CN111171145B - 一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学生物抗体技术领域，提供了一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途。该单克隆抗体的轻链可变结构域包含高变区CDR1、CDR2、CDR3，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示；重链可变结构域包含高变区CDR1＇、CDR2＇、CDR3＇，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4～6所示。经检测，该单克隆抗体具有高体外中和活性、高中和指数，抗原表位靠近狂犬病病毒糖蛋白中和II表位或与位于中和II表位内，其针对的关键氨基酸位点一个为aa205，另一个由37、194和204位氨基酸共同构成，对街毒株有很好的中和能力；此外，其Tm值为70.58℃，具有较好的热稳定性，提示有可能作为抗狂犬病病毒被动免疫制剂产品或开发体外诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物抗体技术领域，涉及一株具有较高体外抗狂犬病病毒活性的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其制备方法及其在检测和中和狂犬病病毒方面的用途。
背景技术
狂犬病毒(Rabies virus,RV)属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)、狂犬病毒属(Lyssavirus)。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA，为RNA病毒，是引起狂犬病的病原体。狂犬病毒主要分为7个基因型，编码5种结构蛋白，其中糖蛋白(Glycoprotein，G)为跨膜蛋白，构成病毒表面的突起，是主要保护性抗原，可以诱导保护性抗体产生。
狂犬病病毒疫苗是预防狂犬病最有效的手段，但对于III级以上暴露，单独使用狂犬病病毒疫苗可能导致免疫失败，需要与被动免疫制剂一同使用。抗狂犬病病毒被动免疫制剂包括抗狂犬病人免疫球蛋白和马抗狂犬病病毒血清，二者均能产生有效的保护。但抗狂犬病人免疫球蛋白价格昂贵且存在伦理问题，马抗狂犬病病毒血清则存在血清病的风险，在一定程度上限制了上述产品的使用。因此需要研发新一代的抗狂犬病病毒被动免疫制剂，而抗狂犬病病毒单克隆抗体被认为是上述产品最有可能的替代品。
发明内容
本发明是为解决上述技术问题而进行的，其目的在于提供一种新型的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其关键氨基酸位点在街毒株中突变率较低，具有较高的体外抗狂犬病病毒活性，对狂犬病病毒CVS-11和CTN株中和指数较高。本发明的另一目的在于提供该单克隆抗体在狂犬病重组被动免疫制剂产品或诊断试剂开发中的用途。本发明的第三目的在于提供该单克隆抗体的制备方法。
本发明的第一方面在于，提供了一种抗狂犬病病毒单克隆抗体(编号为R42抗体)，具有：轻链可变结构域，包含高变区CDR1、CDR2、CDR3；重链可变结构域，包含高变区CDR1＇、CDR 2＇、CDR 3＇，
其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：Ala-Ser-Asn-Ile-Arg-Ser-Ser-Thr；
CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：Gly-Asp-His；
CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：Ala-Val-Trp-Asp-Asp-His-Leu-Asn-Ile-Val-Leu；
CDR 1＇的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：Gly-Ala-Ser-Thr-Asn-Ser-Tyr-Tyr；
CDR 2＇的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：Met-Asn-Tyr-Arg-Gly-Thr-Pro；
CDR 3＇的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：Ala-Arg-Val-Asp-Asn-Trp-Asn-Phe-Asp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile。
在具体形式上，该单克隆抗体选自包含有轻链可变结构域高变区和重链可变结构域高变区的片段、包含有轻链可变结构域和重链可变结构域的片段、或具有全长重链和轻链的完整抗体分子。
经检测，该单克隆抗体具有抗狂犬病病毒体外中和活性，比活为691IU/mg；该抗体对狂犬病病毒CVS-11和CTN株的中和指数分别为8.52和7.05；对该抗体的逃逸株糖蛋白测序分析表明，抗体针对狂犬病病毒糖蛋白37、194、204和205位氨基酸，其中，aa205位是主要突变位点，存在于所有突变株中；37、194和204位氨基酸是次要突变位点。除37位氨基酸位于IIb表位外，其他关键氨基酸均不在传统糖的蛋白中和表位内。
与包括全部7种基因亚型的1338株狂犬病病毒街毒株糖蛋白基因比对表明，纳入分析的1338株街毒株在上述位点仅有一个街毒株的194位氨基酸突变类型与逃逸突变株相同。
本发明的第二方面，提供了一种表达载体，该表达载体承载有上述抗狂犬病病毒单克隆抗体或编码其的核苷酸序列。
编码该单克隆抗体轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码重链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
扩增轻链可变结构域的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示，扩增重链可变结构域的上下游引物序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
本发明的第三方面，提供了抗狂犬病病毒单克隆抗体的用途，第一用途为在制备预防或治疗狂犬病药物中的用途，优选为制备狂犬病重组被动免疫制剂产品；第二用途为在在制备狂犬病毒检测试剂或检测试剂盒中的用途。
针对在制备预防或治疗狂犬病药物中的用途，本发明的第四方面提供了一种抗狂犬病病毒被动免疫制剂，包括活性成分以及药学上可接受的药物载体，所述活性成分包括抗狂犬病病毒单克隆抗体、编码该单克隆抗体的核苷酸或运载有所述抗狂犬病病毒单克隆抗体或所述核苷酸的载体。
针对狂犬病毒检测试剂或检测试剂盒中的用途，检测试剂中包括经生物标记或化学标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体；检测试剂盒中包括血液样本处理试剂以及抗狂犬病病毒单克隆抗体经生物标记或化学标记得到的标记复合物。
本发明的第五方面，提供了单克隆抗体的制备方法，简言之，从抗狂犬病病毒噬菌体库中筛选获得的一个阳性克隆，并扩增获得其抗体轻、重链可变结构域，构建全分子抗体的瞬时表达质粒后在HEK293 EBNA1细胞中瞬时表达，亲和纯化后对该单克隆抗体进行性质分析。
本发明的有益保障及效果如下：
本发明的单克隆抗体具有高体外中和活性、高中和指数，抗原表位靠近狂犬病病毒糖蛋白中和II表位或与位于中和II表位内。该抗体针对的关键氨基酸位点有两个，一个为aa205，另一个由37、194和204位氨基酸共同构成。对街毒株的分析表明，4个氨基酸位点均不是高保守位点，但抗体逃逸株的氨基酸类型基本不存在与街毒株中，仅194位氨基酸突变为Lys在街毒株中有出现，出现率为0.07％；其他三个位点均未出现与逃逸株相同的氨基酸。考虑到病毒逃逸该株抗体的中和需要205位氨基酸突变，且37、194和204位至少一个位点突变，推测该抗体对街毒株有很好的中和能力。
此外，抗体的Tm值对的工程细胞株构建具有重要指导意义。抗体的Tm值越高其稳定性越好、越容易在真核表达中获得更高的表达量。本发明筛选得到的单克隆抗体Tm值为70.58℃，具有较好的热稳定性，有利于提高表达量和维持产品的稳定性。
综上所述，该抗体具有较高体外中和活性、低病毒逃逸率、较高的Tm值，有可能作为一种抗狂犬病病毒被动免疫制剂产品或开发体外诊断试剂盒。
附图说明
图1为R42单克隆抗体非还原CE-SDS纯度测试结果；
图2为R42单克隆抗体溶解温度测试结果；
图3为R42单克隆抗体中和指数测定结果；
图4为逃逸株中发生改变的氨基酸位点；
图5为狂犬病病毒糖蛋白抗原表位和R42抗体逃逸病毒突变位点。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
一、材料
1.1细胞、病毒和载体
幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney,BSR)细胞及狂犬病病毒标准攻击毒株(challenge virus standard,CVS)均来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；狂犬病病毒CTN株由兰州生物制品研究所提供；HEK293 EBNA1细胞，购自北京协和细胞资源中心。人抗狂犬病病毒噬菌体库由兰州生物制品研究所第四研究室构建。
1.2主要试剂和设备
引物由上海生工生物工程有限公司合成；PlatinumTMTaq DNA Polymerase购自Invitrogen公司；DNA胶回收试剂盒购自Qigen公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNASynthesis Kit购自宝日生物有限公司。质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司；PEI、丙戊酸(valproic acid,VPA)、F-68和谷氨酰胺购自Sigma公司；人抗狂犬病病毒国家标准品购自中国食品药品检定研究院；FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体购自北京康思尔泰医学研究中心；DMEM、Free Style F17和新生牛血清均购自Thermo公司；抗体轻、重链瞬时表达载体pgp5con购自无锡天演生物技术有限公司；Mabselect SuRe亲和纯化介质购自GE公司；荧光显微镜购自奥林巴斯公司。
二、单克隆抗体及其制备
2.1单克隆抗体
该单克隆抗体的轻重链可变结构域的核苷酸序列分别如下：
轻链可变结构域序列(SEQ ID NO.7)：
AATTTTATGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGTGCCTCCAACATCAGAAGTAGTACTGTAAATTGGTACCGCCAAGTCCCAGGGACGGCCCCCCAACTCCTCATTTATGGTGATCATAACCGGCCCTCAGGACTCCCGGCTCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGACTCCAGTCTGAGGATGAGGCAACTTATTATTGTGCTGTATGGGATGACCACTTGAATATTGTTCTATTTGGCGGTGGGACCCAGCTGACCGTCCTC
重链可变结构域序列(SEQ ID NO.8)：
GCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCGGCCCAAGAGTGGTGAAGCCTTCGGAAACCCTGTCCCTCACGTGCAGTGTCTCTGGTGCCTCCACCAATAGCTACTACTGGCACTGGATCAGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTGGGCGTATGAATTACAGAGGGACCCCTCTATACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGCTCTCCCTGAAGGTGAGGTCTGCGACCGCTGCGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGAGAGTAGATAACTGGAACTTTGACGATGCTTTTGATATCTGGGGCCGAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA
对轻重链可变结构域序列使用Vbase2分析，得到轻重链可变结构域的高变区，结果见表1：
表1 R42抗体轻重链可变结构域Vbase2分析结果
2.2单克隆抗体制备
2.2.1抗狂犬病病毒scFv序列的获得
抗狂犬病病毒噬菌体颗粒由兰州生物制品研究所第四研究室筛选获得，该噬菌体库选择效价>10IU的30份狂犬疫苗免疫血样建库，抗体可变区基因整合在噬粒上，库容量为8.3×108。
NocI、NotcI双酶切后克隆可变区至PET-26b载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含卡那霉素的LB琼脂糖平皿，挑选克隆，使用T7启动子通用引物测序，获得scFv序列，并使用Vbase2对序列进行分析。
2.2.2真核瞬时表达及抗体亲和纯化
扩增轻链可变结构域的上下游引物序列分别为5’-GGTCTCAGTGTGAGGTGCAGCTGTT-3’(SEQ ID NO.9),5’-GGTCTCACACTTGAAGAGACGGTGAC-3’(SEQ ID NO.10)；扩增重链可变结构域的上下游引物序列分别为5’-GGTCTCAGTGTATGGCCC AGGTCACCTTG-3(SEQ IDNO.11)，5’-GGTCTCACACTTGAAGAGACGGTGACCA TTGTC-3’(SEQ ID NO.12)。
引物序列中下划线部分为BSAI酶切位点。轻链可变结构域扩增产物、重链可变结构域扩增产物、PGP5con轻链载体以及PGP5con重链载体分别使用BSAI酶切，而后将酶切后的轻链可变结构域扩增产物和酶切后的PGP5con轻链载体连接，酶切后的重链可变结构域扩增产物和酶切后的PGP5con重链载体连接，两种连接产物分别转化大肠杆菌To p10，涂布含卡那霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养后挑选克隆测序。选择测序结果符合预期的克隆，按质粒抽提试剂盒说明书进行抽提，获得抗体瞬时表达用轻、重链质粒。
HEK293 EBNA1细胞使用FreeStyle F17培养基无血清悬浮培养。待细胞生长至1.0×106个/mL以上，使用培养基将细胞稀释至1.0×106个/mL。按每1.0×106个细胞取轻链质粒0.4μg、重链质粒0.2μg，GFP指示质粒0.012μg，混匀后加入100μl培养基中，静置5min；加入2.37μg PEI，混匀，室温静置15min，加入稀释好的细胞中，5％CO2，37℃，220r/min培养120h。10000g，离心10min；取上清，使用Mabselect SuRe介质纯化表达的抗体，PBS溶液洗杂后，pH 3.5的乙酸钠溶液洗脱，获得纯化的抗狂犬病病毒单克隆抗体。纯化的抗体使用GENanoVue微量分光光度计中IgG法测定蛋白质浓度。
三、单克隆抗体性质检测
3.1抗体纯度分析
抗体纯度使用非还原CE-SDS法分析。使用CE-SDS检测纯化的单克隆抗体纯度。非还原CE-SDS样品稀释至1mg/mL，加入5％体积的0.8mol/L碘乙酰胺，70℃加热15min，进样后15kV运行15min，检测A214 nm值。检测结束后对图谱进行积分，计算抗体单体纯度。
经检测，瞬时表达的全分子抗体蛋白质浓度为1106mg/ml；纯化后抗体非还原CE-SDS检测结果见图1，真核瞬时表达抗体纯化后抗体单体纯度为92.52％。
3.2抗体体外中和活性分析
抗狂犬病病毒单克隆抗体体外抗狂犬病病毒中和活性分析使用快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)进行，检测方法参考中华人民共和国药典。将抗狂犬病病毒国家标准品、待检测单克隆抗体分别3倍连续稀释，各取50μL加入96孔细胞培养板中，每孔加入50μL 80％～95％细胞被感染剂量狂犬病攻击病毒标准株(CVS-11)，37℃中和1h后，加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，5％CO2，37℃培养24h。弃去上清后，PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮固定15min；弃去丙酮，室温干燥30min。FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察不同稀释度下待检测样品及标准品的荧光灶比例，计算样品体外抗狂犬病病毒活性。
经测定，该抗体对CVS-11株的体外中和活性为625IU/ml，比活为691IU/mg。
3.4抗体热稳定性分析
纯化后抗体使用示差扫描荧光法(differential scanning fluorimetry，DSF)测定抗体Tm(Melting Temperatures)进行稳定性分析。将待检测抗体稀释至1.0mg/ml，0.5mg/ml和0.25mg/ml，SYPRO Orange稀释400倍。抗0.5mg/ml的CD52单克隆抗体为对照品，该抗体Tm值已通过差示扫描量热仪测定，主要Tm值为77.14℃，其他两个峰Tm值分别为72.3℃6和83.39℃。分别取20μl稀释待检测抗体、对照抗体和PBS溶液，加入5μl稀释好的SYPROOrange，混匀。定量PCR仪使用“Melt Curve”方法，设置检测通道CY3，37℃维持5min后，1％速率升温至95℃。检测结束后，导出检测数据，取通道3的荧光信号值，以温度为自变量求导。数据导入EXCEl中，绘制溶解曲线，以峰极值出现的温度为抗体的Tm值。
DSF法测定抗体温度结果如表2所示：R42抗体仅检测到一个主要峰，Tm值为70.58±0.31℃；对照抗体检测到两个峰，Tm值分别为72.48℃和78.21℃，与差式扫描量热法检测结果基本一致(Tm1：72.36±0.06℃，Tm2：77.14±0.07℃，Tm3：83.39±0.04℃)，但少一个次要峰。
3.5病毒培养和滴度测定
3.5.1病毒培养
BSR细胞生长至铺满细胞板，0.5％胰酶消化后，使用含10％小牛血清的DMEM培养基按1：4比例传代，MOI＝0.1接种CVS或CTN毒株，5％CO2，37℃培养24h后调整培养温度为34℃，继续培养4天。收获病毒培养液，反复冻溶三次，使用0.45μm膜过滤，50Kda超滤离心管浓缩约20倍，0.22μm除菌过滤，分装后-70℃保存。
3.5.2病毒滴度测定
BSR细胞生长至铺满细胞板，0.5％胰酶消化后，使用含10％小牛血清的DMEM培养基重悬细胞，使细胞密度为1.0×106个/mL。重悬后细胞加入96孔板中，每孔50μL。待检测狂犬病病毒CTN株或CVS-11株使用含10％小牛血清的DMEM培养基3倍连续稀释，取50μL稀释后病毒加入含BSR细胞的96孔板中，每个稀释度2孔作为平行。每个检测孔中补充50μL培养基，5％CO2，37℃培养24h。弃去上清后，PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮固定15min；弃去丙酮，室温干燥30min。FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察不同稀释度细胞感染比例和荧光灶数，按100000个细胞/孔计算每孔细胞数。
病毒滴度(FFU/ml)＝稀释后病毒荧光灶数×对应孔病毒稀释倍数×20×100000。
CVS-11和CTN病毒滴度分别测定两次，结果见表2，以两次测量的平均值作为病毒滴度，CVS-11病毒滴度为5.28×109FFU/ml；CTN病毒滴度为4.74×109FFU/ml。
表2病毒滴度测定结果
3.6病毒中和指数测定
取测好滴度的CVS-11或CTN病毒加入96孔板中，加入病毒量为CVS-11每孔加入约5×108FFU，CTN每孔约1×107FFU；加入抗狂犬病病毒单克隆抗体并补充培养基至100μL，使抗体终浓度约为10IU/ml，37℃孵育1h。使用DMEM为阴性对照。加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，5％CO2，37℃培养24h。弃去上清后，PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮固定15min；弃去丙酮，室温干燥30min。FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察不同稀释度细胞感染比例和荧光灶数。计算中和指数(Neutralization index，NI)
NI＝log[加入病毒数(FFU)]-log[抗体中和后病毒数(FFU)]
NI高于2.5则认为抗体可以有效中和病毒。
按病毒滴度计算，CTN株病毒使用2.5μL病毒与抗体中和，含病毒约1.19×107FFU；CVS-11株使用10.0μL病毒与抗体中和，含病毒约5.28×108FFU。试验结果见图3。CVS-11中和后仅观察到1个荧光灶(图3中圆圈所示)，CTN中和后未观察到荧光灶。R42抗体对CVS-11株中和指数为8.72，对CTN株中和指数高于7.05。
3.7逃逸病毒培养
将CVS-11株病毒10倍连续稀释，取107～104FFU/ml稀释度的病毒50μL，加入4IU/ml的抗狂犬病病毒单克隆抗体50μL，37℃孵育1h。加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，5％CO2，37℃培养4h，弃去培养基，加入含2IU/ml单克隆抗体的培养基150μL，继续培养72h，收获病毒培养上清。取50μL培养上清，加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，培养基50μL，5％CO2，37℃培养24h。弃去上清后，PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮固定15min；弃去丙酮，室温干燥30min。FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察不同稀释度细胞感染比例和荧光灶数。选择感染剂量在10％～50％之间的病毒，为P1代逃逸病毒。
取P1代逃逸病毒50μL，4IU/ml的抗狂犬病病毒单克隆抗体50μL，37℃孵育1h。加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，5％CO2，37℃培养4h，弃去培养基，加入含2IU/ml单克隆抗体的培养基150μL，继续培养72h，收获病毒培养上清，为P2代逃逸病毒。
取P2代逃逸病毒100μL，4IU/ml的抗狂犬病病毒单克隆抗体100μL，37℃孵育1h。加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液200μL，5％CO2，37℃培养4h，弃去培养基，加入含2IU/ml单克隆抗体的培养基500μL，继续培养72h，收获病毒培养上清，为P3代逃逸病毒。
取P3代逃逸病毒400μL，4IU/ml的抗狂犬病病毒单克隆抗体400μL，37℃孵育1h。加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液500μL，5％CO2，37℃培养4h，弃去培养基，加入含2IU/ml单克隆抗体的培养基2mL，继续培养72h，收获病毒培养上清，为P4代逃逸病毒。
取P4代逃逸病毒50μL，2倍连续稀释至128倍。加入1.0×106个/mL的BSR细胞悬液50μL，培养基50μL，5％CO2，37℃培养24h。弃去上清后，PBS清洗细胞1次，加入200μL预冷的80％丙酮固定10min；弃去丙酮，室温静置15min。FITC标记的抗狂犬病病毒核蛋白抗体使用PBS 200倍稀释后，每孔加入100μL，37℃孵育1h，弃去液体，使用PBS洗涤3次。荧光显微镜下观察不同稀释度细胞感染比例和荧光灶数。
3.8逃逸病毒糖蛋白序列分析
CVS-11及逃逸突变病毒使用RNaeasy试剂盒按说明书提取总RNA，使用6nt随机引物，按照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成。cDNA合成引物序列为上游引物5’-AAGTTCCCCATTTACACGATACCA-3’(SEQ ID NO.13)；下游引物5’-CTCCAACTTTCAAACACCCT-3’(SEQ ID NO.14)，扩增体系包含PCR缓冲液5μL，10mM dNTP混合液1μL，50mM MgSO4溶液2μL，10μM的上下游引物各2μL，cDNA模板2μL，Platinum Taq DNA聚合酶0.2μL，灭菌蒸馏水37.8μL。PCR扩增程序为，94℃，30s起始变性；变性：94℃，15s，复性：55℃，15s，延伸：68℃，2min，30个循环。扩增结束后使用2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，目的条带切胶回收。DNA片段按说明书克隆至pMD 18-T载体，转染E.coil DH5α细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑选10个克隆测序。
P4代逃逸株稀释8倍后即感染80％以上的BSR细胞，表明突变逃逸株已适应2IU/ml浓度的抗体，在该抗体浓度下可以良好的扩增。PCR扩增P4带突变株糖蛋白基因后构建克隆，挑取10个克隆的测序，其中9个测序正常。分析结果见表3和图4。共有4个氨基酸位点发生突变，突变率从高到低依次为205、37、194和204；其中37位氨基酸位于糖蛋白中和表位IIb；194、204和205位氨基酸均靠近IIa表位区。其中，所有序列在205位氨基酸均发生突变；序列在37、194和204位氨基酸突变互不重叠，所有序列在上述氨基酸中有一个氨基酸上发生了突变。推测该抗体表位在中和表位II附近或针对表位II。
表3突变病毒氨基酸测序结果
| 位点 | 37 | 194 | 204 | 205 |
| CVS中氨基酸类型 | Asn | Asn | Ser | Lys |
| 突变形式 | Asn→Lys | Asn→Lys | Ser→Arg | Lys→Asn |
| 突变率 | 44.4％ | 33.3％ | 22.2％ | 100.0％ |
3.9抗体针对的关键氨基酸分析
3.9.1逃逸株关键氨基酸位点分析
使用DNAStar比对CVS-11株原始序列和逃逸突变序列的氨基酸差异，确定该株单克隆抗体针对的氨基酸。
3.9.2数据库检索
从Pubmed“identical protein”数据库中检索2010年1月1日后发表的狂犬病病毒糖蛋白序列，选择长度为524AA的序列，共计得到1338个。使用DNAstar对序列进行比对。统计逃逸株关键氨基酸位点在街毒株中相同位点上氨基酸分布情况。同时分析街毒株序列基因型分布。
对1338个街毒株的糖蛋白序列分析表明，上述四个位点均不是高度保守的氨基酸位点，街毒株中最大保守率低于80％。但所有分析的街毒株在205、37和204位氨基酸上没有出现一个与逃逸株该位点氨基酸相同的，194位氨基酸上有一个街毒株出现与逃逸株相同氨基酸突变，出现概率0.07％。上述四个位点中氨基酸在街毒株中出现的情况见表4。
表4 1388株街毒株37、194、204及205位氨基酸分布
*与逃逸株中氨基酸突变类型一致
4、讨论
通过上述性能分析结果可知，该单克隆抗体具有高体外中和活性、高中和指数，抗原表位靠近狂犬病病毒糖蛋白中和II表位或与位于中和II表位内。该单克隆抗体比活为691IU/mg；对CVS-11株的中和指数为8.72，对CTN株中和指数高于7.05；抗原表位的主要氨基酸位点为205、37、194和204；所有测序的序列中，205位100％发生突变；所有序列均在aa37、aa194和aa204之中的一个位点上发生了突变。因此，推测该抗体针对的关键氨基酸位点有两个，一个为aa205，另一个由37、194和204位氨基酸共同构成。对街毒株的分析表明，4个氨基酸位点均不是高保守位点，但抗体逃逸株的氨基酸类型基本不存在与街毒株中，仅194位氨基酸突变为Lys在街毒株中有出现，出现率为0.07％；其他三个位点均未出现与逃逸株相同的氨基酸。考虑到病毒逃逸该株抗体的中和需要205位氨基酸突变，且37、194和204位至少一个位点突变，推测该抗体对街毒株有很好的中和能力。
狂犬病病毒糖抗原位点主要为I、II、III、IV、G1和G5，他们在糖蛋白上的分布如图5所示。本发明R42抗体逃逸株突变位点集中在II表位内和IIa表位附近，因此推测该株抗体针对抗原表位II或者位于表位II附近。上述四个氨基酸除aa37外，其余氨基酸均不在传统的II表位(IIb34-42,IIa198-200)内，如该抗体针对表位II，则推测其突变逃逸的机制是由在空间上处于不连续位置的构象表位周围氨基酸发生改变而导致构象表位发生变化。
CVS-11和CTN株狂犬病病毒对该抗体具有非常低的逃逸率，与文献报道的其他抗狂犬病病毒抗体相比，R42具有明显更高的中和指数，针对CVS-11和CTN中和指数分别为8.72和7.05。如CL184两株单抗CR57和CRJB对CVS-11中和指数均为6.8[7]；SYN23两株单抗CTB011和CTB012对CVS-11中和指数分别为3.78和1.33，两株联合使用为4.09[8]；Lafon M等对4株单克隆抗体分析，其中和指数在4.2～4.5之间，两株联合使用在4.5～7.0之间。
Kramer等认为，人抗狂犬病病毒主要针对狂犬病毒表位I和表位III，针对表位II的抗体很少，这可能与表位II在人类中的免疫原性较低有关[10]。然而，梁米芳等从中国人特免库中筛选出抗体大部分针对表位II；本文从中国人特免库中筛选获得的抗体亦很可能针对表位II。这种现象产生的原因可能是人类中狂犬病病毒抗体的产生存在人种差异，在中国人中针对表位II的抗体比例较高。该抗体对CVS-11和CTN株均具有很高的中和指数，表明该抗体针对的氨基酸形式在病毒中具有很低的突变率，可以较为彻底的中和病毒。抗体对街毒株的中和能力必须通过中和试验进行验证才能确定，单克隆抗体非结合表位氨基酸的改变可能会对单抗中和活性产生很大影响，但针对街毒株序列分析仍具有一定参考意义。对1338株街毒株的糖蛋白序列分析表明，虽然该抗体针对的关键氨基酸位点不属于高度保守的氨基酸，但其氨基酸突变形式在街毒株中几乎不存在，这在一定程度上证明该抗体对现有街毒株和未来可能出现的新街毒株可能具有较好的中和能力。
抗体的Tm值对工程细胞株构建具有重要指导意义。研究表明，抗体的Tm值越高其稳定性越好、越容易在真核表达中获得更高的表达量。这可能是因为高Tm值抗体具有更高的热稳定性，在细胞体内更不容易产生错误的折叠，有利于蛋白的分泌表达；同时，错误折叠的蛋白可能会对细胞产生毒害，影响细胞的生长和表达。该抗体Tm值为70.58℃，具有较好的热稳定性，有利于提高表达量和维持产品的稳定性。
综上所述，该抗体具有较高体外中和活性、低病毒逃逸率、较高的Tm值，有可能作为一种抗狂犬病病毒被动免疫制剂产品或开发体外诊断试剂盒。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 兰州生物制品研究所有限责任公司
<120> 一种抗狂犬病病毒单克隆抗体、制备方法及用途
<130> 权利要求书 说明书
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Ala Ser Asn Ile Arg Ser Ser Thr
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Gly Asp His
1
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Ala Val Trp Asp Asp His Leu Asn Ile Val Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Gly Ala Ser Thr Asn Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Met Asn Tyr Arg Gly Thr Pro
1 5
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Ala Arg Val Asp Asn Trp Asn Phe Asp Asp Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 7
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aattttatgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60
tcttgttctg gaagtgcctc caacatcaga agtagtactg taaattggta ccgccaagtc 120
ccagggacgg ccccccaact cctcatttat ggtgatcata accggccctc aggactcccg 180
gctcgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggactccag 240
tctgaggatg aggcaactta ttattgtgct gtatgggatg accacttgaa tattgttcta 300
tttggcggtg ggacccagct gaccgtcctc 330
<210> 8
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gccgaggtgc agctgttgga gtccggccca agagtggtga agccttcgga aaccctgtcc 60
ctcacgtgca gtgtctctgg tgcctccacc aatagctact actggcactg gatcaggcag 120
cccccaggga agggactgga gtgggttggg cgtatgaatt acagagggac ccctctatac 180
aacccctccc tcaagagtcg agtcaccata tcagtagaca cgtccaagaa ccagctctcc 240
ctgaaggtga ggtctgcgac cgctgcggac acggccatgt attactgtgc gagagtagat 300
aactggaact ttgacgatgc ttttgatatc tggggccgag ggacaatggt caccgtctct 360
tca 363
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
ggtctcagtg tgaggtgcag ctgtt 25
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ggtctcacac ttgaagagac ggtgac 26
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ggtctcagtg tatggcccag gtcaccttg 29
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ggtctcacac ttgaagagac ggtgaccatt gtc 33
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
aagttcccca tttacacgat acca 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ctccaacttt caaacaccct 20
Claims (9)
1.一种抗狂犬病病毒单克隆抗体，其特征在于，具有：
轻链可变结构域，包含高变区CDR1、CDR2、CDR3；以及
重链可变结构域，包含高变区CDR1＇、CDR 2＇、CDR 3＇，
其中，所述CDR1的氨基酸序列为：Ala-Ser-Asn-Ile-Arg-Ser-Ser-Thr；
所述CDR2的氨基酸序列为：Gly-Asp-His；
所述CDR3的氨基酸序列为：Ala-Val-Trp-Asp-Asp-His-Leu-Asn-Ile-Val-Leu；
所述CDR 1＇的氨基酸序列为：Gly-Ala-Ser-Thr-Asn-Ser-Tyr-Tyr；
所述CDR 2＇的氨基酸序列为：Met-Asn-Tyr-Arg-Gly-Thr-Pro；
所述CDR 3＇的氨基酸序列为：Ala-Arg-Val-Asp-Asn-Trp-Asn-Phe-Asp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile 。
2.根据权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其特征在于：
其中，该单克隆抗体选自包含有轻链可变结构域高变区和重链可变结构域高变区的片段、包含有轻链可变结构域和重链可变结构域的片段、或具有全长重链和轻链的完整抗体分子。
3.根据权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体，其特征在于：
编码该单克隆抗体轻链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码重链可变结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体承载有编码权利要求1~3任一项所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体的核苷酸序列。
5.权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体在制备预防或治疗狂犬病药物中的用途。
6.权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体在制备狂犬病毒检测试剂或检测试剂盒中的用途。
7.根据权利要求6所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体在制备狂犬病毒检测试剂或检测试剂盒中的用途，其特征在于：
其中，所述检测试剂中包括经生物标记或化学标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体；
所述检测试剂盒中包括抗狂犬病病毒单克隆抗体经生物标记或化学标记得到的标记复合物。
8.一种抗狂犬病病毒被动免疫制剂，其特征在于，包括活性成分以及药学上可接受的药物载体，所述活性成分包括权利要求1或2所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体、编码权利要求1或2所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体的核苷酸、或权利要求4所述的表达载体。
9.权利要求1所述的抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、获得抗狂犬病病毒scFv序列
从抗狂犬病病毒噬菌体库中选择效价>10IU的几十份狂犬疫苗免疫血样建库，抗体可变区基因整合在噬粒上；而后将酶切后的抗体可变区克隆至PET-26b载体上，并转化大肠杆菌BL21，涂布于含卡那霉素的LB琼脂糖平皿，挑选克隆，使用T7启动子通用引物测序，获得scFv序列，
B、真核瞬时表达及抗体亲和纯化
扩增轻链可变结构域和重链可变结构域，并将其分别连接至PGP5con轻链载体以及PGP5con重链载体，而后将两种连接产物分别转化大肠杆菌Top10，涂布含卡那霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养后挑选克隆测序，抽提获得抗体瞬时表达用轻、重链质粒；转染HEK293 EBNA1细胞后，使用Mabselect SuRe介质纯化表达的抗体，PBS溶液洗杂后，pH 3.5的乙酸钠溶液洗脱，获得纯化的抗狂犬病病毒单克隆抗体，并进行性质分析。
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