CN113912691B - 重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组长牡蛎高迁移率族蛋白r‑CgHMGB1、制备方法及其应用，重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，制备方法依次按照如下步骤进行：用引物P1和P2对长牡蛎CgHMGB1编码区片段进行PCR扩增，所述引物P1 DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2 DNA序列如SEQ ID NO.3所示；将PCR扩增产物与pET30a载体经BamHI和XholI酶切后通过T4连接酶连接，测序鉴定重组子；将上述重组子转入大肠杆菌Transetta(DE3)表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性即可，所述重组长牡蛎高迁移率族蛋白r‑CgHMGB1可应用于制备抗灿烂弧菌及大肠杆菌药物。

Description

重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1、制备方法及其应用。

背景技术

高迁移率族蛋白B1（HMGB1）是一类包含高迁移率族蛋白（HMG）结构域且氨基酸序列高度保守的分子，在抗菌免疫和炎症反应中具有重要的作用。该结构域于1973年首次在牛胸腺中被提取和鉴定，近年来，越来越多含HMG结构域蛋白在脊椎动物和无脊椎动物中被发现。HMGB1包含两个称为A-box和B-box的HMG结构域及一个羧基端酸性尾区，B-box是引起炎症反应的功能结构域，而A-box对B-box有一定的拮抗作用，羧基端酸性尾区201 -205残基负责HMGB1的抗菌活性。从人类和大鼠睾丸中纯化HMGB1具有类似抗生素的功能，对几种类型的细菌均具有杀菌活性，但目前未见长牡蛎高迁移率族蛋白CgHMGB1具有抗菌免疫功能的报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1、制备方法及其应用。

本发明的技术解决方案是：一种重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种如上所述重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a. 利用引物P1和P2，通过PCR扩增获得长牡蛎CgHMGB1编码区片段，所述引物P1的DNA序列如SEQ ID NO. 2所示，所述引物P2的DNA序列如SEQ ID NO. 3所示；

b. 分别将PCR扩增产物与pET30a载体利用BamHI和Xhol I酶进行酶切，将酶切后的PCR扩增产物与pET30a载体通过T4连接酶连接、转化，构建重组子；

c. 将所述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）中进行诱导培养，而后利用His标签亲和纯化、复性，获得重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1。

一种如上所述重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1在制备抗灿烂弧菌和大肠杆菌药物中的应用。

本发明采用特定引物对长牡蛎CgHMGB1编码区片段进行PCR扩增，分别将PCR扩增产物与pET30a载体通过T4连接酶连接、转化，构建重组子，并将重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）中进行诱导培养，而后利用His标签亲和纯化、复性，获得重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1。所制备的重组长牡蛎高迁移率族蛋白具有显著抑制及杀灭灿烂弧菌和大肠杆菌的活性，可应用于制备抗灿烂弧菌和大肠杆菌的药物。

附图说明

图1是本发明实施例重组蛋白r-CgHMGB1菌结合活性检测效果图。

图2是本发明实施例重组蛋白r-CgHMGB1糖结合活性检测效果图。

图3是本发明实施例重组蛋白r-CgHMGB1抑菌作用检测效果图。

图4是本发明实施例重组蛋白r-CgHMGB1杀菌作用检测效果图。

具体实施方式

本发明的重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1的制备方法，依次按照如下步骤进行：

1. 重组载体的构建

本发明实施例采用重组载体为Novagen公司pET-30a(+)原核表达载体。通过PCR技术，采用5’末端分别添加了BamHI和Xhol I限制性酶切位点引物P1和P2，对长牡蛎CgHMGB1mRNA编码区进行扩增，所述引物P1 DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物P2 DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

PCR反应条件为：首先94℃预变性5 min，然后进入下列循环：94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。利用琼脂糖胶电泳将扩增片段纯化回收，与pMD19-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用BamHI和Xhol I对质粒进行双酶切；回收目的片段与经BamHI和Xhol I酶切的表达载体pET-30a(+)连接，完成重组质粒的构建。

2. 重组蛋白r-CgHMGB1的表达

将构建好的重组质粒转化表达大肠杆菌Transetta（DE3）中，挑取单克隆菌株，接种于200 mL LB液体培养基中，220 rpm，37℃培养至OD₆₀₀=0.4~0.6。加入IPTG（终浓度1mmol·L^-1），继续培养4 h后于4℃，8,000 rpm离心20 min，收集菌体，于-80℃冻存备用；同时取1 mL菌液离心，弃去上清后，加入80 μL水和20 μL 5×蛋白上样缓冲液，99℃煮沸10min，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。

3.重组蛋白r-CgHMGB1纯化与复性

将菌体采用镍琼脂糖凝胶FF柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：

（1）镍琼脂糖凝胶FF装柱，15.6×83 mm，空柱体积为12 mL；

（2）用缓冲液I（50 mmol·L^-1 Tris-Hcl缓冲液，pH 9.0，50 mmol·L^-1 NaCl，8mol·L^-1尿素）平衡2~5个床体积，流速为2 mL·min^-1；

（3）取经IPTG诱导表达细胞，用缓冲液I重悬，150 W超声破碎30 min，12,000 rpm，4℃离心30 min，上清液用0.45 μm滤膜过滤后，过柱，流速为1 mL·min^-1；

（4）用缓冲液1再洗2~5个床体积，流速为2 mL·min^-1；

（5）用有50 mmol·L^-1咪唑缓冲液I再洗2~5个柱床体积，流速为2 mL·min^-1；

（6）用400 mmol·L^-1咪唑缓冲液I洗脱目的蛋白，收集；

（7）用SDS-PAGE检测融合蛋白表达；

（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%乙醇流洗3个柱床体积，流速为2 mL·min^-1，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2 mM还原谷胱甘肽、0.4 mM氧化谷胱甘肽、1 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始6 M逐渐替换到4 M、3 M、2 M、1 M、0 M，最后一次透析至无尿素透析液时不加甘油，每次在4℃透析12 h。即得到长牡蛎CgHMGB1重组蛋白r-CgHMGB1。

所得到的重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

长度：202个氨基酸

类型：氨基酸

链型：单链

特性：分子量为23.34 kDa，等电点为6.13，具有两个HMG结构域。

实验例1：重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1菌结合活性检测

基于Western blotting方法检测重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1对两种革兰氏阴性菌：灿烂弧菌（Vibrio splendidus JZ6，图中简写为V. splendidus组，下同）和大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli），三种革兰氏阳性菌：藤黄微球菌（Micrococcus luteus, M. luteus），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, B. subtilis）以及一种真菌毕赤酵母（Pichia pastoris GS115, P. pastoris）的结合活性。所用菌种来源如下：灿烂弧菌购自北京微生物菌种保藏中心，大肠杆菌购自北京全式金公司，金黄色葡萄球菌购自北京微生物菌种保藏中心，藤黄微球菌购自北京微生物菌种保藏中心，枯草芽孢杆菌购自北京微生物菌种保藏中心，毕赤酵母菌购自Invitrogen。

具体操作如下：

（1）对上述6种微生物进行过夜培养，培养方法：藤黄微球菌和大肠杆菌于LB培养基37℃培养20 h，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌于LB培养基28℃培养20 h，灿烂弧菌于2216E培养基中28℃培养20 h，毕赤酵母菌于YPD培养基中28℃培养20 h；

（2）离心收集菌体，使用TBS缓冲液重悬，调整菌浓度为1×10⁸ CFU·mL^-1；

（3）吸取100 μL微生物悬液与等体积本发明实施例所得重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1混合，于室温旋转孵育30 min；

（4）10,000 rpm离心2 min收集菌体，TBS缓冲液清洗菌体四次；

（5）洗涤完成后收集菌体，用40 μL无菌水重悬；

（6）加入10 μL 5×蛋白电泳缓冲液，于99℃加热10 min，SDS-PAGE电泳分离蛋白样品；

（7）电泳完成后，取下凝胶，并裁取相同大小NC膜和滤纸共同浸入电转缓冲液中静置10 min；

（8）按照从上到下顺序依次将滤纸、NC膜、凝胶和滤纸放入电转仪中，根据凝胶块面积大小设定对应电流，转膜25 min；

（9）取出NC膜，用TBS缓冲液洗涤三次，每次5 min；

（10）使用缓冲液TBST洗涤三次，每次5 min；

（11）将NC膜放入5%脱脂奶粉（溶解于TBST）中，室温封闭2 h；

（12）取出NC膜，用TBST缓冲液洗涤三次，每次5 min；

（13）将NC膜浸入按比例稀释的His标签单抗（购于上海生工）溶液（5%脱脂奶粉，TBST缓冲液），于室温条件下孵育1 h；

（14）取出NC膜，用TBST缓冲液洗涤三次，每次5 min。

（15）将NC膜放入按比例稀释的羊抗小鼠HRP二抗（购自于上海生工）溶液中（5%脱脂奶粉TBST缓冲液），于室温孵育2 h；

（16）取出NC膜，使用TBST缓冲液洗涤三次，每次5 min；

（17）ECL方法显影，成像仪记录Western blotting结果，如图1所示。

结果表明，本发明实施例重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1对革兰氏阴性菌具有明显结合活性，rTrx阴性对照组中则无明显条带。

实验例2：重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1 的糖结合活性检测

利用酶联免疫吸附反应（ELISA）实验检测重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1与各种PAMPs结合情况。所用肽聚糖（peptidoglycan, PGN）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）和葡聚糖（glucan, GLU）均购买自Sigma。

具体操作步骤如下：

（1）将10 μg各种PAMPs分别溶于Na₂CO₃与NaHCO₃按15 mmol·L^-1和35 mmol·L^-1浓度配置pH值为7.6的包被液，每孔100 μL包被酶标板，4℃冰箱过夜；

（2）弃掉包被液体并TBST清洗3次，每次5 min；

（3）清洗后孔内加3% BSA 200 μL于37℃恒温培养箱中封闭1 h；

（4）封闭完毕后用TBST清洗3次，每次5 min；

（5）各孔加入稀释的浓度梯度重组蛋白100 μL（阴性对照加入rTrx蛋白，对照孔加TBS）室内恒温孵育2 h；

（6）孵育完毕后清洗同步骤（4）；

（7）各孔中以1:1,000比例加入100 μL的His标签一抗，37℃放置1 h；

（8）孵育完毕后清洗同步骤4；

（9）之后步骤7中抗体换成HRP二抗，并37℃恒温培养箱孵育1 h；

（10）用TBST洗涤各孔3次，每次5 min；

（11）利用TMB显色液显色约30 min后加入终止液50 μL（浓度为2 M NaOH）终止显色。随后测定得到OD₄₅₀数值，结果如图2所示。

结果表明，本发明实施例重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1与PGN、LPS和GLU都具有较高的结合活性，并且r-CgHMGB1与LPS亲和力随CgHMGB1重组蛋白浓度递增而加强。阴性对照rTrx与以上三种糖均无结合活性。

实验例3：重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1 的抑菌活性检测

重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1与两种细菌（灿烂弧菌和大肠杆菌）孵育，使用酶标仪（Tecan Infinite M1000 PRO）检测菌液的浓度，分析重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1的抑菌活性。

所述菌种来源如上。

具体操作如下：

（1）本次实验分为三个组：本发明实施例重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1处理组，rTrx对照组（阴性对照），TBS对照组（空白对照），每个实验组重复次数不小于三个平行；

（2）将上述两种微生物分别培养并收集菌体；

（3）用LB培养基将收集的菌液洗两遍后，用LB培养基重悬菌体并调整其吸光值OD₆₀₀为0.3，向酶标板中加入50 μL菌液；

（4）将本发明实例例所得50 μL重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1（最终浓度为0.2 mg·mL^-1）与细菌以1:1体积加入96孔酶标板中。以rTrx（0.2 mg·mL^-1）组为对照组；

（5）每孔再加入100 μL LB无菌培养基；

（6）每个样品在37℃，200 rpm下孵育，每30 min用Tecan Infinite M1000 PRO酶标仪测定OD₆₀₀的吸光值，直到12 h。根据三次独立实验的数据绘制微生物生长曲线，结果如图3所示。

结果显示，本发明实施例重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1对灿烂弧菌和大肠杆菌有明显抑菌活性。

实验例4：重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1 的杀菌活性检测

重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1对两种微生物（灿烂弧菌和大肠杆菌）进行杀菌实验，然后通过计算平板上菌落生长数目评价重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1杀菌活性。

所述菌种来源如上。

将大肠杆菌和灿烂弧菌分别进行培养。在TBS（pH 7.4）中添加重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1，其最终浓度为0.2 mg·mL^-1。rTrx（终浓度为0.2 mg·mL^-1）蛋白作为阴性对照。用200 μL r-CgHMGB1和rTrx分别与200 μL菌液孵育5 h。然后将孵育后的产物稀释1,000倍，涂布于固体Luria-Bertani（LB）培养基上，28℃培养24-48 h，计数细菌数量。每个实验重复三次。

具体操作如下：

（1）本次实验分组：r-CgHMGB1与大肠杆菌处理组， rTrx与大肠杆菌处理组，r-CgHMGB1与灿烂弧菌处理组，rTrx与灿烂弧菌处理组；

（2）将上述两种微生物分别培养并收集菌体；

（3）用TBS（pH 7.4）将收集的菌液洗两遍后，用LB培养基重悬菌体并调整其吸光值OD₆₀₀=0.3；

（4）将本发明实施例所得200 μLr-CgHMGB1（最终浓度为0.2 mg·mL^-1）与200 μL菌液（灿烂弧菌和大肠杆菌）孵育5 h。对照组rTrx（0.2 mg·mL^-1）作为对照；

（5）取50 μL孵育后并稀释1000倍的液体，涂布于LB平板，每个实验组至少涂三个平板；

（6）将涂布好的培养皿放入28℃恒温培养箱中，培养24-48 h。统计平板上的菌落数目，根据三次独立实验绘制统计图，结果如图4所示。

结果显示，本发明实例长牡蛎CgHMGB1重组蛋白对灿烂弧菌和大肠杆菌具有明显杀菌活性。

序列表

<110> 大连海洋大学

<120> 重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1、制备方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 202

<212> PRT

<213> 长牡蛎(Crassostrea gigas)

<400> 1

Met Gly Arg Pro Lys Ala Glu Gly Ser Arg Lys Arg Lys Ala Lys Asp

1 5 10 15

Pro Asn Arg Pro Lys Arg Ala Thr Ser Ala Tyr Phe Phe Phe Leu Ser

20 25 30

Lys Met Arg Glu Asp Ser Lys Lys Ala Gly Lys Pro Ile Thr Lys Ile

35 40 45

Ala Glu Phe Thr Lys Glu Cys Ser Ala Lys Trp Ala Lys Met Asn Glu

50 55 60

Lys Asp Lys Glu Pro Phe Ala Lys Lys Ala Leu Thr Asp Lys Asn Arg

65 70 75 80

Tyr Asp Ala Glu Met Ala Ile Tyr Lys Gly Lys Asp Pro Asn Asp Ala

85 90 95

Gly Lys Pro Lys Arg Pro Gln Ser Ala Tyr Phe Cys Phe Leu Ala Asp

100 105 110

Phe Arg Leu Lys Met Lys Gly Lys Asp Ile Asp His Lys Glu Ile Ile

115 120 125

Lys Met Ala Gly Glu Ala Trp Arg Asn Leu Asp Asp Asn Glu Lys Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Lys Leu Ala Gln Lys Glu Gln Glu Lys Tyr Glu Gln Ala

145 150 155 160

Leu Ser Asp Trp Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ala Ser Pro Ser Lys Lys

165 170 175

Pro Lys Gln Glu Glu Asn Gly Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu

180 185 190

Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu

195 200

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial)

<220>

<221> exon

<222> (1 )..(33)

<223> 引物

<400> 2

tactcaggat ccatgggtcg cccaaaagca gaa 33

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列 (Artificial)

<220>

<221> exon

<222> (1 )..(33)

<223> 引物

<400> 3

tactcactcg agttcatcat cttcatcatc atc 33

Claims (1)

1.一种重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1在体外抗灿烂弧菌和大肠杆菌中的应用，所述重组长牡蛎高迁移率族蛋白r-CgHMGB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。