CN113150134B - 抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒 - Google Patents

抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒 Download PDF

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CN113150134B CN202110277976.3A CN202110277976A CN113150134B CN 113150134 B CN113150134 B CN 113150134B CN 202110277976 A CN202110277976 A CN 202110277976A CN 113150134 B CN113150134 B CN 113150134B
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Abstract

本发明提供抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒。所述抗体能特异性地识别并结合猪δ冠状病毒的N蛋白，优选是单克隆抗体。本发明还提供分泌抗猪δ冠状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株FL125‑29，其被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202131。本发明另外还提供基于双抗体夹心法检测猪δ冠状病毒的ELISA定量检测试剂盒。本发明的抗体与重组猪δ冠状病毒N蛋白和天然猪δ冠状病毒N蛋白均能发生很强的特异性反应，与其他病原的蛋白成分不发生交叉反应。本发明的试剂盒最低可检出含量为0.5ng/mL的猪δ冠状病毒N蛋白，能很好地应用于对猪δ冠状病毒N蛋白进行定量检测。

Description

抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及抗猪δ冠状病毒的抗体、分泌抗猪δ冠状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒。
背景技术
猪δ冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）为δ冠状病毒成员，是2012年新发现的一种感染猪的冠状病毒，临床特征是引起母猪和仔猪腹泻症状，以呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降为基本特征，发病仔猪中的死亡率为 30%~40%。
此前，对PDCoV病原的检测多用常规的RT-PCR或RT-qPCR核酸检测方法，操作繁杂、耗时长、成本较高、检测过程易污染，且RT-PCR不能定量检测、只能定性判断，且不能高通量检测。
发明内容
本发明一方面旨在提供抗猪δ冠状病毒的抗体，所述抗猪δ冠状病毒的抗体能特异性地识别并结合所述猪δ冠状病毒的N蛋白。
优选地，所述抗猪δ冠状病毒的抗体是单克隆抗体。
优选地，所述单克隆抗体由2021年2月2日保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO:C202131的杂交瘤细胞株FL125-29分泌。
本发明还提供分泌抗猪δ冠状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株FL125-29，该细胞株于2021年2月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202131。
本发明还提供上述抗猪δ冠状病毒的单克隆抗体在制备检测猪δ冠状病毒的试剂中的应用。
本发明还提供一种检测猪δ冠状病毒的试剂盒，其包括酶标板，所述酶标板的各反应孔内预包被有抗猪δ冠状病毒的抗体，所述试剂盒还包括检测抗体。
优选地，所述检测抗体是抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体。
优选地，所述抗猪δ冠状病毒的抗体是由2021年2月2日保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO:C202131的杂交瘤细胞株FL125-29分泌的单克隆抗体。
优选地，所述检测抗体选自兔抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体或羊抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体。
优选地，所述试剂盒还包括酶标抗体工作液、标准品冻干粉、样品处理液、显色剂、终止液和洗涤液。
本发明提供的抗猪δ冠状病毒的抗体与重组猪δ冠状病毒N蛋白和临床病料中的天然猪δ冠状病毒N蛋白均能发生很强的特异性反应，而与其他病原的蛋白成分不发生交叉反应。基于该抗猪δ冠状病毒的抗体制备的试剂盒最低可检出含量为0.5 ng/mL的猪δ冠状病毒N蛋白，能很好地应用于对被检样品中猪δ冠状病毒N蛋白进行定量检测，进而反映出被检样品中猪δ冠状病毒的水平。
本发明所制备的试剂盒具有特异性好、灵敏度高、重复性好、稳定性好，操作简便、快速等优点，适合用于高通量临床病原诊断、弱毒活疫苗的质量控制等应用实践，对猪δ冠状病毒的防控具有重要意义。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 抗体、杂交瘤细胞株和检测猪δ冠状病毒的试剂盒
<130> JAAS2021-1
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggcagcac ctgtagtccc aactaccgat gcaagctggt tccaggtgct gaaagcccag 60
aacaagaaag ctacccaccc gcagttccgt ggtaacggtg tccctctgaa cagcgcaatc 120
aaaccagtgg agaaccacgg ctactggctg cgttacaccc gtcagaaacc gggtggtact 180
ccaatccctc cttcctacgc attctactac acgggcaccg gtccacgtgg taacctgaaa 240
tacggcgagc tgccaccaaa cgacactccg gcaactactc gtgtgacttg ggtgaaaggc 300
agcggtgcag atacgagcat caaaccgcac gtggctaaac gcaacccgaa caacccgaaa 360
caccagctgc tgccgctgcg tttcccgact ggtgacggtc cggctcaagg ttttcgtgtt 420
gatccgttta acgctcgtgg tcgtccgcaa gaacgtggtt ctggtccgcg ttctcaatct 480
gtaaactccc gtggtactgg taaccagccg cgtaaacgtg accagtctgc tccggctgct 540
gtacgtcgca agacgcaaca tcaggctccg aaacgcaccc tgccgaaagg caaaaccatt 600
tctcaggttt tcggcaaccg ctctcgcacc ggcgcgaatg ttggctctgc cgatacggag 660
aagaccggca tggcggatcc gcgcatcatg gcgctggcgc gccatgttcc gggcgtacag 720
gaaatgctgt ttgccggcca cctggaatcc aatttccagg ccggcgcgat caccctgacc 780
ttctcctatt ccattaccgt taaagaaggc agcccggatt atgaacgcct gaaagatgcg 840
ctgaataccg ttgttaacca gacctatgaa ccgccgacca aaccgaccaa agacaagaaa 900
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ctgccggcgg acaaacagga ctgggaatgg gacgacgcgt tcgaaattaa gcaggaaagc 1020
gcggcg                                                            1026
<210> 2
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 2
Met Ala Ala Pro Val Val Pro Thr Thr Asp Ala Ser Trp Phe Gln Val
1               5                   10                  15
Leu Lys Ala Gln Asn Lys Lys Ala Thr His Pro Gln Phe Arg Gly Asn
            20                  25                  30
Gly Val Pro Leu Asn Ser Ala Ile Lys Pro Val Glu Asn His Gly Tyr
        35                  40                  45
Trp Leu Arg Tyr Thr Arg Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Ile Pro Pro
    50                  55                  60
Ser Tyr Ala Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Arg Gly Asn Leu Lys
65                  70                  75                  80
Tyr Gly Glu Leu Pro Pro Asn Asp Thr Pro Ala Thr Thr Arg Val Thr
                85                  90                  95
Trp Val Lys Gly Ser Gly Ala Asp Thr Ser Ile Lys Pro His Val Ala
            100                 105                 110
Lys Arg Asn Pro Asn Asn Pro Lys His Gln Leu Leu Pro Leu Arg Phe
        115                 120                 125
Pro Thr Gly Asp Gly Pro Ala Gln Gly Phe Arg Val Asp Pro Phe Asn
    130                 135                 140
Ala Arg Gly Arg Pro Gln Glu Arg Gly Ser Gly Pro Arg Ser Gln Ser
145                 150                 155                 160
Val Asn Ser Arg Gly Thr Gly Asn Gln Pro Arg Lys Arg Asp Gln Ser
                165                 170                 175
Ala Pro Ala Ala Val Arg Arg Lys Thr Gln His Gln Ala Pro Lys Arg
            180                 185                 190
Thr Leu Pro Lys Gly Lys Thr Ile Ser Gln Val Phe Gly Asn Arg Ser
        195                 200                 205
Arg Thr Gly Ala Asn Val Gly Ser Ala Asp Thr Glu Lys Thr Gly Met
    210                 215                 220
Ala Asp Pro Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg His Val Pro Gly Val Gln
225                 230                 235                 240
Glu Met Leu Phe Ala Gly His Leu Glu Ser Asn Phe Gln Ala Gly Ala
                245                 250                 255
Ile Thr Leu Thr Phe Ser Tyr Ser Ile Thr Val Lys Glu Gly Ser Pro
            260                 265                 270
Asp Tyr Glu Arg Leu Lys Asp Ala Leu Asn Thr Val Val Asn Gln Thr
        275                 280                 285
Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Pro Thr Lys Asp Lys Lys Pro Asp Lys Gln
    290                 295                 300
Asp Gln Ser Ala Lys Pro Lys Gln Gln Lys Lys Pro Lys Lys Val Thr
305                 310                 315                 320
Leu Pro Ala Asp Lys Gln Asp Trp Glu Trp Asp Asp Ala Phe Glu Ile
                325                 330                 335
Lys Gln Glu Ser Ala Ala
            340
附图说明
图1是用于说明实施例1中重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)在IPTG诱导条件下表达了重组猪δ冠状病毒N蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道M为蛋白质分子量标准，泳道1是未在IPTG诱导条件下培养的重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)样品，泳道2是在IPTG诱导条件下培养的重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)样品。
图2是用于说明实施例1中重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)在IPTG诱导条件下培养时蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳图，其中泳道M为蛋白Marker，泳道1是在IPTG诱导条件下培养后的重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)超声破碎后的离心上清样品，泳道2是在IPTG诱导条件下培养后的重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)超声破碎后的离心沉淀样品。
图3是用于示出实施例1中最终纯化得到的重组猪δ冠状病毒N蛋白成品的电泳图。
图4是实施例5中利用本发明的试剂盒以试剂盒中的阳性标准品作为被检样品而制作的标准曲线，横坐标为阳性标准品的浓度，纵坐标为OD450nm与OD630nm的差值。
实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的原料如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的原料。
本发明提供抗猪δ冠状病毒的抗体，该抗猪δ冠状病毒的抗体能特异性地识别并结合猪δ冠状病毒的N蛋白，优选是单克隆抗体。
本发明提供分泌抗猪δ冠状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株FL125-29，该细胞株于2021年2月2日保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202131。该杂交瘤细胞株FL125-29分泌的单克隆抗体能特异性地识别并结合猪δ冠状病毒的N蛋白。
本发明还提供该抗猪δ冠状病毒单克隆抗体在制备检测猪δ冠状病毒试剂盒方面的应用。
本发明还提供检测猪δ冠状病毒的试剂盒，优选是利用猪δ冠状病毒单克隆抗体制备的基于双抗体夹心法的ELISA定量检测试剂盒，其包括酶标板和检测抗体，其中酶标板的各个反应孔中预包被有抗猪δ冠状病毒单克隆抗体。
酶标板优选是用浓度为2 μg/mL的抗猪δ冠状病毒单克隆抗体预包被的，检测抗体的浓度优选是0.2 μg/mL。
检测抗体是抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体。抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体优选是兔抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体或羊抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体。
上述检测猪δ冠状病毒的试剂盒还包括酶标抗体工作液、阳性标准品、样品处理液、显色剂、终止液和洗涤液。当检测抗体是兔抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体时，酶标抗体工作液优选是HRP标记的羊抗兔抗体溶液，使用时用样品处理液稀释至终浓度为0.2 µg/mL。阳性标准品优选是本发明制备的重组猪δ冠状病毒N蛋白，更优选是重组猪δ冠状病毒N蛋白的冻干粉。样品稀处理优选是0.01 mM、pH值为7.4的PBS缓冲液。洗涤液的溶剂优选是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％。终止液是2M的硫酸水溶液。显色剂是TMB单组分底物（来源于KPL，货号5120-0078）。
实施例1：制备重组猪δ冠状病毒N蛋白
将猪δ冠状病毒的N基因序列进行优化，得到优化后的N基因序列，如SEQ ID NO:1所示，其编码的N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。通过人工合成的方式获得优化后的N基因片段，然后将该片段克隆至原核表达载体pET30a的NdeI和XhoI酶切位点之间，得到质粒载体pET30a-PDCoV。
用质粒载体pET30a-PDCoV转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37℃下培养12~16h。挑取单菌落于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养12-16h，通过测序鉴定，得到重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)。
按照0.5%的接种量将pET30a-PDCoV(BL21)转接至300 mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下培养至培养物的OD600为0.4~0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃下诱导表达5h，然后将培养物在8000 rpm、4℃条件下离心5min，收集菌体，通过SDS-PAGE电泳检测菌体中重组猪δ冠状病毒N蛋白的表达情况，以在不含IPTG的相同培养基中培养的重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)菌体作为对照，结果如图1所示，结果表明重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)在IPTG诱导下成功地表达重组猪δ冠状病毒N蛋白。
收集IPTG诱导条件下培养的重组大肠杆菌pET30a-PDCoV(BL21)菌体，加入100 mL的PBS缓冲液作为破碎液，进行超声波裂解。超声波裂解条件为：冰浴、功率60%、超声2s、间隔2s，裂解时间为15min。将菌体裂解液在12000rpm、4℃条件下离心15min，分别收集上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，图2的结果表明，重组猪δ冠状病毒N蛋白在上清和沉淀均有表达。
接下来，进行包涵体纯化以获取重组猪δ冠状病毒N蛋白。采用增溶液对按上述方式获得的离心沉淀进行重悬，在冰浴条件下放置2h，然后10000rpm、4℃离心15min，收集上清。利用组氨酸标签蛋白亲和纯化填料从上清液中纯化重组猪δ冠状病毒N蛋白，分别收集流穿液、洗脱液，采用SDS-PAGE电泳检测蛋白纯化的效果。上述所用的增溶液为：溶剂是pH8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液，溶质及其浓度为50mM NaCl、20mM咪唑、8M尿素、0.2mM DTT和2wt%Triton。
如图1~2所示，重组猪δ冠状病毒N蛋白的分子量约为46 kD，主要被含250mM咪唑的流动相洗脱下来，纯度85%，蛋白浓度为1 mg/mL。收集含有重组N蛋白的洗脱液，透析去除咪唑，得到纯化后的重组猪δ冠状病毒N蛋白，通过SDS-PAGE对纯化得到的蛋白进行检测，结果如图3所示，结果显示所纯化得到的蛋白质是期望得到的重组猪δ冠状病毒N蛋白，基本不含其它杂质蛋白。300mL培养物最终得到5mg纯化的重组猪δ冠状病毒N蛋白。
实施例2：杂交瘤细胞株的构建
将实施例1制备的重组猪δ冠状病毒N蛋白制成疫苗，用于免疫小鼠。
取4只6周龄的雌性Balb/c小鼠进行免疫，分别编号为FL125-1~FL125-4。第一次免疫所用佐剂为弗氏完全佐剂，将重组猪δ冠状病毒N蛋白与等体积佐剂混合乳化均匀成油包水的状态，通过皮下多点注射的方式免疫小鼠，每只小鼠每次免疫25μg重组猪δ冠状病毒N蛋白。第一次免疫28天后进行第二次免疫，第二次免疫所用佐剂为弗氏不完全佐剂，将重组猪δ冠状病毒N蛋白与等体积佐剂混合乳化均匀成油包水的状态，通过皮下多点注射的方式免疫小鼠。第二次免疫14天后进行第三次免疫，第三次免疫用等量生理盐水与重组猪δ冠状病毒N蛋白（1 mg/mL）混合，通过腹腔注射的方式免疫小鼠。第三次免疫结束后一周进行断尾取血，并分离血清。
采用间接ELISA方法检测上述血清中抗体的效价。
首先，用通过碳酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH9.6）稀释至1 μg/ml的重组猪δ冠状病毒N蛋白（实施例1制备）包被96孔酶标板，每孔100μl，37℃反应3h或者4℃静置过夜。包被结束之后甩去板孔中液体，每孔加入250μl洗涤液（溶剂是0.01mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2%），静置30s，甩去板中液体，重复3次。接下来，加入待检的血清，每孔100μl，同时设置阳性对照、阴性对照（免疫前小鼠的血清）和空白对照（不加小鼠血清），37℃反应45 min。反应结束后，弃去反应液，每孔加入250μl洗涤液进行洗涤，重复洗涤3次。接下来，加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗（来源于KPL公司），每孔100 μl，37℃下反应45 min。反应结束后，按与前述相同的方法洗涤3次。接下来，加入显色剂，每孔100μl，室温下避光反应15 min。最后，每孔加入100 μl终止液（2M的硫酸水溶液）终止反应，使用酶标仪在450 nm波长处读取OD值。
结果如表1所示。
表1
接下来，进行细胞融合。
第三次免疫结束后两周，取血清抗体效价最高的小鼠，对其腹腔注射25μg重组猪δ冠状病毒N蛋白溶液进行加强免疫。三天后取出免疫后小鼠的脾脏，磨碎，过80目筛网，得到脾细胞，加入SP2/0骨髓瘤细胞，在PEG4000的作用下进行细胞融合构建杂交瘤细胞株。
将融合好的细胞铺进96孔板，用HAT培养液（购自sigma）进行培养，三天后换液，改用HT培养液（购自sigma）培养。10天后，取细胞培养上清，采用间接ELISA方法检测上清中抗体的效价（方法同上）。取反应阳性的孔中的细胞进行亚克隆。
接下来，使用有限稀释法对各阳性孔中的细胞进行亚克隆和建株，10天后进行检测，将检测为阳性的克隆继续采用有限稀释法进行亚克隆，直到得到的所有亚克隆都为阳性。最终获得12株能够分泌抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，依次编号为1#、2#……12#，它们产生的抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的编号与相应杂交瘤细胞株的编号相同。
接下来，将上述得到的各杂交瘤细胞株分别扩大培养，并进行冻存。
实施例3：抗猪δ冠状病毒单克隆抗体的制备
利用实施例2得到的12株杂交瘤细胞株来制备抗猪δ冠状病毒单克隆抗体。
首先，制备腹水。在小鼠腹腔注射矿物油，一周后将杂交瘤细胞株以PBS缓冲液稀释后注射入小鼠腹腔，每只小鼠注射的杂交瘤细胞数约为5×105个，10天后收集腹水。
接下来，从上述收集的腹水中纯化获取单克隆抗体。将腹水在4000 rpm、室温条件下离心15 min，取上清。在4℃、搅拌条件下向腹水上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达到50%，继续搅拌30min，然后在13000 rpm、4℃条件下离心30 min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液（0.01M、pH7.4），在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33％，继续搅拌30 min，在13000 rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液（0.01M、pH7.4），4℃透析过夜，得到单克隆抗体粗蛋白溶液，测定其中抗体的含量，-20℃冻存备用。将单克隆抗体粗蛋白溶液采用Protein G预装柱（GE公司）进行纯化，新柱子先用5 ml超纯水过柱，再用5ml浓度为0.4M的PB缓冲液(pH7.0)平衡纯化小柱；将单克隆抗体粗蛋白溶液抗体缓慢过柱，以便抗体蛋白能更好地结合在结合位点上；继续采用10 ml、0.4M的PB缓冲液（pH7.0）平衡纯化小柱；采用5 ml、0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液（pH2.7）洗脱结合位点上的抗体，在洗脱液中加入pH8.0、1M的Tris-HCl中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
接下来，对上述获得的12个单克隆抗体的特性进行分析。
首先，对12个单克隆抗体的效价分别进行测定。用与实施例2相同的间接ELISA法检测各单克隆抗体的效价，以0.5作为截断值。上述12个单克隆抗体中，有2个单克隆抗体效价达>1:1024000，3个单克隆抗体效价达到1:1024000，6个单克隆抗体效价达到1:256000，1个单克隆抗体效价为1:9000。
其次，对12个单克隆抗体的亚型分别进行测定。
按照小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒的说明书对12个单克隆抗体的亚型进行测定，其中1株抗体亚型为IgG1，5株抗体亚型为IgG2a，5株抗体亚型为IgG2b，1株为IgM。
实施例4：制备兔抗猪δ冠状病毒N蛋白多克隆抗体以及筛选能用于检测猪δ冠状病 毒的抗体
取2月龄雌性新西兰大白兔一只，将实施例1制备的重组猪δ冠状病毒N蛋白按照常规方法进行免疫，共进行三次免疫。每次免疫的抗原（即，重组猪δ冠状病毒N蛋白）用量为500ug。初次免疫用等量弗氏完全佐剂对抗原进行乳化，大腿肌肉多点注射。初次免疫28天后进行第二次免疫，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂对抗原进行乳化，大腿肌肉多点注射。第二次免疫14天后进行第三次免疫，第三次免疫用等量生理盐水与抗原混合，耳静脉注射。
用与实施例2相同的方法检测兔血清中抗体的效价，当兔血清抗体效价达到1:243000以上时，采集兔血清。
采用如下方法从兔血清中纯化抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体。
首先，对兔血清进行粗纯化获得兔抗猪δ冠状病毒N蛋白多克隆抗体的粗蛋白溶液。将兔血清在4000rpm、室温条件下离心15min，取上清。在4℃、搅拌条件下向上清中逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度达到50%，继续搅拌30min，然后在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液（0.01M、pH7.4），在4℃、搅拌条件下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵溶液至体系中硫酸铵饱和度为33%，继续搅拌30min，在13000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清，取沉淀溶于PBS缓冲液（0.01M、pH7.4），4℃透析过夜，得到兔抗猪δ冠状病毒N蛋白多克隆抗体的粗蛋白溶液，测定抗体含量。
采用Protein A预装柱（GE公司）对上述获得的兔抗猪δ冠状病毒N蛋白多克隆抗体的粗蛋白溶液进行纯化。新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml的PB缓冲液(0.4M，pH7.0)平衡纯化小柱，将兔抗猪δ冠状病毒N蛋白多克隆抗体的粗蛋白溶液缓慢过柱，以便抗体蛋白能更好地结合在结合位点上；随后，继续用10 ml的PB缓冲液（0.4M，pH7.0）平衡纯化小柱；用5ml甘氨酸-盐酸缓冲液（0.1M，pH3.0）洗脱结合位点上的抗体，收集含有兔抗猪δ冠状病毒N蛋白多克隆抗体的洗脱液，在该洗脱液中加入Tris-HCl溶液（1M，pH8.0）以中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性。
接下来，进行抗体配对筛选。
用实施例2制备的12个单克隆抗体分别包被酶标板，然后以重组猪δ冠状病毒N蛋白（50 ng/mL）或阳性样本（即，猪δ冠状病毒细胞培养物）作为夹心抗原，以本实施例制备的抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体作为检测抗体，进行双抗体夹心ELISA检测，筛选出能用于检测猪δ冠状病毒的抗体。阴性对照中以缓冲液替代夹心抗原。检测结果以OD450与OD630的差值表示。结果如表2所示。
表2
从表2的结果可以看到，12个单克隆抗体中有10个单克隆抗体表现出具有比阴性样本OD450与OD630差值的2.1倍还要大的阳性样本OD450与OD630差值，可判定为这些单克隆抗体可检出阳性样本。其中编号为2#的抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体（下文简称为单克隆抗体2#）与阳性样本反应的OD450值最高，同时与阴性样本反应的OD450值较低，据此认为其检测效果最好。
因此，选取单克隆抗体2#作为开发用于检测猪δ冠状病毒的试剂盒的抗体。单克隆抗体2#是由杂交瘤细胞株2#制备的，其亚型为IgG1，纯化后的单克隆抗体2#效价>1:1024000。
将产生编号为2#的抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行保藏，保藏信息如下：分类命名为杂交瘤细胞株FL125-29，保藏日期为2021年2月2日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址是武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C202131。
实施例5：制备基于双抗体夹心法检测猪δ冠状病毒的ELISA定量检测试剂盒
选择杂交瘤细胞株FL125-29分泌的抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体来制备试剂盒，对包括包被抗体浓度、检测抗体使用浓度、反应时间在内的不同的ELISA条件进行检测，最终确定试剂盒所包含的成分以及该试剂盒用于检测猪δ冠状病毒的操作方法。
试剂盒组成包括：预包被有猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的酶标板、阳性标准品、检测抗体工作液、酶标抗体工作液、样品处理液、显色剂、终止液、洗涤液。
本实施例中制备试剂盒所需的试剂的配制如下：
（1）包被缓冲液(0.1M、pH值为9.6的CB缓冲液)：3.2g碳酸钠，5.86g碳酸氢钠，用纯水定容至1L；
（2）样品处理液（0.01 mM的PBS缓冲液，pH值为7.4）：8.0g氯化钠，3.35g十二水合磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，用纯水定容至1L；
（3）洗涤液：溶剂是0.01 mM、pH值为7.4的PBS缓冲液，溶质为吐温-20，吐温-20在洗涤液中的体积百分浓度为0.2％；
（4）封闭液：溶剂是0.1M、pH值为9.6的柠檬酸钠缓冲液（CB缓冲液），溶质为BSA（牛血清白蛋白），BSA在封闭液中的质量百分浓度为1%；
（5）终止液：2M的硫酸水溶液；
（6）显色剂：单组分TMB显色液，为KPL商品化产品（货号：5120-0078）分装。
（一）试剂盒的制备
1、预包被酶标板
按以下过程用猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体对酶标板进行预包被。
首先，制备包被工作液。用包被缓冲液将纯化后抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体稀释至2 μg/mL，作为包被工作液。
接下来，按每孔100μL的量将上述制备的包被工作液加入酶标板中，4℃静置12-18h。
接下来，进行封闭。借助洗板机将酶标板进行两次吸干-洗涤的过程，洗涤过程中采用洗涤液。然后将酶标板在洁净的吸水纸上拍干。随后，按每孔150μL的量将封闭液加入酶标板中，37℃下孵育3小时。随后，弃去酶标板中的封闭液，拍干，放入真空冷冻干燥机中抽干3小时，进行真空热封。
2、准备阳性标准品
将按实施例1的方法制备得到的浓度为1 mg/ml重组猪δ冠状病毒N蛋白用样品处理液稀释至浓度为320 ng/ml，此重组猪δ冠状病毒N蛋白溶液即可作为阳性标准品。
出于增强贮存稳定性的考虑，可以将上述溶液状态的阳性标准品通过冷冻干燥机过夜抽干得到呈冻干粉状态的阳性标准品，使用时用样品稀释液复溶即可。
3、配制检测抗体工作液
用样品处理液将实施例3制备的兔抗猪δ冠状病毒N蛋白多克隆抗体稀释至0.2 μg/mL，得到检测抗体工作液，2～8℃避光保存备用。
4、配制酶标抗体工作液
用稀释液将HRP标记的羊抗兔酶标二抗（KPL，货号为5220-0336）稀释至终浓度为0.2 µg/mL，得到酶标抗体工作液，2~8℃避光保存备用。
将上述制备的预包被酶标板、阳性标准品、检测抗体工作液、酶标抗体工作液、样品处理液、显色剂、终止液以及洗涤液进行成套组合得到用于检测猪δ冠状病毒的试剂盒，储存于冷藏环境中。
（二）试剂盒的具体使用方法
试剂盒的具体使用方法包括如下步骤：
（1）对待检样本进行预处理：取0.1g待检样本，加入1 ml样品处理液，4000 rpm离心5分钟，取上清，得到预处理后的待检样本；
（2）将试剂盒从冷藏环境中取出，置于室温（20~25℃）下平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
（3）加样品标准品/被检样本：向预包被酶标板的各反应孔中加入100μL样品处理液（作为空白对照）或阳性标准品（用样品处理液溶解标准品冻干粉）或预处理后的待检样本，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应45min；
（4）洗板：将孔内液体甩干，用洗涤液按250μL/孔的量借助移液枪充分吹吸洗涤4~5次，每次间隔10s，然后在吸水纸进行拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破；
（5）加入检测抗体工作液：按100μL/孔的量加入检测记抗体工作液，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应30min，之后取出酶标板并重复洗板步骤（4）。
（6）加入酶标抗体工作液：按100μL/孔的量加入酶标抗体工作液，轻轻振荡混匀，25℃避光环境中反应30min，之后取出酶标板并重复洗板步骤（4）。
（7）显色反应：按100μL/孔的量加入显色剂，置于25℃避光环境中反应15min。
（8）测定：显色反应结束后，按100μL/孔的量加入终止液，轻轻振荡混匀，在酶标仪中读取450/630nm波长处各反应孔的OD值，得到OD450和OD630的数值。
将阳性标准品稀释成如下梯度浓度：8 ng/mL、4 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL、0.5ng/mL，按照上述方法进行检测，读取OD450和OD630的数值并计算OD450与OD630差值，进行两次重复实验。基于计算得到的OD450与OD630差值平均值制作浓度-OD450与OD630差值标准曲线，检测结果如表3所示，制作得到的标准曲线如图4所示，该标准曲线的相关系数r2为0.998，表明该标准曲线准确性高，可用于计算被检样品中目的物的浓度。
表3
基于图4所示的标准曲线以及测得的OD450和OD630数值，通过以下公式（1）可以计算出被检样品中猪δ冠状病毒N蛋白的浓度，进而反映出待检样品中猪δ冠状病毒的水平：
y=0.32x+0.158                         （1）
其中，y代表OD450与OD630差值，x代表待检样品中猪δ冠状病毒N蛋白的浓度（单位是ng/mL）。
通过图4所示的浓度-OD450与OD630差值标准曲线，利用本发明的试剂盒测得待检样品的OD450与OD630差值，即可准确并快速计算出待检样品中猪δ冠状病毒N蛋白的浓度。
实施例6：试剂盒性能的评价
本实施例通过特异性试验、灵敏度试验和重复性试验对实施例5中制备的试剂盒的性能进行评价。
（一）特异性试验
以包括猪δ冠状病毒（PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（RV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪口蹄疫病毒（FMDV）和猪伪狂犬病毒（PRV）在内的常见猪病病毒作为待检样品，用按实施例5的方法制备的试剂盒及其使用方法对各待检样品进行检测。
基于图4所示的标准曲线，根据检测读取到的OD450和OD630的数值，利用上述公式（1）计算出各待检样品中N蛋白的含量。结果如表4所示，只有PDCoV的样品表现出阳性结果，其他病毒样品均表现为阴性，表明本发明的试剂盒与其他病毒样品不发生交叉反应，具有对猪δ冠状病毒优异的特异性反应。
表4
（二）灵敏度分析
根据利用阳性标准品制作的标准曲线，可以计算出能够检测到的猪δ冠状病毒N蛋白的最低浓度，即为试剂盒的检测敏感性。从图4所示的标准曲线可以看出，只要被检样品中猪δ冠状病毒N蛋白的含量达到0.5 ng/mL及以上时，均可以被本发明试剂盒检出，灵敏度非常高。
将病毒含量为105TCID50/ml的猪δ冠状病毒液进行10倍倍比稀释，提取不同稀释度的病毒液中的蛋白，采用实施例5的试剂盒按照实施例5所描述的方法进行检测，结果如表5所示。从表5可见，该试剂盒可检出的最低病毒含量为103.058TCID50/ml。
表5
（三）重复性试验
1、批内重复试验
使用同批制备的试剂盒在不同时间分别检测7份随机选择的猪δ冠状病毒阳性粪便病料中猪δ冠状病毒N蛋白的含量（μg/kg），计算平均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表6所示，结果显示7份粪便病料检测结果的变异系数在0.67%~7.03％之间，说明同批次试剂盒在不同时间用于检测猪δ冠状病毒时的结果重复性良好。
表6
2、批次间重复试验
采用三个批次的试剂盒在同一时间检测7份随机选择的猪δ冠状病毒阳性粪便病料样品中猪δ冠状病毒N蛋白的含量，计算平均值X，标准差SD，变异系数CV。结果如表7所示，结果显示7份样品的变异系数在1.43%~5.16%之间，说明不同批次的试剂盒用于检测猪δ冠状病毒时的结果重复性良好。
表7
申请人结合说明书附图对本发明的实施例做了详细的说明与描述，但是本领域技术人员应该理解，以上实施例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抗猪δ冠状病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏在位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCCNO:C202131的杂交瘤细胞株FL125-29分泌；所述的单克隆抗体能特异性地识别并结合所述猪δ冠状病毒的N蛋白。
2.如权利要求1所述的的单克隆抗体在制备检测猪δ冠状病毒的试剂中的应用。
3.一种检测猪δ冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其包括酶标板，所述酶标板的各反应孔内预包被有如权利要求1所述的抗猪δ冠状病毒的单克隆抗体，所述试剂盒还包括检测抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体是抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：所述检测抗体选自兔抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体或羊抗猪δ冠状病毒N蛋白的多克隆抗体。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标抗体工作液、阳性标准品、样品处理液、显色剂、终止液和洗涤液。
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