CN104805106A - 含tgev及pedv保护性抗原的融合基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因及其编码蛋白和应用。该含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。编码该融合基因的蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。将该融合基因导入玉米中，经筛选、鉴定得到含TGEV及PEDV保护性抗原转基因玉米植株。本发明获得的转基因玉米疫苗可高效表达含TGEV及PEDV保护性抗原的融合蛋白，而且表达产物具有显著的免疫原性。

Description

含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及一种融合基因、编码蛋白和应用，具体涉及一种含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

猪传染性胃肠炎是以呕吐、严重腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死性为特征，不同品种和年龄的猪均易感，该病是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible GastroenteritisVirus，TGEV)引起的，其主要危害新生仔猪，随着日龄的增大，该病的死亡率逐渐下降，但往往会造成生产性能下降，饲料报酬率降低，经济损失较大。猪流行性腹泻病以腹泻、呕吐和脱水为特征，各种年龄和品种的猪群都易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，该病是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的，该病在我国26个省市自治区都有发生，并且近几年来流行区域有逐渐扩大的趋势。目前，已成为我国养猪业重要的腹泻病之一。

目前，临床上，这两种病常混合感染，导致临床症状类似的腹泻病，因此灭活苗等常提供的是上述两种病的二联苗，即使用灭活苗或弱毒苗接种，但灭活苗和弱毒苗的制备和使用较繁琐。且灭活苗免疫应答产生较慢，不能激发产生以分泌IgA(SIgA)抗体为主的粘膜免疫反应，免疫效果不够理想，成本也很高；而弱毒苗存在易返祖、有潜在感染危险。

同属冠状病毒属的上述两种病毒的S蛋白均在各自的免疫反应中发挥重要作用，因此许多的研究中，S基因也成为了这两种病毒基因工程疫苗研究的首选抗原基因。

TGEV保护性抗原位点的研究主要基于F.Gebauer等(F.Gebauer,W.P.Posthumus,I.Correa,C.Sune,C.Smerdou,C.M.Sanchez,J.A.Lenstra,R.H.Meloen,L.Enjuanes,Residuesinvolved in the antigenic sites of transmissible gastroenteritis coronavirus S glycoprotein,Virology,1991,183:225-238)依据单克隆抗体相互竞争的实验方法，研究发现S蛋白存在三种水平的抗原结构，即抗原位点(Sites)、抗原亚位点(Subsites)和抗原决定簇(Epitopes)。TGEV S抗原分为A,B,C,D共4个抗原位点。A抗原位点又可分为Aa，Ab和Ac3个亚位点，通过相关实验，证明这些亚位点又可再分为抗原决定簇，S蛋白共有11个抗原决定簇，其中5个是与中和作用相关的重要抗原决定簇。研究证实，这四个抗原位点都位于S蛋白N端的543个氨基酸残基之内。

PEDV保护性抗原位点研究方面：S.H.Chang等(S.H.Chang,J.L.Bae,T.J.Kang.Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against theporcine epidemic diarrhea virus.Mol.Cells,2002,14:295–299)用大肠杆菌表达PEDV S基因上499-638蛋白，注射小鼠后产生的多克隆血清能明显地抑制PEDV空斑的形成。推测PEDV S蛋白的中和抗原表位主要位于第498-638之间，基因长度为420bp。随后，将该片段命名为COE(core neutralizing epitope)。D.J.Cruz等(D.J.Cruz,C.J.Kim,H.J.Shin,Phage-displayed peptides having antigenic similarities with porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)neutralizing epitopes,Virology,2006,354:28-34)利用噬菌体随机肽库鉴定了PEDVS蛋白的一个模拟表位(1368GPRLQPY1374)。并于2008年证实该片段能够诱导中和抗体的产生(D.J.Cruz,C.J.Kim,H.J.Shin,The GPRLQPY motif located at the carboxy-terminal ofthe spike protein induces antibodies that neutralize Porcine epidemic diarrhea virus,Virus Res,2008,132:192-196)。D.Sun等(D.Sun,L.Feng,H.Shi,J.Chen,X.Cui,H.Chen,S.Liu,Y.Tong,Y.Wang,G.Tong,Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemicdiarrhea virus spike protein,Vet Microbiol,2008,131:73-81；孙东波，猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选，中国农业科学院，2008)利用fd丝状噬菌体展示系统及生物信息学方法鉴定出PEDV S蛋白5个线性抗原表位即S1P1(第248～280位氨基酸)、S1P2(第442～499位氨基酸)、S1P3(第697～742位氨基酸)、SS5(第748～755位氨基酸)和SS6(第764～771位氨基酸)，1个中和表位区(S1D，第636～789位氨基酸)，1个猪氨基肽酶N潜在的受体结合域(MRR，第249～529位氨基酸)。这些抗原表位以及受体结合域的揭示对进一步分析PEDV S蛋白的结构与功能具有重要的指导意义。

近年来，随着植物基因工程技术的迅速发展，利用转基因技术构建植物生物反应器生产疫苗已成为当前植物基因工程研究的一个重要方向。转基因植物疫苗有以下优点：植物细胞具有全能性，能够再生植株且易于成活；植物细胞完整的真核细胞表达系统使表达产物具有良好的免疫原性及生物学活性；植物细胞壁的天然生物胶囊作用能避免抗原蛋白在消化道中被降解，同时又能起到一定的缓释作用；生产非常简单，成本低，易于大规模生产，且便于运输和保存；使用方便，动物在采食过程中达到免疫的目的，避免了繁琐的免疫程序和对动物的应激反应；使用安全，没有其它病原的污染。因此，对猪安全、有效，并能迅速产生免疫力的基因工程疫苗将有较好的应用前景。目前作为植物生物反应器研究的最多的表达系统是烟草，但烟草含有大量生物碱毒素，下游处理费用较高。玉米作为目前畜禽饲料最大量的组分，有着产量高、环境适应力强、果实不需高温加热等优势，所以在畜禽转基因植物疫苗的研究中吸引着越来越多研究者的目光。TGEV方面，有使用转基因芥菜(N.Gomez,C.Carrillo,J.Salinas,F.Parra,M.V.Borca,J.M.Escribano,Expression ofimmunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus intransgenic plants,Virology,1998,249:352-358)、土豆(N.Gomez,A.Wigdorovitz,S.Castanon,F.Gil,R.Ordas,M.V.Borca,J.M.Escribano,Oral immunogenicity of the plant derived spikeprotein from swine-transmissible gastroenteritis coronavirus,Arch Virol,2000,145:1725-1732)、烟草(T.Tuboly,W.Yu,A.Bailey,S.Degrandis,S.Du,L.Erickson,E.Nagy,Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants,Vaccine,2000,18,2023-2028)等表达TGEV S基因相关片段的报道。PEDV方面，J.L.Bae,T.J.Kang等以烟草(J.L.Bae,J.G.Lee,T.J.Kang,H.S.Jang,Y.S.Jang,M.S.Yang,Inductionof antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenicplants expressing the antigen,Vaccine,2003,21:4052-4058；T.J.Kang,Y.S.Kim,Y.S.Jang,M.S.Yang,Expression of the synthetic neutralizing epitope gene of porcine epidemic diarrheavirus in tobacco plants without nicotine,Vaccine,2005,23:2294-2297；T.J.Kang,S.C.Han,M.O.Jang,K.H.Kang,Y.S.Jang,M.S.Yang,Enhanced expression of B-subunit of Escherichiacoli heat-labile enterotoxin in tobacco by optimization of coding sequence,Appliedbiochemistry and biotechnology,2004,117:175-187；T.J.Kang,S.C.Han,M.S.Yang,Y.S.Jang,Expression of synthetic neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus fused withsynthetic B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin in tobacco plants,Protein ExprPurif,2006,46:16-22)为对象及M.Oszvald等以大米(M.Oszvald,T.J.Kang,S.Tomoskozi,C.Tamas,L.Tamas,T.G.Kim,M.S.Yang,Expression of a synthetic neutralizing epitope ofporcine epidemic diarrhea virus fused with synthetic B subunit of Escherichia coli heat labileenterotoxin in rice endosperm,Mol Biotechnol,2007,35:215-223)以及Nguyen-Xuan Huy等(Nguyen-Xuan Huy,Moon-Sik Yang.Expression of a Cholera Toxin B Subunit-NeutralizingEpitope of the Porcine Epidemic Diarrhea Virus Fusion Gene in Transgenic Lettuce.MolBiotechnol.2011,48:201–209)利用莴苣为对象研发转基因植物疫苗。但将TGEV和PEDV保护性抗原片段串联研发转基因植物疫苗尚未见报道，且烟草、大米胚乳和莴苣等这些作物均不适合在猪饲料中大量添加。玉米作为猪饲料的重要来源，具有不可替代的优势。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因。

本发明的第二目的在于提供一种编码上述融合基因的蛋白。

本发明的第三个目的在于提供一种包含上述融合基因的重组表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种上述融合基因在制备转基因植物疫苗方面的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因(即串联基因)，名称为sTP，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

一种编码上述融合基因的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

一种包含上述融合基因的重组表达载体，优选地，在所述重组表达载体中，由胚乳特异性Zein启动子驱动所述融合基因sTP的表达，更优选地，在所述重组表达载体中，以编码除草剂草甘膦抗性的CP4型EPSP基因作为选择标记。更优选地，所述重组表达载体为如图2所示的pBAC9090。

一种上述融合基因在制备转基因植物疫苗方面的应用。

优选地，所述应用的具体方法如下：将所述融合基因sTP导入植物中，通过鉴定、筛选得到可稳定表达所述融合基因sTP的转基因植物疫苗。所述植物优选为玉米。

在所述应用中，所述融合基因sTP优选是通过插入植物表达载体而得到的重组表达载体导入玉米中的。

在所述应用中，所述含有融合基因sTP的重组表达载体可通过基因枪法、使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到玉米的细胞或组织中。

在所述应用中，所述植物表达载体可以是基因枪转化用常规载体。

在所述应用中，所述重组表达载体优选以胚乳特异性Zein启动子驱动目的基因sTP的表达，更优选地，以编码除草剂草甘膦抗性的CP4型EPSP基因作为选择标记。

在所述应用中，优选地，所述融合基因sTP通过重组表达载体pBAC9090导入玉米中，所述重组表达载体pBAC9090如图2所示。更优选地，所述重组表达载体pBAC9090通过基因枪法导入玉米中。

所述玉米材料优选为易于遗传转化的玉米自交系501。

本发明优选以玉米为生物反应器，将猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪流行性腹泻病毒(PEDV)保护性抗原位点的串联基因sTP导入玉米自交系，从而获得含TGEV及PEDV保护性抗原转基因玉米疫苗。首先，根据玉米密码子的偏好性，设计合成优化的TGEV-PEDV串联编码基因sTP，构建了含有人工合成的sTP基因的表达载体pBAC9090，其以胚乳特异性Zein启动子驱动目的基因sTP的表达。然后，以玉米自交系501作为受体材料，利用PDS1000/He基因枪转化玉米自交系501的幼胚，经过愈伤组织诱导、分化再生培养，获得22株转化再生植株，进而通过田间草甘膦抗性筛选，获得4个转基因玉米株系。利用PCR方法，对获得的4个转基因玉米株系进行检测分析，其中3株均成功检测到转基因目的片段，表明sTP基因已成功整合到玉米基因组中。然后利用间接ELISA和Western blot等方法，对获得的4个转基因玉米株系进行检测分析，结果显示部分植株的sTP基因已成功整合到玉米基因组并进行了蛋白表达。通过对转基因玉米株系的种子中的目的蛋白含量的定量分析得出目的蛋白在种子中的表达量较高。经以下实验证明表达产物具有显著的免疫原性：提取转基因玉米稳定株系的可溶性蛋白，与佐剂混合皮下注射免疫小鼠，结果表明经免疫的小鼠可产生针对TGEV及PEDV抗原的特异性抗体。另外，动物实验证明，本发明得到的转基因玉米疫苗同时具有免疫TGEV及PEDV病毒的功效。因此本研究获得的转基因玉米可稳定表达sTP蛋白，表达产物具有显著的免疫原性。

附图说明

图1是本发明融合基因sTP的结构示意图；

图2是本发明构建的重组表达载体pBAC9090的示意图；

图3是T1代转基因玉米株系基因组中sTP基因的PCR检测结果，其中：M：分子量标准；1：T1代株系1；2：T1代株系2；3：T1代株系3；4：T1代株系4；5：阴性对照；6：阳性对照；

图4是Western blot检测转基因玉米株系总蛋白中sTP的表达情况，其中：M：分子量标准；1：非转基因植株；2：未上样孔；3：T1代株系1；4：T1代株系2；5：T1代株系3；6：T1代株系4；

图5是转基因玉米中sTP蛋白免疫小鼠后针对TGEV CB抗原位点血清抗体的ELISA检测结果；

图6是转基因玉米中sTP蛋白免疫小鼠后针对PEDV COE抗原位点血清抗体的ELISA检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因及其编码蛋白和应用进行详细说明，但本发明并不限于此。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

以下实施例中涉及的PCR反应用试剂、限制性内切酶和抗生素购自大连宝生物公司；大肠杆菌DH5α、各种规格的分子量标准、质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、增强型HRP-DAB底物显色试剂盒等购自天根生化公司。

实施例1使用的大肠杆菌表达并纯化的TGEV CB抗原位点和PEDV COE抗原位点标签蛋白的制备方法

(1)首先在NCBI网站的GenBank中获得TGEV和PEDV的cDNA序列，编码分别为GenBank accession No.AJ271965.2和No.JN825712.1，其中S编码基因的碱基序列分别位于20365-24708(TGEV，共4344bp)和20634-24794(PEDV，共4161bp)；选择TGEV中S编码基因中118-510(包含CB抗原位点)和PEDV中S编码基因中1363-1968(包含COE抗原位点)片段克隆入原核表达载体pET-32a(购自Novagen公司)，经酶切和测序鉴定，将阳性质粒(pET-32a-CB和pET-32a-COE)分别转化到表达菌Rosetta(DE3)感受态细胞(购自康为世纪生物技术有限公司)中用于表达，构建参考周宏专等(周宏专,覃湘婕,杨兵,等.猪传染性胃肠炎病毒S基因不同编码区的表达和反应原性鉴定[J].华北农学报,2014,06:63-673)的方法。

(2)分别挑取pET-32a-CB和pET-32a-COE单菌落接种于同时含氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；再将上述已经过夜培养的培养液以1:100的比例接种于同时含氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600值达到0.6左右；然后加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h，收集菌体。

(3)参照康为世纪生物技术有限公司Ni-Agarose His标签蛋白纯化(包涵体蛋白)说明书进行蛋白纯化，具体如下：从1L上述培养物中收集菌体后用PBS重悬，加入溶菌酶至1mg/mL及DNaseI至1U/mL。超声波破碎后沉淀重悬于结合缓冲液中(Tris-HCl(pH7.9)20mM，咪唑5mM，NaCl 0.5M，尿素8M)，10,000g离心20min后，用0.45μm滤膜过滤上清。将2mL带His标签的Ni-琼脂糖填料装柱，将上述经滤膜过滤的上清样品装入平衡好的镍柱。然后利用15倍柱体积的结合缓冲液洗去杂蛋白，接着使用1mL的洗脱缓冲液(Tris-HCl(pH7.9)20mM，咪唑500mM，NaCl 0.5M，尿素8M)洗脱目的蛋白。最后将洗脱的目的蛋白即大肠杆菌表达并纯化的CB(TGEV)及COE(PEDV)标签蛋白分装备用。

T0代表示由玉米的愈伤组织得到的转基因植株；T1代表示由T0代自交产生的种子及由它们长成的植株。

实施例2含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因sTP的获得

首先在NCBI网站的GenBank中获得TGEV的cDNA序列，编码为GenBank accessionNo.AJ271965.2，其中S编码基因的碱基序列位于20365-24708，共4344bp，根据现有的有关TGEV保护性抗原位点的研究，选择TGEV中S编码基因中118-510(CB抗原位点)、805-1239(D抗原位点)和1537-1986(A抗原位点)的碱基序列作为基础序列。然后在NCBI网站的GenBank中获得PEDV的cDNA序列，编码为GenBank accession No.JN825712.1，其中S编码基因的碱基序列位于20634-24794，共4161bp；根据现有的有关PEDV保护性抗原位点的研究，选择PEDV中S编码基因中1363-1968(COE抗原位点)、2221-2340(B epitope抗原位点)和4084-4158(P1抗原位点)的碱基序列作为基础序列。对所选择的基因序列进行人工串联及优化，优化后的结构参见图1，其中5'端的SP信号肽序列具有促进蛋白分泌表达的作用，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中第19-84；His标签序列(H tag)可便于目的蛋白表达产物的检测，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中第85-111；在5'端SP信号肽序列之前的Kozak序列，具有提高翻译效率的作用，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中第7-15；在3'端加上的SEKDEL基序可以促进偶联的外源性抗原进入抗原提呈细胞(APC)MHC-I类抗原递呈途径，从而促进免疫效果，SEKDEL碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中第2233-2250；各个保护性抗原位点片段间使用了L1(Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Gly)或L2(Gly-Pro-Gly-Gly)短肽串联，其中L1碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中第1405-1422，L2碱基序列如序列表SEQ ID NO.1中第508-519。串联后，根据玉米密码子偏好性对串联的基因序列进行人工优化，这些优化不影响相应保护性抗原位点编码的氨基酸序列。优化后的含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因sTP由人工合成，合成时在5'端增加BamHI酶切位点和起始密码子ATG，在3'端加终止密码子和SacI酶切位点。本实施例的sTP基因由上海生工生物工程有限公司合成。合成后的sTP基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3重组表达载体pBAC9090的构建

(1)植物表达载体pBAC198的构建，构建方法如下：

用SacI和EcoRI双酶切质粒载体pBI221(购自美国Clontech公司)获得0.26kb的根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS3＇末端终止子序列，然后将根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS3＇末端终止子序列插入基础质粒pSP72(购自Promega公司)的SacI和EcoRI位点，用蓝白斑筛选法获得连接正确的质粒，定名为pBPC18(2.7kb)。

Zein启动子(1435bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示)为人工合成序列，由上海生工公司合成。Zein启动子5'端具有HindIII酶切位点，在3'端具有BamHI酶切位点，Zein启动子用HindIII/BamHI酶切后将其插入pBPC18的HindIII/BamHI位点，经筛选、分析得到的插入正确的重组质粒，定名为pBAC155(4126bp)。

用BamHI和SacI酶切实施例1合成的sTP基因，回收2235bp片段；再用BamHI和SacI酶切质粒pBAC155，回收4.1kb的载体片段，然后将酶切后的sTP基因与4.1kb的载体片段连接，经筛选、鉴定后得到的连接正确的载体命名为pBAC198。pBAC198质粒包含Zein启动子驱动sTP基因-Nos终止子，即完整的目的基因表达框。

(2)植物表达载体pBAC9090的构建，构建方法如下：

首先，以pBAC823(6180bp)为基础载体(构建方法参见发明专利ZL201110294326.6)，用DraIII和KpnI双酶切pBAC823，去除1.2kb大小的区域包括多克隆位点，回收4.9kb大小的载体片段，经T4DNA聚合酶补平，自连，获得载体定名为pBAC823D(4.9kb)。

人工合成密码子优化的CP4型EPSP基因，长度为1.38kb，碱基序列如SEQ ID NO.4所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。用BamHI和SacI酶切后回收并插入到pBAC823D经BamHI和SacI酶切后回收的3.5kb载体中，获得的载体定名为pBAC823E(4.8kb)，其含有35S-adh1Intron1-CP4型EPSP-Nos3’表达框架。

第二，pBAC823用NdeI酶切去除原有35S-adh1Intron-EPSP-Nos3’片段，得到3.3kb载体片段；用NdeI酶切pBAC823E回收2.6kb大小的35S-adh1Intron-CP4型EPSP-Nos3’片段，将3.3kb载体片段与2.6kb大小的35S-adh1Intron-CP4型EPSP-Nos3’片段连接，酶切鉴定方向插入正确的质粒，定名为pBAC9031(10113bp)。pBAC9031用KpnI酶切，去除3.7kb大小的35S-adh1intron-anCB-Nos3’片段，剩余载体部分经自连，获得质粒pBAC9031A(6.4kp)。

第三,pBAC9090的构建：用HindIII和EcoRI双酶切pBAC198，回收约4.1kb大小的sTP基因表达框的片段；再用Hind III和EcoR I双酶切pBAC9031A，回收约6.4kb的载体，将4.1kb大小的基因片段和回收的6.4kb的载体连接，经酶切鉴定且测序正确的质粒命名为pBAC9090，大小为10.5kb(参见图2)。pBAC9090以编码除草剂草甘膦抗性的CP4型EPSP基因作为选择标记，以Zein启动子驱动sTP基因的表达。

实施例4 pBAC9090转化玉米

取授粉后10d左右的玉米自交系501(购自北京市农林科学院玉米中心)的果穗，用75％乙醇表面消毒后挑取幼胚接种到诱导培养基(N6基础培养基+10mg/LAgNO3+100mg/L肌醇+2mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L琼脂)上，25℃暗培养3～5d后诱导出愈伤组织。将纯化的pBAC9090载体调整浓度为1μg/μL，按文献(Zhang X-D,Li D-M,Xu W-Y.Development of Transgenic Wheat by biolistic Bombardment Transferring BastaResistance Gene and Novel HMW Glutenin Subumit Genes.Acta Agriculturae Boreall-Sinica,1997,12(1):133–1360)中描述的方法进行基因枪子弹的制备，PDS-1000/He型基因枪轰击愈伤组织，5d后将愈伤组织转移到含有草甘膦的筛选培养基(诱导培养基中加入2mg/L草甘膦)上筛选培养20d左右。然后将生长正常的愈伤组织转移到分化培养基(N6基础培养基+0.5mg/L AgNO3+100mg/L肌醇+1.5mg/L KT+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+1mg/L草甘膦)上分化培养，分化的幼苗在壮苗培养基(1/2MS基本培养基+2mg/L多效唑+100mg/L肌醇+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂)中培养至根长4-5cm后移栽到实验田，共获得22株成活T0代植株，T0代的种子种植于大田，进行田间草甘膦抗性筛选，最后获得4个T1代转基因株系。

实施例5转pBAC9090的玉米T1代转基因玉米植株的鉴定

(1)T1代转基因株系的PCR检测

用CTAB法提取T1代转基因玉米和非转基因玉米叶片基因组DNA作为PCR反应的模板，根据sTP基因片段设计上游引物和下游引物：

sTP-F:5’-CCCACCGTGCAGCCCTGGTT-3’(SEQ ID NO.6),

sTP-R:5’-CTCGGAGCCCCAGTTGCAGGTCA-3’(SEQ ID NO.7)(由上海Invitrogen公司合成)。

以水为阴性对照、重组质粒pBAC9090为阳性对照进行PCR检测。PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 4μL、sTP-F 1μL、sTP-R 1μL、玉米基因组DNA(0.5μg/μL)1μL、Taq酶0.5μL、ddH2O补足至50μL。

反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中进行检测。结果见图3，从图3中来看，4个株系中有3个株系以及阳性对照明显扩增出282bp的目的条带，而空白对照没有扩增出条带，表明3个T1代转基因株系目的基因均整合到玉米基因组中。

(2)T₁代转基因植株的Western blot检测

分别取4个T₁代转基因株系和1个非转基因株系约200mg玉米种子采用液氮研磨后，加入1mL蛋白质提取缓冲液(200mM Tris-Cl pH8.0，100mM NaCl，400mM蔗糖，10mM EDTA，14mMβ-巯基乙醇，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.05wt％吐温20)充分混匀，4℃、12000rpm离心5min，取上清，再重复抽提一次。然后取90μg得到的可溶性总蛋白经15％SDS-PAGE电泳后转膜，转印后的膜在3wt％BSA封闭液中于37℃封闭1h；然后加入1:2000稀释的HRP标记的抗His标签鼠单克隆抗体(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，于37℃反应1h；用PBST洗膜3次，每次10min；使用增强型HRP-DAB(3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)底物显色试剂盒(购自天根生化科技有限公司)进行显色，条带清晰后终止显色反应。

其中图4是将转基因植株和非转基因植株中提取的可溶性总蛋白进行变性蛋白电泳后转印进行Western blot检测得到的结果；泳道5和6可见81kD的条带，大小与预期相符，泳道1中的非转基因植株无相应条带。结果表明两个T1代转基因玉米株系表达了sTP蛋白。

(3)T1代转基因稳定株系中sTP蛋白免疫小鼠后血清抗体的ELISA检测

分别取Western blot检测阳性的两个株系即株系1和2及非转基因株系约750mg玉米种子，铁器粗砸后，继续采用液氮研磨，研磨后加入1mL PBS(pH 7.4)充分混匀，4℃、12000rpm离心5min，取上清，再重复抽提一次总可溶性蛋白，将抽提产物通过MilliporeUltra超滤离心管进行浓缩，按Bradford法测定浓缩后的总可溶性蛋白质浓度。蛋白浓缩液与弗氏佐剂按1∶1混匀乳化后用于小鼠皮下注射免疫，首免用弗氏完全佐剂乳化，二免及以后用弗氏不完全佐剂乳化。

将6周龄雌性BALB/c小鼠(购自北京金牧阳实验动物有限责任公司)随机分成四组，每组5只。第1组为PBS(pH 7.4)免疫组；第2组为非转基因玉米组，每次每只免疫剂量为800μg总可溶性蛋白；第3-4组分别为转基因玉米株系1组和转基因玉米株系2组，每次每只免疫剂量也为800μg总可溶性蛋白。分别于第1、15、29和43天各免疫一次，免疫前和第14、28、42和56天尾静脉采血收集血清，间接ELISA方法检测抗体，具体如下：分别用实施例1制备的大肠杆菌表达并纯化的TGEV CB抗原位点和PEDV COE抗原位点标签蛋白包被过夜，每孔200ng；用PBST洗涤3次，再在每孔加入150μL封闭液(1wt％BSA)，37℃孵育2h；用PBST洗涤3次后，每孔加入100μL 1∶300稀释的上述采集的血清样品(稀释液为1wt％BSA)，置37℃孵育1h；用PBST洗涤3次，每孔加入100μL 1∶6000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(稀释液为1wt％BSA)，置37℃孵育1h，用PBST洗涤3次；每孔加入底物TMB(3,3,5,5-Tetramethyl benzidine solutionliquid membrane substratecas)溶液100μL，置室温避光孵育5-15min；每孔加入100μL浓度为2mol/L的硫酸终止反应。在酶标仪上450nm吸光值检测各孔OD值。

皮下注射免疫小鼠，免疫原性的间接ELISA检测结果参见图5和图6，转基因玉米株系1和2在二免后抗体水平即高于PBS对照组和未转基因对照组，针对TGEV CB抗原位点血清抗体检测结果显示，转基因玉米株系1和2在四免后抗体水平(0.468和0.557)高于非转基因玉米组(0.173)；针对PEDV COE抗原位点血清抗体检测结果显示，转基因玉米株系1和2在四免后抗体水平(0.440和0.490)高于非转基因玉米组(0.154)。此结果表明转基因玉米表达的sTP蛋白可刺激动物机体产生针对TGEV和PEDV的特异性抗体，免疫原性显著。

本发明依据玉米密码子的偏好性，对TGEV及PEDV保护性抗原编码基因的密码子进行了人工优化，但不改变其编码的氨基酸序列，保留了其潜在的免疫保护作用。本发明通过构建表达载体pBAC9090并转化玉米自交系，将优化后的TGEV及PEDV保护性抗原编码基因sTP导入玉米基因组中。转基因植株的分子检测结果表明，目的基因已导入转基因玉米的基因组中。

应当理解，上述实施例仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含TGEV及PEDV保护性抗原的融合基因，名称为sTP，碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.一种编码权利要求1所述融合基因的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如序列表SEQID NO.2所示。

3.一种包含权利要求1所述融合基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，在所述重组表达载体中，由胚乳特异性Zein启动子驱动所述融合基因sTP的表达；优选地，在所述重组表达载体中，以编码除草剂草甘膦抗性的CP4型EPSP基因作为选择标记；更优选地，所述重组表达载体为如图2所示的pBAC9090。

5.一种权利要求1所述融合基因在制备植物疫苗方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法如下：将所述融合基因sTP导入植物中，通过鉴定、筛选得到可稳定表达所述融合基因sTP的转基因植物疫苗。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述融合基因sTP是通过插入植物表达载体而得到的重组表达载体导入玉米中的。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体以胚乳特异性Zein启动子驱动目的基因sTP的表达，优选地，以编码除草剂草甘膦抗性的CP4型EPSP基因作为选择标记。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述融合基因sTP通过重组表达载体pBAC9090导入玉米中，所述重组表达载体pBAC9090如图2所示。