CN103184230B - 一种融合蛋白基因TAT-sVP7及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白基因TAT-sVP7及其应用，基因库里获得了成熟的GCRV的VP7所对应的氨基酸序列信息，将VP7基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，将其与细胞穿膜肽TAT进行柔性连接，导入表达载体并转化大肠杆菌，该菌可高效的表达TAT-sVP7融合蛋白；将融合蛋白基因TAT-sVP7导入植物转基因载体并转化农杆菌，该菌介导了融合蛋白基因TAT-sVP7整入植物细胞核DNA，实现了TAT-sVP7融合蛋白在植物细胞中的高效表达，表达量达总可溶蛋白的1.54%；草鱼经口服吞食含重组融合蛋白的植物材料，产生了有效的免疫应答；草鱼对草鱼呼肠孤病毒的免疫保护率达到70.18%。

Description

一种融合蛋白基因TAT-sVP7及其应用

本发明属于基因工程技术领域，更具体涉及到一种融合蛋白基因TAT-sVP7，还涉及到一种融合蛋白基因TAT-sVP7在制备治疗或预防草鱼呼肠孤病毒口服药物中的应用。以水稻愈伤组织细胞作为生物反应器，采用融合表达的技术策略，将构建的组成型植物表达载体通过转基因的方法，导入水稻愈伤组织细胞，在水稻愈伤组织细胞中高效表达和大量积累融合蛋白。

背景技术

草鱼（Ctenopharyngon idellus）是我国重要的经济淡水养殖品种，其年养殖量约已占我国淡水养殖总量的20%。草鱼出血病是危害草鱼种的主要病害，流行于我国主要淡水养殖区，可导致草鱼种大量死亡，死亡率在70%以上，给养殖户造成了巨大的经济损失，严重影响了我国水产养殖业的可持续健康发展(Fang Q,Seng EK,Ding QQ,Zhang LL(2008)Characterization of infections particles of grass carp reovirus by treatment with proteases.Arch Virol153:675-682)。GCRV是引起草鱼出血病的主要病原。

GCRV是一种直径70nm的球状病毒，有双层衣壳，无囊膜。研究表明，决定病毒进入细胞的是其外层蛋白质衣壳。VP7与VP5形成的异源二聚体是外衣壳主要的结构蛋白，VP6则连接内、外蛋白层。VP5的抗体可对GCRV产生中和作用，但VP7抗体的中和作用是VP5抗体的3倍(Shao L,Sun X,Fang Q(2011)Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E.coli are capable of neutralizing viral infectivity.Virolj8:347)。研究发现，基于VP7构建的核酸疫苗对草鱼GCRV具有较好的免疫保护(He YX,Yang Q,Xu HX,Wu H,Wu FY,Lu LQ(2011)Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protein VP7and its vaccine potential.Afr J Microbiol Res5(13):1643-1648)。因此，VP7是开发GCRV疫苗最佳靶标。

免疫预防是有效防治GCRV导致草鱼出血病的方法之一，因此疫苗研制对于控制该病意义重大。在渔用疫苗中，口服免疫途径是一种最为方便和引起鱼体应激最小的途径(李新华，沈锦玉，潘晓艺，郝贵杰.鱼类口服免疫的研究进展，水产科学，2010,29(1):51-56)。用植物转基因技术研制的口服疫苗会更加符合草食性鱼类的特点，也有利于该疫苗的推广应用。合适的黏膜免疫佐剂，可增强黏膜免疫系统产生更强的免疫应答。如穿膜肽Tat(transcriptional activator protein)是一种带正电荷的短肽,是一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞，且对宿主细胞没有显著毒副作用(Rosales-Mendoza S,Rubio-Infante N,Govea-Alonso DO,Moreno-Fierros L.Current status and perspectives of plant-based candidate vaccines against the humanimmunodeficiency virus(HIV).Plant Cell Rep2012,31:495-511.)。TAT是由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR，该段等电点12.7，为碱性多肽，转导速度快，效率高。TAT可以将与之相连的多肽或全长蛋白质在数分钟内转导进入细胞，而且在体内可以通过血液循环运输至鱼体免疫生发中心—前肾。因此，利用植物细胞生产含有TAT与VP7的GCRV口服疫苗可能会成为预防草鱼出血病的最佳选择，也符合水生动物的特点，也有利于该疫苗的推广应用，具有重要的科学意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种融合蛋白基因TAT-sVP7，其序列为SEQ ID NO.1所示。该基因的密码子根据真核生物基因密码子偏好性进行了优化，优化后TAT-sVP7基因密码子，更加符合真核生物基因表达特点，表达的重组蛋白量高，且更有活性。

本发明还有一个目的在于提供了一种含有融合蛋白基因TAT-sVP7的大肠杆菌基因工程菌，分类命名：大肠杆菌BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT-sVP7，Escherichia coli BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT-sVP7CCTCC NO:M2013084。该菌已于2013年3月14日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。该菌繁殖速度快，扩大培养容易，环境适应性强。

本发明还有一个目的是在于提供了一种含有融合蛋白基因TAT-sVP7的重组农杆菌基因工程菌，分类命名：农杆菌EHA105Act-TAT-sVP7，Agrobacterium sp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC NO:M2013083，该菌已于2013年3月14日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。该菌具有将重组融合蛋白基因整入到植物细胞的核遗传物质中，且整合效率高，对植物细胞无损伤。

本发明最后一个目的是在于提供了一种含有融合蛋白基因TAT-sVP7的重组农杆菌基因工程菌在制备治疗或预防草鱼呼肠孤病毒口服药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

1.获得水稻密码子优化的GCRV外衣壳蛋白sVP7基因；

为了使重组蛋白在水稻愈伤细胞中获得较高的表达，采用了水稻偏爱的遗传密码子，从美国生物技术信息中心（NCBI）基因库里获得了成熟的GCRV的VP7基因序列信息（GenBank AF403394）所对应的氨基酸序列，由DNA分析软件（Gene Runner）将VP7基因的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，人工合成VP7基因，记为sVP7,其序列为SEQ NO.3所示的核苷酸序列。

2.融合基因TAT-sVP7的制备及表达载体的构建：

（1）TAT核苷酸片段的生成

上游引物1条，下游引物1条，一次聚合合成。

TAF:GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCT；

TAR:ATCATGTGAAGTGGAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCAC；

先分别配成10uMol.L^-1,等量混合后，95℃加热10min后，室温冷却1h后，即得到细胞穿膜肽TAT及柔性联系序列。

将其和sVP7片段等量混合作为PCR扩增的模板。

(2)TAT与sVP7基因柔性对接

上游引物，GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAG；下游引物，GGATCCTTATCATAGCTCATCTTTCTC；退火温度56℃进行PCR,PCR扩增目的基因TAT-sVP7,其序列为SEQ ID NO.1所示。PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体（在Promega公司购置）中，转化到大肠杆菌TP10,挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-sVP7基因的大肠杆菌，该质粒命名为pGEM-TAT-sVP7。

（3）质粒pET-28a(+)(在INVITROGEN公司购置)，经BamHI酶切后，并经碱性磷酸酶处理后，再用琼脂糖胶切胶回收，回收的载体记为：pET-28a-B-C。用BamHI酶切pGEM-TAT-sVP7质粒，目的片段TAT-sVP7和开环的pET-28a-B-C在16℃连接过夜，转化大肠杆菌TP10感受态细胞，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-sVP7基因的大肠杆菌，该质粒命名为pET-28a-TAT-sVP7。

3.大肠杆菌基因工程菌的制备和融合蛋白TAT-sVP7的表达

（1）将质粒pET-28a-TAT-sVP7转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-sVP7的重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-TAT-sVP7。

(2)重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)pET-28a-TAT-sVP7的单菌落接种到10ml新鲜液体LB(含终浓度为50μg/ml卡那霉素)培养基中。37℃150rpm摇床培养过夜。无菌条件下，从培养过夜的菌中，取出2ml菌液接种到200ml的新鲜液体LB中，37℃200rpm摇床培养至OD600为0.8时（约4h）加入终浓度为0.5mM IPTG，37℃诱导4h后，离心6000g,4℃,10min收集菌体，用10mM PBS（pH8.0）重悬超声波破壁，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破壁后，离心12000g,4℃,20min收集沉淀，并用尿素变性液在4℃冰箱中溶解处理过夜，4℃离心12000g,30min收集上清。融合蛋白TAT-sVP7的纯化按Ni-NTA说明书进行，用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。得到纯化的TAT-sVP7蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。

一种大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组基因工程菌株，分类命名：大肠杆菌BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT-sVP7，Escherichia coli BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT-sVP7CCTCC NO:M2013084。该菌已于2013年3月14日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。

该菌株有以下特征，最适生长温度为37℃，菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰白色。培养基：LB培养基配方：1L溶液中，Tryptone(胰蛋白胨)：10g;Yeast Extract(酵母提取物)：5g;NaCl（氯化钠）：10g,再加入16g Agar(琼脂)pH7.2,培养温度在32-39℃均可生产，但最适培养温度37℃，卡那霉素抗性，好氧性细菌。

4.TAT-sVP7融合基因导入转基因载体，构建植物转基因载体并转化农杆菌；

将上述目的片段TAT-sVP7与转基因载体ACT（本实验室留存）通过BamHI酶切位点相联（T4DNA连接酶(NEB公司购买)，16℃，连接12h，转化大肠杆菌TP10感受态细胞中，经PCR鉴定正反向。将插入正确的TAT-sVP7-ACT导入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens SP.）EHA105。

一种重组农杆菌基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组基因工程菌株Agrobacterium tumefaciens SP.EHA105ACT-TAT-sVP7，分类命名农杆菌EHA105Act-TAT-sVP7，Agrobacterium sp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC NO:M2013083。该菌已于2013年3月14日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址：中国武汉武汉大学。

该菌株有以下特征，最适生长温度为26℃，菌落边缘整齐，表面湿润、光滑、呈白色不透明。培养基：YEB培养基配方：1L溶液中，蛋白胨：5.0g;酵母提取物：1.0g;牛肉膏：5.0g;蔗糖5.0g;MgSO₄.7H₂O0.5g;再加入16g Agar(琼脂)。其培养基的最适pH7.2，培养温度25-31℃，但最适培养温度28℃，卡那霉素抗性，好氧性菌株。一种含有融合蛋白基因TAT-sVP7的重组农杆菌基因工程菌在制备治疗或预防草鱼呼肠孤病毒口服药物中的应用，其应用过程是：

利用农杆菌介导的转化方法，经共培养和抗性筛选，获得大量的转基因水稻愈伤细胞系，再经继代，GUS显色和PCR分子鉴定，获得了26个水稻转基因愈伤细胞系。从每个水稻愈伤细胞系中取出一部分材料，利用蛋白质检测技术——酶联免疫（ELISA）试剂盒（武汉博士德公司）检测技术，筛选高表达重组TAT-sVP7的转基因愈伤细胞系。

高表达重组TAT-sVP7的水稻转基因愈伤细胞系，经NB和N6培养基进行交替培养，收获水稻转基因愈伤细胞，经冻干机冻干，即为草鱼GCRV的口服疫苗，可以直接或拌饵投喂草鱼，拌饵量为15%，草鱼摄食转基因水稻愈伤组织冻干粉后，产生了有效免疫保护，保护率达到70.18%。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明利用基因工程的方法，利用水稻愈伤组织细胞作为载体，借助植物转基因的技术平台，实现在水稻愈伤组织细胞中高效表达细胞穿膜肽TAT与GCRV外衣壳VP7的融合蛋白，细胞穿膜肽具有协助后面的重组蛋白进入细胞，增强了重组融合蛋白直接进入鱼体消化道粘膜机会，减少了被消化道中消化酶的消化降解作用，并加以直接利用，供草鱼直接口服免疫接种，实现鱼用疫苗的生产和免疫接种的有机统一，不仅简化了重组蛋白的纯化工序，还克服了因表达体系不同而引起的蛋白糖苷化修饰的不同。

本发明提供的GCRV口服疫苗，直接口服免疫接种草鱼鱼种，使鱼体在吞食饵料的同时，也实现了免疫接种。该口服植物疫苗，不仅使用方便，实用性强，成本低，扩大生产容易，具有广阔的应用前景。

本项目的生产的植物疫苗，疫苗的载体为水稻愈伤，草鱼可以直接摄食，即是食物也是疫苗，对草鱼机体无损伤，无毒副作用，使用方便，可以单独投喂，也可拌在饲料中投喂，省时省力，可解决大水面（如湖泊、水库、河流）养殖鱼类和大批量鱼类的免疫接种难题。生产的疫苗可以常温存放，减少了常规疫苗需低温存放和低温运输的烦琐和费用。

本专利生产的植物疫苗，有别于一般的细菌（原核）为载体的口服疫苗，需人工注射或拌饲料，使用不方便。同时，该疫苗的生产利用的是真核生物，重组蛋白在表达过程中，经过了糖基化等修饰，因此，重组蛋白的活性比原核生物更强，特性更好。

附图说明：

图1为sVP7基因的合成电泳示意图。

图1中：M，DL2000分子标准；1，pUC18-sVP7质粒经经BamHI酶切.

图2为一种TAT-sVP7原核诱导表达及其融合蛋白的纯化电泳示意图。

图2中a：pET28a-TAT-sVP7诱导前后菌体总蛋白情况；1,诱导前的总蛋白；2,诱导后的总蛋白;

图2中b：融合蛋白的纯化；1,菌体超声处理后上清中的总蛋白;2,菌体超声处理后下部分的蛋白；3,纯化后的TAT-sVP7融合蛋白。

图3为一种TAT-sVP7合成及其转基因载体构建电泳示意图

TAT-sVP7导入到植物转基因载体，并生产水稻组成型表达的载体；

图3中a：TAT-sVP7融合片段的生成。M,DL2000的DNA标准；1，TAT片段；2，合成的sVP7片段；3，TAT-sVP7融合片段;

图3中b：TAT-sVP7转基因载体构建；M1,λDNA的HindⅢ的DNA标准；M2,DL2000的DNA标准;C,转基因载体的母体经BamHI酶切；1，构建的含TAT-sVP7的转基因载体经BamHI酶切。

图4为一种水稻愈伤组织细胞系PCR鉴定和Western blot定性检测分析示意图。

图4中a：GCRV的TAT-sVP7融合基因在不同水稻愈伤组织细胞系中的PCR鉴定；

图4中b：GCRV的TAT-sVP7融合蛋白在不同水稻愈伤组织细胞系中的Western blot检测。

M,DNA分子标准(DL2000);C0,无样品的PCR对照；V,转基因植物载体；C1,正常水稻愈伤细胞；1-7，分别为不同的水稻愈伤组织样品。TAT-sVP7，TAT-sVP7融合基因融合表达的蛋白。

图5为一种水稻愈伤组织细胞系胚性状态调整示意图。

图5中a：筛选的水稻愈伤组织细胞系在同一N6培养基上继代情况；

图5中b：筛选的水稻愈伤组织细胞系进行N6和NB培养基交替继代的情况。

图6为一种水稻转基因愈伤组织细胞系的冻干材料示意图。

图7为一种GCRV攻毒实验示意图。

图7中C：摄食普通非转基因水稻愈伤组织的草鱼，经攻毒后出现的症状；

图7中TAT-sVP7：摄食含有TAT-sVP7的转基因水稻愈伤组织的草鱼，经攻毒后出现的症状。

具体实施方式：

本实验中所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。

实施例1：融合基因TAT-sVP7的制备

1）从美国生物技术信息中心（NCBI）基因库里获得了成熟的GCRV的VP7（GenBank:AAM92742.1）所对应的氨基酸序列信息，由DNA分析软件（Gene Runner）将VP7基因（GenBank AF403394）的氨基酸序列转换成含有优化水稻遗传密码子的核苷酸序列，人工合成VP7基因，记为sVP7,其序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，人工合成（南京金斯瑞生物科技公司合成）。经密码子优化后的sVP7基因的核苷酸序列改变了23.5%，遗传密码改变了74.5%。

2）TAT核苷酸片段的生成

上游引物1条，下游引物1条，一次聚合合成。

TAF:GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGG TGGATCT；

TAR:ATCATGTGAAGTGGAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCACCAGATCCACCTCCAC

先将两条引物分别配成10uMol.L^-1,等量混合后，95℃加热10min后，室温冷却1h后，生成TAT核苷酸片段，4℃保存备用。其生成的细胞穿膜肽TAT及柔性联系序列为：

GGATCCATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAGCGTCGACGCGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTGGTGGAGGTGGATCTCCACTTCACATGATTCCG。

3）TAT与sVP7的柔性融合

以TAT和人工合成的sVP7为模板，经PCR扩增得TAT-VP7融合基因。在引物中加入BamH I酶切位点，以利于后续的重组质粒构建工作。设计的特异引物序列为：

上游引物：5’－GG GGA TCC ATG ATGTACGGCCGCAAGAAACGCCGACAG－3’

BamH I

下游引物：5’－GG GGA TCC TTA TCATAGCTCATCTTTCTC－3’

BamH I

PCR反应的总体积为50μl。PCR扩增条件为：热启动（94℃，5min），继续进行35个循环，每一循环的程序为94℃，30sec；56℃，30sec;72℃,30sec，最后一个延伸反应（72℃，5min）。取扩增产物5μl在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，EB染色后，紫外灯下观察，拍照。扩增产物用PCR纯化试剂盒纯化。

实施例2：PCR产物的回收、纯化及质粒pMD18-TAT-sVP7的构建

将实施例1中得到的TAT-sVP7,在琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下迅速切下欲回收的条带，用Trans琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称取重量。按其说明书进行回收操作。

将回收、纯化的PCR产物与pMD18-T(在Takara公司购置)连接，连接体系如下：

pMD18-T Vector     1.0μl

纯化的TAT+sVP7     3.0

dH2O               1.0

混匀后，再加入5.0μl的连接溶液I(Solution I)(在Takara公司购置,D6020S)16℃，连接过夜。

实施例3：pMD18-TAT-sVP7工程菌的构建

1）氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞，大肠杆菌感受态细胞采用TP10，其步骤和方法，按照分子克隆实验指导进行。

连接产物转化大肠杆菌感受态细胞：其步骤是：

2）在无菌条件下取连接反应液10μl，加入到100μl大肠杆菌TP10感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴中热激90sec，速移至冰水中2-3min。无菌下，加入600μl液体LB培养基，37℃，100rpm轻摇，温浴45min使细胞复苏。取上述菌液150μl，用无菌三角玻棒均匀涂布在50μg/ml Kan的LB平板上，正向放置1-2h，直至液体被全部吸收，倒置于37℃培养箱中培养过夜。由此法可得到E.coli TP10pMD18-TAT-sVP7菌落。

实施例4：融合基因的制备及表达载体的构建

挑取单克隆E.coli TP10pMD18-TAT-sVP7于10ml新鲜液体LB培养基中，37℃，150rpm摇床培养过夜，按分子克隆实验指导进行提取质粒。用BamHI分别酶切pMD18-TAT-sVP7和pET-28a,目的片段TAT-sVP7与开环pET-28a胶回收后16℃连接过夜，转化大肠杆菌TP10感受态细胞。转化方法同上。选取5个克隆进行测序，鉴定TAT-sVP7插入到pET-28a载体中的方向和序列信息，分析编码框的完整性。

实施例5：大肠杆菌基因工程菌的制备

将鉴定正确的质粒pET-28a-TAT-sVP7(1.0ul)转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达TAT-sVP7的重组基因工程菌株，大肠杆菌BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT-sVP7CCTCC NO:M2013084。

实施例6：基因工程融合蛋白TAT-sVP7的诱导表达和纯化

重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(DE3)hsdS gal pET-28a-TAT-sVP7的单菌落接种到10ml新鲜液体LB(含终浓度为50ug/ml卡那霉素)培养基中。37℃150rpm摇床培养过夜。无菌条件下，从培养过夜的菌中，取出2ml菌液接种到200ml的新鲜液体LB中，37℃200rpm摇床培养至OD600为0.8时（约4h）加入终浓度为0.5mM IPTG，37℃诱导4h后，离心6000g,4℃,10min收集菌体，用10mM PBS（pH8.0）重悬超声波破壁，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破壁后，离心12000g,4℃,20min收集沉淀，并用尿素变性液在4℃冰箱中溶解处理过夜，4℃离心12000g,30min收集上清。融合蛋白TAT-sVP7的纯化按Ni-NTA说明书进行，用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。得到纯化的TAT-sVP7蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例7：融合蛋白TAT-sVP7的抗体制备；

纯化的TAT-sVP7融合蛋白与弗氏不完全佐剂等量混合，腹腔注射Bal/C小白鼠5只，间隔2周免疫1次，共三次，最后1次免疫后第7天，从小白鼠眼眶取少量的血，37℃温箱中作用2h后，4℃放置过夜，取上清采用ELISA检测效价。如达到1:10000，就可大量取血，同上制备血清。TAT-sVP7的鼠源抗血清，4℃保存备用。

实施例8：TAT-sVP7融合基因导入转基因载体，构建植物转基因载体；

将目的片段TAT-sVP7与转基因载体ACT，通过BamHI酶切位点相联，T4DNA连接酶(NEB公司购买)，16℃，连接12h，转化大肠杆菌TP10感受态细胞中，经PCR鉴定正反向。将插入正确的TAT-sVP7-ACT导入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105。获得了一种重组农杆菌，分类命名农杆菌EHA105Act-TAT-sVP7，Agrobacterium sp.EHA105Act-TAT-sVP7CCTCC NO:M2013083。

实施例9：构建植物转基因载体导入农杆菌

将鉴定方向正确的TAT-sVP7-ACT通过电激转化到农杆菌EHA105.电击议的实验参数为：2.5KV,电泳冲25μF,电阻400欧。

实施例10：农杆菌与水稻愈伤组织细胞进行共培养、筛选和继代；

A．愈伤组织的诱导

1.剥去种子的外颖、内颖，选择成熟饱满的水稻世锦B(SJB)种子，装入50ml离心管。

2.蒸馏水30ml清洗3次，70%乙醇浸泡2min，蒸馏水清洗3次，再用0.15%HgCl₂浸泡15-20min，同时100rpm振荡。

3.在无菌台打开离心管，倒出HgCl₂，用无菌水清洗种子4、5次后，把种子倒在灭菌的滤纸，放置约1h。

4.将种子置入N6固体培养基（10粒/25ml/瓶），种胚朝上或接触培养基，28℃，暗培养4周。

5.观察诱导的愈伤，把淡黄色、致密的胚性愈伤与小盾牌分离后，转入新的N6，继代培养2周。

B．前培养

选择致密、相对干燥的胚性愈伤转移至新的N6培养基上，28℃下暗培养2天。

C．农杆菌的培养和悬浮

1.将适量农杆菌涂布接种在含有相应抗生素的LB固体培养基上，对于LBA4404，28℃下暗培养36h即可。

2.向50ml离心管加入30ml1/2N6AS。然后，取灭菌小勺刮取农杆菌，用勺背面将菌体贴在管壁轻轻拍散，使细菌悬液的OD₆₀₀达到0.8～1.0。

D．感染和共培养

1．感染：把经过前培养的愈伤集中至一个平皿，一次性转入菌液中，轻轻转动管子使菌液均匀分布，感染时间约15－25min。

2.共培养：将菌液倒出，把愈伤在无菌滤纸上放置2h，保证菌液被吸干，接至1/2N6AS中，20℃，暗培养1.5-2d。

E．农杆菌的去除

1.将共培养的愈伤装入50ml离心管，用无菌水清洗3次以上，至液体比较清亮。

2.最后一次倒出无菌水，加入含有头孢霉素（500mg/L）的N6液体培养基，于100rpm下，振荡15-20min，重复2-3次。

1.将愈伤倒在无菌滤纸上吸干2h以上。

F.愈伤组织的筛选

1.将干燥愈伤转入含有头孢霉素（250mg/L）的N6培养基中，28℃暗培养7-10d。

2.将没有被农杆菌污染的愈伤转入含有头孢霉素（250mg/L）和潮霉素（50mg/L）的N6培养基中（对于超量表达载体）或含有头孢霉素（250mg/L）和G418（25mg/L）的N6培养基中（对于转基因沉默载体），28℃暗培养15～20d。

3.将愈伤转入仅含有潮霉素（50mg/L）的N6培养基中（对于超量表达载体）或含有G418（50mg/L）的N6培养基中（对于转基因沉默载体），28℃暗培养15～20d。

4.再一次将愈伤转入仅含有潮霉素（50mg/L）的N6培养基中（对于超量表达载体）或含有G418（50mg/L）的N6培养基中（对于转基因沉默载体），28℃暗培养15～20d。

实施例11：外源融合蛋白的表达量检测和高表达水稻愈伤组织细胞系筛选；

取每个水稻愈伤组织细胞系中的部分组织块，采用ELISA试剂盒（从武汉博士德生物工程公司购买）进行外源融合蛋白量的测定。

转基因的水稻愈伤细胞系经继代后，取0.1g的水稻愈伤材料，用100ul的蛋白提取液提取，取20ul的上样在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过蛋白质印迹转膜并进行Western blot，可检测到TAT-sVP7带，后经酶联免疫检测，其表达量为1.54%。

最终获得了一种高表达重组TAT-sVP7的水稻转基因愈伤细胞系，

实施例12：水稻转基因愈伤组织的扩大培养和胚性改良

选取高表达TAT-sVP7融合蛋白的水稻愈伤组织细胞系进行扩大培养，为改善其胚性，采用N6和NB培养基交替进行继代。即是将高表达TAT-sVP7融合蛋白的水稻愈伤组织细胞系先继代在N6培养基上，等愈伤生长14d后，再将其在NB上进行继代培养；再等愈伤生长14d后，又用N6培养基上进行继代，依此类推，这样可以有效地改善了愈伤组织细胞的胚性和愈伤组织细胞状态；

实施例13：转基因水稻愈伤的加工

将采集的水稻转基因愈伤，放在培养皿中进行冷冻干燥。

实施例14：转基因水稻愈伤直接用于草鱼种的GCRV免疫防治

草鱼为草食性鱼类，在人工养殖的条件下可吃天然水草，可吃配合饲料，也可吃冻干的植物愈伤材料。冻干的水稻愈伤组织块，无需纯化处理即为草鱼种的口服疫苗。

实验中，每箱中随机放养15尾，每尾体重50.0±5g的草鱼苗。将阳性愈伤组织直接投喂。对照组的水稻愈伤组织为正常非转基因水稻愈伤组织，实验组的水稻愈伤组织含有TAT-sVP7蛋白，设置不同的浓度梯度，其中冻干粉为15%左右，间隔1天投喂，连续投喂5次，每天的投饵量为鱼体重的2%。设3个平行组，实验前1d和实验开始后第7d、第14d、第28d和第35d进行草鱼尾静脉采血，做间接ELISA、Western blot免疫组化检测。如若检测效果好，则对连续口服摄食28d后的实验草鱼种和对照实验草鱼(一组为空白组和对照组)，经腹腔注射GCRV组织毒进行攻毒实验，分别统计各组的死亡率和相对保护率。结果显示，攻毒后，对照组草鱼的死亡率78.75%±2.56；而投喂了含有转基因水稻愈伤组织块的饲料组，草鱼的死亡率为23.48±1.27，后者比前者下降了55.27%，二者比较达到显著水准（t-test P=0.024）,表明直接喂养转TAT-sVP7融合基因水稻愈伤组织块的获得的相对免疫保护率为70.18%，因此，含有TAT-sVP7融合蛋白的植物疫苗，具有明显的抗GCRV的效果。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国科学院水生生物研究所

 

<120>  一种融合蛋白基因TAT-sVP7及其应用

 

<130>  一种融合蛋白基因TAT-sVP7及其应用

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  945

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  1

ggatccgcca ccatgtacgg ccgcaagaaa cgccgacagc gtcgacgcgg tggaggtgga     60

 

tctggtggag gtggatctgg tggaggtgga tctccacttc acatgattcc gcaggtcgcc    120

 

cacgctatgg tccgtgcagc cgctgcagga cgccttaccc tgtacacaag aactagaact    180

 

gagaccacca actttgatca cgctgagtac gtcacctgcg gtcgctacac catctgcgcc    240

 

ttctgcctta cgactctggc tccccacgcc aacgtcaaga ccattcagga ctcccacgct    300

 

tgctcccgtc aaccaaacga agccattcgc tcactcgtcg aagtgagtga caaagcgcag    360

 

accgccctcg tcggtagccg tactgtcgac tatcacgaat tggatgtgaa ggctgggttc    420

 

gtcgccccaa ctgccgatga aacaatcgcc ccctctaagg atatcgtcga acttccgttt    480

 

cgcacctgtg acttggacga ttcctctgct accgcttgcg tccgaaacca ctgccaggcc    540

 

ggtcacgacg gcgttatcca cctcccgatc ctttctggag atttcaagtt gcctaacgag    600

 

catcccacca agccgctgga cgatacgcat ccccacgaca aggtgctgac tcgctgcccc    660

 

aagactggtc tcctcctcgt ccatgacact cacgcccacg ccaccgccgt cgttgccacc    720

 

gctgctacga gagctatcct catgcacgac ctcctgacat ccgcgaacgc ggacgacggc    780

 

catcaggcac gttccgcttg ctacggtcca gcgttcaaca acctgacctt cgcttgccac    840

 

tccacctgtg cttcagacat ggctcacttc gactgcggcc agatcgttgg actcgacttg    900

 

catgtgagca tccgattctg agaaagatga gctatgatag gatcc                    945

 

 

<210>  2

<211>  311

<212>  PRT

<213>  人工合成

 

<400>  2

 

Gly Ser Ala Thr Met Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro

            20                  25                  30         

 

 

Leu His Met Ile Pro Gln Val Ala His Ala Met Val Arg Ala Ala Ala

        35                  40                  45             

 

 

Ala Gly Arg Leu Thr Leu Tyr Thr Arg Thr Arg Thr Glu Thr Thr Asn

    50                  55                  60                 

 

 

Phe Asp His Ala Glu Tyr Val Thr Cys Gly Arg Tyr Thr Ile Cys Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Phe Cys Leu Thr Thr Leu Ala Pro His Ala Asn Val Lys Thr Ile Gln

                85                  90                  95     

 

 

Asp Ser His Ala Cys Ser Arg Gln Pro Asn Glu Ala Ile Arg Ser Leu

            100                 105                 110        

 

 

Val Glu Val Ser Asp Lys Ala Gln Thr Ala Leu Val Gly Ser Arg Thr

        115                 120                 125            

 

 

Val Asp Tyr His Glu Leu Asp Val Lys Ala Gly Phe Val Ala Pro Thr

    130                 135                 140                

 

 

Ala Asp Glu Thr Ile Ala Pro Ser Lys Asp Ile Val Glu Leu Pro Phe

145                 150                 155                 160

 

 

Arg Thr Cys Asp Leu Asp Asp Ser Ser Ala Thr Ala Cys Val Arg Asn

                165                 170                 175    

 

 

His Cys Gln Ala Gly His Asp Gly Val Ile His Leu Pro Ile Leu Ser

            180                 185                 190        

 

 

Gly Asp Phe Lys Leu Pro Asn Glu His Pro Thr Lys Pro Leu Asp Asp

        195                 200                 205            

 

 

Thr His Pro His Asp Lys Val Leu Thr Arg Cys Pro Lys Thr Gly Leu

    210                 215                 220                

 

 

Leu Leu Val His Asp Thr His Ala His Ala Thr Ala Val Val Ala Thr

225                 230                 235                 240

 

 

Ala Ala Thr Arg Ala Ile Leu Met His Asp Leu Leu Thr Ser Ala Asn

                245                 250                 255    

 

 

Ala Asp Asp Gly His Gln Ala Arg Ser Ala Cys Tyr Gly Pro Ala Phe

            260                 265                 270        

 

 

Asn Asn Leu Thr Phe Ala Cys His Ser Thr Cys Ala Ser Asp Met Ala

        275                 280                 285            

 

 

His Phe Asp Cys Gly Gln Ile Val Gly Leu Asp Leu His Val Ser Ile

    290                 295                 300                

 

 

Arg Ser Glu Lys Asp Glu Leu

305                 310    

 

 

<210>  3

<211>  831

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

atgcctctcc acatgattcc gcaggtcgcc cacgctatgg tccgtgcagc cgctgcagga     60

 

cgccttaccc tgtacacaag aactagaact gagaccacca actttgatca cgctgagtac    120

 

gtcacctgcg gtcgctacac catctgcgcc ttctgcctta cgactctggc tccccacgcc    180

 

aacgtcaaga ccattcagga ctcccacgct tgctcccgtc aaccaaacga agccattcgc    240

 

tcactcgtcg aagtgagtga caaagcgcag accgccctcg tcggtagccg tactgtcgac    300

 

tatcacgaat tggatgtgaa ggctgggttc gtcgccccaa ctgccgatga aacaatcgcc    360

 

ccctctaagg atatcgtcga acttccgttt cgcacctgtg acttggacga ttcctctgct    420

 

accgcttgcg tccgaaacca ctgccaggcc ggtcacgacg gcgttatcca cctcccgatc    480

 

ctttctggag atttcaagtt gcctaacgag catcccacca agccgctgga cgatacgcat    540

 

ccccacgaca aggtgctgac tcgctgcccc aagactggtc tcctcctcgt ccatgacact    600

 

cacgcccacg ccaccgccgt cgttgccacc gctgctacga gagctatcct catgcacgac    660

 

ctcctgacat ccgcgaacgc ggacgacggc catcaggcac gttccgcttg ctacggtcca    720

 

gcgttcaaca acctgacctt cgcttgccac tccacctgtg cttcagacat ggctcacttc    780

 

gactgcggcc agatcgttgg actcgacttg catgtggagc catccgatta a             831

 

 

Claims (5)

1.一种分离的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。

2.表达权利要求1所述蛋白的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：大肠杆菌（Escherichia coli）BL21(DE3)hsdS gal pET28a-TAT-sVP7，所述菌株的保藏号为CCTCC NO:M2013084。

3.表达权利要求1所述蛋白的重组农杆菌基因工程菌，其特征在于：农杆菌（Agrobacteriumsp.）EHA105Act-TAT-sVP7，所述菌株的保藏号为CCTCC NO:M2013083。

4.权利要求2或权利要求3所述的基因工程菌在制备治疗或预防草鱼呼肠孤病毒病药物中的应用。

5.权利要求1所述的蛋白在制备治疗或预防草鱼呼肠孤病毒病药物中的应用。

Images