CN105504051B - 狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105504051B CN105504051B CN201510955395.5A CN201510955395A CN105504051B CN 105504051 B CN105504051 B CN 105504051B CN 201510955395 A CN201510955395 A CN 201510955395A CN 105504051 B CN105504051 B CN 105504051B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- seq
- antibody
- amino acid
- variable region
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 20
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 206010053317 Hydrophobia Diseases 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 claims description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 2
- 101710091977 Hydrophobin Proteins 0.000 abstract description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 6
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 7
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 7
- 101900236200 Rabies virus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 2
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229960003127 rabies vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229920006221 acetate fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000009668 clonal growth Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940021171 curative drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明的单克隆抗体与狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病原体无交叉反应，具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测样品中狂犬病联合疫苗中各有效成分的含量，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于病毒蛋白免疫分析技术领域，具体涉及狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
狂犬病是我国法定报告管理的乙类传染病，是迄今为止人类死亡率最高的急性传染病之一，其病原是狂犬病毒(Rabies virus)，人和所有温血动物对该病毒均易感。据我国疾病预防控制中心统计，2014年我国共发生狂犬病例969例，死亡病例873例。狂犬病的致死率接近100％，虽然人源抗狂犬病毒抗体药近年来有了很大的发展，但是目前仍然没有开发出非常有效的治疗性药物，因此，狂犬疫苗仍然是目前防治狂犬病的最有效的手段。
世界卫生组织(WHO)推荐的狂犬病暴露后预防措施，对狂犬病三级暴露后的预防主要是采用狂犬疫苗注射结合抗狂犬病毒免疫球蛋白的方法。疫苗质量的好坏直接影响到狂犬病的防治，但是目前普遍采用动物实验来进行疫苗的检测，费时费力，并且不同检测批次之间受动物状态的影响非常大，因此检测标准不容易控制，所以急需要一种更加简便的疫苗定量方法，能够简便、准确、重复性高地进行疫苗的定量。2014年，Ma等人开发了双抗体夹心法来定量检测EV71疫苗的方法，双抗体夹心法依托单克隆抗体特异性强、灵敏度高的特点，能够有效地检测并定量疫苗中的有效成分，逐渐成为疫苗定量的主要方法。
狂犬病毒基因组为不分节段的单股负链RNA，全长约12kb，分别编码酶蛋白(L)、糖蛋白(G)、基质蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、核蛋白(N)五个主要结构蛋白。其中，G蛋白和N蛋白含有多个抗原位点，能够诱导产生抗狂犬病毒抗体。自1978年Wiktor和Koprowski首次制备了狂犬病病毒的单克隆抗体以来，越来越多的实验室建立了狂犬病病毒的单抗杂交株，并探讨了单抗在狂犬病病毒的免疫保护机制、流行病学、蛋白的各种功能以及狂犬病诊断等方面的应用。
发明内容
本发明的目的是针对目前狂犬病依然困扰着人类的健康，且防治过程中依然存在各种难处的现状，而提供一种能与狂犬病病毒中的核蛋白特异性结合的单克隆抗体以及产生该抗体的杂交瘤细胞。本发明的单克隆抗体与狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病原体无交叉反应，具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测狂犬病毒疫苗中的有效成分的含量，具有良好的应用前景。
为实现上述目的，本发明提供下述技术方案。
本发明提供的技术方案之一是：狂犬病毒核蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供的技术方案之二是：产生如前所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明提供的技术方案之三是：如前所述的单克隆抗体经生物标记或化学标记得到的标记复合物。
本发明中，所述的生物标记为本领域常规，如可以是以酶、生物素等标记抗体，优选地，所述的生物标记为酶标记，更优选地，所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
本发明提供的技术方案之四是：如前所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒的试剂盒中的应用。
本发明提供的技术方案之五是：如前所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒抗体的试剂盒中的应用。
本发明提供的技术方案之六是：如前所述的单克隆抗体在制备预防或治疗狂犬病的药物中的应用。
本发明提供的技术方案之七是：如前所述的单克隆抗体在狂犬病毒疫苗质检中的应用。
本发明提供的技术方案之八是：包含如前所述的单克隆抗体的药物。
本发明提供的技术方案之九是：特异性检测狂犬病毒核蛋白的ELISA试剂盒，其是以单克隆抗体5H7作为包被抗体，以酶标记的单克隆抗体1C7作为检测抗体，或者，其是以单克隆抗体1C7作为包被抗体，以酶标记的单克隆抗体5H7作为检测抗体；其中，所述单克隆抗体5H7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，所述单克隆抗体1C7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
本发明提供的能够识别狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体5H7和1C7具有良好的特异性，实验表明，各克隆间识别没有交叉反应。间接ELISA表明这两个抗体具有较高的效价，因此可用于狂犬病病毒及疫苗组分的检测。此外，由于5H7和1C7分别识别狂犬病病毒核蛋白上不同的抗原决定簇。因此，可以采用双抗夹心法，分别利用特异识别的两个单克隆抗体对狂犬病病毒核蛋白进行精确定量检测。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的单克隆抗体与狂犬病病毒其他蛋白以及其他抗原和病原体无交叉反应，用于检测具有高特异性、高敏感性的优点，可以准确检测样品中狂犬病联合疫苗中各有效成分的含量，在疫苗和临床检测中将会得到广泛应用。
附图说明
图1是单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图，其中，M是蛋白分子量标准(kDa)，泳道1为BSA，泳道2为1C7，泳道3为5H7。
图2为单克隆抗体的Western blot结果图。
图3为单克隆抗体的免疫荧光结果图。
图4为检测狂犬病病毒核蛋白的ELISA法拟合曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但并不用来限制本发明的范围。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1杂交瘤细胞系的建立
一、实验材料
1、免疫原：以狂犬病病毒SRV9株作为免疫原。
2、培养基：DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma公司。
3、实验动物：Balb/c小鼠，8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。
4、其他材料：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于JacksonImmune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。
二、杂交瘤细胞系的建立
1、动物免疫
1)基础免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为100μg。
2)加强免疫：加强免疫采用抗原与弗氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含150μg抗原的生理盐水溶液。
2、杂交瘤细胞的制备
按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按10:1的比例以500g/L的PEG4000进行融合。用HAT培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接ELISA法筛选识别狂犬病病毒的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：用200μL的SP55和SP70包板，用免疫小鼠血清1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μL，最后测定450nm OD值。凡OD450值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。
3、杂交瘤细胞系的建立
重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到5株分别针对SP55、2株针对SP70的，稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。筛选得到的2株杂交瘤细胞分泌的抗体分别命名为5H7和1C7。
4、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测，结果如表1和表2所示。
表1狂犬病病毒抗体效价检测(腹水)
表2狂犬病病毒抗体效价检测(纯化抗体)
1)细胞培养液上清效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价为：1：50000～1：100000。
2)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1：500000～1：1000000。
5、杂交瘤细胞系的传代培养
将上述稳定分泌5H7和1C7的杂交瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。
以上结果表明，所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定地分泌抗狂犬病病毒核蛋白的单克隆抗体。
实施例2抗狂犬病病毒核蛋白的单克隆抗体的制备
一、抗体制备
选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔分别接种实施例1的2株杂交瘤细胞的第16代细胞，每只小鼠1×106-2×106个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。
将腹水离心(13000r/min 30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G～Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH2.7，20mM的甘氨酸缓冲液，分别得到抗狂犬病病毒的单克隆抗体，其中特异识别核蛋白的单克隆抗体命名为5H7和1C7。
二、抗体的鉴定
1、抗体纯度鉴定：
对获得的2株单克隆抗体分别进行SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95％以上，结果见图1。
2、单克隆抗体的Western验证
狂犬病病毒裂解液用12％的SDS-PAGE分离，然后用200mA电流转移2h至醋酸纤维膜上。膜用5％脱脂奶粉PBS室温封闭一小时。PBST洗两次之后，分别加入单克隆抗体作为一抗，室温孵育1h。PBS洗三次之后，膜用偶联辣根过氧化物酶的羊抗鼠IgG Fc二抗(1:2000)室温孵育1h，然后用Enhenced Chemiluminesen(GE,USA)检测免疫反应。通过Western blot实验(图2)，1C7(1号条带)和5H7(2号条带)结合的蛋白的大小相同，条带位于55kD以下，为核蛋白。
3、单克隆抗体的免疫荧光验证
应用5H7和1C7抗体做免疫荧光检测，将感染狂犬病病毒的BHK-21以及正常的BHK-21细胞用预冷的丙酮固定，然后分别加入单克隆抗体作为一抗，再加入用FITC偶联的羊抗鼠IgG Fc作为二抗，用PBS洗三次后用荧光显微镜观察。检测结果显示(见图3)，免疫小鼠血清，5H7抗体，1C7抗体，抗核蛋白抗体阳性对照均在阴性BHK细胞无荧光，在狂犬病病毒CVS株感染的BHK细胞(CVS-BHK)有荧光信号，5H7和1C7抗体在表达狂犬病病毒核蛋白的BHK细胞(N-TAP-BHK)中有荧光信号，在表达狂犬病病毒磷蛋白的BHK细胞(P-TAP-BHK)中无荧光信号，该结果验证5H7和1C7抗体为特异性识别狂犬病病毒核蛋白的抗体。
4、识别狂犬病病毒核蛋白5H7和1C7可变区序列测定
将2个克隆的细胞提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋白质的氨基酸序列。识别PRN蛋白的5H7和1C7的抗体的可变区氨基酸序列：5H7的氨基酸序列为：轻链如SEQ ID No.1所示，重链如SEQ ID No.2所示。1C7的氨基酸序列为：轻链如SEQ ID No.3所示，重链如SEQ ID No.4所示。将该序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列为2个克隆各自特异的序列。
实施例3应用纯化抗体制备抗狂犬病病毒检测试剂
ELISA双抗体夹心法：应用5H7和1C7抗体做配对实验，确定以5H7为包被抗体，用HRP标记1C7作为检测抗体，确定了ELISA检测方法，试剂盒检测灵敏度可达0.003125IU/ml，具体的结果如表3所示，根据结果制定的拟合曲线如图4所示。采用改良过碘酸钠法标记抗体。
表3ELISA法检测狂犬病病毒核蛋白的检测结果
检测方法：包被抗体5H7用pH 9.6 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液稀释成5μg/mL，在酶标板的每孔加100μL，4℃下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200μL 1％的明胶，放入37℃恒温箱中封闭2小时后，用PBST洗涤3次，拍干后干燥保存。用辣根过氧化物酶标记1C7的抗体，得1C7-HRP并保存。向酶标板中分别加入狂犬病病毒疫苗梯度稀释液100μL/孔，37℃孵育1小时，再加入1C7-HRP(1:4000稀释)100μL/，37℃孵育1小时，加入显色剂A、B各50μL/孔进行显色，37℃温育10min，加入终止液50μL/孔，进行读数。
其中显色剂A液配方为每1000mL水中加入过氧化脲1g，10.3g柠檬酸，35.8gNa2HPO4·12H2O，吐温-20100μL，pH5；B液配方为每1000mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺(TMB)700mg(40mL DMSO溶解)，10.3g柠檬酸，pH2.4。检测结果见表3，说明本申请的2个狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体具有良好的活性和特异性。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.狂犬病毒核蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.产生权利要求1所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
3.权利要求1所述的单克隆抗体经生物标记或化学标记得到的标记复合物。
4.根据权利要求3所述的标记复合物，其特征在于，所述的生物标记为酶标记，所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
5.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒的试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测狂犬病毒抗体的试剂盒中的应用。
7.权利要求1所述的单克隆抗体在狂犬病毒疫苗质检中的应用。
8.包含权利要求1所述的单克隆抗体的药物。
9.特异性检测狂犬病毒核蛋白的ELISA试剂盒，其特征在于，其是以单克隆抗体5H7作为包被抗体，以酶标记的单克隆抗体1C7作为检测抗体，或者，其是以单克隆抗体1C7作为包被抗体，以酶标记的单克隆抗体5H7作为检测抗体；其中，所述单克隆抗体5H7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述单克隆抗体1C7的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510955395.5A CN105504051B (zh) | 2015-12-17 | 2015-12-17 | 狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510955395.5A CN105504051B (zh) | 2015-12-17 | 2015-12-17 | 狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105504051A CN105504051A (zh) | 2016-04-20 |
| CN105504051B true CN105504051B (zh) | 2019-08-30 |
Family
ID=55712399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510955395.5A Active CN105504051B (zh) | 2015-12-17 | 2015-12-17 | 狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105504051B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106802348A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-06 | 广东华南联合疫苗开发院有限公司 | Sf弹状病毒N蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法 |
| CN111171145B (zh) * | 2020-01-21 | 2021-11-05 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途 |
| CN114958774B (zh) * | 2022-05-08 | 2023-10-27 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 抗狂犬病病毒单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101413948A (zh) * | 2008-11-13 | 2009-04-22 | 浙江大学 | 犬狂犬病病毒np-elisa抗体检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MX341147B (es) * | 2011-05-13 | 2016-08-09 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Anticuerpos para el tratamiento del cáncer que expresa cldn6. |
-
2015
- 2015-12-17 CN CN201510955395.5A patent/CN105504051B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101413948A (zh) * | 2008-11-13 | 2009-04-22 | 浙江大学 | 犬狂犬病病毒np-elisa抗体检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 抗狂犬病毒核蛋白荧光标记抗体的制备和初步鉴定;严家新等;《中国人寿共患病杂志》;20001020;第16卷(第5期);第1.3-1.7、2.4-2.5、3节，第59页第1段 |
| 抗狂犬病毒糖蛋白及核蛋白单抗的研制及应用;徐葛林等;《中国生物制品学杂志》;19960215;第9卷(第1期);第23页第6节，第24页第3节，表2 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105504051A (zh) | 2016-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2007074811A1 (ja) | Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法 | |
| CN103665155B (zh) | 一种抗流感病毒广谱中和性的中和分子1f2 | |
| CN105504051B (zh) | 狂犬病毒核蛋白单克隆抗体及其应用 | |
| JP2008196967A (ja) | インフルエンザウイルスｈ５亜型の免疫検出法 | |
| Chattopadhyay et al. | Development and characterization of monoclonal antibody against non-structural protein-2 of Chikungunya virus and its application | |
| Kobayashi et al. | Characterization and epitope mapping of monoclonal antibodies raised against rat hepatitis E virus capsid protein: An evaluation of their neutralizing activity in a cell culture system | |
| CN106771181A (zh) | 一种禽流感h7n9血凝素ha抗原检测 elisa 试剂盒及检测方法 | |
| CN110272488A (zh) | 猫杯状病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN113604438B (zh) | 一种抗罗非鱼湖病毒的单克隆抗体及其细胞株和应用 | |
| CN103254312B (zh) | 一种鼠源单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| de Carvalho Nicacio et al. | Neutralizing human Fab fragments against measles virus recovered by phage display | |
| CN116836270B (zh) | 一种抗蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途 | |
| CN106119209B (zh) | 一种抗肠道病毒EV71 IgA单克隆抗体及应用 | |
| EP2521735A2 (en) | Recombinant human bivalent diabody against rabies virus and uses thereof | |
| CN106701687A (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体 | |
| CN101591390B (zh) | 抗h5n1来源的禽流感病毒核蛋白np的单克隆抗体及其应用 | |
| CN103665153B (zh) | 一种抗流感病毒广谱中和性的中和分子1e1 | |
| Fayaz et al. | Development and characterization of mouse monoclonal antibodies to canine morbillivirus | |
| Munasinghe et al. | Immuno-dominant dengue NS1 peptides as antigens for production of monoclonal antibodies | |
| CN103214571A (zh) | 一种鼠源单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
| CN103374070B (zh) | 一种抗狂犬病毒的结合分子2f5 | |
| CN107011435B (zh) | 抗丙型肝炎病毒的全人单克隆抗体8d6 | |
| CN105814077A (zh) | 能够中和狂犬病毒的结合分子 | |
| KR20190138610A (ko) | 무지개송어의 면역글로불린 m에 특이적인 단클론항체 및 이의 용도 | |
| CN104892755B (zh) | 百日咳prn 蛋白单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200804 Address after: D1117, Xinhua International Plaza, 89 Dayangfang Road, Shilihe, Chaoyang District, Beijing 100122 Patentee after: BEIJING PAIDICHANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. Address before: 101111 Beijing City, Daxing District branch of Beijing economic and Technological Development Zone, 14 Street No. 99 Building No. 18 2-201B Patentee before: ABMAX BIOPHARMACEUTICALS |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211210 Address after: 101111 2-201b, building 18, No. 99, Kechuang 14th Street, economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing Patentee after: ABMAX BIOPHARMACEUTICALS Address before: D1117, Xinhua International Plaza, No. 89, Dayangfang Road, Shilihe, Chaoyang District, Beijing 100122 Patentee before: BEIJING PAIDICHANG TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231027 Address after: No. 18-2-201, No. 99, Kechuang 14th Street, Daxing District Economic and Technological Development Zone, Beijing, 101111 Patentee after: ABMAX BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 101111 2-201b, building 18, No. 99, Kechuang 14th Street, economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing Patentee before: ABMAX BIOPHARMACEUTICALS |