CN102703483B - 罗非鱼重组口服蛋白tat-gh及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗非鱼重组口服蛋白TAT-GH及制备方法和应用。从雄性罗非鱼的脑垂体中提取总mRNA，通过RT-PCR得到cDNA，再通过PCR扩增获得罗非鱼生长激素GH的基因，PCR重叠延伸的方法扩增TAT-GH基因；构建重组质粒pET-32a（+）-TAT-GH。将重组质粒pET-32a（+）-TAT-GH转化大肠杆菌BL21（DE₃），在IPTG诱导下，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式得到高效表达，再通过纯化复性得到活性蛋白，喂食罗非鱼幼苗后能有效地促进其生长发育。

Description

罗非鱼重组口服蛋白TAT-GH及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH，还涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH的制备方法，还涉及一种能表达重组口服生长素蛋白TAT-GH的基因工程菌株；还涉及一种重组口服生长素蛋白TAT-GH在促进罗非鱼生长中的应用。 

技术背景

鱼类生长激素（growth hormone，GH）是由鱼脑垂体远端的嗜酸性细胞分泌与合成的一类单链多肽。它在鱼的生长、能量的固定、性腺的发育等方面都具有重要的调节作用，也是水产养殖中一直备受研究者关注的领域。 

鱼类GH的分离工作始于上世纪70年代，在80年代中后期形成热点。其最初的分离技术类似于哺乳类GH的分离，通常将鱼的脑垂体或体外培养的分泌液在碱性条件下匀浆，经柱层析分离后，再采用等电点沉淀法得到较高浓度的GH，但此法沉淀得到的GH溶解度低，难以溶解。不少学者改进方法，采用柱层析后经离子交换层析，再用rpHP LC纯化，或是通过葡聚糖凝胶过滤和反相高效液相色谱纯化两步法得到GH。 

目前，国内外已有二十多种鱼GH被分离纯化出来，并对这些鱼类GH的氨基酸全序列进行了分析和鉴定，也证明了不同物种间的同源性与差异性。鱼生长激素展现了典型的GH特征，如四个半胱氨酸残基，能形成两个二硫键的能力，推测其能使GH分子形成三级结构和N糖基化位点。对于骨鳔类鱼，GH的序列包含有一组不成对的半胱氨酸残基，推测起着未知的重要功能。 

本发明所研究的罗非鱼(tilapia)原产于非洲，俗称非洲鲫鱼，隶属于鲈形目丽鱼科罗非鱼属，为一种中小型鱼。罗非鱼的肉味鲜美，肉质细嫩，含有多种不饱和脂肪酸和丰富的蛋白质，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一，现在已作为世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类。其cDNA的开放阅读框为615bp，编码204个氨基酸，具有鱼类生长激素的基本结构特征：从起始氨基酸M到第17位氨基酸S是信号肽部分，成熟肽是187个氨基酸。成熟肽中有4个半胱氨酸，位置非常保守，它们在成熟肽中形成两个二硫键（C69与C177位、C194与C202位），构成特征性的一个大环和一个小环。在第201位上有一个N-糖基化位点，这个糖基化位点是蛋白转导入膜的信号，也是硬骨鱼GH的特征之 

利用基因工程菌表达鱼类生长激素是目前大量生产鱼生长激素的主要途径。目前已有多种鱼类GH在大肠杆菌中表达，但由于表达产物通常需要复性处理，耗时耗材，所以不是最理想的表达系统。酵母表达系统可以避免这些缺陷，是一种比较方便和有效的表达系统。而藻类和昆虫等作为表达载体的宿主，可能会获得更高表达量或是更经济的生产鱼GH的途径。 

细胞生物学研究领域中有一类具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度一般小于20个氨基酸，被命名为细胞穿膜肽或蛋白转导域(PTD)。如人类免疫缺陷病毒(HIV)后期转录的调控子蛋白TAT即为PTD的一种。按照结构和功能的不同可以将TAT蛋白划分为5个区域:①酸性N-末端区（1-20位）；②半胱氨酸Cys富积区(21–39位),含7个Cys,在HIV的各亚型属于中高度保守；③核心区(40-47位),含RKGLGI氨基酸序列；④基本区(48-72位),含RKKRRQRRR氨基酸序列,且具有TAR RNA结合活性；⑤细胞黏附的C-末端区(73-86位),含RGD氨基酸序列,TAT可通过RGD与细胞整合素结合。 

通过对TAT的序列进一步的研究已确定其第48-57位（RKKRRQRRR）碱性肽段是保持其穿膜活性的最小片段。穿膜肽TAT可以携带多种物质，大至亲水性蛋白和多肽，小到DNA甚至颗粒性物质等，都能高效而快速地进行细胞间或细胞内的传输，且对细胞无毒副作用。TAT蛋白介导的细胞内转运过程存在多种机制。最初推测是非受体、非转运蛋白介导的和非内吞机制，但最终证实其入胞过程是能量依赖的，且需要细胞表面的蛋白多糖的作用。有研究证明，TAT介导的多种物质的入胞机制与其所携带的分子大小密切相关。当TAT连接的是大分子或颗粒性物质时，遵循的是一种能量依赖的内吞途径，然后从核内体中释放出来进入胞浆；而单独的TAT多肽(49-57位)或仅连有小分子的TAT(49-57位)入胞过程则是通过与细胞表面发生静电作用或氢键连接而完成的，该过程是非能量依赖的。总之，TAT穿膜的具体机制还有待研究。 

尽管TAT的穿膜机制还不太明了，但以其为代表的系列穿膜肽已经广泛应用于生物和医药学领域，大大推进了分子生物学、细胞生物学、药学、免疫学等的发展。 

发明内容

本发明的主要目的是提供了一种TAT-GH融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。本发明首次将穿膜肽TAT与鱼生长激素(growth hormone，GH)融合表达，获得的融合蛋白可以顺利穿过肠膜细胞，进入血清中直接发挥其促生长作用。 

本发明的另一个目的在于提供了一种TAT-GH融合蛋白的制备方法，通过PCR重叠延伸技术，以GH基因为模板，采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长 度为33个碱基的TAT序列，PCR扩增得到TAT-GH基因。通过双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和质粒pET-32a，连接得到重组质粒pET-32a-TAT-GH，转化E.coli DH5a，得到Escherichia coli DH5a pET-32a-TAT-GH。将质粒pET-32a-TAT-GH转化到表达菌株Escherichia coli BL21（DE3），所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株，将该菌株转接到2×YT培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。 

本发明的另一个目的是提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，CCTCC NO：M2012148。该菌株可以表达穿膜肽TAT和罗非鱼生长激素(growth hormone)的基因工程融合蛋白TAT-GH，使其能顺利穿过细胞膜进入胞内产生作用，该菌株能大量表达TAT-GH蛋白，且操作简便快捷，可更好的应用于工业化生产中，为制备口服促生长制品提供良好的基础。 

本发明还有一个目的是提供了一种TAT-GH表达蛋白在促进罗非鱼生长中的应用，通过选取大小不同的幼鱼，用一定剂量的融合蛋白分别以不同时间间隔对其口服喂食，观察其促生长效果的差异性，可得出最优化的饲养方式。 

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 

从雄性罗非鱼脑垂体内提取总RNA，以Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一条链。根据Genbank上已经登录的GH序列设计引物，运用RT-PCR方法扩增罗非鱼GH cDNA序列，与运用搭桥法扩增得到的TAT-GH基因分别克隆到表达载体pET32a(+)上，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，经菌落PCR和双酶切鉴定得到阳性重组菌，IPTG诱导表达。将纯化的GH和TAT-GH蛋白通过酶联免疫吸附受体测定法(ELISA-RA法)测定其生物学活性，并口服喂食罗非鱼，一段时间后抽取鱼的血清用间接ELISA法检测鱼体内GH含量，证明TAT多肽穿膜活性。蛋白口服喂食罗非鱼苗，检测促生长作用。 

一种TAT-GH融合蛋白的制备方法，其步骤是： 

A.罗非鱼生长激素基因的制备:取已处死的新鲜雄性罗非鱼脑垂体，液氮研磨，Trizol法提取鱼基因组的总mRNA后，以Oligo(dT)₂₀为引物通过RT-PCR得到cDNA，查询GeneBank中已经录入的莫桑比克罗非鱼生长激素GH的核苷酸序列（GenBank:AF033805.1），同时设计GH的PCR上下游引物，扩增得到GH基因。最后克隆到pGEM-T载体（由Promega公司购得）中，转化大肠杆菌JM109（由Novagen公司购得，本实验室保种），得到菌株pGEM-T-GH/E.coli JM109，用于基因的增殖和保藏。 

B.TAT-GH融合基因的制备：以步骤A制备得到的GH基因为模板，采用PCR重叠延 伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长度为33个碱基的TAT序列，PCR扩增得到TAT-GH基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。最后克隆到pGEM-T载体中，得到重组载体pGEM-T-TAT-GH，转化大肠杆菌JM109，得到菌株pGEM-T-TAT-GH/E.coli JM109，用于基因的增殖和保藏。 

C.融合基因表达载体的构建：双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和质粒pET-32a（由Novagen公司购得，实验室保种）,胶回收，T4连接酶进行连接，得到重组质粒pET-32a-TAT-GH，转化E.coli DH5a（由Novagen公司购得，实验室保种），涂布含有100μg/mlAmp⁺的LB平板，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是TAT-GH融合基因的大肠杆菌，命名为Escherichia coli DH5a pET-32a-TAT-GH，作为载体的增值和保藏。 

D.大肠杆菌基因工程菌的制备：将质粒pET-32a-TAT-GH转化到表达菌株Escherichia coli BL21（DE3）（由Novagen公司购得，实验室保种）中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH，申请人于2012年4月26日将该菌送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：中国 武汉 武汉大学，分类命名：大肠杆菌BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)，CCTCC NO：M2012148。 

通过上述方法获得了一种大肠杆菌基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH，它具有如下特征：（1）显微镜下观察，大小1-3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢，为革兰氏阴性短杆菌。（2）在普通的LB平板中培养，其菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起。（3）兼性厌氧性菌，最适生长温度为37℃，可用IPTG或乳糖自动诱导表达，代谢旺盛，诱导表达4-6h即可达蛋白最大表达量。 

E.基因工程融合蛋白的制备：将上述基因工程菌Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH转接到2×YT培养基中（该培养基配方1L：16g蛋白胨、10g酵母抽提物、8gNaCl），经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。 

一种TAT-GH融合蛋白促进罗非鱼生长中的应用，其应用过程是： 

A．将大肠杆菌基因工程菌株发酵所得目的蛋白纯化，得到GH和TAT-GH蛋白。通过酶联免疫吸附受体测定法(ELISA-RA法)测定其生物学活性，检测能否与罗非鱼肝膜和肠膜发生较为强烈的特异性反应。 

B．将纯化的GH和TAT-GH口服喂食罗非鱼，一段时间后抽取鱼的血清用间接ELISA法检测鱼体内GH含量，检测TAT多肽能否携带GH蛋白穿过鱼肠壁，进入血液而得到利用。 

C．进行促生长实验，即将有活性的GH蛋白和TAT-GH蛋白与等量PBS分别喂食大小规格相同的罗非鱼苗，喂食周期为40天。40天后测其平均体重和体长，研究其促生长效果。 

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果： 

A．首次将穿膜肽TAT与鱼生长激素GH融合表达，获得融合蛋白可以顺利穿过肠膜细胞，进入血清中直接发挥其促生长作用。 

B．通过对鱼脑垂体的RNA提取，得到完整的总RNA和cDNA序列，保证了基因来源的准确性与完整性，与基因合成相比，更加的经济快捷。 

C．选取了大肠杆菌作为表达系统，其操作简单，生长周期短，产量高，成本低，适用于大规模的工业化生产中。 

附图说明

图1为一种罗非鱼脑垂体总RNA的提取示意图。 

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，由大到小依次是28S、18S、5S。 

图2为一种TAT-GH的PCR扩增示意图。通过PCR重叠延伸技术分3次PCR扩增TAT-GH基因，在GH序列的前端加上TAT序列。扩增产物在1%琼脂糖胶上显示其大小与预期值648bp相符。 

1：DNA Marker（DL2000）2：扩增的TAT-GH基因（648bp） 

图3为一种TAT-GH的双酶切鉴定示意图。 

进行EocRI/BamHI双酶切鉴定，检测到与预期大小相符的片段。 

1:DNA Marker（DL2000）2:EocRI/BamHI双酶切结果（5900bp和648bp） 

图4为一种扩增重组质粒pGEM-T-TAT-GH的构建过程示意图。 

同时用EocRI/BamHI双酶切质粒载体pGEM-T和TAT-GH，再用T4连接酶连接，得到新的重组质粒pGEM-T-TAT-GH。 

图5为一种表达重组质粒pET-32a-TAT-GH的构建图示意图。 

用EocRI/BamHI双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和表达质粒pET-32a，得到的片段TAT-GH与缺口质粒pET-32a连接，获得新的表达重组质粒pET-32a-TAT-GH。 

图6为一种重组蛋白GH和TAT-GH经IPTG诱导表达示意图。 

将基因工程表达菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-tmGH和Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH，用终浓度0.6M的IPTG于37℃恒温、300rpm诱导表达5h。收集发酵液离心后的菌体沉淀，经超声波破碎后，收集破碎上清和沉淀。用12%的SDS-PAGE电泳检测，发现在沉淀中有与预期大小40kDa和41.5kDa相符合的目的蛋白带且大部分以包涵体形式存在，并且表达量较高。 

1：蛋白Marker；2：未诱导的pET32a（BL21）破碎液沉淀；3：未诱导的pET32a-GH（BL21）破碎液沉淀；4：未诱导的pET32a-TAT-GH（BL21）破碎液沉淀；5：未诱导的pET32a（BL21）破碎液上清；6：未诱导的pET32a-GH（BL21）破碎液上清；7：未诱导的pET32a-TAT-GH（BL21）破碎液上清；8：蛋白Marker；9:IPTG诱导的pET32a（BL21）破碎液上清；10:IPTG诱导的pET32a-GH（BL21）破碎液上清；11:IPTG诱导的pET32a-TAT-GH（BL21）破碎液上清；12:IPTG诱导的pET32a（BL21）破碎液沉淀；13:IPTG诱导的pET32a-GH（BL21）破碎液沉淀；14:IPTG诱导的pET32a-TAT-GH（BL21）破碎液沉淀。 

图7为一种纯化的GH和TAT-GH示意图。 

发酵液离心得到的菌体，超声破碎后用2M尿素洗涤并4℃裂解过夜，进行镍柱纯化，用含有低浓度咪唑的Wash Buffer将镍柱中的非目的蛋白洗掉。最后用含有高浓度咪唑的Elution Buffer将目的蛋白洗脱下来。4℃复性过夜，透析后，获得有活性的TAT-GH和GH蛋白，进行SDS-PAGE电泳检测。 

图8为一种Western Blot鉴定示意图。 

蛋白样品经SDS-PAGE分离后，转移到固相载体NC膜上，使蛋白样品与NC膜结合。封闭NC膜上未与蛋白样品结合的其他位点后，依次加入纯化的兔抗GH血清（一抗）及HRP标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)进行免疫反应，最后经DAB显色，将表达的目的蛋白条带显出。 

图9为一种罗非鱼肝膜受体与TAT-GH结合活性示意图。 

ELISA-RA结果表明了罗非鱼肝膜受体和表达的重组生长激素TAT-GH可以发生特异性结合。当肝膜受体浓度一定时（200ug/ml），随着重组TAT-GH浓度的提高，光密度值会相应升高；将高温失活TAT-GH和活性肝膜受体结合时，光密度值有显著下降；将TAT-GH和肝膜受体同时失活，光密度值进一步降低。 

图10为一种罗非鱼肠膜受体与TAT-GH结合活性示意图。 

罗非鱼TAT-GH能够与鱼肠膜受体发生特异性结合。当肠膜受体浓度一定时（200ug/ml），随着TAT-GH浓度的提高，光密度值会相应升高；将高温失活的TAT-GH蛋白和活性肠膜受体结合时，光密度值有显著下降；将TAT-GH蛋白和肠膜受体同时失活时，光密度值进一步降低。 

图11为一种罗非鱼血清的ELISA检测示意图。 

与GH组和PBS对照组相比，TAT-GH组的OD₄₉₀值有显著地的升高，即在血清中检测到TAT-GH蛋白的存在。而GH蛋白由于不能穿过肠壁细胞而未能到达血清中，几乎未在血清中检测到。另外，在喂食蛋白6-12h之间，TAT-GH在血清中的含量有所升高，但在12h-24h开始下降，说明TAT-GH在口服12h后开始在肠内降解。 

具体实施方式

实施例1： 

罗非鱼TAT-GH生长激素基因的制备方法，其步骤是： 

（1）Trizol法提取罗非鱼的总RNA 

将处死的罗非鱼的脑垂体组织直接放入研体中，加入适量（体积约为垂体组织的3-5倍）液氮研磨。按50～100mg/mL加入Trizol，用匀浆器充分匀浆约1-2分钟。室温（20-25℃，以下相同）放置5min，使其充分裂解。12000rpm离心10min，取上清。按200μL氯仿/mL Trizol加入氯仿，振荡5分钟，室温放置5min。4℃12000g离心15min，吸取上层水相于另一离心管中，加入等倍体积异丙醇混匀，室温放置20～30min。4℃12000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按加入1mL 75%（体积比，以下相同）乙醇洗涤两次。4℃5000g离心5min，尽量弃上清。室温晾干2～3min，用50μL经DEPC处理H₂O溶解RNA样品。提取的RNA溶解在无RNase的无菌水中，用DNase(RNase-Free)于37℃消化30min以除去DNA的污染。DNase消化完毕进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图1。 

（2）cDNA第一链的合成： 

按照ReverTra Ace qPCR RT Kit试剂盒(购自TOYOBO公司)说明书，以Oligo(dT)₂₀为引物合成cDNA第一链。反应体系如下，依次将以下试剂加入经DEPC水处理并灭菌过的PCR管中： 

反应参数为： 

（3）GH基因的扩增： 

将反应后的产物储存于-20℃以作为目的基因克隆的模板。查询GeneBank中已经录入的莫桑比克罗非鱼生长激素GH的核酸序列（GenBank:AF033805.1），同时设计GH的PCR上下游引物。由于本实验选取pET-32a（+）质粒（由Novagen公司购得，实验室保种）作为载体，根据其上的多克隆位点及GH的基因序列，分别选取BamH1和EcoR1作为酶切位点。GH的上游引物P1：5’-CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3’(划线处为BamH I位点)，即为SEQ ID NO.3；GH的下游引物P2：5’-CGGAATTCCTACAGAGTGCAGTTTGCCTC-3’(划线处为EcoR I位点)，即为SEQ ID NO.4；以罗非鱼GH基因为模板，按照以下反应体系和条件进行PCR扩增。 

反应条件：①94℃预变性5min，②94℃变性30s→→56℃退火40s→→68℃延伸40s(30cycles)，③68℃延伸5min。将反应后的产物贮于-20℃备用。 

（4）TAT-GH的制备及扩增： 

PCR扩增TAT-GH时采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR加上长度为33个碱基的TAT序列。具体步骤为：①以步骤（3）中PCR得到的罗非鱼GH基因为模板，上游引物P3:5’-CAGCGTCGTCGTGGATCCATGAACTCAGTC-3’，下游引物P2:5’-CGGAATTCCTACAGAGTGCAGTTTGCCTC-3’，退火温度为55℃，PCR扩增后电泳并回收目的片段；②以上一步回收产物为模板，上游引物P5:5’-CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC-3’，下游引物P2:5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’，退火温度55℃,PCR扩增后电泳并回收目的片段；③以上一步回收产物为模板，上游引物P6:5’-GGCGGATCCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT-3’，下游引物P2:5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’，退火温度55℃，PCR扩增目的基因TAT-GH。 

每小步的PCR反应体系与步骤（3）中PCR体系相同。 

PCR反应条件为：①94℃预变性5min，②94℃变性30s→→55℃退火40s→→68℃延伸40s(30cycles)，③68℃延伸5min。将反应后得到的TAT-GH的PCR产物贮于-20℃备用。 

实施例2： 

TAT-GH重组载体的构建方法，其步骤是： 

将实施例1中得到的TAT-GH的PCR产物和10×Loading Buffer混匀，在1%（质量体积比，以下相同）的琼脂糖凝胶上电泳。当目标DNA带完全分离后，在紫外灯下迅速切下含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，并转移到1.5ml EP管中。用BIOMIGA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购自Biomega公司）纯化回收目的条带。加入1倍体积的Buffer GC，于55- 60°C水浴中加热10min,期间颠倒混匀6-8次，直至凝胶块完全溶化。冷却EP管至室温，转移上述混合液（每次不超过700μl）至带有收集管的吸附柱中。室温13000×g离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中。重复上步1-2次，直至剩余的混合液全部通过吸附柱。加入650μl DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13000×g离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复上步1-2次。室温13000×g离心2min，去除残留的乙醇。因乙醇的残留会影响到后续实验，可以适当延长离心时间，或者离心后开盖空气中放置3-6分钟。转移吸附柱至1.5ml收集管中，加入30-50μl 60°C预热的Elution Buffer或ddH₂O到吸附柱膜中央，室温放置1min,13000×g离心1min,回收产物贮于-20℃备用。 

用限制性内切酶BamH I-HF（NEB公司提供的高保真内切酶）、EcoR I同时双酶切载体pET-32a（+）质粒和TAT-GH的PCR产物。酶切体系如下表： 

酶切反应条件为37℃恒温，反应时间2-3个小时。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收pET-32a（+）和GH、TAT-GH的酶切片段。 

用T4连接酶将双酶切后的GH、TAT-GH片段与pET-32a连接。连接体系如下表： 

连接反应条件为22℃，反应时间1-2个小时，得到连接产物pET-32a-GH和pET-32a-TAT-GH。将连接产物转化Escherichia coli DH5a或JM109（由Novagen公司购得，实验室保种），涂布含有100μg/mlAmp⁺的LB平板，挑取白色的单菌落，接种于300μl LB（Amp ⁺）培养液中，37℃、300rpm培养3h。取1μl菌液作为模板，进行菌落PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小的正确性。将初步鉴定为阳性的菌落转接到20mlLB液体培养基中，37℃、300rpm进行扩大培养，对菌液进行小量提取质粒，再进行BamH I/EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图3。将得到的阳性重组子送到Invitrogen公司测序，当测序结果正确时，表明原核表达载体pET-32a（+）-TAT-GH构建完成，如图5。 

实施例3： 

一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，其步骤是： 

（1）氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞： 

在新鲜固体LB平板上挑取Escherichia coli BL21（DE3）（由Novagen公司购得，本实验室保种）的单菌落，接种于20ml LB液体培养基中，37℃摇床300rpm培养过夜。将过夜活化的菌液取200μl转接于新鲜的20ml LB液体培养基中，37℃、300rpm培养约2-3h，至OD₆₀₀约为0.4-0.6。在超净工作台里吸取菌液到预冷的1.5ml EP管中，冰上置10min。再4℃，4000rpm离心10min，弃上清收集菌体。若菌体较少，则重复收集菌体。每管用200μl冰预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬。4℃，4000rpm离心10min，弃上清培养液、收集菌体，置于冰上。每管用200μl冰预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬，冰浴30分钟。最后用100μl预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬，将制备完的感受态细胞保存于4℃冰箱中，在48h内使用即可。 

（2）连接产物转化大肠杆菌感受态细胞： 

在超净工作台里取实施例2中的连接产物10μl加入到100μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴下，热激90s，迅速移至冰上，冷却1-2min。加入400μl LB液体培养基，于37℃摇床中150rpm温育1h。4000rpm离心5min，弃去400μl上清，将剩余的菌液用移液枪轻轻混匀。取100μl细菌悬液，用无菌的三角涂棒均匀涂在含有Amp的LB固体平板上，正向放置1-2h，直至液体被充分吸收，倒置平板，于37℃培养箱中培养过夜。PCR鉴定筛选出阳性转化子，并送到Invitrogen公司测序，当测序结果正确时所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-GH的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH。 

实施例4： 

基因工程融合蛋白TAT-GH的表达 

从含有Amp⁺的固体LB平板上挑取携带有质粒pET-32a-TAT-GH和pET-32a-GH的E.coli BL21(DE3)的单菌落，接种于含Amp⁺的20ml LB液体培养基中，于37℃摇床300rpm过夜培养10-12h。第二天，按1：100的比例接种到20ml新鲜的2×YT培养基（Amp⁺）液 体培养基中，37℃恒温、300rpm培养3h左右，至OD₆₀₀约0.6-0.8时，在超净台里取1ml菌液作为诱导前的对照。加诱导剂IPTG至终浓度为0.6mM，于37℃摇床300rpm诱导表达5h。同时将未加IPTG诱导的对照组在同等条件下培养。4℃，12000rpm离心5min，弃上清，收集菌液。用适量无菌水重悬菌体，400W超声破碎后，4℃12000rpm离心1min，取上清与等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液混匀，制得破碎上清样品。弃去上清，用100μL无菌水重悬沉淀，取20μl与等体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液混匀，制得破碎沉淀样品。将每组样品置于沸水中煮5-10min，进行SDS-PAGE电泳，检测TAT-GH蛋白是否得到表达且是可溶性表达还是包涵体表达。电泳结束后，卸下凝胶，用考马斯亮蓝染液染色3-4h后，再用脱色液将背景色脱尽，以查看蛋白表达情况，发现在沉淀中有与预期大小40kDa和41.5kDa相符合的目的蛋白带且大部分以包涵体形式存在，并且表达量较高（图6）。 

实施例5： 

基因工程融合蛋白TAT-GH的纯化和复性 

（1）Ni-NTA Superflow柱亲和层析法纯化重组蛋白 

用移液器吸取1ml Ni-NTA Agarose装入层析柱底部，用10倍柱体积的ddH₂O洗涤柱子，再用10倍柱体积的Lysis Buffer平衡柱子。将变性好的蛋白溶液经0.45μm的滤膜过滤后，用蠕动泵以0.2ml/min的速率加入到平衡好的镍柱子中，使蛋白前端的6-His与Ni²⁺充分结合。依次用适量的含20mM Imidazole、40mM Imidazole、60mM Imidazole、的Wash Buffer以0.5ml/min的速率洗脱柱子，洗脱下Ni²⁺柱上结合的非目的蛋白。用核酸蛋白检测仪检测每次洗脱后的流出液的OD₂₈₀基线平稳时停止洗涤。用含250mM Imidazole的Elution Buffer以0.2mL/min的速率洗脱柱子，Eppendorf管收集目的蛋白，待OD₂₈₀持续为0时停止收集。进行SDS-PAGE电泳，检测所收集的蛋白的纯化效果，如图7。 

（2）包涵体的变性和复性 

将发酵好的100ml的菌液在4000rpm离心30min，收集菌体，用10ml Lysis Buffer重悬。400W超声破碎细胞40min左右（破碎3s,间隙3s），4℃12000rpm离心10min，弃上清。沉淀用2M尿素洗涤两次，4℃12000rpm离心10min弃上清后，加入适量包涵体裂解液，使溶液变澄清，4℃裂解过夜。第二天将裂解液经0.45μm的滤膜过滤后，适量稀释于蛋白复性液中，4℃复性12-24h。将新购买的透析袋(截流分子量8-14kDa)于10mM NaHCO₃、1mM EDTA的溶液中煮沸10min，除去透析袋表面的一些杂质成分。用透析的方法去除蛋白中的高浓度的尿素，将复性液用0.45μm滤膜过滤后装入透析袋（8-14kDa）中，透析袋两端用夹子夹好，将其放入PBS缓冲液中，4℃透析。期间更换一次或两次透析缓冲液，即可 将尿素完全去除。将透析后的蛋白质溶液用聚乙二醇20000浓缩至约为原体积的1/3，对其进行分装后保存于-20℃ 

本发明通过复性后的TAT-GH浓度为530μg/ml，GH浓度为720μg/ml。 

实施例6： 

多克隆抗体的制备与纯化及其效价检测 

（1）多克隆抗体的制备 

将400-600μgGH纯化蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合后皮下注射免疫新西兰大白兔，每次免疫间隔周期为2周，一共免疫3次。第二次免疫后第10天取血清进行琼脂糖凝胶免疫扩散实验以确定免疫效价。第三次免疫后第11天取血，全血37℃静置2h，然后在4℃静置过夜，4℃，2000g，离心20min，取上清冻存于-20℃备用。 

（2）多克隆抗体的纯化 

用移液器吸取1-2ml Protein A Sepharose装入Protein A Sepharose^TM CL-4B柱底部，用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子。取2mL抗血清用Binding Buffer稀释到30mL，4℃，8000g离心20min，收集上清并用0.45μm滤膜过滤。将处理好的样品以0.2mL/min的速度流过预先用Binding Buffer平衡好的柱子中。以0.5mL/min的流速用Binding Buffer冲洗柱子直到基线平稳。以0.25mL/min的流速用Elution Buffer洗脱IgGs，分部收集洗脱液，为保持抗体IgGs的活性，收集的同时在每1ml洗脱液中加入200μL Neutralizing Buffer并立即混匀。装入透析袋（8-14kDa）透析过夜。用聚乙二醇20000浓缩IgGs溶液至原体积的三分之一，从透析袋中分装成小份后保存于-20℃。用SDS-PAGE电泳检测抗体IgGs的纯化效果。 

GH抗体的血清效价采用间接ELISA法检测。将Protein A纯化获得的GH抗体梯度稀释100-25600倍，阴性对照为稀释100倍的免疫前血清，空白对照为PBS，每个浓度设定3个平行组。用Bio-Rad450全自动酶标仪检测每孔在490nm波长下的吸光值，取平均值，出现阳性反应的最大稀释度即为GH抗体的效价。经测定，本实验制备的兔抗血清效价为1：12800。 

实施例7： 

Western Blot测定TAT-GH融合蛋白 

取40μl纯化后的蛋白样品TAT-GH和GH与等体积的2×上样缓冲液混匀，煮沸10min，离心取上清。待电泳结束后，卸下聚丙烯酰胺凝胶，放入转移缓冲液中浸泡30min，裁剪一张与凝胶大小一致的NC膜，同时裁剪六张比凝胶略小的滤纸。在转膜电极中沿着从阳极到 阴极的方向依次放入两片海绵、三张滤纸、NC膜、凝胶、三张滤纸、两片海绵。计算NC膜面积大小，以1.5mA/cm²NC膜的恒定电流转膜30min。待转膜结束后，将NC膜于5%（质量体积比）BSA溶液中4℃封闭过夜。取出NC膜，用去离子水冲洗三次。用TBST洗膜，每次5-10min，重复三次。将纯化的GH抗体在TBST溶液中稀释500倍，与NC膜37℃结合1小时。用TBST洗膜，每次5-10min，重复三次。将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG于TBST中稀释10000倍，与NC膜37℃结合1小时。用TBST洗膜，每次5-10min，重复三次。加入显色液，避光显色1-3min，暗室压片显色。图8即是GH及TAT-GH蛋白经Western Blot检测的结果。 

实施例8： 

酶联免疫吸附受体法（ELISA-RA）检测TAT-GH的生物活性 

将用TAT-GH喂养过的鲜活罗非鱼杀死，分别取肝脏和鱼肠剪碎，加入5倍于体重的膜受体缓冲液中，4℃充分匀浆后，1500g离心30min，取上清，再用100000g超速离心60min，收集沉淀重悬于上述膜受体缓冲液中，并用Bradford法测定受体膜蛋白浓度。用0.05M Na₂CO₃-NaHCO₃(pH9.6)包被缓冲液稀释受体膜，使其终浓度为200μg/ml，每孔100μl加入到酶标板中，4℃包被过夜。PBST洗板3次后，每孔加入100μl 0.5%（质量体积比）BSA，37℃封闭2h。洗板3次后，每孔加入100μl梯度稀释的蛋白溶液，37℃孵育2h。洗板3次后，每孔加入100μl1:500稀释的罗非鱼GH抗体（通过实施例6制备所得），37℃孵育2h。添加HRP标记的二抗（购自Proteintech Group公司）：洗板3次后，每孔加入100μl按1:10000稀释的HRP标记的二抗，37℃孵育2h。洗板3次后，每孔加入100μl显色液（OPD），37℃避光反应20min。加入50μl反应终止液（2M硫酸）。用酶标仪检测每孔在490nm处的吸光值，如图9和10。 

实施例9： 

间接酶连免疫吸附法(ELISA)检测TAT-GH蛋白的穿肠功能 

将体重约为4g的健康罗非鱼随机分成3组，每组3尾，直接喂食：对照组1每尾每天口服20μl PBS，实验组2每尾每天口服20μl纯化的TAT-GH蛋白，实验组3每尾每天口服20μl纯化的GH蛋白。在30℃恒温饲养3天，于第3次口服蛋白后分别于6h、12h、24h取血，每尾100μl，与等体积的抗凝剂混匀，4℃静置。将血液低速离心取上清，每孔100μl加入到酶标板中，37℃包被2h。PBST洗版3次后，每孔加入100μl 0.5%BSA，4℃封闭过夜。洗板3次后，每孔中加入1:500稀释的GH抗体，37℃孵育2h。洗板3次后，每孔加入100μl按1:10000稀释的HRP标记的二抗，37℃孵育2h。洗板3次后，每孔加入100μl显色 液（OPD），37℃避光反应20min。加入50μl反应终止液（2M硫酸）。用酶标仪检测每孔在490nm处的吸光值，结果如图11。 

实施例10： 

罗非鱼的促生长试验 

选取健康鲜活的罗非鱼鱼苗，按其体长和体重分为3组，每组45尾，其中A组平均体长38.79mm，体重1.03g;B组平均体长56.06mm，体重3.06g;C组平均体长67.66mm，体重5.26g;每组又分为对照组0，实验组1和实验组2，各组15尾，分别标记为A₀、A₁、A₂，B₀、B₁、B₂，C₀、C₁、C₂，饲养在同一室内同样规格的塑料盒中，室温控制在30℃，24h通氧，饲喂时间为40天。 

喂食采用蛋白包裹法，即将罗非鱼饲料与PBS溶解的蛋白液混合包裹，投入饲养盒中。一般每天的饲料量为鱼体重的2%，蛋白液的量为每g鱼2μg融合蛋白。实验组1喂食GH蛋白，实验组2喂食TAT-GH蛋白，对照组0喂食等量的PBS,每天下午3∶00投喂饵料，每天定时换水。称重前一天停止喂食，比较实验前和实验结束时罗非鱼体重及体长的变化，结果见下表1。 

表1喂食蛋白前后罗非鱼体重体长比较 

P<0.05。 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  武汉凯肽来生物科技有限公司

 

<120>  罗非鱼重组口服蛋白TAT-GH的制备及用途

 

<130>  罗非鱼重组口服蛋白TAT-GH的制备及用途

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  1149

<212>  DNA

<213>  罗非鱼

 

<400>  1

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg     60

 

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc    120

 

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac    180

 

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg    240

 

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg    300

 

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat    360

 

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa    420

 

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg    480

 

gctgatatcg gatcctatgg ccgtaaaaaa cgtcgtcagc gtcgtcgtat gaactcagtc    540

 

gtcctccagc tgtcggttgt gtgtttgggc gtctcctctc agcagatcac agacagccag    600

 

cgtttgttct ccattgcagt caacagagtc acgcacctgt acctgctcgc ccagagactc    660

 

ttctcggact ttgagagctc tctgcagacg gaggagcaac gtcagctcaa caaaatcttc    720

 

ctgcaggact tctgcaactc tgattacatc atcagcccga tcgacaaaca cgagactcag    780

 

cgcagctcgg tcctgaagct gctgtcgatc tcttacggac tggttgagtc ctgggagttt    840

 

cccagtcgct ctctgtctgg aggttcctct ctgaggaacc agatttcacc aaggctatct    900

 

gagcttaaaa cgggaatctt gctgctgatt agggccaatc aggatgaagc agagaattat    960

 

cctgacaccg acaccctcca gcacgctcct tacggaaact attatcaaag tctgggaggc   1020

 

aacgaatcgc tgagacaaac ttatgaattg ctggcttgct tcaagaagga catgcacaag   1080

 

gtggagacct acctgacggt agctaaatgt cgactctctc cagaggcaaa ctgcactctg   1140

 

taggaattc                                                           1149

 

 

<210>  2

<211>  265

<212>  PRT

<213>  罗非鱼

 

<400>  2

 

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

            20                  25                  30         

 

 

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile

        35                  40                  45              

 

 

Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Asn Ser

    50                  55                  60                 

 

 

Val Val Leu Gln Leu Ser Val Val Cys Leu Gly Val Ser Ser Gln Gln

65                  70                  75                  80 

 

 

Ile Thr Asp Ser Gln Arg Leu Phe Ser Ile Ala Val Asn Arg Val Thr

                85                  90                  95     

 

 

His Leu Tyr Leu Leu Ala Gln Arg Leu Phe Ser Asp Phe Glu Ser Ser

            100                 105                 110        

 

 

Leu Gln Thr Glu Glu Gln Arg Gln Leu Asn Lys Ile Phe Leu Gln Asp

        115                 120                 125            

 

 

Phe Cys Asn Ser Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Ile Asp Lys His Glu Thr

    130                 135                 140                

 

 

Gln Arg Ser Ser Val Leu Lys Leu Leu Ser Ile Ser Tyr Gly Leu Val

145                 150                 155                 160

 

 

Glu Ser Trp Glu Phe Pro Ser Arg Ser Leu Ser Gly Gly Ser Ser Leu

                165                 170                 175    

 

 

Arg Asn Gln Ile Ser Pro Arg Leu Ser Glu Leu Lys Thr Gly Ile Leu

            180                 185                 190        

 

 

Leu Leu Ile Arg Ala Asn Gln Asp Glu Ala Glu Asn Tyr Pro Asp Thr

        195                 200                 205            

 

 

Asp Thr Leu Gln His Ala Pro Tyr Gly Asn Tyr Tyr Gln Ser Leu Gly

    210                 215                 220                

 

 

Gly Asn Glu Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Glu Leu Leu Ala Cys Phe Lys

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Asp Met His Lys Val Glu Thr Tyr Leu Thr Val Ala Lys Cys Arg

                245                 250                 255    

 

 

Leu Ser Pro Glu Ala Asn Cys Thr Leu

            260                 265

 

 

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  罗非鱼

 

<400>  3

cgggatccat gaactcagtc gtcctcca                                        28

 

 

<210>  4

<211>  29

<212>  DNA

<213>  罗非鱼

 

<400>  4

cggaattcct acagagtgca gtttgcctc                                       29

 

 

Claims (6)

1.一种分离重组的基因，其特征在于，其序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离重组的融合蛋白，其特征在于，其序列为SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达权利要求2所述融合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)pET-32a-TAT-tmGH，F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-)gal dcm(DE3)；CCTCC NO：M2012148。

4.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤为：

A.罗非鱼生长激素基因的制备:取已处死的新鲜雄性罗非鱼脑垂体，液氮研磨，Trizol法提取GH的总mRNA后，以Oligo(dT)₂₀为引物通过RT-PCR得到cDNA，同时设计GH的PCR上下游引物，扩增得到GH基因；最后克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，用于基因的增殖和保藏；

GH的上游引物P1：5’-CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3’；

GH的下游引物P2：5’-CGGAATTCCTACAGAGTGCAGTTTGCCTC-3’；

所述的GH为生长激素基因；

B.TAT-GH融合基因的制备：以GH基因为模板，采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长度为33个碱基的TAT序列，具体步骤为：①以步骤(A)中PCR得到的罗非鱼GH基因为模板，上游引物P3:5’-CAGCGTCGTCGTGGATCCATGAACTCAGTC-3’，下游引物P2:5’-CGGAATTCCTACAGAGTGCAGTTTGCCTC-3’，退火温度为55℃，PCR扩增后电泳并回收目的片段；②以上一步回收产物为模板，上游引物P5:5’-CGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGATCC-3’，下游引物P2:5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’，退火温度55℃,PCR扩增后电泳并回收目的片段；③以上一步回收产物为模板，上游引物P6:5’-GGCGGATCCGGCTATGGCCGTAAAAAACGTCGT-3’，下游引物P2:5’-GCCGAATTCCTACAGAGTGCAGTTAGCTTCTGG-3’，退火温度55℃，PCR扩增目的基因TAT-GH；最后克隆到pGEM-T载体中，获得重组质粒pGEM-T-TAT-GH，转化大肠杆菌JM109，用于基因的增殖和保藏；

所述的TAT-GH基因为连接上TAT穿膜蛋白基因的生长激素基因；

C.融合基因表达载体的构建：双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和质粒pET-32a,胶回收，T4连接酶进行连接，获得质粒pET-32a-TAT-GH，转化E.coliDH5a，涂布含有100μg/mlAmp⁺的LB平板，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是含TAT-GH融合基因的大肠杆菌；

D.大肠杆菌基因工程菌的制备：将质粒pET-32a-TAT-GH转化到表达菌株BL21(DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株；

E.基因工程融合蛋白的制备：将步骤D中获得的基因工程菌转接到2×YT培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。

5.权利要求2所述的TAT-GH融合蛋白在促进罗非鱼体重增加中的应用。

6.权利要求2所述的TAT-GH融合蛋白在促进罗非鱼体长增长中的应用。