CN107099506A - 猪流行性腹泻病毒双抗体夹心elisa定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心elisa定量检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒及其应用，涉及生物检测领域。抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株PEDV，保藏编号为CCTCC NO:C201710。猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，包括预包被酶标板和酶标记抗体，预包被酶标板是采用所述抗PEDV N蛋白单克隆抗体包被的酶标板，酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的抗PEDV N蛋白多克隆抗体；抗PEDV N蛋白多克隆抗体通过用猪流行性腹泻病毒N蛋白免疫兔子，获取兔子血清后纯化获得。本发明试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，能够快速、简便、高效的定量检测猪流行性腹泻病毒，成本低、适合高通量检测。

Description

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diahorrea Virus，PEDV)是猪肠道传染病病原，能够引起猪呕吐、腹泻和脱水，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪中的感染率最高。该病多发生在冬春寒冷季节，以12月至次年2月为高发季节。
2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率达80％左右，死亡率高达50％～85％，造成重大的经济损失。
此前，对PEDV病原的检测多用常规的RT-PCR检测方法，操作繁杂、耗时长、成本较高、不能定量检测，只能定性判断，且不能高通量检测。另一种韩国的胶体金检测试纸条灵敏度较低、且不能定量、价格较贵，不适合高通量抗原检测。
发明内容
本发明提供一种猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，该试剂盒特异性好、灵敏度高、稳定性好，能够快速、简便、高效的定量检测猪流行性腹泻病毒，成本低、适合高通量检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供分泌抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株PEDV，保藏编号为CCTCC NO:C201710。
本发明还提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体及其在制备检测猪流行性腹泻病毒试剂盒方面的应用。
发明还提供猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板是采用所述抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体包被的酶标板，所述酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白多克隆抗体；所述抗猪流行性腹泻病毒N蛋白多克隆抗体通过用猪流行性腹泻病毒N蛋白免疫兔子，获取兔子血清后纯化获得。
在本发明中，所述猪流行性腹泻病毒N蛋白是通过诱导表达携带SEQ ID NO:1所示N蛋白编码基因的重组菌获得的。
在本发明中，抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的包被浓度为2μg/mL，酶标记抗体的浓度为2μg/mL.
在本发明中，所述试剂盒还包括标准品冻干粉、样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液。
所述标准品冻干粉为PEDV重组N蛋白；
所述样品稀释液为0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液；
所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％；
终止液：2M的硫酸水溶液；
显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液是含有H2O2的溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液是含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺的溶液。
本发明的有益效果:
(1)特异性强:本发明试剂盒与PEDV重组N蛋白和临床病料中的PEDV有较强的反应性，其他蛋白和其他病原无交叉反应。
(2)灵敏度高:本发明试剂盒最低可检测1ppb含量的PEDV N蛋白。
(3)定量分析：本发明试剂盒可以对样品中N蛋白含量进行定量。
(4)重复性：本发明试剂盒的批内和批间重复性较好。
(5)快速：本发明试剂盒操作简便、快速。
因此，本发明试剂盒为PEDV的高通量临床病原诊断、弱毒活疫苗的质量控制以及相关基础研究提供技术手段，对猪流行性腹泻病的防控具有重要意义。
附图说明
图1是显示重组N蛋白纯化结果的SDS-PAGE电泳图，其中泳道MK为marker，泳道LS是进样液，泳道FT是流穿液，泳道40/80/200/500分别为咪唑浓度为40、80、200和500mM的洗脱液。
图2本发明试剂盒的标准曲线，横坐标为重组N蛋白的浓度，纵坐标为OD值。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步描述本发明的技术方案。
实施例1、制备重组N蛋白
1.序列合成
将已经公开的PEDV的N基因序列按照大肠杆菌的密码子偏好情况进行优化，得到优化后的N基因序列，如SEQ ID NO:1所示。N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。将优化后的N基因送基因公司合成，然后将该片段克隆至原核表达载体pET-28a(+)的BamH I和XhoI酶切位点之间，得到pET-28a-PEDV阳性质粒。
2.重组N蛋白表达、纯化
(1)转化：pET-28a-PEDV阳性质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3)，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基(卡那霉素浓度100μg/mL)，在37℃培养12-16h。挑取单菌落于含有卡那霉素的LB液体培养基(卡那霉素浓度50μg/mL)中培养12-16h，通过测序鉴定，得到阳性重组菌pET-28a-PEDV/BL21，保存其甘油菌于-80℃。
(2)菌种活化：37℃过夜培养活化pET-28a-PEDV/BL21的甘油菌。
(3)诱导表达：按照接种量为0.5％将pET-28a-PEDV/BL21转接至300mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.4-0.6，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导表达3h。将发酵液在8000rpm、4℃条件下离心5min，收集诱导表达后菌体。
(4)菌体裂解：在诱导表达后菌体中加入100mL破碎液(PBS缓冲液)进行超声波裂解。超声波裂解条件：冰浴、功率60％、超声2s、间隔2s，裂解时间为15min。将菌体裂解液在12000rpm、4℃条件下离心15min，分别收集裂解液上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳检测，发现重组N蛋白主要以包涵体形式表达。
(5)包涵体纯化：增溶液：溶剂为pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度如下：50mM NaCl、20mM咪唑、8M尿素、0.2mM DTT和2％(质量百分浓度)Triton。采用增溶液悬浮诱导表达后pET-28a-PEDV/BL21的裂解液沉淀，在冰浴条件下放置2h，然后10000rpm、4℃离心15min，收集上清。利用组氨酸标签蛋白亲和纯化填料纯化重组蛋白，收集流穿液、洗脱液，采用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化效果。结果如图1所示，重组N蛋白约为55kD，主要被含200mM咪唑的流动相洗脱下来，纯度85％，蛋白浓度0.5mg/mL。收集含有重组N蛋白的洗脱液，透析去除咪唑，得到纯化后的重组N蛋白。300mL培养基发酵后，最终得到5mg重组N蛋白。
实施例2、鼠抗PEDV N蛋白单克隆抗体的制备
1、免疫原制备：将实施例1制备的重组N蛋白(0.5mg/mL)分别与等体积佐剂混合乳化均匀，成油包水状态，制成重组N蛋白疫苗，以备免疫小鼠。第一次免疫所用佐剂为弗氏完全佐剂和YOULONG佐剂，第二次及之后的免疫作用佐剂为弗氏不完全佐剂和YOULONG佐剂。
2、免疫策略：取4只Balb/c小鼠用重组N蛋白疫苗进行皮下免疫，每只小鼠皮下免疫3次，每次每只小鼠免疫0.1mg免疫原，每次免疫间隔4周，三免后一周断尾取血，分离血清，采用间接ELISA方法检测其抗体效价，具体方法如下：
1)用0.1mol/L、pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释重组N蛋白(实施例1制备)至1ug/ml，加入96孔酶标板，每孔100ul，37℃反应3h或者4℃静置过夜。
2)甩去板孔中液体，加入250ul洗涤液(溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％)，静置30s，甩去板中液体，重复3次。
3)加入检测样本，每孔100ul，同时加入阳性对照(步骤2中所取阳性小鼠血清)、阴性对照(免疫前小鼠血清)和空白对照(不加小鼠血清)37℃反应45min，
4)重复步骤2)；
5)加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗(北京博奥森生物技术有限公司)，每孔100ul，37℃反应45min。
6)重复步骤2)；
7)加入显色剂(将实施例4中辣根过氧化物酶催化底物A液和B液等体积混合后得到)，每孔100ul，室温避光反应15min。
8)加入终止液(2M的硫酸水溶液)，每孔100ul，使用酶标仪在450nm波长处读取OD值。
结果如表1。
表1各小鼠血清的抗体效价
小鼠编号 效价
FL021-1 1:243000
FL021-2 >1:243000
FL021-3 >1:243000
FL021-4 >1:243000
3、细胞融合：三免后两周，取血清抗体效价最高的小鼠对其腹腔注射0.1mL重组N蛋白溶液(0.5mg/mL)进行加强免疫，三天后进行细胞融合。将该小鼠断颈处死，用70％乙醇溶液浸泡30min消毒，在超净台剪开腹腔，取出脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合。
4、融合筛选：将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液(购自sigma)进行培养，三天后换液，改用HT培养液(购自sigma)培养。10天后，取细胞培养上清采用间接ELISA方法检测抗体效价(方法同上)，取阳性孔以备进行亚克隆。
5、亚克隆与建株：使用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，10天后检测，将阳性克隆继续采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到的亚克隆都为阳性。最终获得37株能够分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，依次编号为1#、2#……37#，各杂交瘤细胞株与其产生的抗PEDV N蛋白单克隆抗体编号相同。
6、扩大培养：将各杂交瘤细胞株分别扩大培养，并进行冻存。
7、抗体制备与纯化
制备、纯化上述37株杂交瘤细胞株产生的抗PEDV N蛋白单克隆抗体，具体方法如下：
a)腹水制备：在小鼠腹腔注射矿物油，一周后将杂交瘤细胞株以PBS缓冲液稀释后注射入小鼠腹腔，每只小鼠注射的杂交瘤细胞数约为5×105个，10天后收集腹水。
b)单克隆抗体纯化：将腹水在4000rpm、室温条件下离心15min，取上清。在4℃、搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达到50％，继续搅拌30min，然后在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，继续搅拌30min，在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，4℃透析过夜，得到单克隆抗体粗蛋白，测定抗体含量，-20℃冻存备用。将单克隆抗体粗蛋白采用Protein G预装柱(GE公司)进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml、浓度为0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续采用10ml、0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；采用5ml、0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)洗脱结合位点上的抗体，在洗脱液中加入pH 8.0、1M的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
8、抗体特性分析
分析本实施例标题7获得的37个单克隆抗体的特性。
a)效价测定
用间接ELISA法(同上)检测各单克隆抗体的效价，以0.5作为截断值。上述37个单克隆抗体中，有23个单克隆抗体效价>1：1024×103，5个单克隆抗体效价介于1：512×103和1：1024×103之间，4个单克隆抗体效价介于1：64×103和1：128×103之间，5个单克隆抗体效价低于1：64×103。
b)亚型测定
根据亚型检测试剂盒说明书测定抗体亚型，其中30株抗体亚型为IgG1，3株为IgG2a，3株为IgG2b，1株为IgM。
实施例3、制备酶标记多克隆抗体与抗体配对筛选
1.制备酶标记的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的多克隆抗体
(1)制备抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的多克隆抗体
将实施例1制备的重组N蛋白按照常规方法免疫兔子，当兔血清抗体效价(实施例2中方法检测)达到1：243000以上，采集兔血清。
采用如下方法纯化多克隆抗体：将兔血清在4000rpm、室温条件下离心15min，取上清。在4℃、搅拌条件下向上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达到50％，继续搅拌30min，然后在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，继续搅拌30min，在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液(0.01M、pH7.4)，4℃透析过夜，得到兔多克隆抗体粗蛋白，测定抗体含量，-20℃冻存备用。将兔多克隆抗体抗体粗蛋白采用Protein A预装柱(GE公司)进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml、浓度为0.4M的PB缓冲液(pH 7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续采用10ml、0.4M的PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；采用5ml、0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 3.0)洗脱结合位点上的抗体，收集含有多克隆抗体的洗脱液，在该洗脱液中加入pH 8.0、1M的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
(2)酶标记多克隆抗体的制备
取纯化后的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的多克隆抗体，与辣根过氧化物酶(HRP)耦连，得到酶标记抗体。具体方法如下：
(1)取5mg HRP溶于纯水，加入0.2ml、0.1M的NaIO4溶液，室温反应30分钟；
(2)将5mg纯化后的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的多克隆抗体用偶联缓冲液(pH9.5、10mM的碳酸盐缓冲液)透析过夜；
(3)将步骤(1)所得溶液加入步骤(2)透析后所得抗体溶液中，室温反应2小时；
(4)加入硼氢化钠封闭反应位点；
(5)磷酸盐缓冲液透析过夜，得到酶标记抗体，加入等量甘油保存于-20℃。
2.抗体配对筛选
采用实施例2制备的各单克隆抗体分别包被酶标板，然后以重组N蛋白(1ppm)或
阳性样本6#(PEDV病毒蛋白提取物)作为夹心抗原，以本实施例制备的酶标记多克隆抗体作为检测抗体，进行双抗夹心ELISA检测，以进行抗体配对筛选。阴性对照中以缓冲液替代夹心抗原。检测结果以OD450值表示。
部分配对筛选结果如表2。
表2抗体配对筛选
从表2中的配对筛选数据可以看到，其中有7个抗体阳性样本6#的OD450值>2.1*阴性样本OD450值，可判定为可检出阳性样本。其中抗PEDV N蛋白单克隆抗体16#(缩写为单克隆抗体16#)对阳性样本6#的OD450值最高，且阴性样本OD450值较低，检测效果最好，因此，选取单克隆抗体16#作为开发ELISA试剂盒的抗体。单克隆抗体16#是由杂交瘤细胞株16#制备的，其亚型为IgG1，纯化后的单克隆抗体16#效价>1:1024×103。
杂交瘤细胞株16#也称为杂交瘤细胞株PEDV。将杂交瘤细胞株PEDV送中国典型培养物保藏中心保藏。保藏信息如下：
分类命名为：杂交瘤细胞株PEDV，保藏日期为2017年2月15日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201710。
实施例4猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒的组装
选择杂交瘤细胞株PEDV分泌的抗PEDV N蛋白单克隆抗体制备试剂盒，检测不同的ELISA条件：包被抗体浓度、检测抗体使用浓度、反应时间等，最终确定试剂盒中成分及检测方法。
1.试剂盒组成
试剂盒：包括预包被酶标板、标准品冻干粉、酶标记抗体工作液、样品稀释液、显色剂、终止液、洗涤液。
(1)试剂的配制
包被缓冲液(0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液)：3.2克碳酸钠，5.86克碳酸氢钠，用纯水定容至1L。
样品稀释液(0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液)：8克氯化钠，3.35克十二水合磷酸氢二钠，0.2克氯化钾，0.2克磷酸二氢钾，用纯水定容至1L。
洗涤液：溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％。
封闭液：溶剂是0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液，溶质为BSA(牛血清白蛋白)，BSA在封闭液中的质量百分浓度为1％。
终止液：2M的硫酸水溶液。
显色剂：包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液。辣根过氧化物酶催化底物A液：体积百分浓度为3％的H2O2水溶液。辣根过氧化物酶催化底物B液：将1mL浓度为10mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液加入到100mL浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成；浓度为0.1mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液的配制方法为：0.1mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7mL和0.1mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3mL混合即成。
(2)、预包被酶标板的制备
预包被酶标板的制备方法，包括如下步骤：
1)包被：采用包被缓冲液将纯化后的、由杂交瘤细胞株PEDV分泌的抗PEDV N蛋白单克隆抗体(制备方法见实施例2)稀释至2μg/mL，得到包被工作液。将包被工作液按每孔100μL加入酶标板中，4℃静置12-18h。
2)封闭：将酶标板以洗板机吸干-洗涤二次，将板条在洁净的吸水纸上拍干；然后将封闭液按每孔150μL加入酶标板中，37℃烘焙3小时。洗涤过程中采用洗涤液。
3)抽干密封：弃去烘焙后的酶标板中的封闭液，拍干，放入真空冷冻干燥机中抽干3小时，真空热封。
(3)、标准品冻干粉
将实施例1中方法制备得到的重组N蛋白(纯化后的)，用样品稀释液稀释到320ng/ml。在3mL棕色玻璃瓶中加入100μL、320ng/ml的重组N蛋白，采用真空冷冻干燥机抽干，得到标准品冻干粉。
(4)、酶标记抗体工作液的配制
采用实施例3中方法制备酶标记多克隆抗体，采用0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液稀释至2μg/mL，得到酶标记抗体工作液，2～8℃避光保存。
2.试剂盒的具体使用方法
试剂盒的具体使用方法包括如下步骤：
(1)从待检样本中提取蛋白：取0.1g样本，加入1ml样品提取液(0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液)进行提取，4000rpm离心5分钟，取上清，得蛋白提取液；
(2)将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
(3)加标准品/样本：在预包被酶标板的每孔中加入100μL样品稀释液(空白对照)或标准品(标准品冻干粉用样品稀释液溶解)或样本蛋白提取液，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min。
(4)洗板：将孔内液体甩干，用洗涤液250μL/孔充分洗涤4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。
(5)加酶标记抗体工作液：加入酶标记抗体工作液100μL/孔，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min，取出重复洗板步骤(4)。
(6)显色：将辣根过氧化物酶催化底物A液和B液等体积混合，每孔加入100μL，置于25℃避光环境中反应15min。
(7)测定：加入终止液100μL/孔，轻轻振荡混匀，在酶标仪中检测450nm波长处每孔
的OD值，即得到OD450值。
按照上述方法，将标准品冻干粉稀释成如下浓度(重组N蛋白浓度)32、16、8、4、2、0μg/kg，制作浓度-吸光度标准曲线，检测结果如表3所示。标准曲线如图2所示。
表3标准品检测结果(OD450值)
(8)通过浓度-吸光度标准曲线，计算待检样品中的PEDV N蛋白浓度。
实施例5猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒性能评价
考察实施例4中制备的试剂盒的性能。
(1)特异性试验
采用实施例4中制备的试剂盒检测常见的猪病病毒，包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)。根据检测OD值和标准曲线，计算样品中N蛋白的含量。结果如表4所示，只有PEDV采用上述试剂盒检测后呈阳性，其它病毒均为阴性，表明无交叉反应，说明本发明试剂盒特异性较好。
表4特异性试验结果
病原 PEDV TGEV RV PRRSV CSFV PCV2 FMDV PRV
OD值 1.086 0.113 0.111 0.112 0.1 0.101 0.111 0.11
N蛋白浓度(μg/kg) 26.45 -0.53 -0.64 -0.59 -1.1 -0.94 -0.64 -0.65
(2)灵敏度分析
根据试剂盒的标准曲线，可以计算出能够检测到的N蛋白的最低浓度,即为试剂盒的检测敏感性。从标准曲线可以看出，1千克样品中只要含有1μg及以上的N蛋白，均可以被本发明试剂盒检出，灵敏性非常高。
对病毒含量为105TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒(PEDV)液进行10倍倍比稀释，提取不同稀释度的病毒液中的蛋白，采用实施例4中试剂盒进行检测，结果如表5所示。从表5可见，该试剂盒最低可检测的病毒含量为102TCID50/ml。
表5敏感性试验
(3)重复性实验
①批内重复实验
使用同批制备的试剂盒在不同时间分别检测8份随机选择的PEDV阳性粪便病料中PEDVN蛋白的含量，计算平均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表6，可见8份粪便病料检测结果的变异系数在0.6％-6.8％之间，说明同批试剂盒在不同时间操作检测结果重复性良好。
表6批内重复性实验检测结果：N蛋白含量(μg/kg)
②批间重复实验
采用三批次试剂盒在同一时间检测8份随机选择的PEDV阳性粪便病料样品，检测得出PEDV N蛋白的含量，计算平均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表7，可见8份样品的变异系数在2.2-8.2％之间，说明不同批次试剂盒检测结果重复性良好。
表7批间重复性实验结果：N蛋白含量(μg/kg)
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒及其应用
<130> 20170424
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1323
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> N基因
<400> 1
atggcaagcg ttagctttca ggatcgtggt cgtaaacgtg ttccgctgag cctgtatgca 60
ccgctgcgtg ttaccaatga taaaccgctg agcaaagttc tggcaaataa tgcagttccg 120
accaacaaag gtaataaaga tcagcagatt ggctattgga atgagcagat tcgttggcgt 180
atgcgtcgtg gtgaacgtat tgaacagccg agcaattggc atttctatta tctgggcacc 240
ggtccgcatg ccgatctgcg ttatcgtacc cgtaccgaag gtgttttttg ggttgcaaaa 300
gaaggtgcaa aaaccgaacc gaccaatctg ggtgttcgta aagcaagcga aaaaccgatt 360
attccgaatt ttagccagca gctgccgagc gttgttgaaa ttgttgaacc gaatacccct 420
ccgaccagcc gtagcaatag ccgtagccgt agtcgtggta atggtaataa tcgtagccgt 480
tcaccgagca ataatcgtgg caataatcag agccgtggta atagccagaa tcgcggtaat 540
aaccaggacc gtggtgcaag tcagaatcgt ggtggcaaca ataacaacaa caataaaagc 600
cgcaaccagt ccaaaaatcg caatcagagt aatgatcgcg gtggtgttac cagccgtgat 660
gatctggttg cagcagttaa agatgcactg aaaagcctgg gtattggtga aaatccggat 720
aaactgaaac agcagcagaa accgaaacaa gaacgtagcg atagcagcgg taaaaatacc 780
ccgaaaaaaa acaaaagccg tgcgaccagc aaagaacgtg atctgaaaga tatcccggaa 840
tggcgtcgta ttccgaaagg tgaaaatagc gttgcagcat gttttggtcc gcgtggtggc 900
tttaaaaact ttggtgatgc agagtttgtg gaaaaaggtg ttgatgcaag cggttatgca 960
cagattgcaa gcctggcacc gaatgttgca gcactgctgt ttggtggtaa tgttgccgtt 1020
cgtgaactgg cagatagcta tgaaattacc tataactata aaatgaccgt gccgaaaagc 1080
gatccgaatg tggaactgct ggttagccag gttgatgcat ttaaaaccgg taatgcaaaa 1140
ccgcagcgca aaaaagaaaa aaaaaataaa cgtgaaacca cacagcagct gaatgaagag 1200
gcaatttatg atgatgttgg tgttccttca gatgtgaccc atgcaaatct ggaatgggat 1260
accgcagttg atggtggtga tacagcggtt gaaattatca acgaaatttt cgataccggc 1320
aat 1323
<210> 2
<211> 441
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒
<400> 2
Met Ala Ser Val Ser Phe Gln Asp Arg Gly Arg Lys Arg Val Pro Leu
1 5 10 15
Ser Leu Tyr Ala Pro Leu Arg Val Thr Asn Asp Lys Pro Leu Ser Lys
20 25 30
Val Leu Ala Asn Asn Ala Val Pro Thr Asn Lys Gly Asn Lys Asp Gln
35 40 45
Gln Ile Gly Tyr Trp Asn Glu Gln Ile Arg Trp Arg Met Arg Arg Gly
50 55 60
Glu Arg Ile Glu Gln Pro Ser Asn Trp His Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr
65 70 75 80
Gly Pro His Ala Asp Leu Arg Tyr Arg Thr Arg Thr Glu Gly Val Phe
85 90 95
Trp Val Ala Lys Glu Gly Ala Lys Thr Glu Pro Thr Asn Leu Gly Val
100 105 110
Arg Lys Ala Ser Glu Lys Pro Ile Ile Pro Asn Phe Ser Gln Gln Leu
115 120 125
Pro Ser Val Val Glu Ile Val Glu Pro Asn Thr Pro Pro Thr Ser Arg
130 135 140
Ser Asn Ser Arg Ser Arg Ser Arg Gly Asn Gly Asn Asn Arg Ser Arg
145 150 155 160
Ser Pro Ser Asn Asn Arg Gly Asn Asn Gln Ser Arg Gly Asn Ser Gln
165 170 175
Asn Arg Gly Asn Asn Gln Gly Arg Gly Ala Ser Gln Asn Arg Gly Gly
180 185 190
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Lys Ser Arg Asn Gln Ser Lys Asn Arg Asn
195 200 205
Gln Ser Asn Asp Arg Gly Gly Val Thr Ser Arg Asp Asp Leu Val Ala
210 215 220
Ala Val Lys Asp Ala Leu Lys Ser Leu Gly Ile Gly Glu Asn Pro Asp
225 230 235 240
Lys Leu Lys Gln Gln Gln Lys Pro Lys Gln Glu Arg Ser Asp Ser Ser
245 250 255
Gly Lys Asn Thr Pro Lys Lys Asn Lys Ser Arg Ala Thr Ser Lys Glu
260 265 270
Arg Asp Leu Lys Asp Ile Pro Glu Trp Arg Arg Ile Pro Lys Gly Glu
275 280 285
Asn Ser Val Ala Ala Cys Phe Gly Pro Arg Gly Gly Phe Lys Asn Phe
290 295 300
Gly Asp Ala Glu Phe Val Glu Lys Gly Val Asp Ala Ser Gly Tyr Ala
305 310 315 320
Gln Ile Ala Ser Leu Ala Pro Asn Val Ala Ala Leu Leu Phe Gly Gly
325 330 335
Asn Val Ala Val Arg Glu Leu Ala Asp Ser Tyr Glu Ile Thr Tyr Asn
340 345 350
Tyr Lys Met Thr Val Pro Lys Ser Asp Pro Asn Val Glu Leu Leu Val
355 360 365
Ser Gln Val Asp Ala Phe Lys Thr Gly Asn Ala Lys Pro Gln Arg Lys
370 375 380
Lys Glu Lys Lys Asn Lys Arg Glu Thr Thr Gln Gln Leu Asn Glu Glu
385 390 395 400
Ala Ile Tyr Asp Asp Val Gly Val Pro Ser Asp Val Thr His Ala Asn
405 410 415
Leu Glu Trp Asp Thr Ala Val Asp Gly Gly Asp Thr Ala Val Glu Ile
420 425 430
Ile Asn Glu Ile Phe Asp Thr Gly Asn
435 440

Claims (7)

1.分泌抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株PEDV，保藏编号为CCTCCNO:C201710。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体。
3.权利要求2所述抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体在制备检测猪流行性腹泻病毒试剂盒方面的应用。
4.猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，包括预包被酶标板和酶标记抗体，所述预包被酶标板是采用权利要求2所述抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体包被的酶标板，所述酶标记抗体是辣根过氧化物酶标记的抗猪流行性腹泻病毒N蛋白多克隆抗体；所述抗猪流行性腹泻病毒N蛋白多克隆抗体通过用猪流行性腹泻病毒N蛋白免疫兔子，获取兔子血清后纯化获得。
5.根据权利要求4所述猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，其特征在于所述猪流行性腹泻病毒N蛋白是通过诱导表达携带SEQ ID NO:1所示N蛋白编码基因的重组菌获得的。
6.根据权利要求4或5所述猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，其特征在于抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体的包被浓度为2 μg/mL，酶标记抗体的浓度为2μg/mL。
7.根据权利要求6所述猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括标准品冻干粉、样品稀释液、显色剂、终止液和洗涤液；
所述标准品冻干粉为PEDV重组N蛋白；
所述样品稀释液为0.01mM、pH值为7. 4的PBS缓冲液；
所述洗涤液的溶剂是0.01mM、pH值为7. 4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2%；
终止液：2M的硫酸水溶液；
显色剂包括辣根过氧化物酶催化底物A液和B液；所述辣根过氧化物酶催化底物A液是含有H2O2的溶液；所述辣根过氧化物酶催化底物B液是含有3,3',5,5'-四甲基联苯胺的溶液。
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