CN108619527A - 一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物及其制备方法 - Google Patents

一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物及其制备方法属于药物制剂领域，该介孔二氧化钛纳米药物组合物以氨基化的介孔二氧化钛为载体，环五肽‑透明质酸ADH‑1‑HA为靶向材料，阿霉素为模型药物。制备方法包括：首先，以透明质酸钠、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC、N‑羟基琥珀酰亚胺NHS、环五肽ADH‑1为原料，合成抗肿瘤耐药的靶向材料环五肽‑透明质酸ADH‑1‑HA；其次，合成氨基化修饰的介孔二氧化钛纳米粒子；最后，将EDC与NHS加入ADH‑1‑HA溶液后，再加入介孔二氧化钛纳米粒子，反应后得到产物。本发明方法设计合理，制备工艺简单，能够提高对抗耐药肿瘤的杀伤作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物及其制备 方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，提供了一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物及其制备方法，具体涉及一种主动靶向肿瘤EMT细胞的新型抗肿瘤耐药介孔二氧化钛载药纳米粒及其制备方法。
技术背景
肿瘤细胞耐药是当前导致肿瘤常规化疗失败的主要因素，也是患者预后不良的指标。因此，如何克服肿瘤耐药，对于提高癌症患者的生存率至关重要。上皮间质转化(EMT)与化疗敏感耐药关系的研究是肿瘤化疗领域的前沿课题，也是近期的研究热点之一。有研究证实某些癌细胞在经过诱导产生耐药的同时，发生了从形态到表面标志物的改变，成为具有运动侵袭能力的间质细胞，即发生了上皮间质转化；同样的，某些癌细胞经过诱导后，这些细胞将表达间质分化标志物，同时对化学治疗药物的敏感性下降。因此，针对EMT的治疗有希望克服肿瘤的耐药性。
肿瘤细胞发生EMT时，会失去与基质膜之间的联系，细胞的形态和细胞分子标志物的表达会发生变化。其中，N-钙粘蛋白(N-cadherin)是肿瘤细胞发生 EMT时显著高表达的分子标志物，在肿瘤的早期侵袭与转移中发挥着至关重要的作用。并且，肿瘤细胞中N-cadherin表达的上调会促进肿瘤细胞发生上皮间质转化。因此，下调或是抑制N-cadherin的表达，是解决肿瘤耐药性的一个很有潜力的治疗策略。环五肽ADH-1是一种N-cadherin的拮抗剂，能够选择性地结合并阻断N-cadherin的功能，从而逆转EMT的发生达到克服肿瘤耐药性的目的。
由于具有较好比表面积，适宜的孔径和孔结构以及易于修饰的外表面，二氧化钛在生物医学方面的应用越来越多。在药物递送方面，通常使用介孔二氧化钛作为药物递送载体。此外，二氧化钛在紫外线照射下会产生活性氧ROS，从而对细胞进行杀伤。但是由于紫外线较弱的穿透能力，使得其作为药物递送载体中的应用受到限制。综上，目前还没有一种将众多材料结合在一起用来克服肿瘤耐药的组合物。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法。
本发明的技术方案为：
一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物，该介孔二氧化钛纳米药物组合物以氨基化的介孔二氧化钛为载体，环五肽-透明质酸ADH-1-HA为靶向材料，阿霉素为模型药物。所述的靶向材料中的环五肽ADH-1作为发生上皮间质转化的肿瘤细胞中N-cadherin的靶向抑制剂；靶向材料中的透明质酸HA主动靶向递送的靶头分子，可以与高表达CD44受体的肿瘤细胞进行特异性识别，同时HA还作为ADH-1与氨基化的介孔二氧化钛之间的交联剂。
该介孔二氧化钛纳米药物组合物采用氨基化的介孔二氧化钛作为载体，利用其有序的介孔结构，大的比表面积，适宜的孔径，良好的生物相容性以及易于修饰的外表面等特点，对模型药物阿霉素进行高效的包载以及对外表面进行进一步修饰。采用X射线对氨基化的二氧化钛进行照射来避免紫外线照射带来穿透能力不足的问题。同时氨基化的介孔二氧化钛在X射线的照射下也会产生活性氧(ROS)，实现对肿瘤细胞的进一步杀伤。该抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物对肿瘤EMT细胞具有主动靶向结合与靶向抑制能力，能够有效地克服肿瘤细胞的多药耐药。
上述抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
第一步，合成抗肿瘤耐药的靶向材料环五肽-透明质酸ADH-1-HA
1.1)将透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下水化过夜，得到透明质酸钠水溶液。所述的透明质酸钠水溶液的浓度为5-10mg/ml，透明质酸钠的分子量为37KDa。
1.2)室温下，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC和N- 羟基琥珀酰亚胺NHS依次加入步骤1.1)得到的透明质酸钠水溶液中，活化透明质酸纳上的羧基2-4h，得到混合溶液。所述的EDC与NHS的摩尔比为1:1-0.5，透明质酸纳上的羧基与EDC的摩尔比为1:1-1.5。
1.3)室温下，将环五肽ADH-1加入步骤1.2)得到的混合溶液中，搅拌使其完全反应，搅拌时间不低于48h；反应结束后将反应液转移至透析袋中，两端夹紧，用去离子水透析纯化24-48h；将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到产物 ADH-1-HA，产物可用核磁共振氢谱进行鉴定。所述的透明质酸钠与环五肽 ADH-1的摩尔比为3:1-5:1。所述的透析袋的截留分子量为3500-37500。
第二步，合成氨基化修饰的介孔二氧化钛纳米粒子
2.1)室温下，将无水乙醇与正庚酸加入烧杯中搅拌5-10min，充分混匀后，再加入钛源钛酸四丁酯继续搅拌15-20min，此时溶液呈现无色透明，最后再加入去离子水继续搅拌20-30min，溶液由无色透明变为白色乳状液。
所述的每5-30ml的无水乙醇对应加入50-100μl正庚酸、300-400μl钛源钛酸四丁酯后，最后再对应加入5-10ml的去离子水。
2.2)室温下，将反应后的溶液置于反应釜中，110-130℃水热40-50min后，将反应液用无水乙醇和去离子水清洗2-3次，烘干即得到介孔二氧化钛纳米粒MTN。
2.3)室温下，将MTN加入无水乙醇中搅拌均匀后，再加入三氨丙基三甲氧基硅烷APTMS，避光搅拌24-36h使其充分反应，得到反应液。将反应液用无水乙醇和去离子水清洗2-3次，冷冻干燥得到氨基化的介孔二氧化钛。
所述的每20-40ml的无水乙醇对应加入5-10mg的MTN、100-200μl的三氨丙基三甲氧基硅烷APTMS。
第三步，合成抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物
3.1)将第一步得到的抗肿瘤耐药的靶向材料ADH-1-HA溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下过夜水化。所述的靶向材料ADH-1-HA的浓度为8-10mg/ml。
3.2)将EDC与NHS分别加到步骤2.1)得到的溶液中，活化2-4h。将氨基修饰的介孔二氧化钛纳米粒子加到上述溶液中，室温条件下搅拌24-36h得到反应液。
3.3)将3.2)得到的反应液经过去离子水洗涤纯化后，冷冻干燥即得抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物。
本发明的有益效果为：本发明提供一种能够克服肿瘤细胞耐药的新型靶向药物组合物。利用介孔二氧化钛作为载体，一方面为功能团的修饰提供了可修饰点，另一方面通过X射线照射产生活性氧(ROS)对肿瘤细胞进一步杀伤；通过靶向材料ADH-1-HA的修饰，增加介孔二氧化钛纳米药物组合物的肿瘤细胞靶向传递能力及对肿瘤细胞N-cadherin的靶向抑制，提高对抗耐药肿瘤的杀伤作用。本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有广阔的应用前景，同时也为相应给药系统的设计和发展打下基础。
附图说明
图1为HA的核磁共振氢谱图；
图2为ADH-1-HA的核磁共振氢谱图；
图3(a)为用扫描电镜观察到的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的形态图；
图3(b)为采用动态光散射仪分析得到的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的粒径分布图；
图4为用蛋白免疫印迹分析得到的未经TGF-β1诱导和TGF-β1诱导发生 EMT的肿瘤A549细胞相关蛋白的表达情况；
图5为TGF-β1诱导发生EMT的肿瘤A549细胞对包载阿霉素的未经HA和 ADH-1修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物的摄取图，其中细胞核用DAPI进行染色。
图6为TGF-β1诱导发生EMT的肿瘤A549细胞对包载阿霉素的经ADH-1-HA 修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物的摄取图，其中细胞核用DAPI进行染色。
图7为TGF-β1诱导发生EMT的肿瘤A549细胞经介孔二氧化钛纳米药物组合物孵育后在X射线照射下产生活性氧示意图，其中DCFH-DA在活性氧存在下显色。
图8为CCK-8法测定的包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物、包载阿霉素的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物、在X射线照射下的包载阿霉素的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物和游离阿霉素对 TGF-β1诱导发生EMT的肿瘤A549细胞的细胞毒作用。
图9为不同浓度的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物对红细胞溶血度的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1
第一步，合成靶向材料—环五肽-透明质酸(ADH-1-HA)
精密称取31mg透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，水化24h，然后将23.4mg EDC和14.1mg NHS依次滴加到透明质酸钠水溶液中，调节pH＝6.5，活化 2h，随后将5mg环五肽ADH-1加到上述溶液中，室温、搅拌条件下反应48h。反应结束后将反应液转移至截留分子量为3500的透析袋中，两端夹紧，用去离子水透析48h，进行纯化；将透析袋中的溶液进行冷冻干燥后，得到产物ADH-1-HA。
所得样品用核磁共振氢谱进行表征，图2为ADH-1-HA的核磁共振氢谱图：与图1中HA的核磁共振氢谱图相比，ADH-1-HA的核磁共振氢谱图中出现了三个新峰，分别为2.81ppm来自于ADH-1十七杂环上的三个叔氢，7.25ppm和8.58ppm 来自于ADH-1五元杂环上的两个叔氢，证明靶向材料的成功合成。
第二步，合成氨基化修饰的介孔二氧化钛纳米粒
将20ml的无水乙醇与100μl正庚酸与分别加入烧杯中搅拌5min。充分混匀后，加入钛源钛酸四丁酯300μl继续搅拌15min。最后加入5ml的去离子水，继续搅拌20min。
2.2)将反应后的溶液置于反应釜中，120℃水热40min。将得到后的反应液用无水乙醇和去离子水清洗2次，烘干即得到介孔二氧化钛纳米粒MTN。
2.3)将5mg的MTN置于20ml的无水乙醇中搅拌均匀，并加入三氨丙基三甲氧基硅烷APTMS100μl，避光搅拌24h得到反应液。将反应液用无水乙醇和去离子水清洗2次，冷冻干燥得到氨基化的介孔二氧化钛。
第三步，合成抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物
精密称取5mg靶向材料环五肽-透明质酸ADH-1-HA并溶于去离子水中，过夜水化后加入4.5mgNHS和7.5mgEDC，调节pH＝6.5，室温下搅拌活化2h。称取10mg氨基化的介孔二氧化钛加入溶液中，室温搅拌24h。反应液13300r/min 离心并用去离子水洗涤3次，冷冻干燥后即得到抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物(ADH-1-HA-MTN)。
将抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物制成溶液滴加到硅片上，待自然晾干后，用扫描电镜进行观察，如图3(a)所示，形貌为球形，粒径均一。
将抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物用动态光散射仪进行粒径分析，图3(b)为其粒径分布，可以看出它的粒径主要分布在100nm。
肿瘤EMT细胞模型的建立及表征
细胞模型的建立：待A549肺癌细胞的覆盖率达到30％～40％时，用无血清的培养基进行饥饿处理24h，然后用含5ng/ml TGF-β1的完全培养基，再孵育48h，即可得到肿瘤EMT细胞模型A549/EMT。
细胞模型的表征：将A549肿瘤细胞接种于六孔板中，每孔约为4×104个细胞。饥饿处理24h，然后用含5ng/ml TGF-β1的完全培养基，再孵育48h。去除培养基，用磷酸盐缓冲液PBS清洗两次，然后每孔中加入200μL细胞裂解液，用移液枪吹打数下，使裂解液与细胞充分接触，在冰上裂解40分钟后，10000g 离心5分钟，取上清，然后进行免疫印迹分析。图4为用蛋白免疫印迹分析得到的未经TGF-β1诱导和TGF-β1诱导发生EMT的肿瘤A549细胞相关蛋白的表达情况，从图中可以看出TGF-β1诱导之后细胞的上皮细胞的标志物E-钙粘蛋白 (E-cadherin)的表达量下降，间质细胞的标志物N-钙粘蛋白(N-cadherin)， Snail和波形蛋白(Vimentin)的表达量增多，表明诱导之后的A549肿瘤细胞发生了上皮间质转化。
TGF-β1诱导发生EMT的A549肿瘤细胞对抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的摄取
将TGF-β1诱导发生EMT的A549肿瘤细胞接种于放置盖破片的24孔板中，培养过夜，使细胞贴片。吸出培养基，分别用包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物和包载阿霉素的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物处理细胞3h，其中各组阿霉素的浓度均为5μg/ml。用激光共聚焦荧光显微镜观察各处理组介孔二氧化钛纳米药物组合物在TGF-β1诱导下发生EMT的A549肿瘤细胞内的摄取情况。从图5和图6显示的结果可以看出：经过透明质酸-环五肽HA-ADH-1 修饰后的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物在TGF-β1诱导发生EMT的 A549肿瘤细胞内的摄取量明显高于未经透明质酸-环五肽HA-ADH-1修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物的摄取量，说明透明质酸-环五肽HA-ADH-1的修饰增加了介孔二氧化钛纳米药物组合物对TGF-β1诱导发生EMT的A549肿瘤细胞的靶向性。图5，图6的比例尺为25.0μm。
抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的活性氧测定
将TGF-β1诱导发生EMT的A549肿瘤细胞接种于放置盖破片的6孔板中，培养过夜，使细胞贴壁。吸出培养基，加入抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物培养24h后，其中一个6孔板取出进行X射线照射0.5h，继续培养24h。取出6 孔板，去除培养基，用磷酸盐缓冲液PBS清洗三次次，然后每孔中加入1ml的 DCFH-DA，培养20分钟后，置于荧光显微镜下进行观察。
图7表明，在X射线照射下，抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物会产生活性氧ROS，而未经X射线照射，抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物并不会产生ROS。这表明抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物只有在X 射线的刺激下才会产生ROS对肿瘤进行杀伤。
抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的细胞毒性测定
抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的细胞毒性测定采用CCK-8法。将TGF-β1诱导发生EMT的A549细胞接种于96孔板，5×103/孔，过夜培养使贴壁。分别加入不同浓度的包载阿霉素的未经HA和ADH-1修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物、包载阿霉素的只有HA修饰的介孔二氧化钛纳米药物组合物、包载阿霉素的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物、在X射线照射下的包载阿霉素的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物和游离阿霉素，只加入完全培养基的作为对照组。CO2培养箱37℃培养48h，然后每孔中加入10μLCCK-8溶液，继续培养2h，并每隔0.5h晃动使CCK-8溶液与细胞充分接触。取出后在酶标仪上，于450nm测定吸光度OD值。按以下公式计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝(OD样品/OD对照)×100％
图8表明经X射线照射后经过透明质酸-环五肽HA-ADH-1修饰后的抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物在TGF-β1诱导发生EMT的A549肿瘤细胞内的细胞毒性明显增强。这是由于一方面透明质酸-环五肽HA-ADH-1修饰后明显的增加了介孔二氧化钛纳米药物组合物对肿瘤细胞的靶向性从而增加了抗肿瘤药物阿霉素在肿瘤细胞内的聚集，增加了细胞毒性；另一方面是由于ADH-1 阻断了N-cadherin的功能，逆转了EMT，增加了细胞毒性；最后，在X射线照射下，介孔二氧化钛产生大量的ROS，增加了细胞毒性。图8中每个数值为平均值±SD(n＝4)。
抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物生物相容性的测定
从兔耳缘静脉取血，并在4℃以1000rpm离心20分钟分离得到红细胞。将所得红细胞用PBS洗涤3次，直至上清液澄清。取1mL不同浓度的实验组材料渗滤液和阴性对照(0.9％盐水)和阳性对照(去离子水)置于离心管中，每组共7 个离心管并置于37℃的恒温水浴中0.5小时。将0.1ml新鲜抗凝血稀释兔血液加入实验组和阴性对照组，阳性对照组的离心管中，置于37℃恒温振荡器中振荡2h，混匀。然后离心的上清液以1000r/min离心10分钟。观察每个离心管中上清液的颜色，以确定是否有明显的溶血现象。此外，将来自每个管的200μl上清液加入到96孔板中。用酶标仪在波长576nm处测量每个样品的吸光度(OD值)。使用以下等式计算溶血百分比：
溶血(％)＝(OD576实验组-OD576阴性对照)/(OD576阳性对照-OD576 阴性对照)×100％
如图9所示，MTN，透明质酸HA修饰的MTN，透明质酸-环五肽修饰的MTN 均没有显示出明显的细胞毒性，表明合成的材料具有很好的生物相容性，适合作为抗肿瘤耐药纳米药物组合物的载体。
实施例2
将第一步的ADH-1肽和HA的质量5mg和31mg改为9.1mg和31mg；将第二步的正庚酸100μl改为50μl，钛酸四丁酯300μl改为400μl，反应时间15min改为20min，水热反应由120℃改为110℃水热时间由40min改为45min，APTMS由100μl变为 200μl；第三步的ADH-1-HA和氨基修饰介孔二氧化钛的质量5mg和10mg改为 5mg和5mg；其它制备条件不变，制备抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物。
实施例3
将第一步的ADH-1肽和HA的质量5mg和31mg改为9.1mg和31mg；将第二步的钛酸四丁酯300μl改为350μl，反应时间15min改为20min，水热反应由120℃改为130℃水热时间由40min改为50min，APTMS由100μl变为150μl；第三步的 ADH-1-HA和氨基修饰介孔二氧化钛的质量5mg和10mg改为5mg和5mg；其它制备条件不变，制备抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物。
上述实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物，其特征在于，所述的介孔二氧化钛纳米药物组合物以氨基化的介孔二氧化钛为载体，环五肽-透明质酸ADH-1-HA为靶向材料，阿霉素为模型药物；所述的靶向材料中的环五肽ADH-1作为发生上皮间质转化的肿瘤细胞中N-cadherin的靶向抑制剂；靶向材料中的透明质酸HA主动靶向递送的靶头分子，可以与高表达CD44受体的肿瘤细胞进行特异性识别，同时HA还作为ADH-1与氨基化的介孔二氧化钛之间的交联剂。
2.权利要求1所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于以下步骤：
第一步，合成抗肿瘤耐药的靶向材料环五肽-透明质酸ADH-1-HA
1.1)将透明质酸钠溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下水化过夜，得到透明质酸钠水溶液；
1.2)室温下，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS依次加入步骤1.1)得到的透明质酸钠水溶液中，反应2-4h，活化透明质酸纳上的羧基得到混合溶液；所述的步骤1.2)中EDC与NHS的摩尔比为1:1-0.5，透明质酸纳上的羧基与EDC的摩尔比为1:1-1.5；
1.3)室温下，将环五肽ADH-1加入步骤1.2)得到的混合溶液中，搅拌使其完全反应；反应结束后将反应液转移至透析袋中，并采用去离子水透析纯化后，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到产物ADH-1-HA；所述的透明质酸钠与环五肽ADH-1的摩尔比为3:1-5:1；
第二步，合成氨基化修饰的介孔二氧化钛纳米粒子
2.1)室温下，将无水乙醇与正庚酸加入烧杯中搅拌充分混匀后，再加入钛源钛酸四丁酯继续搅拌15-20min，此时溶液呈现无色透明，最后再加入去离子水继续搅拌20-30min，溶液由无色透明变为白色乳状液；
所述的每5-30ml的无水乙醇对应加入50-100μl正庚酸、300-400μl钛源钛酸四丁酯后，最后再对应加入5-10ml的去离子水；
2.2)室温下，将反应后的溶液置于反应釜中，110-130℃水热40-50min后，将反应液用无水乙醇和去离子水清洗后烘干得到介孔二氧化钛纳米粒MTN；
2.3)室温下，将MTN加入无水乙醇中搅拌均匀后，再加入三氨丙基三甲氧基硅烷APTMS，避光搅拌24-36h使其充分反应，得到反应液；将反应液用无水乙醇和去离子水清洗后冷冻干燥得到氨基化的介孔二氧化钛；
所述的每20-40ml的无水乙醇对应加入5-10mg的MTN、100-200μl的三氨丙基三甲氧基硅烷APTMS；
第三步，合成抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物
3.1)将第一步得到的抗肿瘤耐药的靶向材料ADH-1-HA溶于去离子水并置于茄型瓶中，室温下过夜水化；所述的靶向材料ADH-1-HA的浓度为8-10mg/ml；
3.2)将EDC与NHS分别加到步骤2.1)得到的溶液中，活化2-4h；将氨基修饰的介孔二氧化钛纳米粒子加到上述溶液中，室温条件下搅拌24-36h得到反应液；
3.3)将3.2)得到的反应液经过去离子水洗涤纯化后，冷冻干燥即得抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物。
3.根据权利要求2所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，步骤1.1)中所述的透明质酸钠水溶液的浓度为5-10mg/ml，透明质酸钠的分子量为37KDa。
4.根据权利要求2或3所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1.3)中搅拌时间不低于48h。
5.根据权利要求2或3所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1.3)中透析袋的截留分子量为3500-37500。
6.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1.3)中透析袋的截留分子量为3500-37500。
7.根据权利要求2或3所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1.3)中去离子水透析纯化的时间为24-48h。
8.根据权利要求4所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1.3)中去离子水透析纯化的时间为24-48h。
9.根据权利要求5所述的一种抗肿瘤耐药的介孔二氧化钛纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，所述的步骤1.3)中去离子水透析纯化的时间为24-48h。
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