CN111398594A - 一种特异性检测黄热病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒。该诊断试剂盒包括：包被单抗YFV‑M5的微孔反应板、样品处理液、结合有标记物的单抗YFV‑M12、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液。该试剂盒能特异性的检测黄热病毒抗原，与其他黄病毒属病毒抗原无交叉反应，检测黄病毒培养上清敏感度同商品化荧光定量PCR检测试剂盒类似。

Description

一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种医用配制品，特别涉及一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒。
背景技术
黄热病毒(YFV)是以伊蚊为媒介在虫媒传染病毒，与登革病毒、西尼罗河病毒、乙脑病毒、寨卡病毒等同属黄病毒属，可致严重危害人健康的黄热病。当前主要流行于非洲和南美洲的热带、亚热带地区。近年来，由于旅游、商贸等交流增多，黄热病的传播再趋活跃，非疫区人员赴黄热病疫区而感染并死亡的病例时有报道。2016年以来我国已报道多例输入性黄热病病例。当前，黄热病在我国无爆发流行，但华南地区同黄热病毒流行地区具有类似气候、有害媒介及其人群对黄热病毒普遍易感。因此，我国输入性黄热病毒传播流行的潜在威胁不容忽视。控制其输入性传播的关键环节之一是研制高效、特异的实验室检测方法，对感染患者进行早期诊断、隔离。
目前黄热病毒感染的实验室诊断方法主要包括病毒分离、核酸检测、抗原检测和血清学检测等。其中病毒分离是黄热病毒感染诊断和血清型鉴定的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求较高。尽管病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏、更快速，但分子诊断操作相对复杂，对设备和人员要求较高，并较易发生污染导致假阳性结果，同时由于毒株的变异、潜在突变等序列改变也可能引起假阴性结果。而IgM往往在感染病毒后5-6天才开始出现，IgG在感染病毒后14天出现，不能实现快速检测，同时黄热病毒疫苗株广泛使用、黄病毒属病毒间交叉反应，导致血清学方法不能准确区分是否是由于疫苗使用或其它黄病毒感染。同时当前黄热病毒各种商品化诊断试剂并不普及。因此，建立一种简便易行的能够特异性黄热病毒感染的早期诊断试剂盒势在必行。
黄热病毒的非结构蛋白1(nonstructural protein 1，NS1)是一种相对保守的糖蛋白，有膜型和分泌型两种形式，在感染细胞中高度表达，具有很强的抗原性，且研究发现在黄热病毒感染患者或感染动物的早期血中存在高浓度的NS1循环抗原，因此检测急性期病人血清中的分泌型NS1抗原可用于早期诊断黄热病毒感染。通过基于黄热病毒NS1的抗原捕获ELISA法来检测黄热病毒的方法可分为两类，一类是以多克隆抗体的为捕获抗体或检测抗体，这类方法在不同批次的抗血清中存在很大差异，难以重复和实现实验室的标准化。另一类利用NS1的单克隆抗体来检测黄热病毒，当前尚无利用抗NS1的单克隆抗体来检测黄病毒的商品化试剂盒。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种特异性检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒。
本发明所要解决的技术问题提供一种具有高灵敏度和特异性的黄热病毒NS1抗原免疫诊断试剂盒，它可直接检测到血液标本中的YFV NS1抗原，实现黄热病毒感染的早期诊断。
为了解决以上技术问题，本发明提供一种检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒是基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液组成，其特征在于所述的捕获抗体为单抗YFV-M5，由保藏号为CGMCC-19393的杂交瘤细胞株YFV-M5分泌得到；所述的检测抗体为单抗YFV-M12，由保藏号为CGMCC-19394的杂交瘤细胞株YFV-M12分泌得到。杂交瘤细胞株YFV-M5(分类命名为SP2/0杂交瘤细胞株)和杂交瘤细胞株YFV-M12(分类命名为SP2/0杂交瘤细胞株)，分别于2020年3月16号在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏登记号分别为CGMCC-19393和CGMCC-19394。
本发明试剂盒中，所述的单抗YFV-M5和单抗YFV-M12均是IgG1亚类的免疫球蛋白，两种单抗均能特异性结合黄热病毒。所述的杂交瘤细胞株YFV-M5和YFV-M12是用重组的YFVNS1蛋白和天然的NS1蛋白交叉免疫Balb/c小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，最后用HAT培养基筛选得到。
本发明试剂盒中，所述的标记物是指能标记在抗体的非活性部位且可定量分析的物质，例如酶；而相应的显色液则含有能与所述标记物反应并产生颜色变化的物质，例如酶的底物。这些都是本领域的常识，本领域技术人员可根据这些常识轻易地选定标记物与相应的显色液，如辣根过氧化物酶及其底物过氧化氢尿素和四甲基联苯胺(简称TMB)就是ELISA试验中常用的标记物及显色液组合，也同样适用于本发明。所述的样品处理液、浓缩洗液和终止液均是双抗体夹心ELISA方法中的常用试剂，所述的阳性对照物是指黄热病毒NS1蛋白，所述的阴性对照物是不含黄热病毒NS1蛋白的空白对照物。
本发明试剂盒是一种基于双抗体夹心ELISA方法的检测试剂盒，其中所述的捕获抗体YFV-M5和检测抗体YFV-M12是从一组抗黄热病毒NS1蛋白的单克隆抗体中筛选出来的，仅能特异性结合黄热病毒，因此该试剂盒能够准确、快速地检测出黄热病毒，而同其它黄病毒属病毒如登革病毒、西尼罗河病毒以及乙型脑炎病毒均无交叉反应，且对黄热病毒具有很高的敏感度，同商品化黄热病毒核酸检测试剂盒(上海之江)具有类似的敏感度，有利于黄热病毒的早期诊断和治疗。同时，该试剂盒成本低，主要试剂均以工作液形式提供操作简便，能同时快速检测大批样品，能够有效的用于黄热病毒疫情中疑似患者初筛和日常虫媒中病毒监测。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供了一种检测黄热病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒能特异性的检测黄热病毒抗原，与其他黄病毒属病毒抗原无交叉反应，检测黄病毒培养上清敏感度同商品化荧光定量PCR检测试剂盒类似。
附图说明
图1为YFV-NS1重组蛋白的诱导表达图；
图2为免疫印记检测YFV单抗YFV-M5与各重组黄病毒属病毒NS1蛋白反应结果图；
图3为免疫荧光法检测代表性的YFV单抗YFV-M5与黄病毒属病毒感染细胞免疫反应结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
1、所述的单抗YFV-M5和YFVM-12的制备方法和鉴定结果：
(1)免疫抗原的制备
本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组YFVNS1蛋白和已灭活天然的病毒抗原。基因重组YFV NS1蛋白是用一种携带YFV NS1基因的工程菌株制备的，其制备按常规方法进行，经用镍-次氮基三醋酸金属亲和层析的方法进行纯化获得NS1抗原。将NS1蛋白纯化后，以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂定量。Western blot对纯化的重组蛋白鉴定结果显示，小鼠抗his MAb在分子量约46KDa处出现特异性的反应条带，与预测的YFV NS1分子量大小一致(如图1所示)，图1的1表示低分子量蛋白标准，2表示诱导前菌液，3表示IPTG诱导后菌液，4表示NI-NTA层析纯化前，5表示NI-NTA层析纯化后，6表示复性后YFV-NS1重组蛋白。已灭活天然的病毒抗原，是从YFV感染的病毒宿主细胞(C6/36，一种白蚊伊蚊细胞)获得。
(2)免疫小鼠
取4-6周龄雌性BALB/c小鼠，免疫原为原核表达的重组YFV NS1蛋白和天然YFVNS1蛋白。第一次采用弗氏完全佐剂与等体积YFV NS1抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射50μg，以后每10天以弗氏不完全佐剂与天然的YFV抗原或重组的YFV NS1抗原交替免疫共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射YFV NS1抗原100μg进行加强免疫。
(3)杂交瘤细胞的制备和鉴定
按1:10比例将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠脾脏细胞均匀混合后加入融合槽中，利用电融合仪器(日本NEPAGENE)按照操作说明进行融合。融合产物加入10ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基，室温800rpm离心5min，弃上清，用60ml含15％胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入10块96孔培养板上，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养。次日于融合细胞中加入120μl 2×HAT培养基。以后每3天用1×HAT培养基换液一次，当克隆长至占孔底面积的1/10时，取培养上清经间接ELISA法用NS1蛋白和YFV病毒进行双筛选。阳性克隆转至24孔培养板中扩大培养，经ELISA和免疫荧光(YFV17D感染细胞抗原片)复测仍为强阳性的克隆用有限稀释法进行克隆化。克隆化2-3次至阳性率达100％，选择分泌抗体效价高的两个细胞株扩增培养后置液氮保存，记为杂交瘤细胞株YFV M5和杂交瘤细胞株YFV M12，并分别于2020年3月16号在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏登记号分别为CGMCC-19393和CGMCC-19394。
(4)抗YFV NS1蛋白单克隆抗体亚类检测
分别利用1μg/mL的IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3抗体(Sigma，美国)包被的酶标板对YFV NS1单克隆抗体的亚型进行鉴定，详细操作如下：包被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃孵育1h，加入1∶1000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB显色液室温避光显色10min，加1M H2SO4终止反应，测450nm吸光值(A450)，OD值最高的酶标板类型即为该单克隆抗体的亚型。检测结果显示，上述两株杂交瘤细胞的培养上清均为IgG1阳性，即说明这两株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均为IgG1阳性。
(5)单克隆抗体腹水制备和纯化
腹水制备：采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体，即在小鼠体内接种杂交瘤细胞制备腹水。具体方法如下：每只小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma公司)，使瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长。小鼠腹腔注射佐剂1-2周后，将约1×106个对数生长期的杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI 1640培养基中，注入小鼠腹腔。1-2周后，用7号针头放腹水，离心后收集腹水上清，立即加入叠氮钠至终浓度为0.1％，存放于4℃备用。
单抗纯化：采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水中的抗体，操作方法如下：腹水用60mM、pH5.0醋酸缓冲液稀释2倍，室温下于30分钟内边搅拌边逐滴缓慢加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33μl辛酸，出现大量沉淀，4℃静置2小时，10000g，4℃离心30分钟，取上清，加入1/10体积的pH7.4100mM磷酸盐缓冲液，并用1N氢氧化钠调pH值至7.4，冰浴搅拌下缓慢加入硫酸铵，为每毫升液体加入0.277硫酸铵即为45％饱和度，4℃静置14小时，10000g、4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析14小时，换液三次。以考马斯亮蓝(Coomassie)蛋白分析试剂(PIERCE)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50％的甘油于-80℃保存。
(6)单克隆抗体的特异性鉴定
A间接ELISA法鉴定分别用YFV-17D、四个血清型DENV、WNV、JEV重组NS1抗原和天然的抗原包被微孔板，按照常规的间接ELISA法进行检测。即在包被的微孔板中加入本专利发明的杂交瘤细胞培养上清液，37℃孵育1h，加入1∶1000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100μl/孔37℃孵育30min，加TMB显色液室温避光显色10min，加1M H2SO4终止反应，测450nm吸光值(A450)。表1结果显示本专利发明的单克隆抗体YFV M5和YFVM12均为YFV的特异性单抗；与其它黄病毒属病毒均无交叉反应。
B间接免疫荧光鉴定分别用YFV-17D、四个血清型DENV、WNV、JEV感染C6/36细胞，当有2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的1×PBS洗细胞二遍，然后将细胞滴于无菌干燥的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酮固定10分钟后吹干，分别与阳性杂交瘤细胞培养上清和FITC标记的羊抗小鼠IgG孵育，并设立未感染病毒的C6/36细胞抗原片作为阴性对照，最后用0.25％的伊文氏蓝染色后，荧光显微镜下观察荧光图像，以荧光的强度和染色形态进行结果判定，检测抗体强度以(+～++++)计为阳性，抗体强度(±)和(-)计为阴性。利用常规方法制备YFV-17D、DENV 1-4、WNV、JEV病毒感染C6/36细胞涂片，细胞涂片经丙酮固定风干后，每孔加入相应阳性克隆培养上清，37℃孵育1h；0.1％的PBS-T洗涤5min×3次，加入工作浓度的FITC-羊抗小鼠IgG(博士德，中国)20μl/孔，37℃孵育30min，避光洗涤5min×6次；用0.25％伊文氏蓝37℃复染10min，30％甘油封片，荧光显微镜观察结果并拍照保存，并以未感染的C6/36细胞抗原片为阴性对照。结果显示，本专利发明的单克隆抗体与YFV抗原特异性结合，而与其它黄病毒属病毒均无交叉反应(如图3所示)，图3中的A表示YFV，B表示DENV1，C表示DENV2，D表示DENV3，E表示DENV4，F表示JEV，G表示WNV，H表示C6/36。
C免疫印记鉴定
10％SDS-PAGE分离DENV1 NS1、DENV3 NS1、DENV4 NS1、WNV NS1、ZIKA NS1、YFVNS1重组蛋白，利用半干转印仪将NS1蛋白转印到PVDF膜上，将PVDF膜置于1:1000稀释的YFVNS1单克隆腹水37℃孵育1h，0.1％PBS-T洗膜5min×3次；加入工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG，37℃孵育30min；洗膜5min×5次后DAB显色1min，去离子水终止显色，拍照保存实验结果。结果显示本专利发明的单克隆抗体与YFV抗原特异性结合，而与其它黄病毒属病毒均无交叉反应(如图2所示)，图2中1表示YFV NS1，2表示DENV1NS1，3表示DENV3 NS1，4表示DENV4NS1，5表示WNV NS1，6表示ZIKA NS1，7表示HismAb。
2、本发明试剂盒的组成和制备
(1)所用试剂的配制
a.浓缩洗液：含有2％Tween-20的20×PBS，即1L溶液中含有4.56g NaH2PO4，58.02gNa2HPO4.12H2O，175.3g NaCl，15磅20min高压灭菌后，加入20ml Tween-20搅匀，使用时20倍稀释；
b.阳性对照：YFV17D天然NS1抗原1∶1000稀释液；
c.阴性对照：含0.1％Tween-20的10mM PH7.4 PBS，制备方法如下：将4.56gNaH2PO4、58.02g Na2HPO4.12H2O和175.3g NaCl用水溶解并定量至1升，15磅20min高压灭菌，稀释20倍后加入0.1％Tween-20；
d.显色液：由显色液A和B组成，使用时取二者等量混匀使用。其中显色液A、B的制备方法如下：
将0.89g柠檬酸和0.16g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min，降至90℃后加TMB 0.25g，摇匀后得显示液A，于4℃闭光保存；
将9.33g柠檬酸和14.6g EDTA二钠溶于1000ml水中，115℃高压30min后，降至90℃后加0.75％过氧化氢尿素12.8ml，摇匀后得显示液B，于4℃闭光保存；
f.终止液：1M H2SO4。
(2)所述包被单抗YFV M5的微孔反应板的制备方法如下：将本发明单抗YFV M5用10mMpH7.6的磷酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，用150μl/孔包被聚苯乙烯96孔微孔板，于4℃过夜(14小时)。拍干后，每孔加入200μl/孔的0.25％酪蛋白(Sigma)的封闭液，于4℃过夜(14小时)以封闭非特异性结合位点。甩干板条，真空干燥12～24h，用铝膜袋真空包装4℃保存备用。
(3)所述辣根过氧化物酶标记的单抗YFV M12的制备方法如下：
采用改良过碘酸钠法，操作方法如下：将5mg HRP搅拌溶解于1mL双蒸水中，加入0.2mL新配0.1M过碘酸钠避光室温搅拌30min，置1mM pH4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜；次日加入0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液使PH值达9.0-9.5后，与预先调节pH至9.5的抗体10mg混合，在室温避光轻轻搅拌2-3小时，然后加入100μl新配4mg/mL硼氢化钠，4℃避光轻搅过夜(14小时)；次日将过夜(14小时)的抗体溶液用1×PBS稀释5-10倍，冰浴搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.4)，置4℃避光过夜(14小时)；12000rpm 4℃离心30min，弃上清，沉淀溶于适量1×PBS缓冲液，并置1×PBS中4℃透析过夜(14小时)，换液三次。收集结合物加入终浓度50％的2％BSA甘油-PBS保护剂，最后用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，即为工作液。
3、应用本发明试剂盒检测样品中NS1抗原
(1)检测方法
取待测的样品100μl加入YFV M5包被的聚苯乙烯96孔微量测试板中，同时设阴性对照和阳性对照，37℃温育1h，浓缩洗涤液20倍稀释后洗涤板条，洗板6次后，加入1∶1000稀释的HRP标记的单抗YFV M12，100μl/孔，37℃温育30min，同上洗板8次后，加显色液(显色液A和B等量混合，现用现配)，100μl/孔，室温避光显色10min后，加入终止液，100μl/孔，终止反应。
(2)结果判定：以空白孔调零，于450nm波长测定吸光度(A值)。阳性对照平均值≥0.50，阴性对照平均值≤0.15，实验成立。样品A值≥阴性对照A值平均值×2.1，则判为阳性，反之为阴性。
(3)样品选取及制备：
YFV17D、四个血清型DENV、WNV、JEV病毒液采用微孔滴定法(Li J,Hu DM,Ding XX,Chen Y,Pan YX,et al.(2011)Enzyme-linked immunosorbent assay-format tissueculture infectious dose-50test for titrating dengue virus.PLoS One 6:e22553.)实验确定病毒感染性滴度为4.72×109TCID50/mL、3.16×109TCID50/mL、3.16×109TCID50/mL、1.58×109TCID50/mL、1.58×109TCID50/mL、2.16×109TCID50/mL和4.78×109TCID50/mL。上述病毒液灭活后从1×109TCID50/mL开始十倍稀释多个梯度进行检测，同时上述稀释样品取200μl利用RNAiso Plus(TaKaRa,中国)，提取RNA。
选取400份健康人血清，200份DENV1核酸阳性病人血清，50份DENV2核酸阳性病人血清及10份乙脑病人IgM阳性血清进行检测。
白纹伊蚊(广州株)，在温度(26±0.5)℃、相对湿度(75±5)％、光照时间L:D＝14:10条件下，饲养至羽化，待羽化后5-7天，蚊群出现交尾现象后禁食和水17小时，喂食由昆明小鼠全血、10％葡萄糖溶液、YFV17D病毒液1：1：1组成的人工感染性血液(用高压灭菌棉球浸透，置于平皿中放入蚊笼，病毒滴度为4.72×109TCID50/mL)，蚊虫吸食人工感染性血液约2小时，-20℃冻麻后挑取饱血蚊虫饲养，约500只。感染14天随机吸取蚊虫约50只，-80℃冷冻待检。单只蚊虫采用500μl PBS溶液研磨，取上清待用。其中200μl利用RNAiso Plus(TaKaRa,中国)，提取蚊虫RNA。同时取未吸食感染性血液的白纹伊蚊100只采用500μl PBS溶液研磨后取上清待用。
参照方法制备YFV感染性动物血清。取1-3天的昆明乳鼠5窝(每窝8-10只)共60只乳鼠，颅内注射YFV-17D病毒培养液20μl/只，观察乳鼠发病情况。至第3天起有乳鼠出现行动缓慢，拒食等现象，第4天大多数乳鼠出现上述现象，乳鼠颈动脉取抗凝血，离心得血浆和血细胞。血细胞利用RNAiso Plus(TaKaRa,中国)，提取RNA。
(4)本发明试剂盒检测相关病毒的特异性和灵敏度分析
采用上述建立的方法检测上述样品。同时上述样品提取RNA，以检测YFV的商品化黄热病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)进行同步检测比较，操作步骤按照试剂盒说明书进行。
采用本发明试剂盒检测系列稀释的灭活的YFV17D病毒液、四个血清型DENV、WNV、JEV病毒液，本发明试剂盒的检测结果显示对YFV 17D病毒液的检测灵敏度高达100TCID50/ml，与其余6种黄病毒属病毒病毒培养液无交叉反应。如表1和表2所示。
表1本发明试剂盒检测倍比稀释YFV17D病毒培养液敏感性
Figure BDA0002454344140000131
表注a：本发明试剂盒的结果判定如下：样品检测值≥阴性对照平均值的2.1倍(计算为0.014×2.1＝0.3)为阳性，反之为阴性。黄热病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)结果判定如下：样品检测值≦36为阳性
表2本发明试剂盒检测黄病毒属病毒的特异性
Figure BDA0002454344140000132
Figure BDA0002454344140000141
表注a：本发明试剂盒的结果判定如下：样品检测值≥阴性对照平均值的2.1倍(计算为0.014×2.1＝0.3)为阳性，反之为阴性。
商品化的黄热病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)检测梯度对比稀释的灭活YFV17D病毒液Ct值详见表3结果。商品化黄热病毒核酸试剂盒(荧光PCR法)对YFV17D培养上清的检测灵敏度为100TCID50/ml，同本发明的试剂盒检测类似YFV17D培养上清的灵敏度。本发明试剂盒按上述判读方式检测都没有出现假阳性，说明本发明试剂盒的阳性标准是可靠的。
表3本发明试剂盒检测50只吸食含YFV17D感染性血餐蚊虫同核酸检测试剂盒结果比较
Figure BDA0002454344140000142
Figure BDA0002454344140000151
(5)本发明试剂盒临床实验
本发明试剂盒检测正常人血清标本、其它黄病毒属病毒(DENV1、DENV2和乙脑病人)的特异性本发明的试剂盒检测了400例正常人血清，用此检测结果确定本方法的临界值。对检测值进行分析，计算得平均值为0.109，标准差为0.035，以平均值加上5个标准差作为本方法的检测临界值即：0.109+0.035×5＝0.25，以大于或等于临界值作为判断检测值阳性标准，400例正常人血清均为阴性，可确定本方法的特异度为100％。检测200份DENV1核酸阳性病人血清，50份DENV2核酸阳性病人血清及10份乙脑病人IgM阳性血清,分析检测值，其平均值和标准差依次为0.11±0.02、0.09±0.02、0.12±0.03，均为阴性。
(6)本发明试剂盒虫媒样品和YFV17D感染性动物血清样品检测实验
50例YFV17D感染性血餐后白纹伊蚊中采用商品化黄热病毒核酸检测试剂盒(上海之江，荧光PCR法)检测阳性蚊虫40只(Ct值<36),阴性10只。采用本发明试剂盒检测阳性蚊虫40例(平均值和标准差为0.89±0.63)，阴性蚊虫10例(平均值和标准差为0.13±0.06)，同商品化核酸检测试剂盒一致。检测未吸食感染性血液蚊虫100只，均为阴性(平均值和标准差为0.12±0.05)。
应用商品化核酸试剂盒在60只发病乳鼠中血液中均检测到YFV RNA(Ct值<36)。采用本发明试剂盒检测阳性蚊虫40例(平均值和标准差为2.53±1.1)，同商品化核酸检测试剂盒一致。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种特异性检测黄热病毒 NS1 抗原的免疫诊断试剂盒，包括用于包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、与标记物结合的检测抗体、阳性对照物、阴性对照物、浓缩洗液、显色液和终止液；其特征在于，所述捕获抗体为YFV-M5，由保藏号为CGMCC NO ：19393的杂交瘤细胞株 YFV-M5分泌得到；所述的检测抗体为YFV-M12，由保藏号为CGMCC NO ：19394的杂交瘤细胞株YFV-M12分泌得到。
2.根据权利要求1所述的特异性检测黄热病毒 NS1 抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述标记物为辣根过氧化物酶。
3.根据权利要求1所述的特异性检测黄热病毒 NS1 抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述杂交瘤细胞株 YFV-M5和杂交瘤细胞株YFV-M12的制备，包括：用重组的 YFV NS1蛋白和天然的 NS1 蛋白交叉免疫 Balb/c 小鼠，然后用免疫后的小鼠脾细胞和商品化的小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0融合，最后用 HAT 培养基筛选得到。
4.根据权利要求1所述的特异性检测黄热病毒 NS1 抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述阳性对照物为黄热病毒NS1蛋白。
5.根据权利要求1所述的特异性检测黄热病毒 NS1 抗原的免疫诊断试剂盒，其特征在于，所述阴性对照物为不含黄热病毒 NS1 蛋白的空白对照物。
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