CN110423761B - 一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫蛋白制备及其应用技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸。本发明提出了编码非洲猪瘟病毒p54蛋白胞外区的基因序列E183L‑1，基于一个总的发明构思，本发明还提出了扩增该基因序列的引物对和该基因序列编码的合成蛋白；为了解决非洲猪瘟病毒检测中存在的问题，本发明利用上述基因编码的合成蛋白制备了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的试纸，能够快速、准确的检测非洲猪瘟病毒抗体，非常适用于基层和现场快速检测与诊断。

Description

一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸
技术领域
本发明属于免疫蛋白制备及其应用技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸。
背景技术
非洲猪瘟（ASF）是猪的一种高度致死性传染病，该病一直在非洲国家流行，最近几年非洲猪瘟在全球其他地区也出现持续性爆发，给全球养猪产业造成了巨大损失。非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus，ASFV）是双链闭合线性DNA病毒，其基因组大小约170kb至190kb，含有150–167 个开放阅读框(Open reading frames，ORF)，编码54种结构蛋白和100多种非结构蛋白。ASFV在电镜下呈正六边形，直径约200 nm，主要由病毒基因组(Genome)、内核心壳(Core shell)、内膜(Inner envelope)、衣壳(Capsid)和囊膜(External envelope)五部分组成。非洲猪瘟病毒p54蛋白存在于病毒粒子内层囊膜中，参与病毒的吸附与进入，是非洲猪瘟病毒的主要结构蛋白；p54蛋白可以刺激机体产生具有一定中和能力的抗体，因此经常被应用于非洲猪瘟病毒检测方法中。
目前，非洲猪瘟病毒的检测方法主要分为两大类：第一类为病原检测，包括病毒分离检测、病毒抗原检测和基因组DNA的检测，如实验室常用荧光抗体试验(fluorescentantibody test , FAT)检测组织涂片或冷冻切片中的抗原，用聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction , PCR)检测非洲猪瘟病毒基因组DNA；第二类为抗体检测，目前有多种方法用于非洲猪瘟病毒的抗体检测，例如，间接荧光抗体(indirectfluorescent antibody , IFA)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay , ELISA)和免疫印迹试验(immuneblotting test)等；现有的检测技术虽然检测特异性较高，灵敏度也能够满足需要，但是一般需要专业实验室或专业设备，同时对操作人员的技术要求也十分严苛，比如病毒分离检测，需要在生物安全三级(ABSL3) 以上实验室进行操作；ELISA和PCR的方法则需要酶标仪、PCR仪等昂贵的实验仪器；因此，上述方法均不适合基层或现场快速检测或诊断，开发一种简便而快速的、可以检测非洲猪瘟病毒抗体的实时在线检测技术是目前亟需解决的技术问题。
胶体金免疫层析技术是近年来快速发展起来的一种诊断技术，其优点主要有：1）操作简单，能在几分钟内得出诊断结果，特别适合野外、现场诊断；2）受外界因素（包括技术人员和环境）影响较小，检测灵敏度和准确度高；3）能稳定保存，易于携带；4）不需要额外仪器设备，综合成本低，适合临床和基层单位使用需要。专利CN103293306A公开了一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法，能够在5分钟内获得明确的诊断结果，并能直接检测可疑猪血清（或抗凝血）中的病毒抗体，适合现场非洲猪瘟病毒血清学诊断、流行病学调查和生猪贸易检验检疫；但是该方法制得的胶体金免疫层析试纸条特异性不高，尤其在检测非洲猪瘟病毒抗体阴性血清时，准确率有待提高，制约了该方法的推广应用；张鑫宇等人（非洲猪瘟病毒p54抗体胶体金试纸检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014）建立了一种非洲猪瘟病毒p54抗体胶体金试纸检测方法，所制备的胶体金试纸对非洲猪瘟病毒抗体阳性猪血清具有高度特异性，与猪其他病毒抗体阳性血清无交叉反应；但是该种试纸条对非洲猪瘟病毒抗体的敏感度仅为200ng/mL，灵敏度有待提高。
发明内容
本发明的目的是提出编码非洲猪瘟病毒p54蛋白胞外区的基因序列，基于一个总的发明构思，本发明还提出了扩增该基因序列的引物对和该基因序列编码的合成蛋白；为了解决上述非洲猪瘟病毒检测中存在的问题，本发明利用上述基因编码的合成蛋白制备了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的试纸，能够快速、准确的检测非洲猪瘟病毒抗体，非常适用于基层和现场快速检测与诊断。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
编码非洲猪瘟病毒p54蛋白胞外区的基因序列，所述基因序列命名为E183L-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
atggactccgaattcttccagcctgtctaccctcgccactacggtgagtgcctgtcccctgtgaccaccccctccttcttctctacc。
基于一个总的发明构思，本发明还设计了上述基因序列的PCR扩增用引物对，所述引物对序列为：
正向引物：5’-GGATCCATGGACTCCGAATTCCA-3’
反向引物：5’-CTCGAGTTAGGTAGAGAAGAAGGAG-3’。
利用上述基因序列制备p54蛋白胞外区的方法，所述方法包括以下步骤：
1）载体构建：用PCR技术扩增上述E183L-1基因，并将该基因转入昆虫-杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的载体；得到重组载体后，将其转入感受态细胞中，培养后提取杆状病毒质粒；
所述昆虫-杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的载体为pFastBacI 、pFastBacDual、pFastBacHTA、pFastBacHTB中任一种；
所述感受态细胞为E.coli DH5α和/或E.coli DH10Bac；
2）蛋白表达与纯化：用上述提取的杆状病毒质粒转染昆虫细胞，实现E183L-1基因的真核表达，提取并纯化表达产物，既得。
优选的，所述昆虫细胞为sf9 、sf21 、High Five中任一种。
基于一个总的发明构思，本发明技术方案中还包括上述方法制备的p54蛋白胞外区蛋白。
基于一个总的发明构思，本发明技术方案中还包括上述p54蛋白胞外区蛋白在非洲猪瘟病毒抗体检测中的应用。
一种利用上述p54蛋白胞外区蛋白制备的检测非洲猪瘟病毒抗体的试纸，具体结构包括：底板，底板中部所设层析膜，以及分设底板两端的样品垫和吸水垫；所述样品垫与层析膜之间设有结合垫；所述样品垫与结合垫、结合垫与层析膜、层析膜与吸水垫两两之间紧密连接；
所述层析膜上设有检测线和质控线；
所述结合垫上喷涂有与标记物结合的上述p54蛋白胞外区蛋白。
优选的，所述检测线靠近样品垫设置，检测线由金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）溶液喷涂形成；所述质控线靠近吸水垫设置，质控线由抗非洲猪瘟病毒的IgG溶液喷涂形成。
优选的，所述标记物为胶体金、胶体银或胶体硒中任一种；所述纤维膜层为玻璃纤维膜、尼龙纤维膜或聚酯纤维膜任一种；所述层析膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯纤维膜中任一种。
基于一个总的发明构思，本发明技术方案中还包括所述试纸在非洲猪瘟病毒抗体检测中的应用。
作为非洲猪瘟病毒结构蛋白之一的p54蛋白由非洲猪瘟病毒 E183L基因编码，是血清抗体的主要结合位点之一。p54蛋白是跨膜蛋白，其中1至29位氨基酸为胞外区，30至52位氨基酸为跨膜区，53至184位氨基酸为胞内区；本发明在原始p54（GenBank序列号为CBW46791.1 ）蛋白胞外区基因的基础上进行了大幅度的改进设计，按照杆状病毒编码特征设计了密码子优化的E183L-1基因；改造后的合成基因E183L-1与原始基因的序列相比较，同源性为72.73 %；E183L-1基因中选择使用了昆虫细胞用频率最高的密码子，优化后的E183L-1序列密码子适应指数（Codon Adaptation Index, CAI）从原始基因序列的0.69提高到0.95，因此更适用于杆状病毒表达系统；经测定合成基因E183L-1在昆虫细胞中表达后，重组蛋白含量可达到320mg/L，从而克服了传统杆状病毒表达量低的缺点。
另外，本发明利用昆虫杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的载体进行重组基因的转载，并将其依次转入大肠杆菌感受态细胞和昆虫细胞进行蛋白表达；与原核表达系统相比，异源基因的杆状病毒表达允许许多翻译后修饰，如折叠、寡聚、磷酸化、糖基化、酰化、二硫键形成以及蛋白水解切割等，所获得的重组蛋白与哺乳动物体内的p54蛋白胞外区有相似的抗原性和免疫原性，生物活性高。
本发明利用上述重组蛋白作为抗原制备的快速检测非洲猪瘟病毒抗体的试纸，能快速而准确的检测待测血清中非洲猪瘟病毒抗体，检测时间不大于5min，并且检测特异性强，灵敏度高，待测血清中在非洲猪瘟病毒抗体浓度为100ng/mL时依然可以准确检出，是一种携带方便、快速、准确检测非洲猪瘟病毒抗体的产品。
附图说明
图1 非洲猪瘟病毒p54蛋白原始基因的密码子适应指数；
图2 本发明优化后基因E183L-1的密码子适应指数；
图3 实施例2 中E183L-1基因真核表达Western blot鉴定结果；
图4 实施例3中制备的抗原蛋白Western blot鉴定结果；
图5 实施例4中制备的快速检测ASFV抗体试纸条的结构示意图；图中，1底板，2层析膜，3样品垫，4吸水垫，5结合垫，6塑胶膜，21检测线，22质控线，61警戒线；
图6 为图5的俯视图；
图7 试验例1中检测非洲猪瘟病毒抗体的试纸条的特异性检测结果；图中，1.猪阴性血清，2.猪瘟病毒（CSFV）阳性血清，3.猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清，4.猪圆环病毒(PCV2)阳性血清，5.猪细小病毒（PPV）阳性血清，6.猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清，7.非洲猪瘟（ASFV）阳性血清。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明所用生物材料及其来源为：
1）菌株与感受态细胞：E.coli DH5α（全式金生物技术有限公司）；E.coli DH10Bac（博迈德基因技术有限公司）；
2）质粒：昆虫-杆状病毒Bac-to-Bac表达系统质粒pFastBacl（Invitrogen公司）；昆虫细胞：sf21(Invitrogen公司)
3）试剂盒：昆虫细胞转染试剂盒（Gibco公司）；内毒素质粒小提试剂盒（康维世纪生物科技有限公司）
4）培养基：Sf-900ⅡSFM（Gibco公司）。
本发明所使用的仪器设备如无特别说明，均为市售常规仪器设备；所用其他试剂材料，如无特别说明，均为市售常规试剂材料；重组质粒pFastBacI-p54基因测序和引物合成(BamHI和XholI)等技术服务由上海生工生物工程有限公司提供。
实施例1 基因设计与载体构建
1）基因优化与设计
作为非洲猪瘟病毒（以下简称ASFV）结构蛋白之一的p54蛋白由ASFV E183L基因编码，是血清抗体的主要结合位点之一；p54蛋白是跨膜蛋白，其中1至29位氨基酸为胞外区，30至52位氨基酸为跨膜区，53至184位氨基酸为胞内区；
发明人在原始p54（GenBank序列号为 CBW46791.1 ）蛋白胞外区基因的基础上进行了改进设计：ASFV为虹彩病毒科非洲猪瘟病毒属，与昆虫细胞相比，二者作为不同的种属，对密码子的使用频率是不同的，因此本发明选择昆虫细胞用频率最高的密码子组成合成基因，选用的密码子归纳如下：
TTT [392] TCT [413] TAT [389] TGT [330]
TTC [1068] TCC [490] TAC [945] TGC [513]
TTA [300] TCA [410] TAA [90] TGA [26]
TTG [617] TCG [300] TAG [26] TGG [516]
CTT [373] CCT [546] CAT [336] CGT [593]
CTC [661] CCC [533] CAC [603] CGC [605]
CTA [270] CCA [529] CAA [626] CGA [210]
CTG [933] CCG [304] CAG [836] CGG [145]
ATT [600] ACT [554] AAT [520] AGT [324]
ATC [1099] ACC [668] AAC [1115] AGC [430]
ATA [323] ACA [478] AAA [1039] AGA [468]
ATG [1048] ACG [366] AAG [1908] AGG [487]
GTT [546] GCT [953] GAT [849] GGT [833]
GTC [778] GCC [805] GAC [1295] GGC [761]
GTA [466] GCA [497] GAA [1070] GGA [690]
GTG [936] GCG [479] GAG [1285] GGG [179]
优化后合成基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，该合成基因命名为E183L-1；该基因编码的重组蛋白氨基酸序列如下所示：
MDSEF FQPVY PRHYG ECLSP VTTPS FFST
该重组蛋白与ASFV p54蛋白的胞外区氨基酸序列一致；
优化后E183L-1基因的碱基中，A碱基含量为13.79%，G碱基含量为16.09%，T碱基含量为27.59% ，C碱基含量为42.53%；G+C含量由原始基因的43.68 %提高到58.62 %；A+T含量由原始基因的56.32 %降低到41.38 %；对E183L-1与原始基因序列进行同源比对分析，结果显示，E183L-1与原始基因序列的同源性为72.73%；
测定原始基因序列与E183L-1的密码子适应性指数（Codon Adaptation Index,CAI），结果如图1和图2所示，可以看出，原始基因序列的适应指数为0.69，而E183L-1的适应性指数可达0.95，说明优化后E183L-1密码子更适用于杆状病毒表达系统；
2）载体构建
为了扩增上述基因E183L-1，发明人设计了一对扩增引物，具体序列如下：
正向引物：5’-GGATCCATGGACTCCGAATTCCA-3’
反向引物：5’-CTCGAGTTAGGTAGAGAAGAAGGAG-3’
利用该引物进行E183L-1的PCR扩增，PCR反应条件为：反应条件为94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火90s，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；
将得到的PCR扩增产物从BamHI和XholI位点酶切，再经酶切和酶连反应，使E183L-1转入质粒pFastBacI，形成重组质粒pFastBacI-p54；将所得重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄抗性（终浓度为100μg/ml）的LB平板上过夜培养；从培养后的大肠杆菌DH5α中挑取白色单一菌落，并提取其质粒，进行基因测序和酶切鉴定；将鉴定无误的重组质粒pFastBac1-p54转入E.coli DH10Bac感受态细胞中，涂板培养；从培养出的蓝白斑菌落中挑选白斑，提取其杆状病毒质粒Bacmid，即完成携带E183L-1的载体构建。
实施例2 E183L-1基因的真核表达及鉴定
将实施例1所得并经过鉴定的杆状病毒质粒Bacmid用Cellfectin®Ⅱ转染试剂盒转入sf21昆虫细胞，具体步骤如下：
准备细胞密度为1×106cells／mL的sf21细胞悬液，加入六孔板中培养，每孔加入2mL，孵育lh，同时准备转染样品；取l-2ng重组杆粒Bacmid (约5-10μL)稀释于100μL的Sf-900 II SFM中，取转染试剂Cellfectin®Ⅱ稀释于100μL的Sf-900 II SFM中，混合上述两份稀释液，室温孵育15-45min后，加入800μL的Sf-900 II SFM，制成转染混合物；细胞孵育l小时后，除去培养上清，加入上述转染混合物，28℃孵育5h；弃去转染混合物，加入2mL的Sf-900 II SFM，28℃恒温培养箱培养3至4天；
培养后收集细胞培养上清，作为P1代细胞按2％的体积接种到新的sf21细胞中，连续培养两代，从而扩增病毒的毒力；至P3代细胞时，观察记录P3代细胞形态变化，并对P3代细胞进行表达鉴定，鉴定方法采用westernblot法；具体步骤如下，
1. 把聚丙烯酰胺凝胶电泳中的蛋白质转移到PVDF膜上：
1）用甲醇溶液浸泡PVDF膜5秒，激活PVDF膜，转膜缓冲液洗涤凝胶和PVDF膜，将PVDF膜铺在凝胶上，用5 ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡；
2）在凝胶/滤膜外再包一张3 mm滤纸（预先用转膜缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡；
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸放入电泳装置中，凝胶面向阴极；
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转膜缓冲液以淹没凝胶；
5）接通电源开始电泳转移；转膜结束后，取出PVDF薄膜；
2. 将PVDF膜置于5%脱脂奶的封闭液中于37 ℃封闭1小时；
3. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜；
4．用HRP标记的His单抗室温孵育1h；
5. 用PBST充分洗涤后，利用化学发光显色；
westernblot鉴定结果见图3，可以看出，E183L-1基因在sf21中表达后在约7kDa和4kDa处有两个反应条带，其中4 kDa的反应条带为目的蛋白，而7 kDa的反应条带为目的蛋白的二聚体，这说明E183L-1基因在sf21细胞中得到了正确表达。
实施例3 抗原纯化与检测
将实施例2中经过鉴定的P3代细胞，以感染复数为1感染sf21悬浮细胞，接种病毒时的上清细胞密度为0.8-1.0×106个/ml；接毒后培养72h，收获细胞上清并利用镍亲和层析的方法对蛋白进行纯化：将经过细胞破碎的菌液通过镍柱完成上样，然后用20mM PB(150mM NaCL，25mM咪唑)洗去非特异性结合蛋白，之后改用20mM PB(150mM NaCL，250mM咪唑)将与镍填料结合的带有his标签的蛋白洗脱下来，即得；
对所得蛋白进行westernblot鉴定，鉴定结果见图4，从图中可以看出反应条带位于4 kDa位置，说明所得蛋白即为目的抗原蛋白；
用ASFV阳性血清作为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗对上述抗原蛋白作抗原性检测，结果表明该蛋白具有良好的抗原性。
实施例4 快速检测ASFV抗体的试纸
一种快速检测ASFV抗体的试纸，具体结构如图5和图6所示，包括：底板1，底板1中部所设层析膜2，以及分设底板1两端的样品垫3和吸水垫4；样品垫3与层析膜2之间设有结合垫5；样品垫3与结合垫5、结合垫5与层析膜2、层析膜2与吸水垫4两两之间紧密连接；
层析膜2上设有检测线21和质控线22；检测线21靠近样品垫3设置，检测线21由金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）溶液喷涂形成；质控线22靠近吸水垫4设置，质控线22由抗非洲猪瘟病毒的IgG溶液喷涂形成；
结合垫5上喷涂有与胶体金结合的实施例3中制备的抗原蛋白。
上述快速检测ASFV抗体的试纸通过以下步骤制得：
1）胶体金标记抗原制备
在50ml沸腾的0.01%氯金酸水溶液中加入2ml的0.5%柠檬酸三钠溶液，所得胶体金颗粒直径15nm左右，用0.1mol/L的K2CO3调胶体金pH至8.5得到金溶胶；
以1:1000的标记比将抗原蛋白加入金溶胶中，缓慢搅拌10min；加入20% PEG10000至终浓度0.05%，于4℃、1500rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒；4℃、15000rpm离心1h，除去上清，获初步纯化胶体金标记抗原混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化所得混合物，即得胶体金标记抗原；
2）试纸制备与组装
制备结合垫5：将所得胶体金标记抗原按照1:100稀释至1mg/mL后，以1μL/cm均匀喷涂于玻璃纤维膜上，56 ℃烘干 1 h，即得结合垫5；抽真空密封，干燥保存备用；
制备样品垫3：将玻璃棉在缓冲液中充分浸泡后，于56 ℃干燥 1 h，即得结合垫3；抽真空密封，4 ℃干燥保存备用；所述缓冲液为 0.01 mol/L PBS、0.1 % TritonX100或4 %Tween-20、0.01 % 叠氮钠；
制备层析膜2：在XYZ3000 三维喷膜仪的样品 A池泵入 2 mg/mL金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA ）溶液，向样品 B 池中泵入 2 mg/mL ASFV 多抗 IgG溶液；设定参数为：50dots/mL/cm；向硝酸纤维素膜上喷涂SPA 检测线和 ASFV 多抗 IgG 质控线，两条印迹线平行，距离约为 0.5 cm；将硝酸纤维素膜于42 ℃干燥箱中干燥即得层析膜；抽真空密封，干燥保存备用；
组装与切割：将层析膜2粘贴在底板1上；在层析膜2一端粘贴吸水垫4，所述吸水垫4是用吸水滤纸切割而成；吸水垫4与层析膜2交叠2 mm；然后在层析膜2另一端粘贴结合垫5，结合垫5与层析膜2交叠1mm；最后粘贴样品垫3，样品垫3与结合垫5的交叠尺寸为3 mm；将组装完成的检测试纸放入切割机中，切割成宽度为 5 mm的试纸条，然后在表面封装塑胶模6，塑胶膜6上标记警戒线61；所述试纸条也可置于卡壳中制成检测卡。
下面针对实施例4制备的快速检测ASFV抗体试纸条进行特异性、灵敏度和重复性检测。
试验例1 特异性检测
用实施例4中制备的检测试纸条进行ASFV抗体检测，待测血清分别为：ASFV猪阳性血清、猪阴性血清、猪瘟病毒（CSFV）阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清、猪圆环病毒(PCV2)阳性血清、猪细小病毒（PPV）阳性血清和猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清，上述阳性血清取自河南省畜牧局疫控中心，检测方法如下：
将试纸条的检测端插入待处理样品中，静置10-15s，任其沿着试纸自由扩散，5min内观察结果；
检测结果可以分为：
阳性（+）：检测线（T线）和质控线（C线）位置同时出现两条深色反应带，表示样品中非洲猪瘟抗体浓度等于或高于检测限；
阴性（-）：检测线（T线）无色或接近无色，质控线（C线）位置显色，表示样品中非洲猪瘟抗体浓度低于检测限；
无效：未出现质控线（C线），表明操作过程不正确或试纸条已失效，需要重新更换试纸条重新进行检测；
具体检测结果如图7所示，可以看出，ASFV阳性血清在检测线（T线）和质控线（C线）位置同时出现两条深色反应带，结果判定为阳性；猪阴性血清、猪瘟病毒（CSFV）阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清、猪圆环病毒(PCV2)阳性血清、猪细小病毒（PPV）阳性血清和猪流行性腹泻(PEDV)阳性血清只有质控线（C线）位置显色，呈阴性反应；检测结果表面实施例4所制备试纸条能够准确检测ASFV阳性血清，而不会受到其他病毒阳性血清的干扰，特异性高。
试验例2 灵敏度检测
以猪阴性血清为对照，将ASFV阳性血清分别稀释1:2000、1:4000、1:8000、1:16000倍，用实施例4制备的检测试纸条分别对其进行检测；
检测结果显示，在检测1:2000、1:4000和1:8000稀释倍数的ASFV阳性血清时，所制备的试纸条检测线和质控线位置同时出现两条反应带，结果判定为阳性；当检测稀释倍数16000倍的样品时，只在质控线位置出现一条反应带，结果判定为阴性；这说明实施例1中制备的检测试纸条对于ASFV阳性血清的灵敏度为稀释倍数8000，经测定该稀释倍数下非洲猪瘟病毒抗体浓度为100ng/mL，表现出极佳的灵敏度。
试验例3重复性及质量检测
随机抽取不同批次的实施例4所制备检测试纸条，进行多次ASFV阳性血清重复性试验，检测结果显示保存3个月之内检测试纸条对每份血清的检测结果均一致，重复性良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
河南中泽生物工程有限公司
河南百奥生物工程有限公司
<120> 一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atggactccg aattcttcca gcctgtctac cctcgccact acggtgagtg cctgtcccct 60
gtgaccaccc cctccttctt ctctacc 87

Claims (6)

1.编码非洲猪瘟病毒p54蛋白胞外区的基因，其特征在于：所述基因命名为E183L-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述基因的PCR扩增用引物对，其特征在于，所述引物对序列为：
正向引物：5’-GGATCCATGGACTCCGAATTCCA-3’
反向引物：5’-CTCGAGTTAGGTAGAGAAGAAGGAG-3’。
3.利用权利要求1所述基因制备p54蛋白胞外区的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）载体构建：用PCR技术扩增所述E183L-1基因，并将该基因转入昆虫-杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的载体；得到重组载体后，将其转入感受态细胞中，培养后提取杆状病毒质粒；
所述昆虫-杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的载体为pFastBacI 、pFastBacDual、pFastBacHTA、pFastBacHTB中任一种；
所述感受态细胞为E.coli DH5α和/或E.coli DH10Bac；
2）蛋白表达与纯化：用所述提取的杆状病毒质粒转染昆虫细胞，实现E183L-1基因的真核表达，提取并纯化表达产物，即得。
4.如权利要求3所述制备p54蛋白胞外区的方法，其特征在于：所述昆虫细胞为sf9 、sf21 、High Five中任一种。
5.权利要求3所述方法制备的p54蛋白胞外区蛋白。
6.一种利用权利要求5所述p54蛋白胞外区蛋白制备的检测非洲猪瘟病毒抗体的试纸，其特征在于，具体结构包括：底板，底板中部设层析膜，以及分设底板两端的样品垫和吸水垫；所述样品垫与层析膜之间设有结合垫；所述样品垫与结合垫、结合垫与层析膜、层析膜与吸水垫两两之间紧密连接；
所述层析膜上设有检测线和质控线；
所述结合垫上喷涂有与标记物结合的所述p54蛋白胞外区蛋白；
所述检测线靠近样品垫设置，检测线由金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）溶液喷涂形成；所述质控线靠近吸水垫设置，质控线由抗非洲猪瘟病毒的IgG溶液喷涂形成；
所述标记物为胶体金、胶体银或胶体硒中任一种；所述样品垫与结合垫为玻璃纤维膜、尼龙纤维膜或聚酯纤维膜任一种；所述层析膜为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜、羧化纤维素膜或聚偏二氟乙烯纤维膜中任一种；所述吸水垫为吸水滤纸。
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