CN117164722A - 一种螺旋束damp4-pr-fo融合蛋白d2l及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种螺旋束DAMP4‑PR‑FO融合蛋白D2L及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。制备方法是：将DAMP4和PR‑FO通过柔性长连接序列连接，根据密码子偏好性，对序列进行密码子优化构建毕赤酵母高效表达平台；最后选择性地沉淀细胞蛋白质污染物。融合蛋白D2L改善了PR‑FO的酶稳定性并且有良好的盐离子、血清、热、蛋白酶稳定性。本制备方法有效地降低了生产成本，提高了重组产物回收率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种螺旋束DAMP4-PR-FO融合蛋白D2L及其制备方法和应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)作为宿主免疫系统的重要组成部分广泛存在天然生物体中，具有抗细菌、抗真菌、抗炎等多种生物活性并且作用机制独特。因此，AMPs被认为有潜力替代传统抗生素成为新型饲料添加剂。
杂合肽PR-FO是一种新型的α螺旋阳离子AMP，相比于原肽PRW4，PR-FO抗菌活性提高了4-64倍，展现更强的内毒素中和能力及细胞选择性。PR-FO的优良性质使其作为一种高效的抗菌剂在畜牧生产中有广阔的应用前景。目前，PR-FO的制备主要采用基于Fmoc的固相合成法，然而其成本高昂。此外，PR-FO含31个氨基酸残基，对合成技术要求高，限制较多，增加了合成的难度。基于基因工程手段制备重组PR-FO似乎成为推进其产业化的有效桥梁。针对PR-FO分子量小、易被降解、对宿主菌有毒害作用等制约因素，融合表达策略被广泛应用于重组表达中。然而，由于发挥作用的PR-FO被转移到融合标签上，必需经过多次色谱层析、切割等处理获得重组PR-FO，这种策略无疑增加了成本并且造成产量部分损失。此外，研究表明，PR-FO存在酶环境下抗菌活性严重损失的问题。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的提供一种螺旋束DAMP4-PR-FO融合蛋白D2L，以解决杂合肽PR-FO在酶环境下抗菌活性严重损失的问题。
本发明所采用的技术方案如下：一种螺旋束DAMP4-PR-FO融合蛋白D2L，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步的，本发明提供一种核酸片段，所述的核酸片段编码如上所述的融合蛋白D2L。
进一步的，本发明提供一种重组载体，所述的重组载体中插入了如上所述的核酸片段。
本发明的另一目的在于公开如上所述的一种螺旋束DAMP4-PR-FO融合蛋白D2L的制备方法，以解决PR-FO制备成本高、产量低的问题，步骤如下：
步骤一、基于DAMP4耐热耐盐特性，设计DAMP4-PR-FO融合蛋白。通过以下连接序列将DAMP4与PR-FO融合：可裂解的肠激酶识别序列DDDDK和不可裂解的柔性连接序列(GGGGS)n，其中，当n＝4时，通过(GGGGS)4连接序列连接得到D2L，其序列如SEQ IDNo.1所示；
步骤二、构建重组载体pPICZαA-D2L并通过毕赤酵母表达系统进行表达，然后纯化去除蛋白质污染物，得到重组融合蛋白D2L；
步骤三、对重组融合蛋白D2L进行圆二色谱测定、抗菌活性测定和稳定性测定，完成融合蛋白D2L的制备。
进一步的，步骤二纯化去除蛋白质污染物的方法具体如下：向蛋白质混合物中添加Na2SO4，混合液中Na2SO4最终浓度为1M，90℃水浴加热30min，沉淀、离心去除细胞蛋白质污染物。
本发明的另一目的是提供如上所述的一种DAMP4-PR-FO的融合体D2L在制备治疗由革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌所引起的感染性疾病药物中的应用。
本发明的优点及有益效果：本发明通过螺旋束DAMP4-PR-FO的融合体设计出融合蛋白D2L，利用简易设备(水浴锅、离心机)以及精简纯化流程(“烘焙-沉淀”)，有效地降低了生产成本，经测定，重组D2L产量约为79.02mg/L，纯度为85.19％。本发明的重组D2L改善了PR-FO的酶稳定性，并且有良好的盐离子、血清和热稳定性。综上所述，D2L具有较高的应用价值。
附图说明
图1是重组表达载体pPICZαA-D2L的构建图；
图2是PCR筛选重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L图；
其中，1为DNA marker，2为阴性对照，3为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA，4-23为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L；
图3是重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L多拷贝转化子筛选图；
图4是Tricine-SDS-PAGE检测重组产物图；
其中，1为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA发酵上清液，2为蛋白Marker，3-10为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L发酵上清液；
图5是SDS-PAGE分析加热、加盐纯化D2L图；
其中，(A)1为蛋白Marker；2为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L发酵上清液；3，5，7，9分别为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L发酵上清液在30℃，50℃，70℃，90℃加热30min离心后上清；4，6，8，10分别为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L发酵上清液在30℃，50℃，70℃，90℃加热30min离心后沉淀。(B)3，5，7，9分别为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-DK/DL/D2L重组载体发酵上清液添加浓度为0M，0.5M，0.75M，1MNa2SO4加热(90℃，30min)离心后上清；4，6，8，10分别为重组菌株P.pastoris X33-pPICZαA-D2L发酵上清液添加浓度为0M，0.5M，0.75M，1M Na2SO4加热(90℃，30min)离心后沉淀；
图6是重组D2L的肽质量指纹图谱；
图7是重组D2L的N端序列分析图；
图8是重组D2L的C端序列分析图；
图9是重组D2L和PR-FO溶血活性图。
具体实施方式
实施例1抗菌肽的设计合成
PR-FO：将抗菌肽PRW4和Fowlicidin-2的1-15两亲性区组合设计得到新型杂合肽PR-FO。PR-FO与原肽PRW4相比其抗菌活性提高4-64倍，与原肽Fowlicidin-2相比对于革兰氏阳性菌的抗菌活性表现出2-32倍的增加，拓宽了抗菌谱。并且其展现更强的内毒素中和能力及细胞选择性。
DAMP4：DAMP4由4个相同的α-螺旋模式组成(遵循七个残基)，其中每一个第1位和第4位是疏水残基，通过DPS序列连接，以确保螺旋终止，促进相邻环之间的静电排斥，并提供足够的柔性以折叠成稳定的四螺旋束。四螺旋束结构具有耐热耐盐特性，并且在溶液中的稳定性极高，使其适用于开发工业相关纯化程序。
将DAMP4和PR-FO通过(GGGGS)4序列连接，获得D2L。D2L的序列如表1所示。
表1D2L的序列
实施例2构建重组表达载体
依据巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性进行基因优化。在其5'端依次添加Xho I酶切位点和D2L序列的编码基因，在3'端添加终止密码子TAA和Xba I酶切位点。目的基因D2L亚克隆至毕赤酵母表达载体pPICZαA，构建pPICZαA-D2L重组载体。构建图如图1所示。
将重组表达载体pPICZαA-D2L质粒用Sac I线性化后电转化至P.pastoris X33感受态细胞，经ZeocinTM筛选和PCR鉴定，表明目的基因成功整合到P.pastoris X33基因组中。PCR鉴定结果如图2所示。
挑取阳性转化子依次点种到含有不同浓度Zeocin(500，1000，2000μg/mL)的YPD平板上，30℃恒温培养箱中避光培养2-3天，观察P.pastoris转化子的生长情况，筛选含有多拷贝目的基因的重组P.pastoris X33。转化子在Zeocin浓度梯度平板上生长情况如图3所示。
实施例3融合蛋白的表达
将筛选的多拷贝阳性转化子接种到BMGY和BMMY培养基中进行摇瓶表达，将P.pastoris X33-pPICZαA-D2L以及P.pastoris X33-pPICZαA发酵上清液进行TCA浓缩，Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示目的基因成功表达，结果如图4所示。
实施例4D2L(重组D2L)的纯化
取800μL发酵上清液于2mL离心管内，分别在30℃，50℃，70℃，90℃水浴加热30min，冷却后，将混合物溶液在44,000g离心20min，得到上清和沉淀物，确定最佳纯化温度为90℃。
将不同体积的2M Na2SO4溶液与800μL发酵上清液于2mL离心管内混合。然后将Na2SO4最终浓度分别调整为0.5M、0.75M和1M，将所有混合物样水浴加热(90℃，30min)。在热处理期间摇动试管以诱导沉淀，直至反应完成。待混合物冷却后，44,000g下离心20min，得到上清和沉淀物。
通过SDS-PAGE分析上述上清和沉淀样品的纯化效果，结果如图5所示。向蛋白质混合物中添加Na2SO4(1M)、加热(90℃，30min)来选择性地沉淀细胞蛋白质污染物。经测定，重组D2L产量约为79.02mg/L(纯度85.19％)。
通过肽质量指纹图谱(PMF)分析，如图6所示，D2L与对应序列为51％的覆盖率。通过对D2L N端序列分析，如图7所示，其N端6个氨基酸序列推测为：NH2-His-His-His/Pro-His-His/Pro-His/Pro。其C端序列检测到127位序列如图8所示。经验证，重组D2L序列符合预期。
实施例5抗菌肽的二级结构分析
通过CD光谱对重组/合成肽的二级结构进行分析，结果表明，在水溶液条件下，重组D2L表现出α-螺旋构象；当温度从20℃升高到90℃时，重组D2L都能观察到α-螺旋的少量损失；当温度进一步到110℃时，重组D2L仍保持着α-螺旋结构。而PR-FO始终呈现出近乎无规则卷曲的结构构象。在1M Na2SO4存在的溶液条件下，温度从20℃进一步增加到110℃，重组D2L依旧保持着明显的α-螺旋构象，PR-FO依旧呈现出近乎无规则卷曲的结构构象。在10mM PBS、30mM的SDS(模拟细菌细胞膜带负电膜环境)溶液和50％的TFE(模拟细菌细胞膜疏水性膜环境)中重组D2L均呈现α-螺旋结构。PR-FO只在30mM的SDS溶液和50％的TFE中呈现α-螺旋结构。
实施例6重组D2L与PR-FO的的抑菌活性
将接种于MHB的菌种于220rpm、37℃摇床中过夜培养，转移至新的MHB培养基培养至对数中期，调整菌体浓度稀释至OD620＝0.1的菌液，用MHB进一步稀释1000倍备用。将50μL的细菌悬浮液添加到50μL肽稀释溶液中(肽的终浓度为1至64μM)。阳性对照为(50μL菌液+50μL BSA)，阴性对照为(50μL MHB+50μL BSA)。96孔培养板于37℃培养箱中放置18-24h。用酶标仪在492nm处测定吸光度值，确定最小抑菌浓度。进行3次独立重复试验，每个重复两个平行。结果见表1。
表1重组D2L与PR-FO的抑菌活性
实施例7溶血活性
将收集的人类健康血液以1000×g离心5分钟以收集红细胞。然后洗涤红细胞，并重悬于10mM PBS(pH＝7.4)中。将50μL红细胞稀释液和等体积的肽溶液在96孔板中于37℃孵育1小时(肽的终浓度为2至128μM)。用0.1％的Triton X-100处理的红细胞悬液用作阳性对照(100％溶血)，未处理的血细胞悬液用作阴性对照。将96孔板在4℃下以1000×g离心5分钟，然后将上清液转移至新的96孔板中。用酶标仪在570nm下测量吸光度。重组D2L、PR-FO的溶血活性如图9所示。
实施例8选择性指数
为进一步评估肽的细胞选择性，计算重组/合成肽的“选择性指数(SI)”(MHC/GMMIC)。结果如表2所示。
表2重组/合成肽的选择性指数
注：a：MHC是引起10％溶血时所对应的肽浓度。
b：GMMIC表示所测细菌的MIC值的几何平均值(μM)，当在128μM时没有观察到可检测到的溶血活性时，使用256μM的值来计算SI。
c：SI＝MHC/GMMIC
实施例9重组/合成肽的盐离子稳定性
将盐离子添加到0.2％ BSA溶液中，终浓度为：150mM Na+，4.5mM K+，6μM NH4 +，1mMMg2+，2mM Ca2+，，8μM Zn2+，和4μM Fe3+。参照例6的方法确定含生理盐离子的情况下的重组D2L和PR-FO对E.coli ATCC 25922的MIC值。
表3重组/合成肽的生理盐离子稳定性
注：a：不含生理盐离子的情况下测定的最小抑菌浓度。
b：表示各种盐离子作用下所测细菌的MIC值的几何平均值(μM)。
c：几何平均值与对照的比值
重组/合成肽的生理盐离子稳定性如表3所示，重组D2L和PR-FO对E.coli ATCC25922的MIC分别变化了1.22倍和1.49倍。重组D2L的生理盐离子稳定性优于合成PR-FO。
实施例10重组/合成肽的血清稳定性
将100％、50％和25％的胎牛血清与等体积的样品在37℃处理4小时。参照例6的方法确定含血清的情况下的重组D2L和PR-FO对E.coli ATCC 25922的MIC值。
表4重组/合成肽的血清稳定性
注：a：不含血清的情况下测定的最小抑菌浓度。
b：表示各种血清作用下所测细菌的MIC值的几何平均值(μM)。
c：几何平均值与对照的比值。
如表4所示，重组/合成肽的血清稳定性结果，重组D2L和PR-FO均受不同浓度的血清(25％，50％，100％)影响较小，表现出良好的血清稳定性。
实施例11重组/合成肽的热稳定性
将样品在100℃分别处理30min、60min和90min。参照例6的方法确定加热情况下的重组D2L和PR-FO对E.coli ATCC 25922的MIC值。
表5重组/合成肽的热稳定性
注：a：不经热处理的情况下测定的最小抑菌浓度。
b：表示各种热处理作用下所测细菌的MIC值的几何平均值(μM)。
c：几何平均值与对照的比值。
重组/合成肽的热稳定性如表5所示。在100℃下加热30分钟、60分钟和90分钟后，重组D2L和PR-FO其MIC均值降低了2-4倍，均表现出了高度的热稳定性。
实施例12重组/合成肽的蛋白酶稳定性
将4mg/mL胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶与等体积的样品在37℃孵育2小时。参照例6的方法确定与蛋白酶孵育后的重组D2L和PR-FO对E.coli ATCC 25922的MIC值。
表6重组/合成肽的酶稳定性
注：a：未经酶处理的情况下测定的最小抑菌浓度。
b：表示各种酶作用下所测细菌的MIC值的几何平均值(μM)。
c：几何平均值与对照的比值，当最小抑菌浓度为>64μM，按64μM计算。
不同蛋白酶对重组/合成肽抗菌活性的影响如表6所示。与2mg/mL的胰蛋白酶或糜蛋白酶或胃蛋白酶或蛋白酶K孵育2h后，重组D2L的抗菌活性未发生任何变化。合成PR-FO在蛋白酶K和胃蛋白酶处理后MIC上升4倍，但是在胰蛋白酶和糜蛋白酶处理后就完全失去活性。从变化倍数可见，通过连接序列连接得到的重组D2L较合成PR-FO相比，表现出很高的蛋白酶稳定性。
Claims (6)
1.一种螺旋束DAMP4-PR-FO融合蛋白D2L，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段编码如权利要求1所述的融合蛋白D2L。
3.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体中插入了如权利要求2所述的核酸片段。
4.根据权利要求1所述的一种螺旋束DAMP4-PR-FO融合蛋白D2L的制备方法，其特征在于，方法如下：
步骤一、通过以下连接序列将DAMP4与PR-FO融合：可裂解的肠激酶识别序列DDDDK和不可裂解的柔性连接序列(GGGGS)n，其中，当n＝4时，通过(GGGGS)4连接序列连接得到D2L，其序列如SEQ ID No.1所示；
步骤二、构建重组载体pPICZαA-D2L，并通过毕赤酵母表达系统进行表达，然后纯化去除蛋白质污染物，得到重组融合蛋白D2L；
步骤三、对重组融合蛋白D2L进行圆二色谱测定、抗菌活性测定和稳定性测定，完成融合蛋白D2L的制备。
5.根据权利要求4所述的一种螺旋束DAMP4-PR-FO融合蛋白D2L的制备方法，其特征在于，步骤二纯化去除蛋白质污染物的方法具体如下：向蛋白质混合物中添加Na2SO4，混合液中Na2SO4最终浓度为1M，90℃水浴加热30min，沉淀、离心去除细胞蛋白质污染物。
6.根据权利要求1所述的一种DAMP4-PR-FO的融合体D2L在制备治疗由革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌所引起的感染性疾病药物中的应用。
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