CN109810178A

CN109810178A - 一种抗酶解抗菌肽i9h12及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109810178A
Application number: CN201910023187.XA
Authority: CN
Inventors: 单安山; 来振衡; 邵长轩; 谭鹏; 朱永杰; 陈婷婷
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN109810178B

Abstract

本发明提供一种抗酶解抗菌肽I9H12及其制备方法和应用。抗菌肽I9H12的序列为如序列表SEQ ID No.1所示。制备方法：参照氨基酸属性，同时尽可能规避体内主要蛋白酶的酶切位点，选出疏水性氨基酸异亮氨酸(Ile)和正电荷氨基酸组氨酸(His)作为主要氨基酸全新设计出I9H12抗菌肽，并将肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。该抗菌肽在制备治疗革兰氏阴性菌或真菌感染性疾病的靶向抗菌药物中的应用。本发明有效提高抗菌肽的抗酶解能力，提高了其在实际生产中应用的潜力。

Description

一种抗酶解抗菌肽I9H12及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗酶解抗菌肽I9H12及其制备方法和应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，通过抑制病原体在生物体皮肤及粘膜表面的生长从而起到保护机体的作用。很多细胞都可以释放抗菌肽，例如，上皮细胞，内皮细胞，白细胞，血小板等。抗菌肽通常由12-50个氨基酸残基组成，分子量小于10kDa，大多数抗菌肽含有带正电荷的氨基酸，具有两亲性和阳离子性，对多种细菌、真菌、病毒、寄生虫甚至是癌细胞都有抑制作用，而且还有促进伤口愈合，调节免疫应答等生物学活性。最主要的是，抗菌肽的抑菌机制与传统抗生素相比有所不同，它是物理性破膜机制，改变细胞膜的通透性，使细胞内容物泄漏，从而杀死微生物细胞，因此微生物细胞不易对其产生耐药性，并且抗菌肽具有高度的水溶性、热稳定性、盐离子稳定性。

目前，上千种抗菌肽已经被提取或者全新设计出来，但作为抗生素替代品投入实际应用的抗菌肽却很少。由于抗菌肽是一种多肽类物质，这些肽很容易被动物内源性蛋白酶和由入侵的微生物分泌的蛋白酶降解，产生更短的多肽、二肽或者单个的氨基酸分子，而抗菌肽需要保持分子的完整性才能保持其生物学活性，所以设计出一条高抗酶解抗菌肽势在必行。

发明内容

基于以上不足之处，提供一种抗酶解抗菌肽I9H12及其制备方法和应用，得到一种抗酶解能力强，生物学活性和细胞选择性较高的抗菌肽。本发明通过合理的重排氨基酸以避免蛋白酶切割位点，同时考虑正电荷数、疏水性、两亲性、肽链长度等抗菌肽重要指标，设计得到全新抗酶解抗菌肽，在丰富抗菌肽家族的同时，也为抗菌肽在实际生产中的应用取得了阶段性进步。

本发明所采用的技术如下：一种抗酶解抗菌肽I9H12，其序列如序列表SEQ IDNo.1所示。

本发明还具有如下技术特征：一种抗酶解抗菌肽I9H12的制备方法如下：以α-螺旋多肽折叠原则为基础，并以蛋白酶的特异性酶切为依据将氨基酸合理排布，设计出抗酶解的标准α-螺旋肽模板(YXXYXXY)3,X＝His，Y＝Ile，设计出的抗酶解抗菌肽命名为I9H12，其序列如序列表SEQ ID No.1所示，并将肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。

如上所述的一种抗酶解抗菌肽I9H12在制备治疗革兰氏阴性菌或真菌感染性疾病的靶向抗菌药物中的应用。

通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌活性、溶血活性和抗蛋白酶水解能力检测，发现抗菌肽I9H12在作用环境的pH为6.0时，不但对大肠杆菌，绿脓杆菌，鼠伤寒沙门氏菌等革兰氏阴性菌有明显的抑制作用，而且对白色念珠菌，热带念珠菌，近平滑念珠菌等真菌有高效的抑制作用，同时具有很低的溶血毒性。并且高浓度的胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，蛋白酶K，木瓜蛋白酶对I9H12的降解程度很小。因而，综合来看，I9H12是一种具有较高实际应用潜力的抗菌肽。

附图说明

图为抗菌肽I9H12的质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

抗菌肽的设计：

抗菌肽I9H12的氨基酸序列为：

参照氨基酸属性，同时尽可能规避体内主要蛋白酶的酶切位点，选出疏水性氨基酸异亮氨酸(Ile)和正电荷氨基酸组氨酸(His)作为主要氨基酸全新设计出I9H12抗菌肽，并将肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。抗菌肽的序列如表1所示。

表1全新设计肽的主要参数

I9H12为具有21个氨基酸的小肽，在pH为6.0时的电荷数为+13，疏水性氨基酸比例为0.4286。

实施例2：

将上述抗菌肽使用多肽合成仪进行合成，方法为固相化学合成法，具体步骤为：

1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；

2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2小时，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；

3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH＝7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干；

4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(见附图)与表1中的理论分子量基本一致，抗菌肽的纯度大于95％。

具体实施方式3：

对设计并合成得到的抗菌肽通过体外抑菌活性、溶血活性以及蛋白酶水解的能力进行检测；

1、抗菌活性的测定：利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。挑取细菌单菌落在MHB培养基中培养过夜，并转移至新的MHB中生长到对数中期。然后将上述细菌溶液离心并重悬于pH调节为6.0的MHB中至终浓度为1×10⁵CFUml^-1，并将其转移到96孔板中，每孔50μl，真菌在含有吗啉丙磺酸(MOPS)的RPMI 1640(pH＝6.0)培养基中稀释。将50μl含有不同浓度肽的BSA(pH＝6.0)分别加入到上述的96孔板中，96孔板中的最终肽浓度范围为0.125至64μM。在37℃温育22-24小时后，用酶标仪在492nm(OD＝492nm)处测定光吸收值,确定最小抑菌浓度。检测结果见表2。

通过表2可以看出，I9H12在pH为6.0时对于革兰氏阴性和真菌均表现出明显的抑菌活性。

2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2ml PBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10ml PBS(pH＝6.0)重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS(pH＝6.0)溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μL PBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度检测结果见表2。溶血浓度越大，表明溶血活性越小；通过表2可以看出，I9H12在检测范围内没有溶血活性。

表2作用环境pH＝6.0时I9H12的抑菌和溶血活性

3、蛋白酶水解的能力：为了检验抗菌肽对抗蛋白酶水解的能力，我们测定了抗菌肽经过不同类型蛋白酶处理后的抑菌活性。在37℃水浴条件下，用不同反应浓度为的胰蛋白酶、胃蛋白酶、靡蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶溶液分别处理抗菌肽，时间为1h，然后按照抗菌活性的测定中的方法，将这些处理后的抗菌肽与菌液混合于96孔培养板的孔中，以此来测定抗菌肽经过蛋白酶处理后的最小抑菌浓度是否发生了变化。对照组为没有经过抗菌肽处理的组别，测试结果见表3。

表3蛋白酶处理后的I9H12在作用环境pH＝6.0时对大肠杆菌25922的最小抑菌浓度

通过表3可以看出，胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶对I9H12的抑菌活性均没有影响，只有浓度为8mg/mL的糜蛋白酶对I9H12的抑菌活性有轻微影响，表明全新抗酶解抗菌肽I9H12具有优异的抗酶解能力。

以上结果显示，通过参照氨基酸属性，同时尽可能规避体内主要蛋白酶的酶切位点全新设计抗菌肽可以有效提高抗菌肽的抗酶解能力。综合分析抗菌肽经蛋白酶处理前和处理后的抑菌活性，可以通过抗酶解指数(蛋白酶处理后平均最小抑菌浓度与处理前最小抑菌浓度的比值；值越接近1抗酶解能力越强)来更全面的评价抗菌肽的抗酶解能力。由表2和表3可以看出，I9H12在作用环境pH为6.0时具有较高的细胞选择性和较低的抗酶解指数，同时I9H12在作用环境为酸性(pH＝6.0)时的治疗指数高达180.28，抗酶解指数低至1.78。保持了抗菌肽较高的治疗指数，同时有效提高抗菌肽的抗酶解能力，提高了其在实际生产中应用的潜力。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种抗酶解抗菌肽I9H12及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile His His Ile His His Ile Ile His His Ile His His Ile Ile His

1 5 10 15

His Ile His His Ile

20

Claims

1.一种抗酶解抗菌肽I9H12，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗酶解抗菌肽I9H12的制备方法，其特征在于，方法如下：以α-螺旋多肽折叠原则为基础，并以蛋白酶的特异性酶切为依据将氨基酸合理排布，设计出抗酶解的标准α-螺旋肽模板(YXXYXXY)3,X＝His，Y＝Ile，设计出的抗酶解抗菌肽命名为I9H12，其序列如序列表SEQ ID No.1所示，并将肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。

3.根据权利要求1所述的一种抗酶解抗菌肽I9H12在制备治疗革兰氏阴性菌或真菌感染性疾病的靶向抗菌药物中的应用。