CN110361542A - 猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 - Google Patents

猪德尔塔冠状病毒n蛋白的双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种针对猪德尔塔冠状病毒N蛋白的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。该试剂盒包被有单克隆抗体PDCoV‑N‑1A2的酶标板、阳性和阴性对照、HRP标记的检测抗体PDCoV‑N‑5C5、样品稀释液、显色液以及洗涤液。其中所述抗体PDCoV‑N‑1A2和PDCoV‑N‑5C5分别由杂交瘤细胞株PDCoV‑N‑1A2和PDCoV‑N‑1A2分泌。本发明的试剂盒以1A2为捕获抗体、以杂交5C5(HRP偶联)为检测抗体建立的双抗体夹心ELSIA方法可特异性的检测PDCoV N蛋白，为PDCoV感染的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。

Description

猪德尔塔冠状病毒N蛋白的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种针对猪德尔塔冠状病毒N蛋白的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新发现的冠状病毒，可引起猪、特别是新生仔猪腹泻，其引发的临床表现与已知的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻非常相似，容易混淆，感染后可导致较高的发病率和死亡率，是近年来在多个国家和地区造成新生仔猪死亡的重要原因之一。PDCoV最早于2012年由香港学者首次发现(WooPC,et al.Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in thegenus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus.Journal of virology,2012,86(7):3995-4008.)，2014年在美国首次发生大规模流行(Li G,et al.Full-Length GenomeSequence of Porcine Deltacoronavirus Strain USA/IA/2014/8734.Genomeannouncements,2014,2(2)：e00278-14.)，随后在韩国，中国等地相继被检测到(Lee S,etal.Complete Genome Characterization of Korean Porcine Deltacoronavirus StrainKOR/KNU14-04/2014.Genome announcements,2014,2(6)：e01191-14.；Chen F,etal.2015.Full-length genome characterization of Chinese porcinedeltacoronavirus strain CH/SXD1/2015.Genome Announcements,3(5):e01284-15；)。目前，临床诊断PDCoV感染的病原学检测方法主要是RT-PCR、qRT-PCR等针对病毒核酸的检测技术，缺乏直接针对PDCoV抗原的免疫学相关方法。为了准确评估猪群中的PDCoV感染情况，亟需建立PDCoV抗原检测方法，配合已有的抗体检测方法，从抗原抗体两个方面进行综合评定。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒，该试剂盒可用于快速准确地检测PDCoVN蛋白。
为了解决上述技术问题，本发明使用一种已公开的高纯度、可溶性的猪德尔塔冠状病毒重组N蛋白PDCoV-N-His作为免疫原和检测原(CN 109880843 A)，制备抗猪德尔塔冠状病毒N蛋白的单克隆抗体，并从获得的单克隆抗体中优选出其中两株(5C5和1A2)建立了检测PDCoV N蛋白的双抗体夹心ELSIA方法。
本发明提供了一种猪德尔塔冠状病毒N蛋白双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有单克隆抗体PDCoV-N-1A2的酶标板、阳性和阴性对照、HRP标记的检测抗体PDCoV-N-5C5、样品稀释液、显色液以及洗涤液。所述的样品稀释液是含0.05％Tween-20的PBST，显色液是TMB显色液，洗涤液是含0.05％Tween-20的PBST。本发明中，所述的单克隆抗体PDCoV-N-1A2由杂交瘤细胞株PDCoV-N-1A2分泌，杂交瘤细胞株PDCoV-N-1A2的保藏号为CCTCC NO：C2019137。
所述的抗体PDCoV-N-5C5由杂交瘤细胞株PDCoV-N-5C5分泌，杂交瘤细胞株PDCoV-N-5C5的保藏号为CCTCC NO：C2019136。
具体地，所述的抗体PDCoV-N-1A2和PDCoV-N-5C5，通过下述方法制得：用重组蛋白PDCoV-N-His免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0细胞融合，筛选获得分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞5C5和1A2，所述杂交瘤细胞分别注射入小鼠腹腔，小鼠腹部胀大后，采集腹水，通过对腹水进行亲和层析法纯化即可获得含有抗PDCoV N蛋白的单克隆抗体PDCoV-N-1A2和PDCoV-N-5C5。
本发明在制备PDCoVN蛋白特异性单克隆抗体的过程中得到6株单克隆抗体，其中4株为IgG1亚型，2株为IgM亚型，轻链均为kappa亚型。本发明优选出的杂交瘤细胞株PDCoV-N-5C5和PDCoV-N-1A2分泌的单克隆抗体5C5和1A2均能与PDCoV感染细胞特异性反应，两株细胞生物学特性稳定，分泌的单克隆抗体针对PDCoV N蛋白不同表位，在PDCoV感染诊断方面具有重要的应用价值。本发明以杂交瘤细胞株PDCoV-N-1A2分泌的单克隆抗体1A2为捕获抗体、以杂交瘤细胞株PDCoV-N-5C5分泌的单克隆抗体5C5(HRP偶联)为检测抗体建立的双抗体夹心ELSIA方法可特异性的检测PDCoV N蛋白，且方法具有较高的线性系数和较广的检测范围，表明本发明双抗体夹心ELISA方法具有实际应用价值，并进一步制备成试剂盒，为PDCoV感染的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的检测手段。
杂交瘤细胞PDCoV-N-1A2于2019年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号分别为和CCTCC NO：C2019137；分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV-N-1A2。
杂交瘤细胞PDCoV-N-5C5于2019年6月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号分别为和CCTCC NO：C2019136；分类命名为：杂交瘤细胞株PDCoV-N-5C5。
附图说明
图1是单克隆抗体1A2的Western Blot鉴定图(M：蛋白Marker；1：PDCoV CHN/Tianjin/2016株病毒感染PK-1细胞；2：未感染病毒的PK-1细胞)。
图2是单克隆抗体4C5的Western Blot鉴定图(M：蛋白Marker；1：PDCoV CHN/Tianjin/2016株病毒感染PK-1细胞；2：未感染病毒的PK-1细胞)。
图3是单克隆抗体5C5的Western Blot鉴定图(M：蛋白Marker；1：PDCoV CHN/Tianjin/2016株病毒感染PK-1细胞；2：未感染病毒的PK-1细胞)。
图4是单克隆抗体8C12的Western Blot鉴定图(M：蛋白Marker；1：PDCoV CHN/Tianjin/2016株病毒感染PK-1细胞；2：未感染病毒的PK-1细胞)。
图5是单克隆抗体8E8的Western Blot鉴定图(M：蛋白Marker；1：PDCoV CHN/Tianjin/2016株病毒感染PK-1细胞；2：未感染病毒的PK-1细胞)。
图6是单克隆抗体10A7的Western Blot鉴定图(M：蛋白Marker；1：PDCoV CHN/Tianjin/2016株病毒感染PK-1细胞；2：未感染病毒的PK-1细胞)。
图7是双对数回归拟合线示意图。
具体实施方式
为了快速准确地诊断猪PDCoV感染，本发明研制出了能够与PDCoV N蛋白具有良好反应性的单克隆抗体，进而制备了检测N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒。下面将通过具体实施方例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1抗猪德尔塔冠状病毒N蛋白鼠源单克隆抗体的制备
使用已公开的一种重组猪德尔塔冠状病毒N蛋白制备方法制备的重组N蛋白作为免疫原和检测原(CN 109880843 A)，采用淋巴细胞杂交瘤技术，成功制备了6株抗PDCoV N蛋白的特异性单克隆抗体1A2、4C5、5C5、8C12、8E8和10A7。以PDCoV CHN/Tianjin/2016株感染的PK1细胞作为抗原，对6株单抗进行Western Blot鉴定，结果如图1～图6。
制备PDCoV N蛋白特异性单克隆抗体的具体步骤如下：
(1)重组N蛋白作为包被抗原，棋盘滴定法确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，建立检测小鼠血清抗体效价和筛选阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法。
(2)取适量重组N蛋白与弗氏完全佐剂1:1混合，充分乳化后，背部多点免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠。间隔14d，用弗氏不完全佐剂与蛋白1:1混合，充分乳化后免疫小鼠，此后，每次免疫的佐剂均为弗氏不完全佐剂，间隔时间均为14d。
(3)小鼠眶下窦采血，制备血清。从1:100开始，梯度稀释小鼠血清，使用重组N蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法，检测小鼠血清抗体效价。当血清抗体效价大于1:10000时，则可腹腔注射未加佐剂的重组N蛋白加强免疫。若血清抗体效价未达1:10000，则继续免疫。
(4)加强免疫3d后，取小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合。用HAT培养基重悬融合后的细胞并计数，将浓度为2×105/mL的细胞以每孔0.1mL的量加入到预先铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，放入37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。
(5)细胞融合5d后，弃去HAT培养基，换用HT培养基继续培养杂交瘤细胞。
(6)细胞融合11～15d后，当大部分杂交瘤细胞孔培养基变黄时，间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，鉴定为阳性的杂交瘤细胞通过亚克隆纯化。
(7)使用间接ELISA法筛选亚克隆的杂交瘤细胞，并对筛得的阳性细胞株再次亚克隆，重复2～3次，直到每个克隆孔均鉴定为阳性时定株，对定株的杂交瘤细胞进行抗体亚类及其轻链亚型鉴定，结果如表1。
表1 单克隆抗体的亚类及其轻链亚型
(8)经产BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡致敏，1～2周后每只小鼠腹腔注射2×106个杂交瘤细胞。接种细胞一周左右，小鼠腹部开始膨大，待腹部增大到影响其正常生理活动时采集腹水，采集的腹水离心祛除红细胞和脂肪，保存于-20℃。
实施例2猪德尔塔冠状病毒N蛋白双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的建立
本发明所述猪德尔塔冠状病毒N蛋白双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，可以通过下述步骤得到：
(1)单克隆抗体抗原结合表位分析
通过ELISA叠加试验来分析不同株单克隆抗体的抗原结合位点，重组N蛋白抗原按照1μg/mL的浓度包被酶标板，按照100％饱和抗原的单克隆抗体稀释度去稀释单克隆抗体腹水，每孔加入单个或者两个不同组合的单克隆抗体，保持不同株单克隆抗体的量相同，进行间接ELISA检测，读取OD 450nm值。按照下列公式计算各单克隆抗体组合的叠加系数(additivity index，A.I)：
A1、A2和A(1+2)分别为第一个单克隆抗体、第二个单克隆抗体和两个单克隆抗体组合在一起时在同一次ELISA试验中所测得的OD 450nm值。当两个单克隆抗体是针对不同的抗原决定簇时，A(1+2)＝A1+A2，A.I＝100％；当两个单克隆抗体是针对相同的抗原决定簇时，A(1+2)＝(A1+A2)/2，A.I＝0％，考虑到实际操作和技术误差，一般认为A.I＞40％即可判定两株单克隆抗体识别的抗原决定簇不相同。鉴定结果见表2，由表中可见1A2与5C5的A.I＞40％，表明这两株单克隆抗体识别不同的抗原决定簇，可以配对用于制备猪德尔塔冠状病毒N蛋白双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。
表2 不同单克隆抗体之间的叠加系数
(2)最佳捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度的确定
以1A2为捕获抗体，HRP标记的5C5(HRP-5C5)为酶标检测抗体，建立双抗体夹心ELISA方法，对重组N蛋白进行检测。采用棋盘滴定法确定捕获抗体的包被浓度和酶标抗体的稀释度，结果见表3，确定捕获抗体1A2的最佳包被浓度为4μg/mL，检测抗体HRP-5C5的最佳稀释度为1:2500。
表3 最佳捕获抗体包被浓度和酶标抗体稀释度的确定
(2)最佳封闭条件的确定
根据已确定的最佳条件，分别以1％BSA、5％脱脂乳、5％马血清、5％类胎牛血清作为封闭液，每种封闭液均设立30min、60min、90min、120min的时间梯度，每组设3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，读取OD 450nm值。结果见表4，确定最佳封闭液为5％脱脂奶，最佳封闭时间为90min。
表4 封闭液和封闭时间的确定
(3)酶标抗体孵育时间的确定
根据已确定的最佳条件，对酶标抗体HRP-5C5的孵育时间设立30min、60min、90min、120min的梯度，每组各做3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，读取OD 450nm值。结果见表5，确定酶标抗体HRP-5C5的最佳孵育时间为60min。
表5 酶标抗体孵育时间的确定
(4)显色时间的确定
根据已确定的最佳条件，对底物显色时间设立10min、15min、20min、25min的梯度，每组各做3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，读取OD 450nm值。结果见表6，确定底物最佳显色时间为10min。
表6 显色时间的确定
(5)双对数回归拟合线的绘制
根据已确定的最佳条件，将重组N蛋白样品从4μg/mL到3.9ng/ml进行倍比稀释，同时设阴性和空白对照，每个样品和对照均设3个重复，进行双抗体夹心ELISA检测，读取OD450nm值，本底值(空白对照OD 450nm值)为0.063，阴性对照OD 450nm值为0.157。对数据进行双对数线性回归拟合分析，参数如表7，绘制的双对数回归拟合线见图7，算得回归方程(y＝a+b*x，a＝-5.39587，b＝0.64815)和线性相关系数(r＝0.9932)。考虑到实际操作和技术误差，将临界值(2倍阴性对照OD 450nm值)由0.314提高到0.4。将临界值y＝0.4和最大OD450nm值y＝2.5代入回归方程运算，确定双抗体夹心ELISA方法定量分析抗原的检测范围为80ng/mL～1.3μg/mL。
表7 双对数回归拟合分析
(6)重复性与稳定性试验
重组N蛋白从4μg/mL到3.9ng/mL进行倍比稀释，每个稀释度重复3个孔，进行双抗体夹心ELISA检测。
表8 批内和批间重复性试验变异系数
结果见表8，可见批内变异系数范围在2.7％～7.5％之间，批间变异系数范围在6.6％～9.7％之间，均小于10％。表明建立的双抗体夹心ELISA检测方法具有良好的重复性和稳定性。

Claims (3)

1.猪德尔塔冠状病毒N蛋白双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其包括:包被有单克隆抗体PDCoV-N-1A2的酶标板、阳性和阴性对照、HRP标记的检测抗体PDCoV-N-5C5、样品稀释液、显色液以及洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的单克隆抗体PDCoV-N-1A2由杂交瘤细胞株PDCoV-N-1A2分泌，杂交瘤细胞株PDCoV-N-1A2的保藏号为CCTCC NO：C2019137。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗体PDCoV-N-5C5由杂交瘤细胞株PDCoV-N-5C5分泌，杂交瘤细胞株PDCoV-N-5C5的保藏号为CCTCC NO：C2019136。
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