CN114966020B

CN114966020B - 检测牛传染性鼻气管炎病毒的胶体金试纸条及其制备方法

Info

Publication number: CN114966020B
Application number: CN202210817798.3A
Authority: CN
Inventors: 刘文晓; 李永清; 江波; 段景龙
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2022-07-13
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2042-07-13
Also published as: CN114966020A

Abstract

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒的检测，具体涉及一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的胶体金试纸条及其制备方法。提供的检测牛传染性鼻气管炎病毒的胶体金试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述金标垫上包被有胶体金标记的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No. 23006的杂交瘤细胞分泌；所述硝酸纤维素膜上设有检测线，所述检测线上包被有抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体。所述试纸条针对IBRV病毒的检测具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、准确性高的优点。

Description

检测牛传染性鼻气管炎病毒的胶体金试纸条及其制备方法

技术领域

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒的检测，具体涉及一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV）又名牛疱疹病毒1型（Bovine herpesvirus-1, BHV-1），属疱疹病毒科，是牛的一种重要的病原，可引起牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR）、传染性脓疱性外阴阴道炎（Infectious Pustular Vulvovaginitis，IPV）和传染性龟头皮炎（Infectious Pustular Balanoposthitis，IBP），以及结膜炎、脑脊髓炎、乳腺炎、肠炎和流产，还可诱发免疫抑制继发多种病原体感染，对全球养牛业危害巨大。自1995年Miller首次在美国报道该病以来，IBR已呈现出全球性流行的态势，这给世界养牛业造成了巨大的经济损失。牛感染IBRV耐过后或恢复健康的牛体内仍存在病毒，其可长期潜伏于神经细胞中。当出现应激因子如长途运输、怀孕、分娩及饲养环境发生变化时，潜伏的病毒活化后并向外界排毒，转变成持续性感染。因此，牛群中的IBRV病原监测势在必行，刻不容缓。鉴于其危害性，世界动物卫生组织（OIE）将其列为B类传染病，我国亦将其列为二类传染病。临床诊断是评估免疫效果、监测牛群健康和诊断疾病的必要手段。

为有效防控牛传染性鼻气管炎，现已开发出多种IBRV诊断技术，主要可概括为病原学诊断和血清学检测，其中病原学诊断技术主要包括病毒分离与荧光定量PCR方法。OIE推荐的IBRV病原监测的方法主要是实时荧光PCR法，需要一定的检测设备、技术和时间，无法在奶牛场进行快速诊断。胶体金免疫层析方法是将胶体金标记的抗体或抗原包被于玻璃纤维素膜或其他载体上，将相关抗原或抗体固相连接在硝酸纤维膜上，应用层析法的原理检测样品中的抗原或抗体的快速检测技术，具有简单、快速、准确和无污染的特点，适用于现场检测。

目前，还未见到用于检测IBRV的胶体金试纸条的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是使IBRV的检测更加简便快捷。

为解决上述技术问题，本发明提供一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的胶体金试纸条。

所述胶体金试纸条包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述金标垫上包被有胶体金标记的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体的名称为2D6，由保藏编号为CGMCC No. 23006的杂交瘤细胞分泌；所述硝酸纤维素膜上设有检测线，所述检测线上包被有抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体。

在所述试纸条的一些实施例中，所述胶体金的粒径为30～40 nm；所述胶体金标记的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体的包被浓度为5～50 μg/ml。

在所述试纸条的一些实施例中，所述抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体的包被浓度为1.0～1.5 mg/ml。

在所述试纸条的一些实施例中，所述金标垫上还包被有胶体金标记的小鼠IgG；所述硝酸纤维素膜上还设有与所述检测线间隔一定距离的质控线，所述质控线上包被有抗小鼠IgG的抗体。

在所述试纸条的一些实施例中，所述胶体金标记的小鼠IgG的包被浓度为5～25 μg/ml；所述抗小鼠IgG的抗体的包被浓度为1.0～1.5 mg/ml。

本发明还提供制备任一所述的胶体金试纸条的方法，包括如下步骤：

（1）用胶体金标记上述抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体2D6并将其包被于玻璃纤维素膜上，得到金标垫；

（2）在硝酸纤维素膜上用抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体进行划线包被，得到检测线；

（3）将样品垫、步骤（1）制备的金标垫、步骤（2）制备的硝酸纤维素膜、吸水垫沿层析方向依次搭接粘贴在底板上。

在所述方法的一些实施例中，所述胶体金的粒径为30～40 nm；胶体金标记的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体的包被浓度为5～50 μg/ml。

在所述方法的一些实施例中，所述抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体的包被浓度为1.0～1.5 mg/ml。

在所述方法的一些实施例中，所述步骤（1）还包括将胶体金标记的小鼠IgG包被于所述玻璃纤维素膜上；所述步骤（2）还包括用抗小鼠IgG的抗体在所述硝酸纤维素膜上与所述检测线间隔一定距离进行划线包被，得到质控线。

在所述方法的一些实施例中，所述胶体金标记的小鼠IgG的包被浓度为5～25 μg/ml；所述抗小鼠IgG的抗体的包被浓度为1.0～1.5 mg/ml。

本发明采用双抗体夹心法筛选出能够配对检测IBRV病毒的抗体，开发了能够快速、准确检测IBRV病毒的胶体金试纸条。该试纸条以单克隆抗体2D6为检测抗体，以IBRV多克隆抗体为捕获抗体。其工作原理为：将样品液滴加在样品垫上，样品液在毛细作用下朝着吸水垫流动，溶解金标垫上的胶体金标记的检测抗体后，若样品液中含有IBRV，则IBRV与检测抗体发生特异性结合，形成复合物A（胶体金-检测抗体-IBRV）；复合物A随着样品液继续朝着吸水垫流动，当流动到硝酸纤维素膜上的检测线（T线）时，复合物A与T线上的捕获抗体发生特异性结合，形成复合物B（胶体金-检测抗体-IBRV-捕获抗体），复合物B聚集在T线上形成肉眼可见的条带；当样品液流动到硝酸纤维素膜上的质控线（C线）时，溶解在样品液中的胶体金标记的质控抗原与C线上的质控抗体发生特异性结合，形成复合物C（胶体金-质控抗原-质控抗体），复合物C聚集在C线上形成肉眼可见的条带。结果判定标准：若T线没有条带，C线有条带，则判定为IBRV阴性；若T线和C线均有条带，则判定为IBRV阳性；若C线没有条带，则判定为无效。

经实验证明，本发明的胶体金试纸条具有以下优点：

（1）灵敏度高：该试纸条针对IBRV病毒的最低检测限为4.04×10⁴TCID₅₀/mL；

（2）特异性强：该试纸条只能与牛传染性鼻气管炎病毒发生特异性反应，与其他病毒和细菌无反应；

（3）稳定性好：该试纸条在4℃或室温（22~25℃）下保存12个月后，检测IBRV的灵敏度与特异性没有明显变化；

（4）准确性高：针对采集自昌平某牛场的66份样品，该试纸条和荧光定量PCR的检测结果的总符合率为96.9%。

分泌单克隆抗体2D6的杂交瘤细胞的保藏信息如下：

生物材料（株）：2D6

分类命名：杂交瘤细胞

保藏日期：2021年07月14日

保藏编号：CGMCC No. 23006

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1为采用蔗糖梯度密度离心法对病毒液进行浓缩和纯化的结果；在40%蔗糖和60%蔗糖分层处出现大量的白色混合物。

图2为重组杆状病毒rBac-gD接种High Five细胞后48 h、60 h、72 h、96 h的细胞培养上清的Western blot分析；泳道：1为空白对照；2为rBac-gD病毒P4代毒感染SF9细胞后，当细胞病变约为80%时收集的细胞培养上清，表示为P4-gD-Bac-SF9；3、4、5、6分别为rBac-gD病毒接种High Five细胞后48 h、60 h、72 h、96 h的细胞培养上清；M为蛋白分子marker，从上倒下依次为170kD、130kD、100kD、70kD、55kD、40kD、35kD、25kD。

图3为重组gD蛋白纯化结果的SDS-PAGE检测；泳道：1为原液；2为流穿液；3为浓缩后gD蛋白（20mM咪唑）；4为浓缩后gD蛋白（400mM咪唑）；5为浓缩后gD蛋白（50mM咪唑）；M为180 kDa蛋白marker。

图4为单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定；A：阴性对照，B：阳性对照，C：单抗3F8与感染了IBRV的MDBK细胞产生了特异性绿色荧光，D：单抗2D6与感染了IBRV的MDBK细胞产生了特异性绿色荧光；图中标尺＝25μm。

图5为IBRV多抗纯化结果的SDS-PAGE检测；泳道：M为180kDa 蛋白 marker；1为未纯化的兔血清；2-7为洗脱液；8为流穿峰；9为洗杂峰。

图6为重组gD蛋白多抗纯化结果的SDS-PAGE检测；泳道：M为180 kDa 蛋白marker；1-4为洗脱液；5-6为洗杂峰；7为未纯化的兔血清；8-9为流穿峰。

图7为胶体金试纸条的结构示意图。

图8为不同浓度的金标抗体（2D6）在530nm处的最大吸收光值；横坐标为金标抗体（2D6）的浓度（μg/mL）；纵坐标为530nm处的最大吸收光值。

图9为胶体金标记抗体的封闭液优化实验结果。

图10为本发明的胶体金试纸条的灵敏度检测结果；试纸条从左到右检测的样品液依次为4.04×10⁷TCID₅₀、4.04×10⁶TCID₅₀、4.04×10⁵TCID₅₀、4.04×10⁴TCID₅₀、4.04×10³TCID₅₀的IBRV病毒液，和PBS。

图11为本发明的胶体金试纸条的特异性检测结果；试纸条从左到右检测的样品液依次为4.04×10⁶TCID₅₀的牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67、6.32×10⁶TCID₅₀的牛病毒性腹泻/黏膜病毒ISO39、2.19×10⁶TCID₅₀牛冠状病毒J1109、7.59×10⁶TCID₅₀牛轮状病毒J0721、大肠杆菌DH5α的细胞培养物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

动物：6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠、2Kg SPF级实验兔均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

细胞：MDBK细胞、High Five细胞、SF9细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、大肠杆菌DH5α由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供，上述细胞均可商购获得。

病毒：牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）Bartha Nu/67标准株由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供，为已知的牛疱疹病毒Ⅰ型毒株，已在文献Xu J, Zhang X, Zhou S,Shen J, Yang D, Wu J, Li X, Li M, Huang X, Sealy JE, Iqbal M, Li Y. A DNAaptamer efficiently inhibits the infectivity of Bovine herpesvirus 1 byblocking viral entry. Sci Rep. 2017 Sep 18;7(1):11796. doi: 10.1038/s41598-017-10070-1. PMID: 28924154; PMCID: PMC5603541.中公开。牛病毒性腹泻/黏膜病毒ISO39、牛冠状病毒J1109、牛轮状病毒J0721，由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供。以上病毒本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

血清：IBRV标准阳性血清和标准阴性血清购自中国兽医监察所。

试剂：HRP标记的山羊抗牛IgG购自Sigma-Aldrich，产品编号为SAB3700005。HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自Sigma-Aldrich，产品编号为A9309。HAT培养基购自Sigma-Aldrich，产品编号为H0262。HT培养基购自Sigma-Aldrich，产品编号为H0137。DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司。HauCl₄、PEG20000、PEG6000、柠檬酸三钠、PVP-30、Tris-base、酪蛋白、磷酸氢二钠、聚乙烯醇、磷酸二氢钾、BSA和叠氮钠购自北京索莱宝科技有限公司。

耗材：样品垫、玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC底板、试纸条外壳均购自上海金标生物科技有限公司。

PBS：称取磷酸氢二钠（含12个结晶水）2.9g、磷酸二氢钾 0.2g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，加入1000ml纯化水搅拌溶解。

若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

实施例1. 抗体的制备

1. IBRV病毒的纯化

准备好单层生长的MDBK细胞，以MOI=1的比例加入IBRV（Bartha Nu/67标准株）感作1h，随后加入含2%（v/v）FBS的DMEM培养基，37℃培养2-3天。当细胞CPE（致细胞病变效应）达到80%左右时，将其放于-80℃冰箱中反复冻融三次，离心收集上清液（病毒液）。采用蔗糖梯度密度离心法对病毒液进行浓缩和纯化，步骤如下：

（1）剪适当长度的透析袋MD25（北京索莱宝科技有限公司），置于500 mL洗液（2%NaCO₃+1mmol/L EDTA）中，煮沸10min。

（2）用去离子水清洗透析袋后，置于500 mL 1mmol/L EDTA•2Na（pH8.0）中，煮沸10min。

（3）冷却后用去离子水清洗透析袋，然后浸入50%乙醇中，置于4℃待用。

（4）用去离子水将预处理过的透析袋里外清洗后置于适宜槽中。向透析袋内加入病毒液，用夹子夹住透析袋的两端。

（5）用适量PEG6000将透析袋覆盖，直至病毒液浓缩至20~30 mL左右。

（6）吸出病毒液，用5 mL PBS清洗透析袋内部，将吸附在透析袋内壁上的病毒洗脱下来，合并入浓缩的病毒液中。

（7）将浓缩的病毒液于5000 r/min（4500×g）离心30 min，收集上清。

（8）制备蔗糖梯度管，利用长针头向高速离心管中从上至下依次加入浓度分别为20%、40%、60%的蔗糖溶液各5mL，最后缓慢加入上一步收集的上清。

（9）于35000 r/min（54200×g）超速离心2 h，使用注射器小心吸取40%蔗糖和60%蔗糖分层处的病毒条带。用10 mL PBS溶解沉淀，分装后置于-70℃保存备用。

结果如图1所示，采用蔗糖梯度密度离心法对收获的6 L病毒液进行浓缩和纯化，在40%蔗糖和60%蔗糖分层处出现大量的白色混合物。用分光光度计测定纯化的病毒液的A260和A280并计算蛋白浓度。最终浓缩病毒的蛋白浓度为27.9mg/mL。

2. 重组gD蛋白的制备

取10 mL重组杆状病毒rBac-gD接种100 mL 处于对数生长期的High Five细胞，置于27℃摇床中，140 rpm悬浮培养。rBac-gD为本实验室前期制备的重组杆状病毒，其含有能够表达重组gD蛋白的重组穿梭杆粒Bacmid-gD。rBac-gD的制备方法记载在申请号为2021104031189，申请日为2021年04月14日，发明名称为“用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的中和抗体的阻断ELISA试剂盒及其应用”的中国发明专利中。在此通过引用将该专利的全部内容合并到本文中。

分别于48 h、60 h、72 h、96 h 收集细胞培养上清，进行Western blot分析，确定重组gD蛋白的最佳表达条件。具体地，按照每孔15 µL的量上样后进行SDS-PAGE，SDS-PAGE结束后，按照常规转印方法进行转印。转移完毕后，PVDF膜用含5%脱脂奶的PBST溶液封闭作用2h；用PBST将IBRV标准阳性血清按照1:1000倍稀释后作为一抗，25℃孵育2 h，PBST洗膜5次，每次5 min；用PBST将HRP标记的山羊抗牛IgG（Sigma，SAB3700005）按照1:10000倍稀释后作为二抗，25℃孵育2h，PBST洗膜5次，每次5 min；化学发光并拍照保存。

Western blot结果如图2所示，泳道1为空白对照；泳道2为rBac-gD病毒P4代毒感染SF9细胞后，当细胞病变约为80%时收集的细胞培养上清；泳道3、4、5、6分别为rBac-gD病毒接种High Five细胞后48 h、60 h、72 h、96 h的细胞培养上清。结果表明，重组杆状病毒rBac-gD接种High Five细胞72h后，蛋白的表达量最高。

取30 mL 重组杆状病毒rBac-gD接种300 mL High Five细胞，置于27℃摇床中，140 rpm悬浮培养72h。将细胞培养液于12000 rpm离心30 min，收集上清，利用His-镍柱（Qiagen，70971）进行蛋白纯化。在4℃条件下，用5倍柱体积（约50 mL）的ddH₂O低流速置换出His-镍柱中的20%乙醇。过2倍柱体积（约20mL）的0.2M NiCl₂至读数稳定。过5倍柱体积的ddH₂O洗去未结合的Ni离子。过5倍柱体积的lysis buffer（20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.0）平衡His-镍柱。4℃条件下将细胞培养上清过夜循环过His-镍柱，上样前留样，流出液留样。用含20 mM咪唑的lysis buffer，洗至OD280吸收值稳定，留样。用含50 mM咪唑的lysisbuffer，洗至OD280吸收值稳定，留样，加入终浓度为1%的PMSF。用含400 mM咪唑的lysisbuffer，洗至OD280吸收值稳定，留样，加入终浓度为1%的PMSF。依次加入5倍柱体积的ddH₂O、EDTA溶液（0.5M）、ddH₂O、NaOH溶液（0.5M）、ddH₂O和20%乙醇处理Ni柱。

通过SDS-PAGE检测蛋白的纯化结果。如图3所示，泳道：1为原液；2为流穿液；3为浓缩后gD蛋白（20mM咪唑）；4为浓缩后gD蛋白（400mM咪唑）；5为浓缩后gD蛋白（50mM咪唑）；M为180 kDa蛋白marker。

将对应单一条带的样品置于50mL的蛋白浓缩管中，加入终浓度为1 mM的DTT，于4℃，2900 rpm离心直至溶液剩至2 mL左右时。浓缩后的重组gD蛋白用核酸蛋白浓度分析仪测定蛋白浓度为2 mg/mL，保存于30%的甘油中，分装，-80℃冻存待用。

3. 单克隆抗体的制备

（1）动物免疫

将纯化的IBRV病毒液（Bartha Nu/67标准株）与等体积弗氏完全佐剂（Sigma-Aldrich，F5881）混合并乳化完全后，对6～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠进行首次免疫，免疫剂量为50 µg/只。首次免疫2周后，将等体积的IBRV病毒液（Bartha Nu/67标准株）与弗氏不完全佐剂（Sigma-Aldrich，F5506）充分乳化后，进行第2次、第3次和第4次免疫，免疫剂量为50 µg/只，每次免疫间隔2周。

（2）血清效价的测定

利用第3次免疫后的小鼠阳性血清建立杂交瘤筛选的间接ELISA方法，用棋盘法进行最佳抗原包被浓度和最佳阳性血清稀释度的标定。间接ELISA方法如下：

包被：将浓缩后的重组gD蛋白以5 μg/ml、2.5 μg/ml一直倍比稀释至0.1562 μg/ml后，按照每孔100 μL加入酶标板，酶标板最后一行加入PBST作为抗原阴性对照，37℃孵育1h后，4℃过夜。

封闭：用洗板机洗板5次后，每孔加入300 μL采用PBST配制的5%的脱脂奶，37℃封闭2 h。

孵一抗：用PBST对第3次免疫后的小鼠的阳性及阴性血清进行稀释；洗板后加入稀释的血清，100 μL/孔，37℃孵育1 h。

孵二抗：用PBST将HRP标记的山羊抗小鼠IgG（Sigma-Aldrich，A9309）进行1:10000倍稀释；洗板后加入稀释的二抗，100 μL/孔，37℃孵育1 h。

显色：洗板后加入TMB显色液（Solarbio，PR1210），100 μL/孔，37℃避光反应15min，然后加入50 μL 2M硫酸终止反应。读取450 nm波长处的吸光值（OD_450nm）。

选取OD_450nm值最接近1.0的孔所对应的抗原浓度和血清稀释度为最佳抗原包被浓度（250ng/孔）和最佳阳性血清稀释度（1:1）。第4次免疫后一周进行小鼠眼球采血，采用最佳抗原包被浓度和最佳阳性血清稀释度，按照上述间接ELISA方法测定小鼠血清效价。选择效价最高的两只小鼠，于细胞融合前3天进行腹腔加强免疫，免疫剂量为50 µg/只。

（3）细胞融合和筛选

无菌环境下取加强免疫后的BALB/c小鼠的脾脏研制成脾细胞悬液，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照5:1的细胞数量比进行融合，融合后铺于6块96孔细胞培养板，用含有20%胎牛血清的HAT培养基（Sigma-Aldrich，H0262）进行选择性培养，7-12d逐步换用HT培养基（Sigma-Aldrich，H0137）。融合后第10天，用IBRV作为包被抗原，按照上述间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行初步筛选，IBRV的包被量为500 ng/孔。隔2天重复检测一次，筛选出对IBRV为抗体阳性的孔。将6块板中所有检测结果为强阳性的孔的融合细胞转到48孔板进行扩大培养，同时选择5个ELISA值高的孔进行第一次亚克隆。按照同样的方法再进行2次亚克隆，直到阳性率为100%。获得了两株能稳定分泌抗IBRV病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，编号为3F8和2D6，冻存于液氮中。杂交瘤细胞株3F8和2D6分泌的单克隆抗体分别表示为单抗3F8和单抗2D6。

（4）单克隆抗体的鉴定

MDBK细胞经胰酶消化后，取10⁵细胞加入含有飞片的六孔板中，置于37℃，5%CO₂培养箱中培养至细胞成单层，按100 TCID50的病毒量接种IBRV。接毒24h后，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次；0.1% TritonX-100作用15 min，PBS洗3次；用含5% BSA的PBS作为封闭液在室温下封闭1h，PBS洗3次；在不同培养孔中分别加3F8和2D6杂交瘤细胞培养上清并设置阴性对照和阳性对照（阴性对照为空白对照孔，阳性对照孔加入1:100倍稀释的小鼠IBRV阳性血清），37℃孵育1h，PBS洗3次，每次5min；加FITC标记的山羊抗小鼠IgG（Sigma-Aldrich，货号F5387）（用封闭液按1:1000稀释），室温避光作用1h，PBS洗3次，每次5min；加DAPI（Sigma-Aldrich，货号D9542）（去离子水1:10000稀释），室温避光作用6min，去离子水洗2次，用防淬灭剂固定在载玻片上，荧光显微镜下观察。结果如图4所示，单抗3F8和2D6与感染了IBRV的MDBK细胞产生了特异性绿色荧光。

4. 多克隆抗体的制备

将上述纯化的IBRV病毒液（27.9 mg/mL）和重组gD蛋白溶液（2 mg/mL）分别与等体积的弗氏完全佐剂（Sigma-Aldrich，F5881）混合并充分乳化后，对2Kg SPF级实验兔进行首次免疫，免疫剂量为0.5mg/只。首次免疫2周后，将上述纯化的IBRV病毒液（27.9 mg/mL）和重组gD蛋白溶液（2 mg/mL）分别与等体积的弗氏不完全佐剂（Sigma-Aldrich，F5506）混合并充分乳化后，进行第2次、第3次和第4次免疫，每次每只免疫1mg，免疫间隔2周。IBRV免疫组和重组gD蛋白免疫组各免疫三只兔子，经四次免疫后，采血，分离血清，获得分别针对IBRV病毒与重组gD蛋白的多克隆抗体。每组取10 mL兔血清，利用Protein A/G纯化柱（Thermo Fisher, 货号：TF266548）进行抗体纯化。步骤如下：将血清与binding buffer（Thermo Fisher, 货号：21019）等体积混合，4℃，10000rpm离心30min，采用0.45um滤膜过滤；于4℃条件下，用5倍柱体积的binding buffer（约50mL）置换含有2%叠氮化钠的ddH₂O，样品上柱，用5倍柱体积的binding buffer洗杂，用5倍柱体积的Elution buffer（ThermoFisher, 货号：21027）洗脱，收集的洗脱液加入100μL PBS，直至OD280的数值基本无变化。依次使用5倍柱体积的Elution buffer、5倍柱体积的含有2%的叠氮化钠的ddH₂O处理柱子。通过SDS-PAGE检测多抗的纯化结果。

IBRV多抗纯化结果如图5所示，泳道：1为未纯化的兔血清；2-7为洗脱液；8为流穿峰；9为洗杂峰。重组gD蛋白多抗纯化结果如图6所示，泳道：1-4为洗脱液；5-6为洗杂峰；7为未纯化的兔血清；8-9为流穿峰。

使用核酸蛋白浓度分析仪（Nanodrop，Denovix DS-11+）测定抗体浓度，结果显示，IBRV多抗纯化后的浓度为9.8 mg/mL，重组gD蛋白多抗纯化后的浓度为4.7 mg/mL。将两种多抗置于-70℃分装保存备用。

实施例2. 用于检测IBRV的胶体金试纸条的制备

1. 胶体金标记抗体的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，步骤如下：配制0.01% HauCl₄水溶液，取100ml加热至沸腾；在搅拌下加入6.5 ml 1%柠檬酸三钠水溶液；继续加热煮沸15min；冷却至室温后加入ddH₂O定容至500 ml，得到胶体金溶液。制备的胶体金溶液澄清透亮，无悬浮物和沉淀杂质，其中胶体金粒径为35 nm。

抗体的胶体金标记方法：取10 mL的胶体金溶液，用0.2 M K₂CO₃调节pH至8.5，在搅拌状态下逐滴加入1 mg抗体（单抗3F8／单抗2D6／IBRV多抗／重组gD蛋白多抗），轻轻搅拌1h，然后逐滴加入封闭液（用PBST 配制的10%的PEG20000）至其终浓度为0.2%，搅拌0.5 h后置于4℃过夜。次日，于1500 rpm离心15 min，收集上清。将收集的上清于10000 rpm离心30min，按照1/20的体积比加入含有1% BSA的PBS溶液重悬沉淀，得到金标抗体溶液，于4℃保存备用。按照同样的方法制备胶体金标记的鼠IgG（碧云天，A7028）。

2. 样品垫的预处理

配制样品垫处理液：称取10 g PVP-30、4.8 g Tris-base、5 g 酪蛋白、6.2 g 磷酸氢二钠，溶解于ddH₂O中，用盐酸调节pH为8.0，最后用ddH₂O定容至1L。将样品垫置于样品垫处理液中30 min，然后放置在37℃烘干16 h，铝箔袋封装后，室温保存。

3. 金标垫的制备

配制金标垫处理液：称取5 g聚乙烯醇、4.8 g 磷酸氢二钠、5 g BSA、1 g叠氮钠，溶解于ddH₂O中，用NaOH调节pH为8.0，最后用ddH₂O定容至1L。预处理：将玻璃纤维素膜置于金标垫处理液中30 min，然后置于37℃烘干16 h，铝箔袋封装后，室温保存。利用喷金仪将浓度为5～50 μg/ml的金标抗体溶液（单抗3F8／单抗2D6／IBRV多抗／重组gD蛋白多抗）和浓度为5～25 μg/ml胶体金标记的鼠IgG均匀地包被于预处理过的玻璃纤维素膜上，每条8 mm玻璃纤维素膜铺2.5 μg胶体金标记的抗体和1μg胶体金标记的鼠IgG，然后置于37℃烘干16h，得到金标垫，铝箔袋封装后，室温保存。

4. 硝酸纤维素膜的包被

利用PBST将未使用胶体金标记的单抗3F8、单抗2D6、IBRV多抗、重组gD蛋白的多抗，以及羊抗鼠IgG（Sigma-Aldrich, A4416）分别稀释至1 mg/mL。使用三维平面划膜仪（上海金标生物科技有限公司，HM3030）将稀释的单抗或多抗以1μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜上划线得到检测线（T线）。使用三维平面划膜仪将稀释的羊抗鼠IgG以1μL/cm的喷样量在硝酸纤维素膜上划线得到质控线（C线）。检测线与质控线的距离为5 mm。将划线后的硝酸纤维素膜置于37℃烘干16 h，铝箔袋封装后，室温保存。

5. 胶体金试纸条的组装

按照图7所示的结构，将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘贴到PVC底板上，相邻的部件之间相互重叠2 mm，制成大板。然后利用切条机（上海金标生物科技有限公司，ZQ2402）将大板切成4 mm宽的试纸条，装上塑料的试纸条外壳（上海金标生物科技有限公司），用铝箔袋密封包装。试纸条外壳上设有样品孔和观察窗，样品孔的下方为样品垫，观察窗的下方为硝酸纤维素膜上检测线和质控线的位置。

6. 抗体配对筛选试验

将制备的胶体金标记抗体（单抗3F8、单抗2D6、IBRV多抗、重组gD蛋白多抗）分别作为检测抗体，将未使用胶体金标记的单抗3F8、单抗2D6、IBRV多抗、重组gD蛋白多抗分别作为捕获抗体，按照表1所列的方式进行抗体组合。按照前述的试纸条的制备方法，将检测抗体包被于预处理过的玻璃纤维素膜上制成金标垫，将捕获抗体在硝酸纤维素膜上划线得到检测线，并组装成试纸条。

表1 抗体组合方式

组合

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

捕获抗体

3F8

2D6

gD

IBRV

检测抗体

2D6

gD

IBRV

3F8

gD

IBRV

3F8

2D6

IBRV

3F8

2D6

gD

注：表中3F8表示单抗3F8，2D6表示单抗2D6，IBRV表示IBRV多抗，gD表示重组gD蛋白多抗。

通过双抗夹心方法进行抗体配对试验。方法如下：以4.04×10⁷TCID₅₀的IBRV病毒液作为样品液，吸取80 μl样品液滴加到各试纸条的样品垫上，若T线没有条带，C线有条带，则判定为阴性；若T线和C线均有条带，则判定为阳性；若C线没有条带，则判定为无效。对照组使用PBS代替样品液，其余操作同样品组。

结果显示，抗体组合1-9和12的试纸条在滴加样品液后，T线未出现特异性条带；而抗体组合10和11的试纸条在滴加样品液后，T线出现特异性条带，说明IBRV多抗作为捕获抗体时，金标单抗3F8和金标单抗2D6与其配对成功，能够用于IBRV病毒检测。分别以金标单抗3F8和金标单抗2D6为检测抗体制备金标垫，并以IBRV多抗为捕获抗体在硝酸纤维素膜上划线包被，制备胶体金试纸条，命名为试纸条3F8与试纸条2D6。

为了比较单抗3F8和单抗2D6与IBRV病毒的结合能力，我们将4.04×10⁷TCID₅₀的IBRV病毒液进行10^-1，10^-2，10^-3，10^-4十倍梯度稀释，然后各取80μl样品，分别使用试纸条3F8与试纸条2D6进行检测。结果显示，试纸条2D6最低能够检测到10^-3稀释的IBRV病毒液，而试纸条3F8最低能够检测到10^-1稀释的IBRV病毒液。因此，在后续实验中，我们以IBRV多抗为捕获抗体，以胶体金标记的2D6为检测抗体制备胶体金试纸条。

杂交瘤细胞2D6已于2021年07月14日送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行专利保藏，保藏编号为CGMCC No. 23006。

7. 胶体金试纸条的优化

（1）金标垫上抗体包被浓度的优化

将胶体金标记的单抗2D6进行系列稀释，得到浓度分别为100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL的金标抗体。用紫外分光光度计检测不同浓度的金标抗体在530nm处的最大吸收光值。结果如图8所示，金标抗体的最佳包被浓度为25μg/mL。

（2）T线上IBRV多抗包被浓度的优化

使用浓度为25μg/mL的金标抗体（2D6）制备金标垫，分别用不同浓度的IBRV多抗（2mg/mL，1.5mg/mL，1.0 mg/mL，0.5 mg/mL）在硝酸纤维素膜上划线包被，按照前述方法组装成试纸条后，分别检测阳性样品（4.04×10⁷TCID₅₀的IBRV病毒液）和阴性样品（PBS）。结果显示，当IBRV多抗的包被浓度为1.0 mg/mL时，用试纸条检测阴性样品时T线无特异性条带，用试纸条检测阳性样品时T线条带清晰。因此，T线上IBRV多抗的最佳包被浓度是1.0 mg/ml。

（3）胶体金标记抗体的封闭液的选择

按照前述胶体金标记方法对单抗2D6进行胶体金标记，分别使用PBST+0.5%BSA、PBST+10% PEG20000作为封闭液进行封闭。分别使用PBST+0.5%BSA封闭的金标抗体（25μg/mL）和PBST+10% PEG20000封闭的金标抗体（25μg/mL）制备金标垫，用1.0 mg/mL的IBRV多抗溶液在硝酸纤维素膜上划线包被，按照前述方法组装成试纸条后，检测阴性样品（PBS）。结果如图9所示，PBST+10% PEG20000的封闭效果更好，C线条带清晰，T线无非特异结合。

（4）样品稀释液的优化

使用PBST+10% PEG20000封闭的金标抗体（25μg/mL）制备金标垫，用1.0 mg/mL的IBRV多抗溶液在硝酸纤维素膜上划线包被，按照前述方法组装成试纸条。分别使用PBST、PBST+0.5%BSA、PBST+0.5%酪蛋白作为样品稀释液，将待检的IBRV病毒稀释成4.04×10⁷TCID₅₀的IBRV样品液。取样品液80 μl滴加到试纸条的样品垫上进行检测。结果显示，采用PBST+0.5%BSA配制的样品液的检测效果最好，T线条带明显，C线条带清晰。

实施例3. 用于检测IBRV的胶体金试纸条的性能验证

按照实施例2中1-5的方法制备用于检测IBRV的胶体金试纸条，其中，用胶体金标记单抗2D6，胶体金标记后使用PBST+10% PEG20000进行封闭；用浓度为25μg/mL的胶体金标记的单抗2D6溶液以及浓度为10μg /ml胶体金标记的鼠IgG包被预处理过的玻璃纤维素膜，得到金标垫；用浓度为1.0 mg/ml 的IBRV多抗溶液在硝酸纤维素膜上划线，得到检测线（T线）。对制备的胶体金试纸条进行灵敏度、特异性、稳定性和符合性检测。

1、灵敏度检测

用PBST+0.5%BSA将4.04×10⁷TCID₅₀的IBRV病毒液进行10倍梯度稀释，每个梯度取100 μl作为样品液，分别滴加到胶体金试纸条的样品垫上，根据试纸条T线颜色变化判定结果。若T线没有条带，C线有条带，则判定为阴性；若T线和C线均有条带，则判定为阳性；若C线没有条带，则判定为无效。对照组使用PBS代替样品液，其余操作相同。分析和比较试验结果，评估试纸条的敏感性。

结果如图10所示，本发明的胶体金试纸条对IBRV病毒的最低检出限为4.04×10⁴TCID₅₀，具有较高的敏感性。

2、特异性检测

用制备的胶体金试纸条分别对牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67（4.04×10⁶TCID₅₀）、牛病毒性腹泻/黏膜病毒ISO39（6.32×10⁶TCID₅₀）、牛冠状病毒J1109（2.19×10⁶TCID₅₀）、牛轮状病毒J0721（7.59×10⁶TCID₅₀）、大肠杆菌DH5α的细胞培养物进行特异性检测。大肠杆菌DH5α的细胞培养物为大肠杆菌DH5α在LB液体培养基中，于37℃、120rpm条件下培养16h的培养物。分别吸取各样品液100 μl，滴加至试纸条的加样孔中，15 min内观察结果。若T线没有条带，C线有条带，则判定为阴性；若T线和C线均有条带，则判定为阳性；若C线没有条带，则判定为无效。

结果如图11所示，本发明的胶体金试纸条只能与牛传染性鼻气管炎病毒发生特异性反应，与其他病毒和细菌无反应，说明试纸条具有高特异性。

3、稳定性检测

将制备的试纸条分别储存于4℃及室温（22~25℃）环境下，分别于储存后1个月、3个月、6个月、9个月、12个月取出，按照前述方法对试纸条进行灵敏度检测及特异性检测，观察检测结果是否发生变化。

结果表明：本发明的胶体金试纸条在4℃与室温（22~25℃）条件下保存12个月后，其灵敏度与特异性没有明显变化，说明该胶体金试纸条的稳定性良好。

4、符合性检测

从昌平某牛场采集36份鼻拭子与30份阴道拭子，将每个拭子转移至单独的Eppendorf管中，在靠近棉签的末端压断，每管加入500μl PBS，混匀后，取出拭子的棉签，12000rpm离心1min，收集上清液。分别利用本发明的胶体金试纸条与荧光定量PCR方法检测各上清液中是否含有IBRV。

胶体金试纸条检测：吸取100 μl上清液，滴加至试纸条的加样孔中，15 min内观察结果。若T线没有条带，C线有条带，则判定为阴性；若T线和C线均有条带，则判定为阳性；若C线没有条带，则判定为无效。

荧光定量PCR方法：取300μl上清液，使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（天根，DP315）按照试剂盒说明书提取DNA。以DNA为模板，使用文献（Jian Xu, Yunhong Cai, BoJiang, Xiaoyang Li, Huan Jin, Wenxiao Liu, Zimeng Kong, Jiabing Hong, JoshuaE. Sealy, Munir Iqbal, Yongqing Li. An optimized aptamer-binding viraltegument protein VP8 inhibits the production of Bovine Herpesvirus-1 throughblocking nucleocytoplasmic shuttling. International Journal of BiologicalMacromolecules 140 (2019) 1226–1238.）中2.11. Real-time PCR assays中使用的扩增gB基因200bp片段的正向引物和反向引物进行荧光定量PCR。

荧光定量PCR体系：DNA 100 ng，gB-F引物 1μl，gB-R引物 1μl，iTaq universalSYBR Green supermix (2×)(Bio-Rad) 10μl，补充ddH₂O至20μl。荧光定量PCR程序：95℃10min；95℃ 30s，56℃ 30s，共40个循环。Ct值>35判为阴性，Ct值<35判为阳性。

结果如表2所示，本发明的胶体金试纸条和荧光定量PCR的检测结果的总符合率=（51+13）/66=96.9%。

表2

		本发明的试纸条	本发明的试纸条
							IBRV阴性	IBRV阳性	合计
荧光定量PCR法	IBRV阴性	51	0	51
					荧光定量PCR法	IBRV阳性	2	13	15
	合计	53	13	66

Claims

1.一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的胶体金试纸条，包括底板以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述金标垫上包被有胶体金标记的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.23006的杂交瘤细胞分泌；所述硝酸纤维素膜上设有检测线，所述检测线上包被有抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金的粒径为30～40nm；所述胶体金标记的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体的包被浓度为5～50 μg/ml。

3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体的包被浓度为1.0～1.5mg/ml。

4.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标垫上还包被有胶体金标记的小鼠IgG；所述硝酸纤维素膜上还设有与所述检测线间隔一定距离的质控线，所述质控线上包被有抗小鼠IgG的抗体。

5.根据权利要求4所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的小鼠IgG的包被浓度为5～25μg/ml；所述抗小鼠IgG的抗体的包被浓度为1.0～1.5mg/ml。

6.制备权利要求1-5任一所述的胶体金试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用胶体金标记权利要求1中所述的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体并将其包被于玻璃纤维素膜上，得到金标垫；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胶体金的粒径为30～40 nm；胶体金标记的抗牛传染性鼻气管炎病毒的单克隆抗体的包被浓度为5～50 μg/ml。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抗牛传染性鼻气管炎病毒的多克隆抗体的包被浓度为1.0～1.5mg/ml。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）还包括将胶体金标记的小鼠IgG包被于所述玻璃纤维素膜上；所述步骤（2）还包括用抗小鼠IgG的抗体在所述硝酸纤维素膜上与所述检测线间隔一定距离进行划线包被，得到质控线。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述胶体金标记的小鼠IgG的包被浓度为5～25μg/ml；所述抗小鼠IgG的抗体的包被浓度为1.0～1.5 mg/ml。