CN110237035A - 一种主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体及其制备与应用 - Google Patents
一种主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体及其制备与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体及其制备与应用，属于生物医药技术领域。所述两亲性多肽是以烷基链为疏水端，具有主动靶向功能且侧链修饰荧光功能分子的多肽链为亲水端，抗肿瘤药物包载在两亲性多肽自组装形成的胶束的疏水腔中。该纳米载体能够主动靶向肿瘤细胞，并通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞，且两亲性多肽与磷脂分子具有较强的相互作用，促进肿瘤细胞对纳米药物的吞噬。这一过程能够通过多肽链上修饰的荧光功能分子的荧光成像进行追踪，达到肿瘤成像的目的。最终抗肿瘤药物缓慢释放，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。该两亲性多肽纳米载体无毒，生物相容性好，抗肿瘤效率显著，可实现肿瘤诊疗一体化。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。具体而言，本发明提供了一种主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体及其制备与应用。
背景技术
多肽自组装是生命体中十分普遍的现象，对众多生命活动和生物学功能起着重要作用。多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的，具有良好的生物相容性、易于化学修饰和组装特性优良等突出优势。其中，两亲性多肽分子具有类似天然磷脂分子的两亲特性，分子结构具有疏水链段和亲水端基，在疏水性链段间的疏水性作用力和亲水性多肽链段间的氢键协同驱动下，多肽分子能够自组装形成规整有序的纳米/微米结构，有着更为丰富的分子结构设计、独特新颖的组装体结构以及特殊的生物学功能。两亲性多肽由于其良好的生物相容性、生物安全性和生物降解性，被广泛应用于生物医学领域，如组织工程，伤口修复和基因治疗，特别是作为载体用于治疗药物的输送。
两亲性多肽作为载体用于输送治疗药物，如化疗药物、免疫治疗剂、光动力治疗剂、光热治疗剂、基因治疗剂等。作为药物载体，两亲性多肽具有如下显著的优势：(1)生物相容性好；(2)生物安全性；(3)具有多价性，一定程度上保护其免遭降解；(4)合成修饰方法简单易行；(5)尺寸和形状可调；(6)多肽序列具有生物活性功能，例如靶向性、细胞穿膜性。两亲性多肽纳米载体用于药物递送，可以避免载体诱导的毒性和免疫原性，且具有较大的载药量。
发明内容
本发明解决了现有技术中纳米载体对肿瘤细胞的靶向性不好，包封率不高，以及不能检测到肿瘤部位的技术问题。本发明提供了一种新的纳米载体，该纳米载体为具有主动靶向功能的多肽链的N端偶联疏水性烷基链，且在多肽链的侧链修饰荧光功能分子，该两亲性多肽自组装得到纳米载体。
根据本发明的第一方面，提供了一种主动靶向型两亲性多肽纳米载体，所述载体为两亲性多肽自组装形成的胶束；所述多肽的氨基酸序列为Lysn-AAm-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，所述n的取值为1、2、3或4，所述AA为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，所述m的取值为0、1、2或3；
当m的取值为0时，即不存在氨基酸AA时，所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上连接有荧光分子，主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基与疏水性烷基链连接；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，且当AA不为赖氨酸时，所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上连接有荧光分子，主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基与疏水性烷基链连接；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，且当AA为赖氨酸时，所述多肽中靠近C端的除AA之外的第一个Lys侧链氨基上连接有荧光分子，主链N端的氨基和除AA侧链氨基之外的其它所有的侧链氨基与疏水性烷基链连接；
所述荧光分子使胶束具有荧光成像的作用，所述疏水性烷基链作为两亲性多肽纳米的疏水端。
优选地，所述胶束的疏水腔中包载有抗肿瘤药物。
优选地，所述纳米载体为球形结构，直径为10nm-50nm。
优选地，所述荧光分子为含有羧基的罗丹明类染料；
优选地，所述荧光分子为对羧基四乙基罗丹明、5(6)-羧基四甲基罗丹明、罗丹明B或5-羧基-X-罗丹明。
优选地，所述疏水性烷基链为直链脂肪酸、油酸或双炔酸；所述多肽的C端为酰胺结构；
优选地，所述直链脂肪酸的碳原子个数的范围为12-18。
按照本发明的另一方面，提供了所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备两亲性多肽：通过固相肽合成方法制备具有主动靶向功能的多肽，所述多肽的氨基酸序列为或Lysn-AAm-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，所述n的取值为1、2、3或4，所述AA为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，所述m的取值为0、1、2或3；
(2)偶联疏水性烷基链和荧光分子：当m的取值为0时，即不存在氨基酸AA时，在所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上偶联荧光分子，在主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基上偶联疏水性烷基链；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，当AA不为赖氨酸时，在所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上偶联荧光分子，在主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基偶联疏水性烷基链；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，当AA为赖氨酸时，在所述多肽中靠近C端的除AA之外的第一个Lys侧链氨基上偶联荧光分子，在主链N端的氨基和除AA之外的其它所有的侧链氨基偶联疏水性烷基链；即得到主动靶向型两亲性多肽；
(3)自组装制备载体：将步骤(2)所述的主动靶向型两亲性多肽溶解于第一有机溶剂中，通过旋蒸法除去有机溶剂后，在超声条件下将所述主动靶向型两亲性多肽分散于水中，所述主动靶向型两亲性多肽通过自组装，即得到主动靶向型两亲性多肽纳米载体；或者将步骤(2)所述的主动靶向型两亲性多肽溶解于能与水互溶的第二有机溶剂中，然后分散在水中，所述主动靶向型两亲性多肽进行自组装，再通过旋蒸或者透析除去所述能与水互溶的第二有机溶剂，即得到主动靶向型两亲性多肽纳米载体。
优选地，将抗肿瘤药物与所述主动靶向型两亲性多肽同时溶解，所述主动靶向型两亲性多肽通过自组装，将所述抗肿瘤药物包载在疏水腔中，即得到主动靶向型两亲性多肽纳米载体。
优选地，所述荧光分子为含有羧基的罗丹明类染料；所述疏水性烷基链为直链脂肪酸、油酸或双炔酸；所述抗肿瘤药物为喜树碱、阿霉素、紫杉醇、环磷酰胺、卡莫司汀或白消安；
优选地，所述荧光分子为对羧基四乙基罗丹明、5(6)-羧基四甲基罗丹明、罗丹明B或5-羧基-X-罗丹明；所述直链脂肪酸的碳原子个数的范围为12-18。
优选地，步骤(3)中所述超声的频率为30kHz-50kHz，功率为200W-700W，超声时间为20min-40min；
步骤(3)中所述第一有机溶剂为二氯甲烷、甲醇、丙酮、氯仿或四氢呋喃，所述能与水互溶的第二有机溶剂为甲醇、丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；
步骤(3)中所述主动靶向型两亲性多肽的浓度为0.1mM-1mM，所述抗肿瘤药物与所述主动靶向型两亲性多肽的质量比为1:(2-10)。
按照本发明的另一方面，提供了任一所述的主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体用于制备抗肿瘤药物的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明纳米载体的多肽序列具有主动靶向功能的氨基酸序列为Arg-Gly-Asp(RGD)，本发明以肿瘤细胞表面过度表达的整合素受体为靶点，纳米载体可以特异性结合整合素受体，通过受体介导的内吞使纳米载体进入肿瘤细胞。本发明中多肽氨基酸序列Lysn-AAm-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，n的取值为1、2、3或4，所述AA为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，所述m的取值为1、2或3。N端的赖氨酸为荧光分子和疏水性烷基链提供连接的位点；当氨基酸AA为赖氨酸、精氨酸或组氨酸时，使得多肽带正电荷，由于细胞膜表面带负电，因此带正电荷的纳米载体具有更高细胞吞噬效率，当氨基酸AA为天冬氨酸或谷氨酸时，使得多肽带负电荷，具有更长的血液半衰期，提高了其生物利用率；多肽的中的片段Gly-Arg-Gly-Asp-Ser为已知的靶向序列，特异性靶向肿瘤细胞，而且相比于传统的RGD序列，具有更强的肿瘤靶向能力和生理稳定性，当C端的丝氨酸为酰胺结构时，得到的两亲性多肽具有更高的生理稳定性。
(2)本发明中所述纳米载体为球形结构，粒径为10-50nm，该纳米载体粒径较小，有助于肿瘤细胞内吞，并具有体内稳定性，不容易被降解。该纳米载具有肿瘤部位特异靶向性，是一种生物安全、理想的药物载体。多肽自组装纳米材料无毒、生物相容性好；自组装过程中不生成共价键，没有逆反应，形成高度有序的纳米结构，具有广阔的应用前景。
(3)本发明所述疏水性烷基链可采用月桂酸、油酸、双炔酸等，月桂酸酸的碳链亲脂性强，有利于插膜，且其碳链能够作为疏水端位于纳米载体内部，在包载药物后，产物具有较好的稳定性和较高的包载效率。
(4)本发明制备方法优选为薄膜水化法，且溶剂优选为为二氯甲烷，以二氯甲烷为溶剂时，两亲性多肽可顺利自组装包载药物，载药量可达20％以上，且得到的自组装纳米药物粒径均一，稳定性好，具有良好的生物相容性。
(5)本发明中当所述两亲性多肽的N端偶联有C12-18的直链脂肪酸时，保证两亲性多肽与直链脂肪酸的质量比为1:2时，具有较高的载药量。
(6)本发明利用具有主动靶向肿瘤细胞功能的多肽链与疏水性烷基链偶联，且在多肽链的侧链修饰荧光功能分子，得到两亲性多肽，通过自组装方式对抗肿瘤药物进行包载以形成纳米药物。利用疏水作用物理包覆抗肿瘤药物，载药量通常低于10％。而在本发明中，两亲性多肽的疏水作用和多肽侧链的荧光分子与药物的π-π堆积作用使得载药量增加到20％以上。该纳米药物主动靶向肿瘤细胞，并通过受体介导的内吞进入肿瘤细胞，且两亲性多肽与磷脂分子具有较强的相互作用，促进肿瘤细胞对纳米药物的吞噬，最终药物在溶酶体中逐渐释放，作用于肿瘤细胞，杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。该两亲性多肽纳米药物载体无毒，生物相容性好，抗肿瘤效率显著，可实现可视化荧光成像指导下的肿瘤靶向治疗。
(7)与自由化疗药物比较，本发明包载有疏水性抗肿瘤药物的自组装纳米药物对肿瘤部位具有更好的选择性输运效果，并具有较高的最大耐受剂量，且副作用小，有望作为一种新型纳米药物被应用。
附图说明
图1为实施例1制备得到的纳米载体的形貌图像。
图2为实施例8载药后纳米药物载体的形貌图像。
图3为实施例10细胞吞噬效率的流式结果图。
图4为实施例13纳米药物载体对肿瘤细胞的杀伤效率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
其中，所述具有主动靶向功能的多肽链中，起靶向功能的氨基酸序列为Arg-Gly-Asp，是本领域已知序列。所述具有主动靶向功能的多肽链采用标准固相肽合成(SPPS)方法制备得到。本发明提供一种具体的制备方法，本领域技术人员可以理解，该方法并不限定于本发明，如下制备方法中涉及到的原料可市购获得，例如购自吉尔生化(上海)有限公司。
实施例1：主动靶向型两亲性多肽纳米载体的制备方法
(i)制备两亲性多肽分子：
(1)取0.3克Rink Amide-AM树脂至多肽合成装置，加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺浸泡树脂2小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂N,N-二甲基甲酰胺。然后用体积比为1：4的哌啶：N,N-二甲基甲酰胺溶液(10mL)进行树脂的保护基的脱除，反应两次，每次持续20分钟。之后再用10mL N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂3次，每次持续5分钟，取少许树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂变蓝甚至发黑，说明树脂的保护基成功脱除，可以进行第一个氨基酸的偶联，若树脂颜色无明显变化，则需要继续树脂的保护基的脱除操作。
(2)称取0.25克Fmoc-Ser(tBu)-OH，0.34克六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入216微升二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下让Fmoc-Ser(tBu)-OH与树脂反应约4小时，然后用10mL N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂2次，每次5分钟。再称取0.25克Fmoc-Ser(tBu)-OH，0.34克PyBOP，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入216微升催化剂二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下让Fmoc-Ser(tBu)-OH与树脂相互作用约4小时，使其充分固定在树脂上。10mL N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，每次5分钟，取少许树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明第一个氨基酸已完全偶联上了树脂，若树脂变蓝甚至发黑，则说明第一个氨基酸没有与树脂完全反应，需要重复连接。
(3)用体积比为1：4的哌啶：N,N-二甲基甲酰胺溶液(10mL)进行第一个氨基酸的保护基的脱除，反应两次，每次持续20分钟。之后再用10mL N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂3次，每次持续5分钟，取少许树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂变蓝甚至发黑，说明第一个氨基酸的保护基成功脱除，可以进行第二个氨基酸的偶联，若树脂颜色无明显变化，则需要继续第一个氨基酸的保护基的脱除操作。
(4)参照步骤(2)和步骤(3)，依次缩合(Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Alloc)-OH，得到的氨基酸序列为Lys-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser。
(5)称取0.10克月桂酸，0.25克PyBOP，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入159微升催化剂二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下让月桂酸与树脂相互作用约4小时，然后用10mL N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂2次，每次5分钟。再称取0.10克月桂酸，0.25克PyBOP，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入159微升催化剂二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下让月桂酸与树脂相互作用约4小时，使其充分连接到上一个氨基酸上。10mL N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，每次5分钟，取少许树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明月桂酸已完全同肽链偶联，若树脂变蓝甚至发黑，则说明月桂酸没有与肽链完全反应，需要重复连接。
(6)称取0.02克四(三苯基膦)钯，用10毫升二氯甲烷溶解溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入647.7微升苯硅烷，脱除树脂上赖氨酸的保护基，反应两次，每次持续30分钟，之后再用10mL N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂2次，每次持续5分钟，取少许树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂变蓝甚至发黑，说明赖氨酸的保护基成功脱除，若树脂颜色无明显变化，则需要继续赖氨酸的保护基的脱除操作。
(7)称取0.2克罗丹明B，0.22克PyBOP，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入144微升催化剂二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下让罗丹明B与树脂相互作用约4小时，然后用10mL N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂2次，每次5分钟。再称取0.2克罗丹明B，0.22克PyBOP，用10毫升N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入144微升催化剂二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下让罗丹明B与树脂相互作用约4小时，使其充分连接到肽链上。10mL N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，每次5分钟，取少许树脂加入到茚三酮和苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明罗丹明已完全同肽链偶联，若树脂变蓝甚至发黑，则说明罗丹明B没有与肽链完全反应，需要重复连接。
(8)用10mL二氯甲烷冲洗树脂3次，每次5分钟，再用10mL甲醇冲洗树脂3次，每次5分钟，接着用10mL二氯甲烷冲洗树脂3次，每次5分钟。
(9)将多肽从树脂上裂解下来，具体过程如下：首先配置裂解液：9.5mL三氟乙酸+0.25mL三异丙基硅烷+0.25mL去离子水。将裂解液加入到上步含有处理过的树脂的多肽合成装置中，反应2.5小时，之后滤掉树脂，旋蒸除去树脂中的溶剂，接着加入乙醚，立即出现紫红色沉淀。然后离心分离上述悬浊液，转速为5000rpm，离心时间为10分钟，离心两次，除去上清液，加入甲醇溶解，通过HPLC纯化产物，最后加入去离子水溶解，进行冷冻干燥，收集紫红色粉末，即得含有一条疏水烷基链(月桂酸)的两亲性多肽，命名为SACP。
(ii)制备纳米载体：室温下，在超声条件下，将两亲性多肽分散于水中，超声30min，即得。
实施例2至实施例7所采用的参数、条件等如下表所示，除了表中给出的具体参数、条件设定外，其他未说明的参数、条件、处理手段等均与实施例1保持一致。
实施例8：包载抗肿瘤药物的主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体的制备方法
(i)制备含有两条疏水烷基链的两亲性多肽分子(DACP)：参照实施例1中步骤(1)-(9)。
(ii)制备纳米药物载体：室温下，按药物与两亲性多肽分子的质量比为1：(2-10)计，将5mg两亲性多肽分子和疏水性抗肿瘤药物喜树碱溶解于170微升二氯甲烷溶液中，通过旋蒸法除去二氯甲烷溶液，在超声条件下将其分散于水中，超声30min，过滤膜除去未包载的化疗药物，即得。
形态观察
(1)使用电镜观察DACP纳米载体，发现制备的纳米载体为大小较均一、稳定的球形结构(参考附图1)，平均粒径约为18nm，表面电势约为--5毫伏。
(2)采用电镜观察实施例8载药后的纳米药物颗粒，其粒径变大，平均粒径约为23nm(参考附图2)。
实施例9：本发明纳米载体包封率测定
(1)绘制标准工作曲线，称取2.5mg喜树碱溶解于二氯甲烷中，等比稀释7个浓度，每个浓度为1mL，利用紫外分光光度计测定二氯甲烷中喜树碱在紫外吸收峰值处的吸光度；绘制标准工作曲线。
(2)将实施例5的纳米药物载体(DACP@CPT NPs)水溶液冻干，之后溶解在二氯甲烷中，利用紫外分光光度计测定二氯甲烷溶液中抗肿瘤药物的吸光值；
(3)将步骤(2)测得的吸光值带入标准工作曲线中，通过计算，得到喜树碱的包载质量；
(4)根据溶液中抗肿瘤药物的浓度计算纳米载体对喜树碱的包封率。其中，包封率＝(化疗药物的包载质量/化疗药物原始加入量)×100％。
(5)经计算，该纳米载体对化疗药物的包封率可达64％。
实施例10：纳米载体对肿瘤细胞吞噬效果
(1)方法：利用宫颈癌细胞系HeLa，将培养状态良好的细胞接种于12孔板中，24h后分别给10μM和50μM浓度的纳米载体，同时以空白细胞作为对照组，在37℃分别孵育0.5h、4h、8h，通过流式细胞检测仪和激光共聚焦显微镜检测细胞对纳米载体的吞噬效率。
(2)结果：该实验在细胞水平验证纳米载体对HeLa细胞吞噬行为的影响(参考附图3)，在纳米载体与HeLa细胞共孵育0.5h时，即有56％的细胞荧光强度超过103。结果表明，HeLa细胞对纳米载体具有很好的吞噬速率和效率。而且随着时间的延长，HeLa细胞对纳米载体的吞噬效率逐渐增加，共孵育4h后荧光强度基本达到最大值。
实施例11：纳米载体对肿瘤细胞吞噬效果
本实施例同实施例10，将细胞换为小鼠黑素瘤细胞系B16细胞，其他未说明的实验方法、参数、条件、实验结果分析等均与实验例10保持一致。在纳米载体与B16细胞共孵育0.5h时，即有约50％的细胞荧光强度超过103。结果表明，B16细胞对纳米载体具有很好的吞噬速率和效率。而且随着时间的延长，B16细胞对纳米载体的吞噬效率逐渐增加，共孵育4h后荧光强度基本达到最大值。
实施例12：纳米载体对肿瘤细胞吞噬效果
本实施例同实施例10，将细胞换为人肺癌细胞系A549细胞，其他未说明的实验方法、参数、条件、实验结果分析等均与实验例10保持一致。在纳米载体与A549细胞共孵育0.5h时，即有约50％的细胞荧光强度超过103。结果表明，A549细胞对纳米载体具有很好的吞噬速率和效率。而且随着时间的延长，A549细胞对纳米载体的吞噬效率逐渐增加，共孵育4h后荧光强度基本达到最大值。
实施例13：包载药物的载体对细胞的致死作用
(1)方法：利用宫颈癌细胞系HeLa，将培养状态良好的细胞接种于96孔板中，24h后分别给2.5μM和50μM浓度的纳米药物载体，同时以空白细胞作为对照组，在37℃孵育48h，吸走带有纳米药物载体的培养基，加入10％CCK-8的无血清培养基，37℃孵育2-4h，利用酶标仪检测其在450nm处的吸收，根据吸光度值作图。
(2)结果：该实验在细胞水平对治疗效果进行验证(参考附图4)，本实验中，孵育48h后，在较低的纳米药物浓度(2.5μM)下，对细胞的致死率达到65％以上，具有良好的治疗效果。
实施例14
本实施例同实施例13，将细胞换为小鼠黑素瘤细胞系B16细胞，其他未说明的实验方法、参数、条件、实验结果分析等均与实验例13保持一致。孵育48h后，在较低的纳米药物浓度(2.5μM)下，对细胞的致死率达到65％以上，具有良好的治疗效果。
实施例15
本实施例同实施例13，将细胞换为人肺癌细胞系A549细胞，其他未说明的实验方法、参数、条件、实验结果分析等均与实验例13保持一致。孵育48h后，在较低的纳米药物浓度(2.5μM)下，对细胞的致死率达到65％以上，具有良好的治疗效果。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种主动靶向型两亲性多肽纳米载体，其特征在于，所述载体为两亲性多肽自组装形成的胶束；所述多肽的氨基酸序列为Lysn-AAm-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，所述n的取值为1、2、3或4，所述AA为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，所述m的取值为0、1、2或3；
当m的取值为0时，即不存在氨基酸AA时，所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上连接有荧光分子，主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基与疏水性烷基链连接；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，且当AA不为赖氨酸时，所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上连接有荧光分子，主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基与疏水性烷基链连接；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，且当AA为赖氨酸时，所述多肽中靠近C端的除AA之外的第一个Lys侧链氨基上连接有荧光分子，主链N端的氨基和除AA侧链氨基之外的其它所有的侧链氨基与疏水性烷基链连接；
所述荧光分子使胶束具有荧光成像的作用，所述疏水性烷基链作为两亲性多肽纳米的疏水端。
2.如权利要求1所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体，其特征在于，所述胶束的疏水腔中包载有抗肿瘤药物。
3.如权利要求1或2所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体，其特征在于，所述纳米载体为球形结构，直径为10nm-50nm。
4.如权利要求1所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体，其特征在于，所述荧光分子为含有羧基的罗丹明类染料；
优选地，所述荧光分子为对羧基四乙基罗丹明、5(6)-羧基四甲基罗丹明、罗丹明B或5-羧基-X-罗丹明。
5.如权利要求1所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体，其特征在于，所述疏水性烷基链为直链脂肪酸、油酸或双炔酸；所述多肽的C端为酰胺结构；
优选地，所述直链脂肪酸的碳原子个数的范围为12-18。
6.如权利要求1所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备两亲性多肽：通过固相肽合成方法制备具有主动靶向功能的多肽，所述多肽的氨基酸序列为或Lysn-AAm-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，所述n的取值为1、2、3或4，所述AA为赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，所述m的取值为0、1、2或3；
(2)偶联疏水性烷基链和荧光分子：当m的取值为0时，即不存在氨基酸AA时，在所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上偶联荧光分子，在主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基上偶联疏水性烷基链；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，当AA不为赖氨酸时，在所述多肽中靠近C端的第一个Lys侧链氨基上偶联荧光分子，在主链N端的氨基和其它所有的侧链氨基偶联疏水性烷基链；
当m的取值不为0时，即存在氨基酸AA时，当AA为赖氨酸时，在所述多肽中靠近C端的除AA之外的第一个Lys侧链氨基上偶联荧光分子，在主链N端的氨基和除AA之外的其它所有的侧链氨基偶联疏水性烷基链；即得到主动靶向型两亲性多肽；
(3)自组装制备载体：将步骤(2)所述的主动靶向型两亲性多肽溶解于第一有机溶剂中，通过旋蒸法除去有机溶剂后，在超声条件下将所述主动靶向型两亲性多肽分散于水中，所述主动靶向型两亲性多肽通过自组装，即得到主动靶向型两亲性多肽纳米载体；或者将步骤(2)所述的主动靶向型两亲性多肽溶解于能与水互溶的第二有机溶剂中，然后分散在水中，所述主动靶向型两亲性多肽进行自组装，再通过旋蒸或者透析除去所述能与水互溶的第二有机溶剂，即得到主动靶向型两亲性多肽纳米载体。
7.如权利要求6所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体的制备方法，其特征在于，将抗肿瘤药物与所述主动靶向型两亲性多肽同时溶解，所述主动靶向型两亲性多肽通过自组装，将所述抗肿瘤药物包载在疏水腔中，即得到主动靶向型两亲性多肽纳米载体。
8.如权利要求6或7所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体的制备方法，其特征在于，所述荧光分子为含有羧基的罗丹明类染料；所述疏水性烷基链为直链脂肪酸、油酸或双炔酸；所述抗肿瘤药物为喜树碱、阿霉素、紫杉醇、环磷酰胺、卡莫司汀或白消安；
优选地，所述荧光分子为对羧基四乙基罗丹明、5(6)-羧基四甲基罗丹明、罗丹明B或5-羧基-X-罗丹明；所述直链脂肪酸的碳原子个数的范围为12-18。
9.如权利要求6或7所述的主动靶向型两亲性多肽纳米载体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述超声的频率为30kHz-50kHz，功率为200W-700W，超声时间为20min-40min；
步骤(3)中所述第一有机溶剂为二氯甲烷、甲醇、丙酮、氯仿或四氢呋喃，所述能与水互溶的第二有机溶剂为甲醇、丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；
步骤(3)中所述主动靶向型两亲性多肽的浓度为0.1mM-1mM，所述抗肿瘤药物与所述主动靶向型两亲性多肽的质量比为1:(2-10)。
10.如权利要求1-5任一所述的主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体用于制备抗肿瘤药物的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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