CN111777670B

CN111777670B - 一种pH调节自组装抗菌肽及制备方法和应用

Info

Publication number: CN111777670B
Application number: CN202010564532.3A
Authority: CN
Inventors: 单安山; 李丘轲; 李金泽; 丑淑丽
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2040-06-19
Also published as: CN111777670A

Abstract

本发明公开一种pH调节自组装抗菌肽及制备方法和应用，抗菌肽SAP的序列如SEQ ID No.1所示。设计含有疏水性氨基酸Trp和Val的组氨酸His功能化β折叠肽，His和Trp分别置于β‑折叠结构相邻的非氢键位点，呈对角线形式分布，其他氢键位点分别分布等量的His和Val，^DPro‑Gly作为β‑转角连接β‑折叠结构的两端肽链。将该抗菌肽的冻干粉溶解于pH＝6.0的超纯水中，抗菌肽单体在水溶液中充分自组装成纳米颗粒。该抗菌肽在制备治疗在酸性环境下大肠杆菌感染性疾病药物中的应用。抗菌肽在酸性环境下发挥有效的抗菌作用，溶血毒性也较低，盐离子稳定性较好，克服了的天然抗菌肽稳定性低的弱点。

Description

一种pH调节自组装抗菌肽及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种pH调节自组装抗菌肽及制备方法和应用。

背景技术

抗生素的滥用和过度使用促进了多重耐药菌在全世界广泛传播，导致没有或仅有少数药物能够应用于临床治疗耐药细菌感染，世界进入“后抗生素时代”，产生广泛的社会和经济影响，威胁到可持续发展目标的实现。因此应该在合理使用抗生素的同时开发新的抗菌药物，特别是具有新的抗菌机制的药物以应对多重耐药菌给人类社会带来的巨大的人员伤亡与财产损失。抗菌肽(AMPs)又称宿主防御肽，能够破坏细菌细胞膜完整性使得细菌内容物外流，导致细菌死亡，这种抗菌机制被认为不易引发细菌产生耐药性，是抗生素有效替代品之一。但是天然抗菌肽生物相容性低，在生理条件下的稳定性低限制了它在临床和畜牧中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种pH调节自组装抗菌肽SAP，是一种具有较高应用价值的自组装抗菌肽。该抗菌肽能够在超纯水中自发组装成纳米颗粒。在pH为6.0的酸性环境中对病原菌尤其是大肠杆菌具有很好的杀灭效果，并且较好的生物相容性，而在pH为7.0时不具备抗菌活性。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种pH调节自组装抗菌肽SAP，序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明的另一目的在于提供一种pH调节自组装抗菌肽SAP的制备方法，如下：设计含有疏水性氨基酸Trp和Val的组氨酸His功能化β折叠肽，其中组氨酸His和疏水性氨基酸Trp分别置于β-折叠结构相邻的非氢键位点，呈对角线形式分布，其他氢键位点分别分布等量的组氨酸His和缬氨酸Val，^DPro-Gly作为β-转角连接β-折叠结构的两端肽链，对肽段的C端酰胺化提高稳定性，利用固相合成法合成多肽，利用反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定合成肽；其序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一目的在于公开将如上所述的抗菌肽SAP的冻干粉溶解于pH＝6.0的超纯水中，室温放置，抗菌肽单体在水溶液中充分自组装成纳米颗粒。

优选方法如下：将如上所述的抗菌肽SAP的冻干粉溶解于pH＝6.0的超纯水中，超声30min，室温放置6-7天，抗菌肽单体在水溶液中充分自组装成纳米颗粒。

本发明的另一目的在于公开如上所述的pH调节自组装抗菌肽SAP在制备治疗在酸性环境下大肠杆菌感染性疾病药物中的应用。

本发明具有以下优点及有益效果：通过本方法制备的抗菌肽能够在不添加任何赋形剂的情况下在水中自发组装成纳米颗粒，通过pH的改变变换纳米颗粒的形态影响抗菌活性。并且通过对其抗菌活性和生物安全性的检测发现，其在酸性环境(pH＝6.0)中，对病原菌特别是大肠杆菌具有很好的抗菌效果，并且在与细胞共同培养时表现出很好的生物相容性，对哺乳动物细胞具有较低的毒性。并且在生理环境下仍能保持有效的抗菌效果。综上所述，是一种具有较高应用价值的自组装抗菌肽。

附图说明

图1是自组装抗菌肽SAP在投射电镜下观察到的微观形态图；

图2是自组装抗菌肽SAP处理后大肠杆菌ATCC 25922的菌落数图；

图3是在生理盐环境中自组装抗菌肽SAP处理后大肠杆菌ATCC 25922的菌落数图；

图4是自组装抗菌肽SAP的溶血毒性结果图。

具体实施方式

下面根据举例对本实发明做进一步的说明:

实施例1：抗菌肽的设计

设计原理：为了获得能够有效杀灭病原菌并且具有很好生物相容性的抗菌肽，利用单个肽分子通过非共价自组装形成超分子纳米结构，并对其进行抗菌活性和生物相容性的检测，得到一种具有较高应用价值的自组装抗菌肽。在构成天然蛋白质的二十种氨基酸中，除了Gly外，其他蛋白质氨基酸α-碳原子均为非手性碳原子。氨基酸由于侧链不同能够为稳定蛋白质三维结构提供不同的相互作用力，例如疏水作用力，静电作用力和氢键等，以达到蛋白质立体结构化学和物理化学的稳定性，实现配对的最小自由能。His包含一个咪唑基，能够通过cation-π(当His被质子化时，His带正电荷)、π-π相互作用、hydrogen-π、氢键等相互作用力与其他分子或金属阳离子相互作用，在蛋白质相互作用和化学催化中起着重要的作用。咪唑基的等电点是6.5，在弱酸性条件下，His的侧链质子化，会提供cation-π作用力促进在酸性环境中超分子的自组装。在生理pH下，中性的咪唑基既能够作为氢键供体和氢键受体，能够促进肽链分子通过cation-π，氢键和π-π相互作用力自组装成超分子纳米结构。Trp的侧链包含一个芳香环，能够提供很强的疏水作用力，辅助π-π相互作用的形成，稳定组装纳米结构，为自组装系统提供疏水性强度。同时，富含Trp的抗菌肽能够与磷脂双分子层强烈相互作用，并促进肽插入磷脂双层中以通透或形成孔。Val作为疏水性氨基酸能够构成分子内氢键，具有很高β-折叠结构形成倾向。

具体方法如下：

设计含有疏水性氨基酸Trp和Val的组氨酸His功能化β折叠肽，其中组氨酸His和疏水性氨基酸Trp分别置于β-折叠结构相邻的非氢键位点，呈对角线形式分布，其他氢键位点分别分布等量的组氨酸His和缬氨酸Val，^DPro-Gly作为β-转角连接β-折叠结构的两端肽链，对肽段的C端酰胺化提高稳定性。

表1抗菌肽的氨基酸序列

实施例2：组装肽的制备

1、利用Fmoc固相合成法合成多肽，冻干。利用电喷雾质谱法(ESI-MS)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了产物的纯度，抗菌肽的纯度大于95％。

2、将质检合格后的抗菌肽冻干粉完全溶解在pH＝6.0的超纯水中，超声30min，室温放置6-7天允许肽分子自组装成纳米颗粒。

实施例3

1.组装肽的形态观察

将10μl肽溶液涂在铜制栅格(400平方目)，吸附5分钟，然后用0.1％磷钨酸染色30秒，干燥15分钟，上镜观察。结果如图一所示，自组装肽SAP在酸性环境中会形成球状的纳米结构。

2.抗菌肽活性测定

从琼脂板上分离出单个菌落，并在5ml 3％胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中培养，并在37℃下以200rpm的速度振摇过夜。将50μl细菌溶液添加到新鲜的5ml 3％TSB中，并以200rpm的速度摇动，培养至对数期。将OD₆₀₀＝0.4的细菌溶液稀释1000倍，用不同浓度的肽进行处理，37℃孵育3h后，将菌液进行梯度稀释，接种至TSB琼脂上，37℃孵育过夜。计算菌落数。在培养基中添加NaCl，使得盐浓度分别为100mM和150mM，测试组装肽SAP在生理盐环境中的抗菌活性。将添加菌液且未添加肽的培养基作为阳性对照，未添加菌液且未添加肽的培养基作为阴性对照。结果如图二和图三所示，自组装抗菌肽SAP能够在酸性环境中有效杀灭病原菌，降低病原菌的生存率，而在中性环境中则没有有效的抗菌活性，同时自组装肽SAP的抗菌活性没有受到NaCl的影响，稳定性较强。

3.抗菌肽溶血毒性测定

通过左心室心脏穿刺从因过度麻醉雌性癌症研究所(ICR)小鼠(SPF，20-25g)处采集新鲜血液，将新鲜血液用PBS洗涤三次，并将红细胞重悬于10mM PBS(pH 7.4或6.0)中。在96孔板中将50μL的新鲜血细胞悬液与50μL的不同浓度的肽溶液混合，并在37℃下孵育1小时。l h后取出，4℃、1000g离心5min，取出上清，用酶标仪测量570nm的吸光度值。PBS和0.1％Triton X-100中的红细胞分别作为阴性和阳性对照。结果如图四所示，无论是在酸性环境中还是在中性环境中，自组装肽SAP对小鼠血红细胞没有溶血毒性。

如上所述的pH调节自组装抗菌肽SAP能够在不添加任何赋性剂的情况下在超纯水中自发的组装成特定的形态结构，并能够通过pH来调控其形态结构，发挥一定的生物学活性。经试验检测，自组装抗菌肽SAP在酸性环境中对革兰氏阴性菌大肠杆菌具有抗菌作用，并且SAP在酸性环境或是中性环境中的溶血毒性较低，稳定性也较强。因此，这类pH调节自组装抗菌肽SAP具有作为药物载体或是抗菌药物的开发潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种pH调节自组装抗菌肽及制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Trp Val His His Trp Val His His Trp Val His His Pro Gly His His

1 5 10 15

Val Val His His Val Val His His Val Val-NH2

20 25

Claims

1.一种pH调节自组装抗菌肽SAP，其特征在于：序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种pH调节自组装抗菌肽SAP的制备方法，其特征在于：设计含有疏水性氨基酸Trp和Val的组氨酸His功能化β折叠肽，其中组氨酸His和疏水性氨基酸Trp分别置于β-折叠结构相邻的非氢键位点，呈对角线形式分布，其他氢键位点分别分布等量的组氨酸His和缬氨酸Val，^DPro-Gly作为β-转角连接β-折叠结构的两端肽链，对肽段的C端酰胺化提高稳定性；利用固相合成法合成多肽，利用反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定合成肽，其序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种pH调节自组装抗菌肽SAP自组装成的纳米颗粒，其特征在于：将所述的抗菌肽的冻干粉溶解于pH＝6.0的超纯水中，室温放置，抗菌肽单体在水溶液中充分自组装成纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的一种pH调节自组装抗菌肽SAP自组装成的纳米颗粒，其特征在于：将所述的抗菌肽的冻干粉溶解于pH＝6.0的超纯水中，超声30min，室温放置6-7天，抗菌肽单体在水溶液中充分自组装成纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的一种pH调节自组装抗菌肽SAP在制备治疗在pH＝6的环境下大肠杆菌感染性疾病药物中的应用。