CN106554400A - 非完美两亲性抗菌肽prw4‑r及其制备方法和应用 - Google Patents

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朱鑫
王志华
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Abstract

本发明提供一种非完美两亲性抗菌肽PRW4‑R及其制备方法和应用。其序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明截取PMAP‑36 N端16个氨基酸序列，得到具有完美两亲性结构的RI16。根据α‑螺旋蛋白折叠原则，利用色氨酸替换两亲性结构极性面中的成对的赖氨酸，得到了非完美两亲性抗菌肽PRW4，将PRW4序列中的赖氨酸全部换成精氨酸得到PRW4‑R。PRW4‑R的治疗指数高达161.5，该肽表现出较高的细胞选择性，而且具有很低的溶血活性，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。

Description

非完美两亲性抗菌肽PRW4-R及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-R及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽由于其广谱抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性，被认为是潜在的抗菌药物或抗生素替代品而受到广泛的关注。大部分抗菌肽主要通过不可逆的和高强度的破膜作用杀灭细菌的，因此这种独特的作用机理有助于减少细菌耐药性的发生。然而，合成的肽类药物或材料往往生物相容性差，产生异常的细胞毒性，杀菌活性效果较差。目前，广泛认为两亲性对抗菌活性和细胞毒性有很大影响。
两亲性主要是疏水性残基和亲水性残基簇的空间分布，是抗菌肽的另一个显著特征，并且对抗菌肽活性和细胞毒性有重要影响。在膜模拟环境下，除了一部分肽形成无规则构象外，大部分抗菌肽能够形成两亲性结构。当抗菌肽通过静电作用与细菌膜外层的阴离子磷脂结合后，两亲性促使抗菌肽的疏水性部分插入到脂质双分子层，与疏水性磷脂酰基作用，从而穿透细胞膜。
尽管两亲性对抗菌肽发挥膜溶解机制是必要的，但是越加完美的两亲性结构对抗菌肽最佳活性和细胞选择性而言却是不必要的。对于α-螺旋肽的研究表明，在保持其他参数不变的情况下，增加两亲性会同时提高杀菌活性和细胞毒性，且细胞毒性的增加高于杀菌活性。相似地，对β-折叠抗菌肽的研究也得到了同样的结论。所以，适度的降低完美两亲性可以获得抗菌活性强和细胞毒性弱的抗菌肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-R及其制备方法和应用；该抗菌肽对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌活性较高而细胞毒性相对较低。
本发明的目的通过如下技术实现：一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-R，序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-Rd制备方法包括如下步骤：
(1)截取PMAP-36N端16个氨基酸序列，得到具有完美两亲性结构的RI16，根据α-螺旋蛋白折叠原则，利用色氨酸替换两亲性结构极性面中的成对的赖氨酸，设计了非完美两亲性抗菌肽PRW4，序列如SEQ IDNo.2所示；将PRW4序列中的赖氨酸全部换成精氨酸得到非完美两亲性抗菌肽PRW4-R，序列如SEQ ID No.1所示；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到PRW4-R肽树脂，将得到的PRW4-R肽树脂经过TFA切割后，得到多肽PRW4-R；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备。
如上所述的一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-Rd，在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病药物中的应用。
通过本方法制备的抗菌肽的实验技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现PRW4-R对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和粪链球菌等多种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，该肽表现出较高的细胞选择性。综上所述，PRW4-R是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗菌肽的设计
完美的两亲性结构在提高抗菌肽杀菌活性的同时，通常又不可避免的引起细胞毒性的增加。因此，适度破坏抗菌肽的两亲性可能在提高抗菌活性的同时，降低细胞毒性。截取猪骨髓含36个氨基酸的阳离子抗菌肽PMAP-36N端16个氨基酸序列，得到具有完美两亲性结构的RI16。根据α-螺旋蛋白折叠原则，利用色氨酸(Trp)替换两亲性结构极性面中的成对的赖氨酸(Lys)，设计了非完美两亲性抗菌肽PRW4；将PRW4序列中的Lys全部换成Arg得到PRW4-R。氨基酸序列如表1所示。
表1 衍生肽的氨基酸序列
肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。通过该方法在提高抗菌肽杀菌活性的情况下，降低了抗菌肽的溶血活性，提高了抗菌肽在细菌细胞和哺乳动物细胞之间的选择性，提高了其成为抗生素替代物的发展潜力。
实施例2
固相化学合成法合成抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂；
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干；
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3
抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。检测结果如表2所示。
表2 抗菌肽的抑菌活性
通过表2可以看出，PRW4和PRW4-R对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果都很好，因此非完美两亲性设计的抗菌肽具有成为新一代抗菌药物的潜力。
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；l h后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。检测结果如表3所示。
表3 抗菌肽溶血活性的测定
通过表3可以看出,随着序列增加其抗菌活性显著提高。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，设计得到的PRW4-R抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。
<110> 东北农业大学
<120>非完美两亲性抗菌肽PRW4-R及其制备方法和应用
<160> 2
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Phe Arg Arg Leu Arg Trp Arg Thr Arg Trp Arg Leu Arg Arg Ile-NH2
1 5 10 16
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<400>2
Arg Phe Arg Arg Leu Arg Trp Lys Thr Arg Trp Arg Leu Lys Lys Ile-NH2
1 5 10 16

Claims (3)

1.一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-R，其特征在于，序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-R的制备方法，包括如下步骤：
(1)截取PMAP-36N端16个氨基酸序列，得到具有完美两亲性结构的RI16，根据α-螺旋蛋白折叠原则，利用色氨酸替换两亲性结构极性面中的成对的赖氨酸，设计了非完美两亲性抗菌肽PRW4，序列如SEQ IDNo.2所示；将PRW4序列中的赖氨酸全部换成精氨酸得到非完美两亲性抗菌肽PRW4-R，序列如SEQ ID No.1所示；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到PRW4-R肽树脂，将得到的PRW4-R肽树脂经过TFA切割后，得到多肽PRW4-R；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备。
3.根据权利要求1所述的一种非完美两亲性抗菌肽PRW4-R，在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病药物中的应用。
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