CN102643848A - 一种人工合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用。本发明所提供的表达载体为表达人工合成的耐草甘膦基因的表达载体；所述人工合成的耐草甘膦基因为下述a)或b)的DNA分子：a)核苷酸序列为序列表中序列2；b)核苷酸序列与序列表中序列2至少具有98％的同一性，且编码序列10所示蛋白质。与转入含有原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的表达载体的转基因玉米相比，转入本发明所提供的表达载体的转基因玉米，其G2-aroA蛋白的表达量明显提高；同时对草甘膦的耐受性也明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用，特别涉及一种根据玉米偏好密码子设计并合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用。
背景技术
目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如1)AT含量较高，超过60％，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’-UTR序列和3’末端的polyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001％或者几乎检测不到。美国Monsanto公司的Perlak(PerlakF J，Fuchs R L，Dean D A，et al.Modification of the coding SEQ ID NO.uence enhancesplant expressing of insect control protein genes.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：3324-3328)和Iannacone等(Iannacoe R，Grieco P D，Cellini F.Specific SEQ IDNO.uence modification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance.Plant Mol Biol，1997，34：485-496)在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，分别对杀虫蛋白基因和cryIII基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不稳定元件序列，使转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍，高达可溶性蛋白的0.02～1％，获得了明显的抗虫效果。
杂草是农作物生产的大害，自1942年出现近代杂草防治技术以来，化学除草剂有了很大的发展。草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。
但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入玉米，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护玉米免受药害，最终达到增产增收的目的。尽管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被发现，并在宿主荧光假单胞菌G2及大肠杆菌中都能高效表达，表现高耐草甘膦的特性(Yichen Sun，Min Lin and Yiping Wang.Novel AroA with high tolerance to Glyposate，encoded by a gene of Pseudomonas putida 4G-1 isolated from an extremelypollutedenvironment in China.Aplied and environmental microbiology.2005，71(8)：4771-4776)，但其在植物，特别是重要的粮食作物中由于表达量较低而没有被利用，因此急需对其在植物中的应用进行研究，如进行密码子优化，以加速其应用到农业生产中。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达载体。
本发明所提供的表达载体为表达人工合成的耐草甘膦基因的表达载体；所述人工合成的耐草甘膦基因(命名为mG2-aroA)为下述a)或b)的DNA分子：
a)核苷酸序列为序列表中序列2；
b)核苷酸序列与序列表中序列2至少具有98％的同一性，且编码序列9所示的蛋白质(命名为G2-aroA蛋白)。
可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子等。
在本发明的一个实施例中，所述表达载体中启动所述人工合成的耐草甘膦基因的启动子具体为Ubi启动子，其核苷酸序列为序列表中序列5，或与序列5至少具有80％的同一性，且具有启动子功能。
可用于本发明的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
在本发明的一个实施例中，所述表达载体中终止所述人工合成的耐草甘膦基因转录的转录终止序列具体如序列表中序列8的第216-491位所示，或与序列8的第216-491位至少具有80％的同一性，且具有转录终止功能。
在本发明的一个实施例中，所述表达载体中还包括OMK序列；所述OMK序列由Ω序列和Kozak序列顺次连接组成，其序列具体如序列表中序列6所示，或与序列6至少具有80％的同一性，且具有增强子功能。
在本发明的一个实施例中，所述表达载体中还包括叶绿体导肽(CTP)序列；所述叶绿体导肽(CTP)序列如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80％的同一性，且具有信号肽功能。
在本发明的一个实施例中，所述表达载体(命名为pS3300-UMG2)的序列为序列表中序列10。
其中，序列2由1338个核苷酸组成，其末尾处为两个终止密码子。序列2的第1-1335位为编码序列，编码序列表中序列9所示的G2-aroA蛋白。序列5由2010个和核苷酸组成。序列6由67个核苷酸组成。序列7由141个核苷酸组成。序列8由491个核苷酸组成。序列9由444个氨基酸组成。序列10由10488个核苷酸组成，其中第151-2165位为Ubi启动子序列，第2177-2243位为OMK序列，第2244-2384位为CTP序列，第2385-3722位为mG2-aroA序列，第3723-4213位为转录终止序列。
含有所述表达载体的重组细胞系、转基因植物或转基因微生物也属于本发明的保护范围。
所述重组细胞系可以为真核细胞，也可以为原核细胞，如植物细胞系。在本发明的一个实施例中，所述转基因植物(如玉米)包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。所述转基因微生物为转入所述重组DNA片段的农杆菌LBA4404。
所述表达载体在培育耐草甘膦转基因玉米中的应用也属于本发明的保护范围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明针对原核生物耐草甘膦基因G2-aroA在植物中表达较低的问题，在保持原氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好性密码子对其进行优化，去除影响RNA稳定性的结构(如polyA、重复序列、AT和GC串联重复、RNA二级结构、核糖体结合位点等)，增加GC含量。同时在其5’端添加Ω序列和Kozak序列(Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白质基因编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白质的序列)。启动子选用组成性启动子Ubi启动子。再则，在编码序列的3’端设计了2个连续的终止密码子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS稳定终止序列。其中，PolyA具有维持mRNA稳定等作用，T-NOS终止序列确保了翻译的准确终止。另外，根据植物耐草甘膦的特殊机制，在5’起始密码子ATG前加入叶绿体导肽CTP，使目的基因表达的蛋白(即G2-aroA蛋白)转运到叶绿体中，以更好的发挥mG2-aroA基因的抗性效果。通过上述设计，使G2-aroA蛋白在玉米中高效稳定表达。
实验证实，与转入原始G2-aroA基因的表达载体的玉米植株相比，转入本发明所提供的含有mG2-aroA的表达载体(序列10)的阳性玉米植株，其G2-aroA蛋白的表达量明显提高，每克叶片G2-aroA蛋白的表达量中可达15.057μg，远高于原始G2-aroA基因转基因玉米的3.735μg。同时，与转入原始G2-aroA基因的表达载体的玉米植株相比，转入本发明所提供的含有mG2-aroA的表达载体(序列10)的T6代植株，在玉米5叶期喷施800ml/亩农达后，无明显的药害，表现正常，后期的生长期内均无药害反应；而转入含有G2-aroA基因的表达载体的T6代植株，在800ml/亩农达处理后，药害非常严重，植株均表现黄化、畸形，后期植株生长期内大部分表现雄穗不分化、雌穗不吐丝或者植株矮小。
附图说明
图1为载体pUC19-UG2的质粒图谱。
图2为载体pCAMBIA3300的质粒图谱。
图3为载体pS3300的质粒图谱。
图4为重组表达载体pS3300-UG2的质粒图谱。
图5为重组表达载体pS3300-UMG2的质粒图谱。
图6为重组载体pS3300-UG0的质粒图谱
图7为T6代G2-aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道1为阳性对照；泳道2为DNA Marker(D2000)；泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2)；泳道5-15为11株转入G2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。
图8为T6代mG2-aroA转基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道1为阳性对照；泳道2为DNA Marker(D2000)；泳道3为空白对照组；泳道4为未转基因的玉米植株(阴性对照2)；泳道5-24为20株转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米植株。
图9为T6代G2-aroA转基因玉米植株和T6代mG2-aroA转基因玉米植株的草甘膦耐性田间鉴定图。其中，A为mG2-aroA转基因玉米植株、空载体转基因植株和未转基因植株；B为mG2-aroA转基因玉米植株和G2-aroA转基因玉米植株。A和B中，1所示一行玉米为mG2-aroA转基因玉米植株；2所示一行玉米为G2-aroA转基因玉米植株；3所示一行玉米为空载体转基因玉米植株；4所示一行玉米为未转基因的玉米植株。
图10为双抗夹心ELISA检测G2-aroA蛋白浓度的标准曲线。
图11为纯化后G2-aroA蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。其中，泳道1为蛋白Marker，自上到下依次为72KD、45KD、32KD、14.4KD；泳道2-4均为原核重组表达载体pET-28a-G2-aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白，上样量分别为5μl、10μl、15μl。
图12为SDS-PAGE检测纯化后单克隆抗体的纯度。其中，泳道1为蛋白Marker；泳道2为纯化后的单克隆抗体，较大的目的条带为重链，较小的目的条带为轻链。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、密码子优化型耐草甘膦基因的获得
本实施例根据G2-aroA基因(中国专利，申请号03826892.2，授权公告号CN100429311C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列1所示)，在保证氨基酸序列不变的前提下，首先采用玉米偏好密码子对G2-aroA基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有密码子，并调整了密码子的使用频率(表1)，使G2-aroA蛋白的密码子使用频率与玉米中的使用频率接近(表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为序列表中序列2。序列2与G2-aroA基因(序列1)同源性只有84％，而G+C含量由原来的64.83％降低到62.07％。序列2所示基因即为密码子优化型耐草甘膦基因，将其命名为mG2-aroA。密码子在玉米、G2-aroA基因和mG2-aroA基因中的使用频率见表1。为方便克隆，发明人在序列2的5’端引入BamHI酶切位点，在3’端引入KpnI酶切酶切位点，最终序列如序列表中序列3所示。序列3的第7-1344位即为序列2。序列1、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均编码序列，均编码序列表中序列9所示蛋白，将该蛋白命名为G2-aroA蛋白。
表1玉米优选密码子标准
实施例2、mG2-aroA转基因玉米的获得
一、重组表达载体的构建
为了提高mG2-aroA基因(序列2)在受体生物中的表达水平，发明人在构建mG2-aroA基因的重组表达载体时，在mG2-aroA基因的5’端添加了Ω序列和Kozak序列，Ω/Kozak序列(简称OMK)如序列表中序列6所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白基因编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，5’端有一个UAUUUUUACAACAA序列以及4个UUAC序列，这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白的序列。启动子选用组成性启动子Ubi启动子，其序列如序列表中序列5所示。再则，在编码序列3’端设计了2个连续的终止密码子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS稳定终止序列。PolyA+T-NOS序列如序列表中序列8所示。其中，PolyA具有维持mRNA稳定等作用，T-NOS终止序列确保了翻译的准确终止。另外，根据植物耐草甘膦的特殊机制，在5’起始密码子ATG前加入叶绿体导肽CTP，使目的基因表达的蛋白(即G2-aroA蛋白)转运到叶绿体中，以更好的发挥mG2-aroA基因的抗性效果。CTP的序列如序列表中序列7所示。
携带有mG2-aroA基因的重组表达载体pS3300-UMG2构建具体程序如下：
1、中间载体pUC19-UG2的构建
a.人工合成Ubi启动子(序列5)，并在两端添加Pst I酶切位点；Pst I酶切pUC19质粒(购自北京天恩泽基因科技有限公司，产品编号90202)，去磷酸化后，与Ubi启动子片段连接，得到pUC19-Ubi。
b.人工合成G2-aroA基因(序列1)，并在两端添加BamHI和Kpn I酶切位点；连入经BamHI和Kpn I酶切的上述步骤1a所得的pUC19-Ubi，得到pUC19-Ubi-G2。
c.人工合成PolyA+T-NOS终止序列(序列8，其中第216-491位为T-NOS终止序列)，并在两端添加Kpn I和EcoR I酶切位点；连入经Kpn I和EcoR I酶切的上述步骤1b所得的pUC19-Ubi-G2，得到pUC19-Ubi-G2-polyA-T-NOS。
d.人工合成OMK序列(序列6)和CTP序列(序列7)，并在两端添加BamH I位点；BamH I酶切上述步骤1c所得的pUC19-Ubi-G2-polyA-T-NOS，去磷酸化后连接OMK-CTP(序列6和序列7之间直接连接)，得到pUC19-UG2(质粒图谱见图1)。
2、改造pCAMBIA3300载体获得pS3300载体
a.表达载体pCAMBIA3300(质粒图谱见图2)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(CA：MCV038)，用限制性内切酶SphI、Sac II双酶切，回收纯化大片段。
b.人工合成序列表中序列4所示基因片段(自5’端由T-Border的右边界序列，连接序列和T-Border的左边界序列组成，所述连接序列中自5’端含有Hind III和EcoRI酶切位点的识别序列)，用限制性内切酶SphI、Sac II酶切后，与步骤a回收的大片段连接，得到pS3300载体(质粒图谱见图3)。
3、携带mG2-aroA基因的重组表达载体pS3300-UMG2的构建
a.将步骤2b所得pS3300载体用HindIII和EcoR I双酶切，回收纯化。
b.将表达载体pUC19-UG2(质粒图谱见图1)用Hind和EcoR I双酶切后回收小片段(Ubi-OMK-CTP-G2-polyA-T-NOS)，与步骤3a所得回收产物连接，得到携带有G2-aroA基因的重组表达载体pS3300-UG2(质粒图谱见图4)。
c.用BamH I与Kpn I双酶切上述步骤b所得的pS3300-UG2载体，分别回收片段pS3300-Ubi-polyA-T-NOS及OMK+CTP。
d.将新合成的两端分别带有带有BamH I与Kpn I酶切位点的mG2-aroA基因(序列3)经BamH I与Kpn I酶切后，与上述步骤c得到的大片段pS3300-Ubi-polyA-T-NOS相连，得到重组载体pS3300-Ubi-mG2-polyA-T-NOS。
e.用BamH I酶切上述步骤d得到的重组载体pS3300-Ubi-mG2-polyA-T-NOS，之后进行去磷酸化处理，再与上述步骤d回收的OMK+CTP序列连接，得到携带mG2-aroA基因完整阅读框的重组表达载体pS3300-UMG2(质粒图谱见图5)。所述重组表达载体pS3300-UMG2的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
4、原始基因G2-aroA(序列1)重组表达载体pS3300-UG2的构建：见3a、3b。
5、pS3300-UG0空载体(对照)的构建
a.以上述步骤3e所得的pS3300-UMG2载体为模板，利用如下引物重新扩增OMK+CTP：
OMK+CTP_F：5′-GGATCCTATTTTTACAACAATTA-3′(下划线部分为BamHI酶切位点识别序列)；
OMK+CTP_R：5′-GGTACCTTCCGCCGTTGCTGAC-3′(下划线部分为Kpn I酶切位点识别序列)。
b.扩增产物经BamH I和Kpn I双酶切后与步骤3c所得pS3300-Ubi-polyA-T-NOS大片段连接，得到空载体pS3300-UG0(质粒图谱见图6)。
二、重组表达载体转化玉米获得转基因玉米
1、玉米转化起始材料的获得
玉米品种综31(优良玉米自交系展示综3和综31.玉米科学，2009(5))授粉后9～13天的幼穗，剥去苞叶，进行表面消毒。从消毒后的幼穗中剥取幼胚，将其放入感染培养液(配方参考：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1))中清洗一到两次，备用。
2、重组表达载体转化农杆菌
将步骤一制备的重组表达载体pS3300-UMG2或pS3300-UG2转化农杆菌LBA4404(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)。同时设置转入pS3300-UG0空载体的对照。
将经过鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UMG2；转入了重组表达载体pS3300-UG2的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UG2；转入了pS3300-UG0空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pS3300-UG0。
3、农杆菌转化玉米幼胚
将上述步骤1经感染培养液清洗过的幼胚放入OD600为0.3-0.5左右的上述步骤2制备的三种农杆菌的菌液中，放置5分钟，然后将幼胚置于共培养培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)上，在20℃左右黑暗条件下共培养3天，以未进行农杆菌转化的幼胚作对照。
4、转基因玉米再生苗的获得
将上述步骤3共培养后的幼胚转入选择培养基(参考文献：Methods in MolecularBiology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)，在选择培养基中加入终浓度为1mM的草甘膦作为选择压力，对被转化的材料进行筛选培养，每两周继代一次，直至生长出松脆，颜色鲜黄且生长旺盛的抗性愈伤组织。
将所得抗性愈伤转入诱导培养基(参考文献：Methods in Molecular Biology，vol.343：Agrobacterium Protocols，2/e，volume 1)进行诱导分化，一个月后即可获得成熟的胚状体。再将胚状体放到MS培养基上生根，即得到T0代转基因玉米的再生苗。T0代转基因玉米成熟后获得T1代转基因玉米的种子，T1代转基因玉米的种子继续自交繁殖得到T2代转基因玉米的种子。依此类推，获得T6代转基因玉米的种子。将T6代转基因玉米的种子播种后获得T6代转基因玉米植株。
5、T6代转基因玉米植株的鉴定
对T6代转基因玉米植株进行PCR鉴定，具体如下：
首先，分别提取T6代转基因玉米植株(转入mG2-aroA基因的植株、转入G2-aroA基因的植株，以及转入pS3300-UG0空载体的植株)的基因组DNA，具体操作如下：
1)选取转基因玉米再生植株幼嫩叶片0.1-0.2g，在液氮研磨，转移至1.5ml的Eppendorf管中；
2)加入0.7ml的CTAB溶液(Tris终浓度100mM，NaCl终浓度1.4M，EDTA终浓度20mM，CTAB终浓度2％(w/v)，巯基乙醇终浓度0.1％(v/v))，60℃，45分钟，每隔10分钟，颠倒混匀一次。
3)加入0.7ml的酚∶氯仿(体积比为1∶1)，颠倒几次，1000rpm离心5分钟，转移上清至新离心管。加入等体积的氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，混匀，1000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管。
4)在离心管加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，1000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗一次，抽干，溶于50μL的无菌水中，用于PCR检测。
其次，以上述提取的T6代转基因玉米植株(转入mG2-aroA基因的植株、转入G2-aroA基因的植株，以及转入pS3300-UG0空载体的植株)的基因组DNA为模板，进行PCR鉴定。具体操作如下：
1)对11株转入G2-aroA基因的T6代转基因玉米植株进行原始基因(G2-aroA)的检测，同时以转入pS3300-UG0空载体的T6代转基因玉米植株作为阴性对照1，以未转基因的玉米的阴性对照2，以未加入模板的反应体系为空白对照。PCR扩增引物如下：
正向引物：CGGCTCCAAATCCATTACCAA(序列1的第147-167位)
反向引物：GCCACTTCAATCGGCGCTTC(序列1的第631-650位的反向互补序列)
反应体系(20μL)：DNA 1μL(20-50ng)；10×缓冲液2μL；MgCl2(2.5mM)2μL；dNTP(2.5mM)2μL；Taq酶0.2μL；引物10μM；加无菌水至20μL。反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1分钟，35个循环；72℃延伸5分钟。扩增产物长度610bp。
检测结果如图7所示，泳道5-15所示的11株转入G2-aroA基因的T6代转基因玉米植株均扩增得到大小为610bp的目的条带；而阴性对照组(阴性对照1和阴性对照2)和空白对照组均没有扩增出目的条带。这一结果说明G2-aroA基因已经整合进T6代G2-aroA转基因玉米的基因组中。
2)对20株转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米植株进行优化后基因(mG2-aroA)的检测，同时以转入pS3300-UG0空载体的T6代转基因玉米植株作为阴性对照1，以未转基因的玉米植株作为阴性对照2，以未加入模板的反应体系作为空白对照。
正向引物：CCACCTGGCTCCAAGTCTATCA(序列2的第142-163位)
反向引物：GCGTCAACCTGTGCTCCAAA(序列2的第715-743位的反向互补序列)
反应体系同上。反应条件94℃5分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃45秒，35个循环；72℃延伸5分钟。扩增产物长度593bp。
检测结果如图8所示，泳道5-24所示的20株转入mG2-aroA基因的T6代转基因玉米植株均扩增得到大小为593bp的目的条带；而阴性对照组(阴性对照1和阴性对照2)和空白对照组均没有扩增出目的条带。这一结果说明mG2-aroA基因已经整合进T6代mG2-aroA转基因玉米的基因组中。
实施例3、转基因玉米植株G2-aroA蛋白表达的双抗夹心ELISA检测
样品提取液：Tris-Cl(pH8.0)25mM，KCl 10mM，MgCl2·6H2O 20mM，DTT 1mM，PMSF 1mM(用前加)。
包被缓冲液：取1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，用蒸馏水定容至1000mL，pH9.6。
洗涤液(PBST)：取1mL吐温20，加磷酸盐缓冲液(PBS)定容至1000mL，pH7.5；磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，加1000mL蒸馏水，pH7.5。
样品缓冲液(PBST)：取1mL吐温20，加磷酸盐缓冲液(PBS)定容至1000mL，pH7.5；磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.0g NaCl，0.2g KH2PO4，2.96g Na2HPO4·12H2O，加1000mL蒸馏水，pH7.5。
底物缓冲液：取0.1g MgCl2或0.2g MgCl2·6H2O，97.0mL二乙醇胺，溶于1000mL蒸馏水中，pH9.8，4℃保存。
终止缓冲液：3mol/L NaOH，pH12.0。
封闭液：取3g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL包被缓冲液，包被缓冲液(碳酸盐包被缓冲液)：取1.5g Na2CO3，2.93g NaHCO3，用蒸馏水定容至1000mL，pH9.6。
1、样品处理
选取相同生长阶段(五叶期)的T6代转基因玉米植株(包括转入mG2-aroA基因的植株和转入G2-aroA基因的植株)，各取功能叶(上三叶)叶片1g(鲜重)左右，液氮磨碎后，转入10ml离心管中加入3ml样品提取液，剧烈震动，4℃离心1h，取上清为待测样品，备用。根据转入基因的不同，待测样品共有两种，即来自mG2-aroA转基因植株的待测样品(待测样品-mG2-aroA)和来自G2-aroA转基因植株的待测样品(待测样品-G2-aroA)。同时设置转入pS3300-UG0空载体的T6代玉米植株和未转基因的玉米植株作为对照。
上述鲜重为将叶片用液氮研磨成粉末样品后加入装有提取液的离心管所称重量减去装有提取液的离心管加入粉末样品前的重量。
2、样品测定
具体操作步骤如下：
(1)包被：将浓度为1.5mg/ml的抗G2-aroA蛋白的一抗(兔抗)(制备方法见文章末尾处)用包被缓冲液进行稀释，按照抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体与包被缓冲液的体积比为1∶1000的比例稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，4℃湿盒内包被过夜。
(2)洗板：将包被液去除，然后放到洗板机中用洗涤液洗板5遍。
(3)封闭：每孔加入120μL封闭液，湿盒内37℃孵育1h，然后甩掉封闭液。
(4)反应：一方面，将G2-aroA蛋白标准品(制备方法见文章末尾处)用样品稀释液稀释到浓度为10μg/mL，然后2倍比稀释11个梯度(包括0孔)，重复3次，每孔100μL。其中0孔(不添加标准品溶液而加入100μL样品稀释液)作为对照孔，其余10个梯度孔作为试验孔。置37℃下，温育1h。用于绘制标准曲线。
另一方面，将步骤1制备的待测样品用样品缓冲液按照1∶5的比例稀释后每孔加入100μL，置37℃下，温育1h。用于检测。
(5)洗板：同步骤(2)。
(6)加酶标抗体：按1∶1000用样品稀释液稀释抗G2-aroA蛋白的酶标抗体(鼠单抗)(制备方法见文章末尾处)，混匀后每孔加100μL。置37℃下，温育1h。
(7)洗板：同步骤(2)。
(8)加底物显色：称取30mg硝基酚磷酸二钠(PNPP)加入到30ml底物缓冲液中(配制完后，10分钟内使用)，每孔100μL，20min后加入50μL终止缓冲液终止反应。
(9)测量：在405nm下测定OD值。
(10)绘制标准曲线：以不同浓度的G2-aroA蛋白标准品溶液浓度(ng/mL)作为X轴，以步骤(9)测量所得的G2-aroA蛋白标准品的OD值的作为Y轴，用EXCEL绘制标准曲线。
(11)将步骤(9)测量所得的待测样品的OD值代入上述步骤(10)绘制的标准曲线方程，计算待测样品中G2-aroA蛋白含量。
G2-aroA蛋白占鲜重的含量＝待测样品中G2-aroA蛋白含量×待测样品的体积/样品鲜重，单位：μg/g
实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，得到的标准曲线(图10)，其标准曲线方程为y＝9035.2x+198.75(R2＝0.9997)。
待测样品的检测结果如表2所示，T6代mG2-aroA转基因玉米和T6代G2-aroA转基因玉米中G2-aroA蛋白的表达量均明显高于转入空载体的转基因玉米(平均值0.674μg/g)。而且，优化后的G2-aroA基因(mG2-aroA)在T6代转基因玉米中表达G2-aroA蛋白量(平均值15.057μg/g)要远高于原始G2-aroA基因(G2-aroA)在T6代转基因玉米中表达G2-aroA蛋白量(平均值3.735μg/g)。未转基因的玉米植株中G2-aroA蛋白的表达量和转入pS3300-UG0空载体的T6代玉米植株基本一致，无显著差异。这一结果表明，经过密码子优化后，G2-aroA蛋白在转基因玉米中的表达量得到了明显的提高。
表2转基因植株G2-aroA蛋白表达的ELASA检测结果
| 待测样品 | G2-aroA蛋 | 待测样品 | G2-aroA蛋白 | 空载体对 | G2-aroA蛋 |
| -mG2-aroA | 白浓度(μg/g) | -G2-aroA | 浓度(μg/g) | 照 | 白浓度(μg/g) |
| 1 | 4.339 | 1 | 15.096 | 1 | 0.893 |
| 2 | 3.304 | 2 | 10.671 | 2 | 0.586 |
| 3 | 2.977 | 3 | 20.227 | 3 | 0.722 |
| 4 | 4.321 | 4 | 14.237 | 4 | 0.497 |
| 平均值 | 3.735 | 平均值 | 15.057 | 平均值 | 0.674 |
注：编号1、2、3、4分别表示来自同一种待测样品的四个不同植株；G2-aroA蛋白浓度单位μg/g表示每克叶片(鲜重)所测G2-aroA蛋白的微克数。
实施例4、转基因玉米植株田间除草剂耐性检测
1、试验材料：T6代转基因玉米植株，包括转入mG2-aroA基因的植株、转入G2-aroA基因的植株，以及转入pS3300-UG0空载体的植株。同时设置未转基因的玉米植株对照。
2、试验设计：5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35em
3、试验处理：按照800ml/亩的用量喷施农达(Roundup，含41％的草甘膦，田间推荐使用剂量为150-250ml/亩)。
4、试验处理时期：5-6叶期。7天后开始观察实验结果。
5、试验结果
如图9(喷施农达15天后)所示：(1)转入G2-aroA基因的植株，在800ml/亩农达处理后，药害非常严重，植株均表现黄化、畸形，后期植株生长期内大部分表现雄穗不分化、雌穗不吐丝或者植株矮小；(2)转入mG2-aroA基因的植株，在800ml/亩农达处理后，无明显的药害，表现正常，后期的生长期内均无药害反应；(3)转入pS3300-UG0空载体的植株以及未转基因的玉米植株药害非常严重，所有植株均已全部死亡。这一结果表明，转入密码子优化后的mG2-aroA基因的玉米，其对草甘膦的耐受性得到了明显的提高。
(一)实施例3中的抗G2-aroA蛋白的一抗(兔抗)的制备方法如下：
以纯化后的G2-aroA蛋白(制备方法见下述步骤(二))为免疫原免疫体重约2kg的新西兰大耳白兔，经过血清提取及抗体纯化步骤得到抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体，具体步骤如下：利用与实施例1步骤一相同的方法制备免疫原；用得到的免疫原对体重约2kg的新西兰大耳白兔进行免疫；之后分离血清制备抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体。所述抗G2-aroA蛋白的多克隆抗体可用于双抗夹心法检测G2-aroA蛋白时作为包被抗体使用。
(二)实施例3中G2-aroA蛋白标准品的制备方法如下：
将序列1所示的DNA片段连接到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，得到表达G2-aroA蛋白的原核表达载体pET-28a-G2-aroA。将pET-28a-G2-aroA转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导其表达G2-aroA蛋白，收集菌体后，将菌体通过超声波破碎，将所表达蛋白释放到提取液中，后用His标签蛋白纯化试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司，目录号CW0009A)纯化，G2-aroA蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测。
SDS-PAGE电泳鉴定结果如图11所示。经page胶鉴定，纯度能够达到95％，经eppendorf蛋白核酸测定仪biophotometer plus测定浓度为1.3mg/ml，将纯化后的G2-aroA蛋白作为免疫原S780。
G2-aroA蛋白的浓度达到1.3mg/ml。纯化后的G2-aroA蛋白即为免疫原S780。
G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
(三)实施例3中抗G2-aroA蛋白的酶标抗体(鼠单抗)的制备方法如下：
Balb/C小鼠：北京维通利华实验动物有限公司
Sp2/0：北京康为世纪生物科技有限公司
1、免疫原S780的制备
具体方法和步骤同(二)实施例3中G2-aroA蛋白标准品的制备方法。纯化后的G2-aroA蛋白即为免疫原S780。G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
2、动物免疫
以5只6周龄的雌性Balb/C小鼠为试验动物，按照如下免疫程序及流程进行免疫：
a、免疫前：采用断尾采血法采集血清，用作阴性对照。
b、初次免疫：将浓度为0.64μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80μg的G2-aroA蛋白(250μl乳化好的免疫原)。
c、第一次加强免疫：初次免疫21天后，将浓度为0.32μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射40μg的G2-aroA蛋白(250μl乳化好的免疫原)。
d、第二次加强免疫：第一次加强免疫14天后，进行第二次加强免疫。具体方法同步骤c的第一次加强免疫。
e、终加强免疫：第二次加强免疫14天后，将浓度为0.8μg/μl的G2-aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后，得到免疫原。用所得免疫原脾内注射加强免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80μg的G2-aroA蛋白(100μl的免疫原)。
3、细胞融合和克隆化
在第二次加强免疫14天后，断尾采血法采集血清，并用间接ELISA法(以S780为包被抗原)测定血清效价。在上述步骤一终加强免疫后第3天，选择上述间接ELISA法测定血清效价最佳的小鼠(效价为1∶720000)取脾细胞，再将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按9∶1(数量配比)的比例，用PEG(PEG4000)常规融合方法进行细胞融合。
融合后的第3天和第6天进行换液处理，第7天采用间接ELISA法(以S780为包被抗原)对融合细胞上清进行筛选，选取阳性细胞孔，将孔内细胞分别转入24孔培养板扩增培养。待细胞长至显微镜视野1/3时，收集细胞上清液，采用间接ELISA法(分别以S780、K8(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)作为包被抗原)进行复筛，从中选择与S780及阳性反应均较强，同时与K8和阴性均未反应的细胞(表3中的粗体的5F11)，应用有限稀释法进行亚克隆。经过3次亚克隆最终获得稳定分泌抗G2-aroA蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，命名为AntiG2-5F11。该杂交瘤细胞株已于2012年2月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.5772。
上述作为包被抗原的K8(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(我公司耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)具体按照如下方法制备得到：取0.3g样品材料(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810，或实施例2所获得的T6代mG2-aroA转基因玉米，或未转基因的玉米品种综31)，液氮磨碎后，转入2ml离心管中加入1ml样品提取液，剧烈震动，4℃提取1h，12000转/分离心10分钟后取上清进行样品测定。其中，样品提取液配方为：Tris-Cl(pH8.0)25mm；KCl 10mm；MgCl2·6H2O 20mm；DTT 1mm；PMSF 1mm(用前加)。
上述间接ELISA法的步骤具体如下：
1)包被：在96孔酶标板中加入100μL的2μg/mL的抗原溶液，同时设置不包被抗原的对照，4℃包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。
上述抗原溶液可为S780、K8、阳性和阴性溶液。
2)封闭：加入150μL/孔的封闭液(3％牛血清蛋白)，在37℃孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4℃冰箱保存备用。
3)加待测样品：
a.对于血清效价检测，第一个孔1∶1000稀释，往下以1∶3的梯度倍比稀释，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
b.对于细胞上清检测，吸取细胞上清100μl，加入对应的酶标板中，37℃孵育30min，洗板4次，拍干。
同时设置未经免疫的小鼠血清/抗体/腹水/细胞上清的对照；以PBS代替待检测样品的对照(阴性对照孔)。
4)加酶标二抗：取山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP，按1∶5000倍稀释后，100μl/孔，37℃孵育20至30min，洗涤4次，拍干。
5)显色：将20×TMB稀释至1×TMB，按100μl/孔加入，37℃显色15-30min。
6)终止：加入终止液(2M H2SO4)50μl/孔。
7)读数：以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔(以PBS代替待测样品的对照)OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。
ELISA结果判定方法：(1)筛选阳性细胞时，若P/N＞2.1，则判别为阳性细胞；若1＜P/N＜2.1，则加大包被浓度后再次检测，P/N＞2.1的仍判为阳性。(2)测定效价时，以P/N＞2.1的血清(或是腹水或是抗体)最大稀释倍数表示。
表3采用间接ELISA法对融合细胞上清进行复筛的结果
| 包被抗原 | 1C2 | 1C11 | 1E6 | 2C1 | 2F7 | 3D12 | 3F9 | 4B11 | 5B2 | 5F11 | PBS | 阳性 |
| S780 | 2.398 | 2.463 | 2.655 | 2.232 | 2.067 | 2.332 | 3.431 | 3.400 | 3.474 | 3.452 | 3.489 | 3.470 |
| K8 | 0.048 | 0.057 | 0.044 | 0.049 | 0.041 | 0.053 | 0.048 | 0.045 | 0.050 | 0.046 | 0.053 | 0.104 |
| 阳性 | 0.297 | 0.162 | 0.398 | 0.289 | 1.424 | 0.245 | 1.762 | 0.920 | 0.393 | 2.427 | 0.068 | 1.291 |
| 阴性 | 0.050 | 0.046 | 0.041 | 0.045 | 0.043 | 0.045 | 0.067 | 0.043 | 0.045 | 0.044 | 0.057 | 0.052 |
注：1C2-5F11分别代表细胞融合后第7天采用间接ELISA法(以S780为包被抗原)所筛选的阳性细胞。吸光值越大，说明抗体对抗原的亲和力越高。
4、单克隆抗体的制备与纯化
A、增量培养法
将杂交瘤细胞株AntiG2-5F11CGMCC No.5772置于RPMI 1640培养基中，37℃培养3天，收集细胞上清。采用protein G亲和柱(Pharmacia)进行纯化。具体操作如下：
(1)平衡：用结合缓冲液平衡protein G亲和柱至基线平稳。
(2)上样：将收集的细胞上清上柱，收集流穿液；将流穿液再次上柱，继续平衡至基线平稳。
(3)洗脱：加入洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰。
(4)用0.01M的PBS(pH7.2)透析收集的洗脱峰，使纯化后的抗体保存在0.01M的PBS(pH7.2)中。
(5)用蛋白定量检测仪(Amersham Biosciences)测定纯化后单克隆抗体的浓度。
(6)SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度，抗体上样量：8μg。
B、腹水制备
取2只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蜡油，7天后取杂交瘤细胞株AntiG2-5F11CGMCC No.5772重悬于无血清培养基中，按1×106个细胞/0.5ml/只量注射石蜡小鼠，注射细胞14天后收集腹水。采用间接ELISA法(包被抗原为S780)进行腹水效价检测，具体操作及结果判定方法同步骤3所述(其中的步骤3)按照a进行)，结果表明其效价为1∶81000。采用protein G亲和柱(Phamacia)对腹水进行纯化。具体操作同步骤1所述。
5、单克隆抗体的鉴定
(1)单克隆抗体亚型的鉴定
利用Southern Biotech公司生产的亚型检测试剂盒套装(包括Goat anti MouseIgG1-HRP(1070-50)、Goat anti Mouse IgG2a-HRP(1080-05)、Goat anti MouseIgG2b-HRP(1090-05)、Goat anti Mouse IgG3-HRP(1100-05)、Goat anti Mouse IgA-HRP(1040-05)、Goat anti Mouse IgM-HRP(1020-05)、Goat anti Mouse kappa-HRP(1050-05)和Goat anti Mouse Lambda-HRP(1060-05)共8种组分)对上述步骤4制备的单克隆抗体进行抗体亚型的检测，包被抗原为S780，浓度为2μg/ml，包被量为100μl，检测波长为450nm。具体操作过程按照试剂盒说明书进行。检测结果如表4所示，单克隆抗体的重链恒定区为IgG1型，Lamda型。
表4单克隆抗体亚型的鉴定
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgM | IgA | Kappa | Lamda | |
| 单抗 | 2.252 | 0.051 | 0.048 | 0.058 | 0.055 | 0.056 | 0.065 | 0.461 |
(2)单克隆抗体效价的检测
采用间接ELISA法(包被抗原为S780、K8、阳性和阴性，具体同步骤3)对步骤4所得纯化后单克隆抗体进行效价检测，以PBS溶液替代待测样品作为阴性对照。具体操作及结果判定方法同步骤3所述(其中的步骤3)按照a进行)。
检测结果如表5所示，以阳性作为包被抗原，腹水纯化的单克隆抗体的效价为1∶81000(0.292/0.083＝3.518＞2.1)。
表5单克隆抗体效价检测结果
6、单克隆抗体的SDS-PAGE胶鉴定其纯度
通过SDS-PAGE凝胶对步骤4所得纯化后单克隆抗体进行纯度检测，结果如图12所示，凝胶上显示两个目的条带，上面较大的一条为重链，下面较小的一条为轻链，目的条带清晰，无杂带，可见，经过步骤4的纯化后单克隆抗体已经达到一定纯度。
Claims (10)
1.表达载体，其特征在于：所述表达载体为表达人工合成的耐草甘膦基因的表达载体；所述人工合成的耐草甘膦基因为下述a)或b)的DNA分子：
a)核苷酸序列为序列表中序列2；
b)核苷酸序列与序列表中序列2至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体中启动所述人工合成的耐草甘膦基因的启动子为Ubi启动子。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述Ubi启动子的序列为序列表中序列5，或与序列5至少具有80％的同一性，且具有启动子功能。
4.根据权利要求1-3中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体中终止所述人工合成的耐草甘膦基因转录的转录终止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或与序列8的第216-491位至少具有80％的同一性，且具有转录终止功能。
5.根据权利要求1-4中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体中还包括OMK序列；所述OMK序列由Ω序列和Kozak序列顺次连接组成。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述OMK序列如序列表中序列6所示，或与序列6至少具有80％的同一性，且具有增强子功能。
7.根据权利要求1-6中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体中还包括叶绿体导肽序列；所述叶绿体导肽序列如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80％的同一性，且具有信号肽功能。
8.根据权利要求1-7中任一所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的序列为序列表中序列10。
9.含有权利要求1-8中任一所述表达载体的重组细胞系、转基因植物或转基因微生物。
10.权利要求1-8中任一所述的表达载体在培育耐草甘膦转基因玉米中的应用。
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