CN113322268A - 一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白及其构建的胶体金免疫层析试纸 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白及其构建的胶体金免疫层析试纸 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒疫病诊断及动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，进一步公开一种基于该重组蛋白构建的胶体金免疫层析试纸，以及检测非洲猪瘟病毒抗体的方法。本发明所述基于非洲猪瘟病毒p72蛋白双抗原夹心的胶体金试纸，用胶体金标记ASFV强免疫原性主要结构蛋白p72的重组抗原，以双抗原夹心的方式进行猪血清中ASFV抗体的检测。本发明所述双抗原夹心的胶体金免疫层析试纸，样品采集后只需与样品稀释液按一定比例混合后滴加至样品孔中，5min就可以出检测结果，且结果准确，并能直接用于检测可疑猪血清中的病毒抗体，特别适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。

Description

一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白及其构建的胶体金免疫层析 试纸
技术领域
本发明属于病毒疫病诊断及动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，进一步公开一种基于该重组蛋白构建的胶体金免疫层析试纸，以及检测非洲猪瘟病毒抗体的方法。
背景技术
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的感染家猪和各种野猪的高度接触性、致死性传染病，其发病率和死亡率均可高达100％，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，更被我国列为一类动物疫病。该病主要的临床症状为高热、内脏器官广泛性出血、呼吸系统和神经系统功能紊乱。ASFV首次于1921年在肯尼亚被发现，随后传播到格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯等邻国，并于2018年传入我国，对我国养猪业造成了巨大的危害，目前尚无有效的疫苗或抗病毒药物用于防控非洲猪瘟。因此，如何实现在临床上快速诊断非洲猪瘟病毒感染，建立特异性强、敏感性高、操作简单、适合非疫区国家(地区)使用的ASFV检测体系及方法，对于ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验领域均具有积极的意义。
ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的重要成员，是目前唯一已知的虫媒DNA病毒，ASFV的中间宿主为钝缘蜱，是其主要的传播媒介。经研究报道，ASFV病毒的生物学特性类似于虹彩病毒科和痘病毒科病毒，该病毒基因组为双股线性DNA，大小约为170-190kb，编码150-170种蛋白，其中包括结构蛋白60-70种，诸如目前研究报道较多的p72蛋白、p30蛋白、p54蛋白、CD2v蛋白、p62蛋白等；此外，该病毒粒子呈20面体对称结构，具有直径大小约为180-220nm的囊膜。ASFV主要感染猪的网状内皮细胞和单核巨噬细胞，健康猪与患病猪或污染物直接接触是非洲猪瘟病毒最主要的传播途径。
ASFV编码蛋白中，p72蛋白是由B646L基因编码，占病毒质量的31％-33％，是病毒最为丰富的一种结构蛋白，其蛋白保守且位于病毒粒子最外层，是病毒主要的核衣壳蛋白，也是病毒最主要的抗原之一，可在感染猪体内产生大量的中和抗体，适用于临床的检测。据研究，p72蛋白产生时间主要为病毒感染后晚期，且根据B646L基因序列的不同，现有技术中将ASFV共分为24个基因型。此外，p72在核苷酸水平上虽然存在差异，但是在氨基酸水平上却相对保守，因此，p72蛋白适合用于临床对非洲猪瘟病毒诊断方法的建立。由于目前尚无有效的疫苗和抗病毒药物用于ASF的防控，因此，建立快速、准确的诊断方法对控制该病的传播和降低经济损失具有至关重要的作用。
根据世界动物卫生组织(OIE)的推荐，目前ASF的诊断技术主要包括病原鉴定和血清学试验。在病原鉴定技术中，鉴于ASFV具有血凝特性，血细胞吸附试验(Hemadsorption，HAD)是鉴定ASFV感染的经典方法之一，并具有较高敏感性。但是，该检测方法中需要制备和培养猪骨髓细胞，不仅费时费力、操作不便，而且不能用于不具有血细胞吸附特性的ASFV毒株的诊断。免疫组化试验(IHC)可用于检测可疑病猪组织器官中ASFV抗原，该方法采用ASFV特定抗体与抗原结合后与底物作用显色，从而标记ASFV抗原存在的区域，适用于所有ASFV毒株，且可以对临床样品其他病毒的感染进行鉴别诊断，但是，该方法则存在操作步骤繁琐及耗时长的问题，且由于要接触病毒，因此需要在专门的P3实验室进行操作，增加了检测难度和要求。此外，聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR、重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)技术和环介导等温扩增(LAMP)技术因具有高灵敏度、检测快速、结果准确等优点，也已成为现有技术中诊断ASFV的重要技术手段之一，但却均需要较昂贵的仪器设备支持，且存在容易污染的缺点，需要重复操作和序列测定等方法进行验证。另外，动物接种试验也是诊断ASFV感染的经典方法之一，但却存在周期长、费用高、易散毒的缺陷。
在血清学检测技术中，酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光试验(IFA)是最常用的检测方法。ELISA方法具有灵敏度高、操作简便、结果准确等优点，已被OIE规定为国际贸易检验方法之一，法国和西班牙已有商品化的试剂盒供应，但是，ELISA方法需要包被抗原(全病毒或者是重组蛋白)，而包被全病毒则存在散毒的风险，包被重组蛋白也存在制备难度大、供应有限、价格昂贵、易漏检等缺点，有待于进一步研发改进。IFA试验需要制备肺泡巨噬细胞用于病毒的培养，存在成本昂贵、操作复杂和散毒的风险，因此IFA试验检测血清中的ASFV抗体的方法并不常用，通常仅作为检测标准使用。
胶体金免疫层析技术相比于RT-PCR、ELISA等常规技术，由于其具有操作简单、检测灵敏度高、特异性好、易保存、检测稳定、综合成本低、受外界因素影响小等优点，可适用于野外和现场诊断、基层单位使用，在近年来得到快速的发展。然而，目前用于ASFV诊断的胶体金试纸条的报道和商品则较少。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白，该重组蛋白适宜于胶体金免疫层析检测体系的构建；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种可用于检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，具有特异性强、敏感性好、重复率高、检测结果准确的优势，适用于临床样品的快速检测；
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种基于所述胶体金免疫层析试纸进行非洲猪瘟病毒检测的方法。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，包括如下步骤：
(1)以非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列为模板合成p72基因片段，并设计如下引物进行p72基因的扩增，扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收：
上游引物：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGTTAGGTACTGTAACGCAG-3’；
下游引物：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTCAATGGCATCAGGAGGAGCT-3’；
(2)选择XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切pCold TF DNA质粒以使其线性化，并将步骤(1)中收集的扩增产物使用Vazyme exnase II同源重组酶同源重组至线性化的pCold TF DNA载体上，构建得到重组质粒；
(3)将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，筛选出阳性克隆，并进行p72重组蛋白的表达及纯化，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列的GenBank收录号为MH766894。
本发明还公开了由所述方法构建得到的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白。
本发明还公开了所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白用于制备检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的用途。
本发明还公开了一种检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，包括底板和外壳，所述底板上依次固定有吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫；
所述金标垫吸附的金标抗原包括胶体金标记的p72重组蛋白和胶体金标记的鸡IgY抗体；
所述固相硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，所述检测线为所述p72重组蛋白，所述质控线为山羊抗鸡IgY抗体。
具体的，所述金标抗原的制备方法包括分别制备所述胶体金标记的p72重组蛋白和所述胶体金标记的鸡IgY抗体后再混匀的步骤；
所述胶体金标记的p72重组蛋白的制备方法如下：取胶体金溶液加入K2CO3溶液混匀，再加入权利要求3所述p72重组蛋白，充分混匀后常温静置，再加入BSA充分混匀后进行常温封闭；离心沉淀胶体金标记物，并加入复溶液进行重悬；
所述胶体金标记的鸡IgY抗体的制备方法如下：取胶体金溶液加入K2CO3溶液混匀，再加入鸡IgY抗体，充分混匀后常温静置，再加入BSA充分混匀后进行常温封闭；离心沉淀胶体金标记物，并加入复溶液进行重悬；
所述复溶液包括20-30％蔗糖、8-12％海藻糖、3-8％Tween-20、0.1-0.3％PEG20000和0.01-0.02mol/L的pH＝9-10的硼酸盐缓冲液。
优选的，所述复溶液包括25％蔗糖、10％海藻糖、5％Tween-20、0.2％PEG20000和0.01mol/L的pH＝9.6的硼酸盐缓冲液。
具体的，所述金标抗原中：
所述胶体金标记的p72重组蛋白的蛋白包被量以p72重组蛋白计为4μg/cm，喷涂量以p72重组蛋白计为1μL/cm；
所述胶体金标记的鸡IgY抗体的喷涂量以IgY抗体计为16ng/cm。
本发明还公开了一种所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括如下步骤：
(1)按照所述方法制备得到所述p72重组蛋白，并将所述p72重组蛋白进行胶体金标记，得到金标抗原；
(2)在所述金标垫上喷涂所述金标抗原，在所述固相硝酸纤维素膜表面喷涂所述检测线和质控线；
(3)在所述底板上依次组装所述吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，加盖外壳，即得。
本发明还公开了所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸在非洲猪瘟病毒体外检测领域中的应用。
本发明还公开了一种检测非洲猪瘟病毒的方法，即包括利用所述胶体金免疫层析试纸进行检测的步骤。
本发明基于非洲猪瘟病毒p72蛋白建立适宜于非洲猪瘟病毒检测的体系和方法，试验通过pCold TF原核表达载体构建得到了表达p72蛋白的重组质粒，并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，进行蛋白表达，经镍柱亲和纯化和分子筛筛选后得到高纯度的重组蛋白，该重组蛋白适宜于双抗原夹心的胶体金免疫层析检测体系的构建，可用于临床上检测非洲猪瘟病毒抗体。
本发明所述基于非洲猪瘟病毒p72蛋白双抗原夹心的胶体金试纸，用ASFV强免疫原性主要结构蛋白p72的重组抗原标记胶体金，以双抗原夹心的方式进行猪血清中ASFV抗体的检测，通过将构建的p72重组蛋白包被于硝酸纤维素膜上标记为T线，山羊抗鸡IgY二抗包被于硝酸纤维素膜上标记为C线，以及用胶体金标记的所述p72重组蛋白和鸡IgY蛋白喷涂至样品垫上形成金标垫。本发明所述双抗原夹心的胶体金免疫层析试纸，样品采集后只需与样品稀释液按一定比例混合后滴加至样品孔中，5min就可以出检测结果，且结果准确，并能直接用于检测可疑猪血浆中的病毒抗体，具有操作简便、快速、结果准确、可测定大量样本、携带方便、易保存的优点，同时胶体金试纸条使用蛋白原料和胶体金试剂较少，可有效节约成本，特别适合现场ASFV血清学诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。
本发明所述基于非洲猪瘟病毒p72蛋白双抗原夹心的胶体金试纸，利用已知非洲猪瘟抗体阴阳性的临床血清和标准阴阳性血清测定胶体金试纸条的特异性、敏感性和可重复性，结果显示该方法特异性强(97％)、敏感性好(100％)，重复率高(100％)，且该试纸检测操作简便、结果准确，适用于临床样品的快速检测，为非洲猪瘟的防控提供一种有效的检测手段。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为所述p72重组蛋白的表达和纯化结果；其中，图1中(A)为p72重组蛋白的SDS-PAGE结果，泳道1为纯化后的p72重组蛋白，泳道2为未纯化的p72重组蛋白，泳道3为空载体对照；图1中(B)为p72重组蛋白的WB结果；
图2为本发明所述胶体金试纸条的特异性试验结果。
具体实施方式
本发明下述实施例中，涉及的材料和试剂包括：
病毒和细胞：非洲猪瘟病毒保存于华南农业大学兽医学院张桂红教授实验室；PAMs细胞取自38日龄的SPF猪，并保存于中国农业大学农业农村部动物流行病学重点实验室；
质粒和菌株：原核表达质粒pCold TF DNA质粒(#3365)购自TaKaRa生物技术有限公司；BL21(DE3)大肠杆菌化学感受态细胞(#CD601-02)购自北京全式金生物技术有限公司；
阴、阳性标准血清和临床血清：非洲猪瘟病毒阴、阳性血清和临床血清由张桂红教授实验室保存；
主要试剂和耗材：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(#9030)购自TaKaRa生物技术有限公司；鸡IgY蛋白(#CY01)和山羊抗鸡IgY抗体(#GCY06)购自杭州启泰生物技术有限公司；氯金酸(HAuCl4)(#254169)、Tween-20(#655204)、Triton X-100(#93443)购自Sigma-Aldrich生物技术有限公司；牛血清白蛋白BSA(#A8020)、D-海藻糖(#G8570)、蔗糖(#S8271)购自北京索莱宝生物技术有限公司；聚酯纤维素膜和硝酸纤维素膜(NC)购自Millipore公司。
如下实施例中，涉及的样品稀释液配制：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H2O3.64g、K2HPO4.3H2O 0.82g、5％(v/v)Tween-20，溶解于1L的双蒸水中，调节pH7.4，得到样品稀释液。
向上述样品稀释液中添加终浓度为25％的蔗糖、10％的D-海藻糖5％、Tween-20、0.2％PEG20000和0.01mol/L的pH＝9.6的硼酸盐缓冲液作为胶体金复溶液。
实施例1p72重组蛋白的表达
以GenBank中公布的非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列(GenBank收录号：MH766894)为模板，由北京擎科生物技术有限公司合成获得p72基因片段。
设计如下表达引物进行p72基因的扩增：
上游引物：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGTTAGGTACTGTAACGCAG-3’；
下游引物：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTCAATGGCATCAGGAGGAGCT-3’。
PCR扩增体系(总体系25μL)包括：
Figure BDA0003084903910000081
具体PCR扩增程序包括：98℃5min；98℃40s，55℃40s，68℃3min，35个循环；68℃10min。
扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用Omega胶回收试剂盒进行胶回收，胶回收产物直接使用或者-20℃保存备用。
选择XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切pCold TF DNA质粒，使其线性化，并将收集的p72扩增产物使用Vazyme exnase II同源重组酶进行同源重组至线性化的pCold TFDNA载体上。
将得到的重组产物转化至BL21(DE3)化学感受态细胞中，经氨苄抗性LB平板筛选和菌液PCR鉴定，筛选出阳性克隆，并送至北京擎科生物技术有限公司进行测序验证，并进一步将经测序验证正确的阳性菌进行p72蛋白的表达。
接种阳性菌(1：1000)至无抗LB培养基中，于37℃、180rpm摇至OD600nm＝0.6-0.8；并分别加入0.1mM、0.2mM、0.5mM和1mM的IPTG进行蛋白表达诱导；分别诱导8h后，于6000rpm离心5min收集菌体。按照100mL菌液离心后加入10mL PBS进行重悬，经涡旋震荡充分混匀后进行超声破碎(超声破碎仪设置参数为：发射5s，间歇5s，功率30％，超声20min)，随后于4℃、12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹(WB)试验验证，并在验证试验中设置pCold TF DNA空载体作为阴性对照。
SDS-PAGE试验和WB试验
将样品与5x蛋白上样缓冲液充分混匀后，加至10％的蛋白凝胶中进行蛋白电泳，控制电压80V操作30min，之后调至120V直至结束，并分别进行考马斯亮蓝染色和WB试验。
在考马斯亮蓝染色2h后进行脱色，直至条带清晰，随后将蛋白进行转印，于100V低温转印120min后，取出PVDF膜，经PBS洗涤一次后，PVDF膜放置于5％的脱脂乳中进行封闭，于4℃封闭12h，再经PBS洗涤一次后，PVDF膜放置于His一抗(鼠源，1：5000稀释)中，于37℃进行孵育1h后，经PBST洗涤三次，每次5min。洗涤完成后，将PVDF膜放置于山羊抗鼠二抗(1：5000稀释)中，于37℃孵育1h，再经PBST洗涤三次，每次5min。滴加化学增强型发光液至覆盖整张膜，避光下进行常温孵育2min后，放置于曝膜仪中进行蛋白显色。
本实施例中所述p72重组蛋白的表达和纯化结果见附图1所述，其中，图1中(A)为SDS-PAGE结果，泳道1为纯化后的p72重组蛋白，泳道2为未纯化的p72重组蛋白，泳道3为空载体对照；图1中(B)为p72重组蛋白的WB结果。
鉴于蛋白的表达一般有原核表达和真核表达两种，原核表达常用的表达系统有pET载体系列，真核表达系统有昆虫杆状病毒真核表达系统、酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。本实施例为了表达具有更好的天然构象、表达量高且易纯化的p72重组蛋白，采用pCold TF DNA载体表达p72重组蛋白，该表达系统表达得到的p72重组蛋白不仅表达量高、表达系统稳定，而且目的蛋白主要存在于上清中，标签蛋白可被蛋白酶切除，去除标签蛋白对建立方法的影响，因此适用于表达p72重组蛋白用于胶体金试纸条方法的建立。相比于尝试使用的pET-28a原核表达载体和昆虫杆状病毒蛋白真核表达系统，其表达量更高，昆虫杆状病毒表达系统表达的p72重组蛋白的表达量更优且更为稳定。
实施例2重组蛋白纯化
将实施例1中上清表达的p72重组蛋白经镍柱预装柱亲和纯化后进行分子筛进一步纯化，主要操作步骤包括：取10mL蛋白上清加入800μL镍柱，充分混匀后，于4℃孵育12h，3000rpm、4℃离心10min后弃去上清，分别用10mM、20mM、50mM和100mM的pH＝7.4的咪唑溶液依次洗涤，每个梯度洗涤液使用量为30mL。洗涤完成后，使用5mL 250mM pH＝7.4的咪唑溶液进行洗脱，收集洗脱液经蛋白纯化仪的分子筛进行进一步的蛋白纯化。
实施例3胶体金颗粒标记纯化得到的p72重组蛋白
取0.01％的HAuCl4水溶液100mL置于烧杯中，加热充分煮沸，并加入1mL 1％的枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色，制备得到的胶体金颗粒约为30nm，4℃保存。
取500μL上述胶体金溶液，分别加入1μL、2μL、4μL、8μL和16μL浓度为0.2mol/L的K2CO3溶液，充分混匀，再分别加入0.4μg、0.8μg、1.6μg、3.2μg和6.4μg上述纯化的p72重组蛋白，充分混匀后常温静置20min。继续加入50μL浓度10％的BSA，充分混匀后进行常温封闭10min，于4℃、1000rpm离心10min以去除多余的胶体金，吸取上清液，于4℃、7500rpm离心10min，收集沉淀。沉淀采用50μL复溶液(含25％蔗糖、10％海藻糖、5％Tween-20、0.2％PEG20000和0.01mol/L的pH＝9.6的硼酸盐缓冲液)重悬。
按照上述相同的方法进行鸡IgY抗体的标记，得到胶体金标记的鸡IgY抗体。
将上述制备的胶体金标记的p72重组蛋白和胶体金标记的鸡IgY抗体混匀，控制所述胶体金标记p72重组蛋白的蛋白包被量以p72重组蛋白计为4μg/cm，喷涂量以p72重组蛋白计为1μL/cm，所述胶体金标记的鸡IgY抗体的喷涂量以IgY抗体计为16ng/cm，得到所需金标抗原。
用Biodot XYZ3060胶体金点样系统在聚酯纤维膜的金标垫上均匀喷涂金标抗原，于37℃烘箱干燥2h后，即为金标结合垫；分别以2μg/cm和4μg/cm的包被量在硝酸纤维素膜喷涂p72重组蛋白，作为检测线(T线)；以2μg/cm的喷涂量在NC膜上喷涂山羊抗鸡IgY抗体，作为质控线(C线)，两者线间距为4mm。
本实施例以标准阳性血清和阴性血清选择最优的蛋白标记条件和NC膜上包被的p72重组蛋白的用量，经梯度实验验证，最佳的p72蛋白包被的胶体金试验条件包括：加入16μL的K2CO3、1.6μg的p72重组蛋白、4μL的10％BSA加至1mL胶体金溶液中制备标记蛋白，并以100μL复溶液进行复溶，以1μL/cm的喷涂量和4μg/cm的蛋白包被量为最优条件。
实施例4试纸组装
本实施例中，所述胶体金试纸组装顺序为硬质底板→吸水滤纸→固相硝酸纤维素膜(依次有C线和T线)→吸附有胶体金标记的p72重组蛋白和IgY的金标垫→聚酯纤维素膜(样品垫)→塑料外壳(设置加样孔)，具体操作如下：
(1)选取25mm长的固相硝酸纤维素膜硬质底板上；
(2)黏附吸水滤纸长约18mm，并与固相硝酸纤维素膜重叠约为2mm；
(3)取10mm长的金标垫与固相硝酸纤维素膜重叠约为2mm；
(4)聚酯纤维素膜长约15mm，与金标垫重叠约为2mm；
(5)自动斩切机(上海金标公司ZQ2000)切割成4mm宽的条带；
(6)条带外装上保护性的塑料外壳。
本实施例所述胶体金试纸，与其他胶体金试纸条设计原理不同，本实施例试纸的C线采用包被山羊抗鸡IgY抗体来捕捉流动液相中胶体金标记的IgY抗体，因不与T线共用同一种胶体金标记的抗体，该设计避免了C线亮度不稳定性的问题。
实施例5IFA试验
参考之前的研究报道，IFA试验的主要步骤如下：PAMs细胞均匀铺至细胞培养板中，于37℃、5％CO2培养箱中放置12h后，以MOI＝0.1的接毒剂量接种ASFV，于37℃、5％CO2培养箱中孵育1.5h后，弃去病毒液，加入含2％FBS和1％双抗的1640培养基继续培养72h。
取出细胞，弃去培养基，PBS轻轻洗涤一次，加入4％的多聚甲醛常温固定细胞15min。弃去固定液，PBS洗涤三次，每次5min，加入0.3％的Triton X-100进行细胞透化，常温作用15min。弃去透化液，PBS洗涤一次，加入5％的BSA进行常温封闭15min。弃去封闭液，加入血清(一抗，1：100稀释)，于4℃孵育12h。弃去血清，PBST洗涤三次，每次5min，加入FITC标记的山羊抗猪荧光二抗(1：1000稀释)，于37℃避光孵育1h。弃去二抗，PBST洗涤三次，每次5min，加入DAPI溶液进行核染，常温避光染色2min。弃去DAPI溶液，PBST洗涤三次，每次5min，置于荧光显微镜下观察荧光信号并记录。
实施例6胶体金试纸条特异性试验、敏感性试验和重复性试验测定
本实施例中，以上述选定的最适条件测定所建立方法的特异性和敏感性，最终加样量为80μL。
选用PRRSV阳性血清、CSFV阳性血清、PCV2阳性血清、PRV阳性血清、产肠毒素大肠杆菌ETEC、ASFV阳性血清和ASFV阴性血清测定该胶体金试纸条的特异性。按照5μL阳性血清+75μL样品稀释液的比例，充分混匀后滴加至加样孔中，5min后观察试验结果见附图2。特异性试验结果显示，该方法与其他主要猪病原体抗体阳性血清无交叉反应，表明该方法特异性好。
选用ASFV阳性血清以原液、1：25、1：50、1：100、1：200、1：400、1：800和1：1600进行梯度稀释，并使用该胶体金试纸条进行测定，以IFA结果为参考标准，进行该方法的敏感性测定。敏感性试验结果显示，p72重组蛋白包被的双抗原夹心法胶体金试纸条的敏感性为1：800，该阳性血清的IFA效价为1：400。
选用ASFV强阳性血清、弱阳性血清和阴性血清进行批间三次重复和批内三次重复，测定方法的重复性。重复性结果显示，阴、阳性血清经5次重复测定后结果一致，表明该方法重复性良好。
实施例7临床血清样品检测
任何一种方法的建立均需与标准结果进行比较分析。利用上述建立的胶体金试纸条测定采集于2018年-2020年间临床血清样品，按照5μL临床血清+75μL样品稀释液的比例，充分混匀后滴加至加样孔，作用5min后观察试验结果。结果与IFA结果进行比对，测定该方法的准确性。
将稀释可疑猪血清(或抗凝血)点于试纸条的样品孔，5min内观察结果，将同时出现检测线和质控线血清(或抗凝血)样品判为ASFV抗体阳性，仅出现质控线的判为ASFV抗体阴性。
选取256份2018年10月-2020年10月的临床猪血清，利用建立的胶体金试纸条方法测定血清中ASFV抗体水平，检测结果与IFA试验结果进行对比，结果见下表1。结果显示：该方法的检测敏感性为100％，检测特异性为97％。结果表明，该试验方法可应用于临床ASFV抗体的检测。
表1 p72蛋白包被的胶体金试纸条和IFA试验检测临床猪血清结果
Figure BDA0003084903910000141
本发明建立的胶体金试纸条检测结果与IFA结果进行比较，结果显示，胶体金试纸条的检测结果敏感性和特异性与IFA结果一致，表明该胶体金试纸条检测方法可以很好地应用于临床样品的检测。
本研究通过包被p72蛋白和胶体金标记p72蛋白进行双抗原夹心的方式检测临床血清样品中ASFV抗体的水平，未来期待制备其他蛋白的胶体金试纸条进行联合诊断检测，以增加临床检测结果的准确性。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列为模板合成p72基因片段，并设计如下引物进行p72基因的扩增，扩增产物经凝胶电泳后进行胶回收：
上游引物：5’-GAGCTCGGTACCCTCGAGTTAGGTACTGTAACGCAG-3’；
下游引物：5’-CTGCAGGTCGACAAGCTTTCAATGGCATCAGGAGGAGCT-3’；
(2)选择XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切pCold TF DNA质粒以使其线性化，并将步骤(1)中收集的扩增产物使用Vazyme exnase II同源重组酶同源重组至线性化的pColdTF DNA载体上，构建得到重组质粒；
(3)将重组质粒转化至BL21感受态细胞中，筛选出阳性克隆，并进行p72重组蛋白的表达及纯化，即得。
2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述非洲猪瘟病毒ASFV-SY18序列的GenBank收录号为MH766894。
3.由权利要求1或2所述方法构建得到的非洲猪瘟病毒p72重组蛋白。
4.权利要求3所述非洲猪瘟病毒p72重组蛋白用于制备检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的用途。
5.一种检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括底板和外壳，所述底板上依次固定有吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫；
所述金标垫吸附的金标抗原包括胶体金标记的p72重组蛋白和胶体金标记的鸡IgY抗体；
所述固相硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，所述检测线为所述p72重组蛋白，所述质控线为山羊抗鸡IgY抗体。
6.根据权利要求5所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述金标抗原的制备方法包括分别制备所述胶体金标记的p72重组蛋白和所述胶体金标记的鸡IgY抗体后再混匀的步骤；
所述胶体金标记p72重组蛋白的制备方法如下：取胶体金溶液加入K2CO3溶液混匀，再加入权利要求3所述p72重组蛋白，充分混匀后常温静置，再加入BSA充分混匀后进行常温封闭；离心沉淀胶体金标记物，并加入复溶液进行重悬；
所述胶体金标记的鸡IgY抗体的制备方法如下：取胶体金溶液加入K2CO3溶液混匀，再加入鸡IgY抗体，充分混匀后常温静置，再加入BSA充分混匀后进行常温封闭；离心沉淀胶体金标记物，并加入复溶液进行重悬；
所述复溶液包括20-30％蔗糖、8-12％海藻糖、3-8％Tween-20、0.1-0.3％PEG20000和0.01-0.02mol/L的pH＝9-10的硼酸盐缓冲液。
7.根据权利要求5或6所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述金标抗原中：
所述胶体金标记p72重组蛋白的蛋白包被量以p72重组蛋白计为4μg/cm，喷涂量以p72重组蛋白计为1μL/cm；
所述胶体金标记的鸡IgY抗体的喷涂量以IgY抗体计为16ng/cm。
8.一种权利要求5-7任一项所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1或2所述方法制备得到所述p72重组蛋白，并将所述p72重组蛋白进行胶体金标记，得到金标抗原；
(2)在所述金标垫上喷涂所述金标抗原，在所述固相硝酸纤维素膜表面喷涂所述检测线和质控线；
(3)在所述底板上依次组装所述吸水滤纸、固相硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫，加盖外壳，即得。
9.权利要求5-7任一项所述检测非洲猪瘟病毒的胶体金免疫层析试纸在非洲猪瘟病毒体外检测领域中的应用。
10.一种检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，包括利用权利要求5-7任一项所述胶体金免疫层析试纸进行检测的步骤。
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