JP3095219B2 - ＬＡＶに対する抗体と反応性であるｇａｇによりコードされたペプチド及びその使用 - Google Patents
ＬＡＶに対する抗体と反応性であるｇａｇによりコードされたペプチド及びその使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は一般に、組換技法
により製造されるウイルス蛋白質に関し、そしてさらに
詳しくはリンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＬ）に対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質に関する。 【０００２】 【従来の技術】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は日
和見感染及び若干のまれな悪性腫瘍により特徴付けられ
る細胞性免疫の伝染性疾患である。ＡＩＤＳについての
主たる危険群には同性愛の男性、静脈投与剤の乱用者、
輸注剤及び血液製剤の受容者、並びに高危険個体の異性
パートナー及び子供が含まれ、密接な接触及び血液製剤
を介して伝達される感染体の関与が示唆される。 【０００３】最近の証明によれば、疾患の伝染を担当す
る感染体はリンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＬ）として知
られる新しいリンパ趨向性レトロウイルスである〔Barr
e-Sinoussi等、 Science ２２０：８６８（１９８
３）〕。他の科学者グループによって類似のウイルスが
報告されており〔 Popovic等、 Science ２２４：４９
７（１９８４）；Levy等、 Science ２２５：８４０
（１９８４）；Vilmer等、Lancet １：７５３（１９８
３）〕、そしてヒトＴ−細胞リンパ趨向性ウイルスタイ
プ III（ＨＴＬＶ−III ）、ＡＩＤＳ関連レトロウイル
ス（ＡＲＶ）、又は免疫不全関連ウイルス（ＩＤＡＶ）
と命名されている。 【０００４】さらに最近のデーターは、ＬＡＶ，ＨＴＬ
Ｖ−III ，ＡＲＶ、及びＩＤＡＶは、実質的なヌクレオ
チドの相同性を含む幾つかの特徴を共有し〔 Wain-Hobs
on等、Cell ４０：９（１９８５）； Muesing等，Natu
re，３１３：４５０（１９８５）；Sanchez-Pescader
等、 Science ２２７：４８４（１９８５）〕、そして
同じウイルスの単離体であると考えるべきであることを
示している。但し、ウイルス単離体間の株対株変異が存
在する可能性もある。実質的なヌクレオチドの相同性を
示すことに加えて、単離体形態、細胞病理、最適逆転写
酵素活性の要求性、及び少なくとも幾つかの抗原性に関
して類似している〔Levy, 前掲； Schupbach等、 Scien
ce ２２４：５０３（１９８４）〕。 【０００５】前記のごとく、このウイルスは血液製剤
（血液、血清、血漿、及びこれらの画分）を介して伝染
し得ることが知られており、このため、提供者がこのウ
イルスに暴露されたことがあるか否かを決定するために
血液製剤をスクリーニングすることが重要である。これ
は、ＬＡＶ及び関連ウイルスに対する抗体の検出のため
のエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）を含む幾つかの方法の内任意の方法により行
うことができる。ＬＡＬに対する抗体を含有する血液を
有する個体は“血清反応陽性”（seropositive) である
と言われる。血清反応陽性提供者からの血液は検出の後
血液供給から除去され、こうして疾患の拡散が防止され
る。 【０００６】ＬＡＶに暴露された個体の免疫反応は多様
である。ｐ１３，ｐ１８，ｐ２５，ｐ３６，ｇｐ４３，
ｐ５５，ｇｐ１１０等を含む幾つかのウイルス蛋白質の
いずれに対しても抗体が生産され得る〔 Schupbach等、
N. Engl. J. Med. ３１２：２６５（１９８５）〕。す
べての個体が同じ蛋白質又は所与の蛋白質の同じエピト
ープに対する抗体を生産するわけではないであろう。 【０００７】血清反応陽性個体の検出は、最近行われて
いる所では、幾つかの本質的な問題点を有する。これら
の問題点の内主要な点は、免疫的測定のために全体ウイ
ルスから抗原を単離する必要があることである。この単
離は、潜在的に感染性の生ウイルスの大量操作を必要と
し、そしてこのこと自体かなり安全性を脅やかす。さら
に、調製ごとにウイルスの収量、純度及び再現性に関す
る懸念が存在する。このことが許容されない数の偽陽性
及び／又は偽陰性をもたらす。従って、血液のスクリー
ニング測定において有用でありそして他の関連する利点
をさらにもたらすウイルス抗原を製造するための他の方
法が当業界において求められる。 【０００８】 【発明の開示】要約すれば、この発明は、ＬＡＶゲノム
の群特異的抗原（ｇａｇ）領域の部分、すなわちＬＡＶ
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成るＤＮＡ配列を開示する。細菌宿主中で複
製することができる組換プラスミドも開示される。この
プラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シグ
ナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに続
く前記のＤＮＡ配列を含有する。好ましい態様において
は、シグナルは誘導性及び／又は抑制性であるｔｒｐオ
ペロンのごときオペロンから選択される。上記の組換プ
ラスミドにより形質転換された、Ｅ．コリ（E. coli ）
のごとき細菌の細胞も開示される。 【０００９】この発明の他の観点は、ＬＡＶに対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質の製造方法を開示す
る。この方法は、細菌宿主細胞中で複製可能な組換プラ
スミドを細菌宿主細胞に導入することを含んで成る。こ
のプラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シ
グナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに
続くＬＡＶゲノムのｇａｇ領域の部分、すなわちＬＡＶ
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成る。プラスミドの導入に続き細菌宿主を適
当な培地中で増殖せしめる。次に蛋白質の発現を誘導
し、そしてその配列の蛋白質生成物を細菌宿主から単離
する。単離に続き、蛋白質生成物を、例えばゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより精製する。 【００１０】この発明の他の観点は、ＬＡＶに対する抗
体の生物学的流体中での存在を検出する方法を開示す
る。この方法は、生物学的流体を、前記の組換プラスミ
ドにより形質転換された細菌細胞により生産された蛋白
質と共にインキュベートし、これによって反応混合物を
形成し、そして次にこの反応混合物を分析して抗体の存
在を決定することを含んで成る。好ましい態様において
は、反応混合物を分析する段階は、反応混合物を抗体に
対するラベルされた特異的結合パートナーと接触せしめ
ることを含んで成る。 【００１１】この発明の他の観点は、生物学的流体中の
ＬＡＬ抗原の存在を決定するための方法を開示し、この
方法は生物学的流体を、前記の組換プラスミドにより形
質転換された細菌細胞により生産された標識化蛋白質と
共にインキュベートし、そしてこれに続いて又はこれと
同時に該蛋白質に対する抗体と共にインキュベートして
特異的結合を生じさせる。次に、インキュベーションの
間に形成された反応混合物を分析して抗体と結合した標
識の量を決定する。前記の組換プラスミドにより形質転
換された細菌細胞により生産された蛋白質により動物を
免疫感作することを含んで成る、ＬＡＶに対する抗体の
製造方法も開示される。 【００１２】この発明の他の観点は、ＬＡＶに対する抗
体の生物学的流体中での存在を決定するための方法を開
示し、この方法は、細菌宿主細胞中で複製することがで
きそして発現のための原核性の転写及び翻訳シグナルを
含有する組換プラスミドにより形質転換された細菌細胞
により生産された蛋白質にラテックスビーズを接合せし
めることを含んで成る。前記シグナルに続き、ＬＡＶ遺
伝子のｇａｇ領域の部分、すなわちＬＡＶに対する抗体
と免疫的に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成
るＤＮＡ配列が存在する。次に、生物学的流体をビーズ
／蛋白質接合体と共にインキュベートし、これによって
反応混合物を形成する。次に、この反応混合物を分析し
て抗体の存在を決定する。 【００１３】この発明において製造される蛋白質は、適
当な担体又は稀釈剤と共に使用される場合、免疫的に有
効なワクチン組成物を構成する。ＬＡＶゲノムのｇａｇ
領域の部分を含んで成るＤＮＡ配列によりコードされた
蛋白質の免疫的有効量を医薬として許容される担体と共
に個体に投与することにより、ＡＩＤＳの原因となるウ
イルスにより惹起される感染が回避され得る。 【００１４】 【発明の実施の形態】発明を記載するに先立ち、以下に
使用される幾つかの用語の定義を記載するのが発明の理
解のために有用であろう。リンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＶ） ：ヒトＴ−リンパ趨
向性レトロウイルス。 この発明の目的のため、ウイルスが下記の規準を実質的
に満たす場合、それをＬＡＶと同一であるか又は同等の
ものと考える。 【００１５】（ａ）Ｔ−リンパ球、特にＴ−ヘルパー細
胞〔ＣＤ４+ 、 Bernard等編、Leucocyte Typing, ニュ
ーヨーク，スプリンガーベルラーク（１９８４）中に定
義された国際命名法に従う〕に対して向性である； （ｂ）このウイルスは感染されたＣＤ４+ 細胞に対して
細胞変性的（cytopathic) である（ＨＴＬＶ−Ｉ及びII
のように形質転換的ではなく）； （ｃ）このウイルスは、Ｍｇ2+−依存性であり（最適濃
度５mM、最適pH７．８、アクチノマイシンＤにより阻害
される）そしてオリゴ（ｄＴ）12-18 をプライマーとし
てその３′ＬＴＲからの逆転写のために使用することが
できるＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）をコードする； （ｄ）このウイルスは、シュークロース勾配中で約１．
１６の密度においてバンドを形成する； 【００１６】（ｆ）このウイルスは、免疫学的規準及び
ヌクレオチド配列規準によりＨＴＬＶ−Ｉ／IIファミリ
ーのウイルスから区別される（この規準によりＨＴＬＶ
−III はＨＴＬＶ−Ｉ／IIファミリーの一員であるとは
考えられない）； （ｇ）このウイルスは、ＬＡＶのｇａｇ及びｅｎｖ領域
によりコードされた蛋白質と免疫学的に実質的に交差反
応する；そして、 （ｈ）このウイルスは、ＬＡＶと実質的なヌクレオチド
配列の相同性（７５〜１００％）及びアミノ酸配列の相
同性（７５〜１００％）を有する。免疫的に反応性 ：抗原及び抗体が相互に特異的に、典型
的には１０6 Ｍ-1以上、そしてしばしば１０8 Ｍ-1以上
の親和性をもって、結合することができる場合、これら
は“免疫的に反応性である”と言われる。 【００１７】形質転換、又は形質転換された：精製され
たＤＮＡの導入により受容細胞又は微生物の遺伝子型を
安定に且つ遺伝的に変更する過程。 リンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＶ）はＡＩＤＳ又はリン
パ腺症の症状を有する患者から単離することができる。
このような患者のリンパ腺を典型的には生検採取し、そ
して必要により増殖を支持するように補充された培地に
入れる。インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はフィト
ヘマグルチニン（ＰＨＡ）のごときマイトジエンを含有
せしめることができ、ヒト−インターフェロンに対する
抗血清を含めることもできる。逆転写酵素活性は典型的
には約１５日の培養で表われ、ウイルスの存在が示され
る。非イオン性洗浄を用い、次にシュークロース勾配中
でバンド化することによってウイルスを濃縮することが
できる。これらの精製法及び他の精製法は当業者におい
て良く知られており、例えばMontehro等、 J. Virology
４２：１０２９（１９８２）に記載されている。 【００１８】ＬＡＶは多くの方法のいずれかにより増殖
し得る。これはへその緒、末梢血又は骨髄由来のＴ−リ
ンパ球中で培養することができる。別の方法として、こ
れは不滅化されたＴ−細胞又はＢ−細胞中で増殖するこ
とができる。例えば、 Popovic等、 Science ２２４：
４９７（１９８４）；及びMontagnier等、 Science２２
５：６３（１９８４）を参照のこと。ウイルスの増殖は
通常逆転写酵素活性の存在によりモニターされる。ＬＡ
Ｖのゲノムクローンは当業界においてよく知られている
幾つかの方法のいずれかにより調製することができ、こ
れらの方法にはHahn等、Nature ３１２：１６６（１９
８４）；Alizon等、Nature ３１２：７５７（１９８
４）； Lucin等、Nature ３１２：７６０（１９８
４）；及び Muesing等、Nature ３１３：４５０（１９
８５）により記載された方法が含まれるが、これらに限
定されない。 【００１９】要約すれば、これらの方法の１つ（Alizon
等）においては健康な提供者のＴ−細胞にＬＡＶを感染
させたものからＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄIII のごとき
制限酵素により部分消化し、そして得られた消化物を電
気泳動的に分画する。完全なＬＶＡゲノム（約９．２K
b) のサイズに相当するサイズの断片をゲルから溶出
し、沈澱せしめ、再懸濁し、そして適切に制限酵素処理
されたベクターのアームに連結する。連結混合物をバク
テリオファージ粒子にパッケージする。 【００２０】このバクテリオファージにより細胞を形質
転換し、そしてクローンをその場でＬＡＶ挿入部につい
て、適当なプローブ（例えば、ＬＡＶ−ＲＮＡから調製
されたｃＤＮＡ）を用いてスクリーニングする。陽性ク
ローンから、ＬＡＶの所望の領域を細菌プラスミドベク
ター、例えばｐＵＣ１８にサブクローニングすることが
できる。不所望の配列を除去し、そして発現ベクターへ
のクローニングを促進する目的でいずれかの末端に追加
の制限部位（ポリリンカーの形で）を加えるためさらに
サブクローニングするのが好ましい場合がある。 【００２１】次に、ＬＡＶ配列を誘導性の発現ベクター
にサブクローニングすることができる。種々の発現ベク
ターが当業界において知られており、そしてλｇｔ１
１：Ｔｎ〔Hall等、Nature ３１１：３７９（１９８
４）；ｔｒｐＥ（Eur. J. CellBiol. ３１：１７１
（１９８３）；ｐＩＮ III（ Masui等、 Biotechnolog
y, １９８４年１月、８１頁）を含む。 【００２２】得られた蛋白質は部分的に精製することが
でき、そして免疫源として及びイムノアッセイにおける
抗原としての使用を含む種々の目的のために使用するこ
とができる。免疫源としての使用のためには、蛋白質を
緩衝液中又はアジュバント中で、動物、例えばマウス、
ラビット、ヤギ等に注射することができる。他の方法と
して、蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製し、そして注目のバンドをゲルから切り出し、すり
つぶし、そして宿主動物に注射するために緩衝液中に再
懸濁することができる。ポリクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体を調製することができる。 【００２３】イムノアッセイにおける抗原として使用す
るため、蛋白質をラベル化形又は非ラベル化形のいずれ
かとして使用することができる。これらが標識される場
合、ラベルは放射性同位元素、蛍光物質、酵素、発酵
剤、粒子等を包含することができる。これらの標識及び
他の標識が当業界においてよく知られており、そして例
えば米国特許出願 No.３，７６６，１６２、 No.３，７
９１，９３２、 No.３，８１７，８３７、 No.３，９９
６，３４５、及び No.４，２３３，４０２に記載されて
いる。この発明の組換蛋白質を用いる測定法は不均一法
（すなわち、分離段階を必要とする）、又は均一法であ
ることができる。測定法が不均一法である場合、遠心分
離、濾過、クロマトグラフィー、又は磁気を含む種々の
分離手段を用いることができる。 【００２４】抗体の存在について血液製剤又は他の生理
的流体をスクリーニングするための１つの好ましい測定
法はＥＬＩＳＡである。典型的には、抗体（この場合、
組換蛋白質の１つ又はその組み合わせ）をミクロタイタ
ーウエルの表面に吸着せしめる。次に、表面上の残留蛋
白質結合部位を適当な薬剤、例えばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、熱不活性化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又は
ＢＬＯＴＴＯ（防腐剤塩及び消泡剤をさらに含有する脱
脂粉乳の緩衝化溶液）によりブロックする。次に、ウエ
ルを、特異抗体を含有すると予想されるサンプルと共に
インキュベートする。サンプルはそのまま適用すること
ができ、又は一層しばしば、通常少量の（０．１〜５．
０重量％）の蛋白質、例えばＢＳＡ，ＮＧＳ又はＢＬＯ
ＴＴＯを含有する緩衝化溶液中に稀釈することができ
る。 【００２５】特異的結合が起こるのに十分な時間インキ
ュベートした後、ウエルを洗浄して未結合の蛋白質を除
去し、そして次に標識された抗−ヒト免疫グロブリン
（αＨｕＩｇ）と共にインキュベートする。この標識
は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、
β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及
びグルコースオキシダーゼを包含する種々の酵素から選
択することができる。特異的結合が生ずるのに十分な時
間の後、ウエルを再び洗浄して未結合の接合体を除去
し、そして酵素のための基質を加える。発色させ、そし
てウエルの内容物の光学濃度を視覚的に、又は装置を用
いて決定する。 【００２６】便利のため、ＥＬＩＳＡ用試薬はキットの
形で供給される。これらのキットは、組換技法によって
作られたウイルス蛋白質が前吸着されるミクロタイター
プレート、種々の稀釈剤及び緩衝剤、特異的に結合した
抗体を検出するための標識された接合体、及び他のシグ
ナル発生試薬、例えば酵素基質、コ−ファクター及び色
原体を含むことができる。 【００２７】ＬＡＶに感染された個体は、ｐ１３，ｐ１
８，ｐ２５，ｐ３６，ｇｐ４３，ｐ５５，ｇｐ１１０等
を含む多数のＬＡＶ蛋白質に対する抗体を含有する。す
べての個体が同じ蛋白質に対する抗体を生産するわけで
はないが、個々の血清は最も一貫してｇａｇ蛋白質ｐ２
５及びｐ１８，並びにｅｎｖ蛋白質ｇｐ４３及びｇｐ１
１０と反応性である。個体間の差異は疾患の進行程度を
含む種々の因子による。例えば、コア蛋白質に対する抗
体は疾患の最も早期には支配的であるが、しかし免疫抑
制の進行と共に減少する。これに対して、エンベロープ
糖蛋白質に対する抗体力価は疾患の後期を通じて持続す
ると考えられる。 【００２８】応答における他の差異はウイルス蛋白質を
コードする遺伝子中の多型性（ポリモルフィズム）に基
くであろう。ＬＡＶの異る単離体はｅｎｖ蛋白質の有意
な変化を有する。興味あることには、ｇａｇ蛋白質配列
は高度に保存されている。試験されたすべての血清反応
陽性サンプルにおいて、ｇａｇ蛋白質の少なくとも１つ
（ｐ１８又はｐ２５）あるいはｅｎｖ蛋白質の１つ（ｇ
ｐ４３又はｇｐ１１０）に対する抗体が見られた。しか
しながら、これらの蛋白質はいずれも血清反応陽性個体
により普遍的には認識されなかった。 【００２９】従って、血液を少なくとも１つのｇａｇ及
び１つのｅｎｇ蛋白質に対する抗体についてスクリーニ
ングすることが必須のようである。先行特許出願である
米国出願 No.７２１，２３７ "Expression of Immunolo
gically Reactive Viral Proteins"において、開示され
ている発明は、ＬＡＶに対する抗体と免疫的に反応性で
ある蛋白質をコードする、ＬＡＶゲノムのエンベロープ
（ｅｎｖ）領域の部分を用いる。本発明は、やはりＬＡ
Ｖに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質をコード
する、ＬＡＶゲノムのｇａｇ領域の部分を用いる。組み
合わせにおいて、ｇａｇ領域によりコードされる蛋白質
及びｅｎｖ領域によりコードされる蛋白質を用いて高い
感度をもって血清反応陽性個体を検出することができ
る。 【００３０】この発明の組換蛋白質の他の用途はヒト用
のワクチンとしてである。組換蛋白質は高度に精製し、
そして便利な方法で、一般に宿主kg当り１μｇ〜２０mg
の濃度で、製剤化することができる。生理的に許容され
る担体、例えば無菌水、塩溶液、緩衝化塩溶液等を使用
することができる。助剤、例えば酸化アルミニウムを使
用することもできる。ワクチンは静脈注射、皮下注射、
筋肉内注射、又は腹腔内注射により投与することができ
る。１回の注射で十分な場合もあるが、一層しばしば週
〜月間隔での多数の注射が好ましい。 【００３１】別の方法として、ＬＡＬゲノムの領域を発
現するワクチニアウイルス組換体を造成することができ
る。例えば、この発明の造成物をプラスミドｐＭＭ３４
（ Mackett等、 Science ２２７：４３３，１９８５）
に挿入し、そして生ずるキメラプラスミドを含有するワ
クチニアウイルスハイブリドを相同組換により形成する
ことができる。このような組換ウイルスワクチンによる
免疫感作は、肝炎Ｂウイルス及び水疱性口内炎ウイルス
に対する動物における保護免疫を生じさせるのに効果的
であることが示されている（ Smith等、Nature ３１
１：５７８，１９８４）。 【００３２】この方法による組換蛋白質ワクチンの使用
は、病原性微生物の不活性化調製物又は非毒性株からワ
クチンを構成する必要性を除去する。次の例において、
ＬＡＶ−ｇａｇのオーバラップする領域（図３）、並び
にｐ１８のほとんど及びｐ２５の部分を含むｇａｇ領域
の他の部分を発現のために選択した。この選択は、ｐ１
８及びｐ２５がＬＡＶに感染した個体からの血清と最も
再現性よく反応するｇａｇ蛋白質であるという知見に影
響された。これらの配列内での本発明者等の選択は、親
水性領域及びプロテアーゼ開裂部位（この両者は蛋白質
の表面で露出され、そして免疫原的である）の存在並び
に選択されたベクター（ｔｒｐＥ）中での効果的な発現
のためのサイズの限界により指示された。 【００３３】λＪ１９と称するＬＡＬゲノムクローンを
細菌プラスミドベクターｐＵＣ１８にサブクローン化し
た。ｐＢＴ−１と称する得られるサブクローンをさらに
サブクローン化して主としてｇａｇ及びｐｏｌ配列を含
有するｐＳＳ−５及びｐＢＳ−５を得た。１つの方法に
おいて（例１）、ｇａｇ配列をさらにｐＩＣ１９Ｒにサ
ブクローン化し（プラスミドｐＳＭ００２及びｐＢＰＢ
１４が形成される）、そして次にｇａｇ配列の領域をｔ
ｒｐＥ誘導性発現ベクターに移した。ｇａｇＤＮＡをｔ
ｒｐＥ遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入し、この
造成物によりＥ．コリを形質転換した場合にｔｒｐＥ−
ｇａｇ融合蛋白質の発現が得られた。生ずる蛋白質を部
分的に精製し、そして既知の血清反応陽性個体及び既知
の血清反応陰性個体からの血清とのＥＬＩＳＡにおける
それらの反応性により特徴付けた。ｐＧＡＧ−２及びｐ
ＧＡＧ−３と称する２つの有用な造成物が同定された。 【００３４】他の方法において（例２）、ｇａｇ配列の
部分（ｂｐ３７５−５４７）をｐＵＣ１８ａｍｐにさら
にサブクローン化した（プラスミド０６７４−１４−１
０が形成される）。次に、ｇａｇ配列の第２領域（ｂｐ
５０５−９６１）をプラスミド０６７４−１４−１０に
移し、プラスミド０６７４−２７−３８を生成せしめ
た。次に、ｇａｇ配列（ｂｐ３４７−９６１）をｔｒｐ
Ｅ誘導性発現ベクターｐＡＴＨ１０に移した。ｇａｇＤ
ＮＡをｔｒｐＥ遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入
し、この造成物によりＥ．コリを形質転換した場合ｔｒ
ｐＥ−ｇａｇ融合蛋白質の発現が得られた。生じた抗体
を部分的に精製し、そして既知抗体陽性個体及び既知の
抗体陰性個体からの血清とのＥＬＩＳＡにおけるそれら
の反応性により特徴付けた。ｐＧＡＧ−１と称する１つ
の有用な造成物を同定した。次の例は、制限的にではな
く、例示的に与えられる。 【００３５】例１． Ａ．ｔｒｐ−ｇａｇ発現ベクターの造成 外来蛋白質を発現するために幾つかの細菌発現系のいず
れかを使用することができる。ｔｒｐＥ系をＬＡＶ−ｇ
ａｇの発現のために使用した。なぜなら、これは強力な
誘導性プロモーターを含有するが、しかしその発現は、
外来性の（そして潜在的に毒性の）蛋白質が長期間にわ
たって細菌内に蓄積しないように抑制され得るからであ
る。 【００３６】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより限定される。例えば、
ｔｒｐＥ発現ベクターは、ＤＮＡ挿入部が対応末端にＢ
ａｍＨＩ，ＨｉｎｄIII 、又はＥｃｏＲＩ制限部位を有
することを必要とする。まず注目の領域を広範囲の又は
異る配置の制限部位を有する中間体ベクターにサブクロ
ーン化することにより、一層の多様性を得ることができ
る。次に、中間体ベクターにより提供される制限部位を
用いることにより、注目の領域を発現ベクターに導入す
ることができる。 【００３７】従って、本発明者等の方策は、まずＬＡＶ
ゲノムのｇａｇ領域のほとんどをトランスファーベクタ
ーｐＩＣ１９Ｒに挿入することであった。次に、これら
のサブクローンの種々の断片を、ポリリンカー領域中の
制限部位のリーディングフレームにおいてのみ異る（図
２）２つのｔｒｐ発現ベクター（ｐＪＨ１２，ｐＪＨ１
４）のいずれかに連結した。 【００３８】１．ＬＡＶゲノムのサブクローニング ａ．ファージＤＮＡの調製 完全なＬＡＶゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λＬ４７．１のＨｉｎｄIII 部位中の９．２Kbのゲノム
ＤＮＡ挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手し
た。このクローンはλＪ１９と称され、そして Wain-Ho
bson等、Cell ４０：９（１９８５）に記載されてい
る。λＪ１９ファージ粒子をＥ．コリＫ−１２のＱ３５
９株（Ｑ３５９の遺伝子型はｈｓｄＲＫ- ，ｈａｄＭＫ
+ ，ｓｕｐＦ，φ８０，Ｐ２）に、Maniatis等、 Molec
ular Cloning： A Laboratory Manual，ニューヨーク，
コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８２、
６４頁の方法に従ってトランスフェクトした。単一プラ
ークを拾い、そしてファージをプレート・ライセート法
（Maniatis，前掲、６５頁）により増幅した。 【００３９】３７℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（１００mm
直径）に５mlの１００mM ＮａＣｌ／２０mM ＭｇＳＯ
4 ／５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）を重層した。４℃に
て１２時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで２回抽出した。 【００４０】ファージ粒子を含有する得られた水相１０
mlに２mlの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ／２．５％ ＳＤＳ／
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH９）を加え、そしてこの懸濁液
を７０℃にて１５分間インキュベートしてファージを破
壊した。２．５mlの８Ｍ酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で１５分間インキュベートし、次に４℃
にて１２，０００×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を５０mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH８、１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH
８）により平衡化したもの〕により２０℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム／イソアミルアル
コール（２４：１）により２０℃にて抽出した。次に、
水相に２．５容量の９５％アルコールを加えてＤＮＡを
沈澱せしめた。遠心した後、ＤＮＡペレットを乾燥し、
そして１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．４）／１mM
ＥＤＴＡ中に再懸濁した。 【００４１】ｂ．ｇａｇ領域のサブクローニング 上記Ａ．１．ａで調製した約１２μｇのλＪ１９ＤＮＡ
を、ＬＡＶのこの単離体のＬＴＲ領域においてのみ切断
する制限酵素ＳｓｔＩ（ベセスダ・リサーチ・ラブス，
ベセスダ，ＭＤ）により完全に消化した。この消化混合
物を、０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓ−ボレート／０．０８９
Ｍ硼酸／１mM ＥＤＴＡ中０．９％アガロースを通して
１Ｖ／cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、９．１Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをＮＡ４５紙に電気溶出した（Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からＤＮＡを回収した。 【００４２】９．１Kb ＳｓｔＩ断片をＳｓｔＩで消化
されたベクターｐＵＣ１８に、挿入分子：ベクター分子
の比を１０：１にして連結した。Ｅ．コリＨＢ１０１株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のＣａＣｌ
2 法により形質転換し、そしてＬＢ＋アンピシリン（２
００μｇ／ml）寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、３mlのＬＢ＋アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで３７℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、３６８頁）に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡの
制限酵素分析により決定した場合にポリリンカー中のＥ
ｃｏＲＩ部位がＬＡＶゲノムの５′末端に最も近いよう
な方法で９．１Kb ＳｓｔＩ挿入部を含有する１つのコ
ロニーを選択した。このサブクローンはｐＢＴ−１と命
名された（ＡＴＣＣ＃５３０６９）（図１）。 【００４３】プラスミドｐＢＴ−１から２個のサブクロ
ーンを作った。第１番目（ｐＳＳ−５）のため、ｐＢＴ
−１をＳａｌＩで消化し、そして再連結した。第２番目
のｐＢＳ−５のため、ｐＢＴ−１をＢａｍＨＩ及びＢｇ
ｌIIで消化し、そして再連結した。各場合において、Ｌ
ＡＶゲノムの５′部分がベクターと共に維持された。Ｈ
Ｂ１０１細胞を連結されたＤＮＡにより形質転換し、そ
してｐＳＳ−５挿入部を有するコロニー及びｐＢＳ−５
挿入部を有するコロニーを、精製されたプラスミドＤＮ
Ａの制限分析により同定した。 【００４４】次に、ｐＳＳ−５及びｐＢＳ−５の領域を
中間体ベクターｐＩＣ１９Ｒにサブクローン化した。上
記のように、これは、発現ベクターへの移行のための正
しいリーディングフレーム内に必要な制限部位を与え
る。詳しくは、ｐＢＳ−５のＨｉｎｄIII 断片（ＬＡＶ
ゲノムのｂｐ６３１−ｂｐ１２５８；番号は Wain-Hobs
on等、Cell ４０：９（１９８５）を、ＨｉｎｄIII 及
びウシ腸ホスファターゼ処理されたｐＩＣ１９Ｒに連結
した（図４）。連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2 −ショッ
クを受けたＥ．コリＴＢ−１により取り込ませた。色原
体基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−
ガラクトシッド（シグマ）を用いて、アンピシリン耐性
コロニーを、ｇａｇ配列の挿入によるβ−ガラクトシダ
ーゼの不活性化についてスクリーニングした。挿入部の
方向はプラスミドＤＮＡをＰｖｏIIで消化することによ
り決定した。生ずるプラスミドをｐＳＭ００２と称す
る。 【００４５】ＰｖｕII−ＢｇｌII断片（ＬＡＶ遺伝子の
ｂｐ６９１〜ｂｐ１６４２）を、ＳｍａＩ及びＢｇｌII
で消化したｐＩＣ１９Ｒに連結した（図５）。連結され
たＤＮＡによりＥ．コリＨＢ１０１を処理し、そして生
じたアンピシリン耐性コロニーを上記の色原体によりス
クリーニングした。候補コロニーを、プラスミドＤＮＡ
の制限分析によりさらにスクリーニングした。生じたプ
ラスミドをｐＢＰＢ１４と称する。 【００４６】２．ｇａｇ配列のｔｒｐベクターへの挿入 発現ベクターは、ｐＢＲ３２２に挿入されたＥ．コリｔ
ｒｐオペロンプロモーター、オペレーター及びｔｒｐＥ
遺伝子を含有する（図２）。ｔｒｐＥ遺伝子を最もその
５′に近いＢｇｌII部位においてポリリンカー配列の挿
入により切断した〔 Konopka等、J. Virol. ５１：２２
３（１９８４）〕。異るｔｒｐベクター（ｐＪＨ１２及
びｐＪＨ１４）はポリリンカー領域内の制限部位のリー
ディングフレームに従って異る。適切なベクターへのオ
ープンリーディングフレームの挿入はアミノ末端におけ
るｔｒｐＥ配列との融合蛋白質をもたらす〔Spindler
等、J. Virol. ４９：１３２（１９８４）〕。 【００４７】ｐＧＡＧ−２（ＡＴＣＣ＃５３１１１）は
ＨｉｎｄIII ｇａｇサブクローン（ｐＳＭ００２、図
４）をＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化することにより造
成した。ＢｇｌII及びＢａｍＨＩ部位はｐＩＣ１１９Ｒ
の包囲するポリリンカー領域内に位置する。ｇａｇ断片
をゲル精製し、そしてＢａｍＨＩで消化されたｐＪＨ１
２に連結した（図４）。連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2
ショックＥ．コリＨＢ１０１に取り込ませ、そしてコロ
ニーをアンピシリン（１００μｇ／ml）及びトリプトフ
ァン（４０μｇ／ml）の存在下で増殖せしめた。その蓄
積が細菌にとって不都合である外来蛋白質の発現を抑制
するためにトリプトファンを使用した。候補アンピシリ
ン耐性コロニーを放射能標識されたｇａｇＤＮＡプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより同定した。少量溶
菌物（ミニライセート）の制限分析を用いて挿入部の存
在及び方向を確認した。 【００４８】ｐＧＡＧ−３（ＡＴＣＣ５３１１２）を、
図５に示すように、ＰＶＵII（ｂｐ６９１）及びＢｇｌ
II（ｂｐ１６４２）の間のｇａｇ領域を含有するｐＢＰ
Ｂ１４のＥｃｏＲＩ消化により造成した。ＥｃｏＲＩ部
位はｇａｇ配列を囲むポリリンカー配列内に存在する。
ｇａｇ断片をゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びウシ腸
ホスファターゼで処理したｐＪＨ１４に連結した。Ｅ．
コリＨＢ１０１細胞を、連結されたＤＮＡにより形質転
換し、前記のようにしてプレートし、そして制限分析に
よりスクリーニングしてｐＪＨ１４中のｇａｇ配列の存
在及び方向を確認した。 【００４９】Ｂ．蛋白質の発現 １．ｔｒｐ−ｇａｇ造成物によるＥ．コリの形質転換 組換ｔｒｐ−ｇａｇ発現プラスミドのそれぞれをＥ．コ
リＨＢ１０１からＥ．コリＣ６００に移した。後者が蛋
白質の生産のために一層良好な宿主だからである。移行
は、ＨＢ１０１の少量溶菌物からのスーパーコイルＤＮ
ＡによりＣａＣｌ2 −ショックＣ６００を形質転換する
ことにより行った。細菌を前記のようにアンピシリン及
びトリプトファンの存在下でプレートした〔 Konopka
等、J. Virol. ５１：２２３（１９８４）〕。薬剤耐性
コロニーを少量溶菌物によりスクリーニングし、適切な
プラスミドの存在を確認した。 【００５０】２．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の発現 ｔｒｐ 発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリＣ６
００の増殖及び誘導は記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. ４９：１３２（１９８４）； Konop
ka等、J. Virol. ５１：２２３（１９８４）〕。要約す
れば、トリプトファン（４０μｇ／ml）及びアンピシリ
ン（１００μｇ／ml）を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら３７℃にて一夜培養せしめた。次
に、この一夜培養物を、アンピシリン（１００μｇ／m
l）を含有するがしかしトリプトファンを含有しない新
鮮な最少培地に１：１００で接種した。 【００５１】これらの培養物を通気しながら２〜３時間
（対数期初期まで）３７℃にて増殖せしめた。誘導剤３
−β−インドール酢酸（シグマ）を、９５％エタノール
中２０mg／mlの新たに調製したストックから、最終濃度
が２０μｇ／mlとなるように加えた。誘導された培養物
を３７℃にて通気しながら４〜５時間増殖せしめ、そし
て次にペレット化し、そして場合によっては凍結した。
ｐＧＡＧ−２及びｐＧＡＧ３からの蛋白質収量は典型的
には１０〜３０mg／ｌであった。 【００５２】Ｃ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.５１：２２３（１９８４）〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物ｌ当り１００mlの
５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）／０．５mM ＥＤＴＡ／
１５０mM ＮａＣｌ（ＴＮＥ）中に再懸濁した。リゾチ
ーム（シグマ）を１mg／mlの最終濃度に加えた。０℃に
て１５分間の後、ＮＰ４０を混合物に最終濃度が０．０
５％〜０．２％となるように０℃にて１０分間にわたっ
て加えた。 【００５３】次に、１〜２mgのＤＮアーゼ（シグマ）を
１５０mlのＤＮアーゼ緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ／１
２mM ＭｇＣｌ2 ）と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、８０００×ｇ、０℃にて１５分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをＴＮＥ中で２回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【００５４】別の方法として、約２００mlからの細胞ペ
レットを１８０μｌの０．１４ＭＴｒｉｓ ＨＣｌ（pH
７．８）／６％ ＳＤＳ及び２０μｌのβ−メルカプト
エタノール中に再懸濁し、そして９５℃〜１００℃にて
２０分間加熱することにより、不溶性ペレットを変性
し、そして還元した。次にサンプルをスピード・バク・
コンセントレーター（サーバントインストルメンツ，ヒ
ックスビル，ＮＹ）中で乾燥した。ＳＤＳを除去した
後、サンプルを次のようにして抽出した。ペレットを１
mlのアセトン／トリエチルアミン／酢酸／水（１７／１
／１／１）中に再懸濁し、そして激しく渦動し、懸濁液
を氷上で１時間冷却し、濃縮し、そして上清を廃棄し
た。この抽出を０．４mlの前記アセトン混合物を用いて
２回、そして次に０．４mlのアセトンのみを用いて２回
反復した。次に、ペレットをスピード・バク・コンセン
トレーター中で乾燥した。 【００５５】次に、この蛋白質ペレットを１．４mlの６
Ｍグアニジンヒドロクロリド／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH８．５）／１０mM ＤＴＴ中に溶解し、そして
３７℃にて４時間インキュベートした。遠心によりすべ
ての粒状物を除去した。上清に含有されるサンプルを、
６Ｍグアニジンヒドロクロリド／１０mM ＥＤＴＡ／１
mM ＤＴＴ中で平衡化された１．６×９６cmセファクリ
ルＳ−３００カラム（ファルマシア，ピスカトウェイ，
ＮＪ）に負荷した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、そし
て溶出した物質の吸光を２８０nmにて測定した。画分を
ＥＬＩＳＡにより、ＬＡＶ血清陽性の血清及びＥ．コリ
血清陽性の血清を用いて測定してそれぞれ特異的反応性
及び汚染による反応性を決定した。前者の血清とは反応
性を示すが後者の血清とは反応性を示さない画分を使用
して次に患者のＥＬＩＳＡを行った。 【００５６】Ｄ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の免疫的反応性 １．ウエスタンブロットによる分析 ｐＧＡＧ−２及びｐＧＡＧ−３により発現された不溶性
蛋白質調製物からのアリコートを２％ドデシル硫酸ナト
リウム／１００mM Ｔｒｉｓ（pH６．８）／２０％グリ
セリン／１．５Ｍ β−メルカプトエタノール中に可溶
化し、そしてポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し
た。蛋白質をニトロセルロース（ＢＡ８５、シュライヒ
ェル・アンド・シュエル，キーン，ＮＨ）上に電気移送
し、そしてフィルターを５％ウシ血清アルブミン（シグ
マ）によりブロックした。次に、フィルターをＡＩＤＳ
患者からプールされた、Ｅ．コリ−吸着されたヒト血清
によりプローブした。このフィルターを、ＨＲＰ−接合
ヤギαＨｕＩｇにより発色せしめた。このプールは両ｔ
ｒｐ−ｇａｇ融合蛋白質と反応性であるがｔｒｐＥ蛋白
質のみとは反応性でなかった。 【００５７】２．ＥＬＩＳＡによる分析 カラム精製されたＧＡＧ−２及びＧＡＧ−３蛋白質を
０．０５Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH９．６）中に
最終濃度がそれぞれ０．３μｇ／ml及び３．４μｇ／ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り５０μｌの
アリコートを負荷し、そして４℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをＢＬＯＴＴＯ（５ｗ／ｖ％脱脂粉
乳／０．０１％チメロソル／０．０１％アンチホーム
Ａ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、pH７．２／０．１５
Ｍ塩化ナトリウム）により１時間室温にてブロックし
た。 【００５８】血清を、ＢＬＯＴＴＯ及びＰＢＳ（０．０
１Ｍリン酸ナトリウム、pH７．３／０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ）の１：１混合物により１：１００稀釈し、そしてウ
エル当り５０μｌの稀釈された血清を加えて３７℃にて
１時間置いた。血清を除去し、そしてプレートを３回洗
浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５ｗ／ｖ％ト
ゥイーン２０）中で３回洗浄した後、１００μｌのヤギ
抗−ヒトＩｇＧ／ホースラディッシュパーオキシダーゼ
接合体（５０％ストックを、５０mMクエン酸ナトリウム
／０．０５％トゥイーン２０／１％熱失活した正常ヤギ
血清、アンチボディーズ社，デービス，ＣＡから入手し
たものに１：１０，０００稀釈したもの）を加えて３７
℃にて１時間置いた。 【００５９】接合体を除去し、そしてプレートを０．１
５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５（ｗ／ｖ）％トゥイーン２０
で３回洗浄した。１００μｌ／ウエルの基質溶液（５０
mlの０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０中１０mg
３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン）を加
えて３０分間室温に置くことによりＥＬＩＳＡを発色せ
しめた。１００μｌ／ウエルの３Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 により
反応を停止し、そして４５０nmにおける光学濃度を自動
ＥＬＩＳＡリーダーにより決定した。ｐＧＡＧ−２及び
ｐＧＡＧ−３により生産された蛋白質はいずれも既知の
血清反応陽性の血清のパネルと反応性であることが見出
された。 【００６０】パネルは、２人の健康な異性愛者、ＬＡＳ
（リンパ腺症の症状）及び／又は同性愛者と診断された
５個体、ＡＩＤＳを有する１個体、及びＡＩＤＳ患者か
らの血清のプールを包含した。ＡＩＤＳ，ＬＡＳ及び／
又は同性愛個体からのすべての血清が、全体ウイルスＥ
ＬＩＳＡにおいて、及びＬＡＶ抗原の放射性ラベル化免
疫沈澱により血清反応陽性であるとして確認された。こ
れらの血清からの結果を表１に示す。これらの知見は、
ＬＡＶ抗原に対して反応性の血清は本発明の細菌により
発現されたｇａｇ蛋白質に対しても反応性であることを
証明している。 【００６１】３．ＬＡＶに対する血清抗体の検出のため
の蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中ＦＩＴＣ−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【００６２】他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中ＦＩＴＣ−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【００６３】 【表１】 【００６４】４．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質及びｔｒｐ−ｅ
ｎｖ蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質をｔｒ
ｐ−ｅｎｖ蛋白質と混合した。次に、ＧＡＧ−２又はＧ
ＡＧ−３のみについて前記したのと同様にしてＥＬＩＳ
Ａを行った。表２は、ＧＡＧ−３とＥＮＶ−３との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。 【００６５】 【表２】 【００６６】例２． Ａ．ｔｒｐ−ｇａｇ発現ベクターの造成 外来蛋白質の発現のために幾つかの細菌発現ベクターの
いずれかを使用することができる。ｔｒｐＥ系をＬＡＶ
−ｇａｇ配列の発現のために選択した。なぜなら、これ
は強力な誘導性プロモーターを含有するが、しかしなが
ら長期間にわたって外来（従って潜在的に毒性である）
蛋白質が細菌内に蓄積しないようにその発現が抑制され
得るからである。 【００６７】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより制限される。例えば、
ｔｒｐＥ発現ベクターｐＡＴＨ１０は、ＤＮＡ挿入部が
適合性末端にＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＨｉｎｄIII ，Ｐ
ｓｔＩ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＸｂａＩ，Ｘ
ｍａＩ、又はＥｃｏＲＩを有することを必要とする。ま
ず、所望の領域を、一層広範囲及び変化した配置の制限
部位を有する中間体ベクターにまずサブクローン化する
ことにより一層の多様性を導入する。次に、注目の領域
を、中間体ベクターにより提供される制限部位を用いて
発現ベクターに導入する。 【００６８】従って、方策はまず、ＬＡＶゲノムの所望
のｇａｇ領域を移送ベクターｐＵＣ１８ａｍｐにサブク
ローン化することである。次に、このサブクローンのｇ
ａｇ配列を、ｇａｇ挿入部の発現を可能にするリーディ
ングフレーム内に適切な制限部位を有するポリリンカー
領域を含有するｔｒｐ発現ベクターｐＡＴＨ１０に連結
する（図６）。 【００６９】１．ＬＡＶゲノムのサブクローン化 ａ．ファージＤＮＡの調製 完全なＬＡＶゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λＬ４７．１のＨｉｎｄIII 部位中の９．２KbゲノムＤ
ＮＡ挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手した。
このクローンはλＪ１９と称され、そして Wain-Hobson
等、Cell ４０：９（１９８５）に記載されている。λ
Ｊ１９ファージ粒子をＥ．コリＫ−１２のＱ３５９株
（Ｑ３５９の遺伝子型はｈｓｄＲｋ- ，ｈａｄＭｋ+ ，
ｓｕｐＦ，φ８０，Ｐ２）に、Maniatis等、 Molecular
Cloning： A Laboratory Manual，ニューヨーク，コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー，１９８２、６４
頁の方法に従ってトランスフェクトした。 【００７０】単一プラークを拾い、そしてファージをプ
レート・ライセート法（Maniatis，前掲、６５頁）によ
り増幅した。３７℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（１００mm
直径）に５mlの１００mM ＮａＣｌ／２０mM ＭｇＳＯ
4 ／５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）を重層した。４℃に
て１２時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで２回抽出した。 【００７１】ファージ粒子を含有する得られた水相１０
mlに２mlの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ／２．５％ ＳＤＳ／
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH９）を加え、そしてこの懸濁液
を７０℃にて１５分間インキュベートしてファージを破
壊した。２．５mlの８Ｍ酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で１５分間インキュベートし、次に４℃
にて１２，０００×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を５０mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH８、１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH
８）により平衡化したもの〕により２０℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム／イソアミルアル
コール（２４：１）により２０℃にて抽出した。次に、
水相に２．５容量の９５％アルコールを加えてＤＮＡを
沈澱せしめた。遠心した後、ＤＮＡペレットを乾燥し、
そして１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．４）／１mM
ＥＤＴＡ中に再懸濁した。 【００７２】ｂ．ｇａｇ領域のサブクローニング 上記Ａ．１．ａで調製した約１２μｇのλＪ１９ＤＮＡ
を、ＬＡＶのこの単離体のＬＴＲ領域においてのみ切断
する制限酵素ＳｓｔＩ（ベセスダ・リサーチ・ラブス，
ベセスダ，ＭＤ）により完全に消化した。この消化混合
物を、０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓ−ボレート／０．０８９
Ｍ硼酸／１mM ＥＤＴＡ中０．９％アガロースを通して
１Ｖ／cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、９．１Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをＮＡ４５紙に電気溶出した（Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からＤＮＡを回収した。 【００７３】９．１Kb ＳｓｔＩ断片をＳｓｔＩで消化
されたベクターｐＵＣ１８に、挿入分子：ベクター分子
の比を１０：１にして連結した。Ｅ．コリＨＢ１０１株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のＣａＣｌ
2 法により形質転換し、そしてＬＢ＋アンピシリン（２
００μｇ／ml）寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、３mlのＬＢ＋アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで３７℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、３６８頁）に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。 【００７４】プラスミドＤＮＡの制限酵素分析により決
定した場合にポリリンカー中のＥｃｏＲＩ部位がＬＡＶ
ゲノムの５′末端に最も近いような方法で９．１Kb Ｓ
ｓｔＩ挿入部を含有する１つのコロニーを選択した。こ
のサブクローンはｐＢＴ−１と命名された（ＡＴＣＣ＃
５３０６９）（図１）。ｐＢＴ−１をＢａｍＨＩ及びＢ
ｇｌIIで消化し、そして再連結した。ＬＡＶゲノムの
５′部分がベクターと共に維持された。ＨＢ１０１を連
結されたＤＮＡで形質転換し、そしてｐＢＳ−５挿入部
（図１参照のこと）を含むコロニーを、精製されたプラ
スミドＤＮＡの制限分析により同定した。 【００７５】ｐＧＡＧ１のｇａｇコード配列を、ｔｒｐ
発現ベクターへの適当な挿入のために必要な制限部位を
与えるｐＵＣ１８ａｍｐにサブクローン化した。必要な
ｇａｇ配列を連結するために２つのサブクローニング段
階を必要とした。第１段階において、ｐＢＳ−５をＳａ
ｕ３Ａで消化し、そしてｂｐ３７５からｂｐ５４７〔Wa
in-Hobson等、 Cell ４０：９（１９８５）に従って番
号を付与する〕にわたる１７２ｂｐ断片をゲル精製し
た。この断片をＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８ａｍｐ
に連結した。この連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2 −ショ
ックＥ．コリに取り込ませ、そして生じたアンピシリン
耐性コロニーを、色原体５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−ガラクトシドを用いて挿入部の存在に
ついてスクリーニングした。候補コロニーをプラスミド
ＤＮＡの制限分析によりスクリーニングした。得られた
プラスミドを０６７４−１４−１０と称する。 【００７６】第２段階において、０６７４−１４−１０
をＡｃｃＩ及びＰｓｔＩにより制限酵素処理し、そして
ｂｐ５０５のＡｃｃＩからｂｐ９６１のＰｓｔＩ部位に
わたるｐＢＳ−５からの４５６ｂｐに連結した。連結さ
れたＤＮＡをＣａＣｌ3 ショックＪＭ８３に取り込ま
せ、そしてアンピシリン耐性コロニーをプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析によりスクリーニングした。“０６７
４−２７−３８”と称する得られたプラスミドはｂｐ３
７５〜ｂｐ９６１のｇａｇコード配列を含有していた
（図７参照のこと）。 【００７７】２．ｔｒｐベクターへのｇａｇ配列の挿入 ｐＧＡＧ１（ＡＴＣＣ＃５３３７９）を、ｇａｇ配列を
囲むＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩポリリンカー制限部位にお
いて０６７４−２７−３８を消化することによって造成
した。この断片をゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＰ
ｓｔＩで消化されたｐＡＴＨ１０に連結した（図８参
照）。連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2 ショックＥ．コリ
Ｃ６００に取り込ませ、そしてアンピシリン耐性コロニ
ーをプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によりスクリーニ
ングしてｇａｇ配列の存在を確認した。 【００７８】Ｂ．蛋白質の発現 １．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の発現 ｔｒｐ 発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリＣ６
００の増殖及び誘導に記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. ４９：１３２（１９８４）； Konop
ka等、J. Virol. ５１：２２３（１９８４）〕。要約す
れば、トリプトファン（４０μｇ／ml）及びアンピシリ
ン（１００μｇ／ml）を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら３７℃にて一夜培養せしめた。 【００７９】次に、この一夜培養物を、アンピシリン
（１００μｇ／ml）を含有するがしかしトリプトファン
を含有しない新鮮な最少培地に１：１００で接種した。
これらの培養物を通気しながら２〜３時間（対数期初期
まで）３７℃にて増殖せしめた。誘導剤３−β−インド
ール酢酸（シグマ）を、９５％エタノール中２０mg／ml
の新たに調製したストックから、最終濃度が２０μｇ／
mlとなるように加えた。誘導された培養物を３７℃にて
通気しながら４〜５時間増殖せしめ、そして次にペレッ
ト化し、そして場合によっては凍結した。ｐＧＡＧ−１
からの蛋白質の収量は典型的には２０〜４０mg／ｌであ
った。 【００８０】Ｃ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.５１：２２３（１９８４）〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物ｌ当り１００mlの
５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）／０．５mM ＥＤＴＡ／
１５０mM ＮａＣｌ（ＴＮＥ）中に再懸濁した。リゾチ
ーム（シグマ）を１mg／mlの最終濃度に加えた。０℃に
て１５分間の後、ＮＰ４０を混合物に最終濃度が０．０
５％〜０．２％となるように０℃にて１０分間にわたっ
て加えた。 【００８１】次に、１〜２mgのＤＮアーゼ（シグマ）を
１５０mlのＤＮアーゼ緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ／１
２mM ＭｇＣｌ2 ）と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、８０００×ｇ、０℃にて１５分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをＴＮＥ中で２回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【００８２】別の方法として、融合蛋白質をＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。約２００
mlの細胞からの融合蛋白質を代表する約０．５mlの不溶
性ペレットを２mlの２％デオキシコレート／１Ｍ ＫＣ
ｌで３回洗浄し、そして次にＴＮＥで２回洗浄した。次
に、このペレットを０．４mlの５％ ＳＤＳ／１００mM
Ｔｒｉｓ（pH６．８）／２０％グリセロール／１．４
Ｍ β−メルカプトエタノール中に渦動により再懸濁し
そして１００℃にて１０分間加熱した。痕跡量の不溶物
を回転除去し、そして上清を８％ポリアクリルアミドゲ
ルに負荷した。蛋白質バンドを、ゲルの縁の染色マーカ
ーレーンによりクマッシーブリリアントブルーを用いて
可視化した。融合蛋白質を含有するゲルの領域を切取
り、そして０．１％ ＳＤＳ／２５mM Ｔｒｉｓ（pH
８．０）の緩衝液を満たした透析バッグに入れた。次
に、融合蛋白質をゲルから電気泳動溶出し、そして緩衝
液中に集めた。 【００８３】Ｄ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の免疫的反応性 １．ウエスタンブロットによる分析 ｐＧＡＧ−１により発現された不溶性蛋白質調製物から
のアリコートを２％ドデシル硫酸ナトリウム／１００mM
Ｔｒｉｓ（pH６．８）／２０％グリセリン／１．５Ｍ
β−メルカプトエタノール中に可溶化し、そしてポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した。蛋白質をニトロ
セルロース（ＢＡ８５、シュライヒェル・アンド・シュ
エル，キーン，ＮＨ）上に電気移送し、そしてフィルタ
ーを５％ウシ血清アルブミン（シグマ）によりブロック
した。次に、フィルターをＡＩＤＳ患者からプールされ
た、Ｅ．コリ−吸着されたヒト血清によりプローブし
た。このフィルターを、ＨＲＰ−接合ヤギαＨｕＩｇに
より発色せしめた。このプールは両ｔｒｐ−ｇａｇ融合
蛋白質と反応性であるがｔｒｐＥ蛋白質のみとは反応性
でなかった。 【００８４】２．ＥＬＩＳＡによる分析 カラム精製されたＧＡＧ−２及びＧＡＧ−３蛋白質を
０．０５Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH９．６）中に
最終濃度がそれぞれ０．３μｇ／ml及び３．４μｇ／ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り５０μｌの
アリコートを負荷し、そして４℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをＢＬＯＴＴＯ（５ｗ／ｖ％脱脂粉
乳／０．０１％チメロソル／０．０１％アンチホーム
Ａ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、pH７．２／０．１５
Ｍ塩化ナトリウム）により１時間室温にてブロックし
た。血清を、ＢＬＯＴＴＯ及びＰＢＳ（０．０１Ｍリン
酸ナトリウム、pH７．３／０．１５Ｍ ＮａＣｌ）の
１：１混合物により１：１００稀釈し、そしてウエル当
り５０μｌの稀釈された血清を加えて３７℃にて１時間
置いた。 【００８５】血清を除去し、そしてプレートを３回洗浄
緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５ｗ／ｖ％トゥ
イーン２０）中で３回洗浄した後、１００μｌのヤギ抗
−ヒトＩｇＧ／ホースラディッシュパーオキシダーゼ接
合体（５０％ストックを、５０mMクエン酸ナトリウム／
０．０５％トゥイーン２０／１％熱失活した正常ヤギ血
清、アンチボディーズ社，デービス，ＣＡから入手した
ものに１：１０，０００稀釈したもの）を加えて３７℃
にて１時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを
０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５（ｗ／ｖ）％トゥイー
ン２０で３回洗浄した。１００μｌ／ウエルの基質溶液
（５０mlの０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０中
１０mg ３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
ン）を加えて３０分間室温に置くことによりＥＬＩＳＡ
を発色せしめた。１００μｌ／ウエルの３Ｎ Ｈ2 ＳＯ
4 により反応を停止し、そして４５０nmにおける光学濃
度を自動ＥＬＩＳＡリーダーにより決定した。ｐＧＡＧ
−１により生産された蛋白質は既知の血清反応陽性の血
清のパネルと反応性であることが見出された。 【００８６】パネルはＬＡＶに対する血清反応陽性２４
１及びＬＡＶに対する血清反応陰性２７１（ウイルスを
基礎ＥＬＩＳＡにより定義されたもの）を含んだ。これ
らの血清は放射性標識されたＬＡＶ抗原の免疫沈澱によ
り確認されていた。表３は、陽性及び陰性血清サンプル
の両者が高及び低危険群の両者の個体から導かれること
を示している。ｐＧＡＧ１に反応する抗体は、程度は異
るが、すべての診断群に見出された。なお、ｐＧＡＧ１
に対する反応性は、健康であるか又はＡＩＤＳへの進行
の初期段階（例えば、ＰＧＬ又は永続的な一般化された
リンパ腺症）の個体に比べ、より少数の個体において見
出された。これは、ＬＡＶへの暴露の後早期にコアー蛋
白質に対する反応性を示すが疾患の進行に従ってコアー
蛋白質への反応性の喪失を示す報告と一致する。図９
は、すべての血清サンプルから得られた光学濃度のヒス
トグラムである。 【００８７】ｐＧＡＧ１の抗原としての有用性を小測定
においてＥＬＩＳＡによりさらに試験した。この方法に
おいては、ｅｎｖ組換蛋白質であるｐＥＮＶ３に対して
弱い反応性を示すか又は非反応性である血清をｐＧＡＧ
１との反応性について試験した。ｐＥＮＶ３及びｐＧＡ
Ｇ１のそれぞれ単独、並びに組合わせに対して試験され
た８個の陽性血清及び４個の陰性血清について、ＥＬＩ
ＳＡ値を表４に示す。これらの血清の内３種（１４−０
０８５，０７−３９１５、及び１４−０１００）はいず
れもｐＥＮＶ３に対して非反応性であるか又は弱く反応
するが、しかしウイルス及びｐＧＡＧ１に対して非常に
反応性であった。 【００８８】ウイルスに弱く反応する２種類の血清（０
８−００３０及び１０−００５６）はｐＥＮＶ３のみ又
はｐＧＡＧ１のみと非常に弱い反応性を有した。しかし
ながら、この両組換体との反応は、血清反応陰性対照か
らより容易に区別できる陽性ＥＬＩＳＡ値を与えた。こ
れらの結果は、ｐＧＡＧ１はｐＥＮＶ３に対して低い反
応性を有する陽性の血清を検出するのに有用であるこ
と、及びｐＧＡＧ１とｐＥＮＶ３との組合わせが、血清
反応陽性個体と血清反応陰性個体との間の識別において
いずれか一方より効果的であることを示している。 【００８９】 【表３】 【００９０】３．ＬＡＶに対する血清抗体の検出のため
に蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中ＦＩＴＣ−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【００９１】他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中ＦＩＴＣ−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【００９２】４．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質及びｔｒｐ−ｅ
ｎｖ蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質をｔｒ
ｐ−ｅｎｖ蛋白質と混合した。次に、ＧＡＧ−１又はＥ
ＮＶ−３のみについて前記したのと同様にしてＥＬＩＳ
Ａを行った。表４は、ＧＡＧ−１とＥＮＶ−３との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。蛋
白質を組み合わせた場合血清反応陽性サンプルの内７／
７が検出され、他方ＧＡＧ−１又はＥＮＶ−３のみによ
り検出した場合、６／７が検出された。 【００９３】 【表４】 【００９４】以上の記載から、この発明の特定の具体例
を説明のために記載したが、この発明の本質及び範囲を
逸脱することなく種々の変更を行うことができることが
予想されよう。従って、この発明は添付された請求の範
囲によるほか限定されるべきでない。
により製造されるウイルス蛋白質に関し、そしてさらに
詳しくはリンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＬ）に対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質に関する。 【０００２】 【従来の技術】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は日
和見感染及び若干のまれな悪性腫瘍により特徴付けられ
る細胞性免疫の伝染性疾患である。ＡＩＤＳについての
主たる危険群には同性愛の男性、静脈投与剤の乱用者、
輸注剤及び血液製剤の受容者、並びに高危険個体の異性
パートナー及び子供が含まれ、密接な接触及び血液製剤
を介して伝達される感染体の関与が示唆される。 【０００３】最近の証明によれば、疾患の伝染を担当す
る感染体はリンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＬ）として知
られる新しいリンパ趨向性レトロウイルスである〔Barr
e-Sinoussi等、 Science ２２０：８６８（１９８
３）〕。他の科学者グループによって類似のウイルスが
報告されており〔 Popovic等、 Science ２２４：４９
７（１９８４）；Levy等、 Science ２２５：８４０
（１９８４）；Vilmer等、Lancet １：７５３（１９８
３）〕、そしてヒトＴ−細胞リンパ趨向性ウイルスタイ
プ III（ＨＴＬＶ−III ）、ＡＩＤＳ関連レトロウイル
ス（ＡＲＶ）、又は免疫不全関連ウイルス（ＩＤＡＶ）
と命名されている。 【０００４】さらに最近のデーターは、ＬＡＶ，ＨＴＬ
Ｖ−III ，ＡＲＶ、及びＩＤＡＶは、実質的なヌクレオ
チドの相同性を含む幾つかの特徴を共有し〔 Wain-Hobs
on等、Cell ４０：９（１９８５）； Muesing等，Natu
re，３１３：４５０（１９８５）；Sanchez-Pescader
等、 Science ２２７：４８４（１９８５）〕、そして
同じウイルスの単離体であると考えるべきであることを
示している。但し、ウイルス単離体間の株対株変異が存
在する可能性もある。実質的なヌクレオチドの相同性を
示すことに加えて、単離体形態、細胞病理、最適逆転写
酵素活性の要求性、及び少なくとも幾つかの抗原性に関
して類似している〔Levy, 前掲； Schupbach等、 Scien
ce ２２４：５０３（１９８４）〕。 【０００５】前記のごとく、このウイルスは血液製剤
（血液、血清、血漿、及びこれらの画分）を介して伝染
し得ることが知られており、このため、提供者がこのウ
イルスに暴露されたことがあるか否かを決定するために
血液製剤をスクリーニングすることが重要である。これ
は、ＬＡＶ及び関連ウイルスに対する抗体の検出のため
のエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ（Ｅ
ＬＩＳＡ）を含む幾つかの方法の内任意の方法により行
うことができる。ＬＡＬに対する抗体を含有する血液を
有する個体は“血清反応陽性”（seropositive) である
と言われる。血清反応陽性提供者からの血液は検出の後
血液供給から除去され、こうして疾患の拡散が防止され
る。 【０００６】ＬＡＶに暴露された個体の免疫反応は多様
である。ｐ１３，ｐ１８，ｐ２５，ｐ３６，ｇｐ４３，
ｐ５５，ｇｐ１１０等を含む幾つかのウイルス蛋白質の
いずれに対しても抗体が生産され得る〔 Schupbach等、
N. Engl. J. Med. ３１２：２６５（１９８５）〕。す
べての個体が同じ蛋白質又は所与の蛋白質の同じエピト
ープに対する抗体を生産するわけではないであろう。 【０００７】血清反応陽性個体の検出は、最近行われて
いる所では、幾つかの本質的な問題点を有する。これら
の問題点の内主要な点は、免疫的測定のために全体ウイ
ルスから抗原を単離する必要があることである。この単
離は、潜在的に感染性の生ウイルスの大量操作を必要と
し、そしてこのこと自体かなり安全性を脅やかす。さら
に、調製ごとにウイルスの収量、純度及び再現性に関す
る懸念が存在する。このことが許容されない数の偽陽性
及び／又は偽陰性をもたらす。従って、血液のスクリー
ニング測定において有用でありそして他の関連する利点
をさらにもたらすウイルス抗原を製造するための他の方
法が当業界において求められる。 【０００８】 【発明の開示】要約すれば、この発明は、ＬＡＶゲノム
の群特異的抗原（ｇａｇ）領域の部分、すなわちＬＡＶ
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成るＤＮＡ配列を開示する。細菌宿主中で複
製することができる組換プラスミドも開示される。この
プラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シグ
ナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに続
く前記のＤＮＡ配列を含有する。好ましい態様において
は、シグナルは誘導性及び／又は抑制性であるｔｒｐオ
ペロンのごときオペロンから選択される。上記の組換プ
ラスミドにより形質転換された、Ｅ．コリ（E. coli ）
のごとき細菌の細胞も開示される。 【０００９】この発明の他の観点は、ＬＡＶに対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質の製造方法を開示す
る。この方法は、細菌宿主細胞中で複製可能な組換プラ
スミドを細菌宿主細胞に導入することを含んで成る。こ
のプラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シ
グナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに
続くＬＡＶゲノムのｇａｇ領域の部分、すなわちＬＡＶ
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成る。プラスミドの導入に続き細菌宿主を適
当な培地中で増殖せしめる。次に蛋白質の発現を誘導
し、そしてその配列の蛋白質生成物を細菌宿主から単離
する。単離に続き、蛋白質生成物を、例えばゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより精製する。 【００１０】この発明の他の観点は、ＬＡＶに対する抗
体の生物学的流体中での存在を検出する方法を開示す
る。この方法は、生物学的流体を、前記の組換プラスミ
ドにより形質転換された細菌細胞により生産された蛋白
質と共にインキュベートし、これによって反応混合物を
形成し、そして次にこの反応混合物を分析して抗体の存
在を決定することを含んで成る。好ましい態様において
は、反応混合物を分析する段階は、反応混合物を抗体に
対するラベルされた特異的結合パートナーと接触せしめ
ることを含んで成る。 【００１１】この発明の他の観点は、生物学的流体中の
ＬＡＬ抗原の存在を決定するための方法を開示し、この
方法は生物学的流体を、前記の組換プラスミドにより形
質転換された細菌細胞により生産された標識化蛋白質と
共にインキュベートし、そしてこれに続いて又はこれと
同時に該蛋白質に対する抗体と共にインキュベートして
特異的結合を生じさせる。次に、インキュベーションの
間に形成された反応混合物を分析して抗体と結合した標
識の量を決定する。前記の組換プラスミドにより形質転
換された細菌細胞により生産された蛋白質により動物を
免疫感作することを含んで成る、ＬＡＶに対する抗体の
製造方法も開示される。 【００１２】この発明の他の観点は、ＬＡＶに対する抗
体の生物学的流体中での存在を決定するための方法を開
示し、この方法は、細菌宿主細胞中で複製することがで
きそして発現のための原核性の転写及び翻訳シグナルを
含有する組換プラスミドにより形質転換された細菌細胞
により生産された蛋白質にラテックスビーズを接合せし
めることを含んで成る。前記シグナルに続き、ＬＡＶ遺
伝子のｇａｇ領域の部分、すなわちＬＡＶに対する抗体
と免疫的に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成
るＤＮＡ配列が存在する。次に、生物学的流体をビーズ
／蛋白質接合体と共にインキュベートし、これによって
反応混合物を形成する。次に、この反応混合物を分析し
て抗体の存在を決定する。 【００１３】この発明において製造される蛋白質は、適
当な担体又は稀釈剤と共に使用される場合、免疫的に有
効なワクチン組成物を構成する。ＬＡＶゲノムのｇａｇ
領域の部分を含んで成るＤＮＡ配列によりコードされた
蛋白質の免疫的有効量を医薬として許容される担体と共
に個体に投与することにより、ＡＩＤＳの原因となるウ
イルスにより惹起される感染が回避され得る。 【００１４】 【発明の実施の形態】発明を記載するに先立ち、以下に
使用される幾つかの用語の定義を記載するのが発明の理
解のために有用であろう。リンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＶ） ：ヒトＴ−リンパ趨
向性レトロウイルス。 この発明の目的のため、ウイルスが下記の規準を実質的
に満たす場合、それをＬＡＶと同一であるか又は同等の
ものと考える。 【００１５】（ａ）Ｔ−リンパ球、特にＴ−ヘルパー細
胞〔ＣＤ４+ 、 Bernard等編、Leucocyte Typing, ニュ
ーヨーク，スプリンガーベルラーク（１９８４）中に定
義された国際命名法に従う〕に対して向性である； （ｂ）このウイルスは感染されたＣＤ４+ 細胞に対して
細胞変性的（cytopathic) である（ＨＴＬＶ−Ｉ及びII
のように形質転換的ではなく）； （ｃ）このウイルスは、Ｍｇ2+−依存性であり（最適濃
度５mM、最適pH７．８、アクチノマイシンＤにより阻害
される）そしてオリゴ（ｄＴ）12-18 をプライマーとし
てその３′ＬＴＲからの逆転写のために使用することが
できるＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵
素）をコードする； （ｄ）このウイルスは、シュークロース勾配中で約１．
１６の密度においてバンドを形成する； 【００１６】（ｆ）このウイルスは、免疫学的規準及び
ヌクレオチド配列規準によりＨＴＬＶ−Ｉ／IIファミリ
ーのウイルスから区別される（この規準によりＨＴＬＶ
−III はＨＴＬＶ−Ｉ／IIファミリーの一員であるとは
考えられない）； （ｇ）このウイルスは、ＬＡＶのｇａｇ及びｅｎｖ領域
によりコードされた蛋白質と免疫学的に実質的に交差反
応する；そして、 （ｈ）このウイルスは、ＬＡＶと実質的なヌクレオチド
配列の相同性（７５〜１００％）及びアミノ酸配列の相
同性（７５〜１００％）を有する。免疫的に反応性 ：抗原及び抗体が相互に特異的に、典型
的には１０6 Ｍ-1以上、そしてしばしば１０8 Ｍ-1以上
の親和性をもって、結合することができる場合、これら
は“免疫的に反応性である”と言われる。 【００１７】形質転換、又は形質転換された：精製され
たＤＮＡの導入により受容細胞又は微生物の遺伝子型を
安定に且つ遺伝的に変更する過程。 リンパ腺症関連ウイルス（ＬＡＶ）はＡＩＤＳ又はリン
パ腺症の症状を有する患者から単離することができる。
このような患者のリンパ腺を典型的には生検採取し、そ
して必要により増殖を支持するように補充された培地に
入れる。インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はフィト
ヘマグルチニン（ＰＨＡ）のごときマイトジエンを含有
せしめることができ、ヒト−インターフェロンに対する
抗血清を含めることもできる。逆転写酵素活性は典型的
には約１５日の培養で表われ、ウイルスの存在が示され
る。非イオン性洗浄を用い、次にシュークロース勾配中
でバンド化することによってウイルスを濃縮することが
できる。これらの精製法及び他の精製法は当業者におい
て良く知られており、例えばMontehro等、 J. Virology
４２：１０２９（１９８２）に記載されている。 【００１８】ＬＡＶは多くの方法のいずれかにより増殖
し得る。これはへその緒、末梢血又は骨髄由来のＴ−リ
ンパ球中で培養することができる。別の方法として、こ
れは不滅化されたＴ−細胞又はＢ−細胞中で増殖するこ
とができる。例えば、 Popovic等、 Science ２２４：
４９７（１９８４）；及びMontagnier等、 Science２２
５：６３（１９８４）を参照のこと。ウイルスの増殖は
通常逆転写酵素活性の存在によりモニターされる。ＬＡ
Ｖのゲノムクローンは当業界においてよく知られている
幾つかの方法のいずれかにより調製することができ、こ
れらの方法にはHahn等、Nature ３１２：１６６（１９
８４）；Alizon等、Nature ３１２：７５７（１９８
４）； Lucin等、Nature ３１２：７６０（１９８
４）；及び Muesing等、Nature ３１３：４５０（１９
８５）により記載された方法が含まれるが、これらに限
定されない。 【００１９】要約すれば、これらの方法の１つ（Alizon
等）においては健康な提供者のＴ−細胞にＬＡＶを感染
させたものからＤＮＡを単離し、ＨｉｎｄIII のごとき
制限酵素により部分消化し、そして得られた消化物を電
気泳動的に分画する。完全なＬＶＡゲノム（約９．２K
b) のサイズに相当するサイズの断片をゲルから溶出
し、沈澱せしめ、再懸濁し、そして適切に制限酵素処理
されたベクターのアームに連結する。連結混合物をバク
テリオファージ粒子にパッケージする。 【００２０】このバクテリオファージにより細胞を形質
転換し、そしてクローンをその場でＬＡＶ挿入部につい
て、適当なプローブ（例えば、ＬＡＶ−ＲＮＡから調製
されたｃＤＮＡ）を用いてスクリーニングする。陽性ク
ローンから、ＬＡＶの所望の領域を細菌プラスミドベク
ター、例えばｐＵＣ１８にサブクローニングすることが
できる。不所望の配列を除去し、そして発現ベクターへ
のクローニングを促進する目的でいずれかの末端に追加
の制限部位（ポリリンカーの形で）を加えるためさらに
サブクローニングするのが好ましい場合がある。 【００２１】次に、ＬＡＶ配列を誘導性の発現ベクター
にサブクローニングすることができる。種々の発現ベク
ターが当業界において知られており、そしてλｇｔ１
１：Ｔｎ〔Hall等、Nature ３１１：３７９（１９８
４）；ｔｒｐＥ（Eur. J. CellBiol. ３１：１７１
（１９８３）；ｐＩＮ III（ Masui等、 Biotechnolog
y, １９８４年１月、８１頁）を含む。 【００２２】得られた蛋白質は部分的に精製することが
でき、そして免疫源として及びイムノアッセイにおける
抗原としての使用を含む種々の目的のために使用するこ
とができる。免疫源としての使用のためには、蛋白質を
緩衝液中又はアジュバント中で、動物、例えばマウス、
ラビット、ヤギ等に注射することができる。他の方法と
して、蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製し、そして注目のバンドをゲルから切り出し、すり
つぶし、そして宿主動物に注射するために緩衝液中に再
懸濁することができる。ポリクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体を調製することができる。 【００２３】イムノアッセイにおける抗原として使用す
るため、蛋白質をラベル化形又は非ラベル化形のいずれ
かとして使用することができる。これらが標識される場
合、ラベルは放射性同位元素、蛍光物質、酵素、発酵
剤、粒子等を包含することができる。これらの標識及び
他の標識が当業界においてよく知られており、そして例
えば米国特許出願 No.３，７６６，１６２、 No.３，７
９１，９３２、 No.３，８１７，８３７、 No.３，９９
６，３４５、及び No.４，２３３，４０２に記載されて
いる。この発明の組換蛋白質を用いる測定法は不均一法
（すなわち、分離段階を必要とする）、又は均一法であ
ることができる。測定法が不均一法である場合、遠心分
離、濾過、クロマトグラフィー、又は磁気を含む種々の
分離手段を用いることができる。 【００２４】抗体の存在について血液製剤又は他の生理
的流体をスクリーニングするための１つの好ましい測定
法はＥＬＩＳＡである。典型的には、抗体（この場合、
組換蛋白質の１つ又はその組み合わせ）をミクロタイタ
ーウエルの表面に吸着せしめる。次に、表面上の残留蛋
白質結合部位を適当な薬剤、例えばウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）、熱不活性化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又は
ＢＬＯＴＴＯ（防腐剤塩及び消泡剤をさらに含有する脱
脂粉乳の緩衝化溶液）によりブロックする。次に、ウエ
ルを、特異抗体を含有すると予想されるサンプルと共に
インキュベートする。サンプルはそのまま適用すること
ができ、又は一層しばしば、通常少量の（０．１〜５．
０重量％）の蛋白質、例えばＢＳＡ，ＮＧＳ又はＢＬＯ
ＴＴＯを含有する緩衝化溶液中に稀釈することができ
る。 【００２５】特異的結合が起こるのに十分な時間インキ
ュベートした後、ウエルを洗浄して未結合の蛋白質を除
去し、そして次に標識された抗−ヒト免疫グロブリン
（αＨｕＩｇ）と共にインキュベートする。この標識
は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）、
β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及
びグルコースオキシダーゼを包含する種々の酵素から選
択することができる。特異的結合が生ずるのに十分な時
間の後、ウエルを再び洗浄して未結合の接合体を除去
し、そして酵素のための基質を加える。発色させ、そし
てウエルの内容物の光学濃度を視覚的に、又は装置を用
いて決定する。 【００２６】便利のため、ＥＬＩＳＡ用試薬はキットの
形で供給される。これらのキットは、組換技法によって
作られたウイルス蛋白質が前吸着されるミクロタイター
プレート、種々の稀釈剤及び緩衝剤、特異的に結合した
抗体を検出するための標識された接合体、及び他のシグ
ナル発生試薬、例えば酵素基質、コ−ファクター及び色
原体を含むことができる。 【００２７】ＬＡＶに感染された個体は、ｐ１３，ｐ１
８，ｐ２５，ｐ３６，ｇｐ４３，ｐ５５，ｇｐ１１０等
を含む多数のＬＡＶ蛋白質に対する抗体を含有する。す
べての個体が同じ蛋白質に対する抗体を生産するわけで
はないが、個々の血清は最も一貫してｇａｇ蛋白質ｐ２
５及びｐ１８，並びにｅｎｖ蛋白質ｇｐ４３及びｇｐ１
１０と反応性である。個体間の差異は疾患の進行程度を
含む種々の因子による。例えば、コア蛋白質に対する抗
体は疾患の最も早期には支配的であるが、しかし免疫抑
制の進行と共に減少する。これに対して、エンベロープ
糖蛋白質に対する抗体力価は疾患の後期を通じて持続す
ると考えられる。 【００２８】応答における他の差異はウイルス蛋白質を
コードする遺伝子中の多型性（ポリモルフィズム）に基
くであろう。ＬＡＶの異る単離体はｅｎｖ蛋白質の有意
な変化を有する。興味あることには、ｇａｇ蛋白質配列
は高度に保存されている。試験されたすべての血清反応
陽性サンプルにおいて、ｇａｇ蛋白質の少なくとも１つ
（ｐ１８又はｐ２５）あるいはｅｎｖ蛋白質の１つ（ｇ
ｐ４３又はｇｐ１１０）に対する抗体が見られた。しか
しながら、これらの蛋白質はいずれも血清反応陽性個体
により普遍的には認識されなかった。 【００２９】従って、血液を少なくとも１つのｇａｇ及
び１つのｅｎｇ蛋白質に対する抗体についてスクリーニ
ングすることが必須のようである。先行特許出願である
米国出願 No.７２１，２３７ "Expression of Immunolo
gically Reactive Viral Proteins"において、開示され
ている発明は、ＬＡＶに対する抗体と免疫的に反応性で
ある蛋白質をコードする、ＬＡＶゲノムのエンベロープ
（ｅｎｖ）領域の部分を用いる。本発明は、やはりＬＡ
Ｖに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質をコード
する、ＬＡＶゲノムのｇａｇ領域の部分を用いる。組み
合わせにおいて、ｇａｇ領域によりコードされる蛋白質
及びｅｎｖ領域によりコードされる蛋白質を用いて高い
感度をもって血清反応陽性個体を検出することができ
る。 【００３０】この発明の組換蛋白質の他の用途はヒト用
のワクチンとしてである。組換蛋白質は高度に精製し、
そして便利な方法で、一般に宿主kg当り１μｇ〜２０mg
の濃度で、製剤化することができる。生理的に許容され
る担体、例えば無菌水、塩溶液、緩衝化塩溶液等を使用
することができる。助剤、例えば酸化アルミニウムを使
用することもできる。ワクチンは静脈注射、皮下注射、
筋肉内注射、又は腹腔内注射により投与することができ
る。１回の注射で十分な場合もあるが、一層しばしば週
〜月間隔での多数の注射が好ましい。 【００３１】別の方法として、ＬＡＬゲノムの領域を発
現するワクチニアウイルス組換体を造成することができ
る。例えば、この発明の造成物をプラスミドｐＭＭ３４
（ Mackett等、 Science ２２７：４３３，１９８５）
に挿入し、そして生ずるキメラプラスミドを含有するワ
クチニアウイルスハイブリドを相同組換により形成する
ことができる。このような組換ウイルスワクチンによる
免疫感作は、肝炎Ｂウイルス及び水疱性口内炎ウイルス
に対する動物における保護免疫を生じさせるのに効果的
であることが示されている（ Smith等、Nature ３１
１：５７８，１９８４）。 【００３２】この方法による組換蛋白質ワクチンの使用
は、病原性微生物の不活性化調製物又は非毒性株からワ
クチンを構成する必要性を除去する。次の例において、
ＬＡＶ−ｇａｇのオーバラップする領域（図３）、並び
にｐ１８のほとんど及びｐ２５の部分を含むｇａｇ領域
の他の部分を発現のために選択した。この選択は、ｐ１
８及びｐ２５がＬＡＶに感染した個体からの血清と最も
再現性よく反応するｇａｇ蛋白質であるという知見に影
響された。これらの配列内での本発明者等の選択は、親
水性領域及びプロテアーゼ開裂部位（この両者は蛋白質
の表面で露出され、そして免疫原的である）の存在並び
に選択されたベクター（ｔｒｐＥ）中での効果的な発現
のためのサイズの限界により指示された。 【００３３】λＪ１９と称するＬＡＬゲノムクローンを
細菌プラスミドベクターｐＵＣ１８にサブクローン化し
た。ｐＢＴ−１と称する得られるサブクローンをさらに
サブクローン化して主としてｇａｇ及びｐｏｌ配列を含
有するｐＳＳ−５及びｐＢＳ−５を得た。１つの方法に
おいて（例１）、ｇａｇ配列をさらにｐＩＣ１９Ｒにサ
ブクローン化し（プラスミドｐＳＭ００２及びｐＢＰＢ
１４が形成される）、そして次にｇａｇ配列の領域をｔ
ｒｐＥ誘導性発現ベクターに移した。ｇａｇＤＮＡをｔ
ｒｐＥ遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入し、この
造成物によりＥ．コリを形質転換した場合にｔｒｐＥ−
ｇａｇ融合蛋白質の発現が得られた。生ずる蛋白質を部
分的に精製し、そして既知の血清反応陽性個体及び既知
の血清反応陰性個体からの血清とのＥＬＩＳＡにおける
それらの反応性により特徴付けた。ｐＧＡＧ−２及びｐ
ＧＡＧ−３と称する２つの有用な造成物が同定された。 【００３４】他の方法において（例２）、ｇａｇ配列の
部分（ｂｐ３７５−５４７）をｐＵＣ１８ａｍｐにさら
にサブクローン化した（プラスミド０６７４−１４−１
０が形成される）。次に、ｇａｇ配列の第２領域（ｂｐ
５０５−９６１）をプラスミド０６７４−１４−１０に
移し、プラスミド０６７４−２７−３８を生成せしめ
た。次に、ｇａｇ配列（ｂｐ３４７−９６１）をｔｒｐ
Ｅ誘導性発現ベクターｐＡＴＨ１０に移した。ｇａｇＤ
ＮＡをｔｒｐＥ遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入
し、この造成物によりＥ．コリを形質転換した場合ｔｒ
ｐＥ−ｇａｇ融合蛋白質の発現が得られた。生じた抗体
を部分的に精製し、そして既知抗体陽性個体及び既知の
抗体陰性個体からの血清とのＥＬＩＳＡにおけるそれら
の反応性により特徴付けた。ｐＧＡＧ−１と称する１つ
の有用な造成物を同定した。次の例は、制限的にではな
く、例示的に与えられる。 【００３５】例１． Ａ．ｔｒｐ−ｇａｇ発現ベクターの造成 外来蛋白質を発現するために幾つかの細菌発現系のいず
れかを使用することができる。ｔｒｐＥ系をＬＡＶ−ｇ
ａｇの発現のために使用した。なぜなら、これは強力な
誘導性プロモーターを含有するが、しかしその発現は、
外来性の（そして潜在的に毒性の）蛋白質が長期間にわ
たって細菌内に蓄積しないように抑制され得るからであ
る。 【００３６】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより限定される。例えば、
ｔｒｐＥ発現ベクターは、ＤＮＡ挿入部が対応末端にＢ
ａｍＨＩ，ＨｉｎｄIII 、又はＥｃｏＲＩ制限部位を有
することを必要とする。まず注目の領域を広範囲の又は
異る配置の制限部位を有する中間体ベクターにサブクロ
ーン化することにより、一層の多様性を得ることができ
る。次に、中間体ベクターにより提供される制限部位を
用いることにより、注目の領域を発現ベクターに導入す
ることができる。 【００３７】従って、本発明者等の方策は、まずＬＡＶ
ゲノムのｇａｇ領域のほとんどをトランスファーベクタ
ーｐＩＣ１９Ｒに挿入することであった。次に、これら
のサブクローンの種々の断片を、ポリリンカー領域中の
制限部位のリーディングフレームにおいてのみ異る（図
２）２つのｔｒｐ発現ベクター（ｐＪＨ１２，ｐＪＨ１
４）のいずれかに連結した。 【００３８】１．ＬＡＶゲノムのサブクローニング ａ．ファージＤＮＡの調製 完全なＬＡＶゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λＬ４７．１のＨｉｎｄIII 部位中の９．２Kbのゲノム
ＤＮＡ挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手し
た。このクローンはλＪ１９と称され、そして Wain-Ho
bson等、Cell ４０：９（１９８５）に記載されてい
る。λＪ１９ファージ粒子をＥ．コリＫ−１２のＱ３５
９株（Ｑ３５９の遺伝子型はｈｓｄＲＫ- ，ｈａｄＭＫ
+ ，ｓｕｐＦ，φ８０，Ｐ２）に、Maniatis等、 Molec
ular Cloning： A Laboratory Manual，ニューヨーク，
コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８２、
６４頁の方法に従ってトランスフェクトした。単一プラ
ークを拾い、そしてファージをプレート・ライセート法
（Maniatis，前掲、６５頁）により増幅した。 【００３９】３７℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（１００mm
直径）に５mlの１００mM ＮａＣｌ／２０mM ＭｇＳＯ
4 ／５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）を重層した。４℃に
て１２時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで２回抽出した。 【００４０】ファージ粒子を含有する得られた水相１０
mlに２mlの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ／２．５％ ＳＤＳ／
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH９）を加え、そしてこの懸濁液
を７０℃にて１５分間インキュベートしてファージを破
壊した。２．５mlの８Ｍ酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で１５分間インキュベートし、次に４℃
にて１２，０００×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を５０mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH８、１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH
８）により平衡化したもの〕により２０℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム／イソアミルアル
コール（２４：１）により２０℃にて抽出した。次に、
水相に２．５容量の９５％アルコールを加えてＤＮＡを
沈澱せしめた。遠心した後、ＤＮＡペレットを乾燥し、
そして１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．４）／１mM
ＥＤＴＡ中に再懸濁した。 【００４１】ｂ．ｇａｇ領域のサブクローニング 上記Ａ．１．ａで調製した約１２μｇのλＪ１９ＤＮＡ
を、ＬＡＶのこの単離体のＬＴＲ領域においてのみ切断
する制限酵素ＳｓｔＩ（ベセスダ・リサーチ・ラブス，
ベセスダ，ＭＤ）により完全に消化した。この消化混合
物を、０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓ−ボレート／０．０８９
Ｍ硼酸／１mM ＥＤＴＡ中０．９％アガロースを通して
１Ｖ／cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、９．１Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをＮＡ４５紙に電気溶出した（Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からＤＮＡを回収した。 【００４２】９．１Kb ＳｓｔＩ断片をＳｓｔＩで消化
されたベクターｐＵＣ１８に、挿入分子：ベクター分子
の比を１０：１にして連結した。Ｅ．コリＨＢ１０１株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のＣａＣｌ
2 法により形質転換し、そしてＬＢ＋アンピシリン（２
００μｇ／ml）寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、３mlのＬＢ＋アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで３７℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、３６８頁）に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡの
制限酵素分析により決定した場合にポリリンカー中のＥ
ｃｏＲＩ部位がＬＡＶゲノムの５′末端に最も近いよう
な方法で９．１Kb ＳｓｔＩ挿入部を含有する１つのコ
ロニーを選択した。このサブクローンはｐＢＴ−１と命
名された（ＡＴＣＣ＃５３０６９）（図１）。 【００４３】プラスミドｐＢＴ−１から２個のサブクロ
ーンを作った。第１番目（ｐＳＳ−５）のため、ｐＢＴ
−１をＳａｌＩで消化し、そして再連結した。第２番目
のｐＢＳ−５のため、ｐＢＴ−１をＢａｍＨＩ及びＢｇ
ｌIIで消化し、そして再連結した。各場合において、Ｌ
ＡＶゲノムの５′部分がベクターと共に維持された。Ｈ
Ｂ１０１細胞を連結されたＤＮＡにより形質転換し、そ
してｐＳＳ−５挿入部を有するコロニー及びｐＢＳ−５
挿入部を有するコロニーを、精製されたプラスミドＤＮ
Ａの制限分析により同定した。 【００４４】次に、ｐＳＳ−５及びｐＢＳ−５の領域を
中間体ベクターｐＩＣ１９Ｒにサブクローン化した。上
記のように、これは、発現ベクターへの移行のための正
しいリーディングフレーム内に必要な制限部位を与え
る。詳しくは、ｐＢＳ−５のＨｉｎｄIII 断片（ＬＡＶ
ゲノムのｂｐ６３１−ｂｐ１２５８；番号は Wain-Hobs
on等、Cell ４０：９（１９８５）を、ＨｉｎｄIII 及
びウシ腸ホスファターゼ処理されたｐＩＣ１９Ｒに連結
した（図４）。連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2 −ショッ
クを受けたＥ．コリＴＢ−１により取り込ませた。色原
体基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−
ガラクトシッド（シグマ）を用いて、アンピシリン耐性
コロニーを、ｇａｇ配列の挿入によるβ−ガラクトシダ
ーゼの不活性化についてスクリーニングした。挿入部の
方向はプラスミドＤＮＡをＰｖｏIIで消化することによ
り決定した。生ずるプラスミドをｐＳＭ００２と称す
る。 【００４５】ＰｖｕII−ＢｇｌII断片（ＬＡＶ遺伝子の
ｂｐ６９１〜ｂｐ１６４２）を、ＳｍａＩ及びＢｇｌII
で消化したｐＩＣ１９Ｒに連結した（図５）。連結され
たＤＮＡによりＥ．コリＨＢ１０１を処理し、そして生
じたアンピシリン耐性コロニーを上記の色原体によりス
クリーニングした。候補コロニーを、プラスミドＤＮＡ
の制限分析によりさらにスクリーニングした。生じたプ
ラスミドをｐＢＰＢ１４と称する。 【００４６】２．ｇａｇ配列のｔｒｐベクターへの挿入 発現ベクターは、ｐＢＲ３２２に挿入されたＥ．コリｔ
ｒｐオペロンプロモーター、オペレーター及びｔｒｐＥ
遺伝子を含有する（図２）。ｔｒｐＥ遺伝子を最もその
５′に近いＢｇｌII部位においてポリリンカー配列の挿
入により切断した〔 Konopka等、J. Virol. ５１：２２
３（１９８４）〕。異るｔｒｐベクター（ｐＪＨ１２及
びｐＪＨ１４）はポリリンカー領域内の制限部位のリー
ディングフレームに従って異る。適切なベクターへのオ
ープンリーディングフレームの挿入はアミノ末端におけ
るｔｒｐＥ配列との融合蛋白質をもたらす〔Spindler
等、J. Virol. ４９：１３２（１９８４）〕。 【００４７】ｐＧＡＧ−２（ＡＴＣＣ＃５３１１１）は
ＨｉｎｄIII ｇａｇサブクローン（ｐＳＭ００２、図
４）をＢｇｌII及びＢａｍＨＩで消化することにより造
成した。ＢｇｌII及びＢａｍＨＩ部位はｐＩＣ１１９Ｒ
の包囲するポリリンカー領域内に位置する。ｇａｇ断片
をゲル精製し、そしてＢａｍＨＩで消化されたｐＪＨ１
２に連結した（図４）。連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2
ショックＥ．コリＨＢ１０１に取り込ませ、そしてコロ
ニーをアンピシリン（１００μｇ／ml）及びトリプトフ
ァン（４０μｇ／ml）の存在下で増殖せしめた。その蓄
積が細菌にとって不都合である外来蛋白質の発現を抑制
するためにトリプトファンを使用した。候補アンピシリ
ン耐性コロニーを放射能標識されたｇａｇＤＮＡプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより同定した。少量溶
菌物（ミニライセート）の制限分析を用いて挿入部の存
在及び方向を確認した。 【００４８】ｐＧＡＧ−３（ＡＴＣＣ５３１１２）を、
図５に示すように、ＰＶＵII（ｂｐ６９１）及びＢｇｌ
II（ｂｐ１６４２）の間のｇａｇ領域を含有するｐＢＰ
Ｂ１４のＥｃｏＲＩ消化により造成した。ＥｃｏＲＩ部
位はｇａｇ配列を囲むポリリンカー配列内に存在する。
ｇａｇ断片をゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びウシ腸
ホスファターゼで処理したｐＪＨ１４に連結した。Ｅ．
コリＨＢ１０１細胞を、連結されたＤＮＡにより形質転
換し、前記のようにしてプレートし、そして制限分析に
よりスクリーニングしてｐＪＨ１４中のｇａｇ配列の存
在及び方向を確認した。 【００４９】Ｂ．蛋白質の発現 １．ｔｒｐ−ｇａｇ造成物によるＥ．コリの形質転換 組換ｔｒｐ−ｇａｇ発現プラスミドのそれぞれをＥ．コ
リＨＢ１０１からＥ．コリＣ６００に移した。後者が蛋
白質の生産のために一層良好な宿主だからである。移行
は、ＨＢ１０１の少量溶菌物からのスーパーコイルＤＮ
ＡによりＣａＣｌ2 −ショックＣ６００を形質転換する
ことにより行った。細菌を前記のようにアンピシリン及
びトリプトファンの存在下でプレートした〔 Konopka
等、J. Virol. ５１：２２３（１９８４）〕。薬剤耐性
コロニーを少量溶菌物によりスクリーニングし、適切な
プラスミドの存在を確認した。 【００５０】２．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の発現 ｔｒｐ 発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリＣ６
００の増殖及び誘導は記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. ４９：１３２（１９８４）； Konop
ka等、J. Virol. ５１：２２３（１９８４）〕。要約す
れば、トリプトファン（４０μｇ／ml）及びアンピシリ
ン（１００μｇ／ml）を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら３７℃にて一夜培養せしめた。次
に、この一夜培養物を、アンピシリン（１００μｇ／m
l）を含有するがしかしトリプトファンを含有しない新
鮮な最少培地に１：１００で接種した。 【００５１】これらの培養物を通気しながら２〜３時間
（対数期初期まで）３７℃にて増殖せしめた。誘導剤３
−β−インドール酢酸（シグマ）を、９５％エタノール
中２０mg／mlの新たに調製したストックから、最終濃度
が２０μｇ／mlとなるように加えた。誘導された培養物
を３７℃にて通気しながら４〜５時間増殖せしめ、そし
て次にペレット化し、そして場合によっては凍結した。
ｐＧＡＧ−２及びｐＧＡＧ３からの蛋白質収量は典型的
には１０〜３０mg／ｌであった。 【００５２】Ｃ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.５１：２２３（１９８４）〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物ｌ当り１００mlの
５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）／０．５mM ＥＤＴＡ／
１５０mM ＮａＣｌ（ＴＮＥ）中に再懸濁した。リゾチ
ーム（シグマ）を１mg／mlの最終濃度に加えた。０℃に
て１５分間の後、ＮＰ４０を混合物に最終濃度が０．０
５％〜０．２％となるように０℃にて１０分間にわたっ
て加えた。 【００５３】次に、１〜２mgのＤＮアーゼ（シグマ）を
１５０mlのＤＮアーゼ緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ／１
２mM ＭｇＣｌ2 ）と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、８０００×ｇ、０℃にて１５分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをＴＮＥ中で２回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【００５４】別の方法として、約２００mlからの細胞ペ
レットを１８０μｌの０．１４ＭＴｒｉｓ ＨＣｌ（pH
７．８）／６％ ＳＤＳ及び２０μｌのβ−メルカプト
エタノール中に再懸濁し、そして９５℃〜１００℃にて
２０分間加熱することにより、不溶性ペレットを変性
し、そして還元した。次にサンプルをスピード・バク・
コンセントレーター（サーバントインストルメンツ，ヒ
ックスビル，ＮＹ）中で乾燥した。ＳＤＳを除去した
後、サンプルを次のようにして抽出した。ペレットを１
mlのアセトン／トリエチルアミン／酢酸／水（１７／１
／１／１）中に再懸濁し、そして激しく渦動し、懸濁液
を氷上で１時間冷却し、濃縮し、そして上清を廃棄し
た。この抽出を０．４mlの前記アセトン混合物を用いて
２回、そして次に０．４mlのアセトンのみを用いて２回
反復した。次に、ペレットをスピード・バク・コンセン
トレーター中で乾燥した。 【００５５】次に、この蛋白質ペレットを１．４mlの６
Ｍグアニジンヒドロクロリド／０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH８．５）／１０mM ＤＴＴ中に溶解し、そして
３７℃にて４時間インキュベートした。遠心によりすべ
ての粒状物を除去した。上清に含有されるサンプルを、
６Ｍグアニジンヒドロクロリド／１０mM ＥＤＴＡ／１
mM ＤＴＴ中で平衡化された１．６×９６cmセファクリ
ルＳ−３００カラム（ファルマシア，ピスカトウェイ，
ＮＪ）に負荷した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、そし
て溶出した物質の吸光を２８０nmにて測定した。画分を
ＥＬＩＳＡにより、ＬＡＶ血清陽性の血清及びＥ．コリ
血清陽性の血清を用いて測定してそれぞれ特異的反応性
及び汚染による反応性を決定した。前者の血清とは反応
性を示すが後者の血清とは反応性を示さない画分を使用
して次に患者のＥＬＩＳＡを行った。 【００５６】Ｄ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の免疫的反応性 １．ウエスタンブロットによる分析 ｐＧＡＧ−２及びｐＧＡＧ−３により発現された不溶性
蛋白質調製物からのアリコートを２％ドデシル硫酸ナト
リウム／１００mM Ｔｒｉｓ（pH６．８）／２０％グリ
セリン／１．５Ｍ β−メルカプトエタノール中に可溶
化し、そしてポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し
た。蛋白質をニトロセルロース（ＢＡ８５、シュライヒ
ェル・アンド・シュエル，キーン，ＮＨ）上に電気移送
し、そしてフィルターを５％ウシ血清アルブミン（シグ
マ）によりブロックした。次に、フィルターをＡＩＤＳ
患者からプールされた、Ｅ．コリ−吸着されたヒト血清
によりプローブした。このフィルターを、ＨＲＰ−接合
ヤギαＨｕＩｇにより発色せしめた。このプールは両ｔ
ｒｐ−ｇａｇ融合蛋白質と反応性であるがｔｒｐＥ蛋白
質のみとは反応性でなかった。 【００５７】２．ＥＬＩＳＡによる分析 カラム精製されたＧＡＧ−２及びＧＡＧ−３蛋白質を
０．０５Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH９．６）中に
最終濃度がそれぞれ０．３μｇ／ml及び３．４μｇ／ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り５０μｌの
アリコートを負荷し、そして４℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをＢＬＯＴＴＯ（５ｗ／ｖ％脱脂粉
乳／０．０１％チメロソル／０．０１％アンチホーム
Ａ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、pH７．２／０．１５
Ｍ塩化ナトリウム）により１時間室温にてブロックし
た。 【００５８】血清を、ＢＬＯＴＴＯ及びＰＢＳ（０．０
１Ｍリン酸ナトリウム、pH７．３／０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ）の１：１混合物により１：１００稀釈し、そしてウ
エル当り５０μｌの稀釈された血清を加えて３７℃にて
１時間置いた。血清を除去し、そしてプレートを３回洗
浄緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５ｗ／ｖ％ト
ゥイーン２０）中で３回洗浄した後、１００μｌのヤギ
抗−ヒトＩｇＧ／ホースラディッシュパーオキシダーゼ
接合体（５０％ストックを、５０mMクエン酸ナトリウム
／０．０５％トゥイーン２０／１％熱失活した正常ヤギ
血清、アンチボディーズ社，デービス，ＣＡから入手し
たものに１：１０，０００稀釈したもの）を加えて３７
℃にて１時間置いた。 【００５９】接合体を除去し、そしてプレートを０．１
５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５（ｗ／ｖ）％トゥイーン２０
で３回洗浄した。１００μｌ／ウエルの基質溶液（５０
mlの０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０中１０mg
３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン）を加
えて３０分間室温に置くことによりＥＬＩＳＡを発色せ
しめた。１００μｌ／ウエルの３Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 により
反応を停止し、そして４５０nmにおける光学濃度を自動
ＥＬＩＳＡリーダーにより決定した。ｐＧＡＧ−２及び
ｐＧＡＧ−３により生産された蛋白質はいずれも既知の
血清反応陽性の血清のパネルと反応性であることが見出
された。 【００６０】パネルは、２人の健康な異性愛者、ＬＡＳ
（リンパ腺症の症状）及び／又は同性愛者と診断された
５個体、ＡＩＤＳを有する１個体、及びＡＩＤＳ患者か
らの血清のプールを包含した。ＡＩＤＳ，ＬＡＳ及び／
又は同性愛個体からのすべての血清が、全体ウイルスＥ
ＬＩＳＡにおいて、及びＬＡＶ抗原の放射性ラベル化免
疫沈澱により血清反応陽性であるとして確認された。こ
れらの血清からの結果を表１に示す。これらの知見は、
ＬＡＶ抗原に対して反応性の血清は本発明の細菌により
発現されたｇａｇ蛋白質に対しても反応性であることを
証明している。 【００６１】３．ＬＡＶに対する血清抗体の検出のため
の蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中ＦＩＴＣ−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【００６２】他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中ＦＩＴＣ−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【００６３】 【表１】 【００６４】４．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質及びｔｒｐ−ｅ
ｎｖ蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質をｔｒ
ｐ−ｅｎｖ蛋白質と混合した。次に、ＧＡＧ−２又はＧ
ＡＧ−３のみについて前記したのと同様にしてＥＬＩＳ
Ａを行った。表２は、ＧＡＧ−３とＥＮＶ−３との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。 【００６５】 【表２】 【００６６】例２． Ａ．ｔｒｐ−ｇａｇ発現ベクターの造成 外来蛋白質の発現のために幾つかの細菌発現ベクターの
いずれかを使用することができる。ｔｒｐＥ系をＬＡＶ
−ｇａｇ配列の発現のために選択した。なぜなら、これ
は強力な誘導性プロモーターを含有するが、しかしなが
ら長期間にわたって外来（従って潜在的に毒性である）
蛋白質が細菌内に蓄積しないようにその発現が抑制され
得るからである。 【００６７】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより制限される。例えば、
ｔｒｐＥ発現ベクターｐＡＴＨ１０は、ＤＮＡ挿入部が
適合性末端にＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，ＨｉｎｄIII ，Ｐ
ｓｔＩ，ＳａｃＩ，ＳａｌＩ，ＳｍａＩ，ＸｂａＩ，Ｘ
ｍａＩ、又はＥｃｏＲＩを有することを必要とする。ま
ず、所望の領域を、一層広範囲及び変化した配置の制限
部位を有する中間体ベクターにまずサブクローン化する
ことにより一層の多様性を導入する。次に、注目の領域
を、中間体ベクターにより提供される制限部位を用いて
発現ベクターに導入する。 【００６８】従って、方策はまず、ＬＡＶゲノムの所望
のｇａｇ領域を移送ベクターｐＵＣ１８ａｍｐにサブク
ローン化することである。次に、このサブクローンのｇ
ａｇ配列を、ｇａｇ挿入部の発現を可能にするリーディ
ングフレーム内に適切な制限部位を有するポリリンカー
領域を含有するｔｒｐ発現ベクターｐＡＴＨ１０に連結
する（図６）。 【００６９】１．ＬＡＶゲノムのサブクローン化 ａ．ファージＤＮＡの調製 完全なＬＡＶゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λＬ４７．１のＨｉｎｄIII 部位中の９．２KbゲノムＤ
ＮＡ挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手した。
このクローンはλＪ１９と称され、そして Wain-Hobson
等、Cell ４０：９（１９８５）に記載されている。λ
Ｊ１９ファージ粒子をＥ．コリＫ−１２のＱ３５９株
（Ｑ３５９の遺伝子型はｈｓｄＲｋ- ，ｈａｄＭｋ+ ，
ｓｕｐＦ，φ８０，Ｐ２）に、Maniatis等、 Molecular
Cloning： A Laboratory Manual，ニューヨーク，コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー，１９８２、６４
頁の方法に従ってトランスフェクトした。 【００７０】単一プラークを拾い、そしてファージをプ
レート・ライセート法（Maniatis，前掲、６５頁）によ
り増幅した。３７℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（１００mm
直径）に５mlの１００mM ＮａＣｌ／２０mM ＭｇＳＯ
4 ／５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）を重層した。４℃に
て１２時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで２回抽出した。 【００７１】ファージ粒子を含有する得られた水相１０
mlに２mlの０．２５Ｍ ＥＤＴＡ／２．５％ ＳＤＳ／
０．５Ｍ Ｔｒｉｓ（pH９）を加え、そしてこの懸濁液
を７０℃にて１５分間インキュベートしてファージを破
壊した。２．５mlの８Ｍ酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で１５分間インキュベートし、次に４℃
にて１２，０００×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を５０mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH８、１Ｍ Ｔｒｉｓ（pH
８）により平衡化したもの〕により２０℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム／イソアミルアル
コール（２４：１）により２０℃にて抽出した。次に、
水相に２．５容量の９５％アルコールを加えてＤＮＡを
沈澱せしめた。遠心した後、ＤＮＡペレットを乾燥し、
そして１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH７．４）／１mM
ＥＤＴＡ中に再懸濁した。 【００７２】ｂ．ｇａｇ領域のサブクローニング 上記Ａ．１．ａで調製した約１２μｇのλＪ１９ＤＮＡ
を、ＬＡＶのこの単離体のＬＴＲ領域においてのみ切断
する制限酵素ＳｓｔＩ（ベセスダ・リサーチ・ラブス，
ベセスダ，ＭＤ）により完全に消化した。この消化混合
物を、０．０８９Ｍ Ｔｒｉｓ−ボレート／０．０８９
Ｍ硼酸／１mM ＥＤＴＡ中０．９％アガロースを通して
１Ｖ／cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、９．１Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをＮＡ４５紙に電気溶出した（Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からＤＮＡを回収した。 【００７３】９．１Kb ＳｓｔＩ断片をＳｓｔＩで消化
されたベクターｐＵＣ１８に、挿入分子：ベクター分子
の比を１０：１にして連結した。Ｅ．コリＨＢ１０１株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のＣａＣｌ
2 法により形質転換し、そしてＬＢ＋アンピシリン（２
００μｇ／ml）寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、３mlのＬＢ＋アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで３７℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、３６８頁）に
よりプラスミドＤＮＡを調製した。 【００７４】プラスミドＤＮＡの制限酵素分析により決
定した場合にポリリンカー中のＥｃｏＲＩ部位がＬＡＶ
ゲノムの５′末端に最も近いような方法で９．１Kb Ｓ
ｓｔＩ挿入部を含有する１つのコロニーを選択した。こ
のサブクローンはｐＢＴ−１と命名された（ＡＴＣＣ＃
５３０６９）（図１）。ｐＢＴ−１をＢａｍＨＩ及びＢ
ｇｌIIで消化し、そして再連結した。ＬＡＶゲノムの
５′部分がベクターと共に維持された。ＨＢ１０１を連
結されたＤＮＡで形質転換し、そしてｐＢＳ−５挿入部
（図１参照のこと）を含むコロニーを、精製されたプラ
スミドＤＮＡの制限分析により同定した。 【００７５】ｐＧＡＧ１のｇａｇコード配列を、ｔｒｐ
発現ベクターへの適当な挿入のために必要な制限部位を
与えるｐＵＣ１８ａｍｐにサブクローン化した。必要な
ｇａｇ配列を連結するために２つのサブクローニング段
階を必要とした。第１段階において、ｐＢＳ−５をＳａ
ｕ３Ａで消化し、そしてｂｐ３７５からｂｐ５４７〔Wa
in-Hobson等、 Cell ４０：９（１９８５）に従って番
号を付与する〕にわたる１７２ｂｐ断片をゲル精製し
た。この断片をＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１８ａｍｐ
に連結した。この連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2 −ショ
ックＥ．コリに取り込ませ、そして生じたアンピシリン
耐性コロニーを、色原体５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−ガラクトシドを用いて挿入部の存在に
ついてスクリーニングした。候補コロニーをプラスミド
ＤＮＡの制限分析によりスクリーニングした。得られた
プラスミドを０６７４−１４−１０と称する。 【００７６】第２段階において、０６７４−１４−１０
をＡｃｃＩ及びＰｓｔＩにより制限酵素処理し、そして
ｂｐ５０５のＡｃｃＩからｂｐ９６１のＰｓｔＩ部位に
わたるｐＢＳ−５からの４５６ｂｐに連結した。連結さ
れたＤＮＡをＣａＣｌ3 ショックＪＭ８３に取り込ま
せ、そしてアンピシリン耐性コロニーをプラスミドＤＮ
Ａの制限酵素分析によりスクリーニングした。“０６７
４−２７−３８”と称する得られたプラスミドはｂｐ３
７５〜ｂｐ９６１のｇａｇコード配列を含有していた
（図７参照のこと）。 【００７７】２．ｔｒｐベクターへのｇａｇ配列の挿入 ｐＧＡＧ１（ＡＴＣＣ＃５３３７９）を、ｇａｇ配列を
囲むＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩポリリンカー制限部位にお
いて０６７４−２７−３８を消化することによって造成
した。この断片をゲル精製し、そしてＥｃｏＲＩ及びＰ
ｓｔＩで消化されたｐＡＴＨ１０に連結した（図８参
照）。連結されたＤＮＡをＣａＣｌ2 ショックＥ．コリ
Ｃ６００に取り込ませ、そしてアンピシリン耐性コロニ
ーをプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によりスクリーニ
ングしてｇａｇ配列の存在を確認した。 【００７８】Ｂ．蛋白質の発現 １．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の発現 ｔｒｐ 発現ベクターにより形質転換されたＥ．コリＣ６
００の増殖及び誘導に記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. ４９：１３２（１９８４）； Konop
ka等、J. Virol. ５１：２２３（１９８４）〕。要約す
れば、トリプトファン（４０μｇ／ml）及びアンピシリ
ン（１００μｇ／ml）を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら３７℃にて一夜培養せしめた。 【００７９】次に、この一夜培養物を、アンピシリン
（１００μｇ／ml）を含有するがしかしトリプトファン
を含有しない新鮮な最少培地に１：１００で接種した。
これらの培養物を通気しながら２〜３時間（対数期初期
まで）３７℃にて増殖せしめた。誘導剤３−β−インド
ール酢酸（シグマ）を、９５％エタノール中２０mg／ml
の新たに調製したストックから、最終濃度が２０μｇ／
mlとなるように加えた。誘導された培養物を３７℃にて
通気しながら４〜５時間増殖せしめ、そして次にペレッ
ト化し、そして場合によっては凍結した。ｐＧＡＧ−１
からの蛋白質の収量は典型的には２０〜４０mg／ｌであ
った。 【００８０】Ｃ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.５１：２２３（１９８４）〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物ｌ当り１００mlの
５０mM Ｔｒｉｓ（pH７．５）／０．５mM ＥＤＴＡ／
１５０mM ＮａＣｌ（ＴＮＥ）中に再懸濁した。リゾチ
ーム（シグマ）を１mg／mlの最終濃度に加えた。０℃に
て１５分間の後、ＮＰ４０を混合物に最終濃度が０．０
５％〜０．２％となるように０℃にて１０分間にわたっ
て加えた。 【００８１】次に、１〜２mgのＤＮアーゼ（シグマ）を
１５０mlのＤＮアーゼ緩衝液（１．５Ｍ ＮａＣｌ／１
２mM ＭｇＣｌ2 ）と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、８０００×ｇ、０℃にて１５分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをＴＮＥ中で２回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【００８２】別の方法として、融合蛋白質をＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。約２００
mlの細胞からの融合蛋白質を代表する約０．５mlの不溶
性ペレットを２mlの２％デオキシコレート／１Ｍ ＫＣ
ｌで３回洗浄し、そして次にＴＮＥで２回洗浄した。次
に、このペレットを０．４mlの５％ ＳＤＳ／１００mM
Ｔｒｉｓ（pH６．８）／２０％グリセロール／１．４
Ｍ β−メルカプトエタノール中に渦動により再懸濁し
そして１００℃にて１０分間加熱した。痕跡量の不溶物
を回転除去し、そして上清を８％ポリアクリルアミドゲ
ルに負荷した。蛋白質バンドを、ゲルの縁の染色マーカ
ーレーンによりクマッシーブリリアントブルーを用いて
可視化した。融合蛋白質を含有するゲルの領域を切取
り、そして０．１％ ＳＤＳ／２５mM Ｔｒｉｓ（pH
８．０）の緩衝液を満たした透析バッグに入れた。次
に、融合蛋白質をゲルから電気泳動溶出し、そして緩衝
液中に集めた。 【００８３】Ｄ．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質の免疫的反応性 １．ウエスタンブロットによる分析 ｐＧＡＧ−１により発現された不溶性蛋白質調製物から
のアリコートを２％ドデシル硫酸ナトリウム／１００mM
Ｔｒｉｓ（pH６．８）／２０％グリセリン／１．５Ｍ
β−メルカプトエタノール中に可溶化し、そしてポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した。蛋白質をニトロ
セルロース（ＢＡ８５、シュライヒェル・アンド・シュ
エル，キーン，ＮＨ）上に電気移送し、そしてフィルタ
ーを５％ウシ血清アルブミン（シグマ）によりブロック
した。次に、フィルターをＡＩＤＳ患者からプールされ
た、Ｅ．コリ−吸着されたヒト血清によりプローブし
た。このフィルターを、ＨＲＰ−接合ヤギαＨｕＩｇに
より発色せしめた。このプールは両ｔｒｐ−ｇａｇ融合
蛋白質と反応性であるがｔｒｐＥ蛋白質のみとは反応性
でなかった。 【００８４】２．ＥＬＩＳＡによる分析 カラム精製されたＧＡＧ−２及びＧＡＧ−３蛋白質を
０．０５Ｍ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH９．６）中に
最終濃度がそれぞれ０．３μｇ／ml及び３．４μｇ／ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り５０μｌの
アリコートを負荷し、そして４℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをＢＬＯＴＴＯ（５ｗ／ｖ％脱脂粉
乳／０．０１％チメロソル／０．０１％アンチホーム
Ａ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、pH７．２／０．１５
Ｍ塩化ナトリウム）により１時間室温にてブロックし
た。血清を、ＢＬＯＴＴＯ及びＰＢＳ（０．０１Ｍリン
酸ナトリウム、pH７．３／０．１５Ｍ ＮａＣｌ）の
１：１混合物により１：１００稀釈し、そしてウエル当
り５０μｌの稀釈された血清を加えて３７℃にて１時間
置いた。 【００８５】血清を除去し、そしてプレートを３回洗浄
緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５ｗ／ｖ％トゥ
イーン２０）中で３回洗浄した後、１００μｌのヤギ抗
−ヒトＩｇＧ／ホースラディッシュパーオキシダーゼ接
合体（５０％ストックを、５０mMクエン酸ナトリウム／
０．０５％トゥイーン２０／１％熱失活した正常ヤギ血
清、アンチボディーズ社，デービス，ＣＡから入手した
ものに１：１０，０００稀釈したもの）を加えて３７℃
にて１時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを
０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０５（ｗ／ｖ）％トゥイー
ン２０で３回洗浄した。１００μｌ／ウエルの基質溶液
（５０mlの０．０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０中
１０mg ３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
ン）を加えて３０分間室温に置くことによりＥＬＩＳＡ
を発色せしめた。１００μｌ／ウエルの３Ｎ Ｈ2 ＳＯ
4 により反応を停止し、そして４５０nmにおける光学濃
度を自動ＥＬＩＳＡリーダーにより決定した。ｐＧＡＧ
−１により生産された蛋白質は既知の血清反応陽性の血
清のパネルと反応性であることが見出された。 【００８６】パネルはＬＡＶに対する血清反応陽性２４
１及びＬＡＶに対する血清反応陰性２７１（ウイルスを
基礎ＥＬＩＳＡにより定義されたもの）を含んだ。これ
らの血清は放射性標識されたＬＡＶ抗原の免疫沈澱によ
り確認されていた。表３は、陽性及び陰性血清サンプル
の両者が高及び低危険群の両者の個体から導かれること
を示している。ｐＧＡＧ１に反応する抗体は、程度は異
るが、すべての診断群に見出された。なお、ｐＧＡＧ１
に対する反応性は、健康であるか又はＡＩＤＳへの進行
の初期段階（例えば、ＰＧＬ又は永続的な一般化された
リンパ腺症）の個体に比べ、より少数の個体において見
出された。これは、ＬＡＶへの暴露の後早期にコアー蛋
白質に対する反応性を示すが疾患の進行に従ってコアー
蛋白質への反応性の喪失を示す報告と一致する。図９
は、すべての血清サンプルから得られた光学濃度のヒス
トグラムである。 【００８７】ｐＧＡＧ１の抗原としての有用性を小測定
においてＥＬＩＳＡによりさらに試験した。この方法に
おいては、ｅｎｖ組換蛋白質であるｐＥＮＶ３に対して
弱い反応性を示すか又は非反応性である血清をｐＧＡＧ
１との反応性について試験した。ｐＥＮＶ３及びｐＧＡ
Ｇ１のそれぞれ単独、並びに組合わせに対して試験され
た８個の陽性血清及び４個の陰性血清について、ＥＬＩ
ＳＡ値を表４に示す。これらの血清の内３種（１４−０
０８５，０７−３９１５、及び１４−０１００）はいず
れもｐＥＮＶ３に対して非反応性であるか又は弱く反応
するが、しかしウイルス及びｐＧＡＧ１に対して非常に
反応性であった。 【００８８】ウイルスに弱く反応する２種類の血清（０
８−００３０及び１０−００５６）はｐＥＮＶ３のみ又
はｐＧＡＧ１のみと非常に弱い反応性を有した。しかし
ながら、この両組換体との反応は、血清反応陰性対照か
らより容易に区別できる陽性ＥＬＩＳＡ値を与えた。こ
れらの結果は、ｐＧＡＧ１はｐＥＮＶ３に対して低い反
応性を有する陽性の血清を検出するのに有用であるこ
と、及びｐＧＡＧ１とｐＥＮＶ３との組合わせが、血清
反応陽性個体と血清反応陰性個体との間の識別において
いずれか一方より効果的であることを示している。 【００８９】 【表３】 【００９０】３．ＬＡＶに対する血清抗体の検出のため
に蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中ＦＩＴＣ−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【００９１】他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中ＦＩＴＣ−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【００９２】４．ｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質及びｔｒｐ−ｅ
ｎｖ蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でｔｒｐ−ｇａｇ蛋白質をｔｒ
ｐ−ｅｎｖ蛋白質と混合した。次に、ＧＡＧ−１又はＥ
ＮＶ−３のみについて前記したのと同様にしてＥＬＩＳ
Ａを行った。表４は、ＧＡＧ−１とＥＮＶ−３との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。蛋
白質を組み合わせた場合血清反応陽性サンプルの内７／
７が検出され、他方ＧＡＧ−１又はＥＮＶ−３のみによ
り検出した場合、６／７が検出された。 【００９３】 【表４】 【００９４】以上の記載から、この発明の特定の具体例
を説明のために記載したが、この発明の本質及び範囲を
逸脱することなく種々の変更を行うことができることが
予想されよう。従って、この発明は添付された請求の範
囲によるほか限定されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、λＪ１９からのｐＳＳ−５及びｐＢＳ
−５の造成を示す。 【図２】図２は、ポリリンカー配列を含有するｔｒｐＥ
発現ベクターｐＪＨ１２及びｐＪＨ１４を示す。 【図３】図３は、ｐＧＡＧ−２及びｐＧＡＧ−３中のＬ
ＡＶ挿入部の由来を示す。 【図４】図４は、ｐＪＨ１２及びｐＳＭ００２からのｐ
ＧＡＧ−２の造成を示す。 【図５】図５は、ｐＪＨ１４及びｐＢＰＢ１４からのｐ
ＧＡＧ−３の造成を示す。 【図６】図６は、ｔｒｐＥ発現ベクターｐＡＴＨ１０を
示し、ポリリンカー領域中の開裂部位のリーディングフ
レームを含む。 【図７】図７は、ｐＧＡＧ１中ＬＡＶ挿入部の由来を示
す。 【図８】図８は、ｐＢＳ−５，ｐＵＣ１８及びｐＡＴＨ
１０からのｐＧＡＧ１の造成を示す。 【図９】図９は、血清サンプルから得られた光学濃度値
のヒストグラムである。
−５の造成を示す。 【図２】図２は、ポリリンカー配列を含有するｔｒｐＥ
発現ベクターｐＪＨ１２及びｐＪＨ１４を示す。 【図３】図３は、ｐＧＡＧ−２及びｐＧＡＧ−３中のＬ
ＡＶ挿入部の由来を示す。 【図４】図４は、ｐＪＨ１２及びｐＳＭ００２からのｐ
ＧＡＧ−２の造成を示す。 【図５】図５は、ｐＪＨ１４及びｐＢＰＢ１４からのｐ
ＧＡＧ−３の造成を示す。 【図６】図６は、ｔｒｐＥ発現ベクターｐＡＴＨ１０を
示し、ポリリンカー領域中の開裂部位のリーディングフ
レームを含む。 【図７】図７は、ｐＧＡＧ１中ＬＡＶ挿入部の由来を示
す。 【図８】図８は、ｐＢＳ−５，ｐＵＣ１８及びｐＡＴＨ
１０からのｐＧＡＧ１の造成を示す。 【図９】図９は、血清サンプルから得られた光学濃度値
のヒストグラムである。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(31)優先権主張番号 ８２８８２８
(32)優先日 昭和61年２月12日(1986．2．12)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(72)発明者 コサンド，ウェスレイ
アメリカ合衆国，ワシントン 98011,
ボーテル，ノースイースト ワンハンド
レッドフィフティセカンド ストリート
9022
(72)発明者 マクアードル，スーザン
アメリカ合衆国，ワシントン 98105,
シアトル，エヌ．イー．アパートメント
ディー．，フォース アベニュ 3911
(72)発明者 トラビス，ブルース，マクファーランド
アメリカ合衆国，ワシントン 98115,
シアトル，トゥエンティーナインス ア
ベニュ ノースイースト 6029
(72)発明者 ワード，パメラ，ジューン
アメリカ合衆国，ワシントン 98121,
シアトル，ファースト アベニュ 3005
(56)参考文献 特開 昭64−63392（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １． LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチド。 ２． bp631-bp1224(pGAG-2)によりコードされている請
求項１に記載のポリペプチド。 ３． bp375-bp961(pGAG-1）によりコードされている請
求項１に記載のポリペプチド。 ４． bp691-bp1642(pGAG-3)によりコードされている請
求項１に記載のポリペプチド。 ５． LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドの
製造方法において、上記ポリペプチドをコードする DNA
及び発現制御配列を含んで成る発現ベクターにより形質
転換された宿主細胞を培養し、該培養物から前記ポリペ
プチドを単離する、ことを特徴とする方法。 ６．前記ポリペプチドを単離した後、該生成物をゲル浸
透クロマトグラフィーによりさらに精製することを含ん
で成る請求項５に記載の方法。 ７．前記制御配列が trpオペロンに由来する請求項５又
は６に記載の方法。 ８． LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドを
含んで成る、 LAV／HTLV-IIIに対する抗体の生物学的液
体中での存在を決定するための測定において使用するた
めの試薬。 ９． LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドを
含んで成る、生物学的液体中での LAV／HTLV-III抗体の
存在を決定するための測定において使用するための試
薬。 １０． LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-
bp1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ
LAVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチド
を含んで成る、 LAV／HTLV-IIIに対する抗体の製造にお
いて使用するための免疫原。 １１． LAV／HTLV-IIIに対する抗体の生物学的液体中
での存在を決定するための、２種類以上の蛋白質を含ん
で成る蛋白質組成物において、その少なくとも１つが、
LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp1224、
又はbp691-bp1642によりコードされており且つ LAVに対
する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドであるこ
とを特徴とする組成物。 １２．生物学的液体中での LAV／HTLV-III抗原の存在を
決定するための測定において使用するための２種類以上
の蛋白質を含んで成る蛋白質組成物において、その少な
くとも１つが、 LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、
bp631-bp1224、又はbp691-bp1642によりコードされてお
り且つ LAVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペ
プチドであることを特徴とする組成物。
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