CN112251440A - 一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用，其中所述的CRISPR/Cas9基因载体，其是一种表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，其中，聚多巴胺表面修饰有聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，地塞米松通过π‑π共轭负载至聚多巴胺表面，聚乙烯亚胺修饰于聚多巴胺表面，透明质酸通过静电吸附作用在聚多巴胺表面。该CRISPR/Cas9基因载体传递效率高、毒性低，生物安全性好，并且制备方法简单，条件温和，拥有广阔的应用前景。

Description

一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，提供了一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用。

技术背景

人类许多重大疾病的发生均与基因缺陷有关，包括绝大部分遗传病、镰刀型细胞贫血症、糖尿病、肿瘤等。目前传统化疗或手术治疗仍然不能有效治愈这些重大疾病，基因治疗被认为是治疗这些重大疾病的有效手段。CRISPR/Cas9基因编辑技术因高效靶向性、操作简便的优势，成为治疗基因疾病的研究热点。

常用的基因载体有两类：病毒载体与非病毒载体。目前CRISPR/Cas9系统的传递多采用慢病毒载体以提高基因的转染效率，从而确保CRISPR/Cas9系统实现其基因编辑的目的。但是慢病毒载体倾向于插入宿主基因组的高表达区域，有较强的致癌、致突变性，目前已经停止临床应用。同时病毒载体的靶向性不强，制备过程复杂，成本较高等缺陷也限制了其临床应用。非病毒载体的生物安全性与靶向性较高，但是没有基因组整合能力，转染效率较低，表达时效短，无法满足CRISPR/Cas9系统传递的需要。

本发明制备一种新型非病毒基因载体，该载体能将CRISPR/Cas9基因靶向传递至肿瘤细胞，再靶向传递至细胞核，并通过转座子将CRISPR/Cas9基因整合至宿主基因组，实现对目的基因的高效敲除。首先，将CRISPR/Cas9基因克隆至“睡美人”转座子中得到pT2SpCas9重组质粒，然后设计靶向特定基因(如：Nanog基因)的sgRNA并插入pT2SpCas9中得到pT2SpCas9-nanog重组质粒。利用睡美人转座子的转座能力，提高将目的基因插入宿主基因组的整合效率，尤其是对于难以转染的祖细胞、干细胞、生殖细胞等，使转基因表达可以稳定的遗传到子代，提高CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率。为了将pT2SpCas9基因靶向递送至细胞，本发明制备聚多巴胺(Polydopamine，PDA)纳米粒，在其表面修饰聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)。将地塞米松(Dexamethasone，DEX)通过π-π共轭负载至PDA表面，使载体具有细胞核靶向能力。最后通过静电吸附作用将透明质酸(Hyaluronic acid，HA)修饰在PDA表面，使载体具有肿瘤细胞靶向性，得到PDA/DEX-PEI@HA(PDPH)基因载体。该基因载体具有极低的细胞毒性和较高的转染效率，可以将pT2SpCas9重组质粒靶向传递至肿瘤细胞，并靶向传递至细胞核，再将CRISPR/Cas9基因插入细胞基因组中，对靶细胞进行高效的基因编辑。PDPH的生物安全性和转染效率远高于其他传统基因载体，是优秀的CRISPR/Cas9基因传递载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效传递CRISPR/Cas9系统的基因载体、其制备方法及应用，该基因载体可以将CRISPR/Cas9系统靶向传递至目的细胞，并传递至细胞核，再利用转座子将CRISPR/Cas9系统插入宿主基因组，提高其基因编辑的效率。该基因载体传递效率高、毒性低，生物安全性好，并且制备方法简单，条件温和，拥有广阔的应用前景。

第一方面，本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因载体，其是一种表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，其中，聚多巴胺表面修饰有聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，地塞米松通过π-π共轭负载至聚多巴胺表面，聚乙烯亚胺修饰于聚多巴胺表面，透明质酸通过静电吸附作用在聚多巴胺表面。其中，聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸的质量比为5：(2.5-3)：(6-7)：(5-10)。

第二方面，本发明提供了一种如上所述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1、将浓度28％的氨水，无水乙醇与去离子水混合均匀，三者的体积比为2:40:(90～180)，20℃～40℃搅拌20-30分钟；

步骤2、将多巴胺盐酸盐溶解于去离子水中，并滴加至步骤1)中所得混合物溶液中，使得多巴胺盐酸盐的最终浓度为2～7mg/mL，20℃～40℃搅拌反应20-24小时；

步骤3、将步骤2)所得产物在12000-13000rpm下离心40～60分钟，水洗3次，得到聚多巴胺纳米粒；

步骤4、将步骤3)获得的聚多巴胺纳米粒3-6mg溶于10-20ml去离子水中并加入2.5-5mg的地塞米松粉末，搅拌24h得到聚多巴胺/地塞米松水溶液；

步骤5、将步骤4)中所得聚多巴胺/地塞米松水溶液滴加至浓度为10mg/ml聚乙烯亚胺水溶液中，聚多巴胺/地塞米松水溶液与聚乙烯亚胺水溶液的质量比为1:(1～2)搅拌20-24h；可以选择地，聚乙烯亚胺为25k分子量的聚乙烯亚胺或者15k分子量的聚乙烯亚胺；

步骤6、将步骤5)获得的反应混合物装入透析袋中(MWCO＝14000)，在蒸馏水中透析，得到聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液。

步骤7、将1mg/ml透明质酸的水溶液缓慢滴加到步骤6)中获得的聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液中，透明质酸的水溶液与聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液的质量比为1:(0.5～1)，搅拌反应4～6小时，得到目标产物，即上述的CRISPR/Cas9基因载体，表面经修饰的聚多巴胺纳米粒。

第三方面，本发明提供了一种基于上述的CRISPR/Cas9基因载体的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其包括以下步骤：

步骤1、CRISPR/Cas9基因载体的制备

所述的CRISPR/Cas9基因载体为上述的表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，其通过上述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法获得；

步骤2、构建携带特异性sgRNA的“睡美人”转座子CRISPR/Cas9重组质粒

2.1)采用限制性内切酶剪切得到PX459质粒中的CRISPR/Cas9系统基因序列；

2.2)采用PCR方法扩增携带“睡美人”转座子的pT2BH质粒中的“睡美人”转座子基因序列；

2.3)将CRISPR/Cas9系统基因序列与“睡美人”转座子基因序列连接得到pT2SpCas9重组质粒；

2.4)将特异性sgRNA退火后插入步骤2.3)中获得的pT2SpCas9重组质粒中，得到携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒。

步骤3、CRISPR/Cas9基因载体负载携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒

将步骤2)中获得的携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒缓慢加入步骤1)中的CRISPR/Cas9基因载体的中，涡旋振荡，室温孵育20-30min即得CRISPR/Cas9系统转染复合物。

进一步地，步骤2.1)中所述的限制性内切酶为EcoRI和SacII。

进一步地，步骤2.2)中所述的PCR方法扩增的具体步骤为：①92℃反应5min；②92℃反应30s；③56℃反应30s；④68℃反应1min；⑤将步骤②～④重复30个循环；⑥68℃反应15min。所使用的正向引物序列为5’-CCGGAATTCCGGGCTACCAAATACTAATTG-3’；反向引物序列为5’-TCCCCGCGGACAGTCAACTT-3’。

进一步地，步骤2.1)中所获得的CRISPR/Cas9系统基因序列如SEQ ID NO.10所示；步骤2.2)中所获得的“睡美人”转座子序列如SEQ ID NO.9所示。

进一步地，步骤2.4)中所述的特异性sgRNA退火的具体步骤为：①37℃反应30-35min；②以3-5℃/min速度从95℃降至25℃。

进一步地，步骤2.4)中所述的特异性sgRNA包括但不限于nanog基因的sgRNA。

进一步地，步骤3)中携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒与CRISPR/Cas9基因载体的质量比为1:(5～30)。

本发明的有益效果为：载体中的HA，使PDA/DEX-PEI@HA具有肿瘤细胞靶向性；载体中的DEX使PDA/DEX-PEI@HA具有细胞核靶向性；“睡美人”转座子具有强大的转座能力，能将CRISPR/Cas9系统插入宿主基因组。因此PDA/DEX-PEI@HA具有细胞靶向性，细胞核靶向性，基因转座能力，三者协同作用提高CRISPR/Cas9的基因编辑效率，而PDA/DEX-PEI@HA的细胞毒性低，生物安全性高，并且制备方法简单，条件温和，是优秀的CRISPR/Cas9基因传递载体。

附图说明

图1为用PCR方法扩增“睡美人”转座子pT2BH质粒中转座子基因的电泳鉴定图；

图2为用限制性内切酶剪切得到PX459质粒中的CRISPR/Cas9系统的电泳鉴定图；

图3(a)和图3(b)为pT2SpCas9重组质粒的酶切电泳鉴定图，图3(a)EcoRI酶切，图3(b)SacII酶切；

图4(a)和图4(b)为对pT2SpCas9重组质粒进行PCR鉴定图，图4(a)用U6引物进行PCR，图4(b)用pT2BH引物对进行PCR；

图5为pT2SpCas9-Nanog重组质粒的基因测序结果图；

图6(a)至图6(e)为PDPH基因载体的红外光谱图：图6(a)PDA、图6(b)DEX、图6(c)HA、图6(d)PDPH_10K、图6(e)PDPH_25K；

图7(a)至图7(c)为PDPH基因载体的透射电镜图：图7(a)PDA、图7(b)PDPH_25K/DNA、图7(c)PDPH_10K/DNA；

图8为PDPH_10K和PDPH_25K凝胶缓滞图；

图9为PDPH_25K和PDPH_10K的转染效率对比图；

图10为PPH_25K、PDP_25K和PDPH_25K的转染效率对比图；

图11为经过HA抑制后PDPH_25K的转染效率对比图；

图12，其包A-D，为PDPH_25K和PDPH_10K的细胞内分布结果图：图12中的A和B为转染2h后、图12中的C和D为转染4h后；

图13为PEI_10K、PEI_25K、DEX、PDPH_25K和PDPH_10K的细胞毒性结果图；

图14为PDPH_25K传递pT2SpCas9-Nanog后的细胞划痕结果图；

图15为Western Blot检测基因转染后Nanog蛋白的敲除结果图；

图16为PCR法验证pT2SpCas9-Nanog插入宿主基因组的结果图。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

有关本发明的前述及其技术内容、特点与功效，在以下配合参考附图的实施例的详细说明中，将可清楚的呈现。

除非另外说明，本文中的术语“聚多巴胺”指的是由多巴胺在碱性加热条件下自聚所得，在附图中以缩写“PDA”表示。

除非另外说明，本文中的术语“地塞米松”，在附图中以缩写“DEX”表示。

除非另外说明，本文中的术语“PDA-PEI-HA”指的是使用上述聚多巴胺为载体，修饰透明质酸和聚乙烯亚胺所形成的复合物，在附图中以缩写“PPH”表示。

除非另外说明，本文中的术语“PDA/DEX-PEI”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松和聚乙烯亚胺所形成的复合物，在附图中以缩写“PDP”表示。

除非另外说明，本文中的术语“PDA/DEX-PEI@HA”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松并修饰透明质酸和聚乙烯亚胺所形成的复合物，在附图中以缩写“PDPH”表示。

除非另外说明，本文中的术语“PPH_25K”指的是使用上述聚多巴胺为载体，修饰透明质酸和25k分子量的聚乙烯亚胺所形成的复合物。

除非另外说明，本文中的术语“PDP_25K”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松并用25k分子量的聚乙烯亚胺所形成的复合物。

除非另外说明，本文中的术语“PDPH_25K”指的是使用上述聚多巴胺为载体，负载地塞米松并用透明质酸和25k分子量的聚乙烯亚胺所形成的复合物。

实施例1：“睡美人”转座子CRISPR/Cas9重组质粒的构建

1)对pT2BH(购自addgene：#26556)质粒中的“睡美人”转座子序列进行PCR扩增。PCR反应体系为：5ng/μL的pT2BH质粒6μL、5μL的10×BeyoFusion Buffer(with Mg²⁺)、10μL的dNTPs(每种均为2.5mM)、引物各2μL(每种均为10mM)、1μL的Fusion聚合酶(2.5U/μL)以及24μL的灭菌水。

pT2BH引物序列如下：

pT2BH-F：5’-CCGGAATTCCGGGCTACCAAATACTAATTG-3’(SEQ ID NO.1)

pT2BH-R：5’-TCCCCGCGGACAGTCAACTT-3’(SEQ ID NO.2)

PCR反应程序为：

①92℃反应5min；②92℃反应30s；③56℃反应30s；④68℃反应1min；⑤将步骤②～④重复30个循环；⑥68℃反应15min。

经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR扩增所得“睡美人”转座子序列长度为3.3kb，具体序列为除去345bp到531bp之间剩余的全部序列(SEQ ID NO.9)，结果如图1所示。

2)对“睡美人”转座子的PCR扩增产物和PX459质粒(购自addgene：#62988)进行双酶切。酶切反应体系为：PX459质粒或者PCR扩增产物1μg，2μL的10×Buffer(T)，EcoRI和SacII各1μL，2μL的0.1％BSA，9μL的灭菌水，在37℃水浴锅中反应2h。

所得的双酶切产物用凝胶电泳鉴定，并切胶回收与纯化。结果如图2所示，PX459质粒酶切得到CRISPR/Cas9基因的长度为6.47kb(SEQ ID NO.10)，“睡美人”转座子基因长度为3.3kb。

3)双酶切产物连接得到重组质粒。连接反应体系如下：“睡美人”转座子的PCR后的双酶切产物50ng，PX459质粒的双酶切产物250ng，10×T4连接酶buffer 5μL，T4连接酶1μL，10μL的灭菌水。上述体系在4℃下反应12h，即得连接产物。将其转化至感受态细胞中，在37℃下培养过夜。取若干转化后的菌落加入10ml的含有氨苄青霉素的液体LB培养基中在250rpm，37℃条件下振荡培养过夜后提取质粒，即得pT2SpCas9重组质粒，其长度为9.8kb。

4)pT2SpCas9重组质粒的鉴定。

首先，用EcoRI或SacII对pT2SpCas9进行酶切鉴定，酶切反应体系为：pT2SpCas9 1μg，10×Buffer(T)2μL，EcoRI或SacII 1μL，灭菌水9μL。将酶切反应体系在37℃水浴中反应2h，用凝胶电泳鉴定，以pT2BH、PX459质粒作为对照。结果如图3(a)，图3(b)所示，由于pT2SpCas9中EcoRI和SacII的酶切位点均只有一个，所得酶切产物为9.8kb，与pT2BH、PX459质粒的酶切产物不同，因此可判断重组质粒制备成功。

然后用PCR方法对重组质粒pT2SpCas9中的CRISPR/Cas9系统序列以及“睡美人”转座子序列进行验证，分别使用U6引物和pT2BH引物。PCR反应体系为：重组质粒10ng，5μL的10×Beyo Fusion Buffer(with Mg²⁺)，10μL的dNTPs((每种均为2.5mM))，引物对各2μL(每种均为10mM)，1μL的Fusion聚合酶(2.5U/μL)，8μL灭菌水。

U6引物的序列如下：

U6-F：5’-CCCAAGCTTAGAATTGGCGCACGC-3’(SEQ ID NO.3)

U6-R：5’-GGACTAGTGCGAGGGCCTATTTCCC-3’(SEQ ID NO.4)

用U6引物进行的PCR反应程序为：①94℃反应5min；②94℃反应30s；③57℃反应30s；④72℃反应90s；⑤将步骤②～④重复30个循环；⑥72℃反应15min。

结果如图4(a)所示，扩增得到长度为414bp的基因片段，说明pT2SpCas9中含有CRISPR/Cas9系统的相关序列。

pT2BH引物的序列如上所述。

用pT2BH引物进行的PCR反应程序为：

①92℃反应5min；②92℃反应30s；③56℃反应30s；④68℃反应1min；⑤将步骤②～④重复30个循环；⑥68℃反应15min。

结果如图4(b)所示，扩增出的序列长度为3.3kb，说明pT2SpCas9含有“睡美人”转座子的相关序列，因此可判断重组载体制备成功。

(2)pT2SpCas9-Nanog质粒的制备

本发明以Nanog基因为例，构建靶向Nanog基因的pT2SpCas9-Nanog质粒，验证其基因编辑效率。靶向Nanog基因的sgRNA序列为：

Nanog-sgRNA-F：5’-CACCGGTAGCTGAGGTTCAGGATGT-3’(SEQ ID NO.5)

Nanog-sgRNA-R：5’-AAACACATCCTGAACCTCAGCTACC-3’(SEQ ID NO.6)

将上述合成的sgRNA进行退火及磷酸化，退火反应体系为：两条sgRNA各1μL(100uM)，T4 PNK酶1μL，10×Buffer 1μL，灭菌水6μL。反应程序为：①37℃反应30min；②95℃→25℃(5℃/min)，得到Nanog-sgRNA。

用BbsI内切酶对pT2SpCas9质粒进行酶切，酶切反应体系为：pT2SpCas9质粒1μg，10×Buffer(G)2μL，BbsI限制性核酸内切酶1μL，灭菌水12μL。将反应体系在37℃水浴条件下反应2h，得到酶切产物。

取上述酶切产物50ng，Nanog-sgRNA(1：200稀释)1μL，T4连接酶1μL，10×Buffer 1μL，灭菌水3μL，在4℃下反应16h，得到pT2SpCas9-Nanog。

对pT2SpCas9-Nanog进行基因测序鉴定，结果如图5所示，表明Nanog-sgRNA成功插入pT2SpCas9，成功得到pT2SpCas9-Nanog质粒。

实施例2：PDA/DEX-PEI@HA(PDPH)纳米粒的制备

将氨水(浓度28％)，无水乙醇与去离子水混合均匀，三者的体积比为2:40:(90～180)，20℃～40℃搅拌30分钟。将多巴胺盐酸盐溶解于去离子水中，滴加至上述混合物溶液中(多巴胺盐酸盐的最终浓度为2～7mg/mL)，20℃～40℃搅拌反应24小时，将产物在13000rpm下离心40～60分钟，水洗3次，得到PDA纳米粒。将上述获得的PDA纳米粒(3-6mg)溶于10-20ml去离子水中并加入2.5-5mg的DEX粉末，搅拌24h得到PDA/DEX。将所得PDA/DEX滴加至PEI_25K或PEI_10K的水溶液(浓度10mg/ml)中，PDA/DEX与PEI的质量比为1:(1～2)，搅拌24h，将反应混合物装入透析袋中(MWCO＝14000)，在蒸馏水中透析72小时，得到PDA/DEX-PEI。将HA的水溶液(1mg/ml)缓慢滴加到PDA/DEX-PEI中，HA与PDA/DEX-PEI的质量比为1:(0.5～1)，搅拌反应4～6小时，得到目标产物PDA/DEX-PEI@HA。

在制备PDPH时不加入DEX即得到PPH，PDP为制备PDPH时未加入HA的产物，PP为制备PDPH时未加入DEX和HA的产物。以PPH，PDP，PP作为PDPH的对照。

实施例3：PDPH/pT2SpCas9-Nanog转染复合物的制备

将pT2SpCas9-Nanog缓慢加入PDA/DEX-PEI@HA中，两者的质量为1:(5～30)，涡旋振荡，室温孵育30min即得。

图6(a)至图6(e)为本发明实施例2中制备所得PDA/DEX-PEI@HA的红外光谱图，图6(a)为PDA，图6(b)为DEX，图6(c)为HA，图6(d)为PDPH_10K，图6(e)为PDPH_25K。图谱显示CH₂骨架的特征峰位置为2924cm^-1和2890cm^-1，透明质酸中C-O-C基团的特征峰位置为1151cm^-1左右，在以上两种不同分子量(PDPH_25K和PDPH_10K)中均有体现，即验证了DEX，PEI，HA的成功修饰。

图7(a)至图7(c)为本发明实施例3中制备所得PDPH_25K和PDPH_10K与DNA复合物的透射电镜图，其中图7(a)为PDA，图7(b)为PDPH_25K与DNA复合物，图7(c)为PDPH_10K与DNA复合物。PDA的平均粒径在110nm左右，PDPH_25K和PDPH_10K与DNA复合物的平均粒径约为120nm左右，表1为动态光散射法(DLS)测定PDPH与DNA在不同质量比时的粒径和电位结果。

表1：不同质量比的PDPH/DNA复合物的粒径和电位结果

图8为本发明实施例3中制备所得PDPH_25K和PDPH_10K的DNA凝胶缓滞图，每孔加入1μgDNA，并按照不同质量比加入PDPH_25K和PDPH_10K，结果说明PDPH_25K和PDPH_10K与DNA的质量比大于4：1时，能完全负载DNA，进行有效的基因传递。

实施例4：转染效率测定

(1)PDPH_25K和PDPH_10K的转染效率测定

将HeLa细胞接种于24孔板中密度为2.5×10⁵个细胞/孔，培养24h后，取2μgpEGFP-N1质粒与PDPH_25K和PDPH_10K按5：1，10：1，15：1，20：1的质量比,分别孵育30分钟，用500μl不含血清的培养基稀释并加入孔中；继续孵育24h后，裂解细胞，取细胞内总蛋白，用酶标仪于488nm波长激发，在520nm波长处检测荧光强度。以下所有转染效率测定的实验步骤均与该实施例同。结果如图9所示，PDPH_25K的转染效率明显高于PDPH_10K，PDPH_25K与DNA的质量比为10：1时，转染效率最高。

(2)PPH_25K、PDP_25K和PDPH_25K的转染效率对比

用PDPH_25K转染基因至HeLa细胞，并用PPH_25K、PDP_25K作为对照。结果如图10所示，PDPH_25K的转染效率明显高于PPH_25K和PDP_25K，说明HA和DEX能显著提高纳米粒的转染效率，这是由于HA具有肿瘤细胞靶向作用，DEX具有细胞核靶向作用，能够将目的基因靶向传递至靶细胞和细胞核，提高传递效率。

(3)HA抑制后PDPH_25K的转染效率

本发明使用4mg/ml的HA与HeLa细胞预培养4小时，再用PDPH_25K进行细胞转染。结果如图11所示，用HA封闭HeLa细胞上的HA受体后，PDPH_25K的转染效率显著降低，证明PDPH_25K中的HA具有肿瘤细胞靶向性。

实施例5：PDPH_25K和PDPH_10K的细胞内分布结果图

将HeLa细胞接种于24孔板中，密度为2.5×10⁵个细胞/孔，培养24h。将DNA用FAM荧光标记，然后按照实施例3的方法，将纳米粒与DNA-FAM混合制备(a)PDP_10K/DNA、(b)PDPH_10K/DNA、(c)PDP_25K/DNA、(d)PDPH_25K/DNA、(e)PP_10K/DNA、(f)PPH_10K/DNA、(g)PP_25K/DNA、(h)PPH_25K/DNA复合物，然后在细胞中分别加入以上复合物，再继续培养2h(图12中的A，图12中的B)或4h(图12中的C，图12中的D)，用激光共聚焦显微镜观察。结果表明，含有DEX的PDP_10K、PDP_25K、PDPH_10K、PDPH_25K纳米粒能够将DNA传递至细胞核(如图中箭头所指)；而不含有DEX的PP_10K、PP_25K、PPH_10K、PPH_25K纳米粒没有将DNA传递至细胞核。相比其它纳米粒，同时含有DEX和HA的PDPH_10K、PDPH_25K纳米粒，能将更多的DNA传递至细胞核。转染4h的处理组中细胞核的荧光强度明显高于转染2h的处理组。这说明DEX具有细胞核靶向性，HA具有细胞靶向性，且随着转染时间的增加，DNA的摄取明显增加。

实施例6：PDPH的细胞毒性

将HeLa细胞接种于96孔板中，密度为5×10³个细胞/孔，培养24h后分别加入1、10、20、50、100μg/mL的PEI_25K、PEI_10K、DEX、PDPH_25K、PDPH_10K；孵育48h后加入20μL MTT继续孵育4h，弃去培养液，用100μL DMSO溶解紫色结晶，用酶标仪于492nm下读取OD值，并计算细胞存活率。结果如图13所示，在检测浓度内，PDPH_25K和PDPH_10K均没有毒性，细胞活性都大于80％的，而PEI_25K、PEI_10K具有明显的细胞毒性，说明PDPH的毒性低，具较高的生物相容性，适合临床应用。

实施例7：细胞划痕实验

将HeLa细胞接种于24孔板中，密度为2.5×10⁵个细胞/孔，培养24h后，取2μgpT2SpCas9-Nanog质粒加入20μg PDPH_25K的水溶液，涡旋振荡，室温孵育30分钟，用500μl无血清培养基稀释后，与HeLa细胞孵育24h，然后换为含2％血清的培养基，对细胞进行划痕处理，继续培养细胞，在0h，6h，12h，24h进行拍照对比。结果如图14所示，未使用PDPH_25K/pT2SpCas9-Nanog转染的空白对照组在24h后细胞划痕宽度明显减少，说明细胞具有迁移能力。而经过PDPH_25K/pT2SpCas9-Nanog转染的细胞，在敲除Nanog基因后，未观察到明显的细胞愈合现象，细胞已经不具备迁移能力。

实施例8：Western Blot检测Nanog基因的敲除

将HeLa细胞接种于24孔板中，密度为2.5×10⁵个细胞/孔，培养24h后，取pT2SpCas9-Nanog质粒2μg加入20μg PDPH_25K或PDPH_10K，涡旋振荡，室温孵育30分钟，用500μl无血清培养基稀释后，加入细胞中孵育48h，裂解细胞并提取细胞总蛋白，通过WesternBlot检测细胞内Nanog蛋白的含量。结果如图15所示，相比于空白对照组，PDPH_25K或PDPH_10K转染组的Nanog基因表达明显降低，说明用PDPH传递pT2SpCas9-Nanog后，能够有效敲除Nanog基因，导致Nanog蛋白表达水平显著降低。

实施例9：PCR法验证pT2SpCas9-Nanog插入宿主基因组

将HeLa细胞接种于24孔板中密度为2.5×10⁵个细胞/孔，培养24h后，取pT2SpCas9-Nanog质粒2μg加入20μg PDPH_25K的水溶液中，涡旋振荡，室温孵育30分钟，用500μl无血清培养基稀释后，加入细胞中孵育48h，裂解细胞并提取细胞基因组DNA，用PCR法检测细胞基因组中是否插入了CRISPR/Cas9基因。

PCR反应体系为：细胞基因组DNA 150ng，引物各1.6μL(10μM)，Taq DNA聚合酶0.1μL，dNTP 1.6μL，10×Buffer 2μL，灭菌水12μL。

PCR引物为：

U6-F-2:5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC-3’(SEQ ID NO.7)

U6-R-2:5’-ATTTGTCTGCAGAATTGGCGCAC-3’(SEQ ID NO.8)

PCR反应程序为：①94℃反应3min；②94℃反应30s；③54℃反应30s；④72℃反应45s；⑤将步骤②～④重复30个循环；⑥72℃反应15min。

结果如图16所示，用PDPH_25K仅转染pT2SpCas9质粒的对照组，细胞基因组中未扩增出CRISPR/Cas9基因的相关条带，说明CRISPR/Cas9基因没有被插入细胞基因组中；而用PDPH_25K转染pT2SpCas9+SB11(睡美人转座酶)的实验组扩增得到长度410bp的片段，符合预期，说明转座子能够将CRISPR/Cas9基因插入细胞基因组内，从而提高其基因编辑效率。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种CRISPR/Cas9基因载体、其制备方法及应用

<130> 2020

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pT2BH-F

<400> 1

ccggaattcc gggctaccaa atactaattg 30

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pT2BH-R

<400> 2

tccccgcgga cagtcaactt 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> U6-F

<400> 3

cccaagctta gaattggcgc acgc 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> U6-R

<400> 4

ggactagtgc gagggcctat ttccc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanog-sgRNA-F

<400> 5

caccggtagc tgaggttcag gatgt 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nanog-sgRNA-R

<400> 6

aaacacatcc tgaacctcag ctacc 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> U6-F-2

<400> 7

gagggcctat ttcccatgat tccttc 26

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> U6-R-2

<400> 8

atttgtctgc agaattggcg cac 23

<210> 9

<211> 3372

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> "睡美人"转座子序列

<400> 9

tgagtgtatg taaacttctg acccactggg aatgtgatga aagaaataaa agctgaaatg 60

aatcattctc tctactatta ttctgatatt tcacattctt aaaataaagt ggtgatccta 120

actgacctaa gacagggaat ttttactagg attaaatgtc aggaattgtg aaaaagtgag 180

tttaaatgta tttggctaag gtgtatgtaa acttccgact tcaactgtat agggatcctc 240

tagctagagt cgacctcgag ggggggcccg gtacccagct tttgttccct ttagtgaggg 300

ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 360

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 420

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 480

ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 540

gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 600

gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 660

ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 720

ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 780

cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 840

ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 900

tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 960

gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 1020

tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 1080

gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 1140

tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 1200

ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 1260

agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 1320

gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 1380

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 1440

agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 1500

atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 1560

cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 1620

ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 1680

agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 1740

tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 1800

gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 1860

caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 1920

ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 1980

gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 2040

tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 2100

tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 2160

cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 2220

cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 2280

gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 2340

atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 2400

agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 2460

ccccgaaaag tgccacctga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 2520

gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 2580

ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 2640

cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt 2700

gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 2760

tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 2820

gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 2880

ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttccatt 2940

cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 3000

gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 3060

cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgagcgcgc gtaatacgac tcactatagg 3120

gcgaattgga gctcggatcc ctatacagtt gaagtcggaa gtttacatac acttaagttg 3180

gagtcattaa aactcgtttt tcaactactc cacaaatttc ttgttaacaa acaatagttt 3240

tggcaagtca gttaggacat ctactttgtg catgacacaa gtcatttttc caacaattgt 3300

ttacagacag attatttcac ttataattca ctgtatcaca attccagtgg gtcagaagtt 3360

tacatacact aa 3372

<210> 10

<211> 6478

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CRISPR/Cas9基因序列

<400> 10

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 60

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 120

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 180

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 240

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 300

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 360

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 420

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 480

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 540

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 600

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 660

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 720

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 780

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 840

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 900

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtg 960

agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct gttagagaga 1020

taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg tgacgtagaa 1080

agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata 1140

tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac 1200

gaaacaccgg gtcttcgaga agacctgttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg 1260

ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttgt tttagagcta 1320

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg tttttagcgc gtgcgccaat tctgcagaca 1380

aatggctcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 1440

caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 1500

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 1560

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt gtgcccagta 1620

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 1680

catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc cctccccacc 1740

cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg cggggggggg 1800

gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag 1860

aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg 1920

gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgacgct 1980

gccttcgccc cgtgccccgc tccgccgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga 2040

ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc 2100

tgagcaagag gtaagggttt aagggatggt tggttggtgg ggtattaatg tttaattacc 2160

tggagcacct gcctgaaatc actttttttc aggttggacc ggtgccacca tggactataa 2220

ggaccacgac ggagactaca aggatcatga tattgattac aaagacgatg acgataagat 2280

ggccccaaag aagaagcgga aggtcggtat ccacggagtc ccagcagccg acaagaagta 2340

cagcatcggc ctggacatcg gcaccaactc tgtgggctgg gccgtgatca ccgacgagta 2400

caaggtgccc agcaagaaat tcaaggtgct gggcaacacc gaccggcaca gcatcaagaa 2460

gaacctgatc ggagccctgc tgttcgacag cggcgaaaca gccgaggcca cccggctgaa 2520

gagaaccgcc agaagaagat acaccagacg gaagaaccgg atctgctatc tgcaagagat 2580

cttcagcaac gagatggcca aggtggacga cagcttcttc cacagactgg aagagtcctt 2640

cctggtggaa gaggataaga agcacgagcg gcaccccatc ttcggcaaca tcgtggacga 2700

ggtggcctac cacgagaagt accccaccat ctaccacctg agaaagaaac tggtggacag 2760

caccgacaag gccgacctgc ggctgatcta tctggccctg gcccacatga tcaagttccg 2820

gggccacttc ctgatcgagg gcgacctgaa ccccgacaac agcgacgtgg acaagctgtt 2880

catccagctg gtgcagacct acaaccagct gttcgaggaa aaccccatca acgccagcgg 2940

cgtggacgcc aaggccatcc tgtctgccag actgagcaag agcagacggc tggaaaatct 3000

gatcgcccag ctgcccggcg agaagaagaa tggcctgttc ggaaacctga ttgccctgag 3060

cctgggcctg acccccaact tcaagagcaa cttcgacctg gccgaggatg ccaaactgca 3120

gctgagcaag gacacctacg acgacgacct ggacaacctg ctggcccaga tcggcgacca 3180

gtacgccgac ctgtttctgg ccgccaagaa cctgtccgac gccatcctgc tgagcgacat 3240

cctgagagtg aacaccgaga tcaccaaggc ccccctgagc gcctctatga tcaagagata 3300

cgacgagcac caccaggacc tgaccctgct gaaagctctc gtgcggcagc agctgcctga 3360

gaagtacaaa gagattttct tcgaccagag caagaacggc tacgccggct acattgacgg 3420

cggagccagc caggaagagt tctacaagtt catcaagccc atcctggaaa agatggacgg 3480

caccgaggaa ctgctcgtga agctgaacag agaggacctg ctgcggaagc agcggacctt 3540

cgacaacggc agcatccccc accagatcca cctgggagag ctgcacgcca ttctgcggcg 3600

gcaggaagat ttttacccat tcctgaagga caaccgggaa aagatcgaga agatcctgac 3660

cttccgcatc ccctactacg tgggccctct ggccagggga aacagcagat tcgcctggat 3720

gaccagaaag agcgaggaaa ccatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tggacaaggg 3780

cgcttccgcc cagagcttca tcgagcggat gaccaacttc gataagaacc tgcccaacga 3840

gaaggtgctg cccaagcaca gcctgctgta cgagtacttc accgtgtata acgagctgac 3900

caaagtgaaa tacgtgaccg agggaatgag aaagcccgcc ttcctgagcg gcgagcagaa 3960

aaaggccatc gtggacctgc tgttcaagac caaccggaaa gtgaccgtga agcagctgaa 4020

agaggactac ttcaagaaaa tcgagtgctt cgactccgtg gaaatctccg gcgtggaaga 4080

tcggttcaac gcctccctgg gcacatacca cgatctgctg aaaattatca aggacaagga 4140

cttcctggac aatgaggaaa acgaggacat tctggaagat atcgtgctga ccctgacact 4200

gtttgaggac agagagatga tcgaggaacg gctgaaaacc tatgcccacc tgttcgacga 4260

caaagtgatg aagcagctga agcggcggag atacaccggc tggggcaggc tgagccggaa 4320

gctgatcaac ggcatccggg acaagcagtc cggcaagaca atcctggatt tcctgaagtc 4380

cgacggcttc gccaacagaa acttcatgca gctgatccac gacgacagcc tgacctttaa 4440

agaggacatc cagaaagccc aggtgtccgg ccagggcgat agcctgcacg agcacattgc 4500

caatctggcc ggcagccccg ccattaagaa gggcatcctg cagacagtga aggtggtgga 4560

cgagctcgtg aaagtgatgg gccggcacaa gcccgagaac atcgtgatcg aaatggccag 4620

agagaaccag accacccaga agggacagaa gaacagccgc gagagaatga agcggatcga 4680

agagggcatc aaagagctgg gcagccagat cctgaaagaa caccccgtgg aaaacaccca 4740

gctgcagaac gagaagctgt acctgtacta cctgcagaat gggcgggata tgtacgtgga 4800

ccaggaactg gacatcaacc ggctgtccga ctacgatgtg gaccatatcg tgcctcagag 4860

ctttctgaag gacgactcca tcgacaacaa ggtgctgacc agaagcgaca agaaccgggg 4920

caagagcgac aacgtgccct ccgaagaggt cgtgaagaag atgaagaact actggcggca 4980

gctgctgaac gccaagctga ttacccagag aaagttcgac aatctgacca aggccgagag 5040

aggcggcctg agcgaactgg ataaggccgg cttcatcaag agacagctgg tggaaacccg 5100

gcagatcaca aagcacgtgg cacagatcct ggactcccgg atgaacacta agtacgacga 5160

gaatgacaag ctgatccggg aagtgaaagt gatcaccctg aagtccaagc tggtgtccga 5220

tttccggaag gatttccagt tttacaaagt gcgcgagatc aacaactacc accacgccca 5280

cgacgcctac ctgaacgccg tcgtgggaac cgccctgatc aaaaagtacc ctaagctgga 5340

aagcgagttc gtgtacggcg actacaaggt gtacgacgtg cggaagatga tcgccaagag 5400

cgagcaggaa atcggcaagg ctaccgccaa gtacttcttc tacagcaaca tcatgaactt 5460

tttcaagacc gagattaccc tggccaacgg cgagatccgg aagcggcctc tgatcgagac 5520

aaacggcgaa accggggaga tcgtgtggga taagggccgg gattttgcca ccgtgcggaa 5580

agtgctgagc atgccccaag tgaatatcgt gaaaaagacc gaggtgcaga caggcggctt 5640

cagcaaagag tctatcctgc ccaagaggaa cagcgataag ctgatcgcca gaaagaagga 5700

ctgggaccct aagaagtacg gcggcttcga cagccccacc gtggcctatt ctgtgctggt 5760

ggtggccaaa gtggaaaagg gcaagtccaa gaaactgaag agtgtgaaag agctgctggg 5820

gatcaccatc atggaaagaa gcagcttcga gaagaatccc atcgactttc tggaagccaa 5880

gggctacaaa gaagtgaaaa aggacctgat catcaagctg cctaagtact ccctgttcga 5940

gctggaaaac ggccggaaga gaatgctggc ctctgccggc gaactgcaga agggaaacga 6000

actggccctg ccctccaaat atgtgaactt cctgtacctg gccagccact atgagaagct 6060

gaagggctcc cccgaggata atgagcagaa acagctgttt gtggaacagc acaagcacta 6120

cctggacgag atcatcgagc agatcagcga gttctccaag agagtgatcc tggccgacgc 6180

taatctggac aaagtgctgt ccgcctacaa caagcaccgg gataagccca tcagagagca 6240

ggccgagaat atcatccacc tgtttaccct gaccaatctg ggagcccctg ccgccttcaa 6300

gtactttgac accaccatcg accggaagag gtacaccagc accaaagagg tgctggacgc 6360

caccctgatc caccagagca tcaccggcct gtacgagaca cggatcgacc tgtctcagct 6420

gggaggcgac aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaag 6478

Claims (9)

1.一种CRISPR/Cas9基因载体，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因载体是一种表面经修饰的聚多巴胺纳米粒，包括聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸；其中，

所述的聚多巴胺表面修饰有聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸，地塞米松通过π-π共轭负载至聚多巴胺表面，聚乙烯亚胺修饰于聚多巴胺表面，透明质酸通过静电吸附作用在聚多巴胺表面；

在CRISPR/Cas9基因载体中，聚多巴胺、聚乙烯亚胺、地塞米松和透明质酸的质量比为5：(2.5-3)：(6-7)：(5-10)。

2.一种如权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括以下步骤：

步骤1、将浓度28％的氨水，无水乙醇与去离子水混合均匀，三者的体积比为2:40:(90～180)，20℃～40℃搅拌20-30分钟；

步骤2、将多巴胺盐酸盐溶解于去离子水中，并滴加至步骤1)中所得混合物溶液中，使得多巴胺盐酸盐的最终浓度为2～7mg/mL，20℃～40℃搅拌反应20-24小时；

步骤3、将步骤2)所得产物在12000-13000rpm下离心40～60分钟，水洗3次，得到聚多巴胺纳米粒；

步骤4、将步骤3)获得的聚多巴胺纳米粒3-6mg溶于10-20ml去离子水中并加入2.5-5mg的地塞米松粉末，搅拌24h得到聚多巴胺/地塞米松水溶液；

步骤5、将步骤4)中所得聚多巴胺/地塞米松水溶液滴加至浓度为10mg/ml聚乙烯亚胺水溶液中，聚多巴胺/地塞米松水溶液与聚乙烯亚胺水溶液的质量比为1:(1～2)搅拌20-24h；

步骤6、将步骤5)获得的反应混合物装入透析袋中，在蒸馏水中透析，得到聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液；

步骤7、将1mg/ml透明质酸的水溶液缓慢滴加到步骤6)中获得的聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液中，透明质酸的水溶液与聚多巴胺/地塞米松-聚乙烯亚胺溶液的质量比为1:(0.5～1)，搅拌反应4～6小时，得到目标产物，即上述的CRISPR/Cas9基因载体，表面经修饰的聚多巴胺纳米粒。

3.根据权利要求2所述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺为25k分子量的聚乙烯亚胺或者15k分子量的聚乙烯亚胺。

4.一种CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法基于权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因载体或者如权利要求2或3的制备方法所获得的CRISPR/Cas9基因载体；所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法包括以下步骤：

步骤1、CRISPR/Cas9基因载体的制备

通过如权利要求2或3所述的CRISPR/Cas9基因载体的制备方法获得CRISPR/Cas9基因载体；

步骤2、构建携带特异性sgRNA的“睡美人”转座子CRISPR/Cas9重组质粒

2.1)采用限制性内切酶剪切得到PX459质粒中的CRISPR/Cas9系统基因序列；

2.2)采用PCR方法扩增携带“睡美人”转座子的pT2BH质粒中的“睡美人”转座子基因序列；

2.3)将CRISPR/Cas9系统基因序列与“睡美人”转座子基因序列连接得到pT2SpCas9重组质粒；

2.4)将特异性sgRNA退火后插入步骤2.3)中获得的pT2SpCas9重组质粒中，得到携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒；

步骤3、CRISPR/Cas9基因载体负载携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒

将步骤2)中获得的携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒缓慢加入步骤1)中的CRISPR/Cas9基因载体的中，涡旋振荡，室温孵育20-30min即得CRISPR/Cas9系统转染复合物。

5.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，步骤2.1)中所述的限制性内切酶为EcoRI和SacII。

6.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，步骤2.2)中所述的PCR方法扩增的具体步骤为：①92℃反应5min；②92℃反应30s；③56℃反应30s；④68℃反应1min；⑤将步骤②～④重复30个循环；⑥68℃反应15min。

7.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，步骤2.4)中所述的特异性sgRNA退火的具体步骤为：①37℃反应30-35min；②以3-5℃/min速度从95℃降至25℃。

8.根据权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，步骤3)中携带特异性sgRNA的pT2SpCas9重组质粒与CRISPR/Cas9基因载体的质量比为1:(5～30)。

9.根据权利要求4-8中任一项所述的CRISPR/Cas9系统转染复合物的构建方法，其特征在于，步骤2.1)中所获得的CRISPR/Cas9系统基因序列如SEQ ID NO.10所示；步骤2.2)中所获得的“睡美人”转座子序列如SEQ ID NO.9所示。

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