CN114605496B - 一种多肽及其应用、抗菌药物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽及其应用、抗菌药物及其制备方法。所述多肽的氨基酸主链的序列为Lys‑Lys‑Lys‑His‑Lys‑Lys‑Lys或Arg‑Arg‑Lys‑His‑Lys‑Arg‑Arg。本发明提供了序列与结构简单的、可用于抗菌的多肽，总氨基酸数量少，在保证良好性能的前提下降低了制备成本，本发明采用疏水β折叠序列作为侧链，驱动多肽形成规整组装结构，并增强了组装体的生理稳定性。该多肽与金属离子、配体药物多组分通过配位作用组装后，负载能力高，且能够实现药物的深层递送、对细菌表现出主动靶向性。

Description

一种多肽及其应用、抗菌药物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，更具体地，涉及一种多肽及其应用、抗菌药物及其制备方法。
背景技术
多肽是以α-氨基酸作为结构单元，按照一定序列以肽键连接，构成的一类化合物。因其是蛋白质水解的中间产物，在生物体内分布非常广泛，并且参与调控生命体内多种生理活动与功能。多肽类具有药效高，生物利用度好，副作用小，易降解代谢，易化学修饰等优点，已发展出细胞因子模拟肽、抗菌活性肽、诊断用多肽、其他药用小肽等，广泛应用于医学领域以及美容化妆品中。
用于抗菌领域的多肽通常通过基因工程表达系统得到，但存在容易被宿主细胞分解、对宿主细胞产生毒性、氨基酸组成不均匀、表达效率低、常以融合蛋白的形式表达后期难以提纯分离等问题，限制了抗菌肽的广泛应用。近年来出现了固相合成制备抗菌多肽的方法，可以解决上述问题，但目前通过固相合成制备抗菌多肽的序列较为冗长繁杂，使用的氨基酸种类多，通常采用5-6种，甚至多于10种，这样的抗菌多肽序列通常为不带有侧基的主链，通过调整不同种类的氨基酸顺序和数量来调整其性能，大大增加了抗菌多肽的制备成本。而利用抗菌多肽制备的药物，通常采用直接将抗菌多肽对药物进行包裹，负载能力低，且无法保证药物的深层递送。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种多肽及其应用、抗菌药物及其制备方法，其目的在于提供序列与结构简单的、可用于抗菌的多肽，总氨基酸数量少，在保证良好性能的前提下降低了制备成本。该多肽与金属离子、配体药物多组分通过配位作用组装后，负载能力高，且能够实现药物的深层递送、对细菌表现出主动靶向性。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种多肽；所述多肽的氨基酸主链的序列为Lys-Lys-Lys-His-Lys-Lys-Lys或Arg-Arg-Lys-His-Lys-Arg-Arg，所述多肽包括两个氨基酸侧链，该两个氨基酸侧链的序列独立地选自Val-Val-Val、Ala-Ala-Ala、Leu-Leu-Leu、Ile-Ile-Ile、Phe-Phe-Phe或Trp-Trp-Trp，该两个氨基酸侧链分别位于所述氨基酸主链的第3位氨基酸的中心碳原子和第5位氨基酸的中心碳原子上。
按照本发明的另一个方面，提供了一种多肽在制备抗细菌药物中的应用。
优选地，所述多肽用于靶向至细菌生物膜表面；优选地，所述细菌为金色葡萄球菌、大肠杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
按照本发明的另一个方面，提供了一种抗菌药物，包括多肽。
按照本发明的又一个方面，提供了一种抗菌药物的制备方法，所述方法包括：
步骤1：将多肽和金属离子溶解于去离子水中，将配体药物溶解在有机溶剂中，将两种溶液混合后加入缓冲液稀释得到混合液；所述金属离子分别与多肽和配体药物进行配位反应；
步骤2：将所述混合液进行孵育，将孵育完成后的混合液进行离心并过滤，得到抗菌药物。
优选地，所述金属离子为锌离子、银离子、铜离子、钙离子、铁离子、钴离子、铂离子和金离子中的至少一种。
优选地，所述配体药物为姜黄素、卟啉类化合物和多酚类化合物中的一种；优选地，所述卟啉类化合物为二氢卟吩e6、酞菁或福大赛因；优选地，所述多酚类化合物为儿茶素、没食子儿茶酚、儿茶酚没食子酸酯、没食子儿茶酚没食子酸酯、鼠李素、杨梅素、桑黄素、槲皮素、原花青素、没食子酸鞣质或鞣花单宁，所述有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、六氟异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酸和三氟乙酸中的一种。
优选地，所述多肽、金属离子、配体药物的摩尔比为1:(0.5-2):(1-3)；优选地，所述去离子水中多肽的浓度为500-1000μM，所述去离子水中金属离子的浓度为500-1000μM，所述有机溶剂中配体药物的浓度为1-10mM；所述缓冲液为醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH为5.5-8.5，所述缓冲液的浓度为10-100mM；所述混合液中多肽的浓度为10-100μM,所述混合液中配体药物的浓度为10-100μM,所述混合液中金属离子的浓度为10-100μM。
优选地，所述孵育的温度为10-40℃，孵育的时间为0.5-8小时。
优选地，所述的离心时间为10-20分钟，离心转速为5000-12000rpm。
优选地，所述抗菌药物的粒径为50-100nm。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，至少能够取得下列有益效果。
(1)本发明提供的多肽具有较为简单的序列与结构，总氨基酸数量少，氨基酸种类少。在保证良好性能的前提下降低了制备成本。本发明中多肽采用带有正电的阳离子氨基酸作为主链；使得该多肽能够对细菌表现出主动靶向性，该多肽主链带有正电，而细菌生物膜表面为负电，细胞表面的正负电荷吸引是多肽与细菌的主要作用机制之一。同时，本发明采用疏水β折叠序列作为侧链，驱动多肽形成规整组装结构，并增强了组装体的生理稳定性，从而避免了抗菌性能差，在体内很快被降解的问题。本发明中的多肽采用对称结构，中间为组氨酸可以作为配位单元，对称的两端为带有正电荷的序列作为功能活性位点。这样对称的结构可以实现在后续与金属离子、治疗药物多组分通过配位作用组装后，得到形貌粒径均一的球形纳米结构。包含该多肽的药物可以作用于细菌细胞膜，形成跨膜的离子通道，造成细菌内容物泄漏，从而杀死细胞。
(2)本发明提供的抗菌药物形貌为球形纳米胶束，粒径为50-100nm，有利于细胞内吞、细菌渗透，稳定性优良。在该抗菌药物中金属离子作为超分子作用支点使超分子自组装具有灵活、可控的优势，由此产生的多肽-金属超分子纳米药物具有较窄的尺寸分布、较高的药物负载能力、组装体主动靶向至细菌、解组装后组装体尺寸转变有利于药物的深层递送等优势。
(3)本发明提供的抗菌药物的生物相容性优良，能够将药物精准递送至靶标部位，且对正常组织不产生副作用，安全可靠，具有广阔的应用前景。
(4)本发明提供的多肽均由天然氨基酸固相合成得到，合成简单、成本低廉、易于修饰，且多肽的生物利用度高，系统副作用小，体内易降解代谢。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的多肽的基质辅助激光解吸飞行时间质谱图；
图2中(a)为本发明实施例1提供的多肽的色性(CD)光谱图；
图2中(b)为本发明实施例1提供的多肽的红外光谱图；
图3为本发明提供的抗菌药物的结构示意图；
图4为本发明实施例2制备得到的抗菌药物的形貌照片；
图5为本发明实施例2制备得到的抗菌药物对细菌生物膜的靶向效果；
图6为本发明实施例2制备得到的抗菌药物对正常细胞的杀生作用；
图7为本发明实施例2制备得到的抗菌药物对红细胞的破裂溶解作用；
图8为本发明实施例2制备得到的抗菌药物对细菌生物膜的抑制作用；
图9为本发明实施例2制备得到的抗菌药物对细菌生物膜的消融作用；
图10为本发明实施例2制备得到的抗菌药物对细菌的杀伤直观照片；
图11为本发明实施例2制备得到的抗菌药物治疗结束后小鼠照片；
图12为本发明实施例2制备得到的抗菌药物治疗结束后植入体内的医疗器械上菌落平板涂布照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。在不脱离本发明上述技术思想和所公开精神的情况下，根据本领域普通技术知识与惯用手段，做出各种等效、替换、修改或变更，都落入本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种多肽所述多肽的氨基酸主链的序列为Lys-Lys-Lys-His-Lys-Lys-Lys，如SEQ ID No.1所示，或Arg-Arg-Lys-His-Lys-Arg-Arg，如SEQ ID No.2所示，所述多肽包括两个氨基酸侧链，该两个氨基酸侧链的序列为Val-Val-Val、Ala-Ala-Ala、Leu-Leu-Leu、Ile-Ile-Ile、Phe-Phe-Phe或Trp-Trp-Trp，该两个氨基酸侧链分别位于所述氨基酸主链的第3位氨基酸的中心碳原子和第5位氨基酸的中心碳原子上。
本发明另一个实施例提供了一种多肽在制备抗细菌药物中的应用。
所述多肽用于靶向至细菌的生物膜表面；优选地，所述细菌为金色葡萄球菌、大肠杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明实施例还提供了一种抗菌药物的制备方法，所述方法包括：
步骤1：将多肽和金属离子溶解于去离子水中，将配体药物溶解在有机溶剂中，将两种溶液混合后加入缓冲液稀释得到混合液；所述金属离子分别与多肽和配体药物进行配位反应；所述多肽的氨基酸主链的序列为Lys-Lys-Lys-His-Lys-Lys-Lys或Arg-Arg-Lys-His-Lys-Arg-Arg，所述多肽包括两个氨基酸侧链，该两个氨基酸侧链的序列独立地选自Val-Val-Val、Ala-Ala-Ala、Leu-Leu-Leu、Ile-Ile-Ile、Phe-Phe-Phe或Trp-Trp-Trp，该两个氨基酸侧链分别位于所述氨基酸主链的第3位氨基酸的中心碳原子和第5位氨基酸的中心碳原子上。
步骤2：将所述混合液进行孵育，将孵育完成后的混合液进行离心并过滤，得到抗菌药物。
实施例1：
本实施例提供一种多肽的制备方法及通过该方法制备得到的多肽，其利用标准固相合成(SPPS)法合成。所述制备方法包括：
1)称取0.5克，Rink Amide-AM树脂至多肽合成装置，加入分析纯N,N-二甲基甲酰胺溶胀树脂2小时，随后用氩气增压排除溶剂。然后用10毫升含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液进行树脂脱保护，反应2次，每次反应20分钟，反应结束后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。随后，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色由白色变为紫色则说明树脂脱保护成功，可以进行氨基酸偶联反应。反之，则需要继续脱保护反应。
2)称取0.4610克Fmoc-Lys(BOC)-OH，0.5121克六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)，溶解在10毫升N,N-二甲基甲酰胺中，然后将其转移至步骤1)含有处理过树脂的多肽合成装置中，再向体系内加入345微升二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应4小时。随后用10毫升N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2次，再次按照同样的比例投料再次反应4小时，使其充分偶联在树脂上。最后使用10毫升N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂不变色则说明第一个氨基酸与树脂成功偶联。反之，则需要继续偶联反应。
3)用10毫升含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液对第一个氨基酸脱保护，反应2次，每次反应20分钟，反应结束后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。随后，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色由白色变为紫色则说明第一个氨基酸脱保护成功，可以进行后续氨基酸偶联反应。反之，则需要继续脱保护反应。
4)参照步骤2)和步骤3)，依次缩合Fmoc-Lys(BOC)-OH,Fmoc-Lys(Alloc)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Lys(Alloc)-OH,Fmoc-Lys(BOC)-OH,Fmoc-Lys(BOC)-OH,得到的氨基酸序列Lys-Lys-Lys-His-Lys-Lys-Lys。
5)用10毫升含有20％体积比为3:2的乙酸酐:吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液对肽链末端封端处理，反应2次，每次反应30分钟，反应结束后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。随后，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂不变色则说明肽链末端氨基酸封端成功。反之，则需要继续对肽链末端氨基酸进行封端处理。
6)称取0.0758克四(三苯基膦)钯，用10毫升二氯甲烷溶解，然后将溶液转移至步骤5)含有处理过树脂的多肽合成装置中，再向体系中加入1943微升苯硅烷，脱除赖氨酸侧链保护基团，反应2次，每次30分钟，反应结束后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。随后，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色由白色变为紫色则说明赖氨酸侧链脱保护成功，可以进行后续氨基酸偶联反应。反之，则需要继续脱保护反应。
7)称取0.6680克Fmoc-Val-OH，1.0242克六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBop)，溶解在20毫升N,N-二甲基甲酰胺中，然后将其转移至步骤6)含有处理过树脂的多肽合成装置中，再向体系内加入690微升二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应4小时。随后用10毫升N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂2次，再次按照同样的比例投料再次反应4小时，使其充分偶联在树脂上。最后使用10毫升N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂不变色则说明氨基酸与赖氨酸侧链成功偶联。反之，则需要继续偶联反应。
8)用10毫升含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液对Fmoc-Val-OH脱保护，反应2次，每次反应20分钟，反应结束后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。随后，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂颜色由白色变为紫色则说明Fmoc-Val-OH脱保护成功，可以进行后续氨基酸偶联反应。反之，则需要继续脱保护反应。
9)参照步骤7)和步骤8)，依次缩合Fmoc-Val-OH,Fmoc-Val-OH,得到的赖氨酸侧链修饰序列为Val-Val-Val。
10)用20毫升含有20％体积比为3:2的乙酸酐:吡啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液对多肽侧链末端封端处理，反应2次，每次反应30分钟，反应结束后用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次。随后，取少量树脂至于茚三酮与苯酚的乙醇溶液中，加热至沸腾，观察树脂不变色则说明多肽侧链末端氨基酸封端成功。反之，则需要继续对多肽侧链末端氨基酸进行封端处理。
11)依次使用10毫升二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷洗涤树脂各3次，随后使用真空油泵对树脂进行1小时干燥处理。
12)向多肽反应装置中加入9.5毫升三氟乙酸、0.25毫升三异丙基硅烷、0.25毫升去离子水，室温下反应3小时，将多肽与树脂切割分离。将切割液缓慢滴加在冰乙醚中，随即出现白色沉淀。然后再3000rpm转速下离心10分钟分离粗产物，弃去上清液，沉淀用适量甲醇溶解，通过中压纯化色谱系统纯化产物，最后冷冻干燥，收集白色粉末，即得到序列为Lys-Lys-Lys(Val-Val-Val)-His-Lys(Val-Val-Val)-Lys-Lys，可以主动靶向至细菌生物膜表面的功能性多肽，将其命名为Pep。
通过实施例1提供的制备方法制备得到的多肽的氨基酸序列为Lys-Lys-Lys(Val-Val-Val)-His-Lys(Val-Val-Val)-Lys-Lys。
其中，Lys为赖氨酸，Val为缬氨酸，His为组氨酸。
该多肽的分子结构具体如下所示：
参见图1，其为本实施例提供的多肽的基质辅助激光解吸飞行时间质谱图。图中可以看到多肽的分子信号峰及其钠、钾离子加和峰。从该图可以判断多肽的成功合成。参见图2中(a)和(b)，图2中(a)为圆二色性(CD)光谱图，可以看出，在197nm处的最大峰值和在205nm处的最小峰值表明通过实施例1制备得到的Pep组装成了β-sheet的二级结构。并且，图2中(b)的红外光谱显示通过实施例1制备得到的Pep在水溶液中在1625cm-1处有特征峰，位于β-sheet峰位范围1615-1637cm-1之中。此处，β-sheet是多肽的一种二级结构，β-sheet序列，驱动多肽形成规整组装结构，并增强组装体的生理稳定性，可使抗菌药物在体内环境稳定存在，长效抗菌。
用与实施例1相同的固相合成方法，可以得到例如如下所示氨基酸序列的多肽：
Lys-Lys-Lys(Ala-Ala-Ala)-His-Lys(Ala-Ala-Ala)-Lys-Lys；
Lys-Lys-Lys(Leu-Leu-Leu)-His-Lys(Leu-Leu-Leu)-Lys-Lys；
Lys-Lys-Lys(Ile-Ile-Ile)-His-Lys(Ile-Ile-Ile)-Lys-Lys；
Lys-Lys-Lys(Phe-Phe-Phe)-His-Lys(Phe-Phe-Phe)-Lys-Lys；
Lys-Lys-Lys(Trp-Trp-Trp)-His-Lys(Trp-Trp-Trp)-Lys-Lys；
Arg-Arg-Lys(Val-Val-Val)-His-Lys(Val-Val-Val)-Arg-Arg；
Arg-Arg-Lys(Ala-Ala-Ala)-His-Lys(Ala-Ala-Ala)-Arg-Arg；
Arg-Arg-Lys(Leu-Leu-Leu)-His-Lys(Leu-Leu-Leu)-Arg-Arg；
Arg-Arg-Lys(Ile-Ile-Ile)-His-Lys(Ile-Ile-Ile)-Arg-Arg；
Arg-Arg-Lys(Phe-Phe-Phe)-His-Lys(Phe-Phe-Phe)-Arg-Arg；
Arg-Arg-Lys(Trp-Trp-Trp)-His-Lys(Trp-Trp-Trp)-Arg-Arg；
Lys-Lys-Lys(Val-Val-Val)-His-Lys(Ala-Ala-Ala)-Lys-Lys；
Arg-Arg-Lys(Val-Val-Val)-His-Lys(Ala-Ala-Ala)-Arg-Arg；
本领域技术人员可以理解的是，上述氨基酸序列并非穷举，多肽包括的两个氨基酸侧链可以相同也可以不同。当两个氨基酸侧链不同时，例如序列为Lys-Lys-Lys(Val-Val-Val)-His-Lys(Ala-Ala-Ala)-Lys-Lys的多肽，制备方法与实施例1不同之处在于：当两条侧链不相同时需要对主链氨基酸选择性脱保护。
实施例2
本实施例提供一种抗菌药物的制备方法及通过该方法制备得到的抗菌药物。所述制备方法包括：
1)将通过实施例1制备得到的多肽和硝酸锌分别溶解于水中，按照多肽:硝酸锌＝1:1的摩尔比例混合上述两种溶液，随后加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)，缓冲液浓度为10mM，经稀释后多肽浓度为500μM，锌离子浓度为500μM。
2)称取二氢卟吩e6溶解于二甲基亚砜中，二氢卟吩e6浓度为5mM。
3)按照多肽:硝酸锌:二氢卟吩e6＝1:1:1的摩尔比例混合步骤1)与步骤2)两种溶液，随后加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液，缓冲液浓度为10mM，经稀释后多肽最终浓度为50μM，锌离子最终浓度为50μM，二氢卟吩e6最终浓度为50μM。
4)将步骤3)中的混合溶液在25℃条件下孵育2小时。
5)待步骤4)的溶液孵育结束后，在6000rpm下离心10分钟，弃去上清液即可得到纳米药物，命名为PCZ。
参见图3，图3为本实施例提供的多组份配位自组装多肽-金属超分子纳米抗菌药物的结构示意图，圆球由大到小分别表示具有主动靶向功能的多肽、治疗药物、金属离子。
形貌观察：使用透射电子显微镜观察多肽-金属超分子纳米药物，如图4所示可，以清楚观察到纳米药物呈形貌均一、结构稳定、粒径分布较窄的球形纳米粒子，平均粒径大小为80nm。
实施例3
本实施例与实施例2的不同之处在于，所述多肽:硝酸锌:二氢卟吩e6的摩尔比例为1:2:3。
实施例4
本实施例与实施例2的不同之处在于，将硝酸锌换为硫酸铜。
实施例5
本实施例与实施例2的不同之处在于，将配体药物换为儿茶素。
结果与分析
1、实施例2制备得到的抗菌药物对细菌生物膜的靶向效果：
方法：分别使用金色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，将生长状态良好的菌液接种于共聚焦皿中，37℃恒温培养2天，加入50μM浓度的多肽-金属超分子纳米药物，以磷酸盐缓冲液(PBS)、二氢卟吩e6与锌离子溶液(命名为CZ)作为对照组，在37℃恒温孵育4小时，采用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察靶向结果。
结果：该结果证明了本发明提供的抗菌药物对金色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜的主动靶向性能，如图5所示，与对照组相比多肽-金属超分子纳米药物组治疗药物二氢卟吩e6的荧光信号显著增强，表明纳米组装体可以主动靶向至生物膜表面，增强药物对生物膜的渗透作用。
2、实施例2制备得到的抗菌药物对正常细胞的杀生作用
方法：使用小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3，将培养状态良好的细胞接种于96孔板中，培养24小时后分别加入浓度为50μM的Pep溶液、CZ溶液、PCZ溶液，以磷酸盐缓冲液作为对照组，孵育24小时后使用CCK-8方法检测细胞活力，根据称微孔板检测器在450nm处的读数判断细胞活力。
结果：如图6所示，该结果在细胞水平验证了本发明提供的抗菌药物对正常细胞基本不产生杀生作用，可以减轻药物直接作用对正常细胞的影响，说明该药物递送平台具有良好的生物安全性。
3、实施例2制备得到的抗菌药物对红细胞的破裂溶解作用
方法：取家兔全血2毫升，保存于含肝素钠管中。取血经磷酸盐缓冲液稀释后在3000rpm转速下离心5分钟，再悬浮于磷酸盐缓冲液中制备红细胞悬液，重复多次洗涤。将1毫升的红细胞悬液与浓度为50μM的Pep溶液、CZ溶液、PCZ溶液混合在无菌试管中。在37℃孵育2小时后，以3000rpm转速离心5分钟，然后用微孔板检测器在545nm波长处测定上清液的吸光度。以超纯水处理的红细胞悬液为阳性对照，磷酸盐缓冲液处理的红细胞悬液为阴性对照，计算溶血率。
结果：如图7所示，该结果说明了本发明提供的抗菌药物对红细胞产生破裂溶解作用较弱，并且可以降低药物直接作用对红细胞的破裂溶解作用，说明该药物递送平台具有良好的生物安全性。
4、实施例2制备得到的抗菌药物对细菌生物膜的抑制作用
方法：分别使用金色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，将生长状态良好的菌液与浓度为50μM的CZ溶液、PCZ溶液混合，以磷酸盐缓冲液作为对照组接种于24孔板中，37℃恒温孵育4小时，然后使用655nm近红外光照射5分钟。37℃恒温孵育24小时后，使用结晶紫染色处理，醋酸脱色后使用紫外可见分光光度计读取570nm处溶液的吸光度，计算生物膜的抑制率。
结果：该结果证明了本发明提供的抗菌药物对细菌生物膜具有抑制作用。如图8所示，近红外光照射后，具有主动靶向性能的药物递送平台体现出了更高的生物膜抑制能力。
5、实施例2制备得到的抗菌药物对细菌生物膜的消融作用
方法：分别使用金色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，将生长状态良好的菌液接种于24孔板中，37℃恒温培养2天，将生长状态良好的菌液与浓度为50μM的CZ溶液、PCZ溶液混合，以磷酸盐缓冲液作为对照组，37℃恒温孵育4小时，然后使用655nm近红外光照射5分钟。37℃恒温孵育24小时后，使用结晶紫染色处理，醋酸脱色后使用紫外可见分光光度计读取570nm处溶液的吸光度，定量分析残留生物膜。
结果：该结果证明了本发明提供的抗菌药物对细菌生物膜具有消融作用。如图9所示，近红外光照射后，具有主动靶向性能的药物递送平台体现出了更高的生物膜消融能力。利用扫描电子显微镜观察近红外光照射前后细菌生物膜，如图10所示，可以观察到具有主动靶向性能的纳米药物对细菌杀伤更为显著，其中NIR为近红外光(本发明实施例中使用655nm激光)。
6、实施例2制备得到的抗菌药物对于医疗器械植入引发耐药菌感染的治疗效果
方法：将带有耐药菌的导管植入到4周龄ICR小鼠背部皮下，建立细菌感染皮下包埋模型。实验分为CZ溶液、PCZ溶液、磷酸盐缓冲液三个大组进行，每大组再细分为近红外光照组与非近红外光照组。植入带有耐药菌的导管后向包埋处注射0.5毫升磷酸盐缓冲液，以及浓度为50μM的CZ溶液、PCZ溶液，并在第1天与第3天对近红外光照组进行5分钟光照处理。于第5天处死小鼠取出包埋材料，将取出的材料再磷酸盐缓冲液中超声震荡30分钟，使用平板菌落计数法评价抗菌药物对于体内耐药菌生物膜感染的治疗效果。
结果：该结果说明了实施例2制备得到的抗菌药物对于医疗器械植入引发耐药菌感染具有较好的治疗效果，如图11所示，治疗结束后小鼠皮损部位没有感染性囊肿出现，手术伤口预后良好。平板菌落计数法结果如图12所示，说明经过治疗后医疗器械上菌落数显著减少，说明多肽-金属超分子纳米药物对体内细菌生物膜具有较强的消融作用，其中NIR为近红外光(本发明实施例中使用655nm激光)。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种多肽的应用、抗菌药物及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Lys Lys Lys His Lys Lys Lys
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Arg Arg Lys His Lys Arg Arg
1 5

Claims (5)

1.一种多肽在制备抗细菌药物中的应用，其特征在于，所述多肽用于靶向至细菌生物膜表面，所述细菌为金色葡萄球菌、大肠杆菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；所述多肽的氨基酸主链的序列为Lys-Lys-Lys-His-Lys-Lys-Lys，所述多肽包括两个氨基酸侧链，该两个氨基酸侧链分别位于所述氨基酸主链的第3位氨基酸和第5位氨基酸上，该两个氨基酸侧链的序列选自Val-Val-Val。
2.一种抗菌药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1：将如权利要求1所述的多肽和金属离子溶解于去离子水中，将配体药物溶解在有机溶剂中，将两种溶液混合后加入缓冲液稀释得到混合液；所述金属离子分别与多肽和配体药物进行配位反应；
步骤2：将所述混合液进行孵育，将孵育完成后的混合液进行离心并过滤，得到抗菌药物；
其中，所述金属离子为锌离子，所述配体药物为二氢卟吩e6。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多肽、金属离子、配体药物的摩尔比为1:(0.5-2):(1-3)；所述缓冲液为醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH为5.5-8.5，所述缓冲液的浓度为10-100 mM；所述混合液中多肽的浓度为10-100 μM, 所述混合液中配体药物的浓度为10-100 μM, 所述混合液中金属离子的浓度为10-100 μM。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为10-40 ℃，孵育的时间为0.5-8小时；所述离心时间为10-20分钟，离心转速为5000-12000 rpm。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述抗菌药物的粒径为50-100 nm。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110237035A (zh) * 2019-06-28 2019-09-17 华中科技大学 一种主动靶向型两亲性多肽纳米药物载体及其制备与应用
CN113069416A (zh) * 2021-03-31 2021-07-06 华中科技大学 主动靶向型两亲性多肽复合纳米胶束前药及制备与应用

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