вирусные векторы на основе rAAV, которые могут быть составлены для введения и/или которые присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

[125] Например, в некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов.

[126] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл, и вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл, и вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл, и вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл.

[127] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл.

[128] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл.

[129] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% функциональных геномов вирусного вектора на основе AAV9/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% функциональных геномов вирусного вектора на основе AAV9/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% функциональных геномов вирусного вектора на основе AAV9/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV (например, rAAV9)/мл являются функциональными. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV (например, rAAV9)/мл являются функциональными. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV, где по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV (например, rAAV9)/мл являются функциональными.

[130] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше.

[131] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg.

[132] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×1014 vg, где вирусные векторы на основе rAAV бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg.

[133] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл.

[134] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm), где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm), где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm), где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm). В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm). В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm).

[135] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188.

[136] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер.

[137] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер.

[138] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3.

[139] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг.

[140] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×108 до 9,0×1010 МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×108 до 8,4×1010 МЕ на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются инфекционным титром, составляющим от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg.

[141] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля.

[142] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg.

[143] В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 6,0×10¹³ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления при выполнении способов получают вирусные векторы на основе rAAV, которые характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней, где вирусные векторы на основе rAAV составлены для введения и/или присутствуют в фармацевтической композиции в стандартной дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней. В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, где вирусные векторы на основе rAAV характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней.

[144] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов; содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл; содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл; содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл; содержат по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV/мл, которые являются функциональными; содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше; содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg; содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg; характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл; содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm); содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188; содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3; характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг; характеризуются инфекционным титром, составляющий от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg; характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней.

[145] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: значение pH составляет приблизительно 7,7-8,3; осмоляльность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг; содержат менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл; инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg; уровни общего белка составляют приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; содержание Pluronic F-68 составляет приблизительно 20-80 ppm; относительная эффективность составляет приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro, где эффективность измеряют относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; эффективность in vivo, определяемая по медиане выживаемости на мышиной модели с SMNΔ7 при дозе 7,5×10¹³ vg/кг, составляет 24 дня больше; содержат менее приблизительно 5% пустых капсидов; общая чистота составляет приблизительно 95% или больше; уровень эндотоксина составляет приблизительно 0,13 ЕЭ/мл или меньше.

[146] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 6,0×10¹³ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: содержат менее приблизительно 0,09 нг бензоназы на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 30 мкг/г (ppm) цезия; содержат приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188; содержат менее приблизительно 0,22 нг BSA на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 6,8×10⁵ пг остаточной плазмидной ДНК на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 1,1×10⁵ пг остаточной hcDNA на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 4 нг rHCP на 1,0×10¹³ vg; значение pH составляет приблизительно 7,7-8,3; осмоляльность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг; содержат менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл; инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg; уровни общего белка составляют приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; относительная эффективность составляет приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro, где эффективность измеряют относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; содержат менее приблизительно 5% пустых капсидов.

[147] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов; содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл; содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл; содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл; содержат по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV/мл, которые являются функциональными; содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше; содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg; содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg; характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл; содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm); содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188; содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3; характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг; характеризуются инфекционным титром, составляющий от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg; характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней.

[148] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: значение pH составляет приблизительно 7,7-8,3; осмоляльность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг; содержат менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл; инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg; уровни общего белка составляют приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; содержание Pluronic F-68 составляет приблизительно 20-80 ppm; относительная эффективность составляет приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro, где эффективность измеряют относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; эффективность in vivo, определяемая по медиане выживаемости на мышиной модели с SMNΔ7 при дозе 7,5×10¹³ vg/кг, составляет 24 дня или больше; содержат менее приблизительно 5% пустых капсидов; общая чистота составляет приблизительно 95% или больше; уровень эндотоксина составляет приблизительно 0,13 ЕЭ/мл или меньше.

[149] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 1,2×10¹⁴ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: содержат менее приблизительно 0,09 нг бензоназы на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 30 мкг/г (ppm) цезия; содержат приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188; содержат менее приблизительно 0,22 нг BSA на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 6,8×10⁵ пг остаточной плазмидной ДНК на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 1,1×10⁵ пг остаточной hcDNA на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 4 нг rHCP на 1,0×10¹³ vg; значение pH составляет приблизительно 7,7-8,3; осмоляльность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг; содержат менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл; инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg; уровни общего белка составляют приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; относительная эффективность составляет приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro, где эффективность измеряют относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; содержат менее приблизительно 5% пустых капсидов.

[150] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: содержат менее приблизительно 10%, менее приблизительно 8%, менее приблизительно 7% или менее приблизительно 5% пустых вирусных капсидов; содержат менее приблизительно 100 нг/мл белка клетки-хозяина на 1×10¹³ vg/мл; содержат менее приблизительно 5×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 1×10⁶ пг/мл, менее приблизительно 7,5×10⁵ пг/мл или менее 6,8×10⁵ пг/мл остаточной ДНК клетки-хозяина (hcDNA) на 1×10¹³ vg/мл; содержат менее приблизительно 10 нг, менее приблизительно 8 нг, менее приблизительно 6 нг или менее приблизительно 4 нг остаточного белка клетки-хозяина (rHCP) на 1,0×10¹³ vg/мл; содержат по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 100% геномов вирусного вектора на основе rAAV/мл, которые являются функциональными; содержат остаточную плазмидную ДНК в количестве, составляющем 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или от 1×10⁵ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл до 1,7×10⁶ пг/мл на 1×10¹³ vg/мл или меньше; содержат бензоназу в концентрациях, составляющих менее 0,2 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,1 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,09 нг на 1,0×10¹³ vg; содержат бычий сывороточный альбумин (BSA) в концентрациях, составляющих менее 0,5 нг на 1,0×10¹³ vg, менее 0,3 нг на 1,0×10¹³ vg или менее 0,22 нг на 1,0×10¹³ vg; характеризуются уровнями эндотоксина, составляющими менее приблизительно 1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,75 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,5 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,4 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,35 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,3 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,25 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,2 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,13 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,1 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл, менее приблизительно 0,05 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл или менее приблизительно 0,02 ЕЭ/мл на 1,0×10¹³ vg/мл; содержат цезий в концентрациях, составляющих менее 100 мкг/г (ppm), менее 50 мкг/г (ppm) или менее 30 мкг/г (ppm); содержат приблизительно 10-100 ppm, 15-90 ppm или приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188; содержат менее 2000, менее 1500, менее 1000 или менее 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее 10000, менее 8000, менее 1000 или менее 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; характеризуются значением pH, составляющим от 7,5 до 8,5, от 7,6 до 8,4 или от 7,8 до 8,3; характеризуются осмоляльностью, составляющей от 330 до 490 мОсм/кг, от 360 до 460 мОсм/кг или от 390 до 430 мОсм/кг; характеризуются инфекционным титром, составляющий от приблизительно 1,0×10⁸ до 10,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg, от приблизительно 2,5×10⁸ до 9,0×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg или от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg; характеризуются относительной эффективностью приблизительно 30-150%, приблизительно 60-140% или приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; характеризуются уровнями общего белка, составляющими приблизительно 10-500 мкг на 1,0×10¹³ vg, приблизительно 50-400 мкг на 1,0×10¹³ vg или приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; характеризуются эффективностью in vivo, определяемой по медиане выживаемости мыши с SMNΔ7, получившей дозу 7,5×10¹³ vg/кг, которая составляет более 15 дней, более 20 дней, более 22 дней или более 24 дней.

[151] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: значение pH составляет приблизительно 7,7-8,3; осмоляльность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг; содержат менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл; инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg; уровни общего белка составляют приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; содержание Pluronic F-68 составляет приблизительно 20-80 ppm; относительная эффективность составляет приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro, где эффективность измеряют относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; эффективность in vivo, определяемая по медиане выживаемости на мышиной модели с SMNΔ7 при дозе 7,5×10¹³ vg/кг, составляет 24 дня больше; содержат менее приблизительно 5% пустых капсидов; общая чистота составляет приблизительно 95% или больше; уровень эндотоксина составляет приблизительно 0,13 ЕЭ/мл или меньше.

[152] В некоторых вариантах осуществления состав или фармацевтическая композиция содержат стандартную дозировку вирусных векторов на основе rAAV, составляющую приблизительно 2,4×10¹⁴ vg, и соответствуют одному или нескольким из следующих критериев выпуска: содержат менее приблизительно 0,09 нг бензоназы на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 30 мкг/г (ppm) цезия; содержат приблизительно 20-80 ppm полоксамера 188; содержат менее приблизительно 0,22 нг BSA на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 6,8×10⁵ пг остаточной плазмидной ДНК на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 1,1×10⁵ пг остаточной hcDNA на 1,0×10¹³ vg; содержат менее приблизительно 4 нг rHCP на 1,0×10¹³ vg; значение pH составляет приблизительно 7,7-8,3; осмоляльность составляет приблизительно 390-430 мОсм/кг; содержат менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер; содержат менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер; геномный титр составляет от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл; инфекционный титр составляет от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰МЕ на 1,0×10¹³ vg; уровни общего белка составляют приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg; относительная эффективность составляет приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro, где эффективность измеряют относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля; содержат менее приблизительно 5% пустых капсидов.

[153] Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируют следующие примеры, которые не должны рассматриваться как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитируемых на протяжении настоящей заявки, а также фигур, включено в данный документ посредством ссылки во всей полноте для всех целей.

ПРИМЕРЫ

Доклинический пример

[154] Мышь с SMNΔ7 представляет собой подходящую модель для изучения переноса генов. Butchbach et al., "Abnormal motor phenotype in the SMNΔ7 mouse model of spinal muscular atrophy." Neurobiology of disease, 27(2): 207-19. Инъецирование 5 × 10¹¹ вирусных геномов scAAV9.CB.SMN в лицевую вену мышей возрастом 1 день приводит к восстановлению нормального фенотипа на мышиной модели с SMNΔ7. Foust et al., "Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN." Nature biotechnology, 28(3): 271-4. Приблизительно 42 ± 2% мотонейронов поясничного отдела спинного мозга были трансдуцированы у мышей, обработанных с помощью scAAV9.CB.SMN. Уровни SMN также повышались в головном мозге, спинном мозге и мышцах животных, обработанных с помощью scAAV9.CB.SMN, по сравнению с необработанными мышами со SMA (хотя и были ниже, чем у контролей WT). Животных со SMA, обработанных с помощью либо scAAV9.CB.SMN, либо scAAV9.CB.GFP в P1, оценивали в отношении их способность к возвращению в нормальное положение и сравнивали с контрольными мышами дикого типа (WT) и необработанными мышами. Контроли WT могли быстро возвращаться в нормальное положение, тогда как животные со SMA, обработанные с помощью SMN и зеленого флуоресцентного белка (GFP), испытывали трудности в P5. Однако к P13 90% животных, обработанных с помощью SMN, могли возвращаться в нормальное положение по сравнению с 20% контролей, обработанных с помощью GFP, и 0% необработанных животных со SMA. В P18 животные, обработанные с помощью SMN, были крупнее, чем животные, обработанные с помощью GFP, но меньше, чем контроли WT. Локомоторная функция мышей, обработанных с помощью SMN, была почти идентична таковой у контролей WT согласно оценкам в тесте "открытое поле" и бег в колесе.

[155] Выживаемость животных со SMA, обработанных с помощью SMN, по сравнению с животными со SMA, обработанными с помощью GFP, была значительно увеличена. Ни одно из контрольных животных, обработанных с помощью GFP, не выжило после P22, и их медианная продолжительность жизни составила 15,5 дня. Масса тела мышей с GFP достигала пика в P10, а затем резко снижалась вплоть до гибели, в то время как мыши со SMN демонстрировали устойчивый набор массы вплоть до примерно P40, при этом она стабилизировалась на уровне 17 г (приблизительно в два раза меньше массы контролей WT). Меньший размер подвергнутых коррекции животных, вероятно, связан с тропизмом и неполной трансдукцией scAAV9, что приводит к образованию "химерного" животного, у которого некоторые клетки не трансдуцированы. Кроме того, меньший размер предполагает роль SMN в эмбриональном развитии. Наиболее примечательно то, что мыши, обработанные с помощью SMN, выживали намного дольше возраста 250 дней.

[156] Также изучали токсикологическое биораспределение. В исследованиях, не соответствующих требованиям надлежащей лабораторной практики (non-GLP), 24 мышам и 4 отличным от человека приматам (NHP) вводили инъекцией scAAV9.CB.SMN, доставляемый путем сосудистой доставки. Для оценки токсичности и безопасности scAAV9.CB.SMN мышам дикого типа с восприимчивостью к вирусу Фрейнд типа b (FVB) в P1 вводили инъекцией либо среду-носитель (PBS) (3 самца/6 самок), либо 3,3 × 10¹⁴ vg/кг scAAV9.CB.SMN (6 самцов/9 самок) через лицевую височную вену. Ранее было показано, что эта доза является наиболее эффективной на мышиной модели SMA16 с SMNΔ7. Мышей использовали в P1 в целях моделирования потенциальных клинических исследований на младенцах, которые являются запланированной популяцией для первого клинического испытания на людях. Все мыши пережили процедуру инъекции и начальный 24-часовой период наблюдения без каких-либо признаков дистресса или потери массы тела. На протяжении остальной части исследования измеряли массу тела и еженедельно проводили ручной осмотр; при этом ни одно из них не выявило разницы между контрольной и обработанной когортами (фиг. 1).

[157] Через 60, 90 и 180 дней после инъекции у мышей собирали кровь для гематологических исследований и клинического биохимического исследования (уровни ALT, AST, ALK Phos, креатинина, BUN, электролитов и CK). Все результаты были нормальными, за исключением одного варианта в момент времени 90 дней. Вероятно, это отличие обусловлено технической проблемой, связанной с местом забора крови, которое отличается от такового для всех других мышей. Для гистопатологического исследования 13 мышей подвергли вскрытию через 120 дней после инъекции и 8 мышей подвергли вскрытию через 180 дней после инъекции. Все органы были в норме; в частности, ни в одном срезе ни одного органа (сердце, печень, почка, мышца, гонады, головной мозг, легкое, лимфатические узлы и кишечник) не наблюдали воспаления.

[158] В исследовании безопасности на четырех самцах яванских макаков инъекции вводили субъектам возрастом 90 дней, чтобы точно имитировать вероятный возраст введения средства лечения младенцам со SMA I типа. Вектор scAAV9.CB.SMN вводили один раз через катетер в подкожной вене при дозе 6,7 × 10¹³/кг, что соответствует самой низкой тестируемой дозе, при которой мыши со SMN-Δ7 показали значительное увеличение выживаемости. За животными наблюдали в течение шести месяцев, пока их не подвергли умерщвлению в возрасте примерно 9 месяцев. Никаких побочных эффектов не наблюдали, и результаты всех клинических биохимических исследований были нормальными. Т-клеточный иммунный ответ тестировали с использованием ELISpot на мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC), и все тесты были отрицательными через 6 месяцев после инъекции.

[159] В данных исследованиях, не соответствующих GLP, биохимические и гематологические исследования сыворотки были без особенностей, также как и гистопатологическая оценка. У NHP-субъектов развивались соответствующие иммунные ответы на капсид (но не на трансген), при этом очень высокий уровень экспрессии трансгена сохранялся через 6 месяцев после инъекции. Эти исследования предоставляют убедительные доказательства того, что системно вводимый scAAV9.CB.SMN является безопасным и хорошо переносится даже при высоких дозах, используемых для проникновения через гематоэнцефалический барьер. Foust et al. Nat. Biotechnol., 28(3), pp. 271-274 (2010).

[160] Когда новорожденным мышам FVB вводили однократную внутривенную инъекцию scAAV9.CB.SMN на уровнях до 3,3 × 10¹⁴ vg/кг в день 1, не наблюдали ни смертности, связанной с исследуемым препаратом, ни признаков токсичности в моменты времени вплоть до 24 недель после введения. Умеренными эффектами обработки были связанное с обработкой снижение средней массы тела и средней прибавки массы тела, а также более низкие значения активированного частичного тромбопластинового времени (APTT), но она не приводила к токсичности.

[161] Активность scAAV9.CB.SMN демонстрировало биораспределение и наличие экспрессии специфической трансгенной рибонуклеиновой кислоты (РНК) в головном мозге и спинном мозге, основных терапевтических тканях, подлежащих нацеливанию. Через 12 и 24 недели у самцов и самок, получивших 3,3 × 10¹⁴ vg/кг (группа 3), обнаружили низкие уровни антител к капсиду AAV9. В лабораторных диагностических и гистопатологических анализах изменения не наблюдали. Основываясь на этих результатах, считается, что уровень отсутствия наблюдаемых нежелательных эффектов (NOAEL) для scAAV9.CB.SMN у новорожденных самцов и самок мышей составляет 3,3 × 10¹⁴ vg/кг.

[162] В этих исследованиях интратекальное введение scAAV9.CB.SMN в CSF было безопасным и хорошо переносилось мышами (по неделю 12) и макаками (до 14 месяцев после инъекции). Доставка в CSF у мышей, вероятно, уменьшала периферическое воздействие scAAV9.CB.SMN, а результаты качественной полимеразной цепной реакции (qPCR) показывают, что экспрессия трансгена была выше в шейной и поясничной областях по сравнению с грудной областью. Обезьян удерживали в положении Тренделенбурга в течение 5 минут при проведении инъекции, и перед инъекцией подтверждали, что они являются серонегативными в отношении антител к AAV9. Все отличные от человека приматы демонстрировали сильную положительную реакцию в отношении антител к AAV9 вплоть до 6 месяцев после инъекции. В течение 6 месяцев после инъекции не наблюдали ответа с цитотоксическими Т-лимфоцитами ни на капсид AAV9, ни на трансген SMN. В головном мозге или спинном мозге не наблюдали деградации тканей или реактивного ответа.

[163] В базовых 3-месячных токсикологических исследованиях на мышах, соответствующих принципам надлежащей лабораторной практики (GLP), основными органами-мишенями для определения токсичности были сердце и печень. После проведения IV инфузии мыши вектор и трансген распространялись широко, при этом самая высокая экспрессия обычно наблюдалась в сердце и печени, а значительная экспрессия в головном мозге и спинном мозге. Связанные с AVXS-101 отклонения, которые наблюдали в желудочках сердца, включали дозозависимое воспаление, отек и фиброз, а в предсердии наблюдали воспаление и тромбоз. Отклонения, наблюдаемые в печени, включали гепатоцеллюлярную гипертрофию, активацию клеток Купфера и рассеянный гепатоцеллюлярный некроз. Для связанных с AVXS-101 отклонений, наблюдаемых в сердце и печени у мышей, NOAEL не определили, а максимальную переносимую дозу определили как 1,5 × 10¹⁴ vg/кг, что обеспечивает примерно 1,4-кратный резерв безопасности относительно рекомендуемой терапевтической дозы, составляющей 1,1 × 10¹⁴ vg/кг. Возможность трансляции полученных на мышах результатов на приматов в настоящее время не известна.

[164] Эти данные поддерживают переход к клиническим испытаниям.

[165] Чтобы определить, может ли доставка в CSF снизить трансдукцию периферических органов по сравнению с внутривенными (IV) инъекциями, выполнили подробный анализ биораспределения на тканях отличных от человека приматов, которых помещали вниз головой в положение Тренделенбурга на 5 или 10 минут (n=5). Отдавали предпочтение таким животным, а не отличным от человека приматам, которых не помещали вниз головой, потому что данная обработка значительно улучшала распределение в спинном мозге и головном мозге, что способствует использованию данного подхода для клинических испытаний. Через две недели после инъекции яванских макаков умерщвляли и собирали различные ткани для выполнения подробных анализов биораспределения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и РНК. Уровень scAAV9.CBA.GFP был ниже в большинстве периферических тканей, за исключением селезенки и печени, относительно высоких уровней в головном мозге и спинном мозге. Эти результаты согласуются с предыдущими отчетами других групп. Dirren et al., "Intracerebroventricular injection of adeno-associated virus 6 and 9 vectors for cell type specific transgene expression in the spinal cord." Hum Gene Ther 25: 109-120; Gray et al., "Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates." Gene Ther 20: 450-459. В скелетных мышцах и ЦНС существует сильная корреляция между уровнями ДНК и РНК, тогда как в мягких тканях и железах уровни РНК обычно ниже, чем ожидалось для обнаруженных вирусных геномов. В частности, в семенниках, кишечнике и селезенке наблюдали в 1000 раз меньше молекул РНК, чем ДНК. Несмотря на обнаружение AAV в периферических органах, наблюдали значительное уменьшение количества вектора, обнаруживаемого периферически, по сравнению с системной инъекцией. Dirren et al.; Gray et al. Кроме того, аналогичные результаты наблюдали при сравнении мышей, которым вводили инъекцию либо внутривенно, либо интрацеребровентрикулярно в P1 через 24 недели после лечения. Таким образом, доставка в CSF добавляет значительный потенциальный компонент безопасности в будущие клинические испытания AVXS-101.

[166] В некоторых вариантах осуществления положение Тренделенбурга улучшает доставку в CSF. Дозирование и эффективность scAAV9-SMN оценивали на мышах и отличных от человека приматах со SMA, которым препарат доставляли непосредственно в CSF посредством однократной инъекции. Обширную экспрессию трансгена наблюдали на всем протяжении спинного мозга у мышей и отличных от человека приматов при использовании в 10 раз более низкой дозы по сравнению с IV применением. Для достижения аналогичной эффективности нацеливания на мотонейроны у отличных от человека приматов можно использовать более низкие дозы, чем у мышей. Обнаружили, что эффективность трансдукции дополнительно улучшалась, когда субъектов держали в положении Тренделенбурга для содействия распространению вектора. Meyer et al., "Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates." Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 23, 477-487. Удержание животных в наклоненном положении значительно улучшало трансдукцию в грудной и шейной областях спинного мозга, что демонстрировали с помощью иммунофлуоресценции и количественного определения двойных положительных по GFP/ChAT мотонейронов. Удержания в наклоненном положении в течение 10 минут было достаточно для увеличения трансдукции мотонейронов до 55, 62 и 80% в шейной, грудной и поясничной областях соответственно, что предполагает значительные преимущества для пациентов согласно результатам нормализации фенотипа, наблюдаемой на мышиной модели. Количество мотонейронов тесно коррелирует с количественным определением GFP-транскрипта в каждом из сегментов спинного мозга.

Пример 1. - Протокол клинического испытания

[167] Открытое клиническое испытание фазы 1 с применением однократной дозы проводят на младенцах и детях с генетическим диагнозом, соответствующим SMA, биаллельной делецией SMN1 и 3 копиями SMN2 без генетического модификатора, которые могут сидеть, но не могут стоять или ходить на момент включения в исследование. Пациенты получают AVXS-101 в исследовании безопасности со сравнением доз, включающем до трех (3) потенциальных терапевтических доз, описанных ниже. Пациентов разделяют на две группы: пациенты возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы и пациенты возрастом ≥24 месяцев и <60 месяцев на момент введения дозы. В исследование включают по меньшей мере пятнадцати (15) пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев и двенадцать (12) пациентов возрастом ≥24 и <60 месяцев.

[168] В первую когорту включают трех (3) пациентов (когорта 1) возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев, которым будут вводить 6,0 × 10¹³ vg AVXS-101 (доза A). Между введением дозы каждому пациенту в пределах когорты существует интервал, составляющий не менее четырех (4) недель. Исследователи обсуждают с Независимым комитетом по мониторингу данных безопасности исследования (DSMB) все AE степени III или выше в пределах 48 часов после того, как стало известно, что они возможно, вероятно или определенно связаны с исследуемым средством, до продолжения включения в исследование. После включения в исследование первых трех пациентов и на основании доступных данных по безопасности принимают решение: а) прекратить лечение из-за токсичности, или b) перейти к когорте 2 с применением дозы B.

[169] Для дозы B включают трех (3) пациентов возрастом <60 месяцев, чтобы вводить им 1,2 × 10¹⁴ vg AVXS-101 (доза B). Опять же, между введением дозы трем пациентам в пределах когорты существует интервал, составляющий не менее 4 недель. Исходя из доступных данных по безопасности от трех пациентов когорты 2 и всех пациентов когорты 1, дальнейшие 4-недельные интервалы между введением дозы пациентам могут быть излишними. Исследователи обсуждают с DSMB все AE степени III или выше в пределах 48 часов после того, как стало известно, что они возможно, вероятно или определенно связаны с исследуемым средством, до продолжения включения в исследование. После включения в исследование первых шести (6) пациентов и на основании доступных данных по безопасности принимают решение: а) прекратить лечение из-за токсичности, или b) продолжить включение дополнительных 21 пациента до тех пор, пока двенадцать (12) пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев и двенадцать (12) пациентов возрастом ≥24 месяцев и <60 месяцев не получат дозу B.

[170] На основании продолжающейся оценки данных по безопасности и эффективности у пациентов, которых обрабатывают дозой 1,2 × 10¹⁴ vg, рассматривают возможность тестирования третьей дозы (доза C). Три (3) пациента возрастом <60 месяцев получают интратекально вводимую дозу C, которая будет составлять до 2,4 × 10¹⁴ vg. Между введением дозы первым трем пациентам, получающим дозу C, снова существует четырехнедельный интервал, как в случае когорт 1 и 2. После включения в исследование первых трех (3) пациентов, получающих дозу C, и на основании доступных данных по безопасности принимают решение: а) прекратить лечение из-за токсичности, или b) продолжить включение дополнительных 21 пациента до тех пор, пока в общей сложности двенадцать (12) пациентов возрастом >6 месяцев и <24 месяцев и двенадцать (12) пациентов возрастом ≥24 и <60 месяцев не получат дозу C.

[171] Выбор подходящей дозы и обоснование для тестирования дозы C могут поддерживаться продолжающимися обзорами клинических данных в отношении безопасности и эффективности для пациентов, получающих дозу B (1,2 × 10¹⁴ vg). Выбранная доза составляет до 2,4 × 10¹⁴ vg, которые вводят интратекально. Для дозы до 1,1 × 10¹⁴ vg/кг продемонстрирована безопасность при системном (внутривенном) введении детям с массой тела до 8,4 кг (общая доза 9,24 × 10¹⁴ vg). Кроме того, в доклинических исследованиях интратекальное введение scAAV9.CB.SMN было безопасным и хорошо переносилось до 14 месяцев после инъекции у крупных отличных от человека приматов при дозе 2 × 10¹³ vg/кг.

[172] Общий дизайн исследования обобщен на фиг. 2.

[173] Безопасность оценивают путем мониторинга отчетов о нежелательных явлениях (AE) и сопутствующего приема лекарств, а также путем проведения физикального обследования, оценки показателей жизнедеятельности, обследования сердечно-сосудистой системы и лабораторных исследований. Пациентов наблюдают в стационаре в течение 48 часов после интратекальной инъекции. Пациенты возвращаются для визитов последующего наблюдения в дни 7, 14, 21 и 30. После визита в день 30 пациенты возвращаются ежемесячно в течение 12 месяцев после введения дозы. После завершения исследования пациентов, принимавших участие в исследовании, просят включиться в прижизненное долгосрочное исследование с последующим наблюдением, в котором изучают длительную безопасность AVXS-101 вплоть до 15 лет.

Число пациентов

[174] Включают по меньшей мере 27 пациентов; в исследование могут быть включены до 51 пациента, если определят необходимость повышения дозы до дозы C.

Назначение лечения

[175] Представляет собой открытое сравнительное исследование однократной дозы. Лечение назначают в соответствии с графиком повышения дозы, указанным в данном документе.

Критерии корректировки дозы

[176] В исследовании изучают однократную интратекальную инъекцию AVXS-101.

Критерии прекращения исследования

[177] Независимый комитет по мониторингу данных безопасности исследования (DSMB) и медицинский наблюдатель проводят мониторинг данных по безопасности на постоянной основе на протяжении всего испытания. DSMB может рекомендовать досрочное прекращение испытания по соображениям безопасности. Включение в исследовании прекращается исследователями, если какой-либо пациент испытывает токсичность при AE степени III или выше, которая является непредвиденной и возможно, вероятно или определенно связанной с исследуемым продуктом, которая проявляется клиническими симптомами и требует медицинского лечения. Это включает смерть любого пациента, важные клинические лабораторные данные или любые тяжелые местные осложнения в области инъекции, связанные с введением исследуемого средства.

[178] Испытание может быть прекращено, если DSMB рекомендует досрочное прекращение исследования по соображениям безопасности. Испытание также может быть прекращено по рекомендации регулирующего органа. Наконец, испытание также может быть прекращено, если у пациентов разовьются неприемлемые уровни токсичности, определяемые как возникновение любого непредвиденного AE/токсичности степени 3 или выше по CTCAE, которое возможно, вероятно или определенно связано с генной заместительной терапией и ассоциировано с клиническими симптомами и/или требует медицинского лечения.

Критерии включения пациентов

[179] Пациенты, которые соответствуют всем нижеследующим критериям включения:

1. Пациенты возрастом ≥6 месяцев и возрастом до 60 месяцев (1800 дней) на момент введения дозы после диагностического подтверждения по генотипу во время периода скрининга, которые демонстрируют способность сидеть без посторонней помощи в течение 10 секунд или больше, но не могут стоять или ходить;

- Диагностическое подтверждение по генотипу включает подтвержденное лабораторными методами гомозиготное отсутствие экзона 7 SMN1; при этом наличие ровно трех копий SMN2;

2. Отрицательное генный тест на мутацию-модификатор гена SMN2 (c.859G>C);

3. Проявление клинических признаков и симптомов, соответствующих SMA, в возрасте <12 месяцев;

4. Способны сидеть самостоятельно, но не способы стоять и ходить самостоятельно. Определение самостоятельного сидения определяется согласно критериям MGRS Всемирной организации здравоохранения (WHO) как способность сидеть без опоры с поднятой головой в течение по меньшей мере 10 секунд; Ребенок не должен использовать руки или кисти для уравновешивания тела или упора (Wijnhoven 2004);

5. Соответствие институциональным критериям для использования анестезии и седации в соответствии с возрастом, определенных как необходимые исследователем;

6. Прохождение вакцинации для детей в соответствии с графиком вакцинации. Сезонные вакцинации, включающие профилактику паливизумабом (также известным как Synagis) для предупреждения инфекций, вызываемых респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), также рекомендуются в соответствии с Американской академией педиатрии (AAP 2009);

7. Родитель(-и)/законный(-ые) опекун(ы), желающий(-ие) и способный(-ые) завершить процесс подписания информированного согласия.

Критерии исключения пациентов

[180] Пациенты должны не соответствовать любому из следующих критериев исключения:

1. Текущая способность стоять или ходить самостоятельно или такая способность в анамнезе;

2. Противопоказания для проведения спинномозговой пункции или интратекального введения средства терапии (например, расщепление позвоночника, менингит, нарушение, нарушения свертываемости крови или преграждающая металлоконструкция в позвоночнике, препятствующая эффективному доступу к пространству CSF) или присутствие имплантированного шунта для дренажа CSF или имплантированного катетера в ЦНС;

3. Тяжелые контрактуры, определенные назначенным(-и) физиотерапевтом(-ами) при скрининге, которые мешают либо способности достижения/демонстрации функциональных показателей (например, стояния, ходьбы), либо мешают способности получать IT дозу 10. Тяжелый сколиоз (определяемый как искривление позвоночника на ≥50°), видимый при рентгенологическом исследовании;

4. Предшествующая, запланированная или ожидаемая операция/процедура по исправлению сколиоза в пределах 1 года от введения дозы;

5. Применение инвазивной вспомогательной вентиляции легких (трахеотомия с положительным давлением) или сатурация <95%, измеренная с помощью пульсоксиметрии при скрининге, когда пациент бодрствует, или в случае высокогорий >1000 м сатурация кислородом <92%, когда пациент бодрствует

- Сатурация, измеренная с помощью пульсоксиметрии, не должна уменьшаться на ≥ четыре (4) процентных пункта между скринингом и максимальным значением в день введения дозы;

6. Применение или потребность в неинвазивной вспомогательной вентиляции легких в течение 12 или более часов ежедневно за две недели до введения дозы;

7. Медицинская необходимость в желудочном зонде для кормления, при которой большинство кормлений осуществляется с помощью непероральных методов (например, с помощью назогастрального зонда или назоеюнального зонда), или пациенты, у которых отношение массы тела к возрасту находится ниже 3-го процентиля, исходя из Стандартов для оценки роста детей ВОЗ (Onis 2006). Наложение постоянной гастростомы перед скринингом не является критерием исключения;

8. Активная вирусная инфекция (включая HIV или положительную серологическую реакцию на вирус гепатита B или C или вирус Зика);

9. Тяжелое заболевание, не относящее к заболеваниям дыхательного тракта, требующее системного лечения и/или госпитализации в пределах двух (2) недель до включения в исследование;

10. Респираторная инфекция, требующая медицинской помощи, медицинского вмешательства или увеличения поддерживающей терапии любым образом в пределах четырех (4) недель до включения в исследование;

11. Тяжелая инфекция, на относящаяся к легочной инфекции/инфекции дыхательных путей (например, пиелонефрит или менингит), в пределах четырех (4) недель до введения дозы исследуемого средства или сопутствующее заболевание, которое по мнению PI создает ненужные риски для переноса генов, такое как:

- тяжелая почечная или печеночная недостаточность;

- известный эпизод судорожного расстройства;

- сахарный диабет;

- идиопатическая гипокальциурия;

- симптоматическая кардиомиопатия;

12. Наличие в анамнезе бактериального менингита или заболевания головного мозга или спинного мозга, включая опухоли или отклонения по данным MRI или CT, которые могут помешать процедурам LP или циркуляции CSF;

13. Известная аллергия или гиперчувствительность к преднизолону или другим глюкокортикостероидам или их вспомогательным веществам;

14. Известная аллергия или гиперчувствительность к йоду или йодсодержащим продуктам;

15. Одновременное применение любого из следующего: лекарственные средства для лечения миопатии или невропатии, средства, применяемые для лечения сахарного диабета, или продолжающаяся иммуносупрессорная терапия, плазмаферез, иммуномодуляторы, такие как адалимумаб, или иммуносупрессорная терапия в пределах 3 месяцев от введения дозы исследуемого средства (например, кортикостероиды, циклоспорин, такролимус, метотрексат, циклофосфамид, внутривенный иммуноглобулин, ритуксимаб);

16. Невозможность отказаться от приема слабительных средств или диуретиков за 24 часа до введения дозы;

17. Титры антител к AAV9 >1:50, как определено с помощью иммунологического анализа связывания ELISA:

- если потенциальный пациент демонстрирует титр антител к AAV9 > 1:50, он или она могут пройти повторное тестирование в пределах 30 дней после периода скрининга и будут иметь право участвовать в исследовании, если титр антител к AAV9 при повторном тестировании составит ≤1:50;

18. Отклонения от нормы лабораторных показателей, которые считаются клинически значимыми (INR >1,4), GGT >3X ULN, билирубин ≥3,0 мг/дл, креатинин ≥1,0 мг/дл, Hgb <8 или >18 г/дл; WBC >20000 на мм³) до введения дозы исследуемого средства;

19. Участие в недавнем клиническом испытании средства лечения SMA, или получение исследуемого или одобренного составного продукта, или получение средства терапии с целью лечения SMA (например, вальпроевой кислоты, нусинерсена) в любое время до скрининга для данного исследования;

- прием пероральных бета-агонистов следует прекратить за 30 дней до введения дозы;

- прием ингаляционного альбутерола, специально прописанного в рамках респираторного (бронхолитического) лечения, является приемлемым и не является противопоказанием в любое время до скрининга для данного исследования;

20. Вероятность серьезных хирургических вмешательств на протяжении 1-летнего периода оценки исследования (например, хирургическое вмешательство на позвоночнике или трахеостомия);

21. Неспособность или нежелание соблюдать процедуры исследования или невозможность совершения поездок для повторных визитов;

22. Нежелание сохранять конфиденциальность результатов/наблюдений исследования или воздерживаться от публикации конфиденциальных результатов/наблюдений исследования в социальных сетях;

23. Отказ подписать форму согласия.

Критерии отстранения и прекращение участия пациента

[181] Пациенты могут прекратить участие в исследовании, если у них разовьются неприемлемые уровни токсичности, определяемые как возникновение любого непредвиденного нежелательного явления/токсичности степени 3 или выше по CTCAE, которое возможно, вероятно или определенно связано с генной заместительной терапией и ассоциировано с клиническими симптомами и/или требует медицинского лечения. Пациентов отстраняют, если они умирают, и в этом случае будет запрашиваться вскрытие всех пациентов, за исключением не подвергнутых лечению пациентов, которые скончались после участия в исследовании переноса генов. Пациентов также могут отстранить, если они не соблюдают требуемые протоколом визиты или процедуры исследования на протяжении 3 или более визитов подряд, которые не были перенесены, за исключением случаев госпитализации. Также отстраняют от исследования пациентов, родитель(-и) или законный(-ые) опекун(-ы) которых отозвал(-и) согласие. Наконец, пациентов могут отстранить на усмотрение исследователя. Процедуры досрочного прекращения следует выполнить в пределах 14 дней для любого пациента, который преждевременно прекращает исследование по любой причине.

Описание исследуемого продукта

[182] Биологический продукт представляет собой нереплицирующийся рекомбинантный самокомплементарный аденоассоциированный вирус серотипа 9 (AAV9), содержащий кДНК гена SMN человека под контролем энхансера гена цитомегаловируса (CMV)/гибридного промотора гена β-актина курицы (CB). Инвертированный концевой повтор AAV (ITR) был модифицирован таким образом, чтобы стимулировать внутримолекулярную гибридизацию трансгена, за счет чего образуется двухнитевой трансген, готовый к транскрипции. Было показано, что данный модифицированный ITR, имеющий название "самокомплементарный" (sc) ITR, значительно увеличивает скорость, с которой трансген транскрибируется и продуцируется получаемый белок. Клетки, трансдуцированные с помощью AVXS-101 (scAAV9.CB.hSMN), экспрессируют белок SMN человека.

Таблица 3. Исследуемый продукт

	Исследуемый продукт
Название продукта	AVXS-101
Стандартная доза	6,0 × 10¹³ vg (доза A) 1,2 × 10¹⁴ vg (доза B) Не более 2,4 × 10¹⁴ vg (доза C)
Путь введения	Интратекальная инъекция
Описание физических свойств	Сразу после размораживания AVXS-101 представляет собой прозрачный или слегка непрозрачный раствор от бесцветного до бледно-белого цвета, не содержащий видимых частиц

Предыдущие и сопутствующие лекарственные препараты

[183] Предыдущие и сопутствующие лекарственные препараты заносят в электронную индивидуальную регистрационную форму (eCRF) за период от двух недель до введения дозы исследуемого средства до визита завершения исследования.

Профилактическое введение преднизолона

[184] Антиген-специфический Т-клеточный ответ на вектор на основе AAV наблюдали в продолжающемся клиническом исследовании фазы 1, в котором изучают лечение с помощью внутривенной инфузии AVXS-101. Он представляет собой ожидаемый ответ в период 2-4 недель после переноса генов. Одним из возможных последствий такого антиген-специфического Т-клеточного ответа является клиренс трансдуцированных клеток и утрата экспрессии трансгена.

[185] В попытке ослабить иммунный ответ хозяина на средство терапии на основе AAV пациентам назначают профилактический прием преднизолона (глюкокортикоида) (приблизительно 1 мг/кг/день) за 24 часа до введения дозы AVXS-101. Лечение продолжается в течение приблизительно 30 дней в соответствии со следующими протоколом лечения:

• до по меньшей мере 30 дня после инфузии: 1 мг/кг/день;

• недели 5 и 6: 0,5 мг/кг/день;

• недели 7 и 8: 0,25 мг/кг/день;

• неделя 9: прием преднизолона отменяют.

[186] Если значения уровней аспартатаминотрансферазы (AST) или аланинаминотрансферазы (ALT) >2X превышают верхний предел нормы (ULN), или если Т-клеточный ответ составляет ≥100 SFC/10⁶ PBMC после 30 дней лечения, дозу преднизолона поддерживают до тех пор, пока значения уровней AST и ALT не станут ниже порогового значения. Если Т-клеточный ответ продолжается после дня 60, следует полагаться на усмотрение исследователя с учетом соотношения риск/польза при сохранении приема преднизолона. Отклонение от данных рекомендаций остается на усмотрение исследователя, исходя из потенциальных проблем безопасности для каждого пациента.

Запрещенные лекарственные препараты

[187] Запрещается одновременный прием любого из следующих лекарственных препаратов:

• лекарственные средства для лечения миопатии или невропатии;

• средства, применяемые для лечения сахарного диабета;

• средство терапии с целью лечения SMA (например, вальпроевая кислота, нусинерсен).

- Прием пероральных бета-агонистов необходимо прекратить за по меньшей мере 30 дней до введения дозы средства генной терапии.

- Ингаляционные бета-агонисты могут применяться для лечения респираторных осложнений SMA при условии, что такие лекарственные препараты вводят в дозах, соответствующих клинически приемлемым уровням.

• Текущая иммуносупрессорная терапия, плазмаферез, иммуномодуляторы, такие как адалимумаб, или иммуносупрессорная терапия в пределах 3 месяцев от начала испытания (например, кортикостероиды, циклоспорин, такролимус, метотрексат, циклофосфамид, внутривенный иммуноглобулин, ритуксимаб).

[188] Применение кортикостероидов после завершения снижения дозы преднизолона разрешено на усмотрение лечащего врача в рамках обычного клинического ведения. Применение преднизона при таких обстоятельствах должно быть соответствующим образом задокументировано как сопутствующий лекарственный препарат, а событие, которое спровоцировало его применение, должно быть соответствующим образом задокументировано как AE.

[189] Если применение кортикостероидов (кроме ингаляционных кортикостероидов при бронхоспазме) рассматривается как часть лечения на протяжении курса снижения дозы преднизолона, данное лечение следует обсудить с медицинским наблюдателем спонсора, который несет ответственность за любые указанные корректировки лекарственных препаратов, связанные со снижением дозы.

Соблюдение режима лечения

[190] AVXS-101 вводят в виде единоразовой интратекальной инъекции.

Рандомизация и ослепление

[191] Это исследование является открытым.

Доза исследуемого продукта и обоснование дозы

[192] Пациенты получают единоразовую дозу AVXS-101, составляющую 6,0 × 10¹³ vg, 1,2 × 10¹⁴ vg или третий вариант дозы до 2,4 × 10¹⁴ vg, если она считается необходимой, с помощью интратекальной инъекции. Доставка непосредственно в CSF посредством интратекальной инъекции позволяет снизить количество вирусного вектора примерно в десять раз при одинаковом распределении и эффективности на всем протяжении ЦНС, что уменьшает нагрузки вирусным вектором и обеспечивает дальнейшую оптимизацию. Выбор подходящей дозы и обоснование для изучения всех повышений дозы дополнительно поддерживаются за счет продолжающихся обзоров клинических данных в отношении безопасности и эффективности для пациентов, получивших предыдущие дозы, как описано. Самая высокая выбранная доза составляет до 2,4 × 10¹⁴ vg и вводится интратекально. Для дозы до 1,1 × 10¹⁴ vg/кг продемонстрирована безопасность при системном (внутривенном) введении детям с массой тела до 8,4 кг (общая доза 9,24 × 10¹⁴ vg). Кроме того, в доклинических исследованиях интратекальное введение scAAV9.CB.SMN было безопасным и хорошо переносилось до 14 месяцев после инъекции у крупных отличных от человека приматов при дозе 2 × 10¹³ vg/кг.

Приготовление исследуемого продукта

[193] Приготовление AVXS-101 выполняет асептически фармацевт в стерильных условиях.

[194] AVXS-101 предварительно смешивают с подходящей контрастной средой, одобренной и маркированной для использования в педиатрии для рентгенографического мониторинга инъекции, вводимой как поясничная интратекальная инъекция. Общий объем AVXS-101+контрастная среда не превышает 8 мл.

[195] Емкость для доставки дозы доставляют в обозначенную палату детского отделения интенсивной терапии (PICU) или другие подходящие условия (например, блок для интервенционных вмешательств, операционную, специальную процедурную комнату) с немедленным доступом к неотложной помощи в критических состояниях.

[196] Пациенты получают интратекальную инъекцию AVXS-101 в стерильных условиях в палате PICU или других подходящих условиях (например, в блоке для интервенционных вмешательств, операционной, специальной процедурной комнате) с немедленным доступом к неотложной помощи в критических состояниях. Пациентов госпитализируют и показатели их жизнедеятельности отслеживают через каждые 15 (+/-5) минут в течение четырех часов и через каждый час (+/-15 минут) в течение 24 часов после процедуры введения дозы AVXS-101.

[197] Центры получают указание применять атравматическую иглу, вводимую таким образом, чтобы срез иглы располагался параллельно волокнам твердой мозговой оболочки; поскольку было показано, что это значительно снижает повреждение твердой мозговой оболочки и, следовательно, снижает риск истечения спинномозговой жидкости после люмбальной пункции, в том числе у детей. Ebinger et al., "Headache and backache after lumbar puncture in children and adolescents: a prospective study." Pediatrics, 113:1588-1592; Kiechl-Kohlendorfer et al., "Cerebrospinal fluid leakage after lumbar puncture in neonates: incidence and sonographic appearance." Am J Roentgenol, 181:231-234.

[198] Седация/анестезия требуется для всех пациентов, получающих AVXS-101. Метод и лекарственные препараты остаются на усмотрение местного анестезиолога, но они должны предусматривать достаточную степень седации или поверхностной седация, чтобы гарантировать обезболивание и отсутствие движения в течение процедуры и помещения в положение Тренделенбурга после проведения процедуры. Пациентов помещают в положение Тренделенбурга, наклоненное положение с головой вниз под углом 30° на 15 минут, после введения вектора для улучшения распределения в шейном отделе и областях головного мозга.

[199] AVXS-101 вводит исследователь, или интервенционный радиолог, или другой соответствующим образом обученный и квалифицированный врач в стерильных условиях под контролем с помощью флюороскопии/рентгенографии согласно институциональным рекомендациям. Пациентов помещают в положение лежа на боку, а катетер с мандреном вставляют путем люмбальной пункции в межостистый промежуток L3-L4 или L4-L5 в субарахноидальное пространство. Катетеризация субарахноидального пространства подтверждается вытеканием прозрачной спинномозговой жидкости (CSF) из катетера. В случае дозы A и дозы B отбирают приблизительно четыре (4) мл CSF, объем CSF, который очень близок к объему вводимого инъекцией AVXS-101 плюс контрастная среда, при этом в случае дозы C отбирают (до семи (7) мл) и утилизируют их согласно институциональным рекомендациям. AVXS-101 в предварительно смешанном растворе с контрастной средой вводят инъекцией непосредственно в субарахноидальное пространство. Промывка инъекционных игл с помощью 0,5 мл солевого раствора допускается согласно институциональным стандартам/рекомендациям.

Процедуры после введения

[200] После введения AVXS-101 пациентов возвращают на койку в специализированном PICU или в другое подходящее место с тщательным мониторингом показателей жизнедеятельности. Сопутствующие лекарственные препараты и все AE/серьезные AE также отслеживают и документируют после процедур введения дозы.

[201] Пациентов содержат в палате PICU или других подходящих условиях (например, в блоке для интервенционных вмешательств, операционной, специальной процедурной комнате) с немедленным доступом к неотложной помощи в критических состояниях в течение 48 часов для более тщательного мониторинга психического состояния. Во время пребывания в стационаре персонал должен соблюдать соответствующие меры безопасности согласно институциональным стандартам инфекционного контроля; при этом стандарты должны требовать применения средств индивидуальной защиты (PPE), таких как халаты, перчатки, маски, очки и обувь с закрытым носком. Семьям пациентов предоставляются стандартизированные, одобренные IRB раздаточные материалы, касающиеся мониторинга изменений психического состояния, которые включают наблюдение на предмет лихорадки, раздражительности, боли в шее, светочувствительности и рвоты. Пациенты могут быть выписаны из больницы, когда они соответствуют следующим критериям:

• у них отсутствует повышение температуры;

• у них отсутствуют реакции гиперчувствительности;

• у них отсутствуют менингизм;

• у них отсутствуют отклонения от нормы лабораторных показателей, которые позволяют предположить наличие возможной инфекции или осложнения, связанных с ЦНС.

Повышение дозы

[202] Между введением дозы всем пациентам в пределах когорты 1 существует 4-недельный интервал, чтобы обеспечить возможность обзора анализа безопасности для шести моментов времени (дни 1, 2, 7, 14, 21, 30) перед введением дозы следующему пациенту.

[203] Исследователи обсуждают с DSMB все AE степени III или выше в пределах 48 часов после того, как стало известно, что они возможно, вероятно или определенно связаны с исследуемым средством, до продолжения включения в исследование. После включения в исследование первых трех (3) пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы и на основании доступных данных по безопасности принимают решение: а) прекратить лечение из-за токсичности, или b) перейти к когорте 2 с применением дозы B.

[204] В случае дозы B существует интервал, составляющий по меньшей мере 4 недели, между введением дозы первым трем (3) пациентам возрастом <60 месяцев на момент введения дозы в пределах когорты. Исходя из доступных данных по безопасности от первых трех (3) пациентов когорты 2 и всех пациентов когорты 1, дальнейшие 4-недельные интервалы между введением дозы пациентам могут быть излишними. Исследователи обсуждают с DSMB все AE степени III или выше в пределах 48 часов после того, как стало известно, что они возможно, вероятно или определенно связаны с исследуемым средством, до продолжения включения в исследование. После включения в исследование первых шести (6) пациентов и на основании доступных данных по безопасности принимают решение: а) прекратить лечение из-за токсичности, или b) продолжить включение дополнительных 21 пациента до тех пор, пока двенадцать (12) пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы и двенадцать (12) пациентов возрастом >24 месяцев и <60 месяцев на момент введения дозы не получат дозу B.

[205] На основании продолжающейся оценки данных по безопасности и эффективности у пациентов, которых обрабатывают дозой 1,2 × 10¹⁴ vg, могут рассматривать возможность тестирования третьей дозы (доза C). Три (3) пациента возрастом <60 месяцев получают интратекально вводимую дозу C, которая будет составлять до 2,4 × 10¹⁴ vg. Между введением дозы первым трем пациентам, получающим дозу C, снова будет существовать четырехнедельный интервал, как в случае когорт 1 и 2. После включения в исследование первых трех (3) пациентов, получающих дозу C, и на основании доступных данных по безопасности принимают решение: а) прекратить введение дозы C из соображений безопасности, или b) продолжить включение дополнительных 21 пациента до тех пор, пока в общей сложности двенадцать (12) пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев и двенадцать (12) пациентов возрастом ≥24 и <60 месяцев не получат дозу C.

Физиотерапевтические оценки: Расширенная шкала оценки моторных функций больницы Хаммерсмит

[206] Расширенная шкала оценки моторных функций больницы Хаммерсмит была разработана для применения у детей со спинальной мышечной атрофией 2 типа и 3 типа, чтобы дать объективную информацию о двигательных способностях и клиническом прогрессе.

[207] Расширенную шкалу оценки моторных функций больницы Хаммерсмит ведет физиотерапевт в соответствии с таблицей 4 в пределах 30 дней после введения дозы и ежемесячно на протяжении двенадцати (12) месяцев для всех пациентов возрастом ≥24 месяцев. Пациенты возрастом <24 месяцев на момент введения дозы начинают проходить оценки по Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит к тому моменту, когда они достигают возраста 24 месяцев. Сессии проведения оценок по Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит записывают на видео.

Физиотерапевтические оценки: Шкалы оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®

[208] Шкалы оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, третье издание, представляют собой стандартизированную оценку младенцев, ссылающуюся на нормы развития. Подтесты для оценки крупной и мелкой моторики выполнялись в пределах 30 дней перед введением дозы на исходном уровне, а затем ежемесячно вплоть до месяца 12. Оценки по Шкалам Бейли® записывают на видео.

Физиотерапевтические оценки: исследование показателей развития моторных навыков

[209] Достижение значимых показателей развития моторных навыков оценивает физиотерапевт с использованием стандартного исследования показателей развития моторных навыков, показанного в таблице 2, с определениями каждого показателя развития на основе Шкалам Бейли® (см. руководство по физиотерапии). Физиотерапевт регистрирует, достиг ли пациент каждого из показателей развития согласно исследованию показателей развития моторных навыков в соответствии с таблицей 4. После однократного наблюдения показатель развития моторных навыков считается достигнутым. Дата достижения каждого показателя развития моторных навыков определяется датой визита, во время которого данный показатель развития наблюдают. Во время скринингового визита физиотерапевт выполняет оценку достижения показателей развития на исходном уровне в соответствии с таблицей 4; эту оценку записывают на видео, а результаты документируют. Поскольку Шкалы Бейли® не обязательно требуют от ребенка повторения ранее достигнутых показателей развития, каждый показатель развития можно записать на видео. Сессии по оценке показателей развития документируют.

Таблица 4. График выполнения оценок

Период исследования	Скрининг на исходном уровне	Инъекция вектора (AVXS-101) (в стационаре)
№ визита	1	2			3	4	5	6	Ежемесячно (7-16)	Месяц 12 или EOS (17)
№ дня/месяца исследования	-60 до -2	-1	1	2-3	7	14	21	30	Вплоть до месяца 11	Месяц 12
Допустимое отклонение					+/- 2			+/- 7		+/- 7
Подписывание информированного согласия	X
Рентгенография позвоночника	X
Заполнение анкетных данных/истории болезни	X		X	X	X	X	X	X	X	X
Физический осмотр	X		X	X	X	X	X	X	X	X
Определение показателей жизнедеятельности/массы тела/длины тела/роста	X		X	X	X	X	X	X	X	X
Пульсоксиметрия			X	X	X	X	X	X	X	X
Обследование легких	X							X	X	X
ЭКГ в 12 отведениях	X		X	X					X	X
Холтеровское мониторирование в 12 отведениях	X	X	X	X				X	X	X
Эхокардиография	X								X	X
Исследование газового состава капиллярной крови		X		X
Расширенная HFMS (с записью видео)	X							X	X	X
Шкала Бейли®-III (с записью видео)	X							X	X	X
Исследование показателей развития моторных навыков (с записью видео)	X							X	X	X
Гематологическое/биохимическое исследование	X	X		X	X	X	X	X	X	X
CK-MB	X				X			X	X	X
Определение уровня тропонина I	X				X			X	X	X
Исследование свертывания крови	X	X		X	X	X	X	X	X	X
Анализ мочи	X	X		X	X	X	X	X	X	X
Серологическая реакция на вирусы	X
Сбор крови для тестирования, подтверждающего диагноз	X
Сбор образцов слюны, мочи и стула (для выделения вирусов)		X		X	X	X		X
Скрининг матери на исходном уровне (антитела к AAV9)	X
Иммунологические лабораторные исследования (антитела к AAV9/SMN)	X				X	X	X	X
Иммунологические лабораторные исследования (IFN-γ Т-клеток)					X	X	X	X
Введение дозы преднизолона		X	X	X	X	X	X	X
Введение исследуемого продукта под контролем с помощью флюороскопии/рентгенографии			X
Получение фотографии места инъекции			X		X	X	X	X
Контроль нежелательных явлений	X	X	X	X	X	X	X	X	X	X
Предыдущие и сопутствующие лекарственные препараты	Данные необходимо собирать за период от 2 недель до введения дозы исследуемого препарата до последнего визита исследования.

Произведение видеозаписи

[210] Физиотерапевтические оценки при каждом визите исследования записывают на видео, чтобы получить убедительные, очевидные, задокументированные доказательства эффективности, определяемой по изменениям функциональных способностей. Родитель(-и)/законный(-ые) опекун(ы) также может(могут) передавать домашние видеозаписи, демонстрирующие достижение функциональных способностей, в центр исследования.

[211] Видеозаписи передают независимому единому рецензенту для объективной оценки достижения показателя развития. Независимый рецензент использует исследование показателей развития моторных навыков, чтобы задокументировать, демонстрирует ли видеозапись свидетельство достижения каждого показателя развития моторных навыков. Дата достижения показателя развития моторных навыков определяется как самая ранняя из дат видеозаписи, на которой было продемонстрировано достижение этого показателя развития.

Другие клинические оценки: Заполнение анкетных данных/истории болезни

[212] Анкетные данные пациентов и информацию по истории болезни собирают на исходном уровне и заносят в индивидуальную регистрационную форму (CRF). При каждом визите на протяжении всего исследования собирают историю болезни. Информация из истории болезни включает без ограничения: семейный анамнез спинальной мышечной атрофии, включая пораженных заболеванием братьев и сестер или родителей-носителей, гестационный возраст при рождении, длину тела/рост/окружность головы при рождении, информацию о госпитализациях с момента рождения, включая число, продолжительность и причины госпитализаций, включая коды по ICD-10, если таковые имеются, вспомогательную вентиляцию легких в анамнезе, если таковая имеется, и поддержку питания в анамнезе, если таковая имеется.

Другие клинические оценки: Жизненно важные функции

[213] Показатели жизнедеятельности включают артериальное давление, частоту дыхания, пульс и температуру в подмышечных впадинах в пределах 30 дней после введения дозы и в моменты времени, указанные в таблице 4. Показатели жизнедеятельности, включая проведение пульсоксиметрии и определение частоты сердечных сокращений, постоянно отслеживает и записывает член бригады во время инъекции. В момент визита 2 показатели жизнедеятельности, включая артериальное давление, частоту дыхания, пульс, температуру в подмышечных впадинах, пульсоксиметрию и частоту сердечных сокращений, отслеживают и записывают через каждые 15 минут (+/-5 минут) в течение четырех часов и через каждый час (+/-15 минут) в течение 24 часов после процедуры введения дозы AVXS-101.

Другие клинические оценки: определение массы тела и длины тела/роста

[214] Массу тела и длину тела/рост, в зависимости от ситуации, измеряют в моменты времени, указанные в таблице 4.

Другие клинические оценки: физикальное обследование

[215] Физикальное обследование включает осмотр следующих систем: головы, глаз, ушей, носа и горла (HEENT), легких/грудной клетки, сердечно-сосудистой системы, брюшной полости, скелетно-мышечной, лимфатической и мочеполовой систем, неврологический и дерматологический осмотр. Окружность головы измеряют при каждом физикальном обследовании. Чтобы измерить окружность головы, экзаменатор плотно оборачивает гибкую измерительную ленту вокруг окружности головы, прокладывая ее над бровями, над самой широкой частью лба, над ушами и над наиболее выступающей частью затылка. Измерение следует проводить 3 раза, и самое большое значение следует записать с точностью до 0,1 см. Физикальные обследования на исходном уровня выполняют в пределах 30 дней от введения дозы и в соответствии с моментами времени, указанными в таблице 4.

Другие клинические оценки: рекомендации по вакцинации

[216] Пациентам рекомендуют выполнять все традиционные плановые иммунизации, рекомендованные Центром по контролю заболеваний (CDC). Сезонные вакцинации, включающие профилактику паливизумабом (также известным как Synagis) для предупреждения инфекций, вызываемых респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), также рекомендуются в соответствии с Американской академией педиатрии (AAP 2009);

Другие клинические оценки: электрокардиография (ЭКГ) в 12 отведениях

[217] ЭКГ в 12 отведениях выполняют во время скрининга/на исходном уровне, в день 1, день 2, день 3, месяц 3, месяц 6, месяц 9 и месяц 12 (или при досрочном прекращении исследования). Электрокардиограммы или данные аппарата ЭКГ собирают для централизованного рассмотрения кардиологом. ЭКГ в 12 отведениях выполняют (одновременно с холтеровским мониторированием) в день доставки генов, а также в день 2 и день 3 после доставки генов. Дополнительный электрофизиологический мониторинг остается на усмотрение исследователя в соответствии с местными институциональными рекомендациями.

Другие клинические оценки: холтеровское мониторирование в 12 отведениях

[218] Пациентам прикрепляли холтеровский монитор непрерывного действия в 12 отведениях за 24 часа до введения дозы в день -1. Холтеровский монитор оставляли на протяжении 48 часов (день 3). Серийные данные ЭКГ синхронизируют в трех повторностях на основе данных холтеровского монитора в следующие моменты времени: перед введением дозы, через 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 36 часов и 48 часов. Двадцатичетырехчасовое холтеровское мониторирование выполняют во время скрининга и во время визитов в месяцы 1, 2, 3, 6, 9 и 12 (или при досрочном прекращении исследования).

Другие клинические оценки: эхокардиография

[219] Эхокардиографию выполняют во время скрининга/на исходном уровне, а также во время визитов в месяц 3, месяц 6, месяц 9 и месяц 12 (или при досрочном прекращении исследования).

Другие клинические оценки: рентгенография позвоночника

[220] Рентгенографию позвоночника выполняют во время скрининге/на исходном уровне, чтобы исключить пациентов с тяжелым сколиозом или тех, которым потребуются серьезные хирургические вмешательства на позвоночнике в течение 1-летнего периода оценки исследования.

Другие клинические оценки: обследование легких

[221] Пациентов оценивает пульмонолог в моменты времени, указанные в таблице 4, и их могут снабдить неинвазивной вентиляцией легких с положительным давлением (например, BiPAP) на усмотрение пульмонолога и/или исследователя. Пациентов, которым требуется неинвазивная вспомогательная вентиляция легких, просят приносить аппарат при каждом визите исследования, чтобы исследовательский персонал мог извлечь SD-карту, на которой записываются фактические данные об использовании. Эти данные об использовании переносятся в клиническую базу данных. Пациентов, которым требуется неинвазивная вспомогательная вентиляция легких, просят вынуть SD-карту и отправить ее в исследовательский центр в случае пропуска визитов исследования.

Контроль инъекции AVXS-101 с помощью флюороскопии/рентгенографии

[222] Процедуру интратекальной инъекции AVXS-101 выполняет в стерильных условиях при контроле с помощью флюороскопии интервенционный радиолог или другой соответствующим образом обученный и опытный врач в соответствии с институциональными рекомендациями. Получение рентгенографических снимков для этой процедуры может не потребоваться.

Другие клинические оценки: получение фотографий места инъекции

[223] Делают фотографии места инъекции вплоть до дня 30 в моменты времени, указанные в таблице 4, для отслеживания заживления инъекционной раны.

Другие клинические оценки: лабораторные оценки

[224] Биологические образцы собирают на протяжении всего испытания в моменты времени, указанные в таблице 4. Биологические образцы собирают и отправляют в центральную лабораторию. Образцы для лабораторных тестов, проводимых за день до введения дозы (день -1), собирают перед введением дозы и обрабатывают на месте в местной лаборатории центра, сертифицированной в соответствии с Поправками по совершенствованию клинических лабораторий (CLIA). В некоторых случаях образцы могут собирать на месте для получения немедленных результатов или из других соображений безопасности или логистики.

Таблица 5. Общий объем крови

Визит	Тесты	Общий объем
Скрининг	Гематологическое исследование, биохимическое исследование/CK-MB или определение уровня тропонина I, исследование свертывания крови, серологическая реакция на вирусы, образец для иммунологического исследования (только антитела к AAV9/SMN), образец для подтверждения диагноза	19,3-19,6 мл
День 1	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови, исследование газового состава капиллярной крови	6,0 мл
День 2	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови, исследование газового состава капиллярной крови	6,0 мл
День 7	Гематологическое исследование, биохимическое исследование/CK-MB3 или определение уровня тропонина I, исследование свертывания крови, образец для иммунологического исследования	10,0-12,3 мл
День 14	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови, образец для иммунологического исследования	9,0-11,0 мл
День 21	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови, образец для иммунологического исследования	9,0-11,0 мл
День 30	Гематологическое исследование, биохимическое исследование/CK-MB3 или определение уровня тропонина I, исследование свертывания крови, образец для иммунологического исследования	11,0-12,3 мл
Месяц 2	Гематологическое исследование, биохимическое исследование/CK-MB3 или определение уровня тропонина I, исследование свертывания крови	6,0-6,3 мл
Месяц 3	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови	5 мл
Месяц 4	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови	5 мл
Месяц 5	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови	5 мл
Месяц 6	Гематологическое исследование, биохимическое исследование/CK-MB3 или определение уровня тропонина I, исследование свертывания крови	6,0-6,3 мл
Месяц 7	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови	5 мл
Месяц 8	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови	5 мл
Месяц 9	Гематологическое исследование, биохимическое исследование/CK-MB3 или определение уровня тропонина I, исследование свертывания крови	6,0-6,3 мл
Месяц 10	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови	5 мл
Месяц 11	Гематологическое исследование, биохимическое исследование, исследование свертывания крови	5 мл
Последний визит исследования (месяц 12)	Гематологическое исследование, биохимическое исследование/CK-MB3 или определение уровня тропонина I, исследование свертывания крови	6,0-6,3 мл
Общий объем в течение 1 года исследования		135-137,1 мл

[225] В случае, если у пациента невозможно собрать достаточное количество крови, кровь используют в следующем порядке приоритетов, где первый пункт имеет наибольший приоритет, а последний пункт имеет наименьший приоритет:

1. Лабораторные исследования крови по безопасности: биохимическое исследование > гематологическое исследование > исследование свертывания крови > CK-MB или определение уровня тропонина;

2. Исследование IFN-γ с помощью ELISpot для определения Т-клеточных ответов;

3. Определение антитела к AAV9 и SMN в сыворотке крови;

4. Генетическое тестирование для повторного подтверждения.

[226] Если во время скринингового визита объема крови не достаточно для включения образца, предназначенного для генетического тестирования для повторного подтверждения, пациент возвращается до визита 2. Все пациенты выполняют генетическое тестирование для повторного подтверждения.

Другие клинические оценки: Общий анализ крови

[227] Гематологический анализ включает CBC с определением лейкоцитарной формулы и количества тромбоцитов с мазком. Образцы собирают и отправляют в соответствии с лабораторным руководством, предоставленным центральной лабораторией. Немедленные гематологические анализы/анализы день в день во время введения дозы в стационаре, как определено исследователем, выполняют согласно стандартным процедурам исследовательского центра в местной лаборатории.

Другие клинические оценки: биохимическое исследование сыворотки

[228] Образцы собирают и отправляют в соответствии с лабораторным руководством, предоставленным центральной лабораторией.

[229] Немедленные биохимические анализы/анализы день в день во время введения дозы в стационаре, как определено исследователем, выполняют согласно стандартным процедурам исследовательского центра в местной лаборатории.

[230] Во время всех визитов исследования биохимический анализ включает следующие показатели: определение уровней гамма-глутамилтрансферазы (GGT) в сыворотке крови, AST/ALT, общего билирубина в сыворотке крови, прямого билирубина, альбумина, глюкозы, общей креатинкиназы, креатинина, BUN, электролитов, щелочной фосфатазы.

[231] Образцы для CK-MB или определения уровня тропонина I собирают во время скрининга, в день 7, день 30, день 60, а также в месяцы 6, 9 и 12/в конце исследования. Уровень тропонина I измеряют вместо CK-MB у новых пациентов, прошедших скрининг и включенных в исследование после вступления в силу поправки 5 (версия протокола 6.0). Участники, прошедшие скрининг и включенные в исследование, но еще не получившие генную заместительную терапию (визит № 2) на момент вступления в силу поправки 5 (версия протокола 6.0), должны пройти тестирование на определение уровня тропонина I на исходном уровня перед лечением с помощью AVXS-101 и проходят тестирование на определение уровня тропонина I вместо CK-MB. Образцы для CK-MB собирают у всех остальных участников. Исследователи получают результаты лабораторных исследования для всех визитов исследования от центральной лаборатории (кроме результатов дня -1).

Другие клинические оценки: серологическая реакция на вирусы

[232] При введение вектора на основе AAV существует риск развития иммуноопосредованного гепатита. Для пациентов, которые имеют HIV или положительную серологическую реакцию на вирус гепатита B, C или вирус Зика, введение вектора на основе AAV может приводить к необоснованному риску; следовательно, отрицательные серологическое тестирование подтверждают при скрининге до лечения. Данные образцы собирают и отправляют в соответствии с лабораторным руководством, предоставленным центральной лабораторией.

Другие клинические оценки: исследования свертывания крови

[233] Образцы для исследований свертывания крови, включающих определение протромбинового времени (PT), частичного протромбинового времени (PTT) и международного нормализованного отношения (INR), собирают в соответствии с лабораторным руководством, предоставленным центральной лабораторией. Исследования коагуляции выполняют в моменты времени, указанные в таблице 4.

Другие клинические оценки: анализ мочи

[234] Образцы мочи собирают в соответствии с лабораторным руководством, предоставленным центральной лабораторией, в моменты времени, указанные в таблице 4. Анализ мочи в день -1 и немедленный анализ мочи/анализ день в день во время введения дозы в стационаре, как определено исследователем, выполняют в соответствии со стандартными процедурами исследовательского центра в местной лаборатории. Анализ мочи включает следующие параметры: определение цвета, прозрачности/мутности, pH, удельного веса, уровней глюкозы, кетонов, нитритов, лейкоцитарной эстеразы, билирубина, содержания крови, белка, эритроцитов, лейкоцитов, клеток плоского эпителия, цилиндров, кристаллов, бактерий, дрожжей.

Другие клинические оценки: исследование газового состава капиллярной крови

[235] Исследование газового состава капиллярной крови выполняют в моменты времени, указанные в таблице 4. Ланцетом или аналогичным инструментом делают прокол или небольшой разрез в кутикулярном слое кожи пациента в области с высокой васкуляризацией (пятка, палец руки, палец ноги). Чтобы ускорить кровоток и снизить разницу между давлением газов в артериальной и венозной крови, перед проведением пункции область согревают. По мере свободного истечения скольку кровь крови свободно течет из места прокола, образец собирают в капиллярную трубку собирают образец.

Другие клинические оценки: ELISA: Ab к AAV9

[236] Образцы крови собирают и отправляют в центральную лабораторию в соответствии с лабораторным руководством для тестирования антител к AAV9 в сыворотке крови при скрининге и в моменты времени, указанные в таблице 4.

Другие клинические оценки: ELISA: антитела к SMN

[237] Образцы крови собирают и отправляют в центральную лабораторию в соответствии с лабораторным руководством для тестирования антител к SMN в сыворотке крови в моменты времени, указанные в таблице 4.

Другие клинические оценки: исследование IFN-γ с помощью ELISpot

[238] Кровь собирают и отправляют в центральную лабораторию в соответствии с лабораторным руководством для проведения выявления гамма-интерферона (IFN-γ) с помощью ELISpot для обнаружения Т-клеточных ответов на AAV9 и SMN в моменты времени, указанные в таблице 4.

Другие клинические оценки: скрининг матери на исходном уровне

[239] Существует потенциальная возможность, что у матери пациента, включенного в исследование, могут иметься предсуществующие антитела к AAV9, которые могут быть переданы пациенту посредством плацентарного переноса внутриутробно или теоретически через грудное молоко. У матери пациента запрашивают информированное согласие для скрининга матери на наличие циркулирующих антител к AAV9. После получения информированного согласия у матери проводят забор крови из периферической вены и отправляют в центральную лабораторию для скрининга на антитела к AAV9. Если антитела к AAV9 обнаружены, исследователь должен обсудить с матерью, продолжать или прекратить грудное вскармливание. Пациентов, которые потребляют грудное молоко из банка грудного молока, полученное от доноров, которое нельзя протестировать на антитела к AAV9, переводят на смесь до участия в исследовании.

Другие клинические оценки: сбор крови для тестирования, подтверждающего диагноз

[240] Образец крови собирают во время скринингового визита и отправляют в центральную лабораторию в соответствии с лабораторным руководством для повторного подтверждения делеций в SMN1, числа копий SMN2 и отсутствия мутации-модификатора гена в экзоне 7 (c.859G>C). Это делают, чтобы гарантировать единство в практическом осуществлении диагностического тестирования.

Другие клинические оценки: сбор слюны, мочи и стула

[241] Исследования показали, что некоторые векторы могут выводиться из организма в течение нескольких недель после инъекции; это явление называется "выделением вируса". Выделение векторов можно обнаружить в крови, моче, слюне и стуле в течение недели после инъекции. Риски, ассоциированные с выделенным вектором, в настоящее время неизвестны; однако они маловероятны, поскольку вектор является неинфекционным и не может реплицироваться. Тем не менее, семьям пациентов и лицам, обеспечивающим уход, предоставляются одобренные IRB инструкции, касающиеся использования защитных перчаток при/во время непосредственного контакта с биологическими жидкостями и/или отходами пациента, а также надлежащей гигиены рук в течение как минимум двух недель после инъекции. Кроме того, пациентам запрещается быть донорами крови в течение двух лет после инъекции вектора.

[242] Образцы слюны, мочи и стула собирают в соответствии с лабораторным руководством для исследований выделения вирусов в соответствии с таблицей 4, включая моменты 24 часа и 48 часов после введения дозы. Во всех центрах пациенты возрастом ≥48 месяцев, которые больше не носят подгузники, сдают образцы полного объема мочи и полного объема кала в день 7, день 14 и день 30, полученные за счет по меньшей мере одного мочеиспускания и одной дефекации. Образцы подготавливают в соответствии с лабораторным руководством, хранят в морозильной камере при температуре -80°C и отправляют в центральную лабораторию в соответствии с лабораторным руководством. У подгруппы пациентов в центрах, решивших участвовать в подысследовании по выделению вируса, собирают образцы общего 24-часового объема мочи и кала на протяжении 24 часов после введения дозы и 48 часов после введения дозы (чтобы включить все выделения за эти периоды времени).

Пример 2. - Исследования AVXS-101 на пациентах со SMA (промежуточные результаты клинических испытаний I)

[243] Пациентов идентифицировали, лечили и оценивали в соответствии с протоколом, описанным в примере 1. AVXS-101 вводили интратекально пациентам со спинальной мышечной атрофией (SMA), которые могли сидеть, но не могли стоять или ходить на момент включения в исследование. Пациенты имели 3 копии гена SMN2 в дополнение к биаллельной делеции в SMN1. Пациентов разделяли на две группы: пациенты возрастом >6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы и пациенты возрастом ≥24 месяцев и <60 месяцев на момент введения дозы. В исследование включили шестнадцать пациентов возрастом >6 месяцев и <24 месяцев и двенадцать пациентов возрастом ≥24 месяцев и <60 месяцев. В пределах группы более младшего возраста три пациента получили введение 6,0 × 10¹³ vg AVXS-101 (доза А). Остальные пациенты более младшего возраста и все пациенты более старшего возраста получали 1,2×10¹⁴ vg AVXS-101 (доза B).

[244] Пациенты получали AVXS-101, предварительно смешанный с 1,5 мл подходящей контрастной среды для рентгенографического мониторинга, в виде единоразового введения посредством поясничной интратекальной (IT) инъекции. Пациенты получали преднизолон с профилактической целью в течение первых двух месяцев после лечения, чтобы ослабить иммунный ответ хозяина. Безопасность и эффективность оценивали периодически в течение периода 12 месяцев после лечения. Для пациентов возрастом >6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы показателем эффективности была доля пациентов, у которых достигалась способности стоять самостоятельно (Шкалы оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® - № 40 компонента Крупная моторика). Оценивали дополнительные показатели развития, определенные согласно критерию Многоцентрового исследования по разработке справочных показателей роста Всемирной организации здравоохранения (WHO-MGRS) (Wijnhoven, 2004), включая перекатывание со спины на бок, ползание, стояние с опорой, подтягивание, чтобы встать, и ходьбу с посторонней помощью или без нее. Для пациентов возрастом ≥24 месяцев и <60 месяцев на момент введения дозы показателем результата было изменение балла по Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE) относительно исходного уровня. Процент отвечающих на лечение пациентов (определяемых как достигающие увеличения балла по HFMSE на >3 пунктов; Swoboda, et al 2010) оценивали ежемесячно.

[245] Пациентов возрастом 6-24 месяца со SMA 2 типа оценивали в промежуток времени от пяти до 12 месяцев после интратекального введения дозы A (6,0×10¹³ vg; n=3) или дозы B (1,2×10¹⁴ vg; n=13) AVXS-101. Как показано в таблице 6, изменения баллов по шкале Крупная моторика шкалы Бейли® варьировались от -1 до 14 пунктов (среднее увеличение+SD составило 3,6+3,5 пункта), при этом 14 из 16 пациентов (87,5%) показали улучшения относительно исходного уровня. После лечения семь из 16 пациентов достигли по меньшей мере одного нового элемента по шкале Bayley® . Два пациента - по одному в группе каждой дозы - достигли конечной точки исследования, заключающейся в самостоятельном стоянии (E02, E24); один пациент (E24) достиг стояния до возраста 20 месяцев и теперь передвигается самостоятельно.

Таблица 6. Выбранные элементы Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли - Шкала крупной моторики у пациентов со SMA 2 типа возрастом от 6 до 24 месяцев

[246] Пациентов возрастом от двух до пяти лет со SMA 2 типа оценивали в промежуток времени от пяти до девяти месяцев после интратекального введения дозы B (1,2×10¹⁴ vg; n=12) AVXS-101. Как показано в таблице 7, изменения баллов по шкале Крупная моторика шкалы Бейли® варьировались от -8 до 10 пунктов (среднее увеличение+SD составило 2,1+1,3 пункта), при этом девять из 12 пациентов (75%) показали улучшения относительно исходного уровня. После лечения пять из 12 пациентов (42%) достигли по меньшей мере одного нового элемента по шкале Бейли®. Два пациента (E07; E13) продемонстрировали способность стоять с опорой после лечения. Один пациент (E07) в настоящее время может ходить с посторонней помощью.

Таблица 7. Выбранные элемента Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® - Шкалы Крупная моторика у пациентов со SMA 2 типа возрастом от 2 лет до 5 лет

[247] Оценку по Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE) проводили у пациентов после достижения двухлетнего возраста (возрастная группа от 6 до 24 месяцев) и более взрослых пациентов (возрастная группа от 2 до 5 лет). Изменения баллов по HFMSE варьировались от -4 до 14 пунктов (среднее увеличение+SD составило 4,3+5,3 пункта), при этом 12 из 19 пациентов (63,1%) показали улучшение относительно исходного уровня. Семь из 12 пациентов (58%) в старшей возрастной группе (2-5 лет) показали улучшение по HFMSE, тогда как в младшей группе (6-24 месяца) улучшение показали пять из семи пациентов (71%). Один пациент (E02), получивший лечение в возрасте 20,3 месяца, достиг способности стоять без опоры. Двенадцать из 19 пациентов (63%) были признаны отвечающими на лечение (достигшими улучшения по HFMSE на три пункта или больше) (фиг. 3). Корреляции между баллом по HFMSE и возрастом пациента на момент лечения не обнаружили. Swoboda et al. (2010) "SMA CARNI-VAL Trial Part I: Double-Blind, Randomized, Placebo-Controlled Trial of L-Carnitine and Valproic Acid in Spinal Muscular Atrophy," PLOS ONE 5(8): e12140.

Таблица 8. Выбранные элементы Расширенной шкалы оценки моторных функций больницы Хаммерсмит (HFMSE) у пациентов со SMA 2 типа возрастом от 2 лет до 5 лет на момент оценки

[248] На фиг. 3 показаны баллы по HFMSE для отдельных пациентов в зависимости от возраста пациента. Тестирование по HFMSE не начинали у пациентов в возрастной группе 6-24 месяца до достижения ими возраста 24 месяцев. Шестьдесят три процента пациентов (12 из 19) показали улучшение по HFMSE. Один пациент в группе дозы A (6,0×10¹³ vg) показал улучшение на восемь пунктов к сроку восемь месяцев после лечения; второй пациент в группе дозы A показал снижение на два пункта после семи месяцев оценки.

[249] В данном исследовании как отвечающих на лечение характеризовали пациентов, которые достигли улучшения по HFMSE, составившего по меньшей мере 3 пункта. Для когорты старшего возраста (возраст от двух до пяти лет) оценку по HFMSE проводили от исходного уровня вплоть до 5 месяцев после лечения для 12 пациентов и для 10 и 5 пациентов на шестом и седьмом месяцах соответственно. Для когорты более младшего возраста (от шести месяцев до двух лет) одного пациента оценивали в месяцы три и четыре, а пять пациентов оценивали в месяцы шесть и семь после получения лечения с помощью AVXS-101. Все пациенты из когорты старшего возраста и пациенты из когорты более младшего возраста, которые достигли возраста два года и больше, показаны на фиг. 5. Уровень пациентов с быстрым ответом на лечение, составляющий 50%, наблюдали уже через месяц после лечения. Уровень отвечающих на лечение поддерживался на уровне 50% или выше вплоть до семи месяцев исследования, при этом с течением времени наблюдали тенденцию увеличения уровней ответов.

[250] В случае полной когорты (n=12), оцениваемой от исходного уровня на протяжении пяти месяцев после лечения, ежемесячные уровни отвечающих на лечение в когорте старшего возраста (возраст от двух до пяти лет), для которых выполняли оценки по HFMSE, показаны на фиг. 6. Уровень отвечающих на лечение, составляющий 50%, наблюдали уже через один месяц после лечения. За исключением шестого месяца после лечения, уровни отвечающих на лечение поддерживалась при значении 50% или выше на протяжении семи месяцев исследования. У одного пациента с ранним ответом на лечение наблюдали падение балла по HFMSE при оценке через шесть месяцев, что снизило уровень отвечающих на лечение ниже 50% в этот момент времени.

[251] В общей сложности во время периода наблюдения, составляющего от четырех до двенадцати месяцев, у 11 из 24 пациентов наблюдали двадцать три новых показателя развития моторных навыков (таблицы 6-8). В когорте пациентов старшего возраста средний балл по HFMSE увеличился на 4,3 пункта в период между 5 и 9 месяцами исследования (таблица 8). После лечения у большинства пациентов в когортах обоих возрастов (63%) были улучшения баллов по HFMSE, независимо от дозы (фиг. 3, 4). У пятидесяти процентов пациентов в данном исследовании были клинически значимые улучшения по HFMSE (т. е. они были отвечающими на лечение с увеличением баллов на >3 пунктов) уже через один месяц после терапии, при этом уровни отвечающих на лечение постепенно увеличивались с течением времени. Лечение с помощью AVXS-101 было более эффективным, чем сообщалось в отношении других средств терапии, таких как, например, стандарт лечения. Эти результаты демонстрируют, что большинство пациентов имели ранние ответы на однократную дозу AVXS-101, вводимую интратекально, и показали быстрое начало ответа с сохранением эффекта на протяжении всего периода, в течение которого изучали AVXS-101, введенный интратекально.

Пример 3. - Исследования AVXS-101 на пациентах со SMA (промежуточные результаты клинических испытаний II)

[252] Дополнительные промежуточные результаты клинических испытаний, подробно описанных в примерах 1 и 2, представлены в данном разделе. AVXS-101 вводили интратекально (IT) пациентам со спинальной мышечной атрофией (SMA), которые могли сидеть без опоры в течение ≥10 секунд, но не могли стоять или ходить самостоятельно на момент включения в исследование. Пациенты имели 3 копии гена SMN2 в дополнение к биаллельной делеции в SMN1. Пациентов разделяли на две группы: пациенты возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы и пациенты возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев на момент введения дозы. Оценки на исходном уровне перед лечением выполняли для всех пациентов, принимавших участие в исследовании (возрастом ≥6 месяцев и <60 месяцев), с использованием Шкал Бейли®, и дополнительные оценки на исходном уровне выполняли для возрастной группы ≥24 месяцев и <60 месяцев с использованием HFMSE.

[253] В пределах этих двух возрастных групп вводили три различные терапевтические дозы, как описано ниже. Три пациента возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы получали однократное IT введение 6,0×10¹³ vg AVXS-101 (доза A). Тринадцать пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев и двенадцать пациентов возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев получали однократное IT введение 1,2×10¹⁴ vg AVXS-101 (доза B). Три пациента возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы получали однократное IT введение 2,4×10¹⁴ vg AVXS-101 (доза C). В будущих исследованиях дополнительным 21 пациенту будут вводить дозу C, при этом 9 из этих пациентов будут принадлежать к возрастной группе ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы, а 12 из этих пациентов будут принадлежать к возрастной группе ≥24 месяца и <60 месяцев на момент введения дозы.

[254] В текущую исследуемую популяцию также включены 31 пациент из выборки в зависимости от назначенного лечения (ITT), которая была определена как все пациенты, получившие IT AVXS-101, из которых 19 пациентов были в возрасте ≥6 месяцев и <24 месяцев, а 12 пациентов были в возрасте от ≥24 до <60 месяцев на момент включения в исследование. Кроме того, 4 пациентов (3 пациента группы дозы A и 1 пациент группы дозы B) включили в выборку завершивших исследование пациентов для анализа эффективности (ECAS), которая была определена как все пациенты, которые завершили 12-месячное последующее наблюдение после введения дозы. Все анализы эффективности проводили с использованием выборки ITT в качестве первичной популяции и ECAS в качестве вспомогательной популяции для промежуточных результатов.

[255] Данные пациентов, которых лечили с помощью AVXS-101, сравнивали с исходными данными пациентов, взятыми из рецензируемого и широко цитируемого набора данных естественного течения заболевания, собранного сетью Педиатрического нейромышечного клинического исследования (PNCR). Kaufmann et al., "Prospective cohort study of spinal muscular atrophy types 2 and 3." (2012) Neurology, 79(18):1889-1897. PNCR представляет собой крупное исследование естественного течения заболевания на основе когорты из 337 пациентов с любой формой SMA, проводимое в 3 крупных, международно признанных медицинских центрах третичного уровня, обладающих достаточным уровнем экспертности в ведении SMA (Бостонская детская больница Гарвардского университета, Колумбийский университет и Детская больница Филадельфии Пенсильванского университета). Эти данные не содержат оценок с использованием Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, что ограничивает использование данных PNCR для возрастной группы ≥6 месяцев и <24 месяцев. Мутацию-модификатор d SMN2 (c.859G>C), описанную в Prior и соавт., в исследуемой когорте PNCR не оценивали. Prior et al., "A positive modifier of spinal muscular atrophy in the SMN2 gee." (2009) A. J. Hum. Genet., 85(3):408-441.

[256] Контрольная группа с естественным течением заболевания PNCR N=51: В случае пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев когорту из 51 пациента, выбранных из исследования естественного течения заболевания PNCR, обозначали как "популяционно-сопоставленную" контрольную когорту. Данная когорта сравнения включает всех 51 пациента, включенных в исследование PNCR, которые соответствовали следующим критериям: (1) имели SMA 2 или 3 типов, (2) имели 3 копии SMN2, (3) начало симптомов проявилось до 12-месячного возраста, и (4) совершили по меньшей мере один визит в возрасте 36 месяцев или раньше. В вышеуказанной когорте 7/51 пациента (13,74%) достигли способности стоять самостоятельно, что определялось как достижение балла 2 по элементу №19 в HFMSE в любое время в возрасте 36 месяцев или раньше. Способность ходить самостоятельно достигли 5/51 пациента (10%), и это определяли как достижение балла 2 по элементу №20 в HFMSE в любое время в возрасте 36 месяцев или раньше.

[257] Контрольная группа с естественным течением заболевания PNCR N=15: В случае пациентов возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев исходные данные пациентов для когорты из 15 пациентов, выбранных из исследования естественного течения заболевания PNCR, обозначали как "популяционно-сопоставленную" контрольную когорту. Данную контрольную группу использовали для первичных анализов. Данная контрольная группа с естественным течением заболевания характеризовалась следующим: (1) наличием SMA 2 или 3 типов, (2) наличием 3 копий SMN2, (3) началом симптомов до 12-месячного возраста, (4) диагнозом SMA до 24-месячного возраста и (5) неспособностью стоять или ходить на момент включения в исследование PNCR. Членам когорты проводили оценку по HFMS или HFMSE в возрасте от 24 до 60 месяцев, которую использовали в качестве исходного уровня для сравнения с оценками последующего наблюдения. В этой PNCR-группе из 15 пациентов был один пациент, у которого балл по HFMSE, составляющий 0, регистрировали на исходном уровне и во время всех визитов последующего наблюдения. У 5/15 (33%) индивидуумов из когорты баллы по HFMSE собирали в течение периода, превышающего 12 месяцев. Срок последнего визита составил 18 месяцев для 2/15 пациентов (13%), 42 месяца для 2/15 пациентов (13%) и 48 месяцев для 1/15 пациентов (7%).

[258] Контрольная группа с естественным течением заболевания из PNCR N=17: В случае пациентов возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев исходные данные пациентов для когорты из 17 пациентов, выбранных из исследования естественного течения заболевания PNCR, определяли, чтобы улучшить сопоставление между группой пациентов и контрольной группой с естественным течением заболевания. Данную контрольную группу использовали для анализов чувствительности. Двенадцать пациентов, изначально входивших в контрольную группу PNCR N=15, вошли в контрольную группу с естественным течением заболевания PNCR N=17. Трех пациентов, изначально входивших в контрольную группу PNCR N=15, не включили (один индивидуум с баллом по HFMSE=0 на исходном уровне и визитах последующего наблюдения, 2 индивида с последними визитами через >12 месяцев). Данные 17 индивидуумов имели критерии возраста, клинических и генетических показателей, максимально сопоставимые с исследуемой группой. Первый визит в пределах диапазона возраста от ≥24 месяца до <60 месяцев определяли как визит на исходном уровне. Последующие визиты в пределах 12-месячного интервала использовали для определения изменения балла по HFMSE относительно исходного уровня. По клиническим показателям данные индивидуумы могли сидеть, но не могли стоять или ходить самостоятельно. По генетическим показателям пациенты несли биаллельные делеции в SMN1 и имели 3 копии SMN2. Ограничением использования контрольной группы с естественным течением заболевания PNCR было то, что интервалы оценки для разных участников не были одинаковыми. Следовательно, некоторые индивидуумы в данной контрольной группе имели данные за период ≤12 месяцев (см., например, таблицу 13).

[259] Распределение пациентов по лечению и возрасту для всех включенных в исследование пациентов подробно описано в таблице 9. Сводные данные по демографическим характеристикам и характеристикам на исходном уровне для выборки для анализа безопасности представлены в таблице 10 в соответствии с лечением в соответствии с возрастными группами.

Таблица 9. Распределение пациентов - все пациенты (прекращение сбора промежуточных результатов II)

	Доза A	Доза B		Доза C		Всего
	Возраст <24 месяцев	Возраст <24 месяцев	Возраст ≥24 и <60 месяцев	Возраст <24 месяцев	Возраст ≥24 и <60 месяцев	Всего
Подвергнутые скринингу пациенты						36
Пациенты, не прошедшие скрининг						5
Пациенты в выборке включенных в исследование (n (%))	3	13	12	3	0	31
Пациенты в выборке ITT (n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
Пациенты в выборке полного анализа (n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
Пациенты в выборке для анализа безопасности (n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
Пациенты в выборке завершивших исследование пациентов для анализа эффективности (n (%))	3 (100)	1 (7,7)	0	0	0	4 (12,9)
Пациенты, завершившие исследование на данный момент (n (%))	3 (100)	1 (7,7)	0	0	0	4 (12,9)
Пациенты, досрочно прекратившие исследование (n (%))	0	0	0	0	0	0

Таблица 10. Демографические характеристики и характеристики на исходном уровне - выборка для анализа безопасности

Категория демографических характеристик/Статистика	Доза A		Доза B		Доза C	Всего
Категория демографических характеристик/Статистика	Возраст <24 месяцев	Возраст <24 месяцев	Возраст ≥24 и <60 месяцев	Возраст <24 месяцев	Возраст <24 месяцев	Всего
Возраст (месяцы)
n	3	13	12	3	-	31
Среднее (SD)	15,67 (4,041)	15,46 (4,427)	35,92 (10,483)	18,00 (3,464)	-	23,65 (12,200)
Медиана (Min, Max)	18,00 (11,0, 18,00)	16,00 (6,0, 22,0)	32,00 (25,0, 53,0)	16,0 (16,0, 22,0)	-	19,00 (6,0, 53,0)
Пол (n (%))
Самец	1 (33,3)	7 (53,8)	6 (50,0)	3 (100)		17 (54,8)
Женский	2 (66,7)	6 (46,2)	6 (50,0)	0		14 (45,2)
Этническая принадлежность (n (%))
Лица испанского или латиноамериканского происхождения	2 (66,7)	3 (23,1)	0	0	0	5 (16,1)
Лица отличного от испанского или латиноамериканского происхождения	1 (33,3)	10 (76,9)	12 (100)	3 (100)	0	26 (83,9)
Раса (n (%))
Европеоидная	2 (66,7)	10 (76,9)	8 (66,7)	2 (66,7)	0	22 (71,0)
Монголоидная	0	1 (7,7)	4 (33,3)	1 (33,3)	0	6 (19,4)
Другое	0	1 (7,7)	0	0	0	1 (3,2)
Смешанная	1 (33,3)	1 (7,7)	0	0	0	2 (6,5)
Масса тела на исходном уровне (кг)
n	3	13	12	3	-	31
Среднее (SD)	9,90 (1,900)	9,67 (0,778)	13,36 (3,235)	9,23 (0,252)	-	11,08 (2,783)
Медиана (Min, Max)	9,90 (8,0, 11,8)	9,50 (8,3, 10,8)	12,70 (9,8, 20,2)	9,20 (9,0, 9,5)	-	10,10 (8,0, 20,2)
Длина тела/рост на исходном уровне (см)
n	3	13	12	3	-	31
Среднее (SD)	76,63 (4,744)	77,12 (5,308)	92,28 (8,449)	74,50 (2,500)	-	82,68 (9,998)
Медиана (Min, Max)	74,90 (73,0, 82,0)	75,50 (69,0, 87,0)	89,00 (82,5, 112,0)	74,50 (72,0, 77,0)	-	81,00 (69,0, 112,0)
BMI на исходном уровне (кг/м²)
n	3	13	12	3	-	31
Среднее (SD)	16,736 (1,4937)	16,363 (1,6485)	15,530 (1,9429)	16,653 (0,6724)	-	16,105 (1,6973)
Медиана (Min, Max)	17,549 (15,01, 17,65)	16,576 (12,55, 18,90)	15,223 (12,78, 18,66)	16,576 (16,02, 17,36)	-	16,139 (12,55, 18,90)
Семейный анамнез SMA, включая пораженных заболеванием братьев и сестер или родителей-носителей (n [%])
Да (n (%))	1 (33,3)	1 (7,7)	1 (8,3)	0	0	3 (9,7)
Нет (n (%))	1 (33,3)	12 (92,3)	11 (91,7)	2 (66,7)	0	26 (83,9)
Неизвестно (n (%))	1 (33,3)	0	0	1 (33,3)	0	2 (6,5)
Гестационный возраст при рождении (недели)
n	3	13	11	3	-	30
Среднее (SD)	38,33 (1,155)	39,15 (0,899)	39,45 (2,162)	40,00 (1,000)	-	39,27 (1,507)
Медиана (Min, Max)	39,00 (37,0, 39,0)	39,00 (38,0, 41,0)	40,00 (35,0, 42,0)	40,00 (39,0, 41,0)	-	39,00 (35,0, 42,0)
Масса тела при рождении (кг)
n	3	12	11	3	-	29
Среднее (SD)	3,193 (0,3722)	3,699 (0,8065)	3,248 (0,5360)	3,483 (0,2937)	-	3,453 (0,6507)
Медиана (Min, Max)	3,240 (2,80, 3,54)	3,590 (3,10, 6,13)	3,200 (2,55, 4,20)	3,430 (3,22, 3,80)	-	3,410 (2,55, 6,13)
Длинна тела при рождении (см)
n	3	9	7	3	-	22
Среднее (SD)	50,557 (2,2748)	50,459 (1,9058)	51,261 (2,2702)	49,520 (2,1478)	-	50,600 (2,0272)
Медиана (Min, Max)	50,170 (48,50, 53,00)	51,000 (47,00, 52,07)	51,000 (48,26, 55,50)	48,300 (48,26, 52,00)	-	51,000 (47,00, 55,50)
Окружность головы при рождении (см)
n	3	5	7	2	-	17
Среднее (SD)	36,880 (3,4063)	34,464 (0,8328)	34,814 (1,5356)	34,750 (1,0607)	-	35,068 (1,8300)
Медиана (Min, Max)	36,000 (34,00, 40,64)	34,800 (33,02, 35,00)	34,000 (33,00, 36,70)	34,750 (34,00, 35,50)	-	34,800 (33,00, 40,64)
Сообщаемые пациентом случаи госпитализации (n [%])
Да (n (%))	1 (33,3)	4 (30,8)	5 (41,7)	1 (33,3)	0	11 (35,5)
Нет (n (%))	2 (66,7)	9 (69,2)	7 (58,3)	2 (66,7)	0	20 (64,5)
Сообщаемая пациентом поддержка при питании (n [%])
Да (n (%))	0	0	0	0	0	0
Нет (n (%))	3 (100)	13 (100)	12 (100)	3 (100)	0	31 (100)
Сообщаемая пациентом вспомогательная вентиляция легких (n [%])
Да (n (%))	0	0	1 (8,3)	0	0	1 (3,2)
Нет (n (%))	3 (100)	13 (100)	11 (91,7)	3 (100)	0	30 (96,8)

Промежуточные результаты: промежуточная оценка первичной конечной точки эффективности для группы возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев (дозы A, B и C; всего n=19)

[260] Первичной конечной точкой эффективности для данной возрастной группы было приобретение навыка "стоит без опоры в течение по меньшей мере 3 секунд" согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® - элемент №40 компонента Крупная моторика. Считалось, что пациенты достигли этого показателя развития, если этот показатель развития приобретался в любой момент во время 12-месячного периода последующего наблюдения после введения дозы. Видеозаписи оценки показателей развития в исследовательском центре подтверждал независимый центральный рецензент.

Первичные результаты эффективности в зависимости от дозы для выборки ITT обобщены ниже и в таблице 11.

[261] В случае дозы A (6,0×10¹³ vg AVXS-101) 1 из 3 пациентов (33,3%), пациент 007-001, достиг стояния с опорой в срок 11 месяцев после лечения. Возраст данного пациента составлял примерно 20 месяцев на момент введения дозы. Хотя пациент не стоял самостоятельно, на момент включения в исследование пациент достиг следующих навыков: поддержание собственного веса (№33 по шкале Бейли®), ходьба с опорой (№37 по шкале Бейли®) и ходьба боком с опорой (№38 по шкале Бейли®).

[262] В случае дозы B (1,2×10¹⁴ vg AVXS-101) 1 из 13 пациентов (7,7%), пациент 007-002, достиг стояния без опоры в пределах 3 месяцев после лечения. Возраст данного пациента составлял примерно 7 месяцев на момент введения дозы. Согласно заявлению врача-исследователя у данного пациента отсутствовали проявления SMA, идентифицируемые при неврологическом обследовании. Поскольку у пациента был пораженный заболеванием брат или сестра, пациенту поставили диагноз в раннем возрасте с помощью генетического тестирования, после чего проводили исследования нервной проводимости. Перед включением в исследование суммарный потенциал действия мышцы (CMAP) демонстрировал отклонение от нормы.

[263] В случае дозы C (2,4×10¹⁴ vg AVXS-101) ни один из пациентов (0 из 3) не достиг показателя развития, заключающегося в стоянии без опоры, при оценках до срока 12 месяцев после лечения (таблица 11).

[264] В случае дозы B+дозы C 1 из 16 пациентов (6,3%), пациент 007-002 (описанный выше), достиг показателя развития, заключающегося в стоянии без опоры, в срок 3 месяцев после лечения.

Таблица 11. Доля пациентов возрастом <24 месяцев на момент введения дозы, достигших способности стоять самостоятельно во время любого визита после исходного уровня до срока 12 месяцев - выборка ITT

Оценка	Статистические показатели	Контрольная группа с естественным течением заболевания PNCR (n=51)	Доза A (n=3)	Доза B (n=13)	Доза C (n=3)	Доза B+C (n=16)
Доля пациентов, достигших способности стоять самостоятельно	Да	7 (13,7)	1 (33,3)	1 (7,7)	0	1 (6,3)
Доля пациентов, достигших способности стоять самостоятельно	Нет	44 (86,3)	2 (66,7)	12 (92,3)	3 (100,0)	15 (93,8)
Критерий для разницы долей*	Разница долей (95% CI)			-6,0 (-21,8, 22,8)	-13,7 (-28,9, 56,5)	-7,5 (-22,0, 17,2)
Критерий для разницы долей*	p-значение (точный критерий Фишера)			>0,9999	>0,9999	0,6687

*Точный критерий Фишера использовали только для доз B, C и B+C.

[265] В случае контролей с естественным течением заболевания со SMA 2 и 3 типов из набора данных PNCR N=51, 7 из 51 пациента (13,7%) достигли показателя развития, заключающегося в стоянии без опоры (как показано в таблице 11).

[266] Статистический анализ выполняли в соответствии с протоколом с использованием точного критерия Фишера для сравнения долей пациентов, достигших показателя развития (первичной конечной точки эффективности), между группами и анализа Каплана-Мейера для вспомогательной конечной точки эффективности. Первичная конечная точка эффективности, заключающаяся в достижении способности стоять самостоятельно, во время любого визита после исходного уровня до 12 месяцев, представлена в таблице 11.

[267] Время до достижения способности стоять самостоятельно обобщено для всех пациентов в группе PNCR, а также в зависимости от дозы в выборке ITT. Используя модель пропорциональных рисков Кокса для оценки разницы лечения с использованием возраста пациента на исходном уровне в качестве ковариаты, получили соотношение рисков (95% CI) 0,43 (0,05, 3,93) для группы дозы B, 0 (0, не подлежит оценке) для группы дозы C и 0,37 (0,04, 3,39) для группы доза B+доза C, при этом p-значения составили 0,4576, 0,9951 и 0,3826 соответственно. Большинство пациентов в исследовании не достигли показателя развития, заключающегося в самостоятельном стоянии, на момент представления промежуточных результатов, что препятствует расчету таких значений, как 25-й процентиль, медиана и 75-й процентиль.

Промежуточные результаты: промежуточная оценка первичной конечной точки эффективности для группы возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев (доза B; всего n=12)

а. Анализ первичной эффективности с использованием контрольной группы с естественным течением заболевания PNCR N=15

[268] Первичной конечной точкой эффективности для этой возрастной группы было изменение балла по HFMSE относительно исходного уровня к месяцу 12. Значения балла по HFMSE на исходном уровне, после исходного уровня и изменения относительно исходного уровня обобщены и проанализированы с использованием выборки ITT. Контрольную группу с естественным течением заболевания PNCR N=15 используют в качестве первичной "популяционно-сопоставленной" контрольной когорты для анализов, указанных в протоколе.

[269] График изменения баллов по HFMSE относительно исходного уровня до месяца 12 для всех индивидуумов, которых лечили с помощью дозы В AVXS-101, и контролей с естественным течением заболевания PNCR N=15, показан на фиг. 7. Описательные статистики для подвергнутых лечению пациентов и контролей представлены в таблице 12.

[270] У контролей с естественным течением заболевания PNCR N=15 среднее ± стандартное отклонение (SD) для балла по HFMSE на исходном уровне составило 11,8 ± 7,34. В данной контрольной группе PNCR изменение балла по HFMSE относительно исходного уровня можно было рассчитать в месяц 2 (-0,6 ± 1,35), месяц 4 (0,4 ± 0,98), месяц 6 (0,2 ± 1,72), месяц 9 (1,0 ± 2,16) и месяц 12 (0,8 ± 2,86).

[271] В группе лечения с дозой B AVXS-101 значение балла по HFMSE на исходном уровне составляло 14,8 ± 9,98. У большинства подвергнутых лечению пациентов имелись данные баллов по HFMSE за период до 8 месяцев (11/12). Изменение балла по HFMSE относительно исходного уровня в месяцы 2, 4, 6, 9 и 12 составляло 3,5 ± 4,38, 3,6 ± 5,07, 3,9 ± 5,85, 5,7 ± 6,72 и 7 соответственно. В группе лечения с дозой B показано устойчивое увеличение баллов по HFMSE по сравнению с контрольной группой с естественным течением заболевания PNCR N=15.

Таблица 12. Значения баллов по HFMSE в определенные моменты времени (пациенты возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев) - выборка ITT - доза B

Оценка во время визита	Контрольная группа с естественным течением заболевания PNCR (N=15)			Доза B (N=12)
Оценка во время визита	n	Среднее (SD)	Медиана (Min, Max)	n	Среднее (SD)	Медиана (Min, Max)
Исходный уровень
Наблюдаемые баллы	15	11,8 (7,34)	9,0 (0, 22)	12	14,8 (9,98)	12,0 (3,32)
Месяц 1
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	17,2 (10,05)	15,0 (2,36)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	2,4 (3,34)	3,0 (-4, 8)
Месяц 2
Наблюдаемые баллы	10	-13,9 (6,30)	15,5 (5, 21)	12	18,3 (11,04)	14,5 (5, 38)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	10	-0,6 (1,35)	-1,0 (-2, 2)	12	3,5 (4,38)	3,0 (-4, 14)
Месяц 3
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	18,5 (10,94)	15,5 (4, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	3,8 (3,93)	5,0 (-4, 11)
Месяц 4
Наблюдаемые баллы	7	14,1 (7,15)	15,0 (4, 23)	12	18,3 (11,83)	15,5 (4, 40)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	7	0,4 (0,98)	0,0 (-1, 2)	12	3,6 (5,07)	5,0 (-4, 12)
Месяц 5
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	19,3 (11,69)	16,5 (4, 40)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	4,5 (5,79)	5,5 (-3, 16)
Месяц 6
Наблюдаемые баллы	6	10,5 (7,69)	9,5 (0, 22)	12	18,7 (11,72)	15,5 (2, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	6	0,2 (1,72)	0,0 (-2, 3)	12	3,9 (5,85)	4,5 (-4, 16)
Месяц 7
Наблюдаемые баллы	1	21,0	21 (21, 21)	11	17,5 (10,14)	16,0 (4, 32)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	1	-1,0	-1,0 (-1, -1)	11	4,3 (5,35)	4,0 (-3. 14)
Месяц 8
Наблюдаемые баллы	1	20	20 (20, 20)	11	20,5 (11,89)	17,0 (7, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	1	2,0	2,0 (2, 2)	11	4,7 (6,48)	4,0 (-7, 16)
Месяц 9
Наблюдаемые баллы	7	13,7 (7,78)	16,0 (2, 22)	10	22,3 (11,76)	19,5 (7, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	7	1,0 (2,16)	1,0 (-2, 5)	10	5,7 (6,72)	5,5 (-4, 20)
Месяц 10
Наблюдаемые баллы	1	21,0	21 (21, 21)	3	26,3 (12,10)	22,0 (17, 40)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	1	-1,0	-1,0 (-1, -1)	3	8,3 (0,58)	8,0 (8, 9)
Месяц 11
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	1	17,0	17,0 (17, 17)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	1	9,0	9,0 (9, 9)
Месяц 12
Наблюдаемые баллы	9	10,2 (7,36)	10,0 (0, 22)	1	15,0	15,0 (15, 15)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	9	0,8 (2,86)	0,0 (-2, 6)	1	7,0	7,0 (7, 7)

b. Анализ чувствительности с использованием контрольной группы с естественным течением заболевания PNCR N=17

[272] Описательные статистики и графики для всех пациентов группы с дозой B и контролей с естественным течением заболевания PNCR N=17 приведены в таблице 13 и на фиг. 8.

[273] В контрольной группе с естественным течением заболевания PNCR N=17 балл по HFMSE на исходном уровне составил 12,1 ± 9,21. Средние изменения балла по HFMSE относительно исходного уровня можно было рассчитать в месяц 2 (-0,2 ± 1,56), месяц 4 (0,5 ± 1,05), месяц 6 (-0,4 ± 5,32), месяц 9 (1,1 ± 2,03) и месяц 12 (-0,2 ± 8,11). Для сорок одного процента (7/17) пациентов из группы PNCR отсутствовал балл по HFMSE в месяц 12.

[274] В группе лечения с дозой B AVXS-101 балл по HFMSE на исходном уровне составил 14,8 ± 9,98. Среднее изменение балла по HFMSE относительно исходного уровня в месяцы 2, 4, 6, 9 и 12 составляло 3,5 ± 4,38, 3,6 ± 5,07, 3,9 ± 5,85, 5,7 ± 6,72 и 7 соответственно.

[275] В группе лечения с дозой B показано устойчивое увеличение баллов по HFMSE по сравнению с контрольной группой с естественным течением заболевания PNCR N=17.

Таблица 13. Значения балла по HFMSE в определенные моменты времени (пациенты возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев) - выборка ITT (анализ чувствительности с использованием PNCR) - доза B

Оценка во время визита	Контрольная группа с естественным течением заболевания PNCR (N=17)			Доза B (N=12)
Оценка во время визита	n	Среднее (SD)	Медиана (Min, Max)	n	Среднее (SD)	Медиана (Min, Max)
Исходный уровень
Наблюдаемые баллы	17	12,1 (9,21)	8,0 (2, 39)	12	14,8 (9,98)	12,0 (3,32)
Месяц 1
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	17,2 (10,05)	15,0 (2,36)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	2,4 (3,34)	3,0 (-4, 8)
Месяц 2
Наблюдаемые баллы	9	12,1 (6,21)	8,0 (5, 21)	12	18,3 (11,04)	14,5 (5, 38)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	9	-0,2 (1,56)	-1,0 (-2, 2)	12	3,5 (4,38)	3,0 (-4, 14)
Месяц 3
Наблюдаемые баллы	1	2,0	2,0 (2, 2)	12	18,5 (10,94)	15,5 (4, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	1	-2,0	-2,0 (-2, -2)	12	3,8 (3,93)	5,0 (-4, 11)
Месяц 4
Наблюдаемые баллы	6	12,8 (6,85)	12,5 (4, 23)	12	18,3 (11,83)	15,5 (4, 40)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	6	0,5 (1,05)	0,5 (-1, 2)	12	3,6 (5,07)	5,0 (-4, 12)
Месяц 5
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	19,3 (11,69)	16,5 (4, 40)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	12	4,5 (5,79)	5,5 (-3, 16)
Месяц 6
Наблюдаемые баллы	8	13,6 (7,42)	10,5 (6, 27)	12	18,7 (11,72)	15,5 (2, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	8	-0,4 (5,32)	0,5 (-12, 6)	12	3,9 (5,85)	4,5 (-4, 16)
Месяц 7
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	11	17,5 (10,14)	16,0 (4, 32)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	11	4,3 (5,35)	4,0 (-3. 14)
Месяц 8
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	11	20,5 (11,89)	17,0 (7, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	11	4,7 (6,48)	4,0 (-7, 16)
Месяц 9
Наблюдаемые баллы	8	12,8 (7,70)	13,0 (2, 22)	10	22,3 (11,76)	19,5 (7, 39)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	8	1,1 (2,03)	1,0 (-2, 5)	10	5,7 (6,72)	5,5 (-4, 20)
Месяц 10
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	3	26,3 (12,10)	22,0 (17, 40)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	3	8,3 (0,58)	8,0 (8, 9)
Месяц 11
Наблюдаемые баллы	Н. д.	Н. д.	Н. д.	1	17,0	17,0 (17, 17)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	Н. д.	Н. д.	Н. д.	1	9,0	9,0 (9, 9)
Месяц 12
Наблюдаемые баллы	10	13,6 (7,53)	14,0 (1, 25)	1	15,0	15,0 (15, 15)
Изменение относительно баллов на исходном уровне	10	-0,2 (8,11)	0,0 (-20, 11)	1	7,0	7,0 (7, 7)

Промежуточные результаты: вторичная конечная точка эффективности - показатель развития моторных навыков, ходьба самостоятельно на по меньшей мере 5 шагов

[276] Вторичная конечная точка эффективности представляла собой элемент №43 компонента Крупная моторика ("ходит самостоятельно на ≥5 шагов") Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® как для возрастной группы ≥6 месяцев и <24 месяцев, так и для возрастной группы ≥24 и <60 месяцев. Данный показатель развития регистрировали при любом визите после лечения вплоть до визита исследования в месяц 12. Видеодоказательство первоначальной оценки показателя развития рассматривал и подтверждал независимый центральный рецензент.

[277] В случае пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы один пациент (007-002), который получил дозу B (1,2×10¹⁴ vg), ходил без посторонней помощи к сроку визита в месяц 4 (см. описание пациента в предыдущем разделе). Доля пациентов, достигших способности ходить без посторонней помощи, составляла 0% (0/3) в случае дозы A (6,0×10¹³ vg), 7,7% (1/13) в случае дозы B (1,2×10¹⁴ vg) и 0% (0/3) в случае дозы C (2,4×10¹⁴ vg). Для данного анализа использовали контрольную группу с естественным течением заболевания PNCR N=51. Пять из 51 (9,8%) пациента из данной контрольной группы ходили самостоятельно на исходном уровне. Во время периода последующего наблюдения ни один пациент в данной контрольной группы не ходил самостоятельно.

[278] В случае пациентов возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев на момент введения дозы все пациенты получали дозу B (1,2×10¹⁴ vg). Ни один из пациентов в данной возрастной группе не получал дозу C. Ни один из пациентов, подвергнутых лечению дозой B, не ходил самостоятельно. Ни один из пациентов в первичной контрольной группе с естественным течением заболевания PNCR N=15 или в контрольной группе с естественным течением заболевания для анализа чувствительности PNCR N=17 не ходил самостоятельно.

Промежуточные результаты: исследовательская конечная точка эффективности - оценка по Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®

[279] Для возрастной группы ≥6 месяцев и <24 месяцев и возрастной группы ≥24 и <60 месяцев оценивали изменение относительно исходного уровня в компонентах мелкой и крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, третье издание (шкала Бейли®-III). В случае возрастной группы ≥6 месяцев и <24 месяцев второй исследовательской конечной точкой является изменение балла по HFMSE относительно исходного уровня для тех пациентов, которые продолжили участие в исследовании после возраста 24 месяца и которые имели зарегистрированные оценки по HFMSE после исходного уровня для по меньшей мере 6 месяцев. Поскольку оценку по Шкалам Бейли® не проводили в наборе данных PNCR, описательные статистики представлены только для пациентов возрастом <24 месяцев.

[280] Хотя пациенты со SMA 1 типа имеют тяжелые нарушения мелкой моторики, при которых младенцы не могут схватить что-либо с использованием всей своей кисти, функция мелкой моторики относительно хорошо сохраняется при SMA 2 типа и SMA 3 типа, что отражают баллы развития мелкой моторики по шкале Бейли®. De Sanctis et al., "Developmental milestones in type I spinal muscular atrophy." (2016) Neuromuscul. Disord. 26(11):754-759; Chabanon et al., "Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study." (2018) PLoS ONE, 13(7): e0201004. При SMA 2 типа и 3 типа проксимальная мышечная дисфункция значительно больше, чем дистальная мышечная дисфункция, что отражают баллы развития крупной моторики по шкале Бейли®.

а. Пациенты возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев на момент введения дозы

[281] Доза A (6,0×10¹³ vg): все 3 пациента в данной группе завершили 12-месячный период оценки после введения дозы. Изменение относительно исходного уровня согласно Шкалам Бейли® в месяц 12 составило 12,3 ± 6,51 для подтеста мелкой моторики и 5,7 ± 1,15 для подтеста крупной моторики.

[282] Доза B (1,2×10¹⁴ vg): изменение относительно исходного уровня в подтесте мелкой моторики было доступно для всех 13 пациентов в месяц 6 (5,4 ± 3,57). Доступные данные были неполными в последующие месяцы: Месяц 7 (n=11; 7,8 ± 3,03), месяц 8 (n=10; 7,4 ± 3,60), месяц 9 (n=6; 8,2 ± 3,25), месяц 10 (n=3; 11,7 ± 3,06), месяц 11 (n=2; 12,5 ± 4,95). В месяц 12 был один пациенту с изменением относительно исходного уровня, составляющим 16,0. У данных пациентов продолжали улучшаться навыки мелкой моторики, как и предсказывали исследования естественного течения заболевания. Chabanon et al., "Prospective and longitudinal natural history study of patients with Type 2 and 3 spinal muscular atrophy: Baseline data NatHis-SMA study." (2018) PLoS ONE. 13(7): e0201004.

[283] Изменение относительно исходного уровня в подтесте крупной моторики было доступно для всех 13 пациентов для месяца 6 (3,8 ± 5,01). Доступные данные были неполными в последующие месяцы: месяц 7 (n=12; 4,7 ± 4,29), месяц 8 (n=10; 4,9 ± 6,45), месяц 9 (n=6; 3,5 ± 2,07), месяц 10 (n=3; 5,7 ± 4,73), месяц 11 (n=2; 8,0 ± 4,24) и месяц 12 (n=1; 11,0). Пациенты продолжали приобретать показатели развития крупной моторики. Ни один пациент не утратил показатели развития.

[284] Доза C (2,4×10¹⁴ vg): в подтесте мелкой моторики были доступны ограниченные данные об изменении относительно исходного уровня: месяц 2 (n=3; 0,7 ± 0,58), месяц 3 (n=2; 3,5 ± 0,71); в месяц 4 был один пациенту с изменением относительно исходного уровня, составляющим 6,0. Изменение относительно исходного уровня в подтесте крупной моторики было доступно до 4 месяцев: месяц 2 (n=3; 0,3 ± 1,53), месяц 3 (n=2; 0,5 ± 3,54) и месяц 4 (n=1; 4,0).

[285] Доза B+доза C: График изменения согласно Шкалам Бейли® относительно исходного уровня до срока 12 месяцев для все пациентов с дозой B+дозой C представлен на фиг. 9 (мелкая моторика) и фиг. 10 (крупная моторика). Описательные статистики для оценок по Шкалам Бейли® представлены в таблице 14.

Таблица 14. Анализ максимального изменения баллов крупной и мелкой моторики Шкалы оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® относительно исходного уровня при любом визите после исходного уровня до срока 12 месяцев для пациентов возрастом <24 месяцев на момент введения дозы - выборка ITT
Категория визита Статистика	Доза A (N=3)	Доза B (N=13)	Доза C (N=3)	Доза B+C (N=16)
Крупная моторика
Исходный уровень
n	3	13	3	16
Среднее (SD)	26,3 (8,62)	20,8 (4,46)	25,0 (7,00)	21,6 (5,03)
Медиана (Min, Max)	28,0 (17, 34)	20,0 (14, 3)	25,0 (18, 32)	20,0 (14, 32)
Значение после исходного уровня для визита с максимальным наблюдаемым значением CFB
n	3	13	3	16
Среднее (SD)	32,0 (7,55)	26,3 (8,48)	26,0 (5,29)	26,3 (7,83)
Медиана (Min, Max)	33 (24, 39)	24,0 (18, 51)	24,0 (22, 32)	24,0 (18, 51)
Изменение относительно исходного уровня
n	3	13	3	16
Среднее (SD)	5,7 (1,15)	5,5 (5,43)	1,0 (2,65)	4,7 (5,28)
Медиана (Min, Max)	5,0 (5, 7)	4,0 (1, 21)	0,0 (-1, 4)	4,0 (-1, 21)
Мелкая моторика
Исходный уровень
n	3	13	3	16
Среднее (SD)	31,3 (2,89)	31,2 (4,64)	36,0 (6,08)	32,1 (5,08)
Медиана (Min, Max)	33,0 (28, 33)	31,0 (22, 38)	33,0 (32, 43)	31,5 (22,43)
Значение после исходного уровня для визита с максимальным наблюдаемым значением CFB
n	3	13	3	16
Среднее (SD)	46,7 (5,03)	40,5 (5,97)	39,0 (3,61)	40,3 (5,53)
Медиана (Min, Max)	46,0 (42, 52)	41,0 (32, 50)	38,0 (36, 43)	40,0 (32, 50)
Изменение относительно исходного уровня
n	3	13	3	16
Среднее (SD)	15,3 (5,51)	9,3 (3,75)	3,0 (3,00)	8,1 (4,35)
Медиана (Min, Max)	18,0 (9, 19)	11,0 (3, 16)	3,0 (0, 6)	9,0 (0, 16)

b. Пациенты возрастом ≥4 месяцев и <60 месяцев на момент введения дозы

[286] Возрастная группа ≥24 и <60 месяцев состоит из 12 пациентов, которые получили дозу B (1,2×10¹⁴ vg). Наблюдали приобретение навыков в компонентах мелкая и крупная моторика. Изменение относительно исходного уровня в подтесте мелкой моторики было доступно для всех 12 пациентов в месяц 6 (7,6 ± 5,62). Доступные данные были неполными в последующие месяцы: месяц 7 (n=11; 6,6 ± 5,33), месяц 8 (n=11; 8,0 ± 5,74), месяц 9 (n=10; 7,9 ± 5,53) и месяц 10 (n=2; 10,5 ± 0,71). Данные по одному пациенту были в месяц 11 (n=1) и месяц 12 (n=1) с баллами 9,0 и 10,0 соответственно.

[287] Для компонента крупной моторики изменение относительно исходного уровня было доступно для всех 12 пациентов для месяца 6 (1,8 ± 4,47). Доступные данные были неполными в последующие месяцы: месяц 7 (n=11; 2,0 ± 4,36), месяц 8 (n=11; 2,3 ± 4,47), месяц 9 (n=10; 2,4 ± 5,08), месяц 10 (n=2; 5,5 ± 6,36). Ни один пациент не утратил показатели развития крупной моторики по шкале Бейли®.

[288] График изменения согласно Шкалам Бейли® относительно исходного уровня до срока 12 месяцев для всех пациентов с дозой B представлен на фиг. 11 и фиг. 12. Кривая для пациента 008-003 является неправильной. Балл на исходном уровне для пациента 008-003 составил 20, а не 28 (как изначально сообщалось). Следовательно, изменение балла Крупной моторики от измерения на исходном уровне до месяца 1 составило "0", а не "-8". Кроме того, изменение балла Крупной моторики у пациента 008-003 относительно измерения на исходном уровне составило "0" для месяцев 2 и 3, "+1" для месяца 4, "0" для месяцев 5 и 6, "+1" для месяцев 7-11 и "+2" для месяца 12.

[289] Эти промежуточные данные обобщают результаты эффективности на основе клинического испытания, описанного в примере 1, через 12 месяцев после лечения. Описательные статистики для оценок по Шкалам Бейли® представлены в таблице 15.

Таблица 15. Анализ максимального изменения оценок крупной и мелкой моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® относительно исходного уровня при любом визите после исходного уровня до срока 12 месяцев для пациентов возрастом ≥24 и <60 месяцев на момент введения дозы - выборка ITT

Категория визита Статистика	Доза B (N=12)
Крупная моторика
Исходный уровень
n	12
Среднее (SD)	23,2 (6,15)
Медиана (Min, Max)	20,5 (16, 35)
Значение после исходного уровня для визита с максимальным наблюдаемым значением CFB
n	12
Среднее (SD)	26,2 (6,83)
Медиана (Min, Max)	24,5 (18, 38)
Изменение относительно исходного уровня
n	12
Среднее (SD)	3,0 (4,51)
Медиана (Min, Max)	3,0 (-7, 11)
Мелкая моторика
Исходный уровень
n	12
Среднее (SD)	46,2 (8,77)
Медиана (Min, Max)	47 (32, 60)
Значение после исходного уровня для визита с максимальным наблюдаемым значением CFB
n	12
Среднее (SD)	55,6 (5,66)
Медиана (Min, Max)	55,0 (46, 65)
Изменение относительно исходного уровня
n	12
Среднее (SD)	9,4 (5,32)
Медиана (Min, Max)	10,0 (1, 23)

Промежуточные результаты: изменение баллов по HFMSE у пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев, которые продолжают принимать участие в исследовании после возраста 24-месяца

[290] Определение баллов по HFMSE регистрировали для тех пациентов в возрастной группе ≥6 и <24 месяцев, которые достигли возраста 24 месяца. Поскольку данные на исходном уровне до лечения не были доступны ни для одного пациента, первый зарегистрированный балл по HFMSE определяется как исходный уровень. Обозначения месяцев ниже представлены относительно первого зарегистрированного балла по HFMSE в возрасте ≥24 месяца, а не относительно месяца исследования.

[291] Доза A (6,0×10¹³ vg): двое пациентов достигли возраста 24 месяцев. Представлено изменение относительно первого зарегистрированного балла по HFMSE: месяц 1 (n=2; -0,5 ± 4,95), месяц 2 (n=2; 4,0 ± 0,00), месяц 3 (n=2; 3,5 ± 0,71), месяц 4 (n=2; 3,0 ± 2,83), месяц 5 (n=1; 5,0) и месяц 6 (n=2; 2,0 ± 5,66).

[292] Доза B (1,2×10¹⁴ vg): восемь пациентов достигли возраста 24 месяцев. Представлено изменение относительно первого зарегистрированного балла по HFMSE: месяц 1 (n=7; 2,0 ± 2,83), месяц 2 (n=7; 2,7 ± 2,69), месяц 3 (n=6; 1,3 ± 4,97), месяц 4 (n=3; 4,7 ± 4,51) и месяц 5 (n=2; 7,5 ± 0,71).

[293] График изменения баллов по HFMSE относительно исходного уровня до срока 12 месяцев для всех пациентов с дозой B представлен на фиг. 13. Максимальное изменение (среднее значение ± SD) значений по HFMSE относительно исходного уровня при любом визите после исходного уровня до срока 12 месяцев для дозы B составляло 17,7 ± 5,28 (n=7), как показано в таблице 16.

[294] Доза C (2,4×10¹⁴ vg): один пациент достиг первой регистрации балла по HFMSE в возрасте ≥24 месяца. Только эта единственная точка данных на "исходном уровне" была доступна.

Таблица 16. Максимальное изменение балла по HFMSE относительно исходного уровня при любом визите после исходного уровня до срока 12 месяцев для пациентов возрастом <24 месяцев на момент введения дозы, которые продолжают принимать участие в исследовании в возрасте после 24 месяцев - выборка ITT

Категория визита Статистика	Доза B (N=13)	Доза C (N=3)
Исходный уровень определяют как первую оценка по HFMSE во время исследования, когда пациенты достигли возраста 24 месяца
n	8	1
Среднее (SD)	13,0 (5,61)	33,0
Медиана (Min, Max)	13,0 (6, 21)	33,0 (33, 33)
Значение после исходного уровня для визита с максимальным наблюдаемым значением CFB
n	7	0
Среднее (SD)	17,7 (5,28)	-
Медиана (Min, Max)	17 (11, 25)	-
Изменение относительно исходного уровня
n	7	0
Среднее (SD)	5,9 (5,34)	-
Медиана (Min, Max)	4,0 (2, 17)	-

Промежуточные выводы

[295] Описанное в данном документе клиническое испытание представляет собой продолжающееся открытое исследование фазы 1 с применением однократного интратекального (IT) введения младенцам и детям возрастом ≥6 месяцев и <60 месяцев, которым поставлен диагноз спинальная мышечная атрофия (SMA). Данные, полученные на данный момент у подвергнутых лечению пациентов, показывают клинически значимые изменения моторной функции, что включает усовершенствование навыков, усовершенствование показателей развития и стабилизацию заболевания, что описано в сводных данных по каждой возрастной группе ниже.

Возрастная группа ≥6 месяцев и <24 месяцев

[296] В клиническое испытание включили девятнадцать пациентов возрастом ≥6 месяцев и <24 месяцев. Три пациента получили однократную дозу, составляющую 6,0×10¹³ vg AVXS-101 (доза A), 13 пациентов получили однократную дозу, составляющую 1,2×10¹⁴ vg AVXS-101 (доза B), и 3 пациента получили однократную дозу, составляющую 2,4×10¹⁴ vg AVXS-101 (доза C). Четыре пациента завершили оценки на протяжении 12-месяцев после введения дозы: 3 пациента из группы с дозой A и 1 пациент из группы с дозой B.

[297] Первичной конечной точкой эффективности для данной возрастной группы было приобретение навыка "стоит без опоры в течение по меньшей мере 3 секунд" согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® - №40 компонента Крупная моторика. Два пациента достигли первичных конечных точек эффективности. Пациент 007-001, который получил дозу А, достиг способности стоять без опоры в течение по меньшей мере 3 секунд в срок 11 месяцев после лечения. Пациент 007-002, который получил дозу B, достиг способности стоять без опоры в срок 3 месяца после лечения.

[298] Вторичная конечная точкой эффективности представляла собой элемент №43 компонента Крупная моторика ("ходит самостоятельно на ≥5 шагов") Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®. Один пациент (007-002), который получил дозу B, прошел без посторонней помощи по меньшей мере 5 шагов в срок 4 месяца после лечения.

[299] Исследовательской конечной точкой было изменение компонентов мелкой и крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, третье издание (шкала Бейли®-III) относительно исходного уровня. Поскольку оценку по Шкалам Бейли® не проводили в наборе данных PNCR, описательные статистики представлены только для пациентов возрастом <24 месяцев. Однако пациенты продолжают приобретать показатели развития крупной моторики. Ни один пациент не утратил показатели развития.

Возрастная группа ≥24 месяца и <60 месяцев

[300] Двенадцать пациентов возрастом ≥24 месяца и <60 месяцев включили в клиническое испытание и им вводили дозу B. Ни один пациенту в данной возрастной группе не получил дозу C. Один пациент завершил оценки на протяжении 12-месяцев после лечения.

[301] Первичной конечной точкой эффективности для этой возрастной группы было изменение балла по HFMSE относительно исходного уровня. Для рассмотрения в контексте изменений, наблюдаемых в группе c дозой B, улучшение балла по HFMSE на ≥3 пункта считается значимым и важным для заинтересованных сторон, таких как осуществляющие уход лица и врачи, и используется в качестве порога для обнаружения значимых изменений в клинических испытаниях. Mercuri et al., "Nusinersen versus sham control in later-onset spinal muscular atrophy." N Engl J Med. 378(7): 625-635. Для группы лечения с дозой B показано устойчивое увеличение баллов по HFMSE по сравнению с контрольной группой с естественным течением заболевания PNCR N=15. В случае контрольной группы с естественным течением заболевания PNCR N=15 максимальное изменение балла по HFMSE наблюдали в месяц 9 (n=7), и оно составило 1,0 ± 2,16. Аналогичные результаты наблюдали при выполнении анализа чувствительности с использованием контрольной группы с естественным течением заболевания PNCR N=17, при этом максимальное изменение балла по HFMSE наблюдали в месяц 9 (n=8), и оно составило 1,1 ± 2,03.

[302] Для группы лечения с дозой B показано клинически значимое увеличение изменения балла по HFMSE, составившее 5,7 ± 6,72 к месяцу 9 (n=10).

Исследовательской конечной точкой было изменение компонентов мелкой и крупной моторики шкалы Бейли®-III относительно исходного уровня. Как и в более младшей возрастной группе, пациенты продолжают приобретать показатели развития крупной моторики. Ни один пациент не утратил показатели развития.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> AVEXIS, INC.

<120> Вирусные векторы на основе AAV и пути их применения

<130> 14452.0025-00304

<140>

<141>

<150> 62/835,242

<151> 2019-04-17

<150> 62/773,894

<151> 2018-11-30

<160> 4

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 2359

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:

синтетический полинуклеотид"

<400> 1

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtgga 120

tctgaattca attcacgcgt ggtacctctg gtcgttacat aacttacggt aaatggcccg 180

cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 240

gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 300

cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 360

ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 420

cagtacatct actcgaggcc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 480

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 540

ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 600

gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 660

ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagcg ggatcagcca 720

ccgcggtggc ggcctagagt cgacgaggaa ctgaaaaacc agaaagttaa ctggtaagtt 780

tagtcttttt gtcttttatt tcaggtcccg gatccggtgg tggtgcaaat caaagaactg 840

ctcctcagtg gatgttgcct ttacttctag gcctgtacgg aagtgttact tctgctctaa 900

aagctgcgga attgtacccg cggccgatcc accggtccgg aattcccggg atatcgtcga 960

cccacgcgtc cgggccccac gctgcgcacc cgcgggtttg ctatggcgat gagcagcggc 1020

ggcagtggtg gcggcgtccc ggagcaggag gattccgtgc tgttccggcg cggcacaggc 1080

cagagcgatg attctgacat ttgggatgat acagcactga taaaagcata tgataaagct 1140

gtggcttcat ttaagcatgc tctaaagaat ggtgacattt gtgaaacttc gggtaaacca 1200

aaaaccacac ctaaaagaaa acctgctaag aagaataaaa gccaaaagaa gaatactgca 1260

gcttccttac aacagtggaa agttggggac aaatgttctg ccatttggtc agaagacggt 1320

tgcatttacc cagctaccat tgcttcaatt gattttaaga gagaaacctg tgttgtggtt 1380

tacactggat atggaaatag agaggagcaa aatctgtccg atctactttc cccaatctgt 1440

gaagtagcta ataatataga acagaatgct caagagaatg aaaatgaaag ccaagtttca 1500

acagatgaaa gtgagaactc caggtctcct ggaaataaat cagataacat caagcccaaa 1560

tctgctccat ggaactcttt tctccctcca ccacccccca tgccagggcc aagactggga 1620

ccaggaaagc caggtctaaa attcaatggc ccaccaccgc caccgccacc accaccaccc 1680

cacttactat catgctggct gcctccattt ccttctggac caccaataat tcccccacca 1740

cctcccatat gtccagattc tcttgatgat gctgatgctt tgggaagtat gttaatttca 1800

tggtacatga gtggctatca tactggctat tatatgggtt ttagacaaaa tcaaaaagaa 1860

ggaaggtgct cacattcctt aaattaagga gaaatgctgg catagagcag cactaaatga 1920

caccactaaa gaaacgatca gacagatcta gaaagcttat cgataccgtc gactagagct 1980

cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 2040

gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 2100

attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 2160

agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggagagatc gatctgagga 2220

acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 2280

gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 2340

gcgcagagag ggagtggcc 2359

<210> 2

<211> 294

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

синтетический полипептид"

<400> 2

Met Ala Met Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Val Pro Glu Gln Glu

1. 5 10 15

Asp Ser Val Leu Phe Arg Arg Gly Thr Gly Gln Ser Asp Asp Ser Asp

20 25 30

Ile Trp Asp Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Tyr Asp Lys Ala Val Ala

35 40 45

Ser Phe Lys His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Ile Cys Glu Thr Ser Gly

50 55 60

Lys Pro Lys Thr Thr Pro Lys Arg Lys Pro Ala Lys Lys Asn Lys Ser

65 70 75 80

Gln Lys Lys Asn Thr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Trp Lys Val Gly Asp

85 90 95

Lys Cys Ser Ala Ile Trp Ser Glu Asp Gly Cys Ile Tyr Pro Ala Thr

100 105 110

Ile Ala Ser Ile Asp Phe Lys Arg Glu Thr Cys Val Val Val Tyr Thr

115 120 125

Gly Tyr Gly Asn Arg Glu Glu Gln Asn Leu Ser Asp Leu Leu Ser Pro

130 135 140

Ile Cys Glu Val Ala Asn Asn Ile Glu Gln Asn Ala Gln Glu Asn Glu

145 150 155 160

Asn Glu Ser Gln Val Ser Thr Asp Glu Ser Glu Asn Ser Arg Ser Pro

165 170 175

Gly Asn Lys Ser Asp Asn Ile Lys Pro Lys Ser Ala Pro Trp Asn Ser

180 185 190

Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Met Pro Gly Pro Arg Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asn Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

210 215 220

Pro Pro His Leu Leu Ser Cys Trp Leu Pro Pro Phe Pro Ser Gly Pro

225 230 235 240

Pro Ile Ile Pro Pro Pro Pro Pro Ile Cys Pro Asp Ser Leu Asp Asp

245 250 255

Ala Asp Ala Leu Gly Ser Met Leu Ile Ser Trp Tyr Met Ser Gly Tyr

260 265 270

His Thr Gly Tyr Tyr Met Gly Phe Arg Gln Asn Gln Lys Glu Gly Arg

275 280 285

Cys Ser His Ser Leu Asn

290

<210> 3

<211> 736

<212> БЕЛОК

<213> Аденоассоциированный вирус

<400> 3

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1. 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 4

<211> 1621

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

ccacaaatgt gggagggcga taaccactcg tagaaagcgt gagaagttac tacaagcggt 60

cctcccggcc accgtactgt tccgctccca gaagccccgg gcggcggaag tcgtcactct 120

taagaaggga cggggcccca cgctgcgcac ccgcgggttt gctatggcga tgagcagcgg 180

cggcagtggt ggcggcgtcc cggagcagga ggattccgtg ctgttccggc gcggcacagg 240

ccagagcgat gattctgaca tttgggatga tacagcactg ataaaagcat atgataaagc 300

tgtggcttca tttaagcatg ctctaaagaa tggtgacatt tgtgaaactt cgggtaaacc 360

aaaaaccaca cctaaaagaa aacctgctaa gaagaataaa agccaaaaga agaatactgc 420

agcttcctta caacagtgga aagttgggga caaatgttct gccatttggt cagaagacgg 480

ttgcatttac ccagctacca ttgcttcaat tgattttaag agagaaacct gtgttgtggt 540

ttacactgga tatggaaata gagaggagca aaatctgtcc gatctacttt ccccaatctg 600

tgaagtagct aataatatag aacagaatgc tcaagagaat gaaaatgaaa gccaagtttc 660

aacagatgaa agtgagaact ccaggtctcc tggaaataaa tcagataaca tcaagcccaa 720

atctgctcca tggaactctt ttctccctcc accacccccc atgccagggc caagactggg 780

accaggaaag ccaggtctaa aattcaatgg cccaccaccg ccaccgccac caccaccacc 840

ccacttacta tcatgctggc tgcctccatt tccttctgga ccaccaataa ttcccccacc 900

acctcccata tgtccagatt ctcttgatga tgctgatgct ttgggaagta tgttaatttc 960

atggtacatg agtggctatc atactggcta ttatatgggt ttcagacaaa atcaaaaaga 1020

aggaaggtgc tcacattcct taaattaagg agaaatgctg gcatagagca gcactaaatg 1080

acaccactaa agaaacgatc agacagatct ggaatgtgaa gcgttataga agataactgg 1140

cctcatttct tcaaaatatc aagtgttggg aaagaaaaaa ggaagtggaa tgggtaactc 1200

ttcttgatta aaagttatgt aataaccaaa tgcaatgtga aatattttac tggactcttt 1260

tgaaaaacca tctgtaaaag actggggtgg gggtgggagg ccagcacggt ggtgaggcag 1320

ttgagaaaat ttgaatgtgg attagatttt gaatgatatt ggataattat tggtaatttt 1380

atggcctgtg agaagggtgt tgtagtttat aaaagactgt cttaatttgc atacttaagc 1440

atttaggaat gaagtgttag agtgtcttaa aatgtttcaa atggtttaac aaaatgtatg 1500

tgaggcgtat gtggcaaaat gttacagaat ctaactggtg gacatggctg ttcattgtac 1560

tgtttttttc tatcttctat atgtttaaaa gtatataata aaaatattta attttttttt 1620

a 1621

<---

Claims

1. Способ лечения спинальной мышечной атрофии (SMA) у пациента-человека, нуждающегося в этом, включающий интратекальное введение вирусного вектора на основе AAV9, содержащего полинуклеотид, кодирующий белок фактора выживания мотонейронов (SMN), где вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей от приблизительно 5×10¹³ vg до 5×10¹⁴ vg.

2. Способ по п. 1, где вирусный вектор на основе AAV9 дополнительно содержит модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16S SV40, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2.

3. Способ по п. 1, где белок SMN содержит аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 2 и/или вирусный вектор на основе AAV9 содержит последовательность нуклеиновой кислоты с SEQ ID NO: 1.

4. Способ по п. 1, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит капсид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3.

5. Способ по п. 1, дополнительно включающий фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для интратекального введения.

6. Способ по п. 1, где вирусный вектор на основе AAV9 вводят вместе с контрастной средой.

7. Способ по п. 6, где контрастная среда содержит йогексол.

8. Способ по п. 1, где вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg.

9. Способ по п. 1, где вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

10. Способ по п. 1, где SMA представляет собой SMA II типа или SMA III типа.

11. Способ по п. 1, где на момент введения вирусного вектора на основе AAV9 возраст пациента составляет:

шесть месяцев или больше;

от шести месяцев до двадцати четырех месяцев;

от двадцати четырех месяцев до шестидесяти месяцев;

двадцать четыре месяца или меньше или

шесть месяцев или меньше.

12. Способ по п. 1, где до введения или на момент введения вирусного вектора на основе AAV9 у пациента:

имеются биаллельные нуль-мутации или инактивирующие делеции в SMN1;

имеется делеция седьмого экзона в SMN1;

имеются три или более копии SMN2;

отсутствует замена c.859G>C в седьмом экзоне по меньшей мере одной копии гена SMN2;

начало заболевания проявляется до возраста приблизительно 12 месяцев;

на момент введения вирусного вектора на основе AAV9 имеется способность сидеть без посторонней помощи, как определено согласно критериям Многоцентрового исследования по разработке справочных показателей роста Всемирной организации здравоохранения (WHO-MGRS), в течение приблизительно 10 секунд или больше, но он не может стоять или ходить;

наблюдается одно или несколько из следующего: уровни гамма-глутамилтрансферазы в менее чем приблизительно 3 раза превышают верхний предел нормы, уровни билирубина составляют менее приблизительно 3,0 мг/дл, уровни креатинина составляют менее приблизительно 1,0 мг/дл, уровни Hgb составляют приблизительно 8-18 г/дл и/или количество лейкоцитов составляет менее приблизительно 20000 на мм³;

количество тромбоцитов составляет более приблизительно 67000 клеток/мл, или более приблизительно 100000 клеток/мл, или более приблизительно 150000 клеток/мл;

имеется нормальная функция печени;

уровни печеночной трансаминазы составляют менее приблизительно 8-40 Ед/л; и/или

титры антител к AAV9 составляют 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100 или меньше, как определено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA);

отсутствует тяжелый сколиоз (определяемый как искривление позвоночника на ≥ 50°), видимый при рентгенологическом исследовании;

отсутствует противопоказание для проведения спинномозговой пункции или интратекального введения средства терапии;

ранее не проводилась операция или процедура по исправлению сколиоза;

отсутствует необходимость в применении инвазивной вспомогательной вентиляции легких;

в анамнезе отсутствует самостоятельное стояние или ходьба;

не применяется желудочный зонд для кормления;

отсутствует активная вирусная инфекция;

отсутствовала тяжелая инфекция, не являющаяся легочной инфекцией и/или инфекцией дыхательных путей, в пределах четырех недель;

отсутствует сопутствующее заболевание, тяжелая почечная или печеночная недостаточность, известный эпизод судорожного расстройства, сахарный диабет, идиопатическая гипокальциурия или симптоматическая кардиомиопатия;

в анамнезе отсутствует бактериальный менингит или заболевание головного или спинного мозга;

отсутствует известная аллергия или гиперчувствительность к преднизолону или другим глюкокортикостероидам или вспомогательным веществам;

отсутствует известная аллергия или гиперчувствительность к йоду или йодсодержащим продуктам;

не происходит прием лекарственных средств для лечения миопатии или невропатии;

не происходит получение иммуносупрессорной терапии, плазмафереза, иммуномодуляторов или адалимумаба в пределах трех месяцев; и/или

не происходило получение исследуемого или одобренного составного продукта или средства терапии с целью лечения SMA.

13. Способ по п. 1, где пациента помещают в положение Тренделенбурга во время и/или после введения вирусного вектора на основе AAV9.

14. Способ по п. 1, где пациенту вводят пероральный стероид за, по меньшей мере, приблизительно 1-48 часов до введения вирусного вектора на основе AAV9 и пациенту:

пероральный стероид вводят в дозе, составляющей приблизительно 1 мг/кг;

пероральный стероид вводят в дозе, составляющей приблизительно 1 мг/кг, и снижают дозу до 0,5 мг/кг/день в течение 2 недель после введения вирусного вектора на основе AAV9, а затем до 0,25 мг/кг/день в течение еще 2 недель;

пероральный стероид вводят в течение по меньшей мере приблизительно 10-60 дней после введения вирусного вектора на основе AAV9;

продолжают введение перорального стероида в течение более 30 дней после введения вирусного вектора на основе AAV9 и до тех пор, пока уровни аспартаттрансаминазы (AST) и/или аланинаминотрансферазы (ALT) не станут ниже значения, в два раза превышающего верхний предел нормы, или ниже приблизительно 120 МЕ/л;

продолжают введение перорального стероида в течение более 30 дней после введения вирусного вектора на основе AAV9 и до тех пор, пока T-клеточный ответ в образце крови от пациента не упадет ниже 100 пятнообразующих клеток (SFC) на 10⁶ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC); и/или

пероральный стероид вводят до тех пор, пока титры антител к AAV9 у пациента не уменьшатся до менее 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100 при определении с помощью ELISA,

где необязательно пероральный стероид вводят пациенту один или два раза в день.

15. Способ по п. 14, где пероральный стероид представляет собой преднизолон или эквивалент.

16. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение пациенту второго терапевтического средства одновременно или последовательно с введением вирусного вектора на основе AAV9.

17. Способ по п. 16, где второе терапевтическое средство содержит антисмысловой нуклеотид, нацеливающийся на SMN1 и/или SMN2, средство для усиления мышц и/или нейропротектор.

18. Способ по п. 1, где после введения вирусного вектора на основе AAV9 у пациента:

отсутствует операция или процедура по исправлению сколиоза в пределах от 6 месяцев до 3 лет;

титры антител к AAV9 составляют 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100 или выше, как определено с помощью ELISA, и их отслеживают в течение приблизительно 1-8 недель или до тех пор, пока титры не уменьшатся до менее 1:25, 1:50, 1:75 или 1:100;

количество тромбоцитов составляет менее приблизительно 67000 клеток/мл, или менее приблизительно 100000 клеток/мл, или менее приблизительно 150000 клеток/мл и его отслеживают в течение приблизительно 1-8 недель или до тех пор, пока количество тромбоцитов не увеличится до приблизительно 67000 клеток/мл, или более приблизительно 100000 клеток/мл, или более приблизительно 150000 клеток/мл; и/или

количество тромбоцитов составляет менее приблизительно 67000 клеток/мл и его подвергают лечению с помощью переливания тромбоцитов.

19. Способ по п. 1, где через 1-24 месяца после введения вирусного вектора на основе AAV9 у пациента достигается:

способность стоять без опоры в течение по меньшей мере приблизительно трех секунд, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®;

способность ходить без посторонней помощи, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®;

способность сделать по меньшей мере пять шагов самостоятельно, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®;

изменение после лечения по сравнению с измерением на исходном уровне на момент проведения лечения, как определено согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®; и/или

улучшение, составляющее по меньшей мере три пункта по компоненту Крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, по сравнению с баллом до введения.

20. Способ по любому из пп. 1-19, где вирусный вектор на основе AAV9 вводят в дозе, составляющей от приблизительно 6×10¹³ vg до 2,4×10¹⁴ vg, и где у пациента достигается улучшенный балл согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит по сравнению с баллом до введения; и/или у пациента достигается улучшенный балл согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® по сравнению с баллом до введения.

21. Способ по п. 20, где введение приводит к:

улучшению, составляющему по меньшей мере три пункта согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит, к сроку 9 месяцев после введения по сравнению с баллом до введения;

улучшению, составляющему по меньшей мере четыре пункта согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит, к сроку 9 месяцев после введения по сравнению с баллом до введения;

улучшению, составляющему по меньшей мере пять пунктов согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит, к сроку 9 месяцев после введения по сравнению с баллом до введения;

улучшению, составляющему по меньшей мере три пункта по компоненту Крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, после введения по сравнению с баллом до введения;

способности стоять без опоры в течение по меньшей мере трех секунд к сроку 12 месяцев после введения; и/или

способности пройти самостоятельно по меньшей мере пять шагов к сроку 12 месяцев после введения.

22. Фармацевтическая композиция, составленная для интратекального введения, для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA), содержащая вирусный вектор на основе AAV9, содержащий модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16S SV40, полинуклеотид, кодирующий белок фактора выживания мотонейронов (SMN), сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2, где вирусный вектор на основе AAV9 присутствует в фармацевтической композиции в дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg или приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

23. Фармацевтическая композиция по п. 22, где белок SMN содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 и/или вирусный вектор на основе AAV9 содержит последовательность нуклеиновой кислоты с SEQ ID NO: 1.

24. Фармацевтическая композиция по п. 22, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит капсид, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3.

25. Фармацевтическая композиция по п. 22, дополнительно содержащая контрастную среду.

26. Фармацевтическая композиция по п. 25, где контрастная среда содержит йогексол.

27. Фармацевтическая композиция по п. 22, где композиция находится в контейнере и содержит по меньшей мере одно из следующего:

pH приблизительно 7,7-8,3,

осмоляльность приблизительно 390-430 мОсм/кг,

менее приблизительно 600 частиц размером ≥25 мкм на контейнер,

менее приблизительно 6000 частиц размером ≥10 мкм на контейнер,

геномный титр от приблизительно 1,7×10¹³ до 5,3×10¹³ vg/мл,

инфекционный титр от приблизительно 3,9×10⁸ до 8,4×10¹⁰ МЕ на 1,0×10¹³ vg,

общий белок приблизительно 100-300 мкг на 1,0×10¹³ vg,

содержание Pluronic F-68 (полоксамер 188) приблизительно 20-80 ppm,

относительная эффективность приблизительно 70-130% на основе клеточного анализа in vitro, где эффективность измеряют относительно эталонного стандарта и/или подходящего контроля,

эффективность, определяемая по медиане выживаемости на мышиной модели с SMNΔ7 при дозе 7,5×10¹³ vg/кг, 24 дня или больше,

менее приблизительно 5% пустых капсидов,

общая чистота приблизительно 95% или больше,

уровень эндотоксина приблизительно 0,13 ЕЭ/мл или меньше,

менее приблизительно 0,09 нг бензоназы на 1,0×10¹³ vg,

менее приблизительно 30 мкг/г (ppm) цезия,

менее приблизительно 0,22 нг бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1,0×10¹³ vg,

менее приблизительно 6,8×10⁵ пг остаточной плазмидной ДНК на 1,0×10¹³ vg,

менее приблизительно 1,1×10⁵ пг остаточной hcDNA на 1,0×10¹³ vg и

менее приблизительно 4 нг rHCP на 1,0×10¹³ vg.

28. Применение вирусного вектора на основе AAV9 в получении лекарственного средства для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA) у пациента-человека, нуждающегося в этом, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит полинуклеотид, кодирующий белок фактора выживания мотонейронов (SMN), и где вирусный вектор на основе AAV9 составлен для интратекального введения в дозе, составляющей от приблизительно 5×10¹³ vg до 5×10¹⁴ vg.

29. Применение по п. 28, где вирусный вектор на основе AAV9 дополнительно содержит модифицированный ITR AAV2, промотор гена бета-актина курицы (CB), энхансер немедленно-раннего гена цитомегаловируса (CMV), модифицированный поздний интрон 16S SV40, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и немодифицированный ITR AAV2.

30. Применение по п. 28, где белок SMN содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 и/или вирусный вектор на основе AAV9 содержит последовательность нуклеиновой кислоты с SEQ ID NO: 1.

31. Применение по п. 28, где вирусный вектор на основе AAV9 содержит капсид, содержащий аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 3.

32. Применение по п. 28, дополнительно включающее фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для интратекального введения.

33. Применение по п. 28, где вирусный вектор на основе AAV9 вводится вместе с контрастной средой.

34. Применение по п. 33, где контрастная среда содержит йогексол.

35. Применение по п. 28, где вирусный вектор на основе AAV9 составлен для введения в дозе, составляющей приблизительно 1,2×10¹⁴ vg.

36. Применение по п. 28, где вирусный вектор на основе AAV9 составлен для введения в дозе, составляющей приблизительно 2,4×10¹⁴ vg.

37. Применение по п. 28, где SMA представляет собой SMA II типа или SMA III типа.

38. Применение по п. 28, где лекарственное средство предназначено для одновременного или последовательного введения со вторым лекарственным средством и где необязательно второе лекарственное средство содержит антисмысловой нуклеотид, нацеливающийся на SMN1 и/или SMN2, средство для усиления мышц и/или нейропротектор.

39. Применение по любому из пп. 28-38, где лекарственное средство является эффективным для улучшения балла пациента согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит по сравнению с баллом до введения и/или у пациента достигается улучшенный балл согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли® по сравнению с баллом до введения, где необязательно вирусный вектор на основе AAV9 составлен для введения в дозе, составляющей от 6×10¹³ vg до 2,4×10¹⁴ vg.

40. Применение по п. 39, где через 1-24 месяца после введения, необязательно через приблизительно 12 месяцев после введения, у пациента достигается:

способность стоять без опоры в течение по меньшей мере приблизительно трех секунд;

способность ходить без посторонней помощи;

способность сделать по меньшей мере пять шагов самостоятельно и/или

изменение после лечения по сравнению с измерением на исходном уровне на момент проведения лечения;

где необязательно a), b), c) и/или d) определяются согласно Шкалам оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®.

41. Применение по п. 39, где у пациента достигается:

улучшение, составляющее по меньшей мере три пункта согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит, к сроку 9 месяцев после введения по сравнению с баллом до введения;

улучшение, составляющее по меньшей мере четыре пункта согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит, к сроку 9 месяцев после введения по сравнению с баллом до введения;

улучшение, составляющее по меньшей мере пять пунктов согласно Расширенной шкале оценки моторных функций больницы Хаммерсмит, к сроку 9 месяцев после введения по сравнению с баллом до введения;

улучшение, составляющее по меньшей мере три пункта по компоненту Крупной моторики Шкал оценки развития младенцев и детей малого возраста Бейли®, после введения по сравнению с баллом до введения;

способность стоять без опоры в течение по меньшей мере трех секунд к сроку 12 месяцев после введения; и/или

способность пройти самостоятельно по меньшей мере пять шагов к сроку 12 месяцев после введения.