CN107586322B

CN107586322B - 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用

Info

Publication number: CN107586322B
Application number: CN201710748589.7A
Authority: CN
Inventors: 倪宏波
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2017-08-28
Filing date: 2017-08-28
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2037-08-28
Also published as: CN107586322A

Abstract

本发明属于分子生物学和医药领域，具体公开了牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其在制备检测或治疗牛传染性鼻气管炎的试剂或药物中的用途。本发明提供一种抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体，同时筛选出牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的抗原表位为³²³GEPKPGPSPDADRPE³³⁷(最短表位序列为³²³GEPKPGP³²⁹7个氨基酸肽段)，基于此抗原表位的重组蛋白可特异性的检测牛传染性鼻气管炎血清；另外基于此抗原表位所设计的小分子抑制药物可以阻断病毒的感染；同时基于此抗原表位所构建的多拷贝重复表位疫苗，在适宜的佐剂辅助下，可以诱发高滴度的gD蛋白抗体，并且具有较高的中和抗体效价。本发明为建立牛传染性鼻气管炎检测方法及疫苗研发奠定基础。

Description

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和医药领域，具体地说，涉及牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其在制备检测或治疗牛传染性鼻气管炎的试剂或药物中的用途。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus,IBRV)引起的一种重要的牛呼吸道疾病，可导致体重减轻、流产、产奶量下降、双侧结膜炎和极度不安等症状。临床上可分为呼吸道型、生殖道感染型、脑炎型、眼炎型和流产型。疾病的传播途径主要为直接接触病原体以及潜伏感染。该病具有较宽的宿主范围，限制了动物贸易，给养牛业的发展带来巨大经济损失。尽管此病病死率不高，但可能会继发细菌感染，并且该病毒可潜伏在神经节中，一旦激发便会向外界排毒，为疾病的控制带来很大困扰。

IBRV是有囊膜的DNA病毒，全长135-140kbp，其基因组序列可分为约102-104kbp的独特长(UL)片段和约10.5-11kbp的独特短(US)片段，具有约24kbp的反向重复区。已经鉴定了73个编码蛋白的开放阅读框，其中10种具有编码糖蛋白的潜力。gD蛋白是存在于病毒囊膜中的抗原之一，由417个氨基酸组成，分子量约71Ku，GC含量为70％，去除N端的信号肽，产生成熟蛋白，共计399个氨基酸。gD蛋白能够刺激机体体液免疫和细胞免疫，并且是病毒复制的必须蛋白，与病毒吸附、侵入宿主细胞有关。研究证实gD蛋白能够比gC蛋白或者VP8衣壳蛋白产生更好的保护力。本发明采用gD蛋白作为研究对象，通过细胞融合制备其单克隆抗体，通过抗原表位的鉴定，加深对gD蛋白结构和功能的认识，为IBRV致病机理的研究及亚单位疫苗等新型疫苗的开发奠定基础。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gD蛋白制备单克隆抗体并筛选识别IBRV gD单克隆抗体的表位及相应的抗原表位，为疾病的检测和治疗提供基础。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明通过大肠杆菌表达系统表达的IBRV gD-pET-28a重组蛋白为免疫原免疫BALB/c鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合。此外，本发明还利用原核重组gD蛋白作为包被抗原，经间接ELISA方法筛选得到一株稳定分泌抗gD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blot检测结果表明MAb 2B6既与gD重组蛋白发生特异性反应(图1)，又可以与IBRV发生反应(图2)。同时，利用间接免疫荧光试验证明，MAb 2B6可以与IBRV感染的MDBK细胞结合，荧光显微镜下可见特异性荧光(图3)。

采用交互重叠多肽法对gD部分序列进行截短，与pGEX-6P-1连接构建重组质粒，经IPTG诱导表达，验证与MAb 2B6的反应性，对与单抗反应的片段继续截短表达，直至筛选出与其反应的最短肽段。经过多次截短获得最短肽为7肽，即³²³GEPKPGP³²⁹。与其他分离株进行比对具有较高保守性，因此可特异性的检测IBRV。

基于上述研究，本发明提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽，其包括氨基酸序列为³²³GEPKPGP³²⁹(如SEQ ID NO.1所示)的片段。

进一步地，氨基酸序列为³²³GEPKPGPSPDADRPE³³⁷(如SEQ ID NO.2所示)的牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种与所述的蛋白抗原表位多肽结合的特异性抗IBRV gD蛋白单克隆抗体。

需要说明的是，根据本领域常规技术手段制备的可分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株，也属于本发明保护的范围。

进一步地，本发明还提供了所述的抗原表位多肽在制备检测牛传染性鼻气管炎的试剂或试剂盒中的应用。例如，使用ELISA方法实现牛传染性鼻气管炎的检测。

进一步地，本发明还提供了所述的单克隆抗体在制备治疗牛传染性鼻气管炎的药物中的应用。

更进一步地，由于本发明发现了所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的抗原表位多肽，编码所述蛋白抗原表位多肽的核苷酸序列也应当属于本发明的保护范围，可利用其进行所述蛋白抗原表位多肽的表达等。

本发明还提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽的小分子抑制剂，所述小分子抑制剂特异性针对所述蛋白抗原表位多肽，并结合所述蛋白抗原表位多肽并抑制其活性。

更进一步地，本发明基于所鉴定的抗原表位多肽，提供一种亚单位疫苗，所述亚单位疫苗的肽段序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

所述抑制剂在制备治疗牛传染性鼻气管炎的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体，同时筛选出牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的抗原表位。本发明以pET-28a为载体构建表达的蛋白作为免疫原免疫小鼠，筛选阳性杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体2B6与IBRV gD-pET-28a蛋白能够发生特异性反应。利用交互重叠多肽法筛选针对单克隆抗体2B6的抗原表位为7肽，即³²³GEPKPGP³²⁹，此抗原表位可特异性的检测牛传染性鼻气管炎。本发明为建立牛传染性鼻气管炎检测方法奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例2中MAb 2B6的Western blot图。

图2为本发明实施例2中MAb 2B6的Western blot图；其中M为蛋白质分子质量标准；1为2B6与纯化的IBRV反应结果，2为2B6与未接毒SP2/0细胞裂解物反应情况。

图3为本发明实施例2中MAb 2B6的间接免疫荧光图。

图4为本发明实施例3中表位初步截短的Western blot图；其中M为蛋白质分子质量标准；1为pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导；2为311-326-pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导；3为316-330-pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导；4为323-337-pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导；5为326-340-pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导。

图5为本发明实施例3中表位精准确定的Western blot图；其中M为蛋白质分子质量标准；1为323-327-pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导；2为323-328-pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导；3为323-329-pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导；4为pGEX-6P-1 1mM IPTG诱导。

图6为本发明实施例5中所设计的小分子药物对IBRV的抑制效应效果。

图7为本发明实施例6中表位疫苗的抗体滴度。

图8为本发明实施例7中7肽表位疫苗的抗体滴度。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1单克隆抗体的制备

1、小鼠免疫

小鼠免疫以切胶纯化的原核表达的重组gD-pET-28a蛋白免疫3只4-6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，免疫剂量为60μg/只，第1次用等量弗氏完全佐剂与蛋白乳化，第2次、第3次取等量弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫途径为皮下免疫。融合前通过腹腔注射30μg纯化重组蛋白(不加任何佐剂)加强免疫。

2、细胞融合

融合前1天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。眼球采血，分离血清保存，处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞8：1的比例用PEG1450进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。

3、阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

利用纯化后的原核表达的带有His标签的gD-pET-28a蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，同时设纯化的His-tag蛋白做为阴性对照。对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗gD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其分泌的单克隆抗体命名为2B6。

实施例2单克隆抗体的鉴定

1、单克隆抗体的亚类鉴定

经抗体亚类鉴定试剂盒鉴定，抗gD蛋白的单克隆抗体2B6的亚类为IgG2a/κ。

2、Western blot试验

通过Western blot验证单抗与重组蛋白反应性。纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，以阳性杂交瘤细胞株2B6培养上清液作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，DAB显色(图1)。

通过Western blot验证单抗与IBRV的反应性。将蔗糖梯度离心纯化的病毒转印至PVDF膜上，以阳性杂交瘤细胞株2B6培养上清液作为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，DAB显色(图2)。

3、间接免疫荧光试验(IFA)

通过间接免疫荧光试验单抗与IBRV感染的细胞的反应情况。MDBK细胞经MOI＝0.1的IBRV感染后，37℃培养48h，细胞经预冷的甲醇固定10分钟，试验中设非感染细胞对照。以阳性杂交瘤细胞株2B6培养上清液作为一抗，FITC标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，荧光显微镜下观察(图3)。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体2B6既能够与gD重组蛋白发生特异性反应，又能与IBRV反应。

实施例3抗原表位的筛选

1、抗原表位的初步确定

参照BHV-1gD氨基酸序列，实验设计3对引物将gD蛋白首先分成3段，每段之间有部分氨基酸重叠，并且每对引物上游插入BamHⅠ位点，下游插入EcoRⅠ位点。经PCR扩增纯化酶切后与pGEX-6P-1载体连接，(PCR体系、酶切体系以及连接体系如表2-5)将含GST标签的重组蛋白进行表达，经Westernblot测定每个融合短肽与MAb 2B6的反应性。经过三次截短表达(图4)，初步确定表位大小为15个氨基酸，即³²³GEPKPGPSPDADRPE³³⁷。

表1表位初步确定的引物设计

表2第一次截短PCR反应体系

反应条件为98℃3min；(98℃10s；退火10s；72℃3min；)35个循环；72℃10min。

表3第2、3次截短PCR反应体系

反应条件为94℃5min；(94℃30s；55℃30s；72℃30s)5个循环；72℃5min。

表4酶切体系

表5连接体系

2、抗原表位的精准定位

将两侧氨基酸分别逐个缺失，将324-337aa及323-336aa分别表达，Western blot结果显示324-337aa位置处蛋白不与MAb 2B6反应，323-336aa位置处蛋白与MAb 2B6反应，大小为14aa。继续截短后，Western blot结果显示，323-335aa、323-334aa、323-332aa、323-331aa、323-330aa均与MAb 2B6反应。截短后，最短的表位大小为8aa。进一步截短至7aa、6aa和5aa，Western blot结果显示，7aa大小时与MAb 2B6反应，6aa和5aa时均不反应(图5)。因此，针对MAb2B6的表位最短的位置在323-329aa，大小为7aa，即GEPKPGP。

实施例4抗原表位的初步应用

1、表位保守性分析

选取多个IBRV分离株(BHV-1.1、BHV-1Cooper、BHV-1.2B589、BHV-1.2K22、BHV-5)及与IBRV相关的反刍动物疱疹病毒(CoHV-1、ElkHV-1、CpHV-1)gD蛋白氨基酸序列进行比对分析，具有很高的保守性，又能与其他动物的疱疹病毒区分，因此，可特异性的检测IBRV。

表6抗原表位保守性分析

2、间接ELISA鉴定

将表位³²³GEPKPGPSPDADRPE³³⁷编码基因做3个拷贝重复后，克隆至原核表达载体pGEX-6p-1，与GST融合表达后，纯化后重组蛋白纯化按100μg/mL的浓度包被ELISA板，5％脱脂封闭2h，作为牛传染性鼻气管炎血清学诊断快诊板。分别对459份来自黑龙江省部分地区未经免疫的牛血清样本进行检测，并与商品化的ELISA诊断试剂盒进行对比。结果显示在459份血清样本中107份样本IBR抗体呈阳性，血清阳性率为23.3％，与IDEXX试剂盒的符合率达到90.6％。。

表7基于抗原表位的ELISA与IBR IDEXX商品化试剂盒检测结果对比

实施例5牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽抑制剂的开发

通过生物信息学软件对牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白进行同源建模，并对所鉴定的最短7肽抗原表位进行定位和结构模拟。针对模拟结果，设计小分子药物并委托生化公司进行化学合成和纯化。

首先在小鼠体内验证小分子药物的毒理作用，4只6周龄BABL/c小鼠腹腔注射100μg的小分子药物，注射一周内每天断尾采血，分析小鼠血液生化指标的变化；一周后剖杀小鼠，采集肝脏、肾脏。制备组织切片，进行HE染色，观察脏器是否有炎症变化和组织损伤。结果证明，所合成的小分子药物对小鼠是安全的。

在96孔细胞培养板上，铺2×10⁴MDCK细胞/孔，6h后，加入1μg、5μg、10μg或20μg的小分子药物，作用10min，每孔加入100TCID₅₀的IBRV，每组2个重复，37℃CO₂培养箱中孵育1h，弃去上清，DMEM洗涤2次，加入DMEM培养液(含2％胎牛血清)，设不加药物组和非感染组，37℃CO2培养箱中继续培养6-7天，观察细胞的CPE现象，记录并计算TCID₅₀。结果表明，小分子药物可以抑制IBRV的细胞病变效应，而且呈现剂量依赖性(结果如图6所示)。

实施例6基于所鉴定的抗原表位的亚单位疫苗应用

为了评价本发明所鉴定的新型抗原表位在疫苗领域的应用，将前述利用单克隆抗体2B6所鉴定的IBRV gD蛋白上新的抗原表位³²³GEPKPGPSPDADRPE³³⁷串联5次，每两个表位之间连接柔性氨基酸linker(GGGGS或GSGSG或者GGSSGS或者GGGGSGGGGS)，肽段N基端加入破伤风毒素T细胞表位P2:QYIKANSKFIGITEL(编码基因：CAGTATATAAAAGCAAATTCTAAATTTATAGGTATAACTGAACTA)，构建嵌合的表位疫苗，此抗原表位肽段由生物公司合成并纯化(如SEQID NO.3所示)。

40只6～8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为4组，每组10只，表位疫苗20μg/鼠；实验组分组情况如下：表位疫苗+Al(OH)₃、表位疫苗+CpG ODN+Al(OH)₃、表位疫苗+LTK63+CpGODN+Al(OH)₃，对照组为600μg Al(OH)₃。共3次免疫，间隔2周。于每次免疫前和末次免疫后14d采血，分离血清，-20℃保存。用纯化的gD蛋白包被ELISA板(6μg/mL)，检测免疫不同时期小鼠血清中IgG抗体水平。间接ELISA方法检测各组的血清抗体水平，结果表明：首免后14d，三个实验组的血清抗体效价开始出现；二免后(28d)除Al(OH)₃佐剂对照组外，其它3组抗体滴度上升较快；末次免疫后两周(42d)，CpG ODN+Al(OH)₃实验组的抗体滴度最高，且与CpGODN+LTK63+Al(OH)₃、LTK63+Al(OH)₃和Al(OH)₃其他3组差异极显著(P＜0.01)；CpG ODN+LTK63+Al(OH)₃免疫组的抗体滴度与LTK63+Al(OH)₃组无论是在2免后还是3免后差异不显著(结果如图7所示)。

ELISA检测后，将CpG ODN+Al(OH)₃组小鼠血清混和后，进行血清中和抗体滴度检测。血清从1:4开始做倍比稀释至1:2048，加入等体积含300TCID₅₀/0.lml病毒的培养液，37℃作用2h，接种于备好的铺有MDBK单层细胞的96孔板培养板中，每个稀释度4个重复，每孔100μl，置于37℃、5％CO₂培养箱中，48h后观察CPE。50％保护的最大稀释倍数判定为中和效价。结果表明，小鼠血清的中和抗体效价为1:64。

试验结果表明，该申请中的抗原表位在经多拷贝重复后，在合适的免疫佐剂辅佐下，可以诱导较高的抗体滴度，可以作为牛传染性鼻气管炎的候选疫苗。

实施例7基于所鉴定的最短抗原表位的亚单位疫苗应用

为了评价本发明所鉴定的新型抗原表位在疫苗领域的应用，将前述利用单克隆抗体2B6所鉴定的IBRV gD蛋白上新的抗原表位³²³GEPKPGPSP³²⁹串联5次，每两个表位之间连接柔性氨基酸linker序列以及与肽段N基端加入破伤风毒素T细胞表位P2均与实施例6相同，构建嵌合的表位疫苗，此抗原表位肽段由生物公司合成并纯化(如SEQ ID NO.4所示)。

免疫剂量、免疫分组、佐剂使用剂量均与实施例6相同。于每次免疫前和末次免疫后14d采血，分离血清，-20℃保存。用纯化的gD蛋白包被ELISA板(6μg/mL)，检测免疫不同时期小鼠血清中IgG抗体水平。间接ELISA方法检测各组的血清抗体水平，结果表明：7肽³²³GEPKPGP³²⁹重复序列所制备的重组嵌合表位疫苗仍可以诱导与³²³GEPKPGPSPDADRPE³³⁷重复序列嵌合表位疫苗稍微降低的抗体滴度和中和抗体水平(1:32)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用

<130> KHP171114790.1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> GEPKPGP

<400> 1

Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro

1 5

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> GEPKPGPSPDADRPE

<400> 2

Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu

1 5 10 15

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp

20 25 30

Arg Pro Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser

35 40 45

Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Glu Pro

50 55 60

Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu Gly Gly Gly Gly

65 70 75 80

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Ser Pro Asp

85 90 95

Ala Asp Arg Pro Glu Gly Ser Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Pro Gly

100 105 110

Pro Ser Pro Asp Ala Asp Arg Pro Glu

115 120

<210> 4

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Glu Pro Lys Pro Gly Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Glu Pro

35 40 45

Lys Pro Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu

50 55 60

Pro Lys Pro Gly Pro Gly Ser Gly Ser Gly Gly Glu Pro Lys Pro Gly

65 70 75 80

Pro

Claims

1.一种牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽，其特征在于，氨基酸序列为³²³GEPKPGP³²⁹。

2.权利要求1所述的抗原表位多肽在制备检测牛传染性鼻气管炎的试剂或试剂盒中的应用。

3.编码权利要求1所述蛋白抗原表位多肽的核酸。