CN109232717A - 一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽及制作方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽及制作方法与应用。其序列如序列表SEQ ID No.1所示，制备方法利用R语言统计分析天然抗菌肽库的氨基酸序列特征，对只针对革兰氏阴性菌具有抗菌活性的肽链各项影响抗菌活性的肽链参数进行统计分析，筛选得到最佳的氨基酸组成，即K、G、L；正电荷个数：4个，疏水性：30％‐50％。将色氨酸插入筛选序列中心设计得到中心对称的短肽序列；以获得低毒，高效不易引起机体免疫调节紊乱的短链窄谱抗菌肽序列。该靶向抗菌肽有利于在杀灭有害菌同时维持微生态平衡，该抗菌肽活性较高，稳定性强，细胞毒性相对较低，具备替代抗生素，成为更安全，环保新型抗菌产品的应用潜质。

Description

一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽及制作方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽及制作方法与应用。

背景技术

抗生素自上世纪50年代开始在畜牧业中使用以来，其作为饲料添加剂为提高畜产品产量，促进养殖业发展起到了重要的历史作用。然而，长期的大量使用，甚至滥用抗生素导致了耐药菌及超级细菌在世界范围内普遍出现，对人类的公共健康及环境安全造成了极大的危害。据不完全统计，欧洲每年至少有25,000人死于耐药菌感染，直接造成经济损失15亿欧元；美国每年近200万人深陷耐药菌治疗困境，而其中有23000人为此永远失去了生命，如果算上败血症等需要抗生素治疗的疾病，死亡人数直线飙升至21万人，而如果扩大范围至全世界，死亡人数将升至500万人(R.E.W.Hancock,2015)。为了抵抗耐药菌的入侵，世界各国都在加紧新型抗生素的研发，然而近几年发现的新型抗生素(包括万古霉素)都只是针对革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌没有任何效果。事实上，自上世纪60年代发现氟喹诺酮类以来，近50年来没有一个新的治疗革兰氏阴性菌药物被临床应用，人类正面临无药可用的可怖境地。因此，开发新型的抗革兰氏阴性菌药物成为了人们迫切的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽及制作方法与应用，该抗菌肽对革兰氏阴性菌，尤其是产肠毒素大肠杆菌具有靶向选择能力。

本发明的目的通过如下技术实现：

一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽，、其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽的制作方法，具体如下：

(1)利用R语言统计分析天然抗菌肽库的氨基酸序列特征，对只针对革兰氏阴性菌具有抗菌活性的肽链各项影响抗菌活性的肽链参数进行统计分析，筛选得到最佳的氨基酸组成，即lys、Gly、Leu；正电荷个数：4个，疏水性：30％-50％；

(2)将色氨酸插入筛选序列中心设计得到中心对称的短肽序列；以获得短链窄谱抗菌肽序列；

(3)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到F4肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到一条多肽，序列如序列表SEQ ID No.1所示；

(4)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

2、如上所述的一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的靶向抗菌药物中的应用。

4、如上所述的应用，其特征在于所述的革兰氏阴性菌为产肠毒素大肠杆菌。

本发明具有如下优点及有益效果：通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，大大降低筛选成本。并且，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现针对革兰氏阴性菌，尤其是产肠毒素大肠柑橘具有较强的杀灭作用，而对益生菌乳酸杆菌无影响，表现出较精准的靶向特异性，而且具有很低的溶血活性。体内模拟环境稳定性结果说明设计所得抗菌肽具有较高的应用潜力。综上所述，是一种具有较高应用价值的靶向抗菌肽。

附图说明

图1是抗菌肽的溶血活性结果图，图2是抗菌肽的细胞毒性结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

利用R语言统计分析天然抗菌肽库的氨基酸序列特征，对只针对革兰氏阴性菌具有抗菌活性的肽链各项影响抗菌活性的肽链参数进行统计分析，筛选得到最佳的氨基酸组成,即K(lys)，G(Gly),L(Leu)；正电荷个数：4个，疏水性：30％-50％。在此基础上，结合结构功能关系研究将色氨酸插入筛选序列中心设计得到中心对称的短肽序列；以获得低毒，高效不易引起机体免疫调节紊乱的短链窄谱抗菌肽序列。

表1抗菌肽的氨基酸序列

实施例2

固相化学合成法合成信息素标记抗菌肽

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，抗菌肽的纯度大于95％。

实施例3

抗菌肽活性的测定

1、抗菌活性的测定：将抗菌肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～10⁵个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果如表2所示。

表2-1针对革兰氏阴性菌抗菌肽的抑菌活性

表2-2针对革兰氏阳性菌抗菌肽的抑菌活性

表2-3生理盐环境下抗菌肽对大肠杆菌的抑菌活性

通过表2可以看出，设计得到的窄谱抗菌肽F4具有较强的针对革兰氏阴性菌的选择性杀灭作用，并表现出体内盐环境的抗菌稳定性。

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。结果如图1所示。如图可以看出，F4在最大测定浓度128μM下引起的溶血率仍低于15％，说明该抗菌肽具有较低的细胞毒性。

以上结果表明，本发明设计得到的靶向抗菌肽F4可特异性杀灭革兰氏阴性菌，对乳酸杆菌、葡萄球菌等无作用。同时表现出较低的细胞毒性，具有开发成靶向抗革兰氏阴性菌药物的潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽及制作方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Lys Lys Leu Gly Leu Trp Leu Gly Leu Lys Lys Gly

1 5 10

Claims (4)

1.一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽的制作方法，其特征在于，方法具体如下：

(1)利用R语言统计分析天然抗菌肽库的氨基酸序列特征，对只针对革兰氏阴性菌具有抗菌活性的肽链各项影响抗菌活性的肽链参数进行统计分析，筛选得到最佳的氨基酸组成，即lys、Gly、Leu；正电荷个数：4个，疏水性：30％-50％；

(2)将色氨酸插入筛选序列中心设计得到中心对称的短肽序列；以获得短链窄谱抗菌肽序列；

(3)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到F4肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到一条多肽，序列如序列表SEQ ID No.1所示；

(4)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成该抗菌肽的制备。

3.根据权利要求1所述的一种针对革兰氏阴性菌靶向抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌感染性疾病的靶向抗菌药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的革兰氏阴性菌为产肠毒素大肠杆菌。