TWI827560B - 用於製備病毒載體之手段及方法與其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供製備及純化病毒粒子之方法，以及包含該病毒粒子之組成物及用途。

Description

用於製備病毒載體之手段及方法與其用途 序列表
本申請案含有以ASCII格式經由EFS-Web提交之序列表且特此併入其全文以供參考。在2018年10月31日創建之該ASCII複本被命名為AVEX-003001WO_ST25.txt及大小為14,639字節。
相關申請案
本申請案主張在2017年11月8日申請之美國臨時專利申請案第62/583,035號之優先權，將其內容以彼等全文併入本文以供參考。
本發明關於製備及純化病毒粒子之方法，以及包含該病毒粒子之組成物及用途。
腺相關病毒(AAV)為細小病毒科家族成員。AAV基因組係由線性單股DNA分子所組成，其含有約4.7千鹼基(kb)且由編碼非結構Rep(複製)和結構Cap(殼體)蛋白質的兩個主要開放閱讀框所組成。側接AAV編碼區為兩個順式作用的反向末端重複區(ITR)序列，約145個核苷酸長度，具有中斷的迴文序列，其可折疊成髮夾結構，在DNA複製初始期間作為引子起作用。除了彼等在DNA複製中的角色以外，ITR序列已顯示為病毒整合、自宿主基因組復原(rescue)及病毒核酸包殼(encapsidation)成成熟病毒粒子所必要的(Muzyczka,(1992)Curr.Top.Micro.Immunol.158：97-129)。
有多種血清型AAV的存在且供給不同的組織趨性。已知的血清型包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及AAV11。AAV9說明於美國專利第7,198,951號及Gao等人之J.Virol.,78：6381-6388(2004)中，特此併入彼等全文以供參考。在簡單的全身性靜脈內或腹膜內注射後，AAV6及AAV8的遞送進展使得以該等血清型骨骼肌及心肌的轉導變得有可能。參見Pacak等人之Circ.Res.,99(4)：3-9(2006)及Wang等人之Nature Biotech.23(3)：321-8(2005)。可是，使用AAV靶向在中樞神經系統內的細胞類型需要外科腦實質內注射。參見Kaplitt等人之"Safety and tolerability of gene therapy with an adeno-associated virus(AAV)borne GAD gene for Parkinson's disease：an open label,phase I trial." Lancet,369：2097-2105；Marks等人之"Gene delivery of AAV2-neurturin for Parkinson's disease：a double-blind,randomized,controlled trial." Lancet Neurol 9：1164-1172；及Worgall等人之"Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2 adeno-associated virus expressing CLN2 cDNA." Hum Gene Ther,19(5)：463-74。
AAV血清型2(AAV2)基因組之核苷酸序列在Srivastava等人之J Virol,45：555-564(1983)中提出，經Ruffing等人之J Gen Virol,75：3385-3392(1994)修正。引導病毒DNA複製(rep)、包被/包裝及宿主細胞染色體整合之順式作用序列內含在ITR內。三個AAV啟動子(以彼等相對的圖譜位置命名為p5、p19及p40)驅動編碼rep和cap基因的兩個AAV內部開放閱讀框之表現。與差別性剪接的單一AAV內含子(在核苷酸2107及2227上)偶合之兩個rep啟動子(p5及p19)導致自rep基因產生四個rep蛋白質(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。Rep蛋白質具有最終負責複製病毒基因組的多重酶性質。cap基因係自p40啟動子表現且其編碼三個殼體蛋白質VP1、VP2及VP3。替代的剪接及非共識轉譯起始位點負責產生三個相關的殼體蛋白質。單一共識多腺苷酸化位點係位於AAV基因組的圖譜位置95。AAV之生命週期及遺傳學係綜述於Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158：97-129(1992)中。
源自AAV之載體對遞送遺傳物質特別有吸引力，因為 (i)彼等能夠感染(轉導)各種廣泛的非分裂及分裂細胞類型，包括肌肉纖維及神經元；(ii)彼等缺乏病毒結構基因，從而消除天然宿主細胞對病毒感染的反應，例如干擾素介導之反應；(iii)野生型病毒從未與人類的任何病理學相關聯；(iv)與能夠整合至宿主細胞基因組中的野生型AAV相反，複製缺陷型AAV載體通常作為游離基因組存留，因此限制插入突變或致癌基因激活的風險；及(v)與其他的載體系統相反，AAV載體不觸發顯著的免疫反應(參見ii)，因此給予治療性轉基因的長期表現(先決條件為彼等的基因產物未被拒絕)。
自身互補型腺相關載體(scAAV)為來自天然生成的腺相關病毒(AAV)工程化之用於基因療法的病毒載體。ScAAV被稱為「自身互補型」，因為編碼區經設計以形成分子內雙股DNA模板。用於標準的AAV基因組生命週期之限速步驟涉及第二股合成，因為典型的AAV基因組為單股DNA模板。然而，scAAV基因組不是此情況。一旦感染，則scAAV的兩個互補半部締合而非等待細胞介導之第二股合成，以形成一個準備好立即復製及轉錄之雙股DNA(dsDNA)單元。
仍對開發可擴展之方法以製造及純化具有例如低的空殼體、低宿主細胞蛋白質及/或低污染DNA，同時保留高效力之AAV醫藥產品有需求。
本發明提供製備經純化之病毒粒子製劑(包括AAV粒子製劑)之方法。
在一些實施態樣中，本發明提供醫藥組成物，其包含(a)介於1至8×1013之間的AAV9病毒載體基因組/mL(vg/mL)，(b)少於約7%之空病毒殼體(viral capsid)，(c)每1×1013vg/mL計少於約100ng/mL之宿主細胞蛋白質，及(d)每1×1013vg/mL計少於約5×106pg/mL之殘留宿主細胞DNA，且其中1至8×1013 AAV9病毒載體基因組/mL中至少約80%為功能性。在一個實施態樣中，AAV9病毒載體包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸。在一個實施態樣中，AAV9病毒載體包含編碼甲基-CpG-結合蛋白質2(MECP2)蛋白質之多核苷酸。在一個實施態樣中，AAV9病毒載體包含編碼靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)之短髮夾RNA(shRNA)的多核苷酸。在一個實施態樣中，AAV9病毒載體包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子(cytomegalovirus(CMV)immediate/early enhancer)、經修飾之SV40晚期16s內含子(modified SV40 late 16s intron)、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR。
本發明提供醫藥調配物。在一些實施態樣中，水性醫藥調配物包含(a)包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體，(b)Tris緩衝液，(c)氯化鎂，(d)氯化鈉，及(e)泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)，其中醫藥組成物不包含保存劑。在調配物的一個實 施態樣中，AAV9病毒載體另包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR。在調配物的一個實施態樣中，Tris緩衝液濃度為約10至30nM，例如約20mM。在一個實施態樣中，調配物之pH為約7.7至約8.3，例如約pH 8.0(例如根據USP<791>所測量(併入其全文以供參考))。在調配物的一個實施態樣中，氯化鎂濃度為約0.5至1.5mM，例如約1mM。在調配物的一個實施態樣中，氯化鈉濃度為約100至300mM，例如約200mM。在一個實施態樣中，調配物包含約0.005% w/v之泊洛沙姆188。
本發明之另一態樣係指向治療有其需要之患者中的第I型脊髓性肌肉萎縮症(SMA)之方法，其包含經鞘內或靜脈內途徑對患者投予包含編碼SMN蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體(例如本文揭示之組成物或調配物)，其中患者(a)為九個月大或更小，(b)具有至少約2.6kg之體重，(c)具有雙對偶基因SMN1無效突變或缺失，及(d)具有至少一套功能性SMN2。在一個實施態樣中，AAV9病毒載體包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR。在一實施態樣中，患者具有不超過約8.5kg之體重。在一個實施態樣中，患者在至少一套SMN2基因之外顯子7中不具有c.859G>C取代。在一實施態樣中，治療 係投予到不滿6個月大的患者。在一實施態樣中，治療係在一或多種選自低張症、延遲的動作技能、不良頭部控制、圓肩姿勢及關節過度活動之SMA症狀發作前投予患者。在一個實施態樣中，患者在投予前具有1：100或低於1：100之抗AAV9抗體效價，如以ELISA結合免疫檢定法所測定。
本文亦揭示治療患有發病或未發病之第I型脊髓性肌肉萎縮症(SMA)的兒科患者之方法，其包含對患者投予如本文揭示之包含腺相關病毒(AAV)載體之組成物或調配物。
本發明亦指向治療有其需要之患者中的瑞特氏症候群(Rett Syndrome)之方法，其包含經鞘內或靜脈內途徑對患者投予包含編碼甲基-CpG-結合蛋白質2(MECP2)蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體。
本發明亦指向治療有其需要之患者中的肌萎縮側索硬化症(ALS)之方法，其包含經鞘內或靜脈內途徑對患者投予包含編碼靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)之短髮夾RNA(shRNA)的多核苷酸的AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向治療患有第I型SMA的患者之方法，其包含步驟(a)測定患者之體重，(b)獲得含有AAV9病毒載體醫藥組成物之小瓶的套組，及(c)對患者投予來自小瓶之AAV9病毒載體，其中在各小瓶中的病毒載體濃度為約2.0×1013vg/mL，其中AAV9病毒載體包含編碼SMN蛋白質之多核苷酸；且其中套組包含以下數量的小 瓶：
Figure 107138852-A0305-02-0010-1
在一個實施態樣中，套組包含AAV9病毒載體，其包含經突變之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及AAV2 ITR。在一個實施態樣中，AAV病毒載體係以約1.0×1014至2.5×1014vg/kg之劑量經輸注投予。
本發明之另一態樣係指向用於治療患有第I型脊髓性肌肉萎縮症(SMA)的患者之套組，其包含小瓶，該小瓶含有包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸的組成物AAV9病毒載體或包含(a)包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體，(b)Tris緩衝液，(c)氯化鎂，(d)氯化鈉，及(e)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆 188)之調配物。
本發明之另一態樣係指向包含小瓶之套組，該小瓶含有約5.5mL或約8.3mL的AAV9病毒載體，該AAV9病毒載體包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸且在20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005% w/v之泊洛沙姆188中於pH 7.7至8.3，例如約8.0下以約2.0×1013vg/mL之濃度調配。
本發明之另一態樣係指向治療第I型SMA之方法，其包含對其有需要的患者經靜脈內輸注以投予包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸的組成物AAV9病毒載體或包含(a)包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體，(b)Tris緩衝液，(c)氯化鎂，(d)氯化鈉，及(e)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)之調配物的體積。
本發明之另一態樣係指向製造AAV病毒載體之方法。在一個實施態樣中，製造AAV病毒載體之方法包含步驟(a)培養附著型細胞，(b)令附著型細胞以質體轉染而能夠生產AAV病毒載體，(c)令附著型細胞溶解以單離AAV病毒載體，(d)令(c)之細胞溶解物酸化及淨化，(e)令(d)之產物使用陽離子交換層析術(CEX)純化，(f)令(e)之產物使用切向流過濾法(TFF)過濾，(g)令(f)之產物於氯化銫(CsCl)緩衝液中超離心；及(h)自(g)之產物收集AAV病毒載體。
本發明之另一態樣係指向自細胞培養溶解物純化AAV病毒載體之方法，其包含步驟(a)令細胞溶解物酸化及淨 化，(b)令(a)之產物使用陽離子交換層析術(CEX)純化，(c)令(b)之產物通過切向流過濾法過濾，(d)令(c)之產物使用2至4M氯化銫(CsCl)緩衝液超離心，(e)自(d)之產物收集AAV病毒載體，(f)令(e)之產物通過切向流過濾法過濾。在一實施態樣中，該方法係以工業規模進行。在一實施態樣中，該方法係以每一製造批次生產超過5×1015vg、或超過8×1015vg、或超過1×1016vg之產量。
本發明之另一態樣係指向治療患有第1型SMA的患者之方法，其係藉由投予如根據本文揭示之方法中任一者製備的包含編碼SMN蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向治療患有瑞特氏症候群的患者之方法，其係藉由投予如根據本文之方法中任一者製備的包含編碼MECP2蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向治療患有ALS的患者之方法，其係藉由投予如根據本文之方法中任一者製備的包含編碼靶向SOD1之shRNA的多核苷酸之AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向根據本文之方法中任一者製造的包含編碼SMN蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向包含根據本文之方法中任一者製造的AAV9病毒載體之醫藥組成物，該AAV9病毒載體包含編碼SMN蛋白質之多核苷酸。
本發明之另一態樣係指向水性醫藥組成物，其包含編碼SMN蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體、Tris緩衝液、氯化鎂溶液及氯化鈉溶液，其中醫藥組成物不包含保 存劑，且其中組成物係根據本文之方法中任一者製造。
本發明之另一態樣係指向根據本文之方法中任一者製造的包含編碼MECP2蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向醫藥組成物，其包含根據本文之方法中任一者製造的包含編碼MECP2蛋白質之多核苷酸的AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向根據本文之方法中任一者製造的包含編碼靶向SOD1之shRNA的多核苷酸之AAV9病毒載體。
本發明之另一態樣係指向治療有其需要之患者中的第I型SMA之方法，其係藉由經靜脈內投予包含下列的醫藥組成物：(a)自身互補型AAV9病毒載體，其包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR，(b)pH 8.0之20mM Tris，(c)1mM MgCl2，(d)200mM NaCl，及(e)0.005%之泊洛沙姆188，其中患者具有2.6kg至8.5kg之體重。在一個實施態樣中，組成物不包含保存劑。
在一個實施態樣中，患者(a)為九個月大或更小，(b)具有至少約2.6kg之體重，(c)具有雙對偶基因SMN1無效突變或缺失，及(d)具有至少一套功能性SMN2。
本發明之另一態樣係指向適合或經製造用於經靜脈內投予包含下列的醫藥組成物之組成物：(a)自身互補型 AAV9病毒載體，其包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR，(b)pH 8.0之20mM Tris，(c)1mM MgCl2，(d)200mM NaCl，及(e)0.005%之泊洛沙姆188。
在一些實施態樣中，本文揭示組成物或調配物，其中組成物或調配物包含下列中至少一者：(a)每1.0×1013vg計少於約0.09ng班柔酶，(b)少於約30μg/g(ppm)之銫，(c)約20至80ppm泊洛沙姆188，(d)每1.0×1013vg計少於約0.22ng BSA，(e)每1.0×1013vg計少於約6.8×105pg殘留質體DNA，(f)每1.0×1013vg計少於約1.1×105pg殘留hcDNA，及(g)每1.0×1013vg計少於約4ng Rhcp。
在一些實施態樣中，本發明提供上游方法以生產源自工作細胞庫之中間物(例如冷凍之中間物)，其中上游方法包含步驟(a)培養細胞，(b)令培養之細胞以質體(例如三種質體)轉染，(c)在培養期後收穫來自細胞的擴增之病毒粒子，(d)令病毒粒子經由過濾法純化以移出任何完整細胞或細胞碎屑，(e)令來自步驟(d)的溶析液經受切向流過濾法，及(g)視需要地冷凍經純化之病毒粒子的所得中間製劑。在一些實施態樣中，令上游方法與其他的加工步驟組合，特別為其他的純化及調配步驟以生產最終的醫藥物產物。
在一個實施態樣中，工作細胞庫包含HEK293細胞。 在其他的實施態樣中，使用在此項技術可行且適合用於本文揭示之方法的另一細胞類型或衍生物。
在一個實施態樣中，轉染步驟係利用聚乙烯亞胺。在一個實施態樣中，轉染步驟包含使用轉基因質體之三重載體轉染，例如pSMN、pAAV質體及pHELP質體。
在一個實施態樣中，該方法另包含令轉染之細胞以溶解緩衝液及界面活性劑溶解。
在一個實施態樣中，收穫步驟包括令產物以例如濃度介於50至200U/ml之間(例如濃度介於75至150U/ml之間)的核酸內切酶(諸如班柔酶)處理以減少殘留宿主細胞DNA。
在一個實施態樣中，純化步驟包括深層式過濾及通過移出大分子污染物及細胞碎屑但允許載體基因組通過之過濾器(例如0.45微米過濾器)的後續過濾。可使用任何適合的深層式過濾器(depth filter)。
在一個實施態樣中，切向流過濾法(「TFF」)達成步驟(d)之溶析液介於5至15×(例如6至10×)之間的濃縮及至少4滲濾體積(例如6滲濾體積、或10滲濾體積、或12滲濾體積、或15滲濾體積)滲濾。可使用任何適合的TFF過濾器。在一實施態樣中，TFF膜為纖維素膜。在一實施態樣中，TFF膜具有300kDa截留(cutoff)。
其次，本發明提供下游方法以加工中間物(例如經冷凍之中間物)成為經過濾之藥物物質。下游方法步驟包括酸化及淨化步驟(使用過濾法)，繼而以陽離子交換層析 術、切向流過濾法、CsCl超離心及進一步的切向流過濾法步驟以生產經過濾之藥物物質，其中令純化之AAV粒子懸浮在醫藥上可接受之載劑中。
在一個實施態樣中，酸化及淨化步驟包括深層式過濾及通過移出大分子污染物和細胞碎屑之過濾器(例如0.45微米過濾器)的後續過濾。在一些實施態樣中，控制pH調整。在一個實施態樣中，添加清潔劑(例如Tween)作為此步驟的一部分。在一些實施態樣中，控制Tween添加速率及Tween之濃度範圍。
在一個實施態樣中，陽離子交換層析術包含使用具有0.2微米孔徑之複合式磺醯基樹脂的基於膜之層析術樹脂。
在一個實施態樣中，氯化銫(CsCl)超離心步驟係使用介於2至4M之間的CsCl，例如約3M CsCl。
在另一實施態樣中，CsCl超離心步驟係在約40至50kRPM下進行約20至25小時。在另一實施態樣中，CsCl超離心步驟係在約45kRPM下進行約22小時。
在一個實施態樣中，切向流過濾法(「TFF」)達成步驟(d)之溶析液介於5至15×(例如6至10×)之間濃縮及至少4滲濾體積(例如6滲濾體積、或10滲濾體積、或12滲濾體積、或15滲濾體積)滲濾。在一實施態樣中，TFF膜具有300kDa截留。
在一個實施態樣中，溶析液具有低於檢測水平之銫(Cs)。在另一實施態樣中，Cs之檢測水平為低於百萬分之 50(ppm)。在另一實施態樣中，Cs之檢測水平為約50至70ppm。在另一實施態樣中，Cs之檢測水平為約百萬分之70至90(ppm)。在另一實施態樣中，Cs之檢測水平為約百萬分之90至110(ppm)。在另一實施態樣中，Cs之檢測水平為約百萬分之110至130(ppm)。在另一實施態樣中，Cs之檢測水平為約百萬分之約130至150(ppm)。在另一實施態樣中，Cs之檢測水平為低於約百萬分之150(ppm)。
可使用該等純化方法製備高產量病毒製劑，包括AAV製劑(例如AAV9-SMN)，其包含每1×1013載體基因組(「vg」)/ml計少於5×106pg/mL之殘留宿主細胞DNA(hcDNA)，例如每1×1013vg/mL計少於1.2 X106pg/mLhcDNA。因此，接受7.5×1015vg之5kg患者係以每5kg劑量能得到不超過最多1.2×106pg/mL*7.5×1015vg/(1×1013vg/mL)=8.4×107pg hcDNA=84,000ng hcDNA。在一個實施態樣中，製劑包含每1.0×1013vg計少於5.0×105pg之殘留宿主細胞DNA、每1.0×1013vg計少於2.0×105pg之殘留宿主細胞DNA、每1.0×1013vg計少於1.1×105pg之殘留宿主細胞DNA、每1.0×1013vg計少於1.0×105pg之殘留宿主細胞DNA、每1.0×1013vg計少於0.9×105pg之殘留宿主細胞DNA、每1.0×1013vg計少於0.8×105pg之殘留宿主細胞DNA、或介於該等之間的任何濃度。
在一個實施態樣中，AAV為具有經AAV2衍生之ITR的複製缺陷型AAV9，例如scAAV9。在另一實施態樣中，AAV載體攜有SMN轉基因。在一實施態樣中，SMN編碼之 DNA係以GenBank登錄號NM_000344.2提出。亦預期的是SMN DNA之保守性核苷酸取代(例如在位置625上的鳥嘌呤變成腺嘌呤，如以GenBank登錄號NM_000344.2提出)。
本發明之另一態樣係指向適合於(a)靜脈內(「IV」)注射或(b)鞘內(「IT」)投予之醫藥組成物，其包含於調配物中的AAV粒子。
在另一實施態樣中，醫藥組成物具有少於10%之空殼體，少於8%之空殼體，少於7%之空殼體，少於5%之空殼體，少於3%之空殼體，或少於1%之空殼體。在一些實施態樣中，醫藥組成物具有少於約5%之空殼體。在一個實施態樣中，空殼體數量係低於檢測限度。在一些實施態樣中，有利的是醫藥組成物具有少量的空殼體，因為該等空殼體可能產生沒有治療效益的不良反應(例如免疫反應、炎症反應、肝反應及/或心臟反應)。
在另一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞蛋白質(「rHCP」)為每1×1013vg/ml計少於或等於100ng/ml rHCP，例如每1×1013vg/ml計少於或等於40ng/ml rHCP、或每1×1013vg/ml計1至50ng/ml rHCP。在一個實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含每1.0×1013vg計少於10ng rHCP、或每1.0×1013vg計少於5ng rHCP、每1.0×1013vg計少於4ng rHCP、或每1.0×1013vg計少於3ng rHCP、或介於該等之間的任何濃度。
在另一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞DNA(「hcDNA」)為每1×1013vg/ml計少於或等於5×106 pg/ml hcDNA、每1×1013vg/ml計少於或等於1.2×106pg/ml rHDNA、或每1×1013vg/ml計1×105pg/ml rHDNA至每1×1013vg/ml計1.2×106pg/ml。在一個實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞DNA為每1.0×1013vg計少於5.0×105pg、每1.0×1013vg計少少於2.0×105pg、每1.0×1013vg計少於1.1×105pg、每1.0×1013vg計少於1.0×105pg hcDNA、每1.0×1013vg計少於0.9×105pg hcDNA、每1.0×1013vg計少於0.8×105pg hcDNA、或介於該等之間的任何濃度。
在一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留質體DNA為每1×1013vg/ml計少於或等於1.7×106pg/ml、或每1×1013vg/ml計1×105pg/ml至每1×1013vg/ml計1.7×106pg/ml。在一個實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留質體DNA為每1.0×1013vg計少於10.0×105pg、每1.0×1013vg計少於8.0×105pg、或每1.0×1013vg計少於6.8×105pg。
在一實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含每1.0×1013vg計少於0.5ng牛血清白蛋白(BSA)、每1.0×1013vg計少於0.3ng牛血清白蛋白(BSA)、每1.0×1013vg計少於0.22ng牛血清白蛋白(BSA)、或每1.0×1013vg計少於0.2ng牛血清白蛋白(BSA)，或介於該等之間的任何濃度。在一個實施態樣中，在該醫藥組成物中的班柔酶為每1.0×1013vg計少於0.2ng、每1.0×1013vg計少於0.1ng、每1.0×1013vg計少於0.09ng、每1.0×1013vg計少於0.08ng、或介於該等之間的任何濃度。在一個實施態樣中，在該醫藥組成物中的泊洛沙姆188為約10至150ppm、約15至100ppm、或約20 至80ppm。在一個實施態樣中，在該醫藥組成物中的銫為少於50μg/g(ppm)、少於30μg/g(ppm)、或少於20μg/g(ppm)、或介於該等之間的任何濃度。
在一實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含少於10%、少於8%、少於7%、少於6%、少於5%、少於4%、少於3%、少於2%或介於該等之間的任何百分比之總雜質，例如以SDS-PAGE所測定。在一個實施態樣中，總雜質(例如以SDS-PAGE所測定)為大於90%、大於92%、大於93%、大於94%、大於95%、大於96%、大於97%、大於98%、或介於該等之間的任何百分比。在醫藥組成物的一個實施態樣中，無單一未經命名之相關雜質(例如以SDS-PAGE所測定)為大於5%、大於4%、大於3%、或大於2%、或介於該等之間的任何百分比。在一個實施態樣中，醫藥組成物包含相對於總殼體而大於85%、大於86%、大於87%、大於88%、大於89%、大於90%、大於91%、大於91.9%、大於92%、大於93%、或介於該等之間的任何百分比之經填充之殼體百分比(例如以分析型超離心所測量之峰1+峰2)。在醫藥組成物的一個實施態樣中，以分析型超離心之峰1所測量的經填充之殼體百分比為20至80%、25至75%、30至75%、35至75%、或37.4至70.3%。在醫藥組成物的一個實施態樣中，以分析型超離心之峰2所測量的經填充之殼體百分比為20至80%、20至70%、22至65%、24至62%、或24.9至60.1%。
在一個實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含1.0 至5.0×1013vg/mL、1.2至3.0×1013vg/mL、或1.7至2.3×1013vg/mL之基因組效價。
在一個實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物展現少於5CFU/mL、少於4CFU/mL、少於3CFU/mL、少於2CFU/mL、或少於1CFU/Ml、或介於該等之間的任何濃度之生物負荷量。在一個實施態樣中，依照USP，例如USP<85>(併入其全文以供參考)之內毒素量為少於1.0EU/mL、少於0.8EU/mL、或少於0.75EU/mL。
在一個實施態樣中，依照USP，例如USP<785>(併入其全文以供參考)的本文揭示之醫藥組成物的滲透壓度為350至450mOsm/kg、370至440mOsm/kg、或390至430mOsm/kg。在一個實施態樣中，醫藥組成物含有每一容器少於1200個大於25μm之粒子、每一容器少於1000個大於25μm之粒子、每一容器少於600個大於25μm之粒子、每一容器少於500個大於25μm之粒子、或介於該等之間的任何值。在一個實施態樣中，醫藥組成物含有每一容器少於10000個大於10μm之粒子、每一容器少於8000個大於10μm之粒子、或每一容器少於6000個大於10μm之粒子。
在一個實施態樣中，醫藥組成物具有0.5至5.0×1013vg/mL、1.0至4.0×1013vg/mL、1.5至3.0×1013vg/mL、或1.7至2.3×1013vg/mL之基因組效價。
在一個實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含下列中之一或多者：每1.0×1013vg計少於約0.09ng班柔酶，少於約30μg/g(ppm)之銫，約20至80ppm泊洛沙姆188，每 1.0×1013vg計少於約0.22ng BSA，每1.0×1013vg計少於約6.8×105pg殘留質體DNA，每1.0×1013vg計少於約1.1×105pg殘留hcDNA，每1.0×1013vg計少於約4ng rHCP，pH 7.7至8.3，約390至430mOsm/kg，每一容器少於約600個
Figure 107138852-A0305-02-0022-20
25μm大小的粒子，每一容器少於約6000個
Figure 107138852-A0305-02-0022-21
10μm大小的粒子，約1.7×1013至2.3×1013vg/mL之基因組效價，每1.0×1013vg計約3.9×108至8.4×1010IU之感染效價，每1.0×1013vg計約100至300μg總蛋白質，以約7.5×1013vg/kg之病毒載體於△7SMA小鼠具有
Figure 107138852-A0305-02-0022-22
24天的中位存活期，以試管內基於細胞之檢定法為基礎約70至130%之相對效力，及/或少於約5%之空殼體。
在各種實施態樣中，包含本文討論之病毒粒子中任一者(例如AAV SMN、AAV MECP2或AAV SOD1病毒粒子)的本文揭示之醫藥組成物保留參考標準的介於+20%之間、介於+15%之間、介於+10%之間、或介於+5%之間的效力。在一些實施態樣中，效力係使用適合的試管內細胞檢定法或活體內動物模式測量。例如，效力或%功能性AAV SMN病毒粒子可使用SMA之動物模式(例如SMA△7小鼠)測定，或使用適合的細胞株(例如自SMA△7小鼠的皮質單離之原代神經祖細胞(NPC))的基於細胞之定量性檢定法測定。在一個實施態樣中，效力係使用Foust等人於Nat.Biotechnol.,28(3),pp.271-274(2010)之方法相對於參考標準評定。可使用任何適合的參考標準。效力或%功能性AAV MeCP2可使用適合的試管內細胞檢定法或活體內動物 模式檢定，例如Mecp2基因剔除小鼠，如Guy等人之"Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome." Science,315(5815)：1143-7。效力或%功能性AAV SOD1可使用適合的試管內細胞檢定法或活體內動物模式檢定，例如SOD1突變小鼠，如Gurney等人之"Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation." Science,264(5166)：1772-5。在一個實施態樣中，醫藥組成物具有大於15天、大於20天、大於22天、或大於24天之活體內效力，如在SMA△7小鼠中以7.5×1013vg/kg之劑量給出的中位存活期所測定。在一實施態樣中，醫藥組成物具有相對於參考標準及/或適合的對照組之50至150%、60至140%、或70至130%的活體內相對效力，如基於細胞之檢定定法所測試。
在一個實施態樣中，靜脈內(「IV」)調配物具有介於7.5與8.5之間的pH，介於約1至8×1013病毒載體基因組/mL(vg/mL)之間或介於2×1013vg/ml至6×1013vg/ml之間的基因組效價，及隨意的384至448mOsm/kg之滲透壓度。在一個實施態樣中，IV調配物包含在pH 8.0之Tris緩衝液中的MgCl2、NaCl、普朗尼克F68。
在一個實施態樣中，用於IV投予的攜有SMN轉基因之AAV-9載體係在滅菌條件下於適當的環境中(例如介入手術室、操作室、專用手術室)通過插入末梢肢靜脈(手臂或腿)中的靜脈導管以指定劑量一次投予且經約30至60分鐘緩慢輸注。
在另一實施態樣中，本發明提供遞送多核苷酸至其有需要之患者的中樞神經系統之組成物及方法，包含鞘內(「IT」)遞送rAAV9及非離子性、低滲透性對比劑至患者，其中rAAV9包含自身互補型基因組，其包括多核苷酸。多核苷酸被遞送至例如大腦、脊髓、膠質細胞、星形細胞及/或下運動神經元。非離子性、低滲透性對比劑為例如碘比醇(iobitridol)、碘海醇(iohexol)、碘美普爾(iomeprol)、碘帕醇(iopamidol)、碘噴托(iopentol)、碘普胺(iopromide)、碘佛醇(ioversol)或碘昔蘭(ioxilan)。在一些實施態樣中，多核苷酸為運動神經元存活(SMN)多核苷酸。在一個實施態樣中，對比劑為碘海醇，例如碘海醇180(以安你拍克(Omnipaque)180銷售，每mL計含有相當於180mg有機碘的388mg碘海醇)。
在一個實施態樣中，令用於IT投予的攜有SMN轉基因之AAV9載體以生理食鹽水稀釋且與適當的高壓比對介質(諸如安你拍克180)預混合，該比對介質係經批准且標記於兒科用於經由腰椎內注射之放射線照相監測注射。包含攜有SMN轉基因之AAV-9載體加上比對介質及/或食鹽水之水性組成物的總體積不超過5mL。對比劑及攜有SMN轉基因之AAV-9載體可共同調配、共同包裝或單獨包裝及遞送至患者中心。
患者係在滅菌條件下在具有可立即進入急性重症監護管理之PICU病房或其他適當的環境中(例如介入手術室、操作室、專用手術室)經由鞘內注射而接受攜有SMN轉基 因之AAV-9載體。位點可使用以平行於硬腦膜纖維的斜面插入之無創傷針，已顯示這以大程度減少對硬腦膜的損傷且因此降低腰椎穿刺後腦脊液滲漏的風險(Ebinger等人之"Headache and Backache After Lumbar Puncture in Children and Adolescents：A Prospective Study." Pediatrics,113(6)：1588-1592；Kiechl-Kohlendorfer等人之"Cerebrospinal Fluid Leakage After Lumbar Puncture in Neonates：Incidence and Sonographic Appearance." American Journal of Roentgenology,181(1)：231-234)，包括在兒童中。
推薦對接受IT注射的所有患者進行鎮靜/麻醉。方法及用藥係由當地麻醉師自行斟酌，但應併入足夠程度的鎮靜或抗焦慮以確保手術和術後特倫德倫堡定位(Trendelenburg positioning placement)之痛覺缺失和缺乏活動。患者被置於特倫德倫堡位置，在投予IT治療後頭部向下傾斜30°持續15分鐘，以增強頸部和大腦區的分布。
患者被置於側臥位置且令帶有管心針的導管以腰椎穿刺至L3-L4或L4-L5棘突間隙而插入蛛網膜下腔中。蛛網膜下插管係以來自導管的透明腦脊髓液(CSF)流確認。依照機構標準移除及處置CSF。令預混合之比對溶液中的攜有SMN轉基因之AAV-9載體直接注入蛛網膜下腔中。
在一個實施態樣中，本發明提供治療有其需要之患者中的神經疾病之方法，其包含經靜脈內或鞘內遞送本文揭示之醫藥組成物，其中小病毒包含自身互補型rAAV9基因組，其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸，且其中疾 病為SMA。
在另一實施態樣中，本發明提供治療有其需要之患者中的神經疾病之方法，其包含經鞘內遞送本文揭示之醫藥組成物與對比劑，其中小病毒包含自身互補型rAAV9基因組，其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸，其中疾病為SMA，且其中對比劑為安你拍克180。
在另一實施態樣中，本發明提供治療有其需要之患者中的第II、III或IV型SMA之方法，其包含經鞘內遞送本文揭示之醫藥組成物與對比劑，其中小病毒包含自身互補型rAAV9基因組，其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸，且其中對比劑為安你拍克180。
在另一實施態樣中，本發明提供治療有其需要之患者中的第I型SMA之方法，其包含經靜脈內遞送本文揭示之醫藥組成物，其中小病毒包含自身互補型rAAV9基因組，且其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸。在一些實施態樣中，患者為0至9個月大。在一些實施態樣中，患者為0至6個月大。在其他的實施態樣中，兒科患者為至多約8kg之體重。在一些實施態樣中，兒科患者為約8.5kg或更輕。在一些實施態樣中，兒科患者為約2.6kg或更重。
在另一實施態樣中，本發明提供治療有其需要之患者中的第I型SMA之套組，其包含裝在小瓶內的經靜脈內投予之本文揭示之醫藥組成物。在一些實施態樣中，測量患者之體重且以患者之體重為基礎計算劑量。
除非另有其他定義，否則本文所使用之所有技術及科 學術語具有與一般熟習本發明所屬之技術領域者通常理解的相同含義。
如本文所使用之單數形式的單詞亦包括複數形式的單詞，除非上下文另有明確規定；如實例，應理解術語「a」、「an」及「the」為單數或複數，且應理解術語「或」為包括在內。以實例方式說明的「一元件(an element)」意指一或多個元件。
在整篇說明書中，應理解單詞「包含(comprising)」或變型(諸如「包含(comprise)」)意味著包括所述之元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟之群組，但不排除任何其他的元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟之群組。在整篇說明書中，應理解單詞「由...所組成(consisting of)」或變型(諸如「由...所組成(consists of)」)意味著包括所述之元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟之群組且排除任何其他的元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟之群組。在整篇說明書中，應理解單詞「基本上由...所組成(consisting essentially of)」或變型(諸如「基本上由...所組成(consists essentially of)」)意味著包括所述之元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟之群組及不顯著地影響揭示內容及/或申請專利範圍之基本及新穎特徵的任何其他元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟之群組。
約可理解為在所述之值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%之 內。當關於百分比值使用時，「約」可理解為在±1%之內(例如「約5%」可理解為在4%至6%之內)或在±0.5%之內(例如「約5%」可理解為在4.5%至5.5%之內)。除非上下文另有清楚的說明，否則本文所提供的所有數值係以術語「約」修飾。
雖然類似於或等同於那些本文所述者之方法及物料可用於實施或測試本發明，但是於下文說明適合的方法及物料。本文所提及之所有發表案、專利申請案、專利及其他參考係以彼等全文併入以供參考。本文引用之參考並非承認所主張之發明為先前技術。若衝突時，則以本說明書(包括定義)為準。另外，物料、方法及實施例僅為例證且不意欲為限制。本發明的其他特性及優點係自下列的詳細說明及申請專利範圍變得顯而易見。
本發明的各種目的和優點及更完整的理解係藉由參考下列的詳細說明及所附之申請專利範圍與結合隨附的圖形時變得顯而易見且更輕易地領會，其中：圖1pSMN、pHELP及pAAV之質體圖譜。
圖1A顯示pSMN之質體圖譜。pSMN為編碼在控制具有迅/早期巨細胞病毒(CMV)增強子元件之雞-β-肌動蛋白雜交啟動子下表現人運動神經元存活(SMN)cDNA之重組自身互補型AAV DNA基因組的訊息之質體。SMN cDNA編碼全長功能性蛋白質。表現卡匣含有源自猿猴病毒 40(SV40)及牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號的經修飾之內含子序列。表現卡匣(CMV-CB-SV40-SMN-BGHpA)係以AAV2衍生之反向末端重複區(ITR)側接。左ITR經修飾而優先包裝自身互補型AAV基因組。介於且包括ITR之區域在製造最終藥物產物期間一起包裝至重組AAV9殼體中。不意欲包裝至重組AAV基因組中之關鍵的pSMN組分包括編碼對卡那黴素(kanamycin)(KanR)有抗性之開放閱讀框及源自pUC之複製起點(ori)。ori及KanR區有用於質體製造。
圖1B顯示pHELP質體之質體圖譜。pHELP質體含有重組腺相關病毒生產必要的反式作用之腺病毒組分。pHELP質體含有提供對AAV複製重要的因子(亦即E2A、E4和VA RNA)之腺病毒基因組區域。涉及rAVV複製之腺病毒E1功能係由轉染宿主293細胞提供。然而，pHELP質體不含有其他的腺病毒複製或結構基因。存在於此質體中的腺病毒序列僅代表腺病毒基因組的~28%(9,280/35,938)且不含有對複製必不可少的順式元件，諸如反向末端重複區。因此，預期沒感染的腺病毒係自此生產系統產生。
圖1C顯示AAV質體之質體圖譜。野生型AAV基因組含有兩個稱為反向末端重複區的非編碼結構元件，其側接rep和cap開放閱讀框。Rep和cap分別編碼病毒複製及殼體蛋白質。在生產重組腺相關病毒載體時，病毒ITR為唯一以順式使用的元件，而病毒開放閱讀框係以反式供給。使用瞬時轉染附著型HEK293細胞之方法使得AAV藉由分裂彼等成單獨的質體而解決不同的遺傳元件之順式/反式角 色。pAAV2/9質體含有AAV2 rep基因及AAV9 cap基因之開放閱讀框。
圖2顯示用於異常附著型及前種源細胞庫(pre-master cell bank)(MCB)存放之HEK293細胞的選擇之方法流程圖。
圖3顯示用於異常附著型及前種源細胞庫(MCB)存放之HEK293細胞的選擇之細胞加工細節摘要。
圖4說明藥物物質上游方法流程圖。
圖5說明藥物物質下游方法流程圖。
圖6顯示XmuLV在至多120分鐘添加之Tween 20滅活。
圖7顯示PRV在至多120分鐘添加之Tween 20滅活。
圖8說明在細胞接種密度實驗期間的HEK 293細胞擴增方法流程。
圖9A至E顯示生長及代謝物概況。令HEK 293細胞以12,000及8,000細胞/cm2一式兩份接種在生物反應器中(pH 7.23，37.0℃，55%之溶解氧(DO))。令細胞在接種後四天(12,000細胞/cm2)及五天(8,000細胞/cm2)以DNA質體/PEI轉染。在接種後八天(12,000細胞/cm2)及九天(8,000細胞/cm2)收穫生物反應器。每天在Nova BioFlex上讀取pH及代謝物讀值。
圖10顯示以細胞接種密度(8000或12000細胞/cm2)及四個不同的轉染時間長度(20分鐘、1小時或2小時)為函數之病毒基因組生產。
圖11顯示來自整個製造方法期間在不同的過濾步驟取 樣之中間物的病毒效價。
圖12A至B顯示在TFF1步驟的病毒載體回收率及宿主細胞蛋白質(HCP)清除率。
圖13說明在細胞接種密度實驗期間的HEK 293細胞擴增方法流程。
圖14A至E顯示令HEK 293細胞以8,000細胞/cm2、9,350細胞/cm2、10,700細胞/cm2、12,050細胞/cm2一式兩份接種在生物反應器中(pH 7.23，37.0℃，55%之DO)。令細胞在接種後五天以DNA質體/PEI(1：1m/m)轉染。pH及代謝物分析係使用NOVA BioProfile 400進行。
圖15A至B顯示在生物反應器中以四種起始接種密度的藥物物質生產。每單位表面積收穫之病毒效價及載體基因組的比較。
圖16顯示第1期(方法A)及第3期試驗(方法B)製造方法。
圖17A至B提供說明可相比性及製造一致性結果的表-方法A(第1期)及方法B(第3期)產物。與方法A相比，方法B產物顯示具有額外的效益。
圖18顯示使用方法A(第1期批號NCHAAV9SMN0613)及方法B(第3期批號600156)之逐對比較的方法A與方法B之間的可相比性。與方法A相比，方法B產物顯示具有額外的效益。
圖19顯示方法B(第3期)批號600156和600307之逐對比較的製造一致性評定。
圖20顯示在
Figure 107138852-A0305-02-0032-30
-60℃之即時儲存條件下經12個月儲存之NCH批號NCHAAV9SMN0613的穩定性概況。
圖21顯示第1期物料(NCHAAV9SMN0613)之沉降係數(sec×10-13)，顯示空殼體(7%)具有約60×10-13秒之沉降係數及完全殼體具有約80至150×10-13秒之沉降係數範圍。
圖22顯示第3期物料(600156)之沉降係數(sec×10-13)，顯示空殼體(2%)具有約60×10-13秒之沉降係數及完全殼體具有約80至150×10-13秒之沉降係數範圍。
圖23顯示第3期物料(600307)之沉降係數(sec×10-13)，顯示空殼體(4%)具有約60×10-13秒之沉降係數及完全殼體具有約80至150×10-13秒之沉降係數範圍。
為了推進超越動物模式且進入臨床研究及/或治療應用之AAV基因療法的發展，所以開發能夠生產適合於人類使用的病毒物料之可擴展方法。
在一些實施態樣中，以「載體」意指當與適當的控制元件締合時能夠複製且可在細胞之間轉移基因序列的任何遺傳元件，諸如質體、噬菌體、轉位子、黏質體、染色體、病毒、病毒粒子等。因此，術語包括選殖及表現媒體，以及病毒載體。
在一些實施態樣中，以「AAV載體」意指源自腺相關病毒血清型之載體，包括而不限於AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8及AAV-9。 AAV載體可具有全部或部分缺失的AAV野生型基因中之一或多者，例如rep及/或cap基因，但保留功能性側接ITR序列。功能性ITR序列為復原、複製及包裝AAV病毒粒子所必要的。因此，AAV載體在本文經定義以包括至少那些呈順式提供病毒複製及包裝(例如功能性ITR)之序列。ITR不必為野生型核苷酸序列且可例如藉由核苷酸的插入、缺失或取代而改變，只要序列提供功能性復原、複製及包裝即可。在一個實施態樣中，載體為具有經AAV-2衍生之ITR的AAV-9載體。亦以「AAV載體」意指蛋白質外鞘(protein shell)或殼體，其提供遞送載體核酸至靶細胞核之有效媒體。
在一些實施態樣中，以「scAAV」意指用於基因療法之自身互補型腺相關病毒(scAAV)，其為來自天然生成的腺相關病毒(AAV)工程化之病毒載體。scAAV被稱為「自身互補型」，因為編碼區經設計以形成分子內雙股DNA模板。
在一些實施態樣中，術語「載體相關性雜質」係指除了真正的重組AAV粒子以外所有類型的AAV粒子。載體相關性雜質包括空的AAV殼體(亦稱為「空體(empty)」或「空粒子」)及含有除了意欲之載體基因組以外的多核苷酸序列之AAV粒子(亦稱為「經AAV包殼之核酸雜質」或「經AAV包殼之DNA雜質」)。
在一些實施態樣中，「重組病毒」意指已經遺傳改變之病毒，例如藉由加入或插入異源性核酸構築體至粒子 中。「重組」可縮寫成「r」，例如rAAV可指重組AAV。如本文所使用之術語「AAV」意欲包含「重組AAV」或「rAAV」。
在一些實施態樣中，以「AAV病毒粒子」意指完整病毒粒子，諸如野生型(wt)AAV病毒粒子(包含與AAV殼體蛋白質外殼(protein coat)締合之線性單股AAV核酸基因組)。關於此點，具有互補有義(例如「有義」)股或「反義」股之單股AAV核酸分子可包裝成任何一種AAV病毒粒子，且兩股具有相等的感染性。
在一些實施態樣中，術語「重組AAV病毒粒子」、「rAAV病毒粒子」、「AAV載體粒子」、「完全殼體」及「完全粒子」在本文經定義為包括AAV蛋白質外鞘的感染性、複製缺陷型病毒，包殼關注之異源性核苷酸序列，在兩側以AAV ITR側接。rAAV病毒粒子係在具有指定AAV載體之序列、AAV輔助功能及其中引入的附屬功能之適合的宿主細胞中生產。在此方式中，使得宿主細胞能夠編碼AAV多肽，其為包裝AAV載體(含有關注之重組核苷酸序列)至用於後續基因遞送之感染性重組病毒粒子粒子作準備。
在一些實施態樣中，術語「空殼體」及「空粒子」係指包括AAV蛋白質外鞘，但缺少完全或部分多核苷酸構築體之AAV病毒粒子，該多核苷酸構築體包含在兩側以AAV ITR側接的關注之異源性核苷酸序列。
術語「宿主細胞」表示例如可用作或已用作為AAV輔 助構築體、AAV載體質體、附屬功能載體或其他的轉移DNA之接受者的微生物、酵母細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。術語包括已轉染之原始細胞的後代。因此，如本文所使用之「宿主細胞」通常係指已經外源性DNA序列轉染之細胞。應理解單一親代細胞的後代係由於天然、偶然或故意突變而在形態學或基因組或總DNA補體與原始親代可能不一定完全相同。
在另一實施態樣中，術語「AAV輔助功能」係指經AAV衍生之編碼序列，其可經表現以提供AAV基因產物，該AAV基因產物依次呈反式作用於生產性AAV複製。因此：AAV輔助功能包括主要的AAV開放閱讀框(ORF)二者：rep和cap。Rep表現產物已顯示出具有許多功能，尤其包括：DNA複製的AAV起源之辨識、結合和切刻；DNA解旋酶活性；及調節來自AAV(或其他的異源性)啟動子之轉錄。Cap表現產物供給必要的包裝功能。AAV輔助功能在本文用於補充AAV載體失去的呈反式之AAV功能。
在一個實施態樣中，術語「AAV輔助構築體」通常係指包括提供自AAV載體缺失之AAV功能的核苷酸序列之核酸分子，其係用於生產遞送關注之核苷酸序列的轉導載體。AAV輔助構築體常用於提供AAV rep及/或cap基因的瞬時表現以補充失去的AAV功能，其為AAV複製必要的；然而，輔助構築體缺乏AAV ITR，且既不可複製亦不可包裝其本身。AAV輔助構築體可呈質體、噬菌體、轉位子、黏質體、病毒或病毒粒子的形式。已說明許多AAV輔助構 築體，諸如編碼Rep和cap表現產物二者之常使用的質體pAAV/Ad及plM29+45。參見例如Samulski等人之(1989)J.Virol.63：3822-3828；及McCarty等人之(1991)J.Virol.65：2936-2945。已說明許多編碼Rep及/或Cap表現產物的其他載體。參見例如美國專利第5,139,941號和第6,376,237號。
在另一實施態樣中，所使用之術語「轉染」係指以細胞攝取外來DNA，且當外源性DNA已引入細胞膜內部時，則細胞經「轉染」。在此項技術中通常已知許多轉染技術。參見例如Graham等人之(1973)Virology,52：456；Sambrook等人之(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York；Davis等人之(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；及Chu等人之(1981)Gene 13：197。可使用此等技術引入一或多種外源性DNA部分至適合的宿主細胞中。
如本文所使用之術語「細胞株」係指能夠於試管內繼續或延長生長及分裂之細胞族群。在此項技術中進一步已知自發性或誘發之變化可在此等無性繁殖族群儲存或轉移期間發生在核型中。因此，源自所述及之細胞株的細胞可能與上代細胞或培養物不完全相同，且所述及之細胞株包括此等變異體。在一些實施態樣中，術語「HEK293細胞」、「293細胞」或彼之語法等效物在此可交換使用且係指用於本文揭示之方法中的宿主/包裝細胞株。
在一些實施態樣中，應理解在上下文中的術語「溶析 液」可指用於溶析物質之緩衝液。在一些實施態樣中，應理解在上下文中的術語「溶析液」可指經溶析之物質，例如來自先前純化步驟之所欲產物或物質，例如用於檢定或進一步純化。
在一些實施態樣中，在此所述之方法係使用優良製造規範(GMP)及以工業規模進行。GMP為監管規範，例如那些由聯邦藥物管理局(FDA)強制實施的規範以確保醫藥品質。GMP法規建立對製造方法的控制。現行GMP法規的實例係由FDA發布。在一些實施態樣中，本文所述之方法係使用以工業規模生產AAV病毒載體之GMP程序。迄今，用於基因療法之AAV病毒載體的工業規模生產正接受挑戰，因為可擴展性問題。因此，在一些實施態樣中，本文所述之方法係以工業規模及足以投予人類的純度水平生產AAV病毒載體(例如在附著型細胞中)而提供優勢。術語「工業規模」係指以大於實驗室規模(例如商業規模)於細胞中生產病毒載體之方法，例如在每一製造批次的產量超過5×1015vg、或超過8×1015vg、或超過1×1016vg的情況。
上游方法
在一些實施態樣中，使用上游方法生產源自工作細胞庫之中間物，其中上游方法包含步驟(a)培養細胞(例如附著型細胞)，(b)令培養之細胞(例如附著型細胞)以三種質體轉染，(c)在培養期後自細胞收穫擴增之病毒粒子，例如藉由總細胞溶解，(d)令病毒粒子經由過濾法純化以移出 任何完整細胞或細胞碎屑，(e)令來自步驟(d)的溶析液經受切向流過濾法，及(g)視需要地冷凍經純化之病毒粒子的所得中間製劑。在一些實施態樣中，可令中間製劑冷凍。在其他的實施態樣中，中間製劑在下游加工前不需要冷凍。在一些實施態樣中，以本文揭示之上游方法製備之AAV為編碼靶向SOD1的shRNA之AAV，AAV包含編碼MECP2之多核苷酸或AAV包含編碼SMN之多核苷酸，如本文所述。在一些實施態樣中，上游方法係在GMP下及以工業規模進行。
1.細胞株轉染及培養
在一個態樣中，本文揭示rAAV基因組。rAAV基因組包含一或多個AAV ITR，其側接編碼多肽(包括但不限於SMN多肽)或編碼針對在突變蛋白質或彼等基因之控制序列上的siRNA、shRNA、反義及/或miRNA之多核苷酸。多核苷酸有效地連結在靶細胞中起作用以形成基因卡匣的轉譯控制DNA，尤其為啟動子DNA、增強子DNA及多腺苷酸化訊號序列DNA。基因卡匣亦可包括內含子序列，在哺乳動物細胞中表現時促進RNA轉錄物加工。
在一些實施態樣中，rAAV(例如rAAV9)基因組編碼用於治療神經退化性疾患之營養或保護因子，該等疾患包括但不限於阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、亨廷頓氏症(Huntington's disease)連同神經系統損傷，包括脊髓和腦創傷/損傷、中風及腦 癌。已知的神經系統生長因子的非限制性實例包括神經生長因子(NGF)、腦衍生之神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3(NT-3)、神經營養因子-4/5(NT-4/5)、神經營養因子-6(NT-6)、睫狀神經營養因子(CNTF)、膠質細胞株衍生之神經營養因子(GDNF)、成纖維細胞生長因子家族(例如FGF之1至15)、白血病抑制因子(LIF)、胰島素樣生長因子家族的特定成員(例如IGF-1)、牛爾土倫(neurturin)、珀瑟芬(persephin)、骨型態發生蛋白質(BMP)、免疫親和素、生長因子之轉化生長因子(TGF)家族、神經調節蛋白質(neuregulin)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生之生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子家族(例如VEGF 165)、卵泡抑素、Hif1及其他等。通常亦預期的是調節本文預期之營養或保護因子中之各者的鋅指轉錄因子。在更多的實施態樣中，預期的是以siRNA、shRNA、反義或miRNA調節神經免疫功能之方法，包括但不限於通過例如NFkB抑制或用於神經保護之NFkB的微膠質細胞及星形神經膠質細胞激活抑制(NFkB及相關路徑在不同的細胞類型中之雙重作用)。在又更多的實施態樣中，rAAV(例如rAAV9)基因組編碼凋亡細胞抑制劑(例如bcl2、bclxL)。亦預期的是編碼營養因子或脊髓損傷調節蛋白質或軸突生長抑制劑之抑制因子(例如Nogo之抑制因子[Oertle等人之The Journal of Neuroscience,23(13)：5393-5406(2003)]的rAAV(例如rAAV9)用於治療脊髓損傷之用途。
在各種實施態樣中，用於治療神經退化性疾患(諸如 帕金森氏症)之rAAV(例如rAAV9)基因組編碼芳香酸多巴脫羧酶(AADC)、酪胺酸羥化酶、GTP-環水解酶1(gtpch1)、凋亡細胞抑制劑(例如bcl2、bclxL)、膠質細胞株衍生之神經營養因子(GDNF)、抑制性神經傳遞質-胺基丁酸(GABA)或涉及多巴胺生物合成之酵素。在更多的實施態樣中，rAAV(例如rAAV9)基因組可編碼例如帕金蛋白(Parkin)及/或突觸核蛋白質之修飾物。
在一些實施態樣中，預期的是增加乙醯膽鹼生產之方法以治療神經退化性疾患(諸如阿茲海默氏症)。在一些實施態樣中，預期的是增加膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)含量或抑制乙醯膽鹼酯酶(AchE)活性之方法。
在一些實施態樣中，rAAV(例如rAAV9)基因組編碼siRNA、shRNA、反義及/或miRNA，用於降低突變的突變的亨廷頓蛋白質(htt)表現以治療神經退化性疾患(諸如亨廷頓氏症)之方法。
在各種實施態樣中，rAAV(例如rAAV9)基因組編碼siRNA、shRNA、反義及/或miRNA，用於治療神經退化性疾患，諸如ALS。治療導致疾病之分子標誌物(諸如TNF-α一氧化氮、過氧亞硝酸鹽及/或一氧化氮合成酶(NOS))的表現降低。
在一些實施態樣中，載體編碼針對ALS的突變蛋白質(諸如超氧化物歧化酶(SOD，例如SOD-1)或ALS或帕金森氏症的神經營養因子(諸如GDNF或IGF1)之短髮夾RNA(shRNA)。
在一個實施態樣中，本文所述之方法及物料可用於治療ALS。ALS為導致腦和脊髓中的運動神經元之進行性喪失的神經退行性疾病，其症狀包括喪失說話、進食、移動及最終呼吸的能力。該疾病通常導致在診斷後3至5年內死亡。雖然ALS原因中之90至95%的原因仍未知，但是ALS的子集係由超氧化物歧化酶1(SOD1)基因中的基因突變所引起，其中突變引起優勢的功能獲得型毒性(toxic dominant gain-of-function)。小鼠研究顯示SOD1基因剔除不導致疾病，且因此降低突變的SOD1含量之療法被認為使疾病症狀緩解。
在一些實施態樣中，AAV載體編碼靶向ALS之SOD1的shRNA。編碼SOD1的shRNA之例示性AAV(例如scAAV9)構築體係於WO2015031392和US2016272976中提供，特此併入彼等全文。在一些實施態樣中，編碼SOD1的shRNA之AAV構築體可使用本文揭示之方法製備。在一些實施態樣中，該等AAV構築體可用於治療ALS。在一些實施態樣中，SOD1 AAV展現少於10%，例如少於7%、5%、4%、3%、2%或1%之空殼體。在一些實施態樣中，SOD1 AAV展現少量的殘留宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、質體DNA及/或內毒素，例如本文以AAV載體之製備及純化所討論之含量。如本文所使用之「AVXS-301」為scAAV9載體的非限制性實例，亦即包含編碼抗人SOD1 shRNA、經修飾之AAV2 ITR、人H1啟動子及未經修飾之AAV2 ITR的多核苷酸(例如pSOD1sh)。經修飾及未經修飾 之ITR可相對於抗人SOD1 shRNA表現卡匣之任一方向(亦即5'或3')進入。
如本文所使用之「pSOD1sh」載體質體包含編碼靶向超氧化物歧化酶1(SOD1)基因表現之短髮夾RNA(shRNA)(亦即抗SOD1 shRNA卡匣)的多核苷酸，其中卡匣係以腺相關病毒反向末端重複區(ITR)序列側接，例如編碼pSOD1sh之多核苷酸的「左」及「右」。在一些實施態樣中，編碼pSOD1sh之多核苷酸轉錄成特異性靶向人SOD1 mRNA之短髮夾RNA。在一些實施態樣中，環繞編碼pSOD1sh之多核苷酸的ITR序列為天生、變異或經修飾之AAVITR序列。在一些實施態樣中，至少一個ITR序列為天生、變異或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，ITR側接編碼pSOD1sh之多核苷酸。在一些實施態樣中，兩個ITR序列皆為天生、變異或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，「左」ITR為容許生產自身互補型基因組的經修飾之AAV2 ITR序列及「右」ITR為天生AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，「右」ITR為容許生產自身互補型基因組的經修飾之AAV2 ITR序列及「左」ITR為天生AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，pSOD1sh載體另包含人H1 RNA啟動子之區段，例如以Myslinksi.Myslinkski等人之"An unusually compact external promoter for RNA polymerase III transcription of the human H1RNA gene." Nucleic Acids Research,29(12)：2502-2509所述。在一些實施態樣中，pSOD1sh載體另包含自隨機質體主鏈 之區段製成的獨特填充序列以增加表現卡匣的大小。在一些實施態樣中，pSOD1sh載體包含編碼抗人SOD1 shRNA、經修飾之AAV2 ITR、人H1啟動子及未經修飾之AAV2 ITR之多核苷酸。
在一個實施態樣中，本文所述之方法及物料可用於治療神經發展性障礙，諸如瑞特氏症候群。瑞特氏症候群為首先在嬰兒期被辨識之罕見的神經系統疾患，在90至95%之病例中由X染色體上的MECP2基因突變所引起。Ruthie等人之"Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2,encoding methyl-CpG-binding protein 2." Nature Genetics,23：185-188。只有一套X染色體的男孩通常在出生後不久死亡，而有兩套X染色體的女孩通常具有一套功能性基因。他們在6至18個月之間開始出現症狀，伴有標誌性症狀，如手擰緊(hand wringing)或擠壓、拍手、摩擦、洗滌或或手伸向嘴巴。該疾病為進行性，具有可包括類自閉症行為、呼吸不規則、進食和吞嚥困難、生長遲緩及癲癇發作的顯著殘疾。有200種已知的MECP2基因突變且疾病的嚴重性係取決於X滅活及劑量補償水平而於患者與患者間迥然不同。小鼠研究顯示MECP2突變不引起神經元死亡，示意其不為神經退化性疾患。Guy等人之"Reversal of Neurological Defects in a Mouse Model of Rett Syndrome." Science,315(5815)"1143-1147。
與瑞特氏症候群有關的實施態樣，rAAV(例如rAAV9)基因組可編碼例如甲基胞嘧啶結合蛋白質2(MeCP2)。包含 編碼MeCP2之多核苷酸的例示性AAV(例如scAAV9)構築體係於美國專利第9,415,121號中提供，特此併入彼等全文。在一些實施態樣中，包含編碼MeCP2之多核苷酸的AAV構築體可使用本文揭示之方法製備。在一些實施態樣中，該等AAV構築體可用於治療瑞特氏症候群。在一些實施態樣中，MeCP2 AAV展現少於10%，例如少於7%、5%、4%、3%、2%或1%之空殼體。在一些實施態樣中，MeCP2 AAV展現少量的殘留宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、質體DNA及/或內毒素，例如本文以AAV載體之製備及純化所討論之含量。
如本文所使用之「AVXS-201」為scAAV9載體的非限制性實例，亦即包含：包含MECP2 cDNA表現卡匣、經修飾之AAV2 ITR、鼠類Mecp2啟動子、經修飾之SV40內含子、最小的多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR的多核苷酸(例如pMECP2)。經修飾及未經修飾之ITR可相對於MECP2 cDNA表現卡匣之任一方向(亦即5'或3')進入。
如本文所使用之「pMECP2」載體質體包含編碼MECP2蛋白質、經修飾之AAV2 ITR、鼠類Mecp2啟動子、經修飾之SV40內含子、最小的多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR的多核苷酸。在一些實施態樣中，pMECP2為包含編碼MECP2蛋白質(亦即MECP2 cDNA表現卡匣)之多核苷酸的載體構築體，其中卡匣係以腺相關病毒反向末端重複區(ITR)序列側接，例如編碼MECP2基因之多核苷酸的「左」及「右」。在一些實施態樣中，編碼MECP2之 多核苷酸為人MECP2序列，例如天然生成人MECP2序列或其同型異構體、變異體或突變體。在一些實施態樣中，ITR序列為天生、變異或經修飾之AAVITR序列。在一些實施態樣中，至少一個ITR序列為天生、變異或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，兩個ITR序列皆為天生、變異或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，「左」ITR為容許生產自身互補型基因組的經修飾之AAV2 ITR序列及「右」ITR為天生AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，「右」ITR為容許生產自身互補型基因組的經修飾之AAV2 ITR序列及「左」ITR為天生AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，pMECP2載體另包含小鼠Mecp2啟動子的區段，但不是所有的小鼠Mecp2啟動子。在一些實施態樣中，pMECP2載體另包含猿猴病毒40(SV40)內含子。在一些實施態樣中，pMECP2載體另包含最小的多腺苷酸化訊號，例如以Levitt等人之"Definition of an efficient synthetic poly(A)site." Genes & Development,3：1019-1025所定義。
在一些實施態樣中，本文揭示之rAAV基因組缺少AAV rep和cap DNA。在rAAV基因組(例如ITR)中的AAV DNA可來自任何可衍生重組病毒之AAV血清型，包括但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10及AAV-11。AAV血清型之基因組的核苷酸序列為此項技術中已知。例如，AAV-1之完整基因組係以GenBank登錄號 NC_002077提供；AAV-2之完整基因組係以GenBank登錄號NC 001401及Srivastava等人之Virol.,45：555-564{1983)提供；AAV-3之完整基因組係以GenBank登錄號NC_1829提供；AAV-4之完整基因組係以GenBank登錄號NC_001829提供；AAV-5基因組係以GenBank登錄號AF085716提供；AAV-6之完整基因組係以GenBank登錄號NC_00 1862提供；AAV-7及AAV-8基因組之至少一部分係分別以GenBank登錄號AX753246及AX753249提供；AAV-9基因組係以Gao等人之J.Virol.,78：6381-6388(2004)提供；AAV-10基因組係以Mol.Ther.,13(1)：67-76(2006)提供；及AAV-11基因組係以Virology,330(2)：375-383(2004)提供。
如本文所使用之「pSMN」載體質體包含編碼SMN蛋白質(亦即SMN cDNA表現卡匣)之多核苷酸，其中卡匣係以腺相關病毒反向末端重複區(ITR)序列側接，例如編碼SMN基因之多核苷酸的「左」及「右」。在一些實施態樣中，編碼SMN之多核苷酸為人SMN序列，例如天然生成人SMN序列或其同型異構體、變異體或突變體。在一些實施態樣中，ITR序列為天生、變異或經修飾之AAVITR序列。在一些實施態樣中，至少一個ITR序列為天生、變異或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，兩個ITR序列皆為天生、變異或經修飾之AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，「左」ITR為容許生產自身互補型基因組的經修飾之AAV2 ITR序列及「右」ITR為天生AAV2 ITR序列。 在一些實施態樣中，「右」ITR為容許生產自身互補型基因組的經修飾之AAV2 ITR序列及「左」ITR為天生AAV2 ITR序列。在一些實施態樣中，pSMN質體另包含CMV增強子/雞β-肌動蛋白(「CB」)啟動子。在一些實施態樣中，pSMN質體另包含猿猴病毒40(SV40)內含子。在一些實施態樣中，pSMN質體另包含牛生長激素(BGH)多腺苷酸化(polyA)終止訊號。可用於上文討論的組分中之一或多者的例示性序列顯示於以下表1中。在一些實施態樣中，使用以下表1中所顯示之所有序列。在一些實施態樣中，「AVXS-101」為使用表1中的所有序列及落在術語pSMN的範圍內之載體構築體的非限制性實例。
在一些實施態樣中，pSMN載體可包含SMN cDNA表現卡匣、經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR。經修飾及未經修飾之ITR可相對於SMN cDNA表現卡匣之任一方向(亦即5'或3')進入。
在一些實施態樣中，例如在本文所述之製造方法期間，令載體構築體序列包殼至例如AAV9病毒粒子中。在該等實施態樣中，包殼係在能夠遞送穩定的功能性轉基因(例如全長功能性人SMN轉基因、MECP2轉基因或抗SOD1 shRNA)之未複製的重組AAV9殼體中。在一些實施態樣中，殼體係由以交替剪接所生產的例如呈1：1：10之比的60個病毒蛋白質(VP1、VP2、VP3)所組成，使得VP2及 VP3為VP1的兩種截短形式，所有皆具有共同的C-末端序列。在一些實施態樣中，製造方法之產物(例如藥物產物)可包含未複製的重組AAV9殼體以遞送穩定的全長功能性人SMN轉基因、MECP2轉基因或抗SOD1 shRNA。在一些實施態樣中，殼體係由以交替剪接所生產的呈1：1：10之比的60個病毒蛋白質(VP1、VP2、VP3)所組成，使得VP2及VP3為VP1的兩種截短形式，所有皆具有共同的C-末端序列。
在一些實施態樣中，功能性病毒載體的量係以使用適合的試管內細胞檢定法或活體內動物模式所測量之%功能性vg/mL測定。例如，%功能性AAV SMN可使用SMA之動物模式(例如SMA△7小鼠)，或使用適合的細胞株(例如自SMA△7小鼠的皮質單離之原代神經祖細胞(NPC))的基於細胞之定量性檢定法的相對效力檢定。%功能性AAV MeCP2可使用適合的試管內細胞檢定法或活體內動物模式(例如Mecp2基因剔除小鼠小鼠)檢定。%功能性AAV SOD1可使用適合的試管內細胞檢定法或活體內動物模式(例如SOD1突變小鼠)檢定。
例示性載體構築體(例如AVXS-101)之DNA序列說明於表1中。
Figure 107138852-A0305-02-0049-2
在另一態樣中，AVXS-101載體構築體之DNA序列係以SEQ ID NO：1提供：
Figure 107138852-A0305-02-0049-3
Figure 107138852-A0305-02-0050-4
Figure 107138852-A0305-02-0051-10
Figure 107138852-A0305-02-0051-11
(SEQ ID NO：1)。
在一些實施態樣中，以pSMN質體編碼之SMN蛋白質的胺基酸序列包含：
Figure 107138852-A0305-02-0051-7
Figure 107138852-A0305-02-0051-8
(SEQ ID NO：2)。
在一些實施態樣中，AAV殼體蛋白質VP1、VP2、VP3係源自相同的轉錄物。該等具有替代的起始位點，但是共享羧基末端。VP1特異性胺基酸序列在下文以黑體及加粗顯示。VP1及VP2共有的胺基酸序列係加底線及呈斜體。所有三種殼體蛋白質共有的胺基酸係加粗及呈斜體。
Figure 107138852-A0305-02-0051-6
Figure 107138852-A0305-02-0052-13
Figure 107138852-A0305-02-0052-14
(SEQ ID NO：3)。
在一個實施態樣中，AAV殼體蛋白質係源自編碼以SEQ ID NO：3提出之胺基酸序列的轉錄物。
在另一態樣中，本文揭示包含rAAV基因組之DNA質體。令DNA質體轉染可允許以AAV之輔助病毒(例如腺病毒、E1缺失之腺病毒或皰疹病毒)感染之細胞，使rAAV基因組組裝至具有AAV9殼體蛋白質之感染性病毒粒子中。生產rAAV粒子之技術為此項技術中的標準技術，其中令欲包裝之AAV基因組、rep和cap基因及輔助病毒功能提供至細胞中。在一些實施態樣中，rAAV之生產涉及存在於單一細胞內(在本文以包裝細胞表示)的下列組分：rAAV基因組、自rAAV基因組單離的AAV rep和cap基因(亦即不在rAAV基因組中)及輔助病毒功能。假型rAAV之生產揭示於例如WO 01/83692中，以其全文併入本文以供參考。在各種實施態樣中，AAV殼體蛋白質可經修飾以增強重組載體之遞送。殼體蛋白質之修飾通常為此項技術中已知。參見例如US 2005/0053922和US 2009/0202490，以彼等全文併入本文以供參考。
rAAV生產的概括原則綜述於例如Carter,1992,Current Opinions in Biotechnology,1533-539；及Muzyczka,1992,CUM Topics in Microbial.and Immunol.,158：97-129)中。 各種方法說明於Ratschin等人之Mol.Cell.Biol.4：2072(1984)；Hennonat等人之Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6466(1984)；Tratschin等人之Mol.Cell.Biol.5：3251(1985)；McLaughlin等人之J.Virol.,62：1963(1988)；及Lebkowski等人之1988 Mol.Cell.Biol.,7：349(1988)中。Samulski等人之(1989,J.Virol.,63：3822-3828)；美國專利第5,173,414；WO 95/13365和相應的美國專利第5,658,776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin等人之(1995)Vaccine 13：1244-1250；Paul等人之(1993)Human Gene Therapy 4：609-615；Clark等人之(1996)Gene Therapy 3：1124-1132；美國專利第5,786,211；美國專利第5,871,982；及美國專利第6,258,595。將前述文件以彼等全文特此併入本文以供參考，特別著重在關於rAAV生產之文件的那些章節。
產生包裝細胞之例示性方法為設計穩定表現用於AAV粒子生產的所有必要組分之細胞株。例如，令包含缺少AAV rep和cap基因之rAAV基因組的質體(或多重質體)、自rAAV基因組單離的AAV rep和cap基因及可選擇的標誌物(諸如新黴素抗性基因)整合至細胞之基因組中。令AAV基因組藉由下列程序引入細菌質體中：諸如GC譜尾 (tailing)(Samulski等人之1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79：2077-2081)、添加含有限制性核酸內切酶切割位點之合成連結子(Laughlin等人之1983,Gene,23：65-73)或直接的鈍端接合(Senapathy & Carter,1984,J.Biol.Chem.,259：4661-4666)。接著令包裝細胞株以輔助病毒(諸如腺病毒)感染。此方法的優點在於細胞是可選擇的且適合於大規模的rAAV生產。適合的方法之其他實例係使用腺病毒或桿狀病毒而不是質體來引入rAAV基因組及/或rep和cap基因至包裝細胞中。
本文之揭示內容因此於各種實施態樣中提供生產感染性rAAV之包裝細胞。包裝細胞可為懸浮液中培養的非附著型細胞或附著型細胞。在一個實施態樣中，可使用任何適合的包裝細胞株，諸如HeLa細胞、HEK 293細胞和PerC.6細胞(同源293系)。在一個實施態樣中，細胞株為HEK 293細胞。
為了增加病毒載體生產量，可培養及選擇附著型細胞以改進對培養燒瓶的附著性。在一些實施態樣中，改進在後續的生物反應器接種步驟期間的轉染效率及細胞計數。在繼代培養期間，細胞可以此項技術中已知的方法自細胞培養物表面單離。例如，細胞可藉由在包含蛋白酶之溶液中刮擦或培育而提升。在例示性實施態樣中，HEK293細胞可以PBS清洗且在室溫下以胰蛋白酶經~2分鐘解離。解離可藉由添加含有血清之生長培養基而終止且細胞團塊可藉由重複滴量懸浮液而解離。接著細胞懸浮液可沉澱且經 單離之細胞沉澱物可再懸浮於適合的完全生長培養基中。接著細胞可接種在新的細胞培養室中且容許附著。在一段時期後，未附著至表面的細胞可藉由溫和的細胞培養基抽吸而移出，然後令細胞培養基以生長培養基完全替換。在一些實施態樣中，容許細胞附著的一段時期可為約2小時、約3小時、約4小時、約5小時、約6小時或約7小時。當細胞擴增時，則可重複此過程以增加牢固地附著至培養燒瓶的細胞部分。在一些實施態樣中，重複此過程至少2次、至少3次、至少4次、至少5次或任何適合的次數。在例示性實施態樣中，令HEK293細胞接種在75cm2燒瓶中，容許在37℃培育器中經4小時附著，然後弱附著之細胞以抽吸移出且替換細胞培養基。在例示性實施態樣中，重複選擇用於牢固的附著型細胞之過程以進行三次細胞培養傳代。
在其他的實施態樣中，rAAV9(亦即感染性包殼之rAAV9粒子)包含本文揭示之rAAV基因組。在一個態樣中，rAAV基因組為自身互補型基因組。
在另一態樣中，提供rAAV，諸如稱為「rAAV SMN」之rAAV9。在一些實施態樣中，rAAV SMN基因組具有依序的第一AAV2 ITR、具有巨細胞病毒增強子之雞β-肌動蛋白啟動子、SV40內含子、編碼SMN之多核苷酸、來自牛生長激素之多腺苷酸化訊號序列及第二AAV2 ITR。在一些實施態樣中，編碼SMN之多核苷酸為人SMN基因，例如提出或源自於GenBank登錄號MN_000344.2、Genbank登 錄號NM_017411或任何其他適合的人SMN同型異構體。例示性SMN序列包含序列：
Figure 107138852-A0305-02-0056-17
Figure 107138852-A0305-02-0056-15
(SEQ ID NO：4)。
亦預期的是SMN DNA之保守性核苷酸取代(例如在GenBank登錄號NM_000344.2之位置625上的鳥嘌呤變成腺嘌呤)。在一些實施態樣中，基因組缺少AAVrep和cap DNA，亦即在基因組的ITR之間沒有AAV rep或cap DNA。所預期之SMN多肽包括但不限於在NCBI蛋白質數據庫編號NP_000335.1中提出之人SMN1多肽。在實施態樣中，SMN DNA包含編碼人SMN多肽(例如以Uniprot登錄號Q16637，同型異構體1(Q16637-1)鑑定之人SMN蛋白質)之多核苷酸。亦預期的是SMN1-修飾因子多肽網素-3(PLS3)[Oprea等人之Science 320(5875)：524-527(2008)]。編碼其 他多肽之序列可取代SMN DNA。
在轉染前，細胞係在適合的培養基中於燒瓶或適合的生物反應器或二者中擴增。在一些實施態樣中，細胞可在提供連續的細胞培養基循環的生物反應器中擴增。在一個實施態樣中，細胞係在200m2、333m2或500m2 iCELLis生物反應器中擴增。一種培養基為具有5至10%之FBS、4.5g/L之葡萄糖、4mM L-麩醯胺酸的DMEM。在一些實施態樣中，令附著型細胞添加至循環培養基袋中的培養基中且通過生物反應器循環。在一些實施態樣中，細胞培養基或任何其他的培養基係使用蠕動泵通過生物反應器連續再循環。細胞可以適合的密度接種在用於培養及轉染之燒瓶或生物反應器中。接種密度可取決於細胞類型及直到轉染的時間量而定。在一些實施態樣中，細胞係以約8000至16000個細胞/cm2接種。在一實施態樣中，HEK293細胞係以8000至12,000個細胞/cm2接種。
適合於轉導及經轉導之細胞再引入個體中的方法為此項技術中已知。在一個實施態樣中，細胞可藉由下列方式於試管內轉導：令rAAV與細胞在例如適當的培養基中組合及使用習知的技術(諸如南方墨點法(Southern blot)及/或PCR)或使用可選擇的標誌物篩選那些攜帶關注之DNA的細胞。
在一些實施態樣中，包裝細胞株係以三種質體轉染：編碼或包含欲包裝在AAV載體內的載體序列之質體(例如pSMN、pMECP2轉基因或pSOD1sh)、pHELP及pAAV2/9。 轉染可使用此項技術中已知的技術中任一者進行，包括但不限於電穿孔、脂質體轉染，例如以脂染胺(lipofectamine)、陽離子性聚合物和陽離子性脂質。可使用任何適合的轉染培養基。在轉染方法的一個實施態樣中，附著型人胚胎腎(HEK293)細胞係以三重DNA質體聚乙烯亞胺(PEI)共沉澱而轉染。在一個實施態樣中，scAAV9.CB.SMN載體(包含CB啟動子及編碼SMN之多核苷酸的自身互補型AAV9載體)係在大規模的附著型細胞生物反應器中使用三重DNA質體轉染至附著型HEK293細胞中而生產，該轉染係使用PEI共沉澱。在一個實施態樣中，令用於細胞擴增之DMEM生長培養基以經修飾之DMEM轉染培養基替換。此培養基不以鈣及L-麩醯胺酸調配。在一個實施態樣中，轉染培養基為沒有FBS、沒有鈣、沒有L-麩醯胺酸及4.5g/L之葡萄糖的DMEM。在一些實施態樣中，沒有血清(例如沒有FBS)的轉染培養基改進轉染功效。在一實施態樣中，轉染培養基為OptiMEM(Invitrogen/Thermo Fisher)。在一個實施態樣中，三種質體(pSMN、pHELP及pAAV2/9)係與PEI一起在轉染培養基中混合且容許反應。在一些實施態樣中，三種質體係以約1：1：1之莫耳比一起混合。在一些實施態樣中，質體與PEI係以1：1之重量比的DNA：PEI混合。在一些實施態樣中，質體與PEI係以低於1：1之重量比的DNA：PEI混合。在一實施態樣中，pSMN、pHELP與pAAV2/9係以1：1：1之莫耳比在OptiMEM培養基中混合。在此一實施態樣中，添加PEI，使得DNA：PEI為以重 量計1：1。在一些實施態樣中，容許反應發生0至60分鐘、或10至45分鐘、或20至30分鐘。在一實施態樣中，容許反應進行15至30分鐘。
在一實施態樣中，本發明提供製造基於AAV之病毒載體之方法，其包含步驟(i)在工業規模生物反應器中培養附著型HEK293細胞，(2)以質體經少於60分鐘轉染附著型細胞而能夠生產AAV載體，且視需要地施加其他的加工、純化、調配及填充步驟以生產醫藥物產物。在此方法的一個實施態樣中，scAAV9.CB.SMN載體係使用三重DNA質體轉染而生產，該轉染係使用聚乙烯亞胺(「PEI」)共沉澱。在一實施態樣中，此轉染所利用的3種質體為pSMN、pAAV2/9及pHELP。
轉染可藉由令包裝細胞株與DNA-PEI共沉澱物接觸來進行。在一些實施態樣中，令轉染培養基中的DNA-PEI共沉澱物填充至培養基循環袋中。在一些實施態樣中，令轉染培養基中的DNA-PEI共沉澱物循環至生物反應器中且完全替換生長培養基。在一些實施態樣中，容許轉染培養基中的DNA-PEI共沉澱物在生物反應器與附著型細胞接觸。在一些實施態樣中，容許轉染培養基中的DNA-PEI共沉澱物在生物反應器中與附著型細胞接觸至多兩小時。在一些實施態樣中，轉染係經一至兩小時發生。在一些實施態樣中，轉染係經少於一小時發生，例如10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘或50分鐘。在一些實施態樣中，轉染係經一至兩小時發生。在一些實施態樣中，轉染係藉由通過生物 反應器再循環完全生長培養基且完全替換轉染培養基而終止。
2.收穫經擴增之病毒粒子
在一些實施態樣中，在轉染後適合的細胞擴增期後，令細胞溶解且收穫病毒粒子。在一些實施態樣中，在細胞溶解過程開始前，令細胞自反應器解離。在一些實施態樣中，令細胞於原位溶解。視需要地收穫病毒粒子而無需溶解。在一些實施態樣中，添加核酸內切酶，例如循環至生物反應器中至最終靶濃度。核酸內切酶可降解DNA和RNA。在一個實施態樣中，核酸內切酶為來自黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)之基因工程化核酸內切酶(Eaves,G.N.等人之J.Bact.1963,85,273-278；Nestle,M.等人之J.Biol.Chem.1969,244,5219-5225)，其係以班柔酶®(EMD Millipore)名稱銷售。酵素係自含有pNUC1生產質體之大腸桿菌菌株W3110(菌株K12的突變體)生產及純化(美國專利第5,173,418，特此併入其全文以供參考)。蛋白質在結構上為相同的245胺基酸之二聚物，約30kDa亞單元，具有兩個重要的二硫鍵。班柔酶®降解所有形式的DNA和RNA(單股、雙股、線性和環狀)且在寬廣的操作條件下有效消化核酸至2至5個鹼基長度的經5'-單磷酸終止之寡核苷酸。班柔酶®係在現行優良製造規範(cGMP)下生產且因此可用於純化蛋白質及/或病毒粒子之工業規模方法中。在cGMP條件下生產的其他核酸內切酶同樣地可用於 本申請案揭示之純化方法中。在一個實施態樣中，令班柔酶添加至生物反應器中達到介於50至200U/ml之最終濃度，例如75至150U/ml，例如約100U/mL。在一些實施態樣中，班柔酶的添加顯著地減少宿主細胞DNA，同時容許在生物反應器中的高vg生產。
在一些實施態樣中，容許核酸內切酶在溶解緩衝液添加至反應器前混合。在一些實施態樣中，容許細胞溶解溶液與附著型細胞混合至多1小時、至多2小時、至多3小時、至多4小時、或至多5小時。在一些實施態樣中，溶解緩衝液可包含氯化鎂及/或Tween-20於適合的緩衝液中。在例示性實施態樣中，溶解緩衝液為500mM HEPES、10%之Tween 20、20mM MgCl2、pH 8.0。可添加淬滅班柔酶反應之鹽蔗糖溶液(SSS)以終止溶解反應。在一些實施態樣中，令SSS添加至包含沖洗緩衝液之收穫袋中且混合15分鐘。在一些實施態樣中，令生物反應器以生物反應器沖洗緩衝液沖洗，且接著令沖洗液連同經淬滅之細胞溶解溶液及經溶解之細胞內容物收集在收穫物收集袋中，所有該等一起包含大批收穫物。在一些實施態樣中，生物反應器沖洗緩衝液可包含Tris、MgCl2、NaCl、Tween-20及蔗糖。在例示性實施態樣中，生物反應器沖洗緩衝液包含20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1%之Tween-20w/v及1%之蔗糖w/v，pH 8.1。
3.純化病毒粒子
在收穫後，通常可經由過濾法濃縮及純化大批病毒粒子收穫物。在一個實施態樣中，令病毒粒子以深層式過濾法，繼而以通過移出大分子污染物和細胞碎屑但允許載體基因組通過之過濾器(例如0.45μm過濾器)過濾。可使用任何適合的深層式過濾器。
如此項技術所理解，與在此等條件下會快速堵塞之膜過濾法相比，深層式過濾法係指使用多孔過濾器介質以淨化含有很大量的大粒子(例如完整細胞或細胞碎屑)之溶液。各種不同孔徑之深層式過濾介質係自市場上的各種製造商取得，諸如Millipore、Pall、General Electric和Sartorious。
可降低深層式過濾法的靶流速以保持過濾器入口壓力在規格內。一旦過濾所有的大批收穫物，則可令深層式過濾器在特定的實施態樣中以用於後續的第一切向流過濾步驟(「TFF1」)之滲濾緩衝液驅趕(chased)。令深層式過濾器積液(pool)混合。接著可令深層式過濾器積液通過0.45μm過濾器過濾，以進一步淨化大批收獲物。接著令0.45μm過濾器以TFF1緩衝液驅趕。
4.切向流過濾法
在各種實施態樣中，使用切向流過濾法濃縮大批收穫物及移出鹽和蛋白質，例如使用切向流過濾法。切向流過濾法(TFF)(亦稱為交叉流過濾法(Cross Flow Filtration)CFF)為那些熟習此項技術領域者所熟知，且在廣泛的情況 下用於實施的設備及操作程序係自市場上的各種製造商取得，包括但不限於Pall Corporation,Port Washington,NY及Spectrum Labs,Rancho Dominguez,CA。TFF通常可涉及滲餘物跨越膜表面的再循環。在特定的實施態樣中，此溫和的交叉流進料可使膜積垢最小化，維持高的過濾速率且提供高的產物回收率。在一個實施態樣中，TFF步驟可以平薄片(flat sheet)系統實施，如本文所例示。平薄片系統可用於大規模生產，其中此等系統具備有防止在病毒粒子上過度的剪切力之裝置(例如開放式流動通道)。另一選擇地，TFF步驟可以中空纖維系統實施，如本文所例示。在一個實施態樣中，TFF系統之分子量截留(MWCO)係介於200至400kDa之間，例如約300kDa。
在一個實施態樣中，TFF1步驟係使用300kDa MW截留再生纖維素膜卡匣進行。卡匣係以NaOH溶液沖洗及消毒且以TFF1緩衝液平衡。在一個實施態樣中，TFF1緩衝液包含20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1%之蔗糖、pH 8.1。
在一些實施態樣中，選擇TFF1步驟的濃縮階段以減少約10x的經淨化之收穫物體積。一旦達到滲餘物靶體積，則可開始滲濾操作。在一些實施態樣中，滲餘物可以約6滲濾體積之TFF1緩衝液滲濾。在一些實施態樣中，滲餘物係以約5至20、或10至15、或12滲濾體積之TFF1緩衝液滲濾。一旦達成6滲濾體積之滲透物總流量，則再濃縮及收穫滲餘物。可執行膜沖洗以增加中間藥物物質的產物回收 率，例如連續沖洗兩次。
5.中間產物
在一些實施態樣中，接著令中間藥物物質在乾冰上或在冷凍器中冷凍且接著轉移至
Figure 107138852-A0305-02-0064-23
-60℃儲存。在其他的實施態樣中，中間產物在下游方法前無需冷凍。
在一些實施態樣中，令多次中間產物批次積聚在一起用於進一步加工(例如以下游方法純化，例如本文所述)。多次中間產物批次可在冷凍及儲存前積聚。在其他的實施態樣中，多次中間產物批次可在經冷凍及儲存之批次解凍後積聚。
下游方法
在一些實施態樣中，使用下游方法加工中間產物(例如經積聚之中間產物)成為經過濾之藥物物質。在一些實施態樣中，下游方法步驟包括：(a)酸化及淨化(例如使用過濾法)，(b)陽離子交換層析術，(c)切向流過濾法(「TFF2」)，(d)CsCl超離心，(e)收集病毒載體，及(f)進一步的切向流過濾法(「TFF3」)以生產經過濾之藥物物質，其中令純化之AAV粒子懸浮在醫藥上可接受之載劑中。在一些實施態樣中，下游方法含有接續在生產TFF1中間物後的下列製造步驟：解凍及積聚TFF1中間物、酸化及淨化、陽離子交換層析術(CEX)、切向流過濾法(TFF2)、用於完全/空殼體單離之CsCl超離心、用於濃縮/緩衝液更 換之切向流過濾法(TFF3)、TFF3積液物過濾以產生藥物物質、稀釋及過濾藥物物質以生產藥物產物、儲存藥物產物、及填充藥物產物至小瓶中。
在一些實施態樣中，可使用本文揭示之下游方法加工包含AAV SMN、AAV MECP2或編碼靶向SOD1之shRNA的AAV之中間物，如本文所述。
1.中間物之酸化及淨化
在其中冷凍中間物的實施態樣中，下游方法係以解凍TFF1中間物開始。可使用清潔劑(例如Tween 20)在酸性pH下促進大部份的宿主細胞蛋白質及DNA絮凝。接著可降低含有清潔劑之TFF1中間物的pH。接著可令pH降低時所形成之絮凝物及沉澱物藉由溶液通過深層式過濾器及移出大分子污染物和細胞碎屑，但允許載體基因組通過之過濾器(例如0.45μm過濾器)過濾而移出。可使用任何適合的深層式過濾器。
在一個實施態樣中，令Tween 20緩慢地添加至TFF1中間物溶液中以達成介於10至20%之Tween 20的最終濃度。在一些實施態樣中，在添加Tween 20後，靶組成物為在20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1%之蔗糖m/v、pH 8.1中的36%之Tween 20溶液。在一些實施態樣中，Tween 20係經約1至6小時期間緩慢地添加。在一些實施態樣中，Tween 20係經約3至6小時緩慢地添加。在一些實施態樣中，Tween 20係經約4小時緩慢地添加。在 一些實施態樣中，容許Tween 20/TFF1中間物溶液在室溫下經隔夜培育。在一些實施態樣中，容許Tween 20/TFF1中間物溶液在室溫下培育8至20小時。在例示性實施態樣中，容許Tween 20/TFF1中間物溶液在室溫下培育12至20小時。
在培育後，含有TFF1中間物之Tween 20的pH可藉由添加任何適合的酸降低。在一些實施態樣中，添加1M甘胺酸pH 2.5以達成3.5±0.1之靶pH。在一些實施態樣中，靶pH為pH 3.0至4.0、約pH 3.3至3.7、約pH 3.4至3.6、或約pH 3.5。一旦pH在允收範圍內，則可令溶液通過任何大小的過濾器。在例示性實施態樣中，深層式過濾器(例如Clarisolve POD)可0.45μm過濾器(例如Opticap XL10 Durapore過濾器)或0.8/0.45μm PES過濾器連線使用。
2.陽離子交換層析術
在各種實施態樣中，使用陽離子交換(CEX)俘獲層析術步驟，例如自宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、宿主細胞脂質、Tween 20及其他的加工相關雜質單離病毒殼體。陽離子交換層析術的原理為此項技術中所熟知，但簡言之，此方法係依賴欲單離之帶正電粒子與所使用之帶負電樹脂之間的電荷-電荷相互作用。通常管柱先藉由流過很少的滲濾體積之緩衝液來平衡，直到pH及電導率穩定。接著裝載樣品且以裝載緩衝液清洗管柱。最後，使用溶析緩衝液自管柱溶析出關注之樣品，且收集含有樣品的部份。 存在的關注樣品可以溶析液之光學吸收量度檢測。
在一個實施態樣中，CEX步驟係利用CIMmultus S03-8000 Advanced Composite Column(磺醯基)(2μm小孔)層析管柱。在一個實施態樣中，溶析峰係在OD280急劇上升時開始收集。當電導率在介於80至85mS/cm之間時，OD280開始上升。CEX溶析液可根據慣例的程序收集且可以兩個部分收集。在一個實施態樣中，第一部分係在OD280急劇上升時開始且收集1.5收集體積(CV)。在另一實施態樣中，第二部分係在第一部分後立即開始且收集1.0CV。令兩個部分積聚且接著中和至pH 8.0±0.30。在一個實施態樣中，中和緩衝液包含1.0M Tris，在20℃下pH 9.1±0.1。
3.切向流過濾法2
在一些實施態樣中，使用切向流過濾步驟(TFF2)濃縮、移出蛋白質雜質及更換緩衝液成為適合於後續CsCl超離心步驟之緩衝液。可使用任何適合的TFF膜。在一實施態樣中，TFF2步驟係利用300kD MWCO再生纖維素膜。
在一些實施態樣中，設計此步驟之濃縮階段以減少CEX溶析液體積。在一個實施態樣中，令滲餘物以滲濾緩衝液稀釋2倍且令滲餘物濃縮至其初始體積。在一個實施態樣中，滲濾緩衝液為TFF2 NaCl滲濾緩衝液，其含有20mM Tris、2mM MgCl2、150mM NaCl、0.2%之泊洛沙姆188、1%之蔗糖、在20℃下pH 8.1±0.1。在此等實施態樣中，可重複此過程，直到完成以新的緩衝液滲濾。在一個 實施態樣中，令滲餘物以含有CsCl之滲濾緩衝液稀釋2倍且令滲餘物濃縮至其初始體積。在一實施態樣中，含有CsCl之滲濾緩衝液為TFF2 CsCl滲濾緩衝液，其含有20mM Tris、2mM MgCl2、3M CsCl、0.2%之泊洛沙姆188、在20℃下pH 8.1±0.1。在此等實施態樣中，可重複此過程，直到完成以新的緩衝液滲濾。一旦完成CsCl滲濾，則接著可濃縮滲餘物至指定體積，其係取決於系統滯留體積。在一些實施態樣中，執行膜沖洗(例如連續沖洗兩次)，使來自TFF2系統的產物回收率最大化。
4.CsCl超離心
在一些實施態樣中，在使用AAV於活體內基因轉導的情況下，rAAV之最終產物可含有最少的雜質及空粒子。用於純化AAV載體之兩種方法為使用碘克沙醇(iodixanol)梯度或CsCl梯度之超離心。一種比較兩種方法的研究證實碘克沙醇與CsCl相比而得到具有較高的載體純度之AAV載體，但是具有更多的空病毒殼體。Strobel等人之"Comparative Analysis of Cesium Chloride-and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications." Human Gene Therapy Methods,26(4)：147-157。儘管使用CsCl導致較少量的空病毒殼體，但是CsCl可能對細胞有毒，且可能需要多個純化步驟以移出殘留CsCl，其與較短時間的方法(如碘克沙醇(~1天))相比而導致較長的加工時間(~3.5天)。不同的研 究顯示以許多步驟移出殘留CsCl時常造成顯著的rAAV損失，導致低的產量及回收率，常常否定該方法的其他好處。Hermens等人之"Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus by Iodixanol Gradient Ultracentrifugation Allows Rapid and Reproducible Preparation of Vector Stocks for Gene Transfer in the Nervous System." Human Gene Therapy,10：1885-1891。此外，雖然該兩種方法在用於生產臨床前樣品的實驗室中作用良好，但是該等方法不具有可擴展性且因此不適合大規模生產商業產品。參見例如Tomono等人之"Ultracentrifugation-free chromatography-mediated large-scale purification of recombinant adeno-associated virus serotype 1(rAAV1)." Molecular Therapy-Methods & Clinical Development,3：15058(「使用氯化銫(CsCl)或碘克沙醇密度超離心之純化方法不適合於大規模生產」)。
在一些實施態樣中，使用超離心步驟例如自完全殼體單離空殼體。本文揭示之CsCl超離心方法出乎意外地可擴展且適合於大規模生產經純化之AAV載體。超離心可以分析型超離心進行且可涉及使用梯度緩衝液。梯度緩衝液的實例包括但不限於CsCl、蔗糖、碘克沙醇及此項技術中已知的其他等。離心可在任何能夠達到所欲g-力之離心機中進行，例如自動化Optima XPN 100 Ultra Centrifuge系統或具備有50.2 Ti型轉子或等效轉子之等效系統。在超離心後，空殼體及完全殼體在試管內單離至不同區帶中且可藉 由自特定的區帶抽出物料而提取。在一些實施態樣中，經TFF2純化之過濾物料係以241,600至302,000g(在50.2 Ti轉子中以~40,000至50,000rpm)離心。在一些實施態樣中，經TFF2純化之過濾物料經隔夜離心。在一些實施態樣中，經TFF2純化之過濾物料離心16至24小時。在一些實施態樣中，經TFF2純化之過濾物料離心20至24小時。在一些實施態樣中，經TFF2純化之過濾物料係在15至25℃下離心。在一實施態樣中，經TFF2純化之過濾物料係在20℃下以302,000g(在50.2 Ti轉子中以50,000rpm)離心17小時。在一些實施態樣中，用於CsCl離心之緩衝液可具有下列成分中之一或多者，包含：(a)CsCl，另包含下列中之一或多者：(b)MgCl2、(c)泊洛沙姆188及(d)Tris。在一些實施態樣中，用於CsCl之緩衝液可包括所有的(a)、(b)、(c)及(d)。在一些實施態樣中，用於CsCl之緩衝液具有pH 7.5至8.5、或pH 7.9至8.2。在一實施態樣中，適合於CsCl離心的緩衝液為20mM Tris、2mM MgCl2、3M CsCl、0.2%之泊洛沙姆188、pH 8.1±0.10。在完成離心步驟後，自超離心機移出試管。在一些實施態樣中，最高的區帶(區帶A)含有空殼體。在一些實施態樣中，次高的區帶(區帶B、C和D)含有完全殼體的雙區帶。在一些實施態樣中，使用注射器收集AAV病毒載體。在一實施態樣中，區帶B、C和D係以連接至插入區帶D正下方至試管中間的30mL注射器之18G針移出。在其他的實施態樣中，存在於區帶中的完全或空殼體可使用此項技術中已知及/或如本文所述之技 術檢定且收集含有完全殼體之區帶。
空病毒殼體對非空病毒殼體之比可以標準的實驗室技術測量。在一些實施態樣中，測量係以光學吸收量度進行。在一些實施態樣中，測量係以UV吸收量度進行。在一些實施態樣中，殼體蛋白質總量及DNA總量可自UV吸收量度測定。在一些實施態樣中，測量係以光學折射率量度進行。在一些其他的實施態樣中，測量係以分析型超離心進行。
在一個實施態樣中，在超離心後收集之AAV病毒載體具有少於8%之空殼體、少於7%之空殼體、少於5%、少於3%、或少於1%。在一個實施態樣中，在超離心後收集之AAV病毒載體具有1至10%之空殼體。在一個實施態樣中，在超離心後收集之AAV病毒載體具有2至8%之空殼體。在一個實施態樣中，空殼體數量係低於檢測限度。在另一實施態樣中，空殼體百分比係以總殼體百分比測定。
5.切向流過濾法3以產生經過濾之藥物物質
在一些實施態樣中，使用切向流過濾法步驟(TFF3)移出CsCl且濃縮完全載體殼體。切向流過濾法可使用適合的膜進行。在一個實施態樣中，使用300kDa MWCO再生纖維素膜。載體殼體可由膜保留。可設計TFF3操作之濃縮階段以降低殘留CsCl的濃度及超離心積液的體積。在一些實施態樣中，一旦達到滲餘物靶體積，則開始滲濾。滲餘物係以至多10滲濾體積之適合的TFF3緩衝液滲濾。在一個實 施態樣中，適合的TFF3緩衝液可包括下列組分中之一或多者，包含(a)Tris、(b)MgCl2、(c)NaCl或(d)泊洛沙姆188。在一個實施態樣中，適合的TFF3緩衝液可包括所有的(a)、(b)、(c)及(d)。在一個實施態樣中，TFF3緩衝液具有pH 7.5至8.5、pH 7.7至8.3、或pH 8.0。在一實施態樣中，適合的TFF3緩衝液包含20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.001%之泊洛沙姆188、在20℃下pH 8.0±0.1。在另一實施態樣中，適合的TFF3緩衝液包含20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005%之泊洛沙姆188、在20℃下pH 8.0±0.1。在一個實施態樣中，經濃縮之滲餘物係使用0.2μm Pall Supor® EKV Sterilizing-Grade Filter(Mini Kleenpak)過濾器過濾以生產經過濾之藥物物質。在一些實施態樣中，本文所述之方法得到每一製造批次超過5×1015vg、或超過8×1015vg、或超過1×1016vg之rAAV。
醫藥組成物
根據本文揭示之方法純化之病毒(例如AAV)粒子可以高產量生產，具有足夠使彼等可投予人個體的純度。在一些實施態樣中，病毒載體係以介於約1至8×1013病毒載體基因組/mL(vg/mL)，或約1.7至2.3×1013vg/mL之間的濃度調配。在一些實施態樣中，病毒載體係以約1.9至2.1×1013vg/mL之濃度調配。在一些實施態樣中，病毒載體濃度調配係以約2.0×1013vg/mL之濃度調配。
在一些實施態樣中，在病毒載體之生產過程期間可產 生不含有核酸物料的空病毒殼體。包含少量的空病毒殼體之醫藥組成物可為有利的，因為彼等避免具有不成熟的免疫系統之患者(例如嬰兒)不必要地暴露於抗原物料(空殼體、宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA)而無治療效益。在一些實施態樣中，此等醫藥組成物可降低潛在的輸注反應或更寬的免疫反應且可改進治療功效。與具有基因組物料之完全病毒殼體相比，空殼體具有不同的密度，容許兩種物種以梯度離心或此項技術中已知的其他方法單離。在一些實施態樣中，空殼體係以超離心單離。在一些實施態樣中，空殼體係以CsCl梯度超離心單離。在其他的實施態樣中，空殼體係以碘克沙醇梯度超離心單離。在一些實施態樣中，空殼體係以蔗糖梯度超離心單離。
空病毒殼體對非空病毒殼體之比可以標準的實驗室技術測量。在一些實施態樣中，該比係以光學吸收量度測量。在一些實施態樣中，該比係UV吸收量度測量。在一些實施態樣中，殼體蛋白質總量及DNA總量可自UV吸收量度測定。在一些實施態樣中，測量係以光學折射率量度測定。在一些其他的實施態樣中，測量係以分析型超離心測定。
高含量的空殼體可對病毒載體治療的功效提出挑戰。在一個實施態樣中，醫藥組成物具有少於10%之空殼體、少於8%之空殼體、少於7%、少於約5%、少於3%、少於1%之空殼體。在另一實施態樣中，醫藥組成物具有1至10%之空殼體。在另一實施態樣中，醫藥組成物具有2至 8%之空殼體。在另一實施態樣中，醫藥組成物具有少於或等於6%之空殼體、5%之空殼體、4%之空殼體、3%之空殼體、2%之空殼體或更少。在一實施態樣中，高空殼體數量係低於檢測限度。在另一實施態樣中，空殼體百分比係以總殼體百分比測定，例如使用AUC。在一些實施態樣中，在投予患者後，該等低百分比空殼體改進治療功效及/或減少不良事件(例如發炎反應、肝損傷)，例如與具有較高的百分比空殼體之組成物相比。在一些實施態樣中，與例如那些不使用本文所述之附著型細胞及/或純化方法之先前方法的含量相比，製備本文揭示之病毒載體之方法提供該等改進的空殼體百分比。
在病毒載體之生產過程期間，可能未完全單離出用於產生病毒載體之附著型細胞(例如HEK293細胞)的殘留蛋白質。殘留宿主細胞蛋白質具有引發免疫反應的潛力。殘留宿主細胞的量可藉由可區分病毒殼體蛋白質與殘留宿主細胞蛋白質之任何標準的實驗室技術來測量。在一些實施態樣中，殘留宿主細胞蛋白質的量可以大小排阻或離子交換層析術測量。在一些實施態樣中，測量可以親代細胞特異性抗體之西方墨點法進行。在一個實施態樣中，殘留宿主細胞蛋白質的量可以酵素連結免疫吸附檢定法(ELISA)測量。在一些實施態樣中，殘留宿主細胞蛋白質的量可以商業上的ELISA套組測量。在一些實施態樣中，殘留宿主細胞蛋白質的量可以Cygnus Technologies HEK293 HCP ELISA套組測量。
在另一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞蛋白質係每1×1013vg/ml計少於或等於5×106pg/ml、每1×1013vg/ml計少於或等於1.2×106pg/ml、或每1×1013vg/ml計1×105pg/ml至每1×1013vg/ml計1.2×106pg/ml、或每1×1013vg/ml計少於或等於40ng/ml。在一實施態樣中，醫藥組成物包含每1.0×1013vg計少於或等於5、4、3、2、1ng或更少的殘留宿主細胞蛋白質。在一個實施態樣中，醫藥組成物包含每1.0×1013vg計少於或等於4ng殘留宿主細胞蛋白質。
在病毒載體之生產過程期間，可能未完全移出來自附著型細胞(例如HEK293細胞)的殘留宿主細胞DNA或經轉染以產生病毒載體之殘留質體。純化方法(例如酸化、淨化、切向流過濾法等)移出大部分的殘留宿主細胞或質體DNA。在一個實施態樣中，殘留宿主細胞或質體DNA的量係以PCR進行測量。在另一實施態樣中，殘留宿主細胞或質體DNA的量係以對宿主細胞或質體序列具有特異性的引子之定量性PCR(qPCR)進行測量。在另一實施態樣中，殘留宿主細胞或質體DNA的量係以數位式液滴PCR(ddPCR)進行測量。在一個實施態樣中，質體DNA的量係使用對質體之卡那黴素抗性基因區具有特異性的引子之qPCR檢定法測定。在另一實施態樣中，殘留宿主細胞DNA的量係以商業上的qPCR檢定套組測定，例如ThermoFisher之resDNASEQ© Human Residual DNA Quantitation Kit、Biorad之Residual DNA Quantification Supermix或任何等效 產品。減少殘留宿主細胞或質體DNA的量可改進治療結果，且可純化及/或選擇用於本文揭示之治療的此等組成物。
在一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞DNA係以每1×1013vg/ml計少於或等於1.7×106pg/ml、每1×1013vg/ml計1×105pg/ml至每1×1013vg/ml計1.2×106pg/ml。在一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞DNA係以每1×1013vg計少於或等於3×105、2×105、1.1×105、1×105pg或更少。在實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞DNA係以每1×1013vg計少於或等於1.1×105pg。
在另一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留質體DNA係以每1×1013vg/ml計少於或等於1.7×106pg/ml、每1×1013vg/ml計1×105pg/ml至每1×1013vg/ml計1.7×106pg/ml。在另一實施態樣中，在該醫藥組成物中的殘留質體DNA係以每1×1013vg計少於或等於6.8×105pg。
在一實施態樣中，在醫藥組成物中的殘留宿主細胞DNA係以每1×1013vg計少於或等於1.1×105pg，及在該醫藥組成物中的殘留質體DNA係以每1×1013vg計少於或等於6.8×105pg。
在一實施態樣中，在醫藥組成物中的殘留宿主細胞DNA係以每1×1013vg計少於或等於1.1×105pg，及在該醫藥組成物中的殘留質體DNA係以每1×1013vg計少於或等於6.8×105pg，及在該醫藥組成物中的殘留宿主細胞蛋白質 係以每1×1013vg計少於或等於4ng。
在一些實施態樣中，在醫藥組成物中的內毒素量係以每1.0×1013vg/mL計少於約1EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.75EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.5EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.4EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.35EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.3EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.25EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.2EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.15EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.1EU/mL、每1.0×1013vg/mL計少於約0.05EU/mL、或每1.0×1013vg/mL計少於約0.02EU/mL。用於測定內毒素量之方法為此項技術中已知，例如鱟變形細胞溶解物(limulus amoebocyte lysate)(LAL)試驗。在實施態樣中，內毒素係依照U.S.藥典(「USP」)<85>(以其全文併入本文以供參考)檢定。
在一個實施態樣中，在醫藥組成物中的牛血清白蛋白(BSA)係以每1.0×1013vg計少於0.5ng、每1.0×1013vg計少於0.3ng、或每1.0×1013vg計少於0.22ng。在一個實施態樣中，在該醫藥組成物中的班柔酶係以每1.0×1013vg計少於0.2ng、每1.0×1013vg計少於0.1ng、或每1.0×1013vg計少於0.09ng。
在一個實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含下列中之一或多者：每1.0×1013vg計少於約0.09ng班柔酶、少於約30μg/g(ppm)之銫、約20至80ppm泊洛沙姆188、每 1.0×1013vg計少於約0.22ng BSA、每1.0×1013vg計少於約6.8×105pg殘留質體DNA、每1.0×1013vg計少於約1.1×105pg殘留hcDNA、每1.0×1013vg計少於約4ng rHCP、pH 7.7至8.3、約390至430mOsm/kg、每一容器少於約600個
Figure 107138852-A0305-02-0078-24
25μm大小的粒子、每一容器少於約6000個
Figure 107138852-A0305-02-0078-25
10μm大小的粒子、約1.7×1013至2.3×1013vg/mL之基因組效價、每1.0×1013vg計約3.9×108至8.4×1010IU之感染效價、每1.0×1013vg計約100至300μg總蛋白質、以約7.5×1013vg/kg之病毒載體劑量於△7SMA小鼠中
Figure 107138852-A0305-02-0078-26
24天的中位存活期、以試管內基於細胞之檢定法為基礎約70至130%之相對效力、及/或少於約5%之空殼體。
在一個實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含下列中之一或多者(例如全部)：pH 7.7至8.3(例如根據USP<791>所測量)、約390至430之mOsm/kg(例如根據USP<785>所測量)、每一容器少於約600個
Figure 107138852-A0305-02-0078-27
25μm大小的粒子(例如根據USP<787>所測量)、每一容器少於約6000個
Figure 107138852-A0305-02-0078-28
10μm大小的粒子(例如根據USP<787>所測量)、約1.7×1013至2.3×1013vg/mL之基因組效價、每1.0×1013vg計約3.9×108至8.4×1010IU之感染效價、每1.0×1013vg計約100至300μg總蛋白質、以約7.5×1013vg/kg之病毒載體劑量於△7SMA小鼠中
Figure 107138852-A0305-02-0078-29
24天的中位存活期(例如以例如本文所述之活體內功能性試驗)、以試管內基於細胞之檢定法為基礎約70至130%之相對效力、及/或少於約5%之空殼體。在實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含大於或等於95%之 總純度(例如以SDS-PAGE所測定)。在實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含大於2%含量的無單一未經命名之相關雜質(例如以SDS-PAGE所測定)。在實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物包含少於或等於0.75EU/mL之內毒素含量(例如根據USP<85>所測量)。在實施態樣中，本文揭示之醫藥組成物在滅菌試驗中測試出未生長，例如根據USP<71>所測量。
高含量的殘留宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、質體DNA及/或內毒素可對病毒載體治療的功效提出挑戰。在一些實施態樣中，在投予患者後，該等少量的殘留宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、質體DNA及/或內毒素改進治療功效及/或減少不良事件(例如發炎反應、肝損傷)，例如與具有較高的該等量之組成物相比。在一些實施態樣中，與例如那些不使用本文揭示之附著型細胞及/或純化方法之先前方法的含量相比，製備本文揭示之病毒載體之方法提供該等改進的含量。在一些實施態樣中，除了少量的殘留宿主細胞蛋白質、宿主細胞DNA、質體DNA及/或內毒素以外，本文之方法亦容許製備具有減少的空殼體百分比之病毒載體。
在一些實施態樣中，在TFF後(例如第二TFF後)的殘留銫量少於約50μg/g。在一些實施態樣中，在TFF後(例如第二TFF後)的殘留銫量少於約30μg/g。在一些實施態樣中，在TFF後(例如第二TFF後)的殘留銫量少於約20μg/g。在一些實施態樣中，在醫藥組成物中的殘留銫少於或等於30 μg/g(ppm)。在一些實施態樣中，殘留CsCl量可以質譜術、感應耦合電漿質譜術(ICP-MS)及/或另一適合的方法測量。在一些實施態樣中，在第二TFF後的殘留銫量低於例如使用ICP-MS之定量限度。
在一些實施態樣中，在第二TFF後收集的AAV病毒載體濃度係大於或等於約5×1012vg/ml、大於或等於約1×1013vg/ml、或大於或等於約3×1013vg/ml。
在一個實施態樣中，醫藥組成物具有下列中之一或多者：每1.0×1013vg計少於0.09ng班柔酶、少於30μg/g(ppm)之銫、約20至80ppm泊洛沙姆188、每1.0×1013vg計少於0.22ng BSA、每1.0×1013vg計少於6.8×105pg殘留質體DNA、每1.0×1013vg計少於1.1×105pg殘留hcDNA、及每1.0×1013vg計少於4ng rHCP。
在另一實施態樣中，醫藥組成物保留介於參考標準的+20%、介於參考標準的+15%、介於參考標準的+10%、或介於參考標準的+5%之效力。在一個實施態樣中，效力係以相對於參考標準來評定，該評定係使用Foust等人之Nat.Biotechnol.,28(3),pp.271-274(2010)中的方法。可使用任何適合的參考標準。在一個實施態樣中，醫藥組成物具有如以SMA△7小鼠所測試之活體內效力。在一實施態樣中，以7.5×1013vg/kg之劑量給出之測試小鼠具有大於15天、大於20天、大於22天、或大於24天的中位存活期。在一個實施態樣中，醫藥組成物具有相對於參考標準及/或適合的對照組的50至150%、60至140%、或70至130%之試管內相 對效力，如以基於細胞之檢定定法所測試。
根據本發明純化之病毒粒子(例如病毒粒子)可根據已知的方法調配以製備醫藥上有用的組成物。本發明之組成物可使用此項技術中已知的技術調配以投予哺乳動物個體，例如人。遞送系統特別地可經調配用於肌肉內、皮膚內、黏膜、皮下、靜脈內、鞘內、可注射儲庫型裝置或局部投予。
當遞送系統經調配成溶液或懸浮液時，則遞送系統係於可接受之載劑中，例如水性載劑。可使用各種水性載劑，例如水、經緩衝之水、0.8%之食鹽水、0.3%之甘油、玻尿酸及類似者。該等組成物可以慣例、熟知的滅菌技術滅菌或可經滅菌過濾。所得水性溶液可以原樣子包裝使用或凍乾，經凍乾之製劑係在投予前與滅菌溶液組合。
組成物(例如醫藥組成物)可含有接近生理條件的醫藥上可接受之輔助物質，諸如pH調節和緩衝劑、張力調節劑、潤濕劑及類似者，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。在一些實施態樣中，醫藥組成物包含保存劑。在一些其他的實施態樣中，醫藥組成物不包含保存劑。
病毒載體(例如那些在本文揭示之組成物及調配物中的病毒載體)之基因組效價可以許多標準方式測定。以對病毒載體具有特異性的引子之PCR可提供相對量度，但是可以定量性PCR(qPCR)用於更小的樣品及絕對量度。液滴數位式PCR(ddPCR)為以水-油乳液滴技術為基礎進行數位 式PCR之方法。令樣品分成數以萬計的液滴，且模板分子的PCR擴增係發生在各單獨的液滴中。不需要製作標準曲線或具有高擴增效率的引子，因此ddPCR通常不使用與傳統的基於PCR之技術一樣多的樣品。在一個實施態樣中，病毒載體之基因組效價係使用PCR測定。在另一實施態樣中，病毒載體之基因組效價係使用qPCR測定。在另一實施態樣中，病毒載體之基因組效價係使用ddPCR測定。使用ddPCR測定病毒基因組效價之方法說明於例如Loek等人之"Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR," Human Gene Therapy Methods,25(2)：115-125中。
在一些實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向SMN基因之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向雞β-肌動蛋白啟動子之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向CMV增強子之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向ITR序列之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向牛生長激素多腺苷酸化訊號之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。
在一些實施態樣中，醫藥組成物為約pH 7.7至8.3及具有390至430mOsm/kg之滲透壓度。在一些實施態樣中，pH係使用pH計測量。在一些實施態樣中，pH係依照由美國藥典(USP)設定之標準(例如<791>)(併入其全文以供參考)使用具有溫度補償之微電極以電位方式測量。在一些實施態樣中，滲透壓度係依照USP(例如USP<785>)(併入其全文以供參考)使用凝固點下降測量。在一些實施態樣中，滲透壓度係使用蒸氣壓下降滲透壓計測量。在其他的實施態樣中，滲透壓度係使用膜滲透壓計測量。
在一個實施態樣中，靜脈內調配物具有介於7.5與8.5之間的pH、2×1013vg/ml至6×1013vg/ml之基因組效價及384至448mOsm/kg之滲透壓度。在另一實施態樣中，靜脈內調配物具有介於7.5與8.5之間的pH、1.5×1013vg/ml至3.5×1013vg/ml之基因組效價及384至448mOsm/kg之滲透壓度。在另一實施態樣中，靜脈內調配物具有介於7.5與8.5之間的pH、1.8×1013vg/ml至2.2×1013vg/ml之基因組效價、及384至448mOsm/kg之滲透壓度。在一實施態樣中，IV調配物包含約0.1至2.0mM MgCl2。在一實施態樣中，IV調配物包含約100至300mM NaCl。在一實施態樣中，IV調配物包含約0.001%至0.01% w/v之泊洛沙姆188。在一實施態樣中，IV調配物為在例如7.5至8.5之pH的10至30mM Tris緩衝液中的水性調配物。
在一實施態樣中，IV調配物包含在pH 8.0的20mM Tris緩衝液中的1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005% w/v 之泊洛沙姆188。在實施態樣中，IV調配物包含約1×1013至3×1013vg/mL或1.7×1013至2.3×1013vg/mL之基因組效價。
醫藥組成物之用途
在其他的實施態樣中，本文揭示用於遞送多核苷酸至患者的中樞神經系統之方法，其包含投予具有包括多核苷酸之基因組的rAAV9。在一些實施態樣中，遞送為鞘內遞送多核苷酸至患者的中樞神經系統，其包含投予具有包括多核苷酸之基因組的rAAV9。在一些實施態樣中，亦對患者投予非離子性、低滲透性對比劑。非離子性、低滲透性對比劑增加靶細胞在患者的中樞神經系統中轉導。在一些實施態樣中，rAAV9基因組為自身互補型基因組。在其他的實施態樣中，rAAV9基因組為單股基因組。
在一些實施態樣中，多核苷酸係遞送至大腦區。遞送預期之大腦範圍包括但不限於運動皮質和腦幹。在一些實施態樣中，多核苷酸係遞送至脊髓。在一些實施態樣中，多核苷酸係遞送至下運動神經元。本發明之實施態樣係使用rAAV9以遞送多核苷酸至神經及膠質細胞。在一些實施態樣中，膠質細胞為微膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞或星形細胞。在一些實施態樣中，使用rAAV9遞送多核苷酸至神經鞘細胞。
用途包括例如治療下運動神經元疾病(諸如SMA和ALS)、以及龐貝氏症(Pompe disease)、溶小體儲積症、多 形神經膠母細胞瘤和帕金森氏症。溶小體儲積症包括但不限於激活蛋白質缺陷/GM2神經節苷脂症、α-甘露糖苷儲積症、天冬胺醯葡萄糖胺尿症(Aspartylglucosaminuria)、膽固醇酯儲積症、慢性己醣胺酶A缺乏症、胱胺酸病、達農氏病(Danon disease)、法布瑞氏症(Fabry disease)、法貝爾症(Farber disease)、岩藻糖血症(Fucosidosis)、半乳糖苷唾液酸儲積症(Galactosialidosis)、高雪氏症(Gaucher Disease)(I型、II型、III型)、GM1神經節苷脂症(嬰兒型、晚期嬰兒型/青少年型、成人型/慢性)、I-細胞疾病/黏脂儲積病II型、嬰兒型游離唾液酸儲積病(Free Sialic Acid Storage Disease)/ISSD、青少年型己醣胺酶A缺乏症、克拉貝氏症(Krabbe disease)(嬰兒發病、晚期發病)、異染性白質失養症、黏液多醣體病(假性哈倫多發性營養不良(Pseudo-Hurler polydystrophy)/黏脂儲積病IIIA、MPSI哈倫症候群、MPSI沙伊(Scheie)症候群、MPS I哈倫-沙伊症候群、MPS II杭特(Hunter)症候群、A型聖菲利柏(Sanfilippo)症候群/MPS III A、B型聖菲利柏症候群/MPS III B、C型聖菲利柏症候群/MPS III C、D型聖菲利柏症候群/MPS III D、莫奎歐氏症(Morquio)A型/MPS WA、莫奎歐症B型/MPS IVB、MPS IX玻尿酸酶缺乏症、MPS VI馬洛托-拉米症(Maroteaux-Lamy)、MPS VII史萊氏(Sly)症候群、黏脂儲積病I型/唾液腺病、黏脂儲積病IIIC型、黏脂儲積病IV型)、多發性硫酸酯酶缺乏症、尼曼-匹克二氏病(Niemann-Pick Disease)(A型、B型、C型)、神經元蠟樣質 脂褐質沉積症(Neuronal Ceroid Lipofuscinoses)(CLN6病(非典型晚期嬰兒、晚期發病變型、早期青少年)、巴-斯-沃(Batten-Spielmeyer-Vogt)三氏/青少年型NCL/CLN3病、芬蘭變異晚期嬰兒型CLN5、詹-比(Jansky-Bielschowsky)二氏病/晚期嬰兒型CLN2/TPP1病、庫夫斯(Kufs)/成人發病型NCL/CLN4病、北方癲癇型/變異晚期嬰兒型CLN8、聖-霍(Santavuori-Haltia)二氏/嬰兒型CLN1/PPT病、β-甘露糖苷儲積症、龐貝氏症/肝醣儲積症II型、緻密成骨不全症、山德霍夫症(Sandhoff Disease)/成人發病型/GM2神經節苷脂症、山德霍夫症/GM2神經節苷脂症-嬰兒型、山德霍夫症/GM2神經節苷脂症-青少年型、辛德勒(Schindler)症、莎拉(Salla)病/唾液酸儲積症、戴薩克斯(Tay-Sachs)症/GM2神經節苷脂症、沃爾曼(Wolman)症。
在更多的實施態樣中，該等方法及物料之用途適應於治療神經系統疾病，諸如瑞特氏症候群、阿茲海默氏症、帕金森氏症、亨廷頓氏症，或治療神經系統損傷，包括脊髓和腦創傷/損傷、中風和腦癌。在一個實施態樣中，該等方法及物料之用途適應於治療脊髓性肌肉萎縮症(SMA)。
有四種類型的SMA，其照慣例以發病年齡及所達成的最高運動功能分類。所有形式的SMA為體染色體隱性遺傳且由運動神經元存活1(SMN1)基因突變所引起。人亦攜帶稱為SMN2之第二套幾乎相同的SMN基因。Lefebvre等人之"Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene." Cell,80(1)：155-65。Monani等人之"Spinal muscular atrophy：a deficiency in a ubiquitous protein；a motor-neuron specific disease." Neuron,48(6)：885-896。SMN1及SMN2基因二者表現SMN蛋白質，然而SMN2含有在外顯子7中的轉譯沉默突變，其導致在SMN2轉錄物中含有無效的外顯子7。因此，SMN2生產全長SMN蛋白質及缺少外顯子7之截短型SMN，以截短型為主要形式。因此，以SMN2生產之功能性全長蛋白質的量比以SMN1生產的量少得多(70至90%)。Lorson等人之"A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy." PNAS,96(11)6307-6311。Monani等人之"A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2." Hum Mol Genet 8(7)：1177-1183。儘管SMN2不可能完全補償SMN1基因的損失，但是患有較輕度形式之SMA的患者通常具有較多的SMN2套數量。Lefebvre等人之"Correlation between severity and SMN protein level in spinal muscular atrophy." Nat Genet 16(3)：265-269。Park等人之"Spinal muscular atrophy：new and emerging insights from model mice." Curr Neurol Neurosci Rep 10(2)：108-117。需要注意的是SMN2套數量不是唯一的表型修飾因子。在SMN2基因之外顯子7中的c.859G>C變異體特別地經報導為陽性疾病修飾因子。具有此特定突變的患者具有較不嚴重的疾病表型。Prior等人之"A positive modified of spinal muscular atrophy in the SMN2 gene." Am J Hum Genet 85(3)：408-413。
當SMA症狀係在出生時或6個月大出現時，則為第I型SMA(亦稱為嬰兒發病型或韋德尼希-霍夫曼症(Werdnig-Hoffmann disease))。在此類型中，嬰兒通常具有低肌肉張力(低張症)、微弱的哭聲及呼吸困難。他們經常難以吞嚥和吸吮，且沒有達到能夠獨自坐起來的發展里程碑。他們經常顯示出選自下列的SMA症狀中之一或多者：低張症、延遲的動作技能、不良頭部控制、圓肩姿勢及關節過度活動。該等嬰兒通常具有兩套SMN2基因，在各5號染色體上一套。超過一半的SMA新病例為第I型SMA。
當SMA係在介於7至18個月之間發病及在兒童可獨立站立或行走前，則為第II型或中級SMA。患有第2型SMA之兒童通常具有至少三種SMN2基因。遲發型SMA(亦稱為第III和IV型SMA、輕度型SMA、成人型SMA及庫格勃-韋蘭德症(Kugelberg-Welander disease))導致不同的虛弱程度。第III型SMA係18個月後發病，且兒童可獨立站立和行走，儘管他們可能需要幫助。第IV型SMA係於成人期發病且人們在彼等成年期間能夠行走。患有第III或IV型SMA的人們通常具有介於四種與八種之間的SMN2基因，可由此生產相當多的全長SMN蛋白質。
在一個實施態樣中，術語「治療」包含對其有需要之動物(包括人類)經靜脈內或經由鞘內途徑投予有效劑量或多次有效劑量的組成物之步驟，該組成物包含本文揭示之 rAAV。若劑量係在疾患/疾病發展前投予，則投予為預防性。若劑量係在疾患/疾病發展後投予，則投予為治療性。在實施態樣中，有效量為緩解(消除或減少)至少一種與欲治療之疾患/疾病狀態相關聯的症狀、減慢或防止進展成疾患/疾病狀態、減慢或防止疾患/疾病狀態進展、減弱疾病的程度、導致疾病緩和(部分或全部)及/或延長存活期之劑量。預期治療之疾病狀態的實例於本文中列出。
在一個實施態樣中，包含本發明之rAAV的組成物係經靜脈內投予患有第I型SMA的其有需要之患者。在另一實施態樣中，包含本發明之rAAV的組成物係經鞘內投予患有第II、III或IV型SMA的其有需要之患者。
藉由經鞘內或靜脈內途徑投予AAV9病毒載體以治療其有需要之患者中的第I型SMA之方法係於本文揭示。在一些實施態樣中，患者為0至9個月大。在一些其他的實施態樣中，患者為0至6個月大。在一些實施態樣中，在使用病毒載體治療第I型SMA患者的情況下，測定患者之體重。在一些實施態樣中，患者具有少於8.5kg之體重。在一些實施態樣中，患者具有超過2.6kg之體重。在一些實施態樣中，患者具有2.6至8.5kg之體重。
在一些實施態樣中，患者在一套SMN1基因中有突變，例如無效突變(包含使得經編碼之SMN1無功能的任何突變)。在一些實施態樣中，患者在兩套SMN1基因中有突變，例如無效突變。在一些實施態樣中，患者在全套SMN1基因中有突變，例如無效突變。在一些實施態樣 中，患者在一套SMN1基因中有缺失。在一些實施態樣中，患者在兩套SMN1基因中有缺失。在一些實施態樣中，患者具有雙對偶基因SMN1突變，亦即在染色體的兩個對偶基因中的SMN1缺失或取代。在一些實施態樣中，患者具有至少一套功能性SMN2基因。在一些實施態樣中，患者具有至少兩套功能性SMN2基因。在一些實施態樣中，患者具有至少兩套功能性SMN2基因。在一些實施態樣中，患者具有至少三套功能性SMN2基因。在一些實施態樣中，患者具有至少四套功能性SMN2基因。在一些實施態樣中，患者具有至少五套功能性SMN2基因。在一些實施態樣中，患者在至少一套SMN2基因之外顯子7中不具有c.859G>C取代。在一些實施態樣中，SMN1或SMN2基因之基因序列可以全基因組定序測定。在其他的實施態樣中，SMN1或SMN2基因之基因序列及套數量可以高通量定序測定。在一些實施態樣中，SMN1或SMN2基因之基因序列及套數量可以微陣列分析測定。在一些實施態樣中，SMN1或SMN2基因之基因序列及套數量可以桑格(Sanger)定序測定。在一些實施態樣中，SMN1或SMN2基因之套數量可以螢光原位雜交法(FISH)測定。
在一些實施態樣中，患者顯示一或多種SMA症狀。SMA症狀可包括低張症、延遲的動作技能、不良頭部控制、圓肩姿勢及關節過度活動。在一些實施態樣中，不良頭部控制係令患者置於環坐位置而於肩部(前部及後部)給予幫助下測定。頭部控制係由患者保持頭部直立的能力來 評定。在一些實施態樣中，當患者處於仰臥位置時觀察自發性移動，且動作技能係由患者將其肘部、膝蓋、手和腳抬離表面的能力來評定。在一些實施態樣中，患者的握力係藉由令手指放在患者的手掌中且抬起患者直到其肩部離開表面來測量。低張症及握力係藉由患者維持多快/多久的抓握來測量。在一些實施態樣中，頭部控制係藉由令患者的頭部置於最大可能的旋轉處且測量患者頭部向中線轉回的能力來評定。在一些實施態樣中，肩部姿勢可藉由令患者以頭部和軀干支撐下坐著且觀察患者是否屈曲肘部或肩部以伸手到放置在臂長處的肩部水平之刺激物來評定。在一些實施態樣中，肩部姿勢亦可以藉由令患者置於側臥位置且觀察患者是否屈曲肘部或肩部以伸手到放置在臂長處的肩部水平之刺激物來評定。在一些實施態樣中，動作技能係藉由觀察患者在腳被撫摸、搔癢或擰時是否屈曲其臀部或膝蓋來評定。在一些實施態樣中，肩關節屈曲、肘關節屈曲、髖關節內收、頸屈曲、頭伸出、頸伸出及/或脊柱彎曲可藉由已知的臨床量度來評定，例如CHOP INTEND。其他的SMA症狀可根據已知的臨床量度來評估，例如CHOP INTEND。
在一些實施態樣中，患者係在彼等顯示出如使用本文所述之試驗中之一所測定的第I型SMA症狀(例如一或多種症狀)後治療。在一些實施態樣中，患者係在彼等顯示出第I型SMA症狀前治療。在一些實施態樣中，患者係在出現症狀前基於基因測試而診斷出患有第I型SMA。
本文亦預期的是組合療法。如本文所使用之組合包括同時治療或相繼治療。方法之組合可包括加入特定的標準醫學治療(例如在ALS中的利魯唑(riluzole))，以及與新穎療法之組合。例如，用於SMA之其他療法包括反義寡核苷酸(ASO)，其改變與前mRNA之結合及改變彼等之剪接樣式。Singh.等人之"A multi-exon-skipping detection assay reveals surprising diversity of splice isoforms of spinal muscular atrophy genes." Plos One,7(11)：e49595。在一個實施態樣中，可使用紐辛那森(nusinersen)(美國專利8,361,977和US 8,980,853，併入本文以供參考)。紐辛那森為靶向SMN2前mRNA之內含子6、外顯子7或內含子7的經批准之ASO，調節SMN2之剪接以更有效地生產全長SMN蛋白質。在一些實施態樣中，包含AAV9病毒載體之治療方法係與肌肉增強劑組合投予。在一些實施態樣中，包含AAV9病毒載體之治療方法係與神經保護劑組合投予。在一些實施態樣中，包含AAV9病毒載體之治療方法係與靶向SMN之基於反義寡核苷酸的藥物組合投予。在一些實施態樣中，包含AAV9病毒載體之治療方法係與紐辛那森組合投予。在一些實施態樣中，包含AAV9病毒載體之治療方法係與抑制肌肉生長抑制素之藥物組合投予。在一些實施態樣中，包含AAV9病毒載體之治療方法係與司他蘆單抗(stamulumab)組合投予。
雖然預期在出生後遞送至其有需要之個體，但是亦預期經胎內遞送至胎兒。
預期的是使用包含病毒載體之醫藥組成物治療第I型SMA患者之方法。在一些實施態樣中，病毒載體係以約1至8×1013 AAV9病毒載體基因組/mL(vg/mL)之濃度調配。在一些實施態樣中，病毒載體係以約1.7至2.3×1013vg/mL之濃度調配。在一些實施態樣中，病毒載體係以約1.9至2.1×1013vg/mL之濃度調配。在一些實施態樣中，病毒載體係以約2.0×1013vg/mL之濃度調配。
在一些實施態樣中，在使用病毒載體治療第I型SMA患者的情況下，AAV病毒載體(例如AAV SMN)係以約1.0至2.5×1014vg/kg之劑量投予患者。在一些實施態樣中，在使用病毒載體治療第I型SMA患者的情況下，AAV病毒載體係以約1.1×1014vg/kg之劑量投予患者。在一些實施態樣中，在使用病毒載體治療第I型SMA患者的情況下，AAV病毒載體係經約45至70分鐘輸注至患者中。在一些實施態樣中，在使用病毒載體治療第I型SMA患者的情況下，AAV病毒載體係經約60分鐘輸注至患者中。在一些實施態樣中，在使用病毒載體治療第I型SMA患者的情況下，AAV病毒載體係使用輸注泵、蠕動泵或此項技術中已知的任何其他設備輸注至患者中。在一些實施態樣中，在使用病毒載體治療第I型SMA患者的情況下，AAV病毒載體係使用注射泵輸注至患者中。
欲投予之rAAV病毒載體效價係取決於例如特定的rAAV、投予模式、治療目標、個體及靶向之細胞類型而改變，且可以此項技術中的方法標準測定。rAAV效價可 在每ml計約1×106、約1×107、約1×108、約1×109、約1×1010、約1×1011、約1×1012、約1×1013、約1×1014、或更多的DNase抗性粒子(DRP)之範圍內。劑量亦可以載體基因組(vg)的單位表示。基因組效價可使用如本申請案、Lock等人或此項技術中已知的任何其他方法所述之ddPCR測定。
劑量亦可取決於投予人的時間而改變。rAAV的該等劑量可在每公斤成人之體重計約1×1011vg/kg、約1×1012vg/kg、約1×1013vg/kg、約1×1014vg/kg、約1×1015vg/kg、約1×1016vg/kg、或更多的載體基因組之範圍內。用於新生兒之rAAV的劑量可在每公斤之體重計約1×1011vg/kg、約1×1012vg/kg、約3×1012vg/kg、約1×1013vg/kg、約3×1013vg/kg、約1×1014vg/kg、約3×1014vg/kg、約1×1015vg/kg、約3×1015vg/kg、約1×1016vg/kg、約3×1016vg/kg、或更多的載體基因組之範圍內。
劑量亦可取決於投予人的時間而改變。rAAV的該等劑量可在每公斤成人之體重計約1×1011vg/kg/週、約1×1012vg/kg/週、約1×1013vg/kg/週、約1×1014vg/kg/週、約1×1015vg/kg/週、約1×1016vg/kg/週、或更多的載體基因組之範圍內。用於新生兒之rAAV的劑量可在每週以每公斤之體重計約1×1011vg/kg/週、約1×1012vg/kg/週、約3×1012vg/kg/週、約1×1013vg/kg/週、約3×1013vg/kg/週、約1×1014vg/kg/週、約3×1014vg/kg/週、約1×1015vg/kg/週、約3×1015vg/kg/週、約1×1016vg/kg/週、約3×1016vg/kg/週、或 更多的載體基因組之範圍內。以每公斤成人之體重計1×1011vg/1.5kg/週、約1×1012vg/1.5kg/週、約1×1013vg/1.5kg/週、約1×1014vg/1.5kg/週、約1×1015vg/1.5kg/週、約1×1016vg/1.5kg/週、或更多的載體基因組之rAAV的劑量。用於新生兒之rAAV的劑量可在每週以每1.5公斤之體重計約1×1011vg/1.5kg/週、約1×1012vg/1.5kg/週、約3×1012vg/kg/週、約1×1013vg/1.5kg/週、約3×1013vg/1.5kg/週、約1×1014vg/1.5kg/週、約3×1014vg/1.5kg/週、約1×1015vg/1.5kg/週、約3×1015vg/1.5kg/週、約1×1016vg/1.5kg/週、約3×1016vg/1.5kg/週、或更多的載體基因組之範圍內。
在一實施態樣中，劑量為每公斤患者之體重計約1.1×1014載體基因組(vg/kg)。在一實施態樣中，5kg患者可接受介於0.5×1014至5.0×1014載體基因組之間的總劑量。在一實施態樣中，病毒載體係於Tris緩衝之食鹽水中投予。在一實施態樣中，病毒載體係於約5至20mL/kg、約10至20mL/kg、或約5.5至6.5mL/kg的Tris緩衝之食鹽水中投予。
劑量可以許多標準方式測定。以對病毒載體具有特異性的引子之PCR可提供相對量度，但是可以qPCR用於更小的樣品及絕對量度。ddPCR為以水-油乳液滴技術為基礎進行數位式PCR之方法。Baker等人之"Digital PCR hits its stride." Nature Methods,9(6)：541-544。Sykes等人之"Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution." Biotechniques,13(3)444-449。令樣品分成數以萬計的液 滴，且模板分子的PCR擴增係發生在各單獨的液滴中。不需要製作標準曲線或具有高擴增效率的引物，因此ddPCR通常不使用與傳統的基於PCR之技術一樣多的樣品。市場上取得的ddPCR機器的實例包括但不限於BioRad QX100 ddPCR及RainDance Raindrop Digital PCR。在一個實施態樣中，劑量係使用PCR測定。在另一實施態樣中，劑量係使用qPCR測定。在另一實施態樣中，劑量係使用數位式液滴PCR(ddPCR)測定。在一些實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向SMN基因之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向雞β-肌動蛋白啟動子之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向CMV增強子之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向ITR序列之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。在其他的實施態樣中，基於PCR之方法係使用經特異性設計以靶向牛生長激素多腺苷酸化訊號之引子及探針檢測及定量包殼化AAV9病毒基因組。
在一個態樣中，劑量係根據下表投予，使用2.0×1013vg/ml作為藥物產物之靶濃度。
Figure 107138852-A0305-02-0097-19
在一些實施態樣中，包含AAV病毒載體之醫藥組成物係經約20至70分鐘輸注至患者中，例如經約45至70分鐘。在一些實施態樣中，包含AAV病毒載體之醫藥組成物係經約60分鐘輸注至患者中。在一些實施態樣中，包含AAV病毒載體之醫藥組成物係使用輸注泵、蠕動泵或此項技術中已知的任何其他設備輸注至患者中。在一些實施態樣中，包含AAV病毒載體之醫藥組成物係使用注射泵輸注至患者中。
亦預期的是順從於治療的患者預篩選，以及根據本文揭示之標準鑑定對患者的治療投予。AAV可引起細胞及體液性免疫反應二者。因此，基於AAV之基因療法的一部分潛在患者藏匿預存在對抗AAV之抗體。Jeune等人之"Pre-existing anti-Adeno-Associated Virus antibodies as a challenge in AAV gene therapy." Hum Gene Ther Methods,24(2)：59-67。Boutin等人之"Prevalence of serum IgG and neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,5,6,8,and 9 in the healthy population：implications for gene therapy using AAV vectors." Hum Gene Ther,21：704-712。因為即使非常低含量的抗體亦可阻止成功的轉導，所以先成的抗AAV抗體對AAV基因療法之完整應用性具有嚴重的障礙。在一些實施態樣中，在患者中的抗AAV9抗體效價水平係在投予AAV病毒載體前測定。在一些實施態樣中，在患者中的抗AAV9抗體效價水平係以ELISA結合免疫檢定法測定。在一些實施態樣中，患者在投予治療前具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之在或低於1：100之抗AAV9抗體效價。在一些實施態樣中，患者在投予治療前具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之1：50或低於1：50之抗AAV9抗體效價。在一些實施態樣中，患者在治療後具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之高於1：100之抗AAV9抗體效價，且監測1至8週或直到效價降低至低於1：100。在一些實施態樣中，患者在治療後具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之高於1：100之抗AAV9抗體效價，且監測1至8週或直到效價降低至低於1：50。
一種克服高的抗AAV抗體效價之方法係使用免疫抑制藥物。與環孢素(cyclosporine)A組合之單株抗CD20抗體利妥昔單抗(rituximab)已顯示出有效降低抗AAV效價。Mingozzi等人之"Pharmacological modulation of humoral immunity in a nonhuman primate model of AAV gene transfer for hemophilia B." Mol Ther,20：1410-1416。另一方法係 在載體投予前使用血漿清除術以耗盡中和抗體。Monteilhet等人之"A 10 patient case report on the impact of plasmapheresis upon neutralizing factors against adeno-associated virus(AAV)types 1,2,6,and 8." Mol Ther,19(11)：2084-2091。在血漿清除術期間，自患者抽出血液，且血漿及血細胞係藉由離心或中空纖維過濾而單離。接著令血細胞與經處理之血漿或替代流體(諸如在食鹽水中的4.5%之人類白蛋白)一起返回患者。治療性血球分離術之常見用途係移出非所欲之免疫球蛋白，但在此情況下，血漿清除術代表用於耗盡抗AAV抗體的有吸引力之方法。在一些實施態樣中，患者在治療前或後具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之高於1：100之抗AAV9抗體效價，且以血漿清除術處理。在一些實施態樣中，患者在治療前或後具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之高於1：50之抗AAV9抗體效價，且以血漿清除術處理。
預存在對AAV9之母體抗體可通過母乳或子宮中的胎盤轉移而轉移至嬰兒患者。在一些實施態樣中，患者在治療前或後具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之高於1：100之抗AAV9抗體效價且轉換成配方餵哺(formula feeding)。在一些實施態樣中，患者在治療前或後具有如以ELISA結合免疫檢定法所測定之高於1：50之抗AAV9抗體效價且轉換成配方餵哺。
可在治療投予前及後監測患者的症狀。一些接受基於AAV之治療的患者經歷血小板減少症，其以低的血小板計 數為特徵的症狀。血小板減少症可使用稀釋的血液樣品在血細胞計數器上以全血計數檢測。血小板減少症亦可藉由在顯微鏡下觀察以患者的血液製備之載玻片(血液薄膜或周邊血液抹片)來檢測。正常的人類血小板計數係在150,000個細胞/ml至約450,000個細胞/ml之範圍內。
在一些實施態樣中，患者在投予前具有高於約67,000個細胞/ml、或高於約100,000個細胞/ml、或高於約150,000個細胞/ml之血小板計數。在一些實施態樣中，患者在投予前具有少於約150,000個細胞/ml、或少於約100,000個細胞/ml、或少於約67,000個細胞/ml之血小板計數，且監測1至8週或直到血小板計數增加至高於約67,000個細胞/ml、或高於約100,000個細胞/ml、或高於約150,000個細胞/ml。在一些實施態樣中，在投予病毒載體後血小板計數少於約67,000個細胞/ml的情況下，患者可以血小板輸注治療。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前沒有血小板減少症。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體後具有血小板減少症，且監測約1至8週或直到患者沒有血小板減少症。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體後具有血小板減少症且以血小板輸注治療。
監測患者的狀況亦可包含標準的血液試驗，其測量血小板、血清蛋白質電泳、血清γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)、天冬胺酸轉胺酶(AST)和丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、總膽紅素、葡萄糖、肌酸激酶(CK)、肌酸酐、血尿素氮(BUN)、電解質、鹼性磷酸酶及澱粉酶含量。肌鈣蛋白質I含量為 心臟健康的一般量度，且升高的含量反映心臟損傷或心臟相關症狀。在一些實施態樣中，在投予病毒載體後監測肌鈣蛋白質-I含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前可能具有低於約0.3、0.2、0.15、或0.1μg/ml之肌鈣蛋白質-I含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前可能具有低於約0.176μg/ml之肌鈣蛋白質-I含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體後可能具有高於約0.176μg/ml之肌鈣蛋白質-I含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體後接受心臟監測，直到肌鈣蛋白質-I含量低於約0.176μg/ml。
天冬胺酸轉胺酶(AST)和丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及總膽紅素為肝功能的一般量度，而肌酸酐追蹤腎功能。升高的AST、ALT或總膽紅素含量可能表示肝功能不全。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前具有正常的肝功能。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前具有低於約8至40U/L之肝轉胺酶含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前具有低於約8至40U/L之AST或ALT含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前具有低於3.0mg/dL之膽紅素含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前具有低於1.8mg/dL之肌酸酐含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前具有介於8至18g/dL之血紅素(Hgb)含量。在一些實施態樣中，患者在投予病毒載體前具有每mm3計少於20000個白細胞計數(WBC)。
治療方法的功效可在治療前及後使用各種用於動作技 能的試驗測定。特別開發費城兒童醫院神經肌肉疾患嬰兒測試(Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders)(CHOP INTEND)以評估第I型SMA患者之運動技能。Glanzman等人之"The Children's Hospital of Philadelphia Infant Test of Neuromuscular Disorders(CHOP INTEND)：Test development and reliability." Neuromuscular Disorders,20(3)：155-161。CHOP INTEND試驗係以新設計用於SMA的運動評定之嬰兒運動性能測試(Test of Infant Motor Performance)(TIMP)及費城兒童醫院之SMA強度試驗(Children's Hospital of Philadelphia Test of Strength in SMA)(CHOP TOSS)評估26位平均年齡11.5個月(1.4至37.9個月)的第I型SMA嬰兒後開發。治療功效的測試不限於CHOP INTEND試驗，但亦可包括此項技術中已知的其他動作技能試驗，包括但不限於TIMP、CHOP TOSS、皮巴迪運動發展量表(Peabody Development Motor Scale)、布列茲頓新生兒行為評定試驗(Brazelton Neonatal Behavior Assessment test)、動作里程碑發展調查(Motor Milestone Development Survey)、通過互動視頻評估補獲之能力(Ability Captured Through Interactive Video Evaluation)(ACTIVE)、貝莉嬰兒發展量表(Bayley Scale of Infant Development)及運動之複合動作電位測量(measurements of compound motor action potentials)(CMAP)。
在一些實施態樣中，在治療前的基線測試係使用 CHOP INTEND量表進行。在一個實施態樣中，治療功效係在追蹤訪視期間使用CHOP INTEND量表測定。在一些實施態樣中，CHOP INTEND包括頭部控制、扶正反應、以支撐就坐、仰臥和俯臥位置的軀幹移動之測量。在一些實施態樣中，CHOP INTEND包括以輔助滾動、腹部懸抱和支撐站立的反重力移動之測量。
在涉及AAV載體的許多基因療法研究中，已觀察到對AAV載體之抗原特異性T細胞反應，且可預期在基因轉移後2至4週之間。此抗原特異性T細胞反應的一個可能結果為清除經轉導之細胞及喪失轉基因表現。為了抑制宿主對基於AAV療法的免疫反應，可給予患者免疫抑制藥物。在一些實施態樣中，患者可在投予病毒載體前給予糖皮質素。在一些實施態樣中，患者可在投予病毒載體前給予皮質類固醇。在一些實施態樣中，患者可在投予病毒載體前給予口服類固醇。口服類固醇的實例包括但不限於普賴鬆、普賴蘇濃、甲基普賴蘇濃、特安皮質醇(triamcinolone)、倍他米松(bethamethasone)、地塞米松和氫皮質酮。在一些實施態樣中，口服類固醇為或包含普賴蘇濃。在一些實施態樣中，患者係在投予病毒載體前至少24小時開始預防性類固醇。在一些實施態樣中，患者係在投予病毒載體後至少30天給予口服類固醇。在一些實施態樣中，口服類固醇係每天投予一次。在一些實施態樣中，口服類固醇係每天投予兩次。在一些實施態樣中，口服類固醇係以約0.1至10mg/kg之劑量給予，例如約1mg/kg。 在一些實施態樣中，口服類固醇係以約0.1至10mg/kg/天之劑量給予，例如約1mg/kg/天。在一些實施態樣中，AST及ALT含量係在投予病毒載體後監測。在此等實施態樣中，當AST及ALT含量以例如此項技術中已知的臨床標準及方法測定而超過正常上限的兩倍或超過約120IU/L時，則投予口服類固醇治療。在一些實施態樣中，口服類固醇治療係投予超過30天，只要AST及ALT含量以例如此項技術中已知的臨床標準及方法測定而超過正常上限的兩倍或超過約120IU/L時。在以皮質類固醇持續治療期間，腎上腺自然地減少皮質醇的生產。若突然終止皮質類固醇治療，則身體可能經歷皮質醇缺乏症。在一些實施態樣中，在給予患者至少30天口服類固醇的情況下，類固醇劑量係按時間表逐漸遞減。在一些實施態樣中，當AST及ALT含量下降至以例如此項技術中已知的臨床標準及方法測定而低於正常上限的兩倍或低於約120IU/L時，則逐漸遞減口服類固醇劑量。在一些實施態樣中，遞減包含逐步減量至0.5mg/kg/天經2週，繼而以0.25mg/kg/天再經2週。在一些其他的實施態樣中，口服類固醇的遞減係由醫師斟酌進行。
套組
本發明亦提供治療其有需要之患者中的SMA之套組，其中套組包含一或多個劑量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含有效量或劑量的病毒載體，其包含本文揭示之SMN多 核苷酸且取決於SMA類型而定(如本文進一步的揭示)。套組另包含對比劑(例如安你拍克180)及如何使用醫藥製劑或組成物及對比劑之用法說明。
在一些實施態樣中，套組含有病毒載體醫藥組成物之小瓶。在一些實施態樣中，病毒載體醫藥組成物係以約1.7至2.3×1013vg/mL之濃度。在一些實施態樣中，病毒載體醫藥組成物係以約1.9至2.1×1013vg/mL之濃度。在一些實施態樣中，病毒載體醫藥組成物係以約2.0×1013vg/mL之濃度。在一些實施態樣中，小瓶含有約5.9mL病毒載體醫藥組成物。在一些實施態樣中，小瓶含有約8.7mL病毒載體醫藥組成物。在一些實施態樣中，套組不含有5.9mL小瓶，含有至少一個5.9mL小瓶、至少兩個5.9mL小瓶、或至少三個5.9mL小瓶。在一些實施態樣中，套組不含有8.7mL小瓶，含有至少一個8.7mL小瓶、至少兩個8.7mL小瓶、至少三個8.7mL小瓶、至少四個8.7mL小瓶、至少五個8.7mL小瓶、至少六個8.7mL小瓶。
在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，測定患者之體重。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，患者之體重為至少約2.6kg。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，患者之體重不超過約8.5kg。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，患者之體重為約2.6至8.5kg。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，來自 套組中的小瓶之AAV病毒載體投予患者。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，來自套組中的小瓶之AAV病毒載體係以約1.0至2.5×1014vg/kg之劑量投予患者。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，來自套組中的小瓶之AAV病毒載體係以約1.1×1014vg/kg之劑量投予患者。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，來自套組中的小瓶之AAV病毒載體係經約45至70min輸注至患者中。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，來自套組中的小瓶之AAV病毒載體係經約60min輸注至患者中。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，來自套組中的小瓶之AAV病毒載體係使用輸注泵、蠕動泵或此項技術中已知的任何其他設備輸注至患者中。在一些實施態樣中，在使用套組治療患者中的第I型SMA的情況下，來自套組中的小瓶之AAV病毒載體係使用注射泵輸注至患者中。
在一個實施態樣中，載體係經靜脈內或鞘內投予。在一個實施態樣中，載體係經靜脈內投予。在一個實施態樣中，載體係與安你拍克180一起經靜脈內投予。在另一實施態樣中，載體係與安你拍克180一起經鞘內投予。
在另一態樣中，本文預期的是以rAAV轉導患者的靶細胞(包括但不限於神經或膠質細胞)之方法。
以本文揭示之rAAV轉導患者的細胞可導致以rAAV編碼之多肽或RNA的持續表現。本發明因此提供對動物或人 患者投予/遞送rAAV(例如編碼SMN蛋白質)之方法。該等方法包括以一或多種rAAV轉導神經及/或膠質細胞。轉導可以包含組織特異性控制元件之基因卡匣進行。例如，容許啟動子特異性地表現在神經元內或特異性地表現在星形細胞內。實例包括神經元特異性烯醇酶及膠質原纖維酸性蛋白質啟動子。亦可開發在攝入之藥物控制下可誘發的啟動子。
在一些態樣中，當本發明之載體與如本文所述之對比劑組合使用時，則預期的是細胞的轉導與本發明之載體不與對比劑組合使用時的轉導相比而增加。在各種實施態樣中，當本發明之載體與如本文所述之對比劑組合使用時，則細胞的轉導與本發明之載體不與對比劑組合時的轉導相比而增加至少約1%，或至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約120%、至少約150%、至少約180%、至少約200%、至少約250%、至少約300%、至少約350%、至少約400%、至少約450%、至少約500%或更多。在更多的實施態樣中，當本發明之載體與如本文所述之對比劑組合使用時，則細胞的轉導與本發明之載體不與對比劑組合時的轉導相比而增加約10%至約50%、或約10%至約100%、或約5%至約10%、或約5%至約50%、或約1%至約500%、或約10%至約200%、或約10%至約300%、或約10%至約400%、或約100%至約500%、或約150%至約300%、或約200%至 約500%。
本發明亦提供其中經鞘內對其有需要的患者之中樞神經系統投予本發明之載體及對比劑與投予本發明之載體而沒有對比劑存在時的患者之存活期相比而導致患者之存活期增加的態樣。在各種實施態樣中，本發明之載體及對比劑係經鞘內分開投予其有需要的患者之中樞神經系統。在其他的實施態樣中，載體及對比劑經共同調配且經鞘內投予中樞神經系統或其有需要的患者。在其他的實施態樣中，載體及對比劑係提供在相同的包裝中，經鞘內投予中樞神經系統或其有需要的患者。在各種實施態樣中，對其有需要的患者之中樞神經系統投予本發明之載體及對比劑與投予本發明之載體而沒有對比劑存在時的患者之存活期相比而導致患者的存活期增加至少約1%、至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約150%、至少約200%或更多。
在一些態樣中，當本發明之載體與對比劑組合使用時及當患者處於特倫德倫堡位置(低頭位置)時，則預期的是進一步增加細胞的轉導。在一些實施態樣中，例如患者在鞘內載體輸注期間或後以低頭位置傾斜約1度至約30度、約15至約30度、約30至約60度、約60至約90度、或約90至最多約180度)。在各種實施態樣中，當本發明之載體與如本文所述之對比劑及特倫德倫堡位置組合使用時，則細胞的轉導與本發明之載體不與對比劑及特倫德倫堡位置組合 時的轉導相比而增加至少約1%，或至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、至少約120%、至少約150%、至少約180%、至少約200%、至少約250%、至少約300%、至少約350%、至少約400%、至少約450%、至少約500%或更多。在更多的實施態樣中，當本發明之載體與如本文所述之對比劑及特倫德倫堡位置組合使用時，則細胞的轉導與本發明之載體不與對比劑及特倫德倫堡位置組合時的轉導相比而增加約10%至約50%、或約10%至約100%、或約5%至約10%、或約5%至約50%、或約1%至約500%、或約10%至約200%、或約10%至約300%、或約10%至約400%、或約100%至約500%、或約150%至約300%、或約200%至約500%。
本發明亦提供其中經鞘內對其有需要之處於特倫德倫堡位置的患者之中樞神經系統投予本發明之載體及對比劑與投予本發明之載體而沒有對比劑及特倫德倫堡位置存在時之患者的存活期相比而導致患者的存活期進一步增加之態樣。在各種實施態樣中，對其有需要之處於特倫德倫堡位置的患者之中樞神經系統投予本發明之載體及對比劑與投予本發明之載體而沒有對比劑及特倫德倫堡位置存在時之患者的存活期相比而導致患者的存活期增加至少約1%、至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少 約80%、至少約90%、至少約100%、至少約150%、至少約200%或更多。
如本發明及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「a」、「an」及「the」包括複數個指示物，除非上下文另有明確的指定。視需要的或視需要地意指隨後說明的事件或情況可發生或可不發生，且該說明包括其中事件或情況發生的實例及其中事件或情況不發生的實例。例如，組成物可視需要地包含組合之短語意指組成物可能包含不同分子的組合或可能不包括組合，使得該說明包括組合及沒有組合存在(亦即個別的組合成員)二者。範圍在本文可表示為自約一個特定值及/或至約另一個特定值。當表示此一範圍時，則另一態樣包括自一個特定值及/或至其他的特定值。同樣地，當值係使用先行詞約來表示近似值時，則應理解特定值構成另一態樣。應進一步理解與其他的端點有關及獨立於其他端點每個範圍的端點皆具有意義。
本發明係由不應解釋為限制的下列實施例進一步例證。在整篇本申請案中所引用之所有參考文獻、專利及公開的專利申請之內容以及附圖係出於所有目的而以彼等全文併入本文以供參考。
實施例
下列的實施例被認為是說明性且不限制上述本發明之範圍。
實施例1-GMP前(Pre-GMP)之種源細胞庫的產生 方法
解凍：令單細胞小瓶(1×106個細胞)在37℃水浴中經約1分鐘解凍，且令內容物在5mL預熱的完全生長培養基中稀釋。令細胞轉移至T-25cm2燒瓶中且在37℃培育箱中生長4天，每天以預熱的完全生長培養基替換培養基。
增加之附著性的選擇：令細胞使用下列的技術培養以選擇強附著型細胞。一旦細胞在25cm2燒瓶中達到95%之匯合率，則令細胞繼代培養。令細胞以5mL PBS清洗，接著在室溫下以0.5至1mL之HyQTase經約2分鐘解離。解離係藉由添加5mL完全生長培養基且重複移液以解離細胞團而終止。接著令細胞懸浮液以200×g離心4分鐘。丟棄上清液且令細胞沉澱物再懸浮於10mL完全生長培養基中。令細胞轉移至75cm2燒瓶中。在37℃培育器中培育4小時後，以抽吸細胞培養基清洗弱附著型細胞以移出弱附著型及未附著型細胞。令培養基以10mL預熱的完全生長培養基替換。以目視檢查，此過程使細胞質量減少高達細胞數量的35%。在再次繼代培養前，令細胞再培育2天。由接種後4小時更換培養基所組成的此選擇過程係在所選擇之細胞族群擴增前進行三次(圖2和圖3)。在最後的選擇步驟中，令細胞接種在2×175cm2燒瓶中，具有25mL最終體積。應注意在最後的接種後4小時培養基更換後，細胞損失減少。
細胞擴增：一旦細胞匯合在2×175cm2燒瓶中，則細 胞隨後擴增。令細胞以15mL PBS清洗，接著以3mL HyQTase解離且在室溫下培育~2分鐘。以添加10mL完全生長培養基終止解離。一旦抽吸上清液，接著離心細胞懸浮液，以得到2種細胞沉澱物。令各沉澱物再懸浮於8mL完全生長培養基中且令2mL此濃縮之細胞懸浮液添加至8×175cm2燒瓶中。以添加20mL完全生長培養基準備此燒瓶，得到總共22mL細胞懸浮液及1：4之分開比。下一擴增步驟係使用具有下列變化之相同程序：令4×175cm2燒瓶以1：2之分開比擴增及令4×175cm2燒瓶以1：3之分開比擴增。這得到總共20×175cm2燒瓶。
收穫：自20×175cm2燒瓶收穫細胞。令細胞以15mL PBS清洗，接著以3mL HyQTase解離，如先前所述。以添加10mL完全生長培養基終止細胞解離且收集至50mL試管中，有以來自4×175cm2燒瓶之細胞懸浮液添加至1×50mL試管中。這得到分別具有40mL細胞懸浮液的5×50mL試管。令試管離心以產生細胞沉澱物，抽吸上清液且令細胞以10mL完全生長培養基再懸浮，得到50mL細胞懸浮液。
令體積分至2×50mL試管中，各試管中總共25mL細胞懸浮液。使用1：2稀釋之樣品計算每一試管細胞的活細胞計數，該計算係使用血球計及甲苯胺(Toludine)藍(錐蟲藍)。試管1樣品具有1.99×106細胞/mL之活細胞計數，得到3.98×106細胞/mL之細胞濃度，及試管2樣品具有2.4×106細胞/mL之活細胞計數(總共1×108細胞)，得到4.8×106細胞/mL之細胞濃度(總共1.2×108細胞)。因此，收穫總共2.2×108 細胞。令兩個試管再離心(6分鐘，200×g)且令沉澱物分別再懸浮於10mL(試管1)及12mL(試管2)冷凍培養基中，以調整細胞濃度至1×107細胞/mL。積聚兩細胞懸浮液且令1mL等分量(各含有1×107細胞)填充在22個滅菌冷凍小瓶中(表3)。
Figure 107138852-A0305-02-0113-20
接著令填充之小瓶轉移至-80℃冰凍器中具有新鮮異丙醇之冷凍室中隔夜，以控制的速率冷凍。接著令冷凍之小瓶轉移至液態氮罐中的蒸氣相液態氮中。令10個小瓶轉移至乾冰上存放於GMP設施中。
令來自ATCC的HEK293細胞解凍且成功地適應在擴增及成功的存放於種子庫前在3次傳代中增加的附著性。測試種子庫之外來病原(黴漿菌、真菌和細菌)的生長及存在。測試顯示種子庫適合於GMP設施中的種源細胞庫。
實施例2-上游方法
使用上游方法(參見例如圖4)生產源自工作細胞庫之中間物，其中上游方法包含步驟(a)培養附著型細胞，(b)令培養之細胞以如圖1所示之三種質體(例如包含本文所述之AAV SMN)轉染而能夠生產AAV病毒載體，(c)令附著型細胞溶解以單離AAV病毒載體，(d)令病毒粒子經由過濾 法純化以移出任何完整細胞或細胞碎屑，及(e)令(d)之純化產品經受切向流過濾法，及(f)令純化之病毒粒子的所得中間製劑冷凍。在替代的實施態樣中，以本文揭示之上游方法製備之AAV編碼靶向SOD1或MECP2之shRNA，如本文所揭示。
(a)培養附著型細胞
令HEK293細胞解凍且使用CO2培育器在可棄式燒瓶中通過七次傳代而擴增。令解凍之細胞以細胞擴增生長培養基清洗，離心且以新鮮細胞擴增生長培養基再懸浮。令再懸浮之細胞接種至含有細胞擴增生長培養基之燒瓶中且培育。
當細胞匯合時，令彼等以DPBS清洗且以TrypLE Select酵素溶液自燒瓶移出。添加細胞擴增生長培養基以中和酵素溶液，且令懸浮之細胞分開及再接種至含有細胞擴增生長培養基的新燒瓶中。重複7次此擴增過程。在最後一次迭代時，經懸浮之細胞不再接種至燒瓶中，而是令細胞漿液接種在生物反應器中以進一步擴增。
在接種前，準備用於接種的iCELLis 500/200m2或iCELLis 500/333m2附著型細胞生物反應器。準備活動包括拆開可棄式生物反應器、物理檢查、洩漏測試、管道組件連接及探針平衡。裝入細胞擴增生長培養基以平衡生物反應器。一旦驗證pH(pH 6.9至7.5)、溫度(35℃至39℃)及溶解氧(40至125%)係在指定的範圍內，則令生物反應器以 4800至7000細胞/cm2(用於200m2反應器)或5000至12000細胞/cm2(用於333m2反應器)之接種靶密度接種。令來自先前步驟之細胞漿液添加至再循環培養基袋的培養基中且通過生物反應器循環。
(b)轉染附著型細胞
在自生物反應器接種起第4、5或6天，令附著型HEK293細胞以三重DNA質體PEI共沉澱而轉染。用於此轉染的3種質體為pSMN、pAAV2/9及pHELP。令用於細胞擴增之DMEM生長培養基自生物反應器移出且以轉染培養基替換。scAAV9.CB.SMN載體係在大規模的附著型細胞生物反應器中使用三重DNA質體轉染至附著型人胚胎腎(HEK293)細胞中而生產，該轉染係使用聚乙烯亞胺(「PEI」)共沉澱。載體質體pSMN含有用於人運動神經元存活蛋白質(SMN)之cDNA。用於此轉染的3種質體為pSMN(222mg)、pAAV2/9(333mg)及pHELP(444mg)。質體可以1：1：1之莫耳比轉染。容許轉染培養基在生物反應器中平衡，直到生物反應器溫度在添加PEI-質體共沉澱物前為>30℃。PEI-質體共沉澱方法包含添加質體至轉染培養基中及以0.2μ過濾至反應袋中。令PEI添加至轉染培養基中及接著至反應袋中。PEI-質體之比為以重量計約1：1。令PEI-質體反應以手動混合以形成均勻的懸浮液且反應係在15至30分鐘期間內發生。在反應時間結束時，令PEI-質體共沉澱物自反應袋轉移至生物反應器。在重新開 始攪動前，容許PEI-質體共沉澱物在生物反應器中混合1至2小時(可替代的期間說明於實施例7中)。在下一次培養基更換前，令轉染培養基在生物反應器中再循環18至24小時。
在生物反應器第6天，在轉染後18至24小時排出生物反應器且令再循環培養基袋的轉染培養基以轉染後培養基替換。令生物反應器再以轉染後培養基填充，在生物反應器中再循環。在第7天，在第6天的培養基更換後18至24小時，令再循環袋中的轉染後培養基以新鮮袋的轉染後培養基替換。在此步驟期間未排出生物反應器。繼續再循環培養基，直到通常在第9天收穫。
(c)溶解經轉染之附著型細胞
在生物反應器中第9天後，自反應器採集最終收穫前之樣品且開始總細胞溶解過程。令班柔酶添加至生物反應器中至100U/mL之最終濃度。容許班柔酶在反應器中混合且令溶解緩衝液添加至反應器中。令溶解緩衝液在反應器中以15至25℃混合2小時，然後令生物反應器內容物轉移至收穫袋。令淬滅班柔酶反應之鹽蔗糖溶液(SSS)添加至收穫袋中且混合15分鐘。接著令生物反應器以生物反應器沖洗緩衝液沖洗15分鐘且接著令沖洗液與經淬滅之細胞溶解溶液一起收集在收穫物收集袋中。一旦沖洗液已添加至收集袋中，則令內容物混合15分鐘且採集大批的收穫物樣品。
(d)以過濾法及切向流過濾法製備病毒粒子
令混合之大批收穫物通過POD深層式過濾器過濾至收集袋中。一旦已過濾所有的大批收穫物，則令深層式過濾器以TFF1緩衝液驅趕。令深層式過濾器積液混合且取樣。接著可令深層式過濾器積液通過0.45μm過濾器過濾，以進一步淨化大批收獲物料。接著令0.45μm過濾器以TFF1緩衝液驅趕。
令用於TFF1步驟的5.0m2之300kDa MW截留再生纖維素膜卡匣以NaOH溶液沖洗、消毒且以TFF1緩衝液平衡。設計此操作之濃縮階段以減少約10x的經淨化之收穫物體積。一旦達到靶滲餘物體積，則開始滲濾操作。令滲餘物以6滲濾體積之TFF1緩衝液滲濾。或者，可令滲餘物以超過6滲濾體積之TFF1緩衝液滲濾，例如10滲濾體積、12滲濾體積或15滲濾體積。一旦達成6滲濾體積之滲透物總流量，則再濃縮滲餘物且收穫至收集袋中。執行兩次連續的膜沖洗，使來自TFF系統之產物回收率最大化，以生產中間藥物物質。
(e)冷凍中間物
令TFF1中間物在LFH櫥中等分至1或2公升滅菌PETG瓶中且接著在乾冰上或在冷凍器中冷凍及轉移至-60℃儲存。
Figure 107138852-A0305-02-0118-21
實施例3-下游方法
使用下游方法(參見例如圖5)加工TFF1中間物成為經過濾之藥物物質。在一些實施態樣中，可使用本文揭示之下游方法加工如本文所述之包含編碼靶向SOD1之shRNA的AAV SMN、AAV MECP2或AAV之中間物。下游方法步驟包括：(a)酸化及淨化中間物(使用過濾法)，(b)使用陽離子交換層析術純化，(c)以切向流過濾法(「TFF2」)過濾，(d)使用CsCl緩衝液超離心以單離經填充及空的空病毒殼體，(e)收集AAV病毒載體，及(d)令收集之AAV病毒載體以第二切向流過濾法(「TFF3」)步驟過濾。
(a)酸化及淨化
令來自上游方法之TFF1中間物(若先前冷凍，則解凍至室溫)泵抽至具有混合器的袋中。令積聚之TFF1中間物混合且採集樣品以測定效價。令積聚之TFF1中間物立即以添加11至14%之Tween 20加工。使用Tween 20促進大部分的宿主細胞蛋白質及DNA在酸性pH條件下絮凝。容許混合物培育12至20小時。接著添加酸化緩衝液(1M甘油)使pH降低至pH 3.3至3.7。令溶液通過1.1m2 Clarisolve和2.2m2 Millistak+C0HC深層式過濾器及0.45μm增澤過濾器(polishing filter)過濾以移出在pH降低後所形成之沉澱物。此過程得到經酸化及淨化之TFF中間物。
(b)以陽離子交換層析術純化
使用陽離子交換(CEX)層析術步驟自蛋白質、DNA及其他的加工雜質(例如宿主細胞脂質、TWEEN 20)單離出病毒殼體。此步驟係利用CIMmultus S03-8000 Advanced Composite Column(磺醯基)(0.2μm孔)層析術管柱(8.0L)，其係使用自動化加工層析術系統操作。緩衝液及溶液說明於下表中：
Figure 107138852-A0305-02-0120-22
令酸化及淨化之TFF中間物(亦即CEX裝載物)裝載在經清潔及平衡之CEX管柱上。條件為使得病毒載體與整體管柱結合。令未結合之物料以CEX A緩衝液自管柱洗出。以CEX A緩衝液中的CEX B緩衝液梯度自樹脂溶析產物。第1部分係在10管柱體積(CV)之溶析梯度開始的2.3至2.7CV之限定體積開始收集。在每批次後丟棄層析管柱(亦即不重複使用層析管柱)。接著令CEX產物溶析物(第2部分)使用中和緩衝液中和至7.7至8.3之pH。
(c)以切向流過濾法(TFF2)過濾
TFF2步驟濃縮病毒載體、移出蛋白質雜質及更換緩衝液成適合於CsCl超離心步驟之緩衝液。令中和之CEX溶析 液使用安裝0.3m2 300kDa MWCO再生纖維素膜之TFF系統加工。
令中和之CEX溶析液的體積減少至滲餘物靶體積。一旦達到滲餘物靶體積，則以不連續的TFF模式(批次模式)開始滲濾。令滲餘物以TFF2 NaCl滲濾緩衝液稀釋2倍且令滲餘物濃縮至其初始體積。重複上述，直到以TFF2 NaCl滲濾緩衝液完成滲濾。接著令滲餘物以TFF2 CsCl滲濾緩衝液稀釋2倍且令滲餘物濃縮至其初始體積。重複上述，直到以TFF2 NaCl滲濾緩衝液完成滲濾。
滲餘物係基於經中和之CEX溶析液的物理效價、系統滯留體積、系統沖洗體積及滲餘物而進一步濃縮至最終質量，以達成所欲載體靶濃度且回收至收集袋中。在以TFF2 CsCl滲濾緩衝液的一次系統沖洗循環後進行產物排放，使來自TFF系統的產物回收率最大化。採集含有滲餘物及沖洗液之TFF2滲餘物樣品用於物理效價測量。在每批次後丟棄TFF2膜卡匣(亦即不重複使用TFF膜)。
Figure 107138852-A0305-02-0121-23
(d)CsCl超離心
超離心步驟的目的係藉由利用氯化銫梯度超離心而自完全殼體移出空殼體。令TFF2滲餘物添加至超離心試管中 且密封試管。令試管置於超離心機中，如自動化Optima XPN 100 Ultra Centrifuge系統或具備有50.2 Ti型轉子或等效轉子之等效系統。令填充之試管在20℃下以45,000rpm離心22小時。
(e)收集AAV病毒載體
在完成離心步驟後，自超離心機移出試管且置於生物安全櫃中。令含有產物的試管架設在廢物容器上方的環形支架上。令燈放置在試管的正下方以顯現空殼體區帶(區帶A，最高區帶)、完全殼體雙區帶(區帶B和區帶C，雙區帶的上及下區帶)及在雙區帶下方的最低區帶(區帶D)。以連接至注射器的針刺穿試管，使試管通氣且以針移出區帶B、C和D。令收集之物料轉移至收集袋。令收集之超離心積液(UC積液)以TFF2緩衝液稀釋以達到TFF2裝載物料中一致的起始CsCl濃度。令稀釋之UC積液在TFF3步驟中加工。用於CsCl超離心步驟之緩衝液列示於下表中：
Figure 107138852-A0305-02-0122-24
(f)以切向流過濾法(TFF3)過濾
令TFF3步驟移出CsCl且使用最終調配緩衝液濃縮完全載體。切向流過濾系統係與50cm2 300kDa MWCO再生纖維素膜一起使用。以膜保留病毒載體。
令稀釋之UC積液的體積減少至滲餘物靶體積。一旦達到靶體積，則開始以恆定的滲餘物體積持續滲濾。令滲餘物以TFF3緩衝液滲濾。採集經滲濾之滲餘物樣品用於物理效價測量。令滲餘物以靶向滲透物重量進一步濃縮，該重量係由如下計算：1)在滲濾結束時在TFF系統中的滲餘物體積，2)經稀釋之UC積液物理效價，3)靶藥物物質(DS)濃度，4)系統沖洗液與過濾器沖洗液之組合體積，及5)TFF3緩衝液密度。在每批次後丟棄TFF3膜卡匣(亦即不重複使用卡匣)。
Figure 107138852-A0305-02-0123-25
以TFF3緩衝液進行兩次連續的TFF膜之20mL沖洗，自TFF系統回收載體。沖洗液係通過0.2mm Pall Supor® EKV Sterilizing-Grade Filter(Mini Kleenpak)回收。以TFF3緩衝液進行過濾器沖洗，以回收剩餘在過濾器中的任何載體及調整經過濾之TFF3積液(亦即藥物物質DS)的最終體積。令DS等分量至125或250mL PETG瓶中且在<-60℃下冷凍。
實施例4-調配及填充
藥物產物(DP)為2.0×1013vg/ml之靶濃度的單一劑量、 不含保存劑、滅菌、透明至略微不透明及無色至淡白色、無複製的靜脈內輸注、自身互補型AAV9載體。DP包含20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005% w/v之泊洛沙姆188。溶液之pH範為7.7至8.3。
Figure 107138852-A0305-02-0124-26
令DP填充至滅菌、即用型10ml Crystal Zenith(CZ)小瓶中，以滅菌、即用型氯丁基彈性塞子塞住且以滅菌的20mm可掀式(flip-off)鋁密封件密封。以5.5mL或8.3mL之標稱填充體積填充小瓶。靶溢出量為0.4mL且填充小瓶至5.9±0.1mL或8.7±0.1mL。
實施例5-效力檢定法
藥物產物之相對效力係使用定量性活體內檢定法測量。檢定法係使用經確立之SMA疾病的小鼠模式。育種配對之SMA△7小鼠品系(Jackson Laboratories，#005025)在表型上為正常的，但是彼等後代的~25%對靶向之SMN基因突變為純合子且顯現SMA樣表型。彼等於第5天顯示出肌肉無力的跡象且在後來一周內發展出異常的步態和摔倒的傾向。Jackson Laboratories報告具有SMA樣表型的動物之平均存活期為~15±2天。試驗性研究證實未治療之SMA樣 表型的動物具有16.3天中位存活期(幾何平均值；n=3次研究：每次研究10隻小鼠)。
經靜脈內(IV)輸注投予之生物活性藥物產物得到增加的存活時間，其係以劑量(vg/kg)為函數。藥物產物效力係相對於參考物料(先前批次載體)測量。藥物產物及參考物料之效價(載體基因組/mL；vg/mL)係以液滴數位式聚合酶鏈反應(ddPCR)測定。令載體於食鹽水中稀釋，分別達成三個指定之劑量水平，令其投予具有SMA樣表型的小鼠。
若檢定法通過適合性，則認為檢定結果是可接受的。檢定適合性係由以下者所組成。
1.負對照樣品之允收限度(15±2天，中位存活期)
2.正對照樣品之允收限度(>40天，中位存活期)
3.參考標準中位存活期劑量-反應曲線之允收限度
在此研究中使用先前批次載體(在下文的先前批次)以測定當以五種不同的劑量水平(包括使用0.9%食鹽水溶液之0(零)劑量(未治療組))之藥物產物(在下文的樣品批次)給藥時於SMA△7小鼠的中位存活期(天)之間的線性相關性。
藥物產物樣品批次之相對效力係藉由比較先前批次參考標準之線性迴歸曲線與藥物產物樣品批次線性迴歸曲線而確立。此係藉由使用各線性迴歸線的y-截距及斜率之比率(亦即參考標準及試驗物品)來完成。相對效力百分比計算係由以下公式(1)描述：%RP=[(試驗物品之y-截距/斜率)÷(參考標準之y-截距/斜率)]×100 (1)
在第1期臨床試驗中所使用之先前批次係用作為參考標準批次且賦予100%之效力。
使用△7小鼠模式證實SMA療法(包括藥物產物)之功效。經TFF3緩衝溶液(媒劑)處理之對照動物提供可信賴的基線對照，可自此測量產物效力作為增加的中位存活期。藥物產物的開發工作鑑定三(3)個藉由使用液滴數位式PCR(ddPCR)之基因組效價所測定之劑量(不包括經媒體處理之劑量)，當投予之劑量(vg/kg)經對數轉換且以經治療之SMA△7新生小鼠的中位存活期(以天計)繪圖時，該等劑量係以線性相關性影響小鼠模式中的存活期。參考表11關於低、中及高效價標準之標準效價(vg/mL)。另外，TFF緩衝(媒劑)溶液係用於零(0)校準曲線點以及負對照組二者。亦包括證實
Figure 107138852-A0305-02-0126-100
40天存活期的劑量(大於證實中位存活期加倍的劑量)作為正對照組。
Figure 107138852-A0305-02-0126-27
劑量溶液製備(參考表12之稀釋流程實例)
負對照組--使用TFF3緩衝溶液(藥物產物最終調配緩衝液)作為負對照組
正對照組--使用TFF3緩衝溶液製備1.10×1014vg/kg之 試驗物品批號。參見表12之稀釋流程實例。
參考標準溶液--使用TFF3緩衝溶液製備以表11中描述的三種濃度之參考標準批號。
Figure 107138852-A0305-02-0127-28
試驗物品製備--試驗物品係使用TFF3緩衝溶液稀釋。計算稀釋以產生表11中描述之每隻小鼠的50μl總體積之試驗劑量(vg/kg)。稀釋係為12隻小鼠進行，在當時以一個額外的體積作為正對照組，其目標為增加經治療之小鼠的最短壽命至
Figure 107138852-A0305-02-0127-101
40天之中位存活期(天)。
對照樣品之允收限度
負對照組(未經治療之小鼠)--用於負對照組之檢定允收限度為SMA△7小鼠符合15±2天之中位存活期。另外，
Figure 107138852-A0305-02-0127-102
10天死亡的任何小鼠被排除在分析之外。
正對照組(以臨床靶劑量治療之組)--用於正對照組之檢定允收限度為經治療之小鼠的最短壽命為
Figure 107138852-A0305-02-0127-103
40天之中位存活期。另外，
Figure 107138852-A0305-02-0127-104
10天死亡的任何小鼠被排除在分析之外。
參考標準劑量反應曲線之允收限度
檢定適合性標準係以中位存活期(天)對投予之劑量 (vg/mL)繪圖之參考標準線性劑量反應曲線測定。
Y-截距/斜率之比--測定參考標準及試驗物品之中位存活期(天)相對於投予之劑量(vg/kg)的線性迴歸曲線。計算各線性迴歸的y-截距對斜率之比。
報告結果
相對效力結果的定性報告--在測定正對照組物料
Figure 107138852-A0305-02-0128-105
40天之單點中位存活期(天)讀值前，評估各檢定法之檢定適合性標準。若正對照組之中位存活期
Figure 107138852-A0305-02-0128-106
40天，則可處置若符合以下標準之試驗物品。
相對效力結果的定量性報告--在試驗物品的定量性測定相對效力前，評估各檢定法之檢定適合性標準。一旦正對照組達到
Figure 107138852-A0305-02-0128-107
40天及代表7.5×1013vg/kg之上標準劑量的小鼠組達到31±3天之中位存活期，則可報告試驗物品之相對效力。試驗物品之相對效力百分比(%RP)係如下使用中位存活期(天)劑量-反應之線性迴歸的y-截距及斜率計算：%RP=100%*[(試驗物品y-截距/斜率)÷(參考標準y-截距/斜率)]
實施例6：界面活性劑滅活研究
為了區分低pH及tween的影響，使用具有7.6之pH及4至8%之Tween-20之藥物物質TFF1中間物樣品進行界面活性劑滅活研究。當Tween-20係在酸化前添加至TFF1中間物時，則在TFF1中間物中的Tween-20濃度比整個方法低 約2.5倍。此較低的Tween-20濃度被認為是藥物物質方法中經界面活性劑驅動之滅活的最壞情況。以界面活性劑處理之病毒滅活步驟的測試物品為含有4至8%之Tween-20之TFF-1中間物。為了評估以界面活性劑處理步驟之病毒滅活的能力，在一式兩份的實驗中分別使用XMuLV及PRV攙入具有病毒之試驗物品中。病毒係使用斑點形成感染力檢定法定量。
TFF1製造步驟產生4至8%之Tween-20的界面活性劑濃度範圍。令TFF1中間物積聚，且令超過12%之Tween-20在16至20℃之操作溫度下添加至TFF1中間物中，經12至20小時的持續期間混合。病毒清除法係在4至8%之Tween-20濃度及16.0℃±0.1℃之控制溫度下進行。相對於16小時之典型方法的時間，此滅活方法的持續期間為120分鐘。
用於滅活方法之滅活裝載物係藉由測量試驗物品體積、平衡至靶溫度及接著攙入病毒而製備。在六(6)個時間點移出攙入之滅活裝載物樣品以證實隨時間滅活之動力學：<1分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘。在收集後，令各樣品在生長培養基中稀釋以停止病毒滅活且檢定病毒。為了增加在90分鐘和120分鐘之檢定敏感性，亦檢定大量體積的該六個時間點樣品之病毒。由於Tween-20存在於此步驟的試驗物品中，故滅活裝載物之效價係自攙入之病毒效價及經攙入之病毒體積計算。
以界面活性劑(Tween-20)處理之病毒滅活的有效性顯示為有效的，如以兩種病毒在90分鐘時間點大於4 log10之 LRV值證明。以界面活性劑處理之滅活動力學係於圖6和圖7中以Tween-20界面活性劑處理期間經120分鐘過程之病毒滅活比率的圖形例證。
實施例7：以更高的接種密度、提早轉染和收穫及DNA/PEI混合時間對藥物物質生產之效應
評估更高的接種密度、提早一天轉染和收穫及DNA/PEI混合時間對DS生產之效應。各條件係以一式兩份在1.6m2生物反應器中評估。
物料及方法 細胞按比例增加
令HEK 293細胞解凍且再懸浮於以10%之FBS補充之DMEM中。令細胞在室溫下以209×g離心5min，接著移出上清液且添加新鮮DMEM+10%之FBS。細胞係以活細胞密度和存活率計數且接種在2×T175cm2燒瓶中及在37.0℃、5% CO2下培育三天，直到培養物達到~90%匯合率。移出用於各細胞傳代之廢培養基，令燒瓶以0.08mL/cm2之PBS(-CaCl2、-MgCl2)清洗，且接著令燒瓶以TrypLE Select(0.04mL/cm2)處理及在37.0℃、5% CO2下培育2至3分鐘。令胰蛋白酶以DMEM+10%之FBS(0.04mL/cm2)淬滅。依照圖8之示意圖擴增及接種細胞。
細胞接種及監測
令一式兩份的HEK 293細胞以在生長培養基(高葡萄糖DMEM+10%之Australian Origin FBS+1：100之青黴素鏈黴素(Pen Strep))中的8,000個細胞/cm2及12,000個細胞/cm2之靶密度以攪拌接種於生物反應器。方法參數經設定成pH 7.23、37.0℃、55%之溶解氧(DO)及2cm/s之線速度。在接種後24小時，開啟以DMEM生長培養基(0.188mL/cm2)的再循環至再循環速度(12.5mL/min)。使用Nova BioFlex讀取採集之每日樣品的離線pH、代謝物及營養物。在接種後第四天(12,000個細胞/cm2)、第五天(8,000cells/cm2)和第九天，移出三種纖維且以1：1：1 v/v之PBS、A100及B100溶液(ChemoMetec)溶解及計數(NucleoCounter NC-200)總細胞核以監測培養物生長。
轉染
在細胞接種後第四天(12,000個細胞/cm2)和第五天(8,000個細胞/cm2)停止再循環，且令各生物反應器中的細胞以質體DNA及聚乙烯亞胺(PEI)轉染。令DNA及PEI以1：1mg/mg之比混合。質體DNA係以1：1.5：2之質量比的pSMN質體、pAAV2/9質體及pHELP質體轉染，添加至DMEM -/-培養基：高葡萄糖、-CaCl2、-L-麩醯胺酸中，且經0.2μM過濾及以反轉混合。令PEI添加至DMEM -/-培養基中且以反轉混合。接著令PEI添加至DNA中，以反轉混合且在室溫下針對8,000個細胞/cm2(對照組)及12,000個細胞/cm2培育20分鐘。令DNA/PEI針對其他兩個8,000個細 胞/cm2條件培育1hr及2hr。使用此DNA/PEI複合混合物轉染針對四種條件之各者的兩個生物反應器。令DNA/PEI複合物添加至各生物反應器中且在方法參數下培育兩小時。在轉染後兩小時重新啟動再循環迴路。
轉染後培養基更換
在轉染後24小時，移出生物反應器及再循環迴路中的所有培養基且以OptiMEM+1：100Pen Strep(0.132mL/cm2)替換及在方法參數下再循環24小時。在轉染後48小時，僅自再循環移出所有培養基且以OptiMEM+1：100Pen Strep(12mL/min)替換及在方法參數下再循環。
收穫
在細胞接種後第八天(12,000個細胞/cm2)和第九天(8,000個細胞/cm2)添加班柔酶(100U/mL)，以溶解緩衝液(50mM HEPES、1%之Tween 20)驅趕且在方法參數下培育兩小時。排出生物反應器且添加蔗糖鹽溶液(500mM NaCl、1% w/v之蔗糖)，且令該等以反轉混合。令生物反應器在方法參數下以生物反應器沖洗緩衝液(500mM NaCl、1% w/v之蔗糖、20mM Tris Base、1% v/v Tween 20、1mM MgCl2.6H2O)清洗約15分鐘。排出生物反應器且令生物反應器沖洗緩衝液與粗製大批收穫物積聚，以反轉混合且取樣用於ddPCR檢定法。
深層式過濾法及切向流過濾法
在細胞接種後第八天(12,000個細胞/cm2)和第九天(8,000個細胞/cm2)收穫生物反應器、取樣且積聚各條件的粗製溶解物(n=2個生物反應器)。接著令積聚之溶解物通過Millistak C0HC Pod，270cm2過濾器及Millipak 40，0.45μm，Durapore，200cm2增澤過濾器(EMD Millipore)淨化。在C0HC+0.45之後採集樣品且在-80.0℃下冷凍。接著令淨化之溶解物經由切向流Pellicon® 2 Ultrafiltration Module PLCMK C 0.1m2過濾器(EMD Millipore)濃縮。使用至少6滲濾體積滲濾最終產物。獲得TFF1過濾後樣品在-80.0℃下冷凍。提交所有的樣品用於AAV2/9效價及宿主細胞蛋白質。
使用質體於生物反應器中生產DS。數據代表相應於表14中所示之生物反應器數目及條件的一式兩份之各條件。
Figure 107138852-A0305-02-0133-29
細胞生長：細胞係在接種當天(第0天)計數，及細胞核係在接種後第4天(12,000個細胞/cm2)、第5天(8,000個細胞/cm2)和第9天計數。數據表明在所有反應器中的細胞係 在第0天與第5天之間呈指數生長。在轉染後，第9天的細胞核計數示意生物反應器221係自第5天至第9天增加2.0倍的總細胞核。所有其他的反應器(222至228)在第5天至第9天之間未展現顯著的生長。在生物反應器221中增加的生長可能是基於細胞不均勻分布在用於總細胞核計數之個別纖維上的假象。基於圖9A至E中所示之代謝物數據，所有生物反應器中的細胞有可能以類似方式生長。
pH、營養物及代謝物：葡萄糖在所有生物反應器培養物中係以相同的趨勢消耗，示意儘管生物反應器221的生長曲線增加，但細胞仍以類似的速率消耗葡萄糖。以12,000個細胞/cm2及8,000個細胞/cm2接種之生物反應器的pH經前三天平均為7.06及7.18。pH隨著增加的營養物代謝而略微下降且在第9天同時隨著上升的銨離子含量而增加。乳酸鹽增加至第5天(生物反應器221、223、224、225、227)和第6天(生物反應器222、226、228)，接著在生產結束時趨於平穩，示意在此階段利用乳酸鹽作為能源。
生產效價
令來自收穫物之病毒基因組以數位式液滴(ddPCR)測量。以12,000個細胞/cm2接種之生物反應器中的6.37E+10vg/mL(n=2)之平均效價量度相對於以12,000個細胞/cm2接種之對照生物反應器中的4.33E+10vg/mL(n=2)之平均效價量度，效價高約1.5倍。效價數據示意以更高的密度接種、提早一天轉染和收穫支持更高的DS產量。與其中培 育20分鐘之DNA/PEI的對照組(4.33E10vg/mL，n=2)相比，培育1小時之DNA/PEI的效價收益展現所測量的平均效價降低1.4倍(3.17E10vg/mL，n=2)及培育2小時之DNA/PEI的效價收益展現所測量的平均效價降低1.6倍(2.67E10vg/mL，n=2)。數據示意更長的培育時間導致效價降低。這可能是由於DNA及PEI形成不能有效地轉染HEK293細胞的大量複合物。與作為正對照組之已知方法中的生產相比，每mL之病毒生產力及表面積值於圖10中給出。
在淨化及濃縮步驟之各步驟所測量之病毒效價顯示於圖11中。在TFF1步驟期間的各步驟之殘留宿主細胞蛋白質顯示於圖12A至B中。
實施例8：接種密度對藥物物質生產之效應
評估接種密度對DS生產之效應。評估四種接種密度且各接種密度係以一式兩份於生物反應器中。
細胞按比例增加
令HEK 293細胞解凍且再懸浮於以10%之FBS補充之DMEM中。令細胞在室溫下以209×g離心5min，接著移出上清液且添加新鮮DMEM+10%之FBS。細胞係以活細胞密度和存活率計數且接種在2×T175cm2燒瓶中及在37.0℃、5% CO2下培育四天，直到培養物達到~90%匯合率。移出用於各細胞傳代之廢培養基，令燒瓶以0.08mL/cm2之 PBS(-CaCl2、-MgCl2)清洗，且接著令燒瓶以TrypLE Select(0.04mL/cm2)處理及在37.0℃、5% CO2下培育2至3分鐘。令胰蛋白酶以DMEM+10%之FBS(0.04mL/cm2)淬滅。依照圖13之示意圖擴增及接種細胞。
細胞接種及監測
令一式兩份的HEK 293細胞以四種靶密度以攪拌接種生物反應器：在700ml生長培養基(高葡萄糖DMEM+10%之Australian Origin FBS+1：100之Pen Strep)中的8,000個細胞/cm2、9,350細胞/cm2、10,700細胞/cm2和12,050細胞/cm2。方法參數經設定成pH 7.23、37.0℃、55%之溶解氧(DO)及2cm/s之線速度。在接種後24小時，開啟以DMEM生長培養基(目前的總體積0.188mL/cm2)的再循環至再循環速度(12.5mL/min)。使用Nova BioProfile 400讀取採集之每日樣品的離線pH、代謝物及營養物。在接種後第五天和第九天，移出三種纖維且以1：1：1 v/v之PBS、A100及B100溶液(ChemoMetec)溶解及計數(NucleoCounter NC-200)總細胞核以監測培養物生長。
轉染
在細胞接種後第五天停止再循環，且令各生物反應器室(不是再循環瓶)內部的培養基以600ml DMEM -/-培養基(高葡萄糖、-CaCl2、-L麩醯胺酸)更換。令各反應器以1：1之質量比的質體DNA及聚乙烯亞胺(PEIpro)轉染。質體 DNA係以1：1.5：2之質量比(pSMN-3.56mg、pAAV2/9-5.34mg和pHELP-7.1mg)混合，添加至300mL DMEM -/-培養基，經0.2μM過濾且以反轉混合。令PEI(16mL)添加至300mL DMEM -/-培養基中且以反轉混合。令PEI與DNA混合物組合，以反轉混合且在室溫下培育20分鐘。使用各600ml PEI/DNA複合混合物轉染兩個生物反應器，重複各相應之接種密度。令DNA/PEI複合物添加至各生物反應器中且在方法參數下培育兩小時。在轉染後兩小時重新啟動再循環迴路(12.5mL/min)。
轉染後培養基更換
在轉染後24小時，移出在生物反應器及再循環迴路中的所有培養基且以OptiMEM(0.132mL/cm2)替換及在方法參數下再循環(12.5mL/min)24小時。在轉染後48小時，以新鮮OptiMEM更換在再循環瓶中的培養基且在方法參數下再循環(12mL/min)。
收穫
在細胞接種後第九天添加班柔酶(100U/mL)，以溶解緩衝液(50mM HEPES、1%之Tween 20)驅趕且在方法參數下培育兩小時。排出生物反應器且添加蔗糖鹽溶液(500mM NaCl、1% w/v之蔗糖)，以反轉混合。令生物反應器在方法參數下以生物反應器沖洗緩衝液(500mM NaCl、1% w/v之蔗糖、20mM Tris Base、1% v/v之Tween 20、1mM MgCl2.6H2O)清洗15分鐘。排出生物反應器且令生物反應器沖洗緩衝液與粗製大批收穫物積聚，以反轉混合且取樣用於ddPCR檢定法。
使用質體於生物反應器中生產藥物物質。反應器係以不同的密度接種及以相同的時間表轉染及收穫(分別在接種後第5天、第9天)。數據代表一式兩份的各接種密度，如下表15中所示：
Figure 107138852-A0305-02-0138-30
細胞生長：細胞係在接種當天(第0天)計數，及細胞核係在接種後第5天(8,000個細胞/cm2)和第9天計數。數據表明在所有反應器中的細胞係在第0天與第5天之間呈指數生長。儘管起始接種密度不同，但細胞核計數未表明在第5天於群組之間顯著的細胞數量差異。在轉染後第9天的細胞核計數示意五個生物反應器(221、224、225、226、228)係自第5天至第9天的總細胞核加倍。兩個反應器(222、223)的總細胞核增加1.4倍，如圖14A中所示。反應器227係自第5天至第9天的總細胞核增加3.8倍。此差異可能是基於細胞不均勻分布在用於計數的個別纖維之間的假象。基於圖14B至E中所示之代謝物數據，所有反應器中的細胞有可能以類似方式生長。
pH、營養物及代謝物：葡萄糖在所有生物反應器培養 物中係以相同的趨勢消耗(圖14B)，示意儘管起始接種密度不同，但培養物仍以類似的速率消耗葡萄糖。在所有培養物中的離線pH(圖14C)在前三天維持固定(pH 7.25)，隨著增加的營養物代謝而下降且在第8天後同時隨著上升的銨離子含量而增加(圖14E)。乳酸鹽(圖14D)增加至第6天且接著在生產結束時趨於平穩，示意在此階段利用乳酸鹽作為能源。在以不同的起始密度接種的反應器之間未觀察到顯著的代謝物分布差異。這可能是因為起始接種密度的差異很小，<1.2倍的差異。
生產效價
令來自收穫物之病毒基因組以數位式液滴(ddPCR)測量。效價係在8,000個細胞/cm2及10,070個細胞/cm2之起始接種密度之間進行比較，平均分別為3.99E+10±2.1E+09vg/mL(n=2)及3.70E+10±7.4E+09vg/mL(n=2)。由於不明原因，以9,350個細胞/cm2接種之反應器展現5.02E+08vg/mL(n=2)之平均效價量度，比以兩側密度下接種之反應器的平均效價低約2個對數。此差異有可能是轉染或收穫期間未識別之操作錯誤的結果，而不是在此接種密度下缺乏生產力。以12,050個細胞/cm2接種之複製反應器彼此之間證實兩倍的差異，一個反應器以較低的接種密度觀察到3.2E+10vg/mL之範圍，而另一反應器僅得到1.4E+10vg/mL之效價。每mL之病毒生產力及表面積值於圖15中給出。
評估接種密度及DS生產力，如圖15B中所示。以8E+03至10E+03細胞/cm2之範圍接種之HEK 293細胞顯示一致的生長分布、pH、葡萄糖消耗、乳酸鹽及氨生成。另外，產生可相比的效價，示意略高的接種密度不負面衝擊生產力。相反地，以12×103個細胞/cm2之較高密度接種之反應器在一式兩份之間展現更多的可變性，包括與其他條件相比而較低的平均效價，示意本實驗中所使用之方法對生產力可能不優。該等結果支持以介於8×103與1×104個細胞/cm2之間的密度範圍接種細胞以進行生物反應器實驗。
實施例9：可相比性評定
在第1期臨床研究(方法A)中所使用的AVXS-101藥物產物與在關鍵臨床研究(方法B)中所使用的藥物產物之間的可相比性係作為主要目標評定，第二目標係藉由比較藥物產物批號600156和600307來評定使用方法B之製造一致性。圖16表示第1期(方法A)及第3期試驗(方法B)製造方法流程及在彼等之間的差異。
可相比性評定係使用以Nationwide兒童醫院(NCH)所製造之第1期臨床藥物產物批號NCHAAV9SMN0613及以AveXis所製造之藥物產物批號600156進行。
產物
評估下列的物料批次，如表16中所總結。評定包括直 接比較來自使用方法A之第1期臨床藥物產物批號NCHAAV9SMN0613與使用方法B之AVXS-101藥物產物批號600156的所得品質屬性。另外，批號600156與批號600307之釋放測試結果係以按比例放大之方法重現性及一致性進行整體評估。
Figure 107138852-A0305-02-0141-31
製造方法概述
圖17A至B提供可相比性結果的總結。
可相比性及製造一致性評定
方法A和方法B物料係用於評定可相比性及方法B物料被評定為一致的。亦測定方法B物料具有額外的效益，例如用於工業規模生產。
試驗方法 pH
pH分析係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。來自兩種方法的結果係在7.9至8.0之範圍內。這證實方法A和方法B物料之pH是可相比的且方法B物料為一致 的。
外觀
以目視檢查的外觀係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。在方法A與方法B之間的外觀結果之顯著差異係由於不同的載體濃度(基因組效價)。批次NCH AAV9SMN0613具有比方法B批次更低的載體濃度。因此，批次NCH AAV9SMN0613更稀釋，導致更澄清且無色的溶液，而方法B批次觀察到的無色至白色及略微不透明係起因於每mL溶液中約4倍濃度的病毒粒子。
考慮到濃度差異，評估方法A和方法B物料的外觀是可相比的，且評估過程B物料被評定為一致的。
滲透壓度
以凝固點下降的滲透壓度係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。來自兩種方法的結果係在410至415mOsm/kg之範圍內。這證實方法A和方法B物料之滲透壓度是可相比的且方法B物料為一致的。
微可見粒子
以遮光法之微可見粒子係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。 來自兩種方法的結果遠低於USP著作之可注射藥物產物的推薦限度。這證實方法A和方法B物料之微可見粒子計數是可相比的且方法B物料為一致的。
基因組效價
以ddPCR之基因組效價係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。預期AVXS-101批次之基因組效價係基於製造中的靶濃度而波動。以方法B所得之基因組效價(3.7×1013vg/mL和4.0×1013vg/mL)比來自方法A之基因組效價(1.1×1013vg/mL)高至少3倍，於是方法B為用於大規模製造AVXS-101的更好方法。
感染效價
以TCID50之感染效價係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。方法B(1.3×1010IU/mL和6.7×109IU/mL)得到比方法A(5.9×1010IU/mL)平均高66%之感染效價，其可能有利於例如大規模製造rAAV(例如AVXS-101)。
總蛋白質
以Micro BCA之總蛋白質係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。以1.0×1013vg/mL標準化之來自兩種方法的結果係在167至 179μg/mL之範圍內。經標準化之總蛋白質值證實方法A和方法B物料是可相比的且方法B物料為一致的。
以西方墨點法之同一性
以西方墨點法之同一性係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。以主要區帶(VP1、VP2和VP3)之墨點分布及視分子量評定方法A和方法B物料是可相比的且亦評定方法B物料為一致的。
以AUV之%空殼體
以AUV之%空殼體係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。批號NCHAAV9SMN0613(方法A)的結果為7%。批號600156和600307(方法B)的結果分別為2%和4%。根據AUC的測量，方法B(2%和4%)得到比方法A(7%)少約兩倍的空殼體。於是，方法B能夠生產包含更低濃度的空殼體之改進的組成物。
以SDS-PAGE之同一性及純度
以SDS-PAGE之同一性及純度係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。來自兩種方法的%總純度為
Figure 107138852-A0305-02-0144-108
98%，且三種殼體蛋白質中之各者的區帶樣式以及視分子量是非 常一致的。該等結過證實方法A和方法B物料是可相比的且方法B物料為一致的。
殘留宿主細胞蛋白質
以ELISA之殘留宿主細胞蛋白質係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。用於檢定所測試之所有批次的結果為<LOQ(8ng/mL)。該等結果證實方法A和方法B物料是可相比的且方法B物料為一致的。
殘留牛血清白蛋白(BSA)
殘留BSA係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。用於檢定所測試之所有批次的結果為<LOQ(0.50ng/mL)。該等結果證實方法A和方法B物料是可相比的且方法B物料為一致的。
殘留班柔酶
以ELISA之殘留班柔酶係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。用於檢定所測試之所有批次的結果為<LOQ(0.20ng/mL)。該等結果證實方法A和方法B物料是可相比的且方法B物料為一致的。
殘留宿主細胞DNA
以qPCR之殘留宿主細胞DNA係以批號NCHAAV9SMN0613(方法A)、批號600156(方法B)和批號600307(方法B)進行。以1.0×1013vg/mL標準化之方法A的結果為3.7×105pg/mL，而方法B的結果分別為0.76×105pg/mL和0.68×105pg/mL。因此，方法B生產具有顯著較低的殘留hcDNA之病毒載體，其可能有利於例如大規模製造rAAV(例如AVXS-101)。
統計學分析
統計學分析係以定量性品質屬性進行。比較係在如下文列示之方法A批次(NCHAAV9SMN0613)與各方法B批號(600156和600307)之間逐對進行。結果顯示於圖18和19。
該等研究顯示方法B為生產病毒載體之卓越的方法。方法B一致地生產更大量的病毒載體(根據基因組效價及感染效價的測量)、具有少量雜質(較少的殘留hcDNA)及較少的空殼體。
次世代定序
亦進行次世代定序(NGS)以確立同一性(測定及/或確認基因組序列)且評定來自方法B的AVXS-101藥物產物第3期物料是否有序列變異體(亞族群)存在。序列數據集相對於資助者提供之參考序列(pscSMN)的比對揭露全長基因組的完整(100%)寬度及足夠的覆蓋深度而能夠檢測變異體。注意到總共四個小的變異體位置，然而，該等似乎代表在 難以定序之區域內(例如由於其高的GC含量及迴文序列而出名地難以定序的AAV之反向末端重複區(ITR))的定序錯誤，而不是真正的變異體。參考表17之定序結果。
Figure 107138852-A0305-02-0147-32
第1期批號NCHAAV9SMN0613穩定性概況
令批號NCHAAV9SMN0613在
Figure 107138852-A0305-02-0147-109
-60℃下儲存12個月。在各時間點分析批號。沒有提出不利的趨勢。圖20顯示迄今的穩定性結果。
完成在第1期臨床研究中所使用之AVXS-101的可相比性研究。評定係使用以Nationwide兒童醫院所製造的第1期臨床藥物產物批號NCHAAV9SMN0613及以AveXis所製造的AVXS-101藥物產物批號600156進行。另外，製造一致性係使用方法B批號600156和600307評估。可相比性評定(方法A對方法B)及製造一致性(方法B批號600156對600307)二者的研究係使用新改進之方法及分析方法評估AVXS-101臨床試驗物料的同一性、品質、純度，能夠健全的評定可相比性及製造一致性。
統計學分析係以定量性品質屬性進行。比較係在方法A批號NCHAAV9SMN0613與方法B批號600156之間逐對進行。方法B為更好的方法，其生產比方法A更高純度的更 大量病毒載體。例如，與方法A相比，以方法B所生產之病毒載體具有高48%之感染效價、高8%之基因組效價、少92%之大於10μm大小的微可見粒子、少50%之大於25μm大小的微可見粒子、少於100%之空殼體及少於11%之殘留hcDNA。所有的結果相對於各品質屬性之試驗限度為一致的。
此外，為了使用方法B確立製造一致性，故使用批號600156和600307進行逐對比較。來自方法B批號600156和600307之間的此初始逐對比較的結果展現製造一致性。所有的結果相對於各品質屬性之試驗限度亦為一致的。
來自使用方法A的第1期臨床藥物產物批號NCHAAV9SMN0613及使用方法B的AVXS-101藥物產物批號600156之所得品質屬性係基於結果評估而證實方法B得到更大量病毒載體及改進的純度，其可能有利於例如大規模製造rAAV。另外，發現自方法B產生的兩個批次物料(批號600156和600307)具有重現性，進一步展現製造一致性。
實施例10：分析型超離心(AUC)分析
來自第1期(方法A，批號NCHAAV9SMN0613)及第3期(方法B，批號600156和600307)之物料係使用AUC方法分析。NCHAAV9SMN0613、600156和600307之AUC概況(以一式兩份分析)分別顯示於圖21、圖22和圖23中。
當與分別具有2%和4%之空殼體含量的第3期物料(方 法B，批號600156和600307)相比時，各物料之AUC分析展現與顯示升高的空殼體含量(7%)之第1期物料(方法A，批號NCHAAV9SMN0613)相似的空殼體及完全殼體之沉降係數。這是由於方法B中的CsCl梯度超離心製造步驟比以方法A使用之碘克沙醇梯度超離心製造步驟更選擇性地自完全殼體單離空殼體的能力。
當以Nationwide兒童醫院生產之第1期臨床試驗物料(NCHAAV9SMN0613)及各後續以AveXis之生產批次二者中經受使用超離心之CsCl梯度純化方法時，使用臨床和商業表現的AVXS-101生產批次一致地展現殼體的三個可見區帶。該等物料係基於使用方法A之第1期臨床藥物產物批號NCHAAV9SMN0613及使用方法B之AVXS-101藥物產物批號600156之AUC概況而被認為是可相比的。另外，自方法B產生之物料的兩個批次(批號600156和600307)之AUC概況被評定為一致的。
實施例11-上游方法
使用上游方法生產源自工作細胞庫之中間物，其中上游方法包含步驟(a)培養細胞，(b)令培養之細胞以如圖1中所示之三種質體轉染，(c)在培養期後自細胞收穫擴增之病毒粒子，(d)令病毒粒子經由過濾法純化以移出任何完整細胞或細胞碎屑，(e)令來自步驟(d)的溶析液經受切向流過濾法，及(g)冷凍經純化之病毒粒子的所得中間製劑。
在轉染前，令細胞在適合的培養基中於燒瓶或適合的 生物反應器或二者中擴增。一種培養基為具有10%之FBS、4.5g/L之葡萄糖、4mM L-麩醯胺酸的DMEM。在一些實施態樣中，令附著型細胞最初在燒瓶中生長及接著轉移iCELLis生物反應器中而於生物反應器中進一步擴增附著型細胞。
在細胞擴增後，令附著型HEK293細胞以三重DNA質體PEI共沉澱而轉染。用於此轉染的3種質體為：pSMN、pAAV2/9及pHELP。令用於細胞擴增之DMEM生長培養基以經修飾之DMEM轉染培養基替換。DMEM轉染培養基不含有FBS、不含有鈣、不含有L-麩醯胺酸和4.5g/L葡萄糖。scAAV9.CB.SMN載體係在大規模的附著型細胞生物反應器中使用三重DNA質體轉染至附著型HEK293細胞中而生產，該轉染係使用PEI共沉澱。載體質體pSMN含有用於人SMN之cDNA。用於此轉染的3種質體為：pSMN(222mg)、pAAV2/9(333mg)及pHELP(444mg)。容許轉染培養基在生物反應器中平衡，直到生物反應器溫度在添加PEI-質體共沉澱物前為>30℃。PEI-質體共沉澱方法包含添加質體至轉染培養基中及以0.2μ過濾至反應袋中。令PEI添加至轉染培養基中及接著至反應袋中。令PEI-質體反應以手動混合以形成均勻的懸浮液且反應係在15至30分鐘期間內發生。在反應時間結束時，令PEI-質體共沉澱物添加至生物反應器中。在重新開始再循環前，容許PEI-質體共沉澱物在生物反應器中混合1至2小時。在下一次培養基更換前，令DMEM生長培養基在生物反應器中再循環18至24小 時。
rAAV SMN基因組(SEQ ID NO：1之核苷酸980-3336)依序具有AAV2 ITR、具有巨細胞病毒增強子之雞β-肌動蛋白啟動子、SV40內含子、編碼在(GenBank登錄號NM_000344.2)中提出之DNA的SMN、來自牛生長激素之多腺苷酸化訊號序列及另一AAV2 ITR。亦預期的是SMN DNA之保守性核苷酸取代(例如在GenBank登錄號NM_000344.2之位置625上的鳥嘌呤變成腺嘌呤)。基因組缺少AAV rep和cap DNA，亦即在基因組的ITR之間沒有AAV rep或cap DNA。所預期之SMN多肽包括但不限於在NCBI蛋白質數據庫編號NP_000335.1中提出之人SMN1多肽。rAAV9 SMN載體說明於Foust等人之Nature Biotechnology 28(3)：271-274(2010)中，其中載體基因組插入物之序列顯示為SEQ ID NO：1之核苷酸980-3336。
在生物反應器第6天，在轉染後18至24小時排出生物反應器且令循環培養基袋的DMEM以200公升新鮮的OptiMEM轉染後培養基替換。令生物反應器再以64公升該培養基填充且重新開始在生物反應器中再循環。在第7天，在第6天的培養基更換後18至24小時，令再循環袋中的OptiMEM轉染後培養基(~135公升)以新鮮袋的OptiMEM培養基替換。在此步驟期間未排出生物反應器。繼續再循環培養基，直到在第9天收穫。
在生物反應器中第9天後，自反應器採集最終收穫前之樣品且開始總細胞溶解過程。令班柔酶添加至生物反應 器中至100U/mL之最終濃度。在容許班柔酶在反應器中混合後，令7.1公升溶解溶液添加至反應器中。在第一收穫步驟前，令溶解溶液在反應器中混合2小時。在2小時溶解結束時，令生物反應器內容物轉移至收穫袋。令8.9公升鹽蔗糖溶液(SSS)添加至收穫袋中且混合15分鐘。SSS溶液淬滅收穫袋中的班柔酶。接著令生物反應器以生物反應器沖洗緩衝液沖洗。令用於生物反應器沖洗之64公升生物反應器沖洗緩衝液添加至生物反應器中且混合15分鐘。接著令沖洗液轉移至共同的收穫物收集袋中。一旦沖洗液已添加至收集袋中，則令內容物混合15分鐘且採集大批的收穫物樣品。
令混合之大批收穫物通過深層式過濾器過濾至收集袋中。一旦已過濾所有的大批收穫物，則令深層式過濾器以50公升TFF1滲濾緩衝液驅趕。令深層式過濾器積液混合且取樣。接著令深層式過濾器積液通過0.45μm過濾器過濾，以進一步淨化大批收獲物。接著令0.45μm過濾器以6公升TFF1緩衝液驅趕。
令用於TFF1步驟的5.0m2之300kDa MW截留再生纖維素膜卡匣以NaOH溶液沖洗、消毒且以TFF1緩衝液平衡。設計此操作之濃縮階段以減少約10x的經淨化之收穫物體積。一旦達到滲餘物靶體積，則開始滲濾操作。令滲餘物以6滲濾體積之TFF1緩衝液滲濾。一旦達成6滲濾體積之滲透物總流量，則再濃縮滲餘物且收穫至收集袋中。執行兩次連續的膜沖洗，使來自TFF系統之產物回收率最大 化，以生產中間藥物物質。令TFF1中間物在LFH櫥中等分至1或2公升滅菌PETG瓶中且接著在乾冰上或在冷凍器中冷凍及轉移至-60℃儲存。
Figure 107138852-A0305-02-0153-33
實施例12-下游方法
使用下游方法加工中間物成為經過濾之藥物物質。下游方法步驟包括酸化及淨化步驟(使用過濾法)，繼而以陽離子交換層析術、切向流過濾法(「TFF2」)、CsCl超離心及進一步的切向流過濾法步驟(「TFF3」)以生產經過濾之藥物物質，其中令純化之AAV粒子懸浮在醫藥上可接受之載劑中。特定言之，下游方法含有接續在生產TFF1中間物之後的下列製造步驟：解凍及積聚TFF1中間物、酸化及淨化、陽離子交換層析術(CEX)、切向流過濾法(TFF2)、用 於完全/空殼體單離之CsCl超離心、用於濃縮/緩衝液交換之切向流過濾法(TFF3)、TFF3積液物過濾以產生藥物物質、稀釋及過濾藥物物質以生產藥物產物、儲存藥物產物、及填充藥物產物至小瓶中。
令TFF1中間物解凍且溫和地混合。使用Tween 20促進大部分的宿主細胞蛋白質及DNA在酸性pH下絮凝。令含有15%之Tween 20之TFF1中間物的pH降低以進行CEX層析術(pH 3.5)。接著令pH降低後所形成之沉澱物以溶液通過深層式過濾器及0.45μm過濾器過濾而移出。
令Tween 20(在20mM Tris、1mM MgCl2、500mM NaCl、1%之蔗糖m/v中的36%之Tween 20溶液，pH 8.1)經4小時緩慢地添加至TFF1中間物溶液中以達成20%之Tween 20之最終濃度。在室溫(RT)下培育隔夜後，令含有TFF1中間物之Tween 20的pH以每kg之TFF1中間物/Tween攙入積液計添加約4g之1M甘胺酸pH 2.5而降低，以達成3.5±0.1之靶pH。一旦pH在允收範圍內，則令溶液通過Clarisolve POD深層式過濾器與連線的0.45μm Opticap XL10 Durapore過濾器或0.8/0.45μ PES過濾器，繼而以CEX緩衝液A沖洗過濾器兩次：POD過濾器的滯留體積加上增澤過濾器的一份滯留體積。
使用陽離子交換(CEX)俘獲層析術步驟自蛋白質、DNA及其他的加工雜質單離病毒殼體。此步驟係利用CIMmultus S03-8000 Advanced Composite Column(磺醯基)(2μm孔)層析術管柱(8.0L)，其係使用自動化加工層析 術系統操作。緩衝液及溶液說明於下表中。
Figure 107138852-A0305-02-0155-34
CEX管柱裝載量係以經淨化、純化之TFF1中間物的蛋白質含量測定。CEX管柱之蛋白質裝載量經設定在最大管柱容量的70%。
溶析峰係在OD280急劇上升時開始以手動收集。當電導率在介於80至85mS/cm之間時，OD280上升。CEX溶析液(產物)的大約體積為~20公升或2.5CV(管柱體積)。CEX溶析液係以兩個部分收集。第一部分係在OD280急劇上升時開始且收集1.5CV。第二部分係在第一部分後立即開始且收集1.0CV。令兩個部分使用pH 9.0中和緩衝液中和至pH 8.0±0.30。
TFF2步驟濃縮、移出蛋白質雜質且以適合於CsCl超離心步驟之緩衝液更換緩衝液。切向流過濾系統係與0.4m2(兩次CEX循環)或0.2m2(一次CEX循環)300k MWCO再生纖維素膜一起使用。
該操作的濃縮階段減少CEX溶析液的體積。一旦滲餘物靶體積減少，則以不連續的TFF模式(批次模式)開始滲濾。令滲餘物稀釋2X且以8滲濾體積之TFF2 NaCl滲濾緩衝液滲濾及隨後以不連續的TFF模式以8滲濾體積之TFF2 CsCl滲濾緩衝液滲濾。一旦完成CsCl滲濾，則令滲餘物濃縮至指定體積，其係取決於系統滯留體積。執行兩次連續的膜沖洗，使來自TFF2系統的產物回收率最大化。
滲餘物進料速率經設定為5L/m2/min(每0.1m2卡匣計500mL/min)，以20%之轉化率成為滲透物(滲透物流速係以每500mL滲餘物進料速率計100ml)。滲透物流速係以滲透管上的夾具控制以維持滲餘物進料流速的20%之滲透物流速。
Figure 107138852-A0305-02-0156-35
可使用超離心自完全殼體移出空殼體，該超離心係利用氯化銫梯度超離心。使用自動化Optima XPN 100 Ultra Centrifuge系統或具備有50.2 Ti型轉子或等效轉子之等效 系統進行CsCl超離心步驟。令經TFF2純化之過濾物料沿著試管壁內側緩慢地添加至超離心試管中，不引入氣泡至溶液中。令填充之試管以手持熱封機密封且在20℃下以302,000g(在50.2 Ti轉子中以50,000rpm)離心17小時。在完成離心步驟後，令試管自超離心機移出且置於生物安全櫃中。令含有產物的試管架設在廢物容器上方的環形支架上。令燈放置在試管的正下方，且在試管上標記空殼體區帶(區帶A為最高區帶)、完全殼體雙區帶(區帶B和區帶C，雙區帶的上及下區帶)及在雙區帶下方的最低區帶。以連接至插入區帶D正下方至試管中間的30mL注射器之18G針移出區帶B、C和D。令收集之物料轉移至1L滅菌PETG瓶。令來自所有離心試管的物料積聚在1L滅菌PETG瓶中，得到超離心(UC)積液。用於CsCl超離心步驟之緩衝液列示於下表中：
Figure 107138852-A0305-02-0157-36
TFF3步驟係使用最終調配緩衝液移出CsCl且濃縮完全載體。切向流過濾系統係與兩個50cm2 300k MWCO再生纖維素膜一起使用。設計TFF3操作之濃縮階段以減少殘留CsCl的濃度及UC積液的體積。一旦達到滲餘物靶體積時，則開始滲濾。令滲餘物以10滲濾體積之TFF3緩衝液滲濾。一旦完成滲濾，則令濃縮之滲餘物通過0.2μm Pall Supor® EKV Sterilizing-Grade Filter(Mini Kleenpak)過濾器轉移至二次錐形管。
執行連續的膜沖洗，自TFF3系統回收載體。令TFF3緩衝液添加至先前保留TFF3滲餘物之初次錐形管中。令此物料通過纖維素膜再循環。在再循環後，令沖洗液通過0.2μm Pall Supor® EKV Sterilizing-Grade Filter(Mini Kleenpak)過濾器轉移至二次錐形管。令TFF3濃縮物與部分積液混合以達成
Figure 107138852-A0305-02-0158-110
4.5×1013vg/mL之藥物物質(積聚之TFF3滲餘物+兩次沖洗液)的最終載體濃度。
執行連續的膜沖洗，使來自TFF3系統的產物回收率最大化。令TFF3緩衝液添加至先前保留TFF3滲餘物及最初的沖洗物料之初次錐形管中。令此物料通過纖維素膜再循環。令二次沖洗液通過0.2μm Pall Supor® EKV Sterilizing-Grade Filter(Mini Kleenpak)過濾器轉移至二次錐形管，直到在二次錐形管中達成確定的重量。最終的濃縮溶液被稱為藥物物質(DS)。
Figure 107138852-A0305-02-0158-37
令DS以Pall Supor® EKV Sterilizing-Grade Filter(Mini Kleenpak)過濾至使用滅菌的一次性組件的1L滅菌玻璃瓶中。在過濾TFF3積液前，令TFF3緩衝液使用蠕動泵通過過濾器且丟棄至廢液沖洗袋中，藉此沖洗過濾器。接著令藥物物質(DS)使用蠕動泵通過經沖洗之過濾器過濾且收集 在1L滅菌玻璃瓶中。基於5×1013vg/mL之DS的靶濃度，令TFF3緩衝液添加至保留DS之二次錐形管中且通過過濾器，以製備稀釋的藥物產物(「DP」)至3.5×1013vg/mL之靶濃度。
用於過濾器沖洗及DS稀釋以製備DP的TFF3緩衝液係由下列的調配物所組成。
Figure 107138852-A0305-02-0159-38
令DP填充至5mL滅菌、即用型Crystal Zenith(CZ)小瓶中，以滅菌、即用型塞子塞住且以滅菌、即用型密封件密封。
實施例13-效力檢定法
藥物產物之相對效力係使用定量性活體內檢定法測量。檢定法係使用經確立之SMA疾病的小鼠模式。育種配對之SMA△7小鼠品系(Jackson Laboratories，#005025)在表型上為正常的，但是彼等後代的~25%對靶向之SMN基因突變為純合子且顯現SMA樣表型。彼等於第5天顯示出肌肉無力的跡象且在後來一周內發展出異常的步態和摔倒的傾向。Jackson Laboratories報告具有SMA樣表型的動物之平均存活期為~15±2天。試驗性研究證實未治療之SMA樣表型的動物具有16.3天中位存活期(幾何平均值；n=3次研 究：每次研究10隻小鼠)。
經靜脈內(IV)輸注投予之生物活性藥物產物得到增加的存活時間，其係以劑量(vg/kg)為函數。藥物產物效力係相對於參考物料(先前批次載體)測量。藥物產物及參考物料之效價(載體基因組/mL；vg/mL)係以液滴數位式聚合酶鏈反應(ddPCR)測定。令載體於食鹽水中稀釋，分別達成三個指定之劑量水平，令其投予具有SMA樣表型的小鼠。
若檢定法通過適合性，則認為檢定結果是可接受的。檢定適合性係由以下者所組成：
4.負對照樣品之允收限度(15±2天，中位存活期)
5.正對照樣品之允收限度(>40天，中位存活期)
6.參考標準中位存活期劑量-反應曲線之允收限度
在此研究中使用先前批次載體(在下文的先前批次)以測定當以五種不同的劑量水平(包括使用0.9%食鹽水溶液之0(零)劑量(未治療組))之藥物產物給藥時於SMA△7小鼠的中位存活期(天)之間的線性相關性。
此係藉由使用各線性迴歸線的y-截距及斜率之比率(亦即參考標準及試驗物品)來完成。相對效力百分比計算係由以下公式(1)描述：%RP=[(試驗物品之y-截距/斜率)÷(參考標準之y-截距/斜率)]×100 (1)
使用△7小鼠模式證實SMA療法(包括藥物產物)之功效。未經治療或經食鹽水處理之對照動物提供可信賴的基線對照，可自此測量產物效力作為增加的中位存活期。藥 物產物的開發工作鑑定三(3)個藉由使用液滴數位式PCR(ddPCR)之基因組效價所測定之劑量(不包括經載體處理之劑量)，當投予之劑量(vg/kg)經對數轉換且以經治療之SMA△7新生小鼠的中位存活期(以天計)繪圖時，該等劑量係以線性相關性影響小鼠模式中的存活期。參考表26關於低、中及高效價標準之標準效價(vg/mL)。另外，TFF緩衝(媒劑)溶液係用於零(0)校準曲線點以及負對照組二者。亦包括證實
Figure 107138852-A0305-02-0161-111
40天存活期的劑量(大於證實中位存活期加倍的劑量)作為正對照組。
Figure 107138852-A0305-02-0161-39
劑量溶液製備(參考表26之稀釋流程實例)
負對照組--使用0.9%食鹽水溶液作為負對照組。
正對照組--使用食鹽水製備1.5×1014vg/kg之試驗物品批號。
參考標準溶液--使用食鹽水溶液製備以表25描述的三種濃度之參考標準批號。
Figure 107138852-A0305-02-0162-40
試驗物品製備--試驗物品係使用食鹽水溶液稀釋。計算稀釋以產生表26中描述之每隻小鼠的50μl總體積之試驗劑量(vg/kg)。稀釋係以10隻小鼠進行，同時以一個額外的體積作為正對照組，其目標為增加經治療之小鼠的最短壽命至
Figure 107138852-A0305-02-0162-112
40天之中位存活期(天)。
對照樣品之允收限度
負對照組(未經治療之小鼠)--用於負對照組之檢定允收限度為SMA△7小鼠符合15±2天之中位存活期。另外，
Figure 107138852-A0305-02-0162-113
10天死亡的任何小鼠被排除在分析之外。若此組使用超過7隻小鼠，則最多可排除2隻在<=10天死亡的小鼠。
正對照組(以標的臨床劑量治療之組)--用於正對照組之檢定允收限度為經治療之小鼠的最短壽命為
Figure 107138852-A0305-02-0162-114
40天之中位存活期。另外，
Figure 107138852-A0305-02-0162-115
10天死亡的任何小鼠被排除在分析之外。若此組使用超過7隻小鼠，則最多可排除2隻在<=10天死亡的小鼠。
參考標準劑量反應曲線之允收限度
檢定適合性標準係以中位存活期(天)對投予之劑量(vg/mL)繪圖之參考標準線性劑量反應曲線測定。
Y-截距/斜率之比--測定參考標準及試驗物品之中位存活期(天)相對於投予之劑量(vg/kg)的線性迴歸曲線。計算各線性迴歸的y-截距對斜率之比。
報告結果
相對效力結果的定性報告--在測定正對照組物料
Figure 107138852-A0305-02-0163-116
40天之單點中位存活期(天)讀值前，評估各檢定法之檢定適合性標準。若正對照組之中位存活期
Figure 107138852-A0305-02-0163-117
40天，則可處置若符合以下標準之試驗物品。
相對效力結果的定量性報告--在定量性測定試驗物品的相對效力前，評估各檢定法之檢定適合性標準。一旦正對照組達到
Figure 107138852-A0305-02-0163-118
40天及代表7.5×1013vg/kg之上標準劑量的小鼠組達到31±3天之中位存活期，則可報告試驗物品之相對效力。試驗物品之相對效力百分比(%RP)係如下使用中位存活期(天)劑量-反應之線性迴歸的y-截距及斜率計算：%RP=100% *[(試驗物品y-截距/斜率)÷(參考標準y-截距/斜率)]
實施例14-用於脊髓性肌肉萎縮症之單一劑量基因替代療法： 劑量研究
脊髓性肌肉萎縮症(SMA)為由編碼運動神經元存活1(SMN1)之基因的喪失或功能障礙引起之嚴重的兒童單基因疾病。此疾病的發病率為10,000個活產嬰兒中約1個， 具有1/54之帶原者頻率(carrier frequency)。SMA係以下運動神經元的退化及喪失為特徵，其導致肌肉萎縮。疾病係基於發作年齡及里程碑成就而分成四種亞型(1至4)。第1型SMA(SMA1)為嬰兒中最嚴重的形式及最常見的死亡基因原因。有兩種SMN形式：SMN1為負責SMN蛋白質功能性生成的主要基因。SMN2在剪接期間優先排除外顯子7，且因此與SMN1相比，僅生產小部分的功能性SMN蛋白質。因此，SMN2套數量修飾疾病表型，且兩套SMN2的存在係與SMA1相關聯。
具有SMN1雙對偶基因缺失及兩套SMN2的嬰兒具有97%之SMA1風險。
SMA1(病史世代研究)之自然病史的最新研究顯示患有此疾病的嬰兒中之症狀發作的中位年齡為1.2個月(範圍0至4個月)，且疾病係以低張症、嬰兒早期的嚴重無力症及沒有支撐就無法坐著為特徵。在具有兩套SMN2之SMA1嬰兒中，死亡或每天需要至少16小時非侵入性通氣經至少連續14天(被認為相當於永久性通氣)之中位年齡為10.5個月。在一組受影響的兒童中，僅25%在13.6個月時沒有永久性通氣支撐而存活，及8%在沒有此支撐而存活20個月。由國家衛生研究院(National Institutes of Health)(NeuroNEXT)資助之涉及具有兩套SMN2的患者之另一項前瞻性多中心病史研究顯示8個月的無氣管切開術之中位存活期(95%之信賴區間，6至17)。所有SMA1患者出生後具有急劇下降的呼吸及吞嚥功能，且最終需要機械式營養補 給(通過鼻胃管或胃造口術管)以維持足夠的營養及降低與吸氣相關的呼吸風險。SMA1患者的症狀發作係在3個月大時出現，大多數患者在12個月大時需要餵食補給。
SMA1患者在運動功能方面亦未達到重要的里程碑且具有下降的功能，如以CHOP INTEND(費城兒童醫院的嬰兒神經肌肉疾患測試)量表(其範圍從0到64，評分越高表示越好的運動功能)、對微小的運動功能變化敏感的工具(諸如四胺的反重力運動)所測量。在34位SMA1患者的病史分析中，除了1位患者以外，其他所有的患者在6個月大後均未達到至少40分。在NeuroNEXT組隊中，CHOP INTEND評分在自6個月大至12個月大平均下降10.7分。
增加運動神經元中的SMN蛋白質含量之治療策略集中於增強SMN2的有效性。一種方法為中樞神經系統遞送紐辛那森(Ionis Pharmaceuticals/Biogen)，其為抑制SMN2中的外顯子7剪接而發展的反義寡核苷酸。此藥物已顯示出改進嚴重的SMA小鼠模式之無力症且使受影響的小鼠之中位壽命自16天增加至25天。在2016年12月，紐辛那森經食品藥物管理局批准用於治療SMA。此藥物係在生命的前2個月內以四次負荷劑量後藉助於重複的鞘內注射而投予。
SMA1之可能的替代治療為基因療法，以一次性靜脈內投予給出，其遞送呈自身互補型腺相關病毒血清型9(scAAV9)的一套SMN。(此重組病毒之編碼區域形成分子內雙股DNA[或自身互補型]模板)。此方法誘發在運動神經元及周邊組織中的SMN表現，其反擊鼠類模式中SMA效 應，且在此模式中以低的載體劑量(每公斤之體重計6.7×1013vg)使平均存活期自15天延長至28.5天及以較高的載體劑量(每公斤計2.0×1014和3.3×1014vg)使平均存活期延長至超過250天。
除了跨越血腦屏障及靶向脊髓的所有區域的中樞神經系統神經元以外，鑑於SMN蛋白質隨處可見的表現及SMA1連同許多細胞類型(例如心臟、胰臟和骨骼肌)一起影響多個系統(例如自主神經系統和腸神經系統、心血管系統和胰臟)，使AAV9介導之基因療法的全身投予可能是有利的。與雜交巨細胞病毒增強子-雞β肌動蛋白啟動子組合之載體的自身互補特徵能夠快速且持續表現SMN。在2014年4月，吾等開展涉及SMA1嬰兒之基因替代療法的研究，嬰兒接受一次性劑量的scAAV9，以在雞β-肌動蛋白啟動子的控制下遞送人運動神經元存活基因(hSMN)(scAAV9.CB.hSMN)(AVXS-101)。
方法
患者及研究程序：出於研究的目的，所有的患者皆患有經基因確診之SMA1、純合子SMN1外顯子7缺失及兩套SMN2。排除在SMN2之外顯子7中具有c.859G→C疾病修飾因子的患者。經選擇之患者顯示出自出生至6個月大發病，其係以如臨床評估測定的低張症伴隨有延遲的動作技能、不良頭部控制、圓肩姿勢及關節過度活動為特徵。患有活動性病毒感染(包括HIV或B或C型肝炎血清學陽性)或 同時患有產生不必要的基因轉移風險之疾病的患者亦排除在研究之外。亦排除在篩選訪視時需要侵入性通氣補給(以正壓的氣管切開術)或脈搏血氧定量法<95%之飽和度的患者。
患者係根據投予之基因治療劑量而參加至兩個組隊中。組隊1的患者接受低劑量(每公斤計6.7×1013vg)且參加5個月的療程；組隊2的患者接受高劑量(每公斤計2.0×1014vg)且參加1年的療程。在給藥後第30天，以組隊1的患者1之IFN-γ ELISpot檢定法檢測出T細胞反應，且顯示每106個周邊血單核細胞(PBMC)的斑點形成細胞(SFC)突然增加，其針對AAV9殼體>50(正常為每106個PBMC計<50個SFC)。普賴蘇濃係以2mg/kg開始且維持35天，直至T細胞反應及血清轉胺酶降低。因此修改了實驗方案，且令患者2至15在投予基因載體前24小時開始接受以每天每公斤計1mg劑量之經口普賴蘇濃經約30天。繼續維持以普賴蘇濃治療，直至AST及ALT酵素含量下降至低於120IU/L及T細胞反應下降至以每106個PBMC計少於100個SFC，根據臨床判斷，此時普賴蘇濃會逐漸減少。
載體係於生理鹽水(以每公斤計約10至20ml)遞送，其在約60分鐘期間內經靜脈內輸注。在入選時，一些患者需要基於父母或主治醫師的優選而選擇以胃造口管或鼻胃管進行腸內餵食。一旦入選研究時，所有需要營養補給的患者皆接受胃造口管的放置且在研究期間不移出管。
結果：主要的結果係根據3級或更高級的任何治療相 關不良事件測定安全性。次要的結果為直到死亡或需要永久性通氣輔助的時間。後者被定義為在沒有急性、可逆性疾病或圍手術期狀態存在下每天至少16小時的呼吸輔助持續至少14天。探索性結果包括運動里程碑成就(特別為獨自坐著)及CHOP INTEND評分。
在應用CHOP INTEND量表時，評分維持超過40分在SMA中被認為具有臨床意義。獨自坐著係根據下列標準評估及分類：根據嬰兒及幼兒發育粗大動作分試驗(Infant and Toddler Development gross motor subtest)之貝莉量表的第22項之獨自坐著至少5秒(「獨自坐著」)；根據世界衛生組織(the World Health Organization)(WHO)標準之獨自坐著至少10秒(「依照WHO標準之獨自坐著」)；及根據上文提及之貝莉量表的第26項之獨自坐著至少30秒(「自主功能性坐著」)。主要的運動里程碑係藉助於獨立評論者以通過互動視頻評估補獲之能力-小型(ACTIVE-mini)檢查患者的視頻記錄來確認。自表面電極記錄在基線及輸注後每6個月的複合肌肉動作電位(CMAP)。肌肉的病理狀態係以電阻抗肌動法(Electrical Impedance Myography)(EIM)定量。
統計分析：對所有的患者進行安全性分析，亦包括在生存期的初步分析(如上文及方案中所定義)及自基線至1個月和3個月之CHOP INTEND量表變化分析中的患者。自基線至每次研究訪視的該等變化係使用重複測量的混合效應模式來分析。混合模式包括組隊和訪視的固定效應及基 線評分的共變量。以組隊2分析里程碑成就及營養和通氣補給。統計分析係使用9.4版的SAS軟體進行。所有與病史世代研究的比較僅為描述性的。
結果
患者：在篩選的16位患者之中有1位被排除，因為持續升高的抗AAV9抗體效價(>1：50)。在此研究中包括的15位患者之中，3位入選低劑量組隊1及12位入選高劑量組隊2。在治療時的患者平均年齡在組隊1為6.3個月(範圍5.9至7.2)及組隊2為3.4個月(範圍0.9至7.9)(表28)。
Figure 107138852-A0305-02-0169-41
存活期及永久性通氣：截至研究結束時，所有患者皆達到至少20個月大且不需要永久性機械通氣；彼等上次的 肺部評定之中位年齡在組隊1為30.8個月及在組隊2為25.7個月。相對之下，病史世代研究中僅8%之患者不需要永久性機械通氣。在29個月大時，組隊1中的一位患者係因為唾液過多而需要永久性通氣。在唾液腺結紮後，使用非侵入性通氣的需求減少25%至每天15小時。
運動功能評定：組隊1和2中的所有患者在CHOP INTEND量表上具有自基線增加的評分且在研究期間維持該等變化。在組隊2中的患者在1個月平均增加9.8分及在3個月平均增加15.4分(兩個比較之P<0.001)；11位患者達到且持續超過40分之評分。在2017年8月7日截止研究時，在組隊1中的患者係自16.3分的平均基線起平均增加7.7分及在組隊2中的患者係自28.2分的平均基線起平均增加24.6分。
在組隊2中的運動里程碑：在組隊2的12位患者中共有11位能夠獨自坐著至少5秒，共有10位能夠獨自坐著至少10秒，及共有9位能夠獨自坐著至少30秒(表31)。共有11位達成頭部控制，9位能翻身及2位能夠夠爬行、拉著站立、獨立站立和獨立行走。11位患者達到說話的能力。在病史世代研究中沒有患者達到任何該等運動里程碑且很少達成說話的能力。
Figure 107138852-A0305-02-0171-42
在組隊2中的肺及營養狀況：在組隊2的12位患者之中，與上一次追蹤訪視時不依賴通氣輔助的7位相比，10 位在基線時不需要非侵入性通氣(表29)。在基線時，7位患者不需要腸內餵食，包括1位患者後來在基因替代療法後需要放置胃造口管，可能與脊柱側彎手術相關聯。在基因替代療法前5位患者接受腸內餵食，在上一次追蹤時，12位患者中有11位已達到或保留獨立吞嚥的能力，且4位患者能夠經口餵食。
安全性：截至研究結束時，在兩個組隊的13位患者中觀察到共56例嚴重的不良事件。根據不良事件常用的術語標準(表30)，在該等事件之中，研究人員係基於實驗室值確定2例事件為治療相關的4級事件。組隊1中的1位患者具有升高的血清胺基轉移酶含量(丙胺酸胺基轉移酶(ALT)之正常範圍上限的31倍及天冬胺酸胺基轉移酶(AST)之正常範圍上限的14倍)，沒有其他肝功能異常(亦即總及間接膽紅素和鹼性磷酸酶)且沒有臨床表現。如上文所述，該等升高經普賴蘇濃治療而減低，其隨後投予其餘患者。組隊2中的一位患者需要額外的普賴蘇濃以減低升高的血清ALT及AST含量(ALT之正常範圍上限的35倍及AST之正常範圍上限的37倍)。在241例不嚴重的不良事件之中，3例被認為與治療相關且由2位患者的無症狀升高的血清胺基轉移酶含量所組成(ALT及AST，均低於正常範圍上限的10倍)，無需以額外的普賴蘇濃治療來解決(表0)。肝功能檢查沒有其他異常。在15位患者之中，14位患有呼吸系統疾病，其經常導致SMA1兒童死亡或需要氣管切開術。
Figure 107138852-A0305-02-0173-43
Figure 107138852-A0305-02-0174-44
在SMA1患者中以單一靜脈內輸注含有編碼SMN之DNA的腺相關病毒載體導致比患有該疾病之病史世代研究更長的存活期。所有15位患者皆超過先前報告的中位存活年齡，具有兩套SMN2的SMA1患者未持續通氣10.5個月。所有的患者亦超過20個月的基準，在此時患有此疾病的患者在沒有永久性通氣下通常僅8%存活。在組隊2的12位患者中4位，除了1位以外的所有患者皆達成運動功能里程碑，其未曾於病史世代研究中報告過。獲得的運動功能具有臨床上的意義，如以餵食(手伸到嘴巴)、坐著和說話所反映。大多數在入選時不需要支持性照護的患者在上一次追蹤訪視時無需營養補給(7位患者中的6位)及通氣補給(10位患者中的7位)。在兩個組隊中，患者的CHOP INTEND量表評分自基線起增加。在組隊2的第一個月內，平均增加為9.8分，與在NeuroNEXT研究的病史世代研究中介於6至 12個月大之間超過10分的平均值下降成對比。
SMN△7小鼠模式中的SMN基因替代療法之臨床前研究顯示以早期治療改進存活期及運動功能，大概在運動神經元仍然完整的時候。在吾等研究中的早期治療之臨床發現反映出在臨床前研究中的方向。在早期治療後，兩位患者能夠在沒有支撐下爬行、站立和行走。該兩位患者具有SMA家族史，這可能歸因於早期診斷。儘管在吾等研究的兩個組隊中的所有患者持續具有改進的運動功能，但是臨床前及臨床數據示意早期治療及SMA之新生兒篩檢的好處。
由AAV基因替代療法引起的嚴重不良事件僅限於2位患者在治療後約3週升高的胺基轉移酶含量而無其他的肝酵素異常；另外兩位患者具有未達到嚴重不良事件定義之截止點(亦即>10倍的正常範圍)的升高含量。升高的肝酵素以普賴蘇濃治療而減低。一位患者係由於抗AAV9抗體的存在而未通過篩選，其與族群的研究一致，該研究示意在兒童和年青人中具有低比率的抗AAV9血清陽性及在40歲以上的人群中具有比率增加的抗AAV9血清陽性。然而，針對病毒之抗體的存在可能是AAV基因替代療法的限制。
此研究係使用單組設計，以病史世代研究作為對照組，當自然病史具有良好的特徵及致命性時，其為有限的選項數目之一。為了入選與已發表之病史研究相似的同型樣品，吾等限制僅入選包括具有雙對偶基因SMN1突變及 兩套SMN2之有症狀的SMA1患者，且不入選在SMN2之外顯子7中具有c.859G→C疾病修飾因子的患者，因為此基因修飾因子預測較溫和的疾病表型。然而，此基因替代療法不必受限於有症狀的患者或具有特定基因組亞型的患者。
總之，在SMA1患者中以一次性靜脈輸注含有編碼SMN的DNA之高劑量腺相關病毒載體導致存活期延長、運動功能改進及CHOP INTEND量表評分增加至先前未曾於此疾病中觀察到的水平。與病史研究相比，該等改進導致需要支持性照護的患者百分比低於在病史研究中的該百分比。在長達2年的追蹤，沒有運動功能效應衰退或臨床消退的報告。一些患者具有短暫及無症狀升高的胺基轉移酶含量。需要進一步的研究以評定基因替代療法在SMA1患者中的長期安全性和耐久性。
實施例15-scAAV9.CB.hSMN之藥物動力學
常規的臨床藥物動力學研究不適用於基因替代治療產品。然而，評定經由體液及廢物自身體排除的載體量之scAAV9.CB.hSMN載體脫落研究為可代替常規的藥物動力學研究而用於基因替代療法的手段。
在以scAAV9.CB.hSMN輸注後的載體脫落係在臨床研究期間以多個時間點研究。每周收集唾液、尿液及糞便樣品至第30天，接著每月收集至第12個月及之後每3個月收集一次。使用來自5位患者的樣品經過第18個月訪視以液滴數位式聚合酶鏈反應進行scAAV9.CB.hSMN載體脫落分 析。分析scAAV9.CB.hSMN載體脫落的所有5位患者皆以1.1×1014vg/kg之治療劑量給藥。
檢測在輸注後的脫落樣品之scAAV9.CB.hSMN。在輸注後第1天於尿液及唾液中的scAAV9.CB.hSMN濃度為體內初始濃度的0.1%至0.01%，之後濃度下降至低於定量限度。在輸注後第1天於糞便中可檢測出體內初始濃度的10%至30%之含量。一位患者在輸注後第14天顯示於糞便中的峰濃度為體內初始濃度的280%。相對之下，3位可取得數據的患者在輸注後第14天顯示濃度為體內初始濃度的<1%，在輸注後經30天濃度下降約4 log(10,000倍)。總體而言，scAAV9.CB.hSMN主要於糞便中自體內清除，且在輸注後第60天於糞便中低於定量限度。
實施例16-非臨床毒物學試驗
動物藥理學：在有病的δ7 SMA小鼠模式(SMN △7小鼠)中輸注scAAV9.CB.hSMN載體後，與未治療之SMN △7小鼠相比，之體重增加、改進扶正行為、存活期係以劑量依賴方式顯著地延長及SMA相關的心臟缺陷恢復至正常。
動物毒物學：在小鼠中靜脈內輸注後，載體及轉基因廣泛地分佈，通常於心臟和肝臟中觀察到最高的表現，及顯著的表現在腦和脊髓中。在順從關鍵的良好實驗室規範(Good Laboratory Practice)(GLP)的3個月小鼠毒物學研究中，毒性的主要靶器官為心臟和肝臟。與scAAV9.CB.hSMN載體相關的發現包含在心室中的劑量相關性發 炎、水腫和纖維化，及在心房中的發炎和血栓形成。在肝臟中的發現包含肝細胞肥大、庫普弗(Kupffer)細胞激活和擴散型肝細胞壞死。在小鼠中未鑑定出與scAAV9.CB.hSMN載體相關的心臟和肝臟發現之最低無害劑量(NoAEL)，且最大耐受劑量經定義為1.5×1014vg/kg，提供相對於1.1×1014vg/kg之建議治療劑量約1.4倍的安全範圍。目前尚未知在小鼠中觀察到的發現對靈長類動物的可轉譯性。
實施例17-兒科患者中的脊髓性肌肉萎縮症
此試驗為評估scAAV9.CB.hSMN載體在經基因測試而確認雙對偶基因SMN1缺失、2套運動神經元存活2(SMN2)、在外顯子7中的c.859G>C修飾呈陰性結果及在6個月大前臨床症狀發作之第1型SMA患者中的安全性及功效之第1期研究。scAAV9.CB.hSMN載體係在0.9至7.9個月大的患者中於單一劑量輸注期間經靜脈內遞送。兩個組隊給藥如下：組隊1(n=3)接受在此研究中所使用的低劑量及組隊2(n=12)接受在此研究中所使用的高劑量(治療劑量：1.1×1014vg/kg)。所報告之研究結果反映組隊2且包括在scAAV9.CB.hSMN載體輸注後24個月內所有患者的追蹤。
死亡率及無事件存活期
存活期及時間對事件分析支持scAAV9.CB.hSMN載體的功效。在組隊2中，所有12位患者(100%)皆超過24個月 大且無事件，與自然病史研究中僅8%之患者相反。當與未治療之患者相比時，這表明以scAAV9.CB.hSMN載體輸注之患者的總體存活期顯著且臨床上有意義地增加。在輸注後2年，沒有患者死亡的報告。
發展運動里程碑
檢查發展運動里程碑；對所有15位患者的評定係經視頻記錄，以容許確認發展運動里程碑的成就。在組隊2中的患者一致地達成且維持關鍵的發展運動里程碑。在給藥後24個月的追蹤，11位患者(91.7%)能夠保持其頭部直立
Figure 107138852-A0305-02-0179-119
3秒且在無支撐下坐著
Figure 107138852-A0305-02-0179-120
5秒，10位患者(83.3%)能夠在無支撐下坐著
Figure 107138852-A0305-02-0179-121
10秒，9位患者(75.0%)能夠在無支撐下坐著
Figure 107138852-A0305-02-0179-122
30秒，2位患者(16.7%)分別能夠獨自站立，以輔助行走和獨自行走。目前入選本研究持續觀察之長期追蹤的組隊2患者維持其發展運動里程碑，有一些患者達成額外的運動里程碑。
Figure 107138852-A0305-02-0180-45
肺部
在基線時未使用非侵入性通氣(NIV)的組隊2的中10位患者之中，7位患者在追蹤24個月時沒有每天使用NIV。幾乎所有患者皆經歷過常見的兒童呼吸道疾病，在第1型SMA兒童中，通常導致氣管切開術或死亡。所有的患者在沒有氣管切開術或需要永久性通氣下於呼吸疾病入院中存活。
營養
亦觀察營養收益。在組隊2中，7位患者在基因替代療法前未接受腸內餵食。該7位患者中之一(1)位在脊柱側彎手術難以恢復後具有營養補給以輔助傷口癒合，但亦經口 餵食。在基因替代療法前接受腸內餵食之組隊2的5位患者中之四(4)位能夠在研究結束時經口餵食；因此，在組隊2的12位患者中共有11位能夠經口餵食，排除第6位。
運動功能(CHOP-INTEND)
接受治療劑量的患者在第1個月及第3個月達到統計學上顯著的運動功能改進；費城兒童醫院神經肌肉疾患嬰兒測試(CHOP INTEND)平均值分別自基線起增加9.8分(n=12，P<0.001)及15.4分(n=12，P<0.001)。
在以cAAV9.CB.hSMN載體輸注之患者中，隨著時間持續改進運動功能。12位組隊2中的11位患者在24個月達成
Figure 107138852-A0305-02-0181-123
50 CHOP INTEND評分。早期干預及劑量似乎對反應有積極影響。在一般的臨床實施中，未經治療的6個月大或更大的第1型SMA兒童在CHOP INTEND上未超過40分。此外，在未經治療的嬰兒之中，據報告該評分在6至12個月大之間平均下降10.7分，隨後成為前瞻性自然病史的一部分。
實施例18-使用qPCR測量在AAV9病毒載體中的殘留宿主細胞DNA 方法
使用此方法以qPCR定量AAV藥物物質(例如AVXS-101)及在過程中之樣品中的殘留hc DNA。每個平盤測試至多六個樣品。qPCR檢定法係使用TaqMan探針進行。 TaqMan探針具有與5'-末端結合之螢光報導子染料及與3'-末端結合之非螢光淬滅劑。雖然探針為完整的，但淬滅劑與報導子染料的鄰近度大大地降低由報導子染料發射的螢光。探針的切割分離報導子染料及淬滅劑，增加報導子螢光。
令經設計以結合人基因組內的重複序列之側翼前置及反置引子添加至反應混合物中，且與存在於樣品及標準物中的靶序列黏合(anneal)。TaqMan螢光探針係黏合在引子位點之間。模板變性、引子黏合及產物延伸的連續循環使靶序列擴增。在擴增循環的延伸步驟期間，Taq DNA聚合酶之核酸外切酶活性自探針釋放報導子染料，自淬滅劑游離出染料，導致螢光發射與模板量成比例。
96槽孔盤的各槽孔之螢光係以qPCR儀器測量。通過另外的PCR循環以增加靶序列的量，且結果使更多的報導子染料自探針釋放及在各連續的PCR循環中釋放更高的螢光。測量螢光訊號到達預定閾值所需之擴增循環次數。此循環稱為閾值循環或CT值。在樣品或標準槽孔中的DNA起始濃度越高，則到達閾值螢光水平所需之PCR循環次數越少及CT值越低。標準曲線係藉由log10(DNA濃度)相對於各標準點所測量之CT值繪圖而確定。使用CT值測定存在於樣品中的DNA量，該測定係藉由使用樣品的各個CT值及求解DNA值。
首先使用Wako DNA Extractor套組(Wako，295-50201)製備樣品。簡言之，令用於測試的樣品充分混合且稀釋 1000倍。令稀釋之樣品分裝至四個試管中(各500μL)且令50μL水添加至其中兩個試管中(未攙料之複製物)，同時令50μL之30,000pg/mL DNA標準物添加至另外兩個試管中(攙料之對照組)。進行蛋白質溶解，其係藉由令20μL N-月桂醯基肌胺酸鈉溶液添加至各試管中，渦旋5秒，接著短暫離心。製備含有肝醣及Pellet Paint(Novagen，70748)之NaI溶液，使得彼等之比為2000：5：4之NaI：肝糖：Pellet Paint。令500μL NaI混合物添加至各試管中且在53℃±1℃下培育15分鐘。移除試管加熱，與900μL異丙醇混合且在室溫下培育15分鐘。接著令試管在18℃下以10,000g離心15分鐘且傾析上清液。令剩餘沉澱物以800μL洗液A清洗，旋轉且再沉澱兩次。最後，令沉澱物以1500μL含有肝醣之驟冷異丙醇洗液清洗，旋轉且再沉澱。令最後的沉澱物再懸浮於500μL無核酸酶之水中。
qPCR係使用resDNA SEQ Human Quantitative套組(Applied Biosystems，A26366)進行。按照套組的說明，反應混合物係藉由令2x Environmental Master Mix、10x Human DNA Assay Mix與負對照物組合而製備。令20μL反應混合物與10μL經製備之樣品混合且添加至PCR盤上的各槽孔中。令各樣品以一式三份鋪盤。令盤以光學黏著膜密封。在熱循環期間，先在95℃下進行熔融10分鐘，接著令樣品在95℃經15秒及60℃經1分鐘之間循環40次。
標準曲線係藉由CT值相對於以log計之DNA量([pg/mL])繪圖而產生。數據擬合由以下公式所給出之直 線：CT值=m×log10(x)+b
其中x=以pg/mL計的標準物濃度，m為斜率及b為y-截距。宿主細胞DNA濃度係使用以上公式自槽孔的CT值反計算，接著以稀釋因子校準。
結果
以qPCR測量之殘留宿主細胞DNA：以先前批次載體為3.7×105pg/mL、以AVXS-101批號600156為0.76×105pg/mL、以AVXS1-101批號600307為0.68×105pg/mL及以AVXS-201 DS為1.3×105pg/mL。
實施例19-以ELISA測量在AAV9病毒載體中的殘留宿主細胞蛋白質(HCP) 方法
在AVXS-101樣品中的宿主細胞蛋白質(HCP)濃度係使用市售酵素連結免疫吸附檢定法(ELISA)套組測量。Cygnus Technologies人胚胎腎293 HCP ELISA套組為固相雙位點酵素免疫檢定法。其係基於直接夾心技術，其中兩種多株抗體係針對HCP之不同的抗原決定簇。在培育期間，令樣品中的HCP與結合至微盤槽孔之抗HCP抗體結合及與溶液中的經過氧化物酶共軛之抗HCP抗體結合。
在培育期後，清洗槽孔以移出何未結合的經酵素共軛之抗體。接著令3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)基質溶液 添加至槽孔中。經結合之過氧化物酶共軛物催化基質中的顏色變化反應。以添加酸終止反應，得到比色終點，其可在450nm下以分光光度法讀值。經水解之基質量係與存在的HCP濃度成正比例。
令欲測試之樣品稀釋以滿足此方法自4ng/mL至200ng/mL的範圍。接著令各樣品在SDB中稀釋2倍(110μL樣品及110μL SDB)且混合。亦製備攙料對照物以檢查一致性。在攙料對照物中，令110μL各樣品與27.5μL之200ng/mL HCP標準物及82.5μL SDB混合。最後，令50μL各標準物、對照物或試驗樣品添加至96槽孔盤的槽孔中且與100μL抗HEK 293-HRP共軛物混合。以所有的條件進行一式三份鋪盤。令盤以密封帶密封且在室溫下以400至600rpm振盪2小時。在培育後，藉由輕彈倒置的盤及吸收毛巾吸乾以移除槽孔中的溶液。令槽孔以洗瓶清洗，快速吸乾且輕拍，不要讓洗液浸泡在槽孔中。重複清洗4次且容許在最後清洗後倒置靜放約20秒以排乾。最後令100μL TMB基質添加至盤的各槽孔中且在室溫下以不攪動培育20至30min。添加100μL終止溶液至各槽孔中以終止反應。令盤在添加終止溶液的45分鐘內裝載至盤讀取機上且在450nm和650nm下讀取盤。
標準物之平均吸光度係相對於標準物之理論HCP濃度以半對數圖繪圖，基於以下公式產生四參數邏輯(4PL)擬合曲線：Y=[(A-D)/(1+(X/C)^B)]+D
其中A為底部漸近線，B為希爾斜率(Hill-slope)，C為相應於兩個漸近線之間的中點吸光值之濃度(ng/mL)，D為頂部漸近線，X為樣品濃度(ng/mL)，Y為吸光度。接著使用標準曲線利用SoftMax Pro軟體測定攙料之樣品對照物及未攙料之試驗樣品中的HCP濃度。試驗僅在假設標準曲線的r2
Figure 107138852-A0305-02-0186-124
0.98、200ng/mL之標準物的平均校準吸光度為
Figure 107138852-A0305-02-0186-125
1.0OD、0ng/mL之標準物的平均校準吸光度為
Figure 107138852-A0305-02-0186-126
0.2OD及超過3個槽孔複製物的校準吸光度之變異係數
Figure 107138852-A0305-02-0186-127
15%時才接受。各樣品之HCP最終濃度係使用以下公式計算：HCP濃度樣品(ng/mL)=稀釋因子x測量之平均HCP濃度(ng/mL)。
結果
以ELISA測量之先前批次載體、AVXS-101批號600156、AVXS1-101批號600307及AVXS-201 DS之殘留宿主細胞蛋白質係低於定量限度(8ng/mL)。
實施例20-以ELISA測量在AAV9病毒載體中的殘留班柔酶 方法
在AAV產物(例如AVXS-101)中的殘留班柔酶濃度係使用市售酵素連結免疫吸附檢定法(ELISA)套組測量。Merck班柔酶核酸內切酶ELISA套組II為固相雙位點酵素免疫檢定法。其係基於直接夾心技術，其中兩種多株抗體係針對班柔酶之不同的抗原決定簇。在培育期間，令樣品中的班 柔酶與結合至微盤槽孔之抗班柔酶抗體結合及與溶液中的經過氧化物酶共軛之抗班柔酶抗體結合。
在培育期後，清洗槽孔以移出任何未結合的經酵素共軛之抗體。接著令3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)基質溶液添加至槽孔中。經結合之過氧化物酶共軛物催化基質中的顏色變化反應。以添加酸終止反應，得到比色終點，其可在450nm下以分光光度法讀值。經水解之基質量係與存在的班柔酶濃度成正比例。
簡言之，令樣品以組合175μL樣品與175μL PBST而稀釋2倍。同時，攙入班柔酶之樣品對照物亦藉由組合175μL樣品與35μL 10ng/ml班柔酶標準物及140μL PBST而製備。令來自套組的預塗佈之ELISA條帶架設在條帶支架中且每槽孔裝載100μL各試驗混合物。關於空白組，以裝載100μL PBST代替樣品。以各條件進行一式三份裝載。令盤密封且在室溫下於盤振盪器上(450rpm)攪動培育2小時±5分鐘。在培育後丟棄內容物，且令盤使用免疫清洗器以添加的~350μL PBST清洗及培育1分鐘，接著翻轉且輕拍在吸收毛巾上。在100μL稀釋的經HRP共軛之抗體添加至各槽孔前，共進行3次清洗。令盤密封且在室溫下於盤振盪器上(450rpm)攪動培育1小時±5分鐘。在培育後丟棄內容物，且令盤使用免疫清洗器以添加的~350μL PBST清洗及培育1分鐘，接著翻轉且輕拍在吸收毛巾上。在100μL TMB基質添加至各槽孔前，共進行3次清洗。令盤密封且令內容物在室溫下於暗處不攪動培育15至40分鐘。添加 100μL 0.2N H2SO4終止溶液至各槽孔中以終止反應。盤之吸光度係在添加終止溶液的45分鐘內使用分光光度計在450nm下測量。
標準物之平均吸光度係相對於標準物之理論班柔酶濃度以半對數圖繪圖，基於以下公式產生四參數邏輯(4PL)擬合曲線：Y=[(A-D)/(1+(X/C)^B)]+D
其中A為底部漸近線，B為希爾斜率，C為相應於兩個漸近線之間的中點吸光值之濃度(ng/mL)，D為頂部漸近線，X為樣品濃度(ng/mL)，Y為吸光度。接著使用標準曲線利用SoftMax Pro軟體測定攙料之樣品對照物及未攙料之試驗樣品中的HCP濃度。試驗僅在假設標準曲線的r2
Figure 107138852-A0305-02-0188-128
0.98、2.5ng/mL之標準物的平均校準吸光度為
Figure 107138852-A0305-02-0188-129
1.0OD、0.10ng/mL之標準物的平均校準吸光度大於PBST空白組之平均OD及超過3個槽孔複製物的校準吸光度之變異係數
Figure 107138852-A0305-02-0188-130
15%時才接受。各樣品之HCP最終濃度係使用以下公式計算：班柔酶濃度樣品(ng/mL)=稀釋因子x測量之平均班柔酶濃度(ng/mL)。
結果
以ELISA測量之先前批次載體、AVXS-101批號600156、AVXS1-101批號600307及AVXS-201 DS之殘留班柔酶濃度係低於定量限度(0.2ng/mL)。
實施例21-以Micro BCA檢定法測量AAV9病毒載體中的蛋白質濃度 方法
在例如AVXS-101的過程中、藥物物質及藥物產物樣品中的蛋白質量係使用2mg/mL牛血清白蛋白(Thermo Fisher Scientific，23209)參考蛋白質標準物及Micro BCA蛋白質檢定套組(Thermo Fisher Scientific，23235)之Micro BCA盤檢定法測量。檢定法係基於用於總蛋白質之比色檢測及定量之清潔劑可相容的二金雞鈉酸(bicinchoninic acid)(BCA)調配物。BCA係檢測當Cu2+在鹼性環境中以蛋白質還原時形成之Cu1+。紫色反應產物係由BCA的兩個分子與一個亞銅離子(Cu1+)之螯合作用而形成，其在562nm展現強吸收，其與增加的蛋白質濃度呈線性關係。
簡言之，標準物係藉由令2mg/mL BSA在稀釋劑中進行連續稀釋(以調配緩衝液(200mM NaCl、20mM Tris、1mM MgCl2、0.001% w/v之普朗尼克F-68、pH 8.0)稀釋20倍)而製備。AVXS-101之試驗樣品亦在水及以稀釋劑中製得的連續稀釋液中稀釋20倍。靶濃度為約7.5μg/mL。工作試劑(WR)係藉由令來自套組的25份Micro BCA試劑A、24份試劑B與1份試劑C混合而製備。令150μL各標準物及試驗樣品以一式三份裝載於96槽孔盤中且與150μL WR混合。令盤密封且在盤振盪器上以300rpm振盪30秒。接著令盤在37℃±2℃下不振盪培育2小時。在培育後，令盤以 1000rpm離心2分鐘以收集濃縮物，且令盤在培育後冷卻15至60min。令盤在盤讀取機中以562nm讀取且以SoftMax Pro分析數據。
標準物之平均吸光度相對於標準物之理論蛋白質濃度以半對數圖繪圖且產生二次擬合。二次擬合係基於以下公式：Y=A+Bx+Cx2
其中A、B、C為曲線擬合參數，x為以μg/mL計之樣品濃度及Y為以OD計之吸光度。試驗僅在假設標準曲線的r2
Figure 107138852-A0305-02-0190-131
0.98、空白組之平均吸光度低於最低標準物(1μg/mL)之平均吸光度及各標準物以超過3個槽孔複製物的吸光度之變異係數
Figure 107138852-A0305-02-0190-132
10%時才接受。接著使用標準曲線測定在試驗樣品中的蛋白質濃度。最終蛋白質濃度係使用以下公式計算：總蛋白質濃度(μg/mL)=稀釋因子x測量之平均蛋白質濃度(μg/mL)。
結果
以Micro BCA測量之總蛋白質濃度：以先前批次載體為每1.0×1013vg/mL計167μg/mL，以AVXS-101批號600156為每1.0×1013vg/mL計179μg/mL、以VXS1-101批號600307為每1.01013vg/mL計176μg/mL、以AVXS-201 DP為每1.0×1013vg/mL計182μg/m及以AVXS-301 DP為每1.0×1013vg/mL計418μg/mL。
實施例22-AVXS-101、AVXS-201及AVXS-301之純度及釋放規格
測試實施例1至4的AVXS-101藥物物質及AVXS-101藥物產物的純度。表32和33顯示該等產物之規格及釋放標準。
Figure 107138852-A0305-02-0191-46
Figure 107138852-A0305-02-0192-47
Figure 107138852-A0305-02-0193-48
AVXS-201及AVXS-301可使用與AVXS-101所述之相同方法製造及純化，例如在實施例1至4中。在生物反應器中生產之各產物批號的規格及釋放標準顯示於表34至36。
Figure 107138852-A0305-02-0194-49
Figure 107138852-A0305-02-0195-50
Figure 107138852-A0305-02-0196-51
以AVXS-201及AVXS-301達成的高純度顯示如本申請案所述之生產及純化AAV病毒載體之方法顯示跨越具有不同酬載之AAV病毒載體的廣泛適用性。
已參考附圖說明實施態樣，應理解本發明不受限於確切的實施態樣，且其中各種改變和修改可由那些熟習此項技術領域者實現而不脫離如所附申請專利範圍定義之本發明及實施態樣的範圍或精神。
示例性實施態樣的列示
1.一種醫藥組成物，其包含：(a)介於1至8×1013之間的載體基因組/ml的經轉基因工程化之小病毒；(b)少於5.0%之空殼體；(c)每1×1013vg/ml計少於40ng/ml之殘留宿主細胞蛋白質；(d)每1×1013vg/ml計少於1.2×106pg/ml之殘留宿主細胞DNA；及(e)1至8×1013載體基因組/mL中至少約80%為功能性。
2.實施態樣1之組成物，其中殘留質體DNA的量包含每1×1013vg計少於1.7×106pg。
3.實施態樣1之組成物，其中小病毒之載體基因組/mL的量包含1.8至2.2×1013載體基因組/ml。
4.一種純化來自哺乳動物宿主細胞培養物的AAV粒子以形成經冷凍之中間藥物物質之方法，其包含步驟：(a)培養已經重組AAV病毒粒子轉染之細胞；(b)在培養期後，自細胞收穫經擴增之病毒粒子；(c)令病毒粒子經由過濾法純化以移出任何完整細胞或細胞碎屑；(d)令來自步驟(c)之溶析液經受切向流過濾法；及(e)令純化之病毒粒子的所得中間製劑冷凍。
5.實施態樣4之方法，其中在收穫步驟期間使用核酸 內切酶。
6.實施態樣5之方法，其中核酸內切酶為班柔酶。
7.實施態樣4之方法，其中純化步驟係使用深層式過濾法，繼而以通過移出大分子污染物和細胞碎屑之過濾器過濾。
8.實施態樣4之方法，其中切向流過濾法步驟係使用纖維素膜。
9.一種純化來自哺乳動物宿主細胞培養物的AAV粒子樣品以形成藥物產物之方法，其包含步驟：(a)酸化及淨化步驟；(b)陽離子交換層析術步驟；(c)切向流過濾法步驟；(d)CsCl超離心步驟以移出空殼體；及(e)切向流過濾法步驟。
10.實施態樣9之方法，其中酸化及淨化步驟包含調整樣品至pH 3.5，且宿主細胞蛋白質及DNA係經由以清潔劑絮凝而移出。
11.實施態樣9之方法，其中陽離子交換管柱包含磺醯基樹脂。
12.實施態樣9之方法，其中切向流過濾法步驟(c)係使用具有300kDa MW之分子量截留的纖維素膜且令陽離子交換步驟的溶析體積減少至少六倍。
13.實施態樣9之方法，其中CsCl超離心步驟移出樣品中的至少80%之空殼體，使用深層式過濾法，繼而以通過 0.45微米過濾器過濾。
14.實施態樣9之方法，其中切向流過濾法步驟(e)係使用具有300kDa MW之分子量截留的纖維素膜。
15.一種治療其有需要之患者中的神經疾病之方法，其包含經靜脈內或鞘內遞送實施態樣1至3中任一者之醫藥組成物，其中小病毒包含自身互補型AAV9基因組，且其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸，且其中疾病為SMA。
16.一種治療其有需要之患者中的神經疾病之方法，其包含經鞘內遞送實施態樣1至3中任一者之醫藥組成物與對比劑，其中小病毒包含自身互補型AAV9基因組，且其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸，其中疾病為SMA，且其中對比劑為安你拍克(omnipaque)180。
17.實施態樣15至16中任一者之方法，其中SMA為第II型、第III型或第IV型SMA。
18.一種治療其有需要之患者中的第II型、第III型或第IV型SMA之方法，其包含經鞘內遞送實施態樣1至3中任一者之醫藥組成物與對比劑，其中小病毒包含自身互補型AAV9基因組，其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸，且其中對比劑為安你拍克180。
19.一種治療其有需要之患者中的第I型SMA之方法，其包含經靜脈內遞送實施態樣1至3中任一者之醫藥組成物，其中小病毒包含自身互補型AAV9基因組，且其中經工程化之轉基因包含SMN多核苷酸。
20.實施態樣19之方法，其中患者為0至9個月大。
21.實施態樣20之方法，其中患者為0至6個月大。
22.實施態樣19之方法，其中兒科患者為至多約8kg之體重。
<110> 瑞士商諾華股份有限公司(Novartis AG)
<120> 用於製備病毒載體之手段及方法與其用途
<130> AVEX-003/001WO
<140> TW 107138852
<141> 2018-11-01
<150> US 62/583,035
<151> 2017-11-08
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2359
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 載體構築體
<400> 1
Figure 107138852-A0305-02-0201-52
Figure 107138852-A0305-02-0202-53
Figure 107138852-A0305-02-0203-54
<210> 2
<211> 294
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Figure 107138852-A0305-02-0203-55
Figure 107138852-A0305-02-0204-56
<210> 3
<211> 736
<212> PRT
<213> 腺相關病毒9
<400> 3
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Figure 107138852-A0305-02-0206-59
Figure 107138852-A0305-02-0207-60
Figure 107138852-A0305-02-0208-61
<210> 4
<211> 1621
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
Figure 107138852-A0305-02-0208-62
Figure 107138852-A0305-02-0209-63

Claims (21)

  1. 一種製造AAV9病毒載體之方法，其包含：a.培養附著型HEK293細胞；b.令該附著型HEK293細胞以質體轉染而能夠生產該AAV9病毒載體，其中該質體包含腺病毒輔助質體(pHELP)、編碼AAV rep與cap基因之質體、及包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸、編碼MeCP2之多核苷酸或編碼SOD1 shRNA之多核苷酸的質體；c.令該附著型HEK293細胞溶解以單離該AAV9病毒載體；d.令(c)之該細胞溶解物酸化及淨化；e.令(d)之該產物使用陽離子交換層析術(CEX)純化；f.令(e)之該產物使用切向流過濾法(TFF)過濾；g.令(f)之該產物於氯化銫(CsCl)緩衝液中超離心；及h.自(g)之該產物收集該AAV9病毒載體。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中a.該AAV9為自身互補型(scAAV)；及/或b.其中步驟(a)包含接種該HEK293細胞於可提供連續的細胞培養基循環的大規模生物反應器中；及/或c.該AAV rep基因為rep2且該AAV cap基因為cap9； 及/或d.包含編碼該SMN蛋白質之多核苷酸的質體包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及AAV2 ITR；及/或e.編碼SMN之該多核苷酸編碼SEQ ID NO：2之SMN蛋白質；及/或f.該AAV9病毒載體包含SEQ ID NO：1；及/或g.該轉染步驟包含令該附著型HEK293細胞與轉染劑聚乙烯亞胺(PEI)接觸；及/或h.該轉染步驟包含令該附著型HEK293細胞與不含有血清、鈣或麩醯胺酸之轉染培養基接觸；及/或i.該溶解步驟包含以班柔酶及Tween補充之溶解緩衝液；及/或j.該方法進一步包含在(d)之酸化步驟之前，冷凍步驟(c)之該細胞溶解物。
  3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中步驟(a)包含以接種密度為8,000至12,000個細胞/cm2接種該HEK293細胞於可提供連續的細胞培養基循環的大規模生物反應器中。
  4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中：a.該酸化步驟包含令該細胞溶解物酸化至3.0至4.0之pH；及/或 b.該超離心係在介於40,000至50,000rpm之間進行；及/或c.該CsCl緩衝液包含約3M CsCl、Tris、MgCl2及泊洛沙姆188，且係介於pH 7.5至8.5之間；及/或d.該細胞溶解物係在該酸化步驟前以Tween培育；及/或e.該淨化步驟包含令該細胞溶解物通過深層式過濾器(depth filter)過濾；及/或f.該CEX包含磺醯基樹脂；及/或g.至少一個TFF步驟包含使用具有300kDa MW之分子量截留的纖維素膜；及/或h.在自該超離心之細胞溶解物收集該AAV9病毒載體後，該空的病毒殼體數量少於該總病毒殼體之7%、少於該總病毒殼體之5%、少於該總病毒殼體之3%或少於該總病毒殼體之1%。
  5. 一種自HEK293細胞培養溶解物純化AAV9病毒載體之方法，其包含下列步驟：a.令該細胞溶解物酸化及淨化；b.令(a)之該產物使用陽離子交換層析術(CEX)純化；c.令(b)之該產物通過切向流過濾法(TFF)過濾；d.令(c)之該產物使用2至4M氯化銫(CsCl)緩衝液超離心； e.自(d)之該產物收集該AAV9病毒載體；及f.在第二TFF步驟中，令(e)之該產物通過切向流過濾法過濾；其中該AAV9病毒載體包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸、編碼MeCP2之多核苷酸或編碼SOD1 shRNA之多核苷酸。
  6. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中：a.該酸化步驟包含令該細胞溶解物酸化至3.0至4.0之pH；及/或b.該超離心係在介於40,000至50,000rpm之間進行；及/或c.該CsCl緩衝液包含3M CsCl、Tris、MgCl2及泊洛沙姆188，且介於pH 7.5至8.5；及/或d.該細胞溶解物係在該酸化步驟前以Tween培育；及/或e.該淨化步驟包含令該細胞溶解物通過深層式過濾器(depth filter)過濾；及/或f.該CEX包含磺醯基樹脂；及/或g.至少一個TFF步驟包含使用具有300kDa MW之分子量截留的纖維素膜；及/或h.在自該超離心之細胞溶解物收集該AAV9病毒載體後，該空的病毒殼體數量少於該總病毒殼體之7%、5%、3%、或1%。
  7. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中：a.令該第二TFF步驟後收集之該AAV9病毒載體貯存在包含Tris、MgCl2、NaCl及泊洛沙姆188之溶液中，且該pH介於pH 7.5至8.5；及/或b.令該第二TFF後收集之該AAV9病毒載體包含少於30μg/g或少於20μg/g之CsCl；及/或c.在該第二TFF後收集的AAV9病毒載體濃度係大於或等於3×1013vg/ml。
  8. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中：該生產之AAV9產量係以每一製造批次超過5×1015vg、或超過8×1015vg、或超過1×1016vg。
  9. 根據申請專利範圍第5項之方法，其中，該生產之AAV9產量係以每一製造批次超過5×1015vg、或超過8×1015vg、或超過1×1016vg。
  10. 一種醫藥組成物，包含根據申請專利範圍第1至9項中任一項之方法所製造之AAV9病毒載體，其中該醫藥組成物包含每1×1013vg/mL計少於2.0×105pg/mL之殘留宿主細胞DNA。
  11. 根據申請專利範圍第10項之醫藥組成物，包含下列中 至少一者：a.每1.0×1013vg計，少於0.09ng之班柔酶，b.少於30μg/g(ppm)之銫，c.20至80ppm之泊洛沙姆188，d.每1.0×1013vg計，少於0.22ng之BSA，e.每1.0×1013vg計，少於6.8×105pg之殘留質體DNA，f.每1.0×1013vg計，少於1.1×105pg之殘留hcDNA，g.每1.0×1013vg計，少於4ng之rHCP，h.pH 7.7至8.3，i.390至430mOsm/kg，j.每一容器少於600個
    Figure 107138852-A0305-02-0215-133
    25μm大小的粒子，k.每一容器少於6000個
    Figure 107138852-A0305-02-0215-134
    10μm大小的粒子，l.1.7×1013至2.3×1013vg/mL之基因組效價，m.每1.0×1013vg計，3.9×108至8.4×1010IU之感染效價，n.每1.0×1013vg計，100至300μg之總蛋白質，o.70至130%之相對效力，或p.少於5%之空殼體。
  12. 一種醫藥組成物，包含：a.介於1至8×1013之間的AAV9病毒載體基因組/mL(vg/mL)；b.少於7%之空病毒殼體(viral capsid)； c.每1×1013vg/mL計，少於100ng/mL之宿主細胞蛋白質；及d.每1×1013vg/mL計，少於2.0×105pg/mL之殘留宿主細胞DNA；其中1至8×1013 AAV9病毒載體基因組/mL中至少80%為功能性，以及其中，該AAV9病毒載體包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸、編碼MeCP2之多核苷酸或編碼SOD1 shRNA之多核苷酸。
  13. 根據申請專利範圍第12項之醫藥組成物，其中：a.該AAV9病毒載體包含經修飾之AAV2 ITR、雞β-肌動蛋白(CB)啟動子、巨細胞病毒(CMV)迅/早期增強子、經修飾之SV40晚期16s內含子、牛生長激素(BGH)多腺苷酸化訊號及未經修飾之AAV2 ITR；及/或b.該AAV9病毒載體包含SEQ ID NO：1；及/或c.該組成物包含介於1.7至2.3×1013 AAV9 vg/mL；及/或d.該組成物為水性醫藥調配物，視需要地，其中：i.該水性醫藥調配物包含Tris緩衝液、MgCl2、NaCl及泊洛沙姆188；及/或ii.該水性醫藥調配物不包含保存劑。
  14. 根據申請專利範圍第13a或13b項之醫藥組成物，其中 該多核苷酸編碼SEQ ID NO：2之SMN蛋白質。
  15. 根據申請專利範圍第13(e)項之醫藥組成物，其中：(i)該Tris緩衝液濃度為10至30nM；(ii)該調配物之pH為7.7至8.3；(iii)該MgCl2濃度為0.5至1.5mM；(iv)該NaCl濃度為100至300mM；(v)該調配物包含0.005% w/v之泊洛沙姆188；或(vi)該水性醫藥調配物具有390至430mOsm/kg之滲透壓度。
  16. 一種根據申請專利範圍第12至15項中任一項之組成物用於製造治療有其需要之患者中的第I型脊髓性肌肉萎縮症(SMA)的藥劑之用途，其中該組成物包含AAV9病毒載體，其包含編碼運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸，且其中該患者：a.為九個月大或更小；b.具有至少2.6kg之體重；c.具有雙對偶基因SMN1無效突變或缺失；及d.具有至少一套(copy)功能性SMN2。
  17. 根據申請專利範圍第16項之用途，其中，a.病毒載體係以1至2.5×1014vg/kg之劑量投予；及/或 b.該患者具有不超過8.5kg之體重；及/或c.該患者在至少一套SMN2基因之外顯子7中不具有c.859G>C取代；及/或d.該組成物係投予到不滿6個月大的患者，或在一或多種選自低張症、延遲的動作技能、不良頭部控制、圓肩姿勢及關節過度活動之SMA症狀發作前投予到患者；及/或e.該病毒載體係於5至20mL/kg、10至20mL/kg、或5.5至6.5mL/kg之Tris緩衝之食鹽水中投予；及/或f.功效係使用CHOP-INTEND量表測定；及/或g.該方法包含投予選自下列所組成之群組的劑量體積：對體重2.6至3.0kg之患者，為16.5mL之劑量；對體重3.1至3.5kg之患者，為19.3mL之劑量；對體重3.6至4.0kg之患者，為22.0mL之劑量；對體重4.1至4.5kg之患者，為24.8mL之劑量；對體重4.6至5.0kg之患者，為27.5mL之劑量；對體重5.1至5.5kg之患者，為30.3mL之劑量；對體重5.6至6.0kg之患者，為33.0mL之劑量；對體重6.1至6.5kg之患者，為35.8mL之劑量；對體重6.6至7.0kg之患者，為38.5mL之劑量；對體重7.1至7.5kg之患者，為41.3mL之劑量；對體重7.6至8.0kg之患者，為44.0mL之劑量；及對體重8.1至8.5kg之患者，為46.8mL之劑量；及/或h.對有其需要之患者經靜脈內或鞘內輸注投予該組成物，視需要地，其中該病毒載體係經45至75分鐘輸注。
  18. 一種套組，其包含小瓶，該小瓶含有5.5mL或8.3mL的AAV9病毒載體，該AAV9病毒載體包含編碼SEQ ID NO：2的運動神經元存活(SMN)蛋白質之多核苷酸且在20mM Tris、1mM MgCl2、200mM NaCl、0.005% w/v之泊洛沙姆188中於pH 7.7至8.3下以2.0×1013vg/mL之濃度調配。
  19. 一種根據申請專利範圍第10至15項中任一項之醫藥組成物用於製造治療患有發病或未發病之第I型脊髓性肌肉萎縮症(SMA)的兒科患者的藥劑之用途。
  20. 一種用於治療患有第I型脊髓性肌肉萎縮症(SMA)的患者之套組，其包含小瓶，該小瓶含有根據申請專利範圍第10至15項中任一項之醫藥組成物。
  21. 一種根據申請專利範圍第1至9項中任一項之方法所製造之AAV9病毒載體，其包含編碼SMN蛋白質之多核苷酸。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020000713A (es) * 2017-07-17 2020-08-31 Spark Therapeutics Inc Metodos de aferesis y sus usos.
WO2019236949A1 (en) * 2018-06-08 2019-12-12 Avexis Inc. Cell-based assay for measuring drug product potency
JP2021534154A (ja) * 2018-08-15 2021-12-09 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドBiogen MA Inc. 脊髄性筋萎縮症のための併用療法
US11999974B2 (en) * 2019-04-10 2024-06-04 Prevail Therapeutics, Inc. Gene therapies for lysosomal disorders
US10801042B1 (en) * 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
WO2021016075A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Recombinase compositions and methods of use
EP4004213A1 (en) 2019-07-25 2022-06-01 Novartis AG Regulatable expression systems
MX2022001561A (es) * 2019-08-08 2022-04-18 Biogen Ma Inc Ensayos de potencia para la produccion de vectores virales.
CN115023506A (zh) * 2020-01-28 2022-09-06 隆萨沃克斯维尔股份有限公司 测定病毒滴度的方法
EP4136231A1 (en) 2020-04-17 2023-02-22 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Use of an orphan motif to increase expression of a heterologous transgene
CN112121179A (zh) * 2020-09-15 2020-12-25 山东兴瑞生物科技有限公司 一种组合物及其在治疗脊髓性肌萎缩症中的应用
CN112251440A (zh) * 2020-10-29 2021-01-22 大连理工大学 一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用
WO2022118237A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Use of a combination of an orphan motif and cpg density to control expression of a heterologous transgene
JPWO2022220273A1 (zh) * 2021-04-15 2022-10-20
EP4377459A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
US20240252684A1 (en) 2021-07-30 2024-08-01 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2023012514A1 (en) * 2021-08-04 2023-02-09 Takeda Pharmaceutical Company, Limited Adeno-associated virus separation on a cation exchanger
CN117980484A (zh) 2021-09-16 2024-05-03 诺华股份有限公司 新颖的转录因子
WO2023061499A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Recombinant adeno-associated viral vectors for treating spinal muscular atrophy
WO2023073526A1 (en) 2021-10-25 2023-05-04 Novartis Ag Methods for improving adeno-associated virus (aav) delivery
WO2023095034A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Novartis Ag Modulators of adeno-associated virus transduction and uses thereof
WO2023214346A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Novartis Ag Novel recombinant aav vp2 fusion polypeptides
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
CN114990162A (zh) * 2022-07-18 2022-09-02 苏州吉纳星辰生物技术有限公司 一种降低aav病毒载体生产中质粒残留的方法
WO2024027632A1 (en) * 2022-08-01 2024-02-08 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Novel plasmid backbone to reduce dna impurities in raav preparation
CN116350801A (zh) * 2022-11-22 2023-06-30 四川至善唯新生物科技有限公司 一种重组腺相关病毒载体的药物组合物及其用途
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011094198A1 (en) * 2010-01-28 2011-08-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Research Institute, Abramson Research Center A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
CN105087650A (zh) * 2007-10-05 2015-11-25 吉尼松公司 使用外周注射aav载体向运动神经元进行广泛基因投送

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173418A (en) 1985-05-10 1992-12-22 Benzon Pharma, A/S Production in Escherichia coli of extracellular Serratia spp. hydrolases
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
ATE260980T1 (de) 1993-11-09 2004-03-15 Targeted Genetics Corp Die erzielung hoher titer des rekombinanten aav- vektors
DK0728214T3 (da) 1993-11-09 2004-11-29 Targeted Genetics Corp Stabile cellelinjer, der er i stand til at udtrykke det adenoassocierede virusreplikationsgen
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
CA2207927A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant aav vectors
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
FR2737730B1 (fr) 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
EP0850313B8 (en) 1995-09-08 2009-07-29 Genzyme Corporation Improved aav vectors for gene therapy
US5910434A (en) 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
CA2995542A1 (en) 1997-09-05 1999-03-11 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of recombinant aav vectors
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
WO2001083692A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
PT2573170T (pt) 2001-12-17 2018-03-26 Univ Pennsylvania Sequências de um vírus adenoassociado (aav) de serotipo 9, vetor contendo as mesmas, e suas utilizações
US9233131B2 (en) 2003-06-30 2016-01-12 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
CA2569244C (en) * 2004-06-01 2017-02-14 Avigen, Inc. Compositions and methods to prevent aav vector aggregation
US8361977B2 (en) 2005-06-23 2013-01-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of SMN2 splicing
US9415121B2 (en) 2008-12-19 2016-08-16 Nationwide Children's Hospital Delivery of MECP2 polynucleotide using recombinant AAV9
PL3305302T3 (pl) 2009-06-17 2019-02-28 Biogen Ma Inc. Kompozycje i sposoby modulacji składania smn2 u pacjenta
DE102012007232B4 (de) 2012-04-07 2014-03-13 Susanne Weller Verfahren zur Herstellung von rotierenden elektrischen Maschinen
CA2877428A1 (en) * 2012-06-21 2013-12-27 Association Institut De Myologie Widespread gene delivery of gene therapy vectors
AU2013296425B2 (en) * 2012-08-01 2018-06-07 Nationwide Children's Hospital, Inc. Intrathecal delivery of recombinant adeno-associated virus 9
EP3020808B1 (en) * 2013-07-11 2019-09-11 Takara Bio Inc. Method for manufacturing adeno-associated virus
HUE050546T2 (hu) 2013-08-27 2020-12-28 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Termékek és eljárások amiotróf laterálszklerózis kezelésére
JP2015092462A (ja) 2013-09-30 2015-05-14 Tdk株式会社 正極及びそれを用いたリチウムイオン二次電池
WO2015141521A1 (ja) 2014-03-21 2015-09-24 株式会社日立国際電気 基板処理装置、半導体装置の製造方法及び記録媒体
WO2016004319A1 (en) * 2014-07-02 2016-01-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for purifying recombinant adeno-associated virus
JP6197169B2 (ja) 2014-09-29 2017-09-20 東芝メモリ株式会社 半導体装置の製造方法
EP3054006A1 (en) * 2015-02-09 2016-08-10 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Recombinant adeno-associated virus particle purification with multiple-step anion exchange chromatography
EP3387138B1 (en) * 2015-12-11 2022-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav9
BR112018070256A2 (pt) * 2016-03-31 2019-01-29 Spark Therapeutics Inc processo de fabricação de raav totalmente escalável à base de colunas
AU2017250298A1 (en) * 2016-04-15 2018-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type II

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105087650A (zh) * 2007-10-05 2015-11-25 吉尼松公司 使用外周注射aav载体向运动神经元进行广泛基因投送
WO2011094198A1 (en) * 2010-01-28 2011-08-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Research Institute, Abramson Research Center A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy

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