CN106405093A - 抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒 - Google Patents

抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，其包括：包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板、IBRV阳性标准血清、阴性血清、酶标记二抗、底物显色液、终止液。本发明利用抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体，在酶联板捕获受感染的MDBK细胞裂解物中的牛传染性鼻气管炎病毒，通过方阵滴定法确定了单克隆抗体和病毒抗原的最佳包被浓度。本发明试剂盒具有良好的特异性、敏感性，中和符合率高，具有良好的应用前景。

Description

抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体的检测技术，具体涉及到一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，本发明还涉及该试剂盒的制备方法。
背景技术
牛传染性鼻气管炎(bovine infectious rhinotracheitis,IBR)，又名“坏死性鼻炎”或“红鼻病”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitisvirus,IBRV)引起牛的一种接触性传染病。病牛临床上主要以呼吸道及气管黏膜发炎、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等呼吸道症状为主，部分病牛还会出现眼结膜炎、脑膜脑炎、乳房炎、流产、生殖道感染等多种病症[1]。该病能够延缓育肥牛生长、奶牛产奶量下降、生殖力下降、流产等，牛群淘汰率和死亡率增加，给养牛业带来巨大经济损失[2]。病毒还可侵入牛的三叉神经节和荐神经节，中和抗体不能中和潜伏于神经节内的病毒，造成病毒的潜伏感染，病牛长期乃至终身带毒，并成为传染源，持续向外界环境排毒。病毒通过空气传播，使无IBR的健康牛受感染，给控制和消灭本病带来极大困难[3]。该病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物传染病，我国将其列为二类动物传染病。由于清除IBRV血清反应阳性牛已成为一些经济发达国家消灭和根除本病的主要措施之一，因此有必要建立检测IBRV的血清抗体方法。
迄今，牛传染性鼻气管炎血清抗体的检测方法有：间接血凝试验(IHA)、间接免疫荧光试验(IFA)、免疫胶体金试验、中和试验(SN)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)。间接血凝试验是用鞣酸处理的绵羊红细胞吸附病毒抗原后进行间接血凝试验，以检测被检血清中的相应抗体。该方法简单易行，适用于IBR血清抗体检测，但其抗原制备 过程繁琐费时，而且在进行HI试验时，容易发生交叉反应，混淆检测结果；间接免疫荧光试验(IFA)是一种免疫标记技术。通常将抗牛免疫球蛋白第二抗体与异硫氰荧光素连接成荧光抗体，待检血清加到接有IBRV的细胞培养物表面，置荧光显微镜下观察结果。IFA用于诊断具有快速、简便、敏感性好的特点，而且费用较低。该方法的缺点是标本中出现的假阳性(非特异性荧光)。免疫胶体金试验是利用胶体金标记的单抗与抗原符合物在滤纸上，当结合到待检血清中的抗体时，形成肉眼可见的条带。胶体金斑点免疫渗滤法用于IBR抗体检测，仅需5min即可判定结果，但该方法制作成本高，敏感性较差，不适合大规模的临床样品的检测。
中和试验是通过在易感动物细胞上进行中和试验即可做出诊断。将IBRV接种至单层生长的MDBK细胞，CPE达80％时收毒，反复冻融3次后离心去除细胞裂解碎片，收获病毒液。测定病毒液的TCID50后分装，置-20℃待用。将标准血清和待检血清56℃灭活30min，再和等体积的100TCID50病毒液混合，37℃中和1h后，加入MBDK细胞悬液，37℃CO2培养箱中培养72h后判定结果。中和试验被认为是最标准、最经典的血清抗体检测方法，但其敏感性相对较低，而且中和试验时必须设立标准阳性、阴性血清对照，病毒抗原对照，且涉及到细胞培养、细胞传代、病毒效价测定等步骤，操作复杂，试验周期长，加上IBRV常呈隐性感染状态或处于潜伏期，导致中和试验结果为阴性，但仍不能保证无病毒感染。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前应用最广泛的病毒抗体的检测技术。它具有敏感、特异、快速等特点，且需要的设备和技术条件不高，非常适用于目前的生产实际。现已被广泛应用于IBR的检测，是国际贸易指定检测方法之一。用于IBR诊断的ELISA方法主要有：间接法、阻断法、单抗捕获法、夹心法，其中以间接ELISA最为常用。David等于1981年用全病毒建立了间接ELISA诊断方法，Van Oirschot用制备的两种单克隆抗体建立ELISA方法用于检测IBRV。Florent等[应用IBRV IgM抗体作为包被抗体，建立检测IBRV的单抗捕获ELISA法，该方法能对IBRV的早期感染进行检测，在临床症状出现后5-10天的自然感染或试验感染动物血清中即可检测出IBRV抗体。目前，IDEXX等国外公司已有商品化的IBR阻断ELISA试剂盒销售到我国市场，但其昂贵的价格令奶牛场很难承受，促使国内学者不断研制具有自主知识产权的ELISA方法。朱元茂等用IBRV全病毒作为诊断抗原建立间接ELISA方法，与法国试剂盒的符合率为96.3％。李伟等用IBRV gB蛋白建立间接ELISA方法，与IDEXX试剂盒相比，符合率为92％。颜邦芬用IBRv的gG蛋白建立间接ELISA方法，与IDEXX试剂盒的符合率为93.3％。王海燕等用IBR gE蛋白建立检测gE抗体的间接ELISA方法，与法国试剂盒的符合率为94.3％，且该方法可用于区分野毒株和gE基因缺失疫苗株。
然而，上述ELISA中所用抗原是要么是通过密度梯度离心法将浓缩的IBRV纯化和灭活后得到的，要么将IBR病毒的外膜糖蛋白(如gB,gC,gD,gE等)在大肠杆菌中表达，然后将纯化的表达产物作为包被抗原，以此建立不同形式的ELISA。但IBR病毒的外膜糖蛋白基因的原核表达产物为不可溶蛋白，需要进行变性、复性才能获得纯化产物，而表达产物在变性、复性后，空间结构往往会发生一定程度的改变，致使检测方法的敏感性降低；此外，上述2种纯化方法得到的抗原纯度很难达到建立ELISA的要求。
发明内容
本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的ELISA试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，其包括：包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的 酶标板、IBRV阳性标准血清、阴性血清、酶标记二抗、底物显色液、终止液。
在本发明的一个优选实施方式中，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体的包被浓度为1.0μg/mL，包被量为100μL/孔。
在本发明的一个优选实施方式中，所述IBRV抗原的浓度为包被浓度为12.5μg/mL，包被量为100μL/孔。
所述酶标记二抗可以是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗，在本发明的一个优选实施方式中，所述酶标二抗是HRP标记兔抗牛IgG。
当HRP作为标记酶时，可以用诸如邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)作为色原底物。在本发明中一种优选的实施方式，所述底物显色液的配置如下(1升体系)：
所述终止液为2M H2SO4。
进一步地，所述试剂盒还包括血清稀释液其为PBST。
进一步地，所述试剂盒还包括HRP标记兔抗牛IgG稀释液，其为含3％BSA的PBST。
本发明还提供制备上述试剂盒的方法，包括制备包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板的步骤：将抗牛传染性鼻气管炎病毒gD单克隆抗体包被酶标板，用固相化的 单抗捕获病毒感染细胞裂解物种的牛传染性鼻气管炎病毒抗原。
一种优选的实施方式是，所述制备包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板的步骤为：将抗牛传染性鼻气管炎病毒gD单克隆抗体按100μL/孔包被酶标板，37℃温育2h，4℃过夜，倒出孔内液体，加入300μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次；加封闭液100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次；加入IBRV病毒抗原，100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，加入200μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次。
优选地，其中所述封闭液为3％BSA的PBST。
本发明提供的试剂盒，利用抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体，在酶联板捕获受感染的牛肾细胞(MDBK)裂解物中的牛传染性鼻气管炎病毒，通过方阵滴定法确定了单克隆抗体和病毒抗原的最佳包被浓度。本发明还进一步优化出ELISA的反应条件，包括最佳封闭液和封闭时间，血清和辣根过氧化物酶标二级抗体的稀释液和作用时间，底物反应时间以及阴、阳性血清临界值等。特异性试验结果表明，IBRV阳性血清被检为阳性，BVDV、牛白血病病毒、副结核病病毒阳性血清均被检为阴性。敏感性试验结果表明，IDEXX试剂盒中的标准阳性血清1:640倍稀释时仍能检出阳性抗体。与中和试验相比，特异性为100％(23/23)，敏感性为82.76％(24/29)。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10％，与IDEXX试剂盒相比，阳性符合率为87.7％(228/260)，阴性符合率为98％(196/200)。本发明可用于牛传染性鼻气管炎病毒血清抗体的检测，克服了常规的以密度梯度离心法制备的抗原纯度问题，从而极大地提高了抗体检测的敏感性。此外，该本发明试剂盒还具有抗原制备工艺简单、成本低廉、易于生产等特点，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是抗IBRV gD单抗小鼠腹水纯化产物的电泳图；
图2显示的是间接免疫荧光分析gD单抗与IBRV结合活性；
图3显示的是不同封闭液进行封闭对ELISA结果的影响；
图4显示的是不同血清稀释液稀释血清对ELISA结果的影响；
图5显示的是不同血清作用时间对ELISA结果的影响；
图6显示的是不同HRP-兔抗牛IgG稀释液对ELISA结果的影响；
图7显示的是不同HRP-兔抗牛IgG稀释倍数对ELISA结果的影响；
图8显示的是不同HRP-兔抗牛IgG作用时间对ELISA结果的影响；
图9显示的是底物不同作用时间对ELISA结果的影响；
图10显示的是agD-ELISA检测血清样品的OD值分布情况。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实验材料
1.病毒和细胞
MDBK细胞、IBRV Bartha Nu/67标准株由实验室保存。
2.血清和抗体
IBRV标准阳性、阴性血清来自IDEXX IBR gE抗体检测试剂盒中的血清；IBRV阳性、阴性牛血清由实验室保存；IBRV阳性、阴性小鼠血清由实验室提供；特级马血清购自Solarbio公司；鸡血清采自实验室的SPF鸡。抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体： 利用本实验室保存的杂交瘤细胞(购自美国ATCC，货号CRL-1852)注射Balb/c产后小鼠获得腹水后，利用protein A纯化试剂盒制备。其它供试血清(如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清、牛副结核病毒阳性血清、牛白血病病毒阳性血清)由北京市农林科学院畜牧兽医研究所高技术实验室保存。
3.主要试剂
DMEM、Trypsin、澳洲胎牛血清、TMB购自Thermo公司；透析袋购自Calbiochem公司；PEG6000购自国药集团化学试剂有限公司；HPR-兔抗牛IgG、FITC标记的兔抗牛IgG、FITC标记的羊抗鼠IgG、多聚甲醛均购自Sigma公司；BSA均购自Calbiochem公司；Skim Milk购自DifcoTM公司；Tween-20、SDS和Tris base购自Amresco公司；NaCl、KCl、KH2PO4、Na2HPO4.12H2O和冰乙酸均购自西陇化工股份有限公司；甲醇和乙醇购自北京化工厂；TritonX-100购自四季青公司；98％浓硫酸；IBR gB抗体检测试剂盒购自美国IDEXX公司
4.ELISA检测用试剂及溶液
(1)辣根过氧化物酶(HRP) Sigma公司
(2)辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG Sigma公司
(3)包被液(碳酸盐缓冲液)：Na2CO3 1.59g，NaHC O3 2.93g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到9.6。
(4)磷酸盐缓冲液(0.01M PBS)：NaCl 8.00g，KCl 0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH值到7.4。
(5)封闭液：5g脱脂牛奶用磷酸盐缓冲液溶解，定容至100mL。
(6)洗涤液：含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。
(7)稀释液：0.01M，pH 7.4磷酸盐缓冲液。
0.1mol/L柠檬酸：取柠檬酸3.84g，加蒸馏水150mL， 完全溶解后，定容至200mL。
(8)底物显色液：
A液：
B液：
(9)终止液(2M H2SO4)：22.2mL浓硫酸缓慢加入177.8mL蒸馏水中。
实施例1抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的ELISA检测方法
一、试验方法
1. IBRV病毒抗原的制备
按1％病毒量接种IBRV至单层生长的MDBK细胞，待CPE达80％～90％时收毒。-40℃反复冻融3次，5000r/min(4500×g)离心30min，去除细胞碎片，将上清置经处理过的透析袋中，然后以PEG6000对病毒液进行浓缩。再将浓缩的病毒液35000r/min(54200×g)超速离心2h，最后以0.01M的PBS溶解沉淀原细胞培养物的1/100。在测定稀释物蛋白浓度后，分装并冻存于-20℃待用。
2.单克隆抗体与病毒抗原最佳包被浓度的确定
采用方阵滴定法，选择1：50的标准阳性血清OD450nm值在1.0左右，且P/N(阳性血清/阴性血清)值最大的孔所对应的单克隆抗体和病毒抗原的稀释度为最佳单克隆抗体和抗原病毒的包被浓度。
3. agD-ELISA的操作程序
首先用碳酸盐包被缓冲液将已确定为最适包被浓度的抗gD单克隆抗体按100μL/孔包被酶标板，37℃温育2h，4℃过夜，倒出孔内液体，加入300μl/孔(PBST含0.05％Tween-20的0.01mol/L，pH7.4PBS)洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次；加封闭液100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次；加入最适浓度的IBRV抗原，100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，加入200μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次；加1：50稀释的阳性血清和阴性血清，每孔100μL，37℃作用1h，300μL洗涤液洗5次，吸水纸上拍干。加适当稀释的HRP-兔抗牛IgG，每孔100μL，37℃作用1h，300μL洗涤液洗5次，吸水纸上拍干。每孔加TMB底物100μL，室温避光显色一定时间。用l00μL 2mol/L H2SO4终止反应。用酶标仪测定OD450nm值。
4.最佳封闭液的确定
在最佳抗原稀释倍数和最佳血清稀释倍数条件下，分别以3％BSA、5％鸡血清、5％马血清、5％脱脂奶粉的PBST作为封闭液，然后进行ELISA。将P/N值最大时的封闭液作为最佳封闭液。
5.血清稀释液的确定
在最佳抗原稀释倍数、最佳血清稀释倍数和最佳封闭液条件下，分别以1％BSA、3％BSA、PBST作为血清稀释液，再进行ELISA。将P/N值最大时的血清稀释液作为最佳血清稀释液。
6.血清作用时间的确定
在最佳抗原稀释倍数、最佳血清稀释倍数和最佳封闭液条件下， 用最佳血清稀释液稀释阳性、阴性血清，分别作用30min、60min、90min，再进行ELISA。将P/N值最大时的血清作用时间作为最佳血清作用时间。
7. HRP-兔抗牛IgG稀释液的确定
在最佳浓度的单克隆抗体、最佳的病毒抗原稀释倍数和最佳封闭液、最佳血清稀释液、最佳血清作用时间条件下，分别以1％BSA、3％BSA、PBST作为HRP-兔抗牛IgG稀释液进行ELISA，将P/N值最大时的HRP-兔抗牛IgG稀释倍数作为最佳HRP-兔抗牛IgG稀释倍数。
8. HRP-兔抗牛IgG稀释度的确定
在最佳抗原稀释倍数、最佳血清稀释倍数和最佳封闭液、最佳血清稀释液、最佳血清稀释液条件下，用最佳HRP-兔抗牛IgG稀释液将HRP-兔抗牛IgG作1:10000、1:20000、1:30000、1:40000以及1:50000倍稀释，进行ELISA。将P/N值最大时的HRP-兔抗牛IgG稀释度作为最佳HRP-兔抗牛IgG稀释度。
9. HRP-兔抗牛IgG作用时间的确定
在最佳抗原稀释倍数、最佳血清稀释倍数和最佳封闭液、最佳血清稀释液、最佳血清作用时间、最佳HRP-兔抗牛IgG稀释液条件下，HRP-兔抗牛IgG分别作用30min、60min、90min，进行间接ELISA。将P/N值最大时的HRP-兔抗牛IgG作为最佳HRP-兔抗牛IgG作用时间。
10.显色时间的确定
用上述已优化好的条件，加底物后分别作5min、10min、15min、20min。进行间接ELISA。将P/N值最大且OD450nm值接近1.0时的显色时间作为最佳显色时间。
11.阴、阳性血清临界值的确定
按上述优化好的条件进行ELISA，检测200份经IDEXX IBRgB试剂盒检测为阴性的牛血清，计算出平均值和标准方差(SD)，阴、当样品的时判为阳性，时判为阴性，OD450nm值在和 之间判为可疑。
12.特异性试验
用建立的ELISA方法检测IBRV阳性血清、IBRV阴性血清、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性血清、牛副结核病毒阳性血清、牛白血病病毒阳性血清，每组4个重复，测定ELISA方法的特异性。
13.敏感性试验
分别将IBRV标准阳性、阴性血清从1:80开始作2倍倍比稀释，稀释至1:10240，检测ELISA的敏感性。
14.重复性试验
选取6份牛血清(3份阳性、3份阴性)，在同一酶标板上进行ELISA试验，每份样品做4个重复(批内重复)。将这6份血清在另外一块酶标板上重复相同的步骤，每份样品做4个重复(批间重复)。
15. agD-ELISA与IDEXX试剂盒的对比试验
用建立的ELISA方法检测经IDEXX IBR gB试剂盒检测为阳性的260份牛血清，检测结果与IDEXX试剂盒的进行比较，比较阳性符合率。同时将阴、阳性血清临界值确定时检测的200份阴性血清结果与IDEXX试剂盒的进行比较，比较阴性符合率，并求出总符合率。
16. agD-ELISA与中和试验对比试验
随机选取52份经IDEXX IBR gB试剂盒检测为26份阳性、26份阴性的牛血清，分别进行间接ELISA试验和中和试验。采用固定病毒，稀释血清的方法进行中和试验，即用维持液将100TCID50/50μL的病毒液做4次10倍连续稀释，稀释成100TCID50/50μL、 10TCID50/50μL、TCID50/50μL、0.1TCID50/50μL。每一稀释度2孔，每孔加病毒悬液50μL，维持液50μL，作病毒回归对照。然后将培养板置37℃CO2培养箱作用1h后，)每孔加100μL的MDBK细胞悬液(用维持液稀释至3×105个/mL)。37℃CO2培养箱中培养3d，用倒置显微镜观察细胞病变情况。判定标准为被检血清能抑制50％或50％以上细胞孔出现病变判为阳性，两孔都出现细胞病变判为阴性。，比较建立的间接ELISA方法相对于中和试验的符合率、敏感性和特异性，以及中和试验与IDEXX试剂盒的符合率、敏感性和特异性。
符合率＝(检测结果相同数/中和试验检测样本总数)×100％
敏感性＝(阳性结果相同样本数/中和试验阳性样本总数)×100％
特异性＝(阴性结果相同数/中和试验阴性样本总数)×100％
二.实验结果
1.抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体的鉴定
按“实验材料”描述制备和纯化了抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体。该抗体经12％SDS-PAGE分析了纯度和抗体结构(图1)，进一步利用免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒(Sigma)鉴定该单抗亚型为IgG2α。间接免疫荧光试验结果表明，该单克隆抗体能够结合在MDBK细胞上感染的IBR病毒(图2)。
2.单克隆抗体与病毒抗原最佳包被浓度的确定
利用1：50的抗IBRV标准牛血清在酶联免疫板上测定了单克隆抗体与病毒抗原最佳包被浓度。方阵滴定结果表明：当单克隆抗体浓度和IBR病毒蛋白浓度度分别为1.0μg/mL和12.5μg/mL时，测定OD450nm值约为1.0，而且P/N值最大，因此确定为最佳包被浓度(表1)。
表1单克隆抗体与病毒抗原最佳包被浓度的确定
注：单克隆抗体的初始浓度为4mg/mL；粗制的IBRV抗原浓度为0.5mg/mL.
3.最佳封闭液的确定
以上述确定的最佳浓度的单抗和病毒抗原包被酶标板，血清1:50稀释，分别以含3％BSA、3％鸡血清、5％马血清、5％脱脂奶粉的PBST作为封闭液，每组做4个重复，进行间接ELISA。计算P/N值，结果表明，以3％BSA的PBST作为封闭液时，P/N值最高，且阴性OD450nm值较低，因此选择3％BSA的PBST作为封闭液(图3)。
4.血清稀释液的确定
分别以1％BSA、3％BSA的PBST、PBST作为血清稀释液，每组做4个重复，进行间接ELISA。计算P/N值，结果表明，以PBST作为血清稀释液时，P/N值最高，因此选择PBST作为血清稀释液(图4)。
5.血清作用时间的确定
分别将血清作用30min、60min、90min，每组做4个重复，进行间接ELISA。计算P/N值，结果表明，血清作用60min时，P/N较高且阴性血清OD450nm值较低，因此选择60min作为血清最佳作用(图5)。
6. HRP-兔抗牛IgG稀释液的确定
以1％BSA、3％BSA的PBST和PBST作为HRP-兔抗牛IgG稀释液，每组4个重复，进行间接ELISA。计算P/N值，结果表明，以3％BSA的PBST作为HRP-兔抗牛IgG稀释液时，P/N值最高且阴性血清OD450nm较低。随着BSA含量的降低，P、N值上升幅度很大，说明了BSA对减少非特异蛋白吸附具有很好的作用，但稀释液中BSA含量并不是越高越好，随着BSA含量的升高，OD值会下降。但BSA含量为3％时，阳性OD450nm值在1.0左右，因此选择3％BSA的PBST作为最佳HRP-兔抗牛IgG稀释液(图6)。
7. HRP-兔抗牛IgG稀释倍数的确定
将HRP-兔抗牛IgG作1:10000、1:20000、1:30000、1:40000以及1:50000倍稀释，每组4个重复，进行间接ELISA。计算P/N值，结果表明，HRP-兔抗牛IgG1:20000倍稀释时，P/N值最高且阴性血清OD450nm值较低，因此选择1:20000作为HRP-兔抗牛IgG的最佳稀释倍数(图7)。
8. HRP-兔抗牛IgG作用时间的确定
分别将HRP-兔抗牛IgG作用30min、60min、90min，每组4个重复，进行间接ELISA。计算P/N值，结果表明，HRP-兔抗牛IgG作用60min时，P/N值最高且阴性血清OD450nm值较低，因此选择60min作为HRP-兔抗牛IgG的最佳作用时间(图8)。
9.显色时间的确定
TMB底物分别5min、10min、15min、20min，每组4个重复，进行间接ELISA。计算P/N值，结果表明，TMB底物作用10min时，阳性血清OD450nm值接近1.0，且阴性血清OD450nm值较低，因此选择10min作为TMB的最佳作用时间(图9)。
10. agD-ELISA阴、阳性血清临界值的确定
选取200份经IDEXX试剂盒检测为阴性的牛血清进行agD-ELISA，检测的200份阴性血清样品OD450nm值符合正态分布。阴性血清的标准差(SD)＝0.028。 当样品时判为阳性，样品时判为阴性，介于0.213～0.240判为可疑，对可疑样品再次检测，仍为可疑值判为阳性。
11. agD-ELISA特异性试验
利用已建立的agD-ELISA检测抗不同病原的牛血清，结果表明：除IBRV阳性牛血清检测为阳性外，IBRV阴性牛血清以及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副结核病毒和牛白血病病毒阳性血清均检测为阴性，说明方法具有良好的特异性(表2)。
表2 agD-ELISA特异性试验结果
12. agD-ELISA敏感性试验
对标准阳性血清进行倍比连续稀释后，以建立的agD-ELISA进行检测，结果1:640倍稀释时，OD450nm＝0.365>0.240(临界值)，且P/N＝4.148>2.1成立。即标准阳性血清1:640稀释时，仍能检出阳性抗体(表3)。
表3敏感性试验结果
13. agD-ELISA重复性试验
分别对3份阳性样品及3份阴性样品进行30个重复的agD-ELISA检测，计算出每份样品的平均值和标准差(SD)，求出变异系数，结果批内重复性试验的变异系数最大5.4％；批间重复性试验的变异系数最大6.7％，说明该ELISA方法无论是批间还是批内均具有较好的重复性(表4)。
表4重复性试验结果
14. agD-ELISA与IDEXX试剂盒对比试验
用建立的agD-ELISA方法检测经IDEXX试剂盒检测过的阳性牛血清为260份，阴性血清200份。结果460份牛血清中阳性为228份，阴性样品为196份。与IDEXX试剂盒的相比，阳性符合率为87.7％，阴性符合率为98％，总符合率92.2％(表5)。OD450nm值主要集中在0.3～0.9之间，其中有32份阴性，228份阳性(图10)。
表5 agD-ELISA与IDEXX试剂盒符合率比较结果
15. agD-ELISA与中和试验符合性试验
随机选取52份牛血清临床样品，分别以agD-ELISA、IDEXX的gB抗体检测试剂盒以及中和试验进行检测，结果IDEXX试剂盒检测为26份阳性、26份阴性，agD-ELISA检出24份阳性，28份阴性，中和试验检出29份阳性，23份阴性。建立的ELISA方法与中和试验相比，敏感性82.76％，特异性100％，符合率90.38％。而IDEXX试剂盒敏感性82.76％；特异性91.30％，符合率86.53％(表6)。
表6 agD-ELISA与中和试验对比试验
本发明利用抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体在酶联免疫板孔中捕获IBRV抗原的原理，成功建立了适用于临床牛血清样品检测抗体的agD-ELISA。本发明组装成的试剂盒，已检测了延庆、密云、顺义、昌平和房山10个牛场2058份样品，结果准确、特异性高。
实施例2试剂盒的组成
试剂盒的组成实例如下：
。

Claims (10)

1.一种检测抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体的检测试剂盒，其包括：包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板、IBRV阳性标准血清、阴性血清、酶标记二抗、底物显色液、终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体的包被浓度为1.0μg/mL，包被量为100μL/孔。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述IBRV抗原的浓度为包被浓度为12.5μg/mL，包被量为100μL/孔。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记二抗为HRP标记兔抗牛IgG。
5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述底物显色液的配置如下：
6.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M H2SO4。
7.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括血清稀释液其为PBST。
8.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HRP标记兔抗牛IgG稀释液，其为含3％BSA的PBST。
9.一种制备权利要求1-8任一项所述试剂盒的方法，其特征在于，包括制备包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板的步骤：将抗牛传染性鼻气管炎病毒gD单克隆抗体包被酶标板，用固相化的单抗捕获病毒感染细胞裂解物种的牛传染性鼻气管炎病毒抗原。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述制备包被抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的单克隆抗体和IBRV抗原的酶标板的步骤为：将抗牛传染性鼻气管炎病毒gD单克隆抗体按100μL/孔包被酶标板，37℃温育2h，4℃过夜，倒出孔内液体，加入300μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次；加封闭液100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次；加入IBRV病毒抗原，100μL/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，加入200μl/孔PBST洗涤，每次3min，拍干，重复洗涤3次；其中所述封闭液为3％BSA的PBST。
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