CN116004549A

CN116004549A - 分泌抗牛病毒性腹泻病毒e2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN116004549A
Application number: CN202211630235.XA
Authority: CN
Inventors: 李文良; 张纹纹; 何苗锋; 毛立; 程子龙; 刘鑫欢; 杨蕾蕾; 刘茂军; 白娟; 姜焱; 祝贺
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-12-19
Filing date: 2022-12-19
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明提供分泌抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于生物技术领域。杂交瘤细胞株1E2B3，保藏编号为CCTCC NO：C2022348。本发明还提供该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体及其在制备检测牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体的试剂盒、制备BVDV‑1特异性治疗剂和抗原检测试剂等方面的应用。本发明杂交瘤细胞株能够产生针对BVDV‑1 E2蛋白的单克隆抗体。该单克隆抗体的阻断ELISA方法可用于病毒感染与灭活疫苗免疫抗体的检测；该单克隆抗体具有中和病毒的活性，可用于BVDV相关疾病治疗制剂的研发；该单克隆抗体具有良好的反应性可用于Western blot检测和免疫荧光检测。

Description

分泌抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分泌抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(bovineviral diarrheavirus，BVDV)属于黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)，能感染牛引起牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovineviral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)。该病临床症状表现复杂、多样，以腹泻、发热、粘膜糜烂溃疡、怀孕母牛流产、产死胎或畸胎等症状为主要特征。它还能继发细菌、支原体等感染，造成严重损失。此外，该病毒能够经胎盘传播，产出持续感染牛(PI牛)，PI牛常年带毒、排毒，在畜群中成为主要感染源。除了牛，BVDV还可感染猪、山羊、绵羊等多种家畜，流行广泛，危害较大。BVDV包含BVDV-1和BVDV-2两种型，基于对病毒5′UTR序列的分析，并综合分析其他基因组区域，如N^pro或E2，目前已鉴定出21个BVDV-1亚型(a-u)、4个BVDV-2亚型(a-d)。

牛病毒性腹泻-粘膜病尚无特效药物。疫苗免疫、鉴定及扑杀感染牛和PI牛，是控制BVD的重要手段。目前国内已有BVDV的灭活疫苗上市并广泛使用。针对该病毒目前有多种检测方法，病原学检测方法包括病毒分离、间接免疫荧光、RT-PCR和荧光定量RT-PCR以及ELISA，血清学检测方法主要有中和试验和ELISA。基于单克隆抗体的检测方法具有很强的特异性，大大提高检测结果的准确性和可靠性。目前检测BVDV多采用RT-PCR等核酸检测方法，缺乏针对病毒抗原的检测方法。ELISA方法快速简便、适用于大规模的筛查监测，基于单克隆抗体的阻断ELISA具有较强的特异性，且无严格的物种限制，能适用于不同物种中BVDV抗体水平的检测，但是现有技术中缺乏检测BVDV抗体的高特异性和灵敏性的阻断ELISA检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌具有阻断作用的抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的是提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体。

本发明的再一目的是提供所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体在制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体检测试剂盒方面的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

分泌抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2B3，其保藏编号为CCTCC NO：C2022348。

本发明还提供所述杂交瘤细胞株1E2B3分泌的抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体。

本发明还提供所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体在制备检测牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体的试剂盒方面的应用。

进一步，所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体经HRP标记。

本发明还提供所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体在制备BVDV-1特异性治疗剂方面的应用。

本发明还提供所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体在制备BVDV-1抗原检测试剂方面的应用。

在本发明中，所述BVDV-1抗原检测试剂用于BVDV-1抗原的Westernblot检测和间接免疫荧光检测。

本发明还提供所述单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将所述杂交瘤细胞1E2B3注射到BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，离心并收集腹水上清液，纯化后得到。

有益效果：牛病毒性腹泻病毒自然感染和灭活疫苗免疫后均可诱导机体产生针对E2蛋白的特异性抗体。本发明筛选出了杂交瘤细胞株1E2B3，该杂交瘤细胞株能够产生针对BVDV-1E2蛋白的单克隆抗体1E2B3。单克隆抗体1E2B3具有多种功能：(1)该单克隆抗体可与重组蛋白E2及感染BVDV-1细胞中的E2蛋白特异结合，且具有阻断作用，经条件优化建立的阻断ELISA方法可用于病毒感染与灭活疫苗免疫抗体的检测；另外本发明的阻断ELISA方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性，为牛及其他动物BVDV感染情况的监测、疫苗免疫效果评价及疾病的诊断治疗提供技术支撑。(2)单克隆抗体1E2B3具有中和病毒的活性，可用于BVDV相关疾病治疗制剂的研发。(3)单克隆抗体1E2B3具有良好的反应性可用于BVDV-1的Western blot检测和免疫荧光检测。

附图说明

图1是BVDV E2蛋白表达鉴定的电泳图，图1A是SDS-PAGE电泳图，图1B是Westernblot结果图(His抗体检测)，其中M：蛋白质分子量标准；1：诱导后的pET-28a-E2_BCDA(BL21)裂解液上清，2：诱导后的pET-28a-E2_BCDA(BL21)裂解液沉淀；3：阴性对照蛋白；4：纯化的重组E2蛋白。

图2是Western blot鉴定单克隆抗体1E2B3的反应性的结果图，图2A中抗原为纯化的重组E2蛋白，图2B中抗原为纯化的BVDV。其中M：蛋白质分子量标准；1：阴性对照蛋白；2：纯化的重组E2蛋白；3：MDBK细胞；4：纯化的BVDV

图3间接免疫荧光检测单克隆抗体反应特性(图中标尺表示200μm)，其中A：感染BVDV-1的MDBK细胞；B：感染BVDV-2的MDBK细胞；C：正常MDBK细胞

图4是待检血清最佳稀释度的选择结果图，横坐标为血清稀释度，纵坐标为阻断率。

具体实施方式

本发明中的PBST是含0.5％(质量百分浓度)吐温-20的pH7.4、浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液。

实施例1重组E2蛋白的制备

1.重组质粒的构建与蛋白表达

根据Genbank公布的BVDV-1E2基因序列(KC695814)，选择主要抗原区域，得到如SEQ ID NO:1所示的序列，命名为E2_BCDA。合成SEQ ID NO:1所示的序列，克隆入pET-28a(+)中获得重组质粒pET-28a-E2_BCDA。将重组质粒pET-28a-E2_BCDA转化大肠杆菌感受态细胞(BL21)，挑取单菌落，经测序鉴定后，命名为pET-28a-E2_BCDA(BL21)。将pET-28a-E2_BCDA(BL21)接种至含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基培养，在37℃培养至OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,在37℃诱导表达5h，收集菌体后超声波裂解，分别收集裂解液上清和沉淀，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定重组蛋白的表达情况。将pET-28a(+)转化至大肠杆菌感受态细胞，得到对照菌。采用上述方法培养对照菌，取裂解液作为阴性对照蛋白，用于后续的试验。从图1(A)可见，重组E2蛋白(25kD)成功表达，主要以包涵体形式存在。

2.重组E2蛋白的纯化、鉴定

将重组菌pET-28a-E2_BCDA(BL21)接种至200mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中培养，在37℃培养至OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,37℃诱导5h，收集细菌于50mL离心管，在8000r/min条件下低温离心10min，弃上清，加入40mL的PBS缓冲液(pH＝7.4，0.01mol/L)将菌体重悬。超声破碎菌体，离心收集沉淀，加入含8M尿素的PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.4)溶解，然后静置过夜，按照HisTrap^TMHP(GE公司)纯化说明书纯化重组蛋白，得到纯化的重组E2蛋白。测定纯化的重组E2蛋白浓度，分装保存于-20℃。

3.重组E2蛋白的鉴定

将纯化的重组E2蛋白与上样缓冲液混合，煮沸10min后进行12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结束后采用湿转方法将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂乳的PBST封闭2h。PBST(含0.5％(质量百分浓度)吐温-20的pH7.4、浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液，下同)洗涤3次，加入1:1000稀释的His标签单克隆抗体(北京全式金生物科技有限公司)，室温孵育1h。PBST洗涤3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(北京全式金生物科技有限公司，下同)，室温孵育1h。PBST洗涤3次，按照DAB显色试剂盒说明进行显色(天根生化科技(北京)有限公司)。从图1(B)可见，纯化的重组E2蛋白泳道上在25kD处有特异性条带，纯化的重组E2蛋白可与His抗体反应，表明其正确表达且具有良好的反应性。

实施例2单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

1.病毒的纯化

在长满单层的MDBK细胞上按照MOI＝0.5接种BVDV-1JS2201株(Genbank登录号：OP856581)，培养4-5d后收获细胞培养物，反复冻融三次，4℃、8000g离心15min去除细胞碎片，吸取上清置超速离心机4℃、25000g离心30min，弃沉淀留上清，将上清继续置超速离心机4℃、180000g离心3h，弃去上清，沉淀用细胞培养物体积1/100的PBS缓冲液4℃过夜溶解，得到纯化的BVDV，于-20℃冷冻保存。

2.免疫BALB/c小鼠

将纯化的BVDV与ISA201佐剂按照体积比为1:1混合乳化后皮下多点注射免疫BALB/c小鼠(免疫剂量为100μg纯化的BVDV/只，0.2mL)。之后加强免疫两次，每次与前次免疫间隔两周，共免疫3次，免疫剂量和方法同第一次免疫。第三次免疫2周后采血，采用间接ELISA方法检测免疫小鼠的血清效价。间接ELISA方法如下：将纯化的BVDV用0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至浓度为4μg/mL，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜。PBST洗涤3次，拍干；加入含0.5％(质量百分含量)BSA的PBST封闭2h；PBST洗涤3次，拍干；加入2倍倍比稀释的免疫前后的小鼠血清，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(北京全式金生物科技有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入TMB底物显色液(湖州英创生物科技有限公司，下同)，室温避光显色10min；每孔加入50μL、2mol/L的硫酸溶液终止反应。酶标仪测定酶标板OD_450nm值，P为各检测孔的OD_450nm值，N为阴性血清(免疫前血清)的OD_450nm值，以P/N≥2.1的血清最大稀释度作为其效价。选取血清效价>51200的小鼠，细胞融合前4d采用100μg纯化的BVDV腹腔注射进行加强免疫一次。

3.细胞融合

采取PEG细胞融合方法，具体操作如下：取小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与免疫的BALB/c小鼠(本实施例标题2所选血清效价>51200的小鼠)脾脏细胞按1:5的比例充分混匀，2000rpm离心5min，弃上清，再加入适量的无血清RPMI-1640培养基(购自Hyclone)重悬，2000rpm离心5min以清洗细胞，弃上清，轻击管底，使细胞松散均匀，置37℃水浴预热，90s内加入0.8mL在37℃水浴预热的PEG2000，边加边振荡。加完后静置1min，然后在5min内按照1mL/min、2mL/min、3mL/min、3mL/min、3mL/min的速度分别加入预热至37℃的无血清RPMI-1640培养基(购自Hyclone)，37℃静置10min，2000rpm、25℃条件下离心5min，弃上清，加入含20％FBS(胎牛血清)和20％HAT的RPMI-1640培养基重悬，分装到已铺有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔板中，于5％CO₂培养箱培养。其间观察孔中细胞情况，融合5d后更换新的营养液继续培养，细胞生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，取细胞上清采用如下方法进行间接ELISA抗体检测：以0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液为包被液稀释纯化的重组E2蛋白至浓度为1μg/mL，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜。PBST洗涤3次，拍干；将细胞上清加入相应的孔内，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(北京全式金生物科技有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL、2mol/L的硫酸溶液终止反应。酶标仪测定酶标板OD_450nm值，P为各检测孔的OD_450nm值，N为SP2/0细胞培养上清的OD_450nm值，以P/N≥2.1作为阳性孔的判定标准，选择检测结果为阳性、P/N值高且生长状态良好的杂交瘤细胞株进行亚克隆。

4.杂交瘤细胞的克隆化

将筛选出的阳性孔细胞株用台盼蓝染色，计数，用含20％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基稀释成200个细胞/10mL培养基，将稀释后的细胞悬液加入提前铺有小鼠腹腔巨噬细胞的96孔板，每孔100μL，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，其间观察细胞株，待生长至96孔板孔底面积1/10～1/5时，按照本实施例标题3中间接ELISA方法及时进行ELISA检测。记录单克隆细胞的阳性孔，并进行同样的亚克隆3次以上，直至克隆后所有的克隆细胞株上清检测均为阳性且各孔检测的OD_450nm值较接近。最终筛选到了杂交瘤细胞株1E2B3。将杂交瘤细胞株1E2B3进行扩大培养，收集培养上清-20℃冻存，细胞置液氮冻存。

5.杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性测定

将获得的杂交瘤细胞1E2B3株进行连续培养传代30次、液氮冻存与复苏试验，用本实施例标题3中间接ELISA方法检测不同代次杂交瘤细胞株培养上清液中的抗体效价，发现效价均稳定在64000～128000之间，证明此杂交瘤细胞株能持续稳定地分泌抗BVDV E2蛋白单克隆抗体。

杂交瘤细胞株1E2B3的保藏信息如下：分类命名为杂交瘤细胞株1E2B3，保藏日期为2022年12月13日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址为武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022348。

实施例3单克隆抗体的特性鉴定

将杂交瘤细胞株1E2B3分泌的单克隆抗体命名为1E2B3。本实施例鉴定单克隆抗体1E2B3的特性。

1.单克隆抗体1E2B3的亚型测定

用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(购自Thermo Fisher scientific公司)测定单克隆抗体1E2B3的亚类，结果显示，该单克隆抗体重链为IgG1亚型、轻链为κ型。

2.Westernblot检测单克隆抗体1E2B3的反应特性

将杂交瘤细胞株1E2B3用含20％FBS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基扩大培养，置37℃、5％CO₂培养箱中培养3天，收集培养上清。

通过Western blot试验检测单克隆抗体1E2B3与病毒抗原(纯化的重组E2蛋白和BVDV)的反应性。将纯化的重组E2蛋白、纯化的BVDV、阴性对照蛋白、MDBK细胞分别与上样缓冲液混合，煮沸10min后进行12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结束后采用湿转方法将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，用5％的脱脂乳在37℃封闭2h。PBST洗涤3次，加入杂交瘤细胞株1E2B3的培养上清，在37℃孵育1h。PBST洗涤3次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1h。PBST洗涤3次，按照DAB显色试剂盒说明进行显色。从图2可见，杂交瘤细胞株1E2B3的培养上清可以与纯化的重组E2蛋白(25kD，图2A)和纯化的BVDV的E2蛋白(55kD，图2B)反应，因此出现特异性条带。表明杂交瘤细胞株1E2B3分泌的单克隆抗体1E2B3可以识别重组E2蛋白与天然病毒的E2蛋白，具有良好的反应性。

3.间接免疫荧光试验检测单克隆抗体1E2B3的反应特性

通过间接免疫荧光试验检测单克隆抗体1E2B3与感染细胞中BVDV的E2蛋白的反应特性。在24孔细胞培养板中长满单层的MDBK细胞上，按照MOI＝0.5分别接种BVDV-1JS2201株(Genbank登录号：OP856581)和BVDV-2C201602(Genbank登录号：MG420995)，并设置不接毒细胞作为空白对照细胞。37℃培养3d，弃培养液，加入免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司)室温固定细胞20min，PBST洗涤3次，加入免疫染色封闭液(上海碧云天生物技术有限公司)37℃封闭1h，PBST洗涤3次，分别加入杂交瘤细胞株1E2B3的培养上清，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干；加入1:500稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG(上海碧云天生物技术有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干，置荧光显微镜观察。结果如图3所示，单克隆抗体1E2B3可与BVDV-1感染的细胞发生特异性反应，呈现主要位于胞浆的绿色荧光，而与BVDV-2感染的细胞、空白对照细胞均无特异反应。这表明单克隆抗体1E2B3具有很强的特异性，且可用于BVDV-1的免疫荧光检测方法。

4.单克隆抗体1E2B3阻断ELISA检测

取杂交瘤细胞株1E2B3的培养上清进行阻断ELISA试验，鉴定单克隆抗体1E2B3能否用于阻断ELISA检测方法。使用2份BVDV-1阳性血清与2份阴性血清进行试验：以0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液为包被液稀释纯化后的重组E2蛋白至1μg/mL，包被96孔酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗涤3次，拍干；在样品检测孔中加入用PBST按照体积比为1:1稀释的血清样品，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，拍干；将杂交瘤细胞株1E2B3的培养上清加入相应的孔内，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干；加入用PBST按照体积比为1:4000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(北京全式金生物科技有限公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，拍干。加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μL、2mol/L的硫酸溶液终止反应。另外，设置空白对照孔，仅加入100μL的PBST。

终止反应后，采用酶标仪测定酶标板各孔的OD_450nm值，根据OD_450nm值计算阻断率PI(％)，PI＝100％×(空白对照孔OD_450nm值-样品检测孔OD_450nm值)/空白对照孔OD_450nm值。结果如表1所示，单克隆抗体1E2B3可以阻断BVDV阳性血清与纯化的重组E2蛋白的反应，阴性血清不能阻断，表明该单克隆抗体可用于阻断ELISA检测方法。

表1单克隆抗体阻断ELISA检测结果

实施例4HRP-1E2B3的制备

将灭菌的液体石蜡腹腔注射10～12周龄的BALB/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.5mL/只。7d后，每只小鼠腹腔注射0.2mL杂交瘤细胞株1E2B3悬液(含有2×10⁶个杂交瘤细胞)。7～10d后，收取腹部明显鼓起的小鼠的腹水，8000rpm离心20min，收集上清，间接ELISA方法(实施例2标题3)检测效价为2560000，用Protein A/G琼脂糖凝胶层析柱(上海碧云天生物技术有限公司)纯化腹水中的单克隆抗体1E2B3，然后采用辣根过氧化物酶标记试剂盒(湖州英创生物科技有限公司)将纯化的单克隆抗体1E2B3进行HRP标记，得到HRP标记的抗E2蛋白单克隆抗体1E2B3(缩写为HRP-1E2B3)。当HRP-1E2B3浓度为0.5mg/mL时，其效价为128000。分装后-20℃冻存。

实施例5阻断ELISA抗体检测方法的建立

1.阻断ELISA抗体检测方法的优化

(1)抗原的包被浓度及酶标单抗稀释度的确定

采用方阵滴定法，将纯化的重组E2蛋白用抗原包被液(0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释成0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL浓度，加入96孔酶标板中，每孔分别加入100μL，4℃孵育过夜(16h-18h)；PBST洗涤3次；每孔加入300μL含0.5％(质量百分浓度)BSA的PBST，37℃封闭2h；PBST洗涤3次；每个抗原浓度分别加入采用PBST按照稀释度为1:4稀释的BVDV-1阴性或阳性血清样品，每孔加入100μL，同时设置PBST作为空白对照，37℃孵育1h；PBST洗涤3次；每孔分别加入100μL采用PBST按照稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释的HRP-1E2B3(HRP-1E2B3稀释前浓度为0.5mg/mL)，37℃孵育1h；PBST洗涤3次；每孔加入100μLTMB底物显色液，显色10min。加入50μL浓度为2mol/L硫酸溶液终止反应。置酶标仪读取OD_450nm值。根据OD_450nm值计算阻断率PI(％)，PI＝100％×(空白对照OD_450nm值-血清样品OD_450nm值)/空白对照OD_450nm值。结果如表2所示，选择空白对照OD_450nm值接近1.0，阳性血清样品阻断率较高且阴性血清阻断率较低的条件为最佳条件；最终确定抗原的包被浓度为0.25μg/mL，效价为128000的HRP-1E2B3的稀释度为1:2000。

表2阻断ELISA方阵滴定试验

备注：表2中P为阳性血清，N为阴性血清。

(2)待检血清的最佳稀释度的筛选

将BVDV-1阴阳性血清采用PBST按稀释度为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64进行稀释，按照本实施例标题1中(1)中确定的条件检测进行检测，计算阻断率，以考察血清的最佳稀释度。结果如图4所示，BVDV阴阳性血清在稀释度为1:8时，阻断率显著区分，因此将1:8定为血清的最佳稀释度。

(3)血清最佳孵育时间的筛选

按照本实施例标题1中(2)确定的检测方法检测BVDV-1阴阳性血清，考察血清孵育时间分别为0.5、0.75h、1h、1.5h、2h、2.5h对阻断率的影响。结果如表3所示，当血清孵育1.5h时，阴阳性血清阻断率区分效果最佳，因此将其确定为血清最佳孵育时间。

表3血清最佳孵育时间的选择

血清孵育时间(h)	阳性血清阻断率(％)	阴性血清阻断率(％)
			0.5	49.66	5.47
0.75	57.76	9.63
			1	63.78	12.15
1.5	72.17	17.42
			2	77.57	25.77
2.5	78.7	30.62

(4)HRP-1E2B3最佳作用时间的筛选

按照本实施例标题1中(3)确定的检测方法检测BVDV-1阴阳性血清，仅仅改变HRP-1E2B3的孵育时间为0.5、0.75h、1h、1.5h、2h，计算阻断率，以考察HRP-1E2B3的作用时间对阻断率的影响。结果如表4所示，当HRP-1E2B3作用1h时，阴阳性血清阻断率区分效果最佳，因此将1h定为最佳作用时间。

表4酶标单抗最佳孵育时间的选择

HRP-1E2B3孵育时间(h)	阳性血清阻断率(％)	阴性血清阻断率(％)
			0.5	78.84	31.17
0.75	74.44	25.77
			1.0	70.50	18.51
1.5	67.51	20.79
			2h	60.44	19.71

(5)最佳显色时间的筛选

按照本实施例标题1中(4)确定的条件检测BVDV-1阴阳性血清，仅仅改变显色时间为5、8、10、15min，计算阻断率，以考察显色时间对阻断率的影响。结果如表5所示，当显色时间达到10min的时候，阴阳性血清阻断率区分效果最佳，所以将显色时间确定为10mim。

表5最佳显色时间的筛选

显色时间(min)	阳性血清阻断率(％)	阴性血清阻断率(％)
			5	70.13	27.05
8	71.00	20.86
			10	72.28	17.17
15	71.31	19.48

2.优化后的阻断ELISA抗体检测方法、特异性及应用

(1)优化后的阻断ELISA抗体检测方法

将纯化的重组E2蛋白用抗原包被液(0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释成0.25μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔分别加入100μL，4℃孵育过夜(16h-18h)；PBST洗涤3次；每孔加入300μL含0.5％(质量百分浓度)BSA的PBST，37℃封闭2h；PBST洗涤3次；将待检血清样品采用PBST按稀释度为1:8稀释，每孔加入100μL，同时设置PBST作为空白对照，37℃孵育1.5h；PBST洗涤3次；每孔分别加入100μL采用PBST按照稀释度为1:2000稀释的HRP-1E2B3(HRP-1E2B3稀释前效价为128000)，37℃孵育1h；PBST洗涤3次；每孔加入100μL TMB底物显色液，显色10min。加入50μL浓度为2mol/L硫酸溶液终止反应。置酶标仪读取OD_450nm值。根据OD_450nm值计算阻断率PI(％)，PI＝100％×(空白对照OD_450nm值-待检血清样品OD_450nm值)/空白对照OD_450nm值。

(2)阻断ELISA抗体检测试剂盒

阻断ELISA抗体检测试剂盒(缩写为本发明试剂盒)，包括如下组分：包被有重组E2蛋白的酶标板、PBST、HRP-1E2B3、TMB底物显色液和终止液。

包被有重组E2蛋白的酶标板：将纯化的重组E2蛋白用抗原包被液(0.05mol/L、pH9.6碳酸盐缓冲液)稀释成0.25μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔分别加入100μL，4℃孵育过夜(16h-18h)；PBST洗涤3次；每孔加入300μL含0.5％(质量百分浓度)BSA的PBST，37℃封闭2h；PBST洗涤3次，得到包被有重组E2蛋白的酶标板。

PBST：含0.5％(质量百分浓度)吐温-20的pH7.4、0.01mol/L的PBS缓冲液。

HRP-1E2B3：浓度为0.5mg/mL，制备方法见实施例4。

TMB底物显色液：购自湖州英创生物科技有限公司。

终止液：2mol/L的硫酸水溶液。

(3)Cut-off值的确定

使用本发明试剂盒按照优化后的阻断ELISA抗体检测方法(本实施例标题2(2))对87份BVDV抗体阴性的牛血清进行测定，并算出相应的阻断率。87份血清样品的平均阻断率为9.67％，标准差为5.73，所以，当待检血清的阻断率≤X+2SD＝21.13％时，该血清为阴性；当待检血清的阻断率≥X+3SD＝26.86％时，该血清为阳性；当待检血清的阻断率介于21.13％与26.86％之间时，为可疑，需要重新采集血样进行检验。

(4)特异性检验

采用本发明试剂盒对BVDV-1、BVDV-2、边界病病毒(BDV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、口蹄疫病毒(FMDV)、布鲁氏菌、副结核、牛支原体阳性血清进行阻断ELISA方法检测，根据阻断率判定其特异性。结果如表6，除BVDV-1阳性血清，其他血清检测均为阴性，证明本发明试剂盒具有良好的特异性。

表6特异性检验

血清样品

BVDV-1

BVDV-2

BDV

BPIV3

FMDV

布鲁氏菌

副结核

牛支原体

阻断率(％)

72.33

12.96

19.07

5.24

-6.34

0.92

-3.75

4.65

判定结果

阳性

阴性

(5)敏感性检验

采用本发明试剂盒检测2倍倍比稀释的BVDV-1阳性血清(中和抗体效价为256)，根据阻断率判定其特异性。结果如表7，将BVDV-1阳性血清稀释32倍仍为阳性，该稀释度对应的中和效价为8，稀释64倍时为可疑。证明本发明试剂盒与中和抗体检测敏感性一致。

表7敏感性检验

(6)临床样品检测

采用本发明试剂盒(按照本实施例标题2(2)中优化后的阻断ELISA抗体检测方法)和血清中和试验同时检测牛血清样品105份。中和试验方法如下：将状态良好的MDBK细胞用胰酶消化后用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整为2×10⁵个细胞/mL，均匀地铺到96孔细胞培养板中，放入细胞培养箱培养。待检血清56℃灭活30min后，10000g离心10min，用DMEM培养基按照体积比为1:8稀释。将BVDV悬液(BVDV-1，JS2201株)按照100TCID₅₀/50μL的接种量用DMEM稀释。将等体积的病毒液与待检血清混合，37℃孵育1h。孵育完成的待检血清与病毒混合液加入96孔细胞培养板的MDBK细胞中，每孔100μL，每份样品做4个重复。同时设置阳性血清对照、阴性血清对照、空白细胞对照和接毒细胞对照。放入细胞培养箱继续培养4-5d观察细胞病变情况，记录结果。4个孔中有2个及以上未出现病变，该血清为阳性，否则为阴性。

结果如表8所示，中和试验检测结果显示阳性样品为78份，阴性样品为27份。本发明试剂盒的检测结果为阳性血清75份，阴性血清30份。经过统计，本发明试剂盒的检测方法与血清中和试验总符合率为93.33％，说明本试剂盒方法与中和试验具有较高的符合率，可用于临床样品的检测。

表8临床样品采用本发明试剂盒与中和试验检测结果比较

实施例6单克隆抗体1E2B3的中和活性检测

将状态良好的MDBK细胞用胰酶消化后用含10％胎牛血清的DMEM培养基调整为2×10⁵个细胞/mL，均匀地铺到96孔细胞培养板中，放入细胞培养箱培养。将杂交瘤细胞株1E2B3培养上清(实施例2标题4中制备)和纯化后的单克隆抗体1E2B3分别用DMEM培养基从稀释度为1:8开始两倍倍比稀释至1:8192。将BVDV悬液(BVDV-1，JS2201株)按照100TCID₅₀/50μL的接种量用DMEM培养基稀释。将等体积的病毒液与不同稀释度的单抗或杂交瘤细胞株培养上清混合，37℃孵育1h。孵育完成后，将混合液加入96孔细胞培养板的MDBK细胞中，每孔100μL，每份样品做4个重复。同时设置BVDV-1阳性血清对照，以BVDV-1阳性血清替代单抗稀释液；阴性血清对照，以BVDV-1阴性血清替代单抗稀释液；空白细胞对照，以DMEM培养基稀释液替代单抗稀释液；接毒(BVDV-1)细胞对照，以稀释的病毒液替代单抗稀释液。放入细胞培养箱继续培养4-5d，观察细胞病变情况，记录结果。阴性血清对照出现病变，无中和作用；阳性血清对照无病变，病毒被中和；空白细胞对照无病变；接毒细胞对照出现病变；试验成立。按照Reed-Muench方法计算单克隆抗体中和抗体效价。结果表明，杂交瘤细胞株1E2B3培养上清和单克隆抗体1E2B3的中和效价分别达512和4096。表明单克隆抗体1E2B3具有中和病毒的活性，可用于BVDV相关疾病治疗制剂的研发。

E2_BCDA序列(SEQ ID NO:1)如下：

CCAGCCTGTAAACCTGACTTTTCTTACGCCATAGCCAAAAACAATGAGATCGGCCCTCTTGGAGCTACGGGCCTCACCACTCAATGGTATGAATACTCGGATGGGATGCGGCTGCAGGACACGGAAGTTGTAGTGTGGTGTAAAGATGGAGAGATCAAATATCTAATTACGTGTGAGAGGGAAGCCAGGTATCTGGCCATTTTACACACGAGAGCCCTGCCGACATCTGTAGTATTTGAAAAAATCATAAAAGGAAAAGAACAAGAGGACGTAGTTGAAATGGATGATGACTTTGAGTTCGGTCTTTGCCCGTGTGATGCTAAACCCTTGGTAAGGGGAAAATTTAATACAACACTTCTAAATGGGCCAGCTTTCCAGATGGTTTGCCCTATAGGATGGACTGGGACTGTGAGCTGTGCACTGGCTAATAAGGATACGTTAGCCTTGACCGTTGTACGAACATACACGAGGCACAAGCCGTTCCCCTATAGGCAAGGCTGCATCACCCAGAAAACCATTGGGGAAGACCTCTACAACTGT。

Claims

1.分泌抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2B3，其保藏编号为CCTCCNO：C2022348。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株1E2B3分泌的抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体。

3.权利要求2所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体在制备检测牛病毒性腹泻病毒E2蛋白抗体的试剂盒方面的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体经HRP标记。

5.权利要求2所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体在制备BVDV-1特异性治疗剂方面的应用。

6.权利要求2所述抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体在制备BVDV-1抗原检测试剂方面的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于所述BVDV-1抗原检测试剂用于BVDV-1抗原的Westernblot检测和间接免疫荧光检测。

8.权利要求2所述单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将所述杂交瘤细胞1E2B3注射到BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，离心并收集腹水上清液，纯化后得到。