CN114507644B - 一种副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体及其阻断ELISA试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白制备的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体以及制备的用于检测副猪嗜血杆菌的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被酶标版，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C202230，所述副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株所分泌，所述包被酶标板以MnSOD蛋白作为包被抗原。本发明的试剂盒以阻断ELISA法为原理，检测副猪嗜血杆菌，具有灵敏性和特异性高，重复性好，检测快速方便，易于标准化等优点，非常方便。

Description

一种副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体及其阻断ELISA试 剂盒

技术领域

本发明涉及猪呼吸道疾病检测技术领域，具体为一种副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体及其阻断ELISA试剂盒。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis,G.parasuis)作为一种条件致病菌，通常定植于正常猪只的上呼吸道。当宿主机体处于应激状态或免疫力低下时会引起某些血清型的副猪嗜血杆菌的感染从而导致格拉瑟病( disease)的发生。格拉瑟病是全球范围内流行的猪病，拥有高死亡率和高发病率，给日渐集约化养殖的企业带来了巨大经济损失。目前，已报道副猪嗜血杆菌具有15个标准血清型和众多无法分型的菌株。由于该菌各血清型之间存在较大的遗传异质性，因此筛选出各个血清型共有的且有免疫保护作用的抗原有较大难度，从而导致临床上缺乏各血清型感染检测通用的抗体检测方法，增加了副猪嗜血杆菌的感染监测和抗体水平检测的难度。

因此，建立一种能检测副猪嗜血杆菌各血清型感染的特异性检测方法至关重要。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体及其阻断ELISA试剂盒，已解决上述技术问题。

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种分泌特异性结合副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C202230。

本发明第二方面提供了一种特异性结合副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明第三方面提供了了副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体在副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白的生物检测中的应用。

本发明第四方面提供了一种检测副猪嗜血杆菌的阻断ELISA试剂盒，所述试剂盒包括：包被酶标版，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，所述包被酶标板以副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白作为包被抗原，所述单克隆抗体是针对所述MnSOD蛋白而制备的抗体；所述单克隆抗体为上述的杂交瘤细胞株分泌产生。

进一步地，所述包被抗原的浓度为0.25μg/mL。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明以重组MnSOD与副猪嗜血杆菌血清4、5、12型作为包被抗原，通过间接ELISA方法检测200份临床猪血清。重组MnSOD蛋白间接ELISA结果与三个血清型全菌ELISA结果的符合率达98.5％，且MnSOD组表现出强反应性。由western blot结果可得，MnSOD在副猪嗜血杆菌15个血清型中均表达，且与A.pleuropneumoniae,E.coli,P.multocida,B.bronchiseptica和S.suis五种猪场常见病原菌的鼠多抗不反应，特异性好。此外，MnSOD在13型中表达量最高，9、11、15型中较高，7型最少，菌株内MnSOD表达量高低与菌株毒力不呈现相关性。本发明确定了重组MnSOD具有作为建立阻断ELISA的靶标抗原的潜力，为后续建立阻断ELISA检测方法奠定了基础。

(2)以重组MnSOD为免疫原免疫Balb/C小鼠，通过细胞融合技术制备了针对重组MnSOD的特异性单克隆抗体。经过iELISA和3次亚克隆筛选阳性杂交瘤细胞，最终获得5株杂交瘤细胞株。ELISA相加试验结果表明，5株单抗均针对同一抗原表位。选取2C2单抗进行特异性分析，western blot结果显示MnSOD与单抗细胞上清发生特异性反应，不与SP2/0反应，说明特异性良好。2C2单抗在细胞瓶内传至15代时，抗体效价为25600，能够稳定分泌抗体。单抗亚型鉴定结果表明2C2重链属于IgG2a，轻链为κ型。纯化的腹水经iELISA检测和SDS-PAGE分析，腹水抗体效价>204800，且纯度>85％。本试验制备的单抗能够为后续阻断ELISA方法提供稳定且特异性好的检测抗体。

(3)本发明通过优化抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液、封闭时间、血清作用时间、酶标单抗作用浓度和作用时间、TMB底物显色时间，建立了以重组MnSOD蛋白作为包被抗原，HRP-2C2单抗作为检测抗体的阻断ELISA方法。阻断ELISA的最佳反应条件为：抗原包被浓度0.25μg/mL，0.5％BSA封闭2h，被检血清1:1稀释孵育2h，HRP-2C2单抗1:2000孵育0.5h、TMB显色15min。优化后的阻断ELISA检测50份副猪嗜血杆菌阴性血清以确定临界值，结果表明，PI≤38.22％判断为阴性，PI≥46.59％判定为阳性，38.22％<PI<46.59％判断为可疑。对建立的阻断ELISA方法进行重复性、敏感性、特异性试验，结果显示批内及批间的变异系数均<10％，重复性好；阻断ELISA方法与iELISA阳性符合率为94％，相较于iELISA能够较好区分阴阳性血清，且特异性良好。本发明建立的MnSOD抗体阻断ELISA方法有望用于副猪嗜血杆菌各种血清型感染的流行病学调查，具有对副猪嗜血杆菌感染血清学监测和全菌灭活疫苗免疫效力评估的潜力。

生物保藏说明

杂交瘤细胞株2C2于2022年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C202230。

附图说明

图1为本发明实施例1中SDS-PAGE鉴定MnSOD蛋白的表达及纯化效果图，图中各泳道为：M、非预染Marker；1、诱导后全菌；2、超裂后上清；3、超裂后沉淀；4、流穿液；5、纯化后MnSOD。

图2为本发明实施例1中四种抗原检测200份临床猪血清的间接ELISA结果示意图，图中：圆形标志代表副猪嗜血杆菌血清4型；正方形标志代表副猪嗜血杆菌血清5型；正三角形代表副猪嗜血杆菌血清12型；倒三角形代表重组MnSOD蛋白；横轴表示血清编码数，纵轴代表被检血清OD450nm值。

图3为本发明实施例1中Western blot鉴定MnSOD在副猪嗜血杆菌15个血清型内的表达结果图，图中各泳道为：MW为预染Marker；以抗GAPDH小鼠单克隆抗体为一级抗体，抗体条带在35kDa以上；用2C2单抗细胞上清孵育25kDa以下的条带。

图4为本发明实施例1中Western blot鉴定MnSOD与六种病原菌的反应性结果图，图中各泳道为：MW为预染Marker；以纯化的MnSOD为抗原，以副猪嗜血杆菌5型和其他5种猪病原菌的抗血清为一级抗体。

图5为本发明实施例2中Western blot分析单抗2C2特异性示意图，左侧A部分代表单克隆抗体细胞2C2上清为一级抗体，A部分各泳道为：M、预染Marker；1、纯化MnSOD；2、pET-28a(+)大肠杆菌蛋白表达系统。右侧B部分代表SP2/0细胞上清为一级抗体，B部分各泳道为：M、预染Marker；3、纯化MnSOD；4、pET-28a(+)大肠杆菌蛋白表达系统。

图6为本发明实施例2中SDS-PAGE鉴定纯化后腹水的示意图，图中各泳道为：M、预染Marker；1、纯化腹水。

图7为本发明实施例3中Western blot鉴定临床血清阴阳性的示意图，图中各泳道为：M、预染Marker；1、G.parasuis阴性的猪血清；2、G.parasuis阳性的猪血清；3、G.parasuis阻断值为30.94％的临床猪血清；4、G.parasuis阻断值为39.41％的临床猪血清；5、G.parasuis阻断值为43.37％的临床猪血清。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1阻断ELISA检测方法中靶标抗原的筛选

1材料和方法

1.1菌株和主要试剂

pET28a-MnSOD质粒、副猪嗜血杆菌15个标准血清型菌株、200份临床猪血清、MnSOD多抗和Pm、SS、E.coli、Bb、App全菌多抗均由本实验室保存；1ml蛋白质纯化预装柱为GE公司产品；TMB显色液、HRP-山羊抗小鼠IgG为碧云天生物公司产品；ELISA检测板购自Costar公司；IPTG、氨苄青霉素、NAD辅酶粉末由Biosharp公司提供；GAPDH单克隆抗体购自Proteintech有限公司；其他化学试剂由实验室购买的分析纯试剂现配现用。

1.2重组MnSOD蛋白的诱导表达及纯化

采用实验室构建的pET28a-MnSOD质粒及参照实验室建立的MnSOD重组蛋白诱导表达及纯化方法：

(1)复苏表达菌：将转化有pET28a-MnSOD重组质粒的大肠杆菌表达菌(BL21)菌液划线于带有卡那霉素(Kan)抗性的固体LB平板，37℃培养10-12h；挑取平板内单菌落于带有Kan抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm/min振荡培养12-14h。

(2)诱导菌种表达蛋白：复苏后，将新鲜菌液接种至LB液体培养基内，添加50mg/mLKan(体积为培养基的1/1000)，活化菌至对数生长期(OD600nm：0.6-0.8)；加入1mM IPTG(体积为培养基的1/1000)，诱导条件为：25℃，160rpm/min，8h。

(3)处理蛋白：诱导后富集菌体并用1×PBS重悬洗涤三次，最后用20mM的BindingBuffer(体积为培养基的1/10)重悬菌体。

(4)超声波破碎菌体：按照说明书对洗涤后的菌液在冰水混合物中进行超声波破碎，直至菌液澄清透光，离心沉淀后收集上清液；使用0.22μm滤器过滤上清液，4℃备用。

(5)纯化目的蛋白MnSOD：按照恒流泵、预装柱、收集器顺序组装实验装置。将一定量的ddH2O、Elution Buffer、20mM Binding Buffer、蛋白上清、60mM Wash Buffer、Elution Buffer依次通过上述实验装置；预装柱中的氯化镍与带His标签的重组MnSOD蛋白结合，富集于镍柱上；由于最后通过装置的Elution Buffer中的高浓度咪唑与MnSOD上his标签竞争Ni+的结合位点，目的蛋白MnSOD被洗脱至液体中；及时收集纯化液，暂存4℃。

(6)将上述收集的诱导后全菌液、超裂后上清液、超裂后沉淀、流穿液和纯化蛋白，经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达情况。

(7)收集的纯化液通过超滤管，将纯化液内咪唑置换成PBS，稀释至1μg/mL后，加入10％体积甘油后分装，-80℃保存。

1.3四种抗原的间接ELISA分别检测200份临床猪血清

(1)用碳酸盐缓冲液(pH：9.6)稀释至80μg/mL的4、5、12型副猪嗜血杆菌全菌裂解液以及稀释至1.5μg/mL的重组MnSOD分别包被至酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜；

(2)包被结束后弃液并用1×PBST洗涤三次，5min/次，甩干；

(3)加入200μL/孔的5％脱脂乳，37℃封闭3h；

(4)洗涤甩干同上，用PBST按1:100比例稀释过的200份临床猪血清，按照100μL/孔加入板条，37℃作用1h；

(5)洗涤甩干后，用PBST按1:5000比例稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG加入板条，100μL/孔，37℃孵育45min；

(6)洗涤甩干后，加入100μL/孔的TMB显色液，37℃避光显色10min；

(7)加入50μL/孔的2M H₂SO₄使反应终止，酶标仪读取OD450nm数值。

1.4 MnSOD在G.parasuis 15个标准血清型内表达情况

将副猪嗜血杆菌的15个标准血清型的冻干菌转接至添加有NAD和牛血清的TSA平板上，用接种环进行三区划线，37℃培养24-48h；挑取平板上的单菌落至3mL TSB培养基，加入100μL 0.1％NAD和200μL牛血清，37℃振荡培养12-24h；对复苏活化后的副猪嗜血杆菌菌株经裂解后对蛋白浓度进行定量，尽可能保证15份样品中内参蛋白(GAPDH)的表达量一致，为MnSOD蛋白的定性和定量分析提供对照。

本实验采用蛋白质免疫印迹法鉴定MnSOD在G.parasuis 15个标准血清型内表达情况。按照试剂盒配制12.5％浓缩胶和分离胶，G.parasuis 15个血清型菌株的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳后，将其转印到NC膜上；NC膜用5％脱脂乳室温封闭3h，PBST洗涤三次后，将膜沿着25-35kDa之间的位置裁开；条带在35kDa以上的膜，以1：5000稀释的GAPDH鼠单克隆抗体为一抗，条带在25kDa以下的膜，以1:100稀释的MnSOD鼠多抗(后期使用1:100稀释的2C2单抗细胞上清液)为一抗，室温作用1h；洗涤后，将两块膜与HRP-山羊抗鼠IgG抗体在室温下孵育45min；洗涤后，将膜均匀涂布发光混合液，用ECL曝光仪进行曝光分析。

1.5 MnSOD与Pm、SS、E.coli、Bb、APP多抗的反应性

本实验采用蛋白质免疫印迹法鉴定重组MnSOD与Pm、SS、E.coli、Bb、APP鼠多抗的反应性。方法同1.4，以重组MnSOD作为抗原，一抗分别为实验室保存的G.parasuis血清型5菌和上述5种病原菌的鼠多抗血清(稀释度为1:100)。

2结果

2.1重组MnSOD蛋白的诱导表达及纯化效果

MnSOD蛋白诱导表达及纯化结果见图1，蛋白大小约为27kDa，主要以上清的形式表达。使用His亲和镍柱法进行纯化，纯化的MnSOD蛋白具有较高的纯度及表达量。

2.2四种抗原检测200份临床血清的间接ELISA结果分析

重组MnSOD与副猪嗜血杆菌血清4、5、12型作为iELISA方法中的包被抗原检测200份临床猪血清，如图2所示，结果显示MnSOD与G.parasuis血清4、5、12型作为包被抗原检测的符合率达98.5％，且MnSOD组反应性极高。

2.3 MnSOD在G.parasuis 15个标准血清型内的表达结果

以MnSOD鼠多抗为一抗进行western blot试验，初步确定MnSOD在副猪嗜血杆菌15个血清型内均表达(图未呈现)。后期制备出MnSOD单抗后，2C2单抗上清和GAPDH抗体分别作为一抗孵育NC膜，对western blot结果进行灰度扫描，将抗原和抗体的结合量换算成数值进行分析，比较MnSOD在G.parasuis不同血清型内的表达量，如图3所示，结果显示MnSOD在13型中表达量最高，9、11、15型中较高，7型最少，菌株内MnSOD表达量高低与菌株毒力不呈现相关性。

2.4 MnSOD与Pm、SS、E.coli、Bb、APP多抗的反应结果

如图4所示，Western blot结果显示，重组MnSOD与Pm、SS、E.coli、Bb和APP的小鼠抗血清不反应，与副猪嗜血杆菌血清型5的小鼠抗血清反应。MnSOD蛋白对副猪嗜血杆菌具有特异性。

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)被鉴定为用于副猪嗜血杆菌抗体检测ELISA的合适抗原。iELISA抗体检测结果显示重组MnSOD与副猪嗜血杆菌血清4、5、12型作为包被抗原检测的符合率达98.5％，且MnSOD组表现出强反应性。此外，通过免疫印迹法证实MnSOD在副猪嗜血杆菌的15个血清型中均表达，且对副猪嗜血杆菌具有特异性。因此，无论菌株的血清型如何，MnSOD-ELISA均显示出可用于抗体检测以确定疫苗免疫力和进行格拉瑟病流行病学调查的潜力。

本实施例通过间接ELISA和western blot试验鉴定重组MnSOD在临床检测中具有强反应性，与副猪嗜血杆菌15个标准血清型均反应，具有种特异性，初步判断重组MnSOD具有作为建立阻断ELISA的靶标抗原的潜力。

实施例2锰超氧化物歧化酶单克隆抗体的制备及鉴定

1材料和方法

1.1细胞、实验动物和主要试剂

SP2/0细胞由本实验室保存；6-8周龄雌性BALB/c小鼠及ICR小鼠由南京青龙山动物中心提供；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、PEG4000、HAT及HT培养基均购自Sigma公司；RPMI1640购自Gibco公司；胎牛血清购自Science Cell公司；单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自Proteintech公司；其他试剂见实施例1。

1.2单克隆抗体的准备

1.2.1小鼠免疫程序

免疫对象为五只6-8周龄雌性BALB/c小鼠，同时保留一只小鼠正常饲喂，作为阴性对照。第一次免疫时，将纯化的重组MnSOD作为免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，剂量为100μg/只，对小鼠采取背部皮下多点注射；两周后进行第二次免疫，弗氏不完全佐剂乳化相同剂量蛋白，注射方法同上；两周后进行第三次免疫，佐剂、剂量、注射方法同第二次免疫。

1.2.2间接ELISA测定免疫小鼠血清抗体效价

第三次免疫后第10天，免疫小鼠和阴性小鼠尾尖采血，分别收集血液至1.5ml EP管内，37℃放置30min后转4℃过夜；次日，将EP管放入离心机内，2000rpm/min离心10min，收集血清；采用MnSOD iELISA方法检测小鼠血清的抗体效价，加入的一抗为小鼠血清，分别用PBST进行稀释，从1:100开始，做2倍比连续稀释至1:51200，将各个稀释度的小鼠血清用排枪分别加入酶标板中，其他步骤同第二章1.3，并设置阴性对照(阴性小鼠血清)、阳性对照(MnSOD多抗)。在细胞融合前3天，选取小鼠血清抗体效价大于1:10000且最高的小鼠，直接使用免疫原MnSOD进行腹腔冲击免疫，50μg/只。

1.2.3 SP2/0细胞、饲养细胞的准备

复苏SP2/0细胞之前，配制细胞营养液：1640营养液中添加20％FBS、1％双抗(青霉素和链霉素)；从液氮罐中取出冻存的SP2/0细胞，放入37-42℃的热水中，加速搅拌，直至冻存管内固体融化；将冻存管放入离心机中，配平后，1000r/min离心10min，底部沉淀即为SP2/0细胞；倒掉冻存管中液体，加入细胞营养液重悬混匀SP2/0细胞后，转至带气孔细胞瓶中，放入37℃、5％CO2的恒温箱培养；每天更换细胞营养液，根据细胞状态(即细胞面干净、圆润贴壁、长满单层)进行传代，一般每隔48h传代一次；在细胞融合前准备6瓶状态良好、长满单层的SP2/0细胞。

本实施例采用小鼠腹腔渗出细胞(主要是巨噬细胞和淋巴细胞)作为饲养细胞，可以为少量或单个细胞生长繁殖成群体的过程中提供营养和良好的生长环境。细胞融合前一天准备饲养细胞，过程如下：

(1)提前将经高压灭菌处理的解剖器械、96孔细胞板、灭菌平板和注射器放入超净台中；

(2)提前配制HAT培养液：1640营养液中添加20％FBS、1％双抗和2％HAT；

(3)脱颈处死ICR小鼠，75％酒精浸泡消毒5min；

(4)将小鼠腹部朝上固定至解剖板上，沿着腹中线剪开皮肤，钝性分离皮肤和腹膜，达到充分暴露腹腔的目的；

(5)注射器吸取10ml HAT培养液，部分液体注射至小鼠腹腔间隙，不拔出针头，镊子柄部轻轻按压小鼠腹部，使腹腔巨噬细胞充分混匀；借助腹内压抽吸腹腔中HAT培养液后拔出针头，将液体注入平皿内；若需要较多的腹腔巨噬细胞可重复以上操作；

(6)将平皿内液体补齐至50mL，混匀后铺入6块96孔细胞板，100μL/孔，置于37℃、5％CO2恒温箱中培养过夜。

(7)次日，观察饲养细胞生长状态，确定其未被污染。

1.2.4免疫脾细胞的准备和细胞融合

阳性小鼠进行眼球采血，收集血清，作为后续iELISA筛选杂交瘤细胞的阳性对照。断颈处死经冲击免疫的小鼠并使用75％酒精浸泡消毒；将其固定至解剖板，依次剪开皮肤、腹膜，取出脾脏，放入无菌平皿内；将脾脏剪碎后放入过滤网，研磨以充分释放脾细胞；用1640冲洗滤网，将脾细胞研磨液吸入50mL离心管，1000rpm/min离心10min，弃上清用1640重悬洗涤3次后进行细胞计数。

用1640培养基吹落6瓶长满单层的骨髓瘤细胞至50mL离心管中，1000rpm/min离心10min，弃上清用1640培养基重悬洗涤3次后，进行细胞计数。

采用传统方法将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合的过程如下：

(1)提前30min将HAT培养液、1640培养液和PEG4000(避光)置于37℃水浴锅加热；

(2)将脾细胞与SP2/0细胞按5:1-10:1比例混匀至50mL离心管，用无血清的1640培养液补充混合液至30mL，1000rpm/min离心10min，彻底弃上清；

(3)轻叩离心管底部，使细胞松散；将离心管置于40℃热水浴中，在45s内加入1ml预热的PEG4000(平均3秒一滴)，边加边摇晃离心管，全程注意避光操作；

(4)加完后轻轻搅拌1min，使PEG4000和细胞充分混合；缓慢加入的1640培养液以前30s每2s加1滴，后30s每1s加1滴，第二分钟加2mL，第三分钟加3mL的速度直至加完10mL。将离心管于37℃温箱中静置10min后，1000rpm/min离心10min，弃上清。

(5)使用HAT培养基重悬融合细胞，将其分别稀释至细胞浓度为5×105个/mL、1×106个/mL、1.5×106个/mL；将上述浓度的细胞分别加入6块提前铺有饲养细胞的96孔细胞板中，每种浓度铺2块板子，200μL/孔，置于37℃、5％CO2恒温箱培养。

(6)融合次日，观察细胞是否存在污染，若发生污染则用1M NaOH封闭污染孔及其周围四孔。

1.2.5阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆

阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆过程如下：

(1)融合第五天，观察细胞生长状态，及时记录有杂交瘤细胞团生长的细胞孔；将细胞孔内液体弃一半，HAT培养基补足。

(2)当观察到细胞板孔底内有长满1/4视野的细胞团时，HAT培养基对细胞孔进行全换液。

(3)培养两天后，通过iELISA方法第一次测细胞上清抗体效价以筛选阳性克隆孔，设置阳性对照和阴性对照孔(SP2/0细胞上清)，并同时用目的蛋白和无关蛋白包被的ELISA板测定细胞上清抗体效价。

(4)HT培养基对细胞孔进行全换液；培养两天后，第二次测定细胞上清抗体效价，确保孔内杂交瘤细胞能够稳定分泌抗体。

(5)以P/N值＞2.1时，判断杂交瘤细胞为阳性，经过两次ELISA鉴定，确定为阳性克隆的细胞孔，对其进行亚克隆。

(6)亚克隆前一天准备饲养细胞，方法同本实施例步骤1.2.3的SP2/0细胞、饲养细胞的准备。

(7)采用有限稀释法进行亚克隆，将长满单层的阳性克隆团吹散混匀并细胞计数，稀释到每孔一个细胞，置于37、5％CO2温箱培养。

(8)通过显微镜观察到孔内单克隆细胞团约为整孔的1/4大小时，HT培养液全换液，培养两天后对其上清进行间接ELISA检测。

(9)所有单克隆孔检测均为阳性即完成克隆化。一般至少需要进行三次亚克隆才能得到稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系。

1.2.6阳性单克隆细胞的扩大培养

将获得的能够稳定分泌抗体的阳性单克隆孔在HT培养基中逐渐扩大培养，即长满单层的细胞由96孔板(F1)转入48孔板(F2)，48孔板转入24孔板(F3)，24孔板转入12孔板(F4)，12孔板转入6孔板(F5)，6孔板转入细胞瓶(F6)中。收集F1-F6代细胞上清，进行iELISA检测，进一步筛选能够稳定分泌抗体的阳性单克隆细胞系。

1.3单克隆抗体的初步鉴定

1.3.1单克隆抗体的抗原位点分析

抗原位点分析按照Frigut等[4]报道的方法进行，先用iELISA测出5株单抗的饱和工作浓度；将各单抗稀释到饱和工作浓度后，用ELISA相加实验测定OD450nm。以MnSOD蛋白为抗原包被ELISA板，当一抗为100μL待测的McAb1或McAb2，OD450nm结果分别记录为A1或A2；当一抗为50μL McAb1和50μL McAb2，OD450nm结果记录为A1+2，其他步骤同MnSOD的间接ELISA方法。计算公式为AI％(叠加率)＝[2A1+2/(A1+A2)﹣1]×100％。AI值＞50％即判断两种McAb识别不同的抗原表位。

1.3.2单克隆抗体的特异性鉴定

本试验采用蛋白质免疫印迹法对单抗进行特异性鉴定。以纯化的MnSOD蛋白和pET28a(+)大肠杆菌蛋白表达载体对照蛋白为抗原，1:100稀释的阳性单克隆细胞上清或SP2/0上清原液为一级抗体，4℃孵育过夜，其他步骤同实施例1的步骤1.4MnSOD在G.parasuis 15个标准血清型内表达情况。

1.3.3单克隆抗体的Ig亚型鉴定

根据单克隆抗体亚型鉴定说明书操作，对获得的单克隆抗体进行鉴定，具体操作如下：

(1)取10μL 2C2单抗细胞上清和990μL 1×PBST于1.5mL离心管中混匀，然后将混合液加入检测板的反应孔中，每孔50μL；

(2)以羊抗鼠1×IgG+IgA+IgM-HRP作为反应抗体加入检测板，50μL/孔，轻轻敲击板架四周达到充分混匀的目的，室温避光反应1h；

(3)用1×PBST洗涤并甩干板子后，每孔加入100μL现配的AB液，避光显色15min；

(4)100μL/孔的终止液以终止反应；

(5)酶标仪读取OD450nm，根据说明书判断单抗亚型。

1.3.4单克隆抗体的稳定性分析

将获得的阳性单抗细胞株，进行传代培养，分别取第5、10、15、20代的细胞培养上清，通过MnSOD iELISA的方法测定其抗体效价，以鉴定单抗细胞株分泌抗体的稳定性。

1.4单抗腹水的制备、纯化及酶标单抗

为了达到免疫刺激目的，在计划注射细胞的前一周，将经灭菌的液体石蜡腹腔注射至10只10周龄BALB/c小鼠体内，剂量为500μL/只。一周后，将浓度为10⁶个/mL阳性单克隆细胞，通过腹腔注射往每只小鼠体内注入0.5ml的细胞悬液。每日观察小鼠状态，大约1周后，小鼠表现为腹部胀大，触摸时具有波动感，精神沉郁，被毛粗乱时，用12号针头刺进腹腔中采集腹水，每只小鼠可采集2-3次，每采集一次间隔一天。收集的腹水，1000rpm/min离心10min后，收集腹水。间接ELISA测定其腹水抗体效价，并暂存于-80℃保存。

腹水含有高浓度的单克隆抗体，但该液体含有许多来自小鼠腹腔的杂蛋白，需要进行进一步纯化才能应用于阻断ELISA检测方法中。因此，将采集的腹水送至金斯瑞生物科技公司进行纯化和辣根过氧化物标记，并对送回结果进行SDS-PAGE电泳分析及抗体效价测定。

2结果

2.1细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆结果

纯化的MnSOD作为免疫原免疫雌性BALB/c小鼠，选取抗体效价最高的小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合。收集杂交瘤细胞的上清液，用MnSOD间接ELISA方法进行抗体效价评估，筛选阳性杂交瘤克隆孔。经过三次亚克隆后，获得五株单克隆杂交瘤细胞系用于扩大培养。

2.2五株单抗的抗原位点分析结果

应用叠加ELISA方法检测后计算5株单抗相互叠加后的AI值，均小于50％，得到结果5株单抗针对同一抗原表位。选择抗体效价最高的单抗2C2进行后续建立阻断ELISA方法。

2.3单抗2C2的特异性鉴定结果

为了确定单克隆抗体的特异性，进行western blot实验。结果如图5，表明单抗2C2上清可与MnSOD蛋白发生特异性反应，目的条带大小约为26kDa；同时阴性对照SP2/0上清、pET-28a(+)大肠杆菌蛋白表达系统对照与重组MnSOD不发生特异性反应。

2.4单抗2C2的Ig亚型鉴定分析

由小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体2C2进行了Ig亚型鉴定。如表1所示，结果表明，单抗2C2属于IgG2a亚类，轻链类型均为κ型。

表1单抗2C2亚型鉴定结果

2.5单抗2C2的稳定性分析结果

对单抗2C2进行扩大培养后连续传代进行稳定性分析，选取第1、5、10、15、20代单抗通过iELISA方法测定上清中抗体效价。结果见表2，表明单抗2C215代内稳定性良好。

表2不同代次2C2单抗细胞培养上清抗体效价

2.6纯化腹水、酶标单抗的效价检测及纯化结果

将纯化的MnSOD稀释至1.5μg/L包被ELISA板，间接ELISA方法测得酶标单抗2C2的抗体效价为102400，纯化后腹水的抗体效价＞204800；纯化后腹水进行SDS-PAGE电泳结果如图6所示，纯度＞85％。

本实施例通过传统细胞融合技术，经过HAT和iELISA筛选阳性杂交瘤细胞、三次亚克隆筛选阳性单克隆细胞、扩大培养最终获得针对MnSOD蛋白的单克隆抗体，酶标后的单抗2C2为后续阻断ELISA检测方法提供了稳定且特异性好的检测抗体。

实施例3 MnSOD阻断ELISA检测方法的建立

1材料和方法

1.1主要试剂

HRP酶标2C2单抗；本试验建立阻断ELISA方法所用的阳、阴性血清均由实验室建立的MnSOD间接ELISA从临床血清中筛选而得；其他试剂见实施例1。

1.2阻断ELISA术式

(1)包被：通过抗原包被液即碳酸盐缓冲液(pH：9.6)稀释纯化的MnSOD蛋白至一定浓度后，以100μL/孔的剂量加入酶标板，4℃包被过夜；

(2)洗涤：用PBST洗涤酶标板，5min/次，洗涤三次后甩干板内残余液体；

(3)封闭：每孔加入200μL含5％脱脂乳的PBST，37℃封闭3h；

(4)洗涤同上，每孔加入用PBST稀释至一定浓度的待检血清，100μL/孔，37℃孵育2h；

(5)洗涤后，将100μL按一定比例稀释过的酶标单抗加入酶标孔内，37℃孵育1h；

(6)显色：洗涤后，每孔加入100μLTMB显色液，37℃避光显色10min；

(7)终止：每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液以终止显色反应，用酶标仪读取检测孔的OD450nm，阻断率计算公式：PI％＝(阴性血清OD450nm值-被检血清OD450nm值)/阴性血清OD450nm值×100％。

1.3 MnSOD建立阻断ELISA的反应条件优化

1.3.1筛选最佳抗原包被浓度和血清稀释度

根据棋盘滴定法确定MnSOD抗原的最佳包被浓度和血清的最佳稀释度。以0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL四组浓度包被板条，每组板条检测梯度稀释的阴、阳性血清样品(血清稀释度分别为1:1、1:5、1:10、1:50)，被检血清的每个稀释度做2个重复孔，其他步骤按阻断ELISA术式进行操作，最后根据OD450nm值计算阻断率。当稀释度相同时，PI值最高的即为最佳的抗原包被浓度；在同一抗原包被浓度组中，PI值最高的即为最佳的血清稀释度。另外，最佳抗原包被浓度组别中相较于其他组能较好区分不同稀释度的血清样品。

1.3.2筛选最佳封闭液

本实验分为五组，以封闭液种类为单一变量，分别为5％脱脂乳、2％明胶、2％BSA、1％BSA、0.5％BSA。将本实施例步骤1.3.1中筛选的最佳抗原包被浓度和血清稀释度应用至本试验，其他步骤依照阻断ELISA术式进行，每组使用一份阴性和三份阳性血清进行检测，且每孔做三个重复。计算阻断率的平均值后筛选出PI值最大时使用的封闭液。

1.3.3筛选最佳封闭时间

应用上述实验筛选出的反应条件，将本试验分为三组，以封闭时间为单一变量，分别为3h、2h、1h，其他步骤依据阻断ELISA术式操作，每组使用一份阴性和三份阳性血清进行检测，每孔重复三次。计算阻断血清的平均阻断率，筛选的最佳封闭时间即为PI值最大时使用的封闭时间。

1.3.4筛选最佳血清作用时间

应用上述优化后的反应条件，将本试验分为四组，以血清作用时间为单一变量，分别为2h、1.5h、1h、0.5h。每组使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断ELISA检测，每孔重复三次，计算阻断率的平均值。当PI值最大时，即为最佳血清作用时间。

1.3.5筛选最佳酶标单抗稀释度

应用上述实验优化后的反应条件,将本试验分为四组,以酶标单抗稀释度为单一变量,分别为1:2000、1:1500、1:1000、1:500。每个稀释度组使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断ELISA检测，每孔做三次重复，计算PI值，PI值最大时的稀释度即为最佳酶标单抗稀释度。

1.3.6筛选最佳酶标单抗作用时间

应用上述实验筛选出的反应条件，将本试验分为四组，以酶标单抗作用为单一变量，分别为2h、1.5h、1h、0.5h，每组使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断ELISA检测，每孔重复三次，计算阻断率的平均值。当PI值最大时，即为最佳酶标单抗作用时间。

1.3.7筛选最佳底物显色时间

应用上述实验筛选出的反应条件，将本试验分为四组，以底物显色时间为单一变量，分别为20min、15min、10min、5min。每个显色时间使用一份阴性和三份阳性血清进行阻断ELISA检测，每孔做三次重复，计算血清的平均PI值，确定最佳底物显色时间。

1.4临界值的确定

选取50份G.parasuis阴性血清，经优化的阻断ELISA程序进行检测并统计阻断率(PI)、平均值(X)和标准差(SD)，建立检测结果的判断标准。当血清样品的PI值≥X+3SD，将样品认定为阳性；当PI值<X+2SD，将样品认定为阴性；PI值介于两者之间时，判断结果可疑。

1.5 MnSOD阻断ELISA方法的可重复性

1.5.1批内可重复性

取同一批次制备的重组蛋白按照抗原最佳包被浓度包被ELISA板，其他步骤同优化后的阻断ELISA程序。选用三份临床猪血清分别为G.parasuis阴性、弱阳性和阳性血清，每份血清做5个重复，计算变异系数。根据结果，对该检测方法的批内可重复性进行判断。

1.5.2批间可重复性

取五份不同批次纯化的重组蛋白按照抗原最佳包被浓度包被ELISA板，其他步骤同优化后的阻断ELISA程序。在每批蛋白包被的ELISA板上，检测三份临床猪血清分别为G.parasuis阴性、弱阳性和阳性血清，每份血清做3个重复孔，计算变异系数，对结果进行分析。

1.6 MnSOD阻断ELISA方法对检测样品的敏感性

取临床筛选的50份副猪嗜血杆菌阳性的猪血清，利用已建立的阻断ELISA检测方法测定样品中G.parasuis阴性、阳性血清个数，并判断该方法在临床检测样本中的敏感性。

1.7 MnSOD阻断ELISA方法的特异性

取实验室制备的G.parasuis、E.coli、APP-1、Bb、PMT、SS、PRV、CSFV鼠多抗，利用已建立的阻断ELISA检测方法测定其阴、阳性，判定临床检测样本的特异性。

1.8阻断ELISA对临床样品的检测

取实验室保存的江苏、浙江、江西和山东四个地区某猪场的临床猪血清共100份，应用建立的MnSOD阻断ELISA抗体检测方法对样本进行检测，并计算阳性检出率。

2结果

2.1 MnSOD建立阻断ELISA的反应条件优化的结果

抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度见表3。结果表明，当MnSOD蛋白以0.25μg/ml包被ELISA检测板，待检样品稀释度为1:1时，PI值最大。由表4至表9结果可得，MnSOD建立阻断ELISA检测方法的优化方案为：0.5％BSA作为封闭液，37℃封闭3h；血清37℃作用2h；1:2000稀释的酶标单抗孵育0.5h；TMB避光显色15min。

表3抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的筛选

表4封闭液的筛选

表5最佳封闭时间的筛选

表6待测血清最佳作用时间的筛选

表7酶标单抗最佳作用浓度的筛选

表8酶标单抗最佳作用时间的筛选

表9 TMB显色液最佳作用时间的筛选

2.2临界值的结果

对临床50份已确定为阴性的血清进行检测，结果见表10，50份阴性血清的PI值最低为6.26％，最高为35.81％，根据公式计算得到PI≤38.22％(X+2SD)的样本被视为阴性，PI≥46.59％(X+3SD)的样本被视为阳性。

表10阻断ELISA临界值的确定

2.3 MnSOD阻断ELISA方法的可重复性结果

由表11、表12结果，批内重复变异系数在1.01％-7.24％之间，批间重复变异系数在8.81％-9.12％之间，可得批间、批内重复变异系数＜10％，重复性均良好。

表11阻断ELISA的批内重复试验结果

表12阻断ELISA的批间重复试验结果

2.4 MnSOD阻断ELISA方法对检测样品的敏感性结果

利用MnSOD iELISA方法在临床上筛选50份阳性血清，经阻断ELISA检测其阴、阳性，有2份血清显示阴性，1份显示可疑。将该3份血清通过western blot进行鉴定，结果见图7，未出现特异性条带，判断3份血清为阴性，经过计算得知阻断ELISA方法与iELISA阳性符合率为94％，相较于iELISA能够较好区分阴阳性。

2.5 MnSOD阻断ELISA方法的交叉反应结果

在确定阻断ELISA的临界值后，通过检测猪其它细菌抗体的反应性来评价阻断ELISA的特异性。E.coli、P.multocida、A.pleuropneumoniae、B.bronchiseptica、S.suis、猪瘟病毒和伪狂犬病毒阳性血清的PI值见表13，结果表明大肠杆菌和猪链球菌的PI值在38.22％和46.59％之间，判断为可疑血清。在临床试验前，使用大肠杆菌和猪链球菌菌株的裂解液上清液吸附血清过夜，可以将对结果的影响降至最低。

表4-13阻断ELISA的交叉反应试验结果

2.6阻断ELISA对临床样品的检测结果

应用经优化后的阻断ELISA方法对江苏、山东、江西、浙江四个地区部分猪场血清进行检测，如表14所示，阳性率为86.00％，其中江西地区某猪场检测副猪嗜血杆菌的阳性率高达96.55％，本方法阳性检测率较高。

表14阻断ELISA对临床部分样品的检测

本实施例建立的阻断ELISA方法，以针对MnSOD的单克隆抗体作为检测抗体，与待检测样品中的抗体竞争结合ELISA包被板中的MnSOD，能在一定程度上免受包被抗原中杂蛋白成分的干扰。当抗原包被质量浓度为0.25μg/mL，0.5％BSA作为封闭液封闭2h，被检血清以1:1稀释后反应2h以及HRP-2C2单抗稀释度为1:2000反应1h，TMB显色15min时，MnSOD-ELISA的阻断值最优；PI％≤38.22％判断为阴性血清，PI％≥46.59％判定为阳性血清；该检测方法批内及批间变异系数均<10％，重复性好；相较于间接ELISA，能够更好的区分阴阳性样本；本实施例MnSOD建立的阻断ELISA方法可以检测副猪嗜血杆菌的15个血清型，相较于间接ELISA，能更好地区分阴阳性血清，显示出应用于猪格拉瑟病诊断、疫苗效力评估和副猪嗜血杆菌感染的血清学监测的潜力。然而，特异性实验表现出MnSOD阻断ELISA方法检测链球菌和大肠杆菌时阻断值判定为可疑血清，与副猪嗜血杆菌存在一定的交叉反应。由于单克隆抗体结合蛋白上优势表位，可能存在该表位与其他菌种上蛋白表位同源性较高的问题。在临床试验前，使用大肠杆菌和猪链球菌菌株的裂解液上清液吸附血清过夜，可以将对结果的影响降至最低。

使用副猪嗜血杆菌MnSOD建立的间接ELISA实验筛选临床猪血清获得50份阴性血清。间接ELISA通常导致高灵敏性和低特异性，结果易导致假阳性，如果检测样本呈阴性，则为真阴性。

对血清背景的确认，通常是使用商业化试剂盒或特异性和敏感性更强的血清学方法如免疫印迹试验。敏感性试验时在MnSOD建立间接ELISA的基础上筛选出的阳性血清与阻断ELISA结果进行比较，选择免疫印迹试验作为最终血清背景确认的标准，从而判断该方法的敏感性。

本实施例通过各项条件优化，成功建立了以重组MnSOD蛋白作为包被抗原，HRP-2C2单抗作为诊断抗体的阻断ELISA检测方法，相较于MnSOD间接ELISA，能更好地区分阴阳性血清，且具有较好的重复性和特异性，显示出应用于大规模猪格拉瑟病诊断、疫苗效力评估和副猪嗜血杆菌感染的血清学监测的潜力。

本发明的阻断ELISA试剂盒，使用辣根过氧化物酶标记的副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体作为阻断抗体，由于单克隆抗体具有非常良好的特异性，该试剂盒比间接ELISA方法具有更好的特异性。

本发明的试剂盒用于检测副猪嗜血杆菌，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点，适合于在临床应用中进行推广，为副猪嗜血杆菌的快速检测提供可靠的技术手段。

虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (6)

1.一种分泌特异性结合副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C202230。

2.一种特异性结合副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备副猪嗜血杆菌检测试剂盒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为阻断ELISA试剂盒。

5.一种检测副猪嗜血杆菌的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，所述包被酶标板以副猪嗜血杆菌MnSOD蛋白作为包被抗原，所述单克隆抗体是针对所述MnSOD蛋白而制备的抗体；所述单克隆抗体为权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生。

6.根据权利要求5所述的阻断ELISA试剂盒，其特征在于，所述包被抗原的浓度为0.25μg/mL。