JP3095219B2 - LAVに対する抗体と反応性であるgagによりコードされたペプチド及びその使用 - Google Patents
LAVに対する抗体と反応性であるgagによりコードされたペプチド及びその使用Info
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【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】この発明は一般に、組換技法
により製造されるウイルス蛋白質に関し、そしてさらに
詳しくはリンパ腺症関連ウイルス(LAL)に対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質に関する。 【0002】 【従来の技術】後天性免疫不全症候群(AIDS)は日
和見感染及び若干のまれな悪性腫瘍により特徴付けられ
る細胞性免疫の伝染性疾患である。AIDSについての
主たる危険群には同性愛の男性、静脈投与剤の乱用者、
輸注剤及び血液製剤の受容者、並びに高危険個体の異性
パートナー及び子供が含まれ、密接な接触及び血液製剤
を介して伝達される感染体の関与が示唆される。 【0003】最近の証明によれば、疾患の伝染を担当す
る感染体はリンパ腺症関連ウイルス(LAL)として知
られる新しいリンパ趨向性レトロウイルスである〔Barr
e-Sinoussi等、 Science 220:868(198
3)〕。他の科学者グループによって類似のウイルスが
報告されており〔 Popovic等、 Science 224:49
7(1984);Levy等、 Science 225:840
(1984);Vilmer等、Lancet 1:753(198
3)〕、そしてヒトT−細胞リンパ趨向性ウイルスタイ
プ III(HTLV−III )、AIDS関連レトロウイル
ス(ARV)、又は免疫不全関連ウイルス(IDAV)
と命名されている。 【0004】さらに最近のデーターは、LAV,HTL
V−III ,ARV、及びIDAVは、実質的なヌクレオ
チドの相同性を含む幾つかの特徴を共有し〔 Wain-Hobs
on等、Cell 40:9(1985); Muesing等,Natu
re,313:450(1985);Sanchez-Pescader
等、 Science 227:484(1985)〕、そして
同じウイルスの単離体であると考えるべきであることを
示している。但し、ウイルス単離体間の株対株変異が存
在する可能性もある。実質的なヌクレオチドの相同性を
示すことに加えて、単離体形態、細胞病理、最適逆転写
酵素活性の要求性、及び少なくとも幾つかの抗原性に関
して類似している〔Levy, 前掲; Schupbach等、 Scien
ce 224:503(1984)〕。 【0005】前記のごとく、このウイルスは血液製剤
(血液、血清、血漿、及びこれらの画分)を介して伝染
し得ることが知られており、このため、提供者がこのウ
イルスに暴露されたことがあるか否かを決定するために
血液製剤をスクリーニングすることが重要である。これ
は、LAV及び関連ウイルスに対する抗体の検出のため
のエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ(E
LISA)を含む幾つかの方法の内任意の方法により行
うことができる。LALに対する抗体を含有する血液を
有する個体は“血清反応陽性”(seropositive) である
と言われる。血清反応陽性提供者からの血液は検出の後
血液供給から除去され、こうして疾患の拡散が防止され
る。 【0006】LAVに暴露された個体の免疫反応は多様
である。p13,p18,p25,p36,gp43,
p55,gp110等を含む幾つかのウイルス蛋白質の
いずれに対しても抗体が生産され得る〔 Schupbach等、
N. Engl. J. Med. 312:265(1985)〕。す
べての個体が同じ蛋白質又は所与の蛋白質の同じエピト
ープに対する抗体を生産するわけではないであろう。 【0007】血清反応陽性個体の検出は、最近行われて
いる所では、幾つかの本質的な問題点を有する。これら
の問題点の内主要な点は、免疫的測定のために全体ウイ
ルスから抗原を単離する必要があることである。この単
離は、潜在的に感染性の生ウイルスの大量操作を必要と
し、そしてこのこと自体かなり安全性を脅やかす。さら
に、調製ごとにウイルスの収量、純度及び再現性に関す
る懸念が存在する。このことが許容されない数の偽陽性
及び/又は偽陰性をもたらす。従って、血液のスクリー
ニング測定において有用でありそして他の関連する利点
をさらにもたらすウイルス抗原を製造するための他の方
法が当業界において求められる。 【0008】 【発明の開示】要約すれば、この発明は、LAVゲノム
の群特異的抗原(gag)領域の部分、すなわちLAV
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成るDNA配列を開示する。細菌宿主中で複
製することができる組換プラスミドも開示される。この
プラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シグ
ナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに続
く前記のDNA配列を含有する。好ましい態様において
は、シグナルは誘導性及び/又は抑制性であるtrpオ
ペロンのごときオペロンから選択される。上記の組換プ
ラスミドにより形質転換された、E.コリ(E. coli )
のごとき細菌の細胞も開示される。 【0009】この発明の他の観点は、LAVに対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質の製造方法を開示す
る。この方法は、細菌宿主細胞中で複製可能な組換プラ
スミドを細菌宿主細胞に導入することを含んで成る。こ
のプラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シ
グナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに
続くLAVゲノムのgag領域の部分、すなわちLAV
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成る。プラスミドの導入に続き細菌宿主を適
当な培地中で増殖せしめる。次に蛋白質の発現を誘導
し、そしてその配列の蛋白質生成物を細菌宿主から単離
する。単離に続き、蛋白質生成物を、例えばゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより精製する。 【0010】この発明の他の観点は、LAVに対する抗
体の生物学的流体中での存在を検出する方法を開示す
る。この方法は、生物学的流体を、前記の組換プラスミ
ドにより形質転換された細菌細胞により生産された蛋白
質と共にインキュベートし、これによって反応混合物を
形成し、そして次にこの反応混合物を分析して抗体の存
在を決定することを含んで成る。好ましい態様において
は、反応混合物を分析する段階は、反応混合物を抗体に
対するラベルされた特異的結合パートナーと接触せしめ
ることを含んで成る。 【0011】この発明の他の観点は、生物学的流体中の
LAL抗原の存在を決定するための方法を開示し、この
方法は生物学的流体を、前記の組換プラスミドにより形
質転換された細菌細胞により生産された標識化蛋白質と
共にインキュベートし、そしてこれに続いて又はこれと
同時に該蛋白質に対する抗体と共にインキュベートして
特異的結合を生じさせる。次に、インキュベーションの
間に形成された反応混合物を分析して抗体と結合した標
識の量を決定する。前記の組換プラスミドにより形質転
換された細菌細胞により生産された蛋白質により動物を
免疫感作することを含んで成る、LAVに対する抗体の
製造方法も開示される。 【0012】この発明の他の観点は、LAVに対する抗
体の生物学的流体中での存在を決定するための方法を開
示し、この方法は、細菌宿主細胞中で複製することがで
きそして発現のための原核性の転写及び翻訳シグナルを
含有する組換プラスミドにより形質転換された細菌細胞
により生産された蛋白質にラテックスビーズを接合せし
めることを含んで成る。前記シグナルに続き、LAV遺
伝子のgag領域の部分、すなわちLAVに対する抗体
と免疫的に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成
るDNA配列が存在する。次に、生物学的流体をビーズ
/蛋白質接合体と共にインキュベートし、これによって
反応混合物を形成する。次に、この反応混合物を分析し
て抗体の存在を決定する。 【0013】この発明において製造される蛋白質は、適
当な担体又は稀釈剤と共に使用される場合、免疫的に有
効なワクチン組成物を構成する。LAVゲノムのgag
領域の部分を含んで成るDNA配列によりコードされた
蛋白質の免疫的有効量を医薬として許容される担体と共
に個体に投与することにより、AIDSの原因となるウ
イルスにより惹起される感染が回避され得る。 【0014】 【発明の実施の形態】発明を記載するに先立ち、以下に
使用される幾つかの用語の定義を記載するのが発明の理
解のために有用であろう。リンパ腺症関連ウイルス(LAV) :ヒトT−リンパ趨
向性レトロウイルス。 この発明の目的のため、ウイルスが下記の規準を実質的
に満たす場合、それをLAVと同一であるか又は同等の
ものと考える。 【0015】(a)T−リンパ球、特にT−ヘルパー細
胞〔CD4+ 、 Bernard等編、Leucocyte Typing, ニュ
ーヨーク,スプリンガーベルラーク(1984)中に定
義された国際命名法に従う〕に対して向性である; (b)このウイルスは感染されたCD4+ 細胞に対して
細胞変性的(cytopathic) である(HTLV−I及びII
のように形質転換的ではなく); (c)このウイルスは、Mg2+−依存性であり(最適濃
度5mM、最適pH7.8、アクチノマイシンDにより阻害
される)そしてオリゴ(dT)12-18 をプライマーとし
てその3′LTRからの逆転写のために使用することが
できるRNA−依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵
素)をコードする; (d)このウイルスは、シュークロース勾配中で約1.
16の密度においてバンドを形成する; 【0016】(f)このウイルスは、免疫学的規準及び
ヌクレオチド配列規準によりHTLV−I/IIファミリ
ーのウイルスから区別される(この規準によりHTLV
−III はHTLV−I/IIファミリーの一員であるとは
考えられない); (g)このウイルスは、LAVのgag及びenv領域
によりコードされた蛋白質と免疫学的に実質的に交差反
応する;そして、 (h)このウイルスは、LAVと実質的なヌクレオチド
配列の相同性(75〜100%)及びアミノ酸配列の相
同性(75〜100%)を有する。免疫的に反応性 :抗原及び抗体が相互に特異的に、典型
的には106 M-1以上、そしてしばしば108 M-1以上
の親和性をもって、結合することができる場合、これら
は“免疫的に反応性である”と言われる。 【0017】形質転換、又は形質転換された:精製され
たDNAの導入により受容細胞又は微生物の遺伝子型を
安定に且つ遺伝的に変更する過程。 リンパ腺症関連ウイルス(LAV)はAIDS又はリン
パ腺症の症状を有する患者から単離することができる。
このような患者のリンパ腺を典型的には生検採取し、そ
して必要により増殖を支持するように補充された培地に
入れる。インターロイキン−2(IL−2)又はフィト
ヘマグルチニン(PHA)のごときマイトジエンを含有
せしめることができ、ヒト−インターフェロンに対する
抗血清を含めることもできる。逆転写酵素活性は典型的
には約15日の培養で表われ、ウイルスの存在が示され
る。非イオン性洗浄を用い、次にシュークロース勾配中
でバンド化することによってウイルスを濃縮することが
できる。これらの精製法及び他の精製法は当業者におい
て良く知られており、例えばMontehro等、 J. Virology
42:1029(1982)に記載されている。 【0018】LAVは多くの方法のいずれかにより増殖
し得る。これはへその緒、末梢血又は骨髄由来のT−リ
ンパ球中で培養することができる。別の方法として、こ
れは不滅化されたT−細胞又はB−細胞中で増殖するこ
とができる。例えば、 Popovic等、 Science 224:
497(1984);及びMontagnier等、 Science22
5:63(1984)を参照のこと。ウイルスの増殖は
通常逆転写酵素活性の存在によりモニターされる。LA
Vのゲノムクローンは当業界においてよく知られている
幾つかの方法のいずれかにより調製することができ、こ
れらの方法にはHahn等、Nature 312:166(19
84);Alizon等、Nature 312:757(198
4); Lucin等、Nature 312:760(198
4);及び Muesing等、Nature 313:450(19
85)により記載された方法が含まれるが、これらに限
定されない。 【0019】要約すれば、これらの方法の1つ(Alizon
等)においては健康な提供者のT−細胞にLAVを感染
させたものからDNAを単離し、HindIII のごとき
制限酵素により部分消化し、そして得られた消化物を電
気泳動的に分画する。完全なLVAゲノム(約9.2K
b) のサイズに相当するサイズの断片をゲルから溶出
し、沈澱せしめ、再懸濁し、そして適切に制限酵素処理
されたベクターのアームに連結する。連結混合物をバク
テリオファージ粒子にパッケージする。 【0020】このバクテリオファージにより細胞を形質
転換し、そしてクローンをその場でLAV挿入部につい
て、適当なプローブ(例えば、LAV−RNAから調製
されたcDNA)を用いてスクリーニングする。陽性ク
ローンから、LAVの所望の領域を細菌プラスミドベク
ター、例えばpUC18にサブクローニングすることが
できる。不所望の配列を除去し、そして発現ベクターへ
のクローニングを促進する目的でいずれかの末端に追加
の制限部位(ポリリンカーの形で)を加えるためさらに
サブクローニングするのが好ましい場合がある。 【0021】次に、LAV配列を誘導性の発現ベクター
にサブクローニングすることができる。種々の発現ベク
ターが当業界において知られており、そしてλgt1
1:Tn〔Hall等、Nature 311:379(198
4);trpE(Eur. J. CellBiol. 31:171
(1983);pIN III( Masui等、 Biotechnolog
y, 1984年1月、81頁)を含む。 【0022】得られた蛋白質は部分的に精製することが
でき、そして免疫源として及びイムノアッセイにおける
抗原としての使用を含む種々の目的のために使用するこ
とができる。免疫源としての使用のためには、蛋白質を
緩衝液中又はアジュバント中で、動物、例えばマウス、
ラビット、ヤギ等に注射することができる。他の方法と
して、蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製し、そして注目のバンドをゲルから切り出し、すり
つぶし、そして宿主動物に注射するために緩衝液中に再
懸濁することができる。ポリクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体を調製することができる。 【0023】イムノアッセイにおける抗原として使用す
るため、蛋白質をラベル化形又は非ラベル化形のいずれ
かとして使用することができる。これらが標識される場
合、ラベルは放射性同位元素、蛍光物質、酵素、発酵
剤、粒子等を包含することができる。これらの標識及び
他の標識が当業界においてよく知られており、そして例
えば米国特許出願 No.3,766,162、 No.3,7
91,932、 No.3,817,837、 No.3,99
6,345、及び No.4,233,402に記載されて
いる。この発明の組換蛋白質を用いる測定法は不均一法
(すなわち、分離段階を必要とする)、又は均一法であ
ることができる。測定法が不均一法である場合、遠心分
離、濾過、クロマトグラフィー、又は磁気を含む種々の
分離手段を用いることができる。 【0024】抗体の存在について血液製剤又は他の生理
的流体をスクリーニングするための1つの好ましい測定
法はELISAである。典型的には、抗体(この場合、
組換蛋白質の1つ又はその組み合わせ)をミクロタイタ
ーウエルの表面に吸着せしめる。次に、表面上の残留蛋
白質結合部位を適当な薬剤、例えばウシ血清アルブミン
(BSA)、熱不活性化正常ヤギ血清(NGS)、又は
BLOTTO(防腐剤塩及び消泡剤をさらに含有する脱
脂粉乳の緩衝化溶液)によりブロックする。次に、ウエ
ルを、特異抗体を含有すると予想されるサンプルと共に
インキュベートする。サンプルはそのまま適用すること
ができ、又は一層しばしば、通常少量の(0.1〜5.
0重量%)の蛋白質、例えばBSA,NGS又はBLO
TTOを含有する緩衝化溶液中に稀釈することができ
る。 【0025】特異的結合が起こるのに十分な時間インキ
ュベートした後、ウエルを洗浄して未結合の蛋白質を除
去し、そして次に標識された抗−ヒト免疫グロブリン
(αHuIg)と共にインキュベートする。この標識
は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)、
β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及
びグルコースオキシダーゼを包含する種々の酵素から選
択することができる。特異的結合が生ずるのに十分な時
間の後、ウエルを再び洗浄して未結合の接合体を除去
し、そして酵素のための基質を加える。発色させ、そし
てウエルの内容物の光学濃度を視覚的に、又は装置を用
いて決定する。 【0026】便利のため、ELISA用試薬はキットの
形で供給される。これらのキットは、組換技法によって
作られたウイルス蛋白質が前吸着されるミクロタイター
プレート、種々の稀釈剤及び緩衝剤、特異的に結合した
抗体を検出するための標識された接合体、及び他のシグ
ナル発生試薬、例えば酵素基質、コ−ファクター及び色
原体を含むことができる。 【0027】LAVに感染された個体は、p13,p1
8,p25,p36,gp43,p55,gp110等
を含む多数のLAV蛋白質に対する抗体を含有する。す
べての個体が同じ蛋白質に対する抗体を生産するわけで
はないが、個々の血清は最も一貫してgag蛋白質p2
5及びp18,並びにenv蛋白質gp43及びgp1
10と反応性である。個体間の差異は疾患の進行程度を
含む種々の因子による。例えば、コア蛋白質に対する抗
体は疾患の最も早期には支配的であるが、しかし免疫抑
制の進行と共に減少する。これに対して、エンベロープ
糖蛋白質に対する抗体力価は疾患の後期を通じて持続す
ると考えられる。 【0028】応答における他の差異はウイルス蛋白質を
コードする遺伝子中の多型性(ポリモルフィズム)に基
くであろう。LAVの異る単離体はenv蛋白質の有意
な変化を有する。興味あることには、gag蛋白質配列
は高度に保存されている。試験されたすべての血清反応
陽性サンプルにおいて、gag蛋白質の少なくとも1つ
(p18又はp25)あるいはenv蛋白質の1つ(g
p43又はgp110)に対する抗体が見られた。しか
しながら、これらの蛋白質はいずれも血清反応陽性個体
により普遍的には認識されなかった。 【0029】従って、血液を少なくとも1つのgag及
び1つのeng蛋白質に対する抗体についてスクリーニ
ングすることが必須のようである。先行特許出願である
米国出願 No.721,237 "Expression of Immunolo
gically Reactive Viral Proteins"において、開示され
ている発明は、LAVに対する抗体と免疫的に反応性で
ある蛋白質をコードする、LAVゲノムのエンベロープ
(env)領域の部分を用いる。本発明は、やはりLA
Vに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質をコード
する、LAVゲノムのgag領域の部分を用いる。組み
合わせにおいて、gag領域によりコードされる蛋白質
及びenv領域によりコードされる蛋白質を用いて高い
感度をもって血清反応陽性個体を検出することができ
る。 【0030】この発明の組換蛋白質の他の用途はヒト用
のワクチンとしてである。組換蛋白質は高度に精製し、
そして便利な方法で、一般に宿主kg当り1μg〜20mg
の濃度で、製剤化することができる。生理的に許容され
る担体、例えば無菌水、塩溶液、緩衝化塩溶液等を使用
することができる。助剤、例えば酸化アルミニウムを使
用することもできる。ワクチンは静脈注射、皮下注射、
筋肉内注射、又は腹腔内注射により投与することができ
る。1回の注射で十分な場合もあるが、一層しばしば週
〜月間隔での多数の注射が好ましい。 【0031】別の方法として、LALゲノムの領域を発
現するワクチニアウイルス組換体を造成することができ
る。例えば、この発明の造成物をプラスミドpMM34
( Mackett等、 Science 227:433,1985)
に挿入し、そして生ずるキメラプラスミドを含有するワ
クチニアウイルスハイブリドを相同組換により形成する
ことができる。このような組換ウイルスワクチンによる
免疫感作は、肝炎Bウイルス及び水疱性口内炎ウイルス
に対する動物における保護免疫を生じさせるのに効果的
であることが示されている( Smith等、Nature 31
1:578,1984)。 【0032】この方法による組換蛋白質ワクチンの使用
は、病原性微生物の不活性化調製物又は非毒性株からワ
クチンを構成する必要性を除去する。次の例において、
LAV−gagのオーバラップする領域(図3)、並び
にp18のほとんど及びp25の部分を含むgag領域
の他の部分を発現のために選択した。この選択は、p1
8及びp25がLAVに感染した個体からの血清と最も
再現性よく反応するgag蛋白質であるという知見に影
響された。これらの配列内での本発明者等の選択は、親
水性領域及びプロテアーゼ開裂部位(この両者は蛋白質
の表面で露出され、そして免疫原的である)の存在並び
に選択されたベクター(trpE)中での効果的な発現
のためのサイズの限界により指示された。 【0033】λJ19と称するLALゲノムクローンを
細菌プラスミドベクターpUC18にサブクローン化し
た。pBT−1と称する得られるサブクローンをさらに
サブクローン化して主としてgag及びpol配列を含
有するpSS−5及びpBS−5を得た。1つの方法に
おいて(例1)、gag配列をさらにpIC19Rにサ
ブクローン化し(プラスミドpSM002及びpBPB
14が形成される)、そして次にgag配列の領域をt
rpE誘導性発現ベクターに移した。gagDNAをt
rpE遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入し、この
造成物によりE.コリを形質転換した場合にtrpE−
gag融合蛋白質の発現が得られた。生ずる蛋白質を部
分的に精製し、そして既知の血清反応陽性個体及び既知
の血清反応陰性個体からの血清とのELISAにおける
それらの反応性により特徴付けた。pGAG−2及びp
GAG−3と称する2つの有用な造成物が同定された。 【0034】他の方法において(例2)、gag配列の
部分(bp375−547)をpUC18ampにさら
にサブクローン化した(プラスミド0674−14−1
0が形成される)。次に、gag配列の第2領域(bp
505−961)をプラスミド0674−14−10に
移し、プラスミド0674−27−38を生成せしめ
た。次に、gag配列(bp347−961)をtrp
E誘導性発現ベクターpATH10に移した。gagD
NAをtrpE遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入
し、この造成物によりE.コリを形質転換した場合tr
pE−gag融合蛋白質の発現が得られた。生じた抗体
を部分的に精製し、そして既知抗体陽性個体及び既知の
抗体陰性個体からの血清とのELISAにおけるそれら
の反応性により特徴付けた。pGAG−1と称する1つ
の有用な造成物を同定した。次の例は、制限的にではな
く、例示的に与えられる。 【0035】例1. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質を発現するために幾つかの細菌発現系のいず
れかを使用することができる。trpE系をLAV−g
agの発現のために使用した。なぜなら、これは強力な
誘導性プロモーターを含有するが、しかしその発現は、
外来性の(そして潜在的に毒性の)蛋白質が長期間にわ
たって細菌内に蓄積しないように抑制され得るからであ
る。 【0036】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより限定される。例えば、
trpE発現ベクターは、DNA挿入部が対応末端にB
amHI,HindIII 、又はEcoRI制限部位を有
することを必要とする。まず注目の領域を広範囲の又は
異る配置の制限部位を有する中間体ベクターにサブクロ
ーン化することにより、一層の多様性を得ることができ
る。次に、中間体ベクターにより提供される制限部位を
用いることにより、注目の領域を発現ベクターに導入す
ることができる。 【0037】従って、本発明者等の方策は、まずLAV
ゲノムのgag領域のほとんどをトランスファーベクタ
ーpIC19Rに挿入することであった。次に、これら
のサブクローンの種々の断片を、ポリリンカー領域中の
制限部位のリーディングフレームにおいてのみ異る(図
2)2つのtrp発現ベクター(pJH12,pJH1
4)のいずれかに連結した。 【0038】1.LAVゲノムのサブクローニング a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHindIII 部位中の9.2Kbのゲノム
DNA挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手し
た。このクローンはλJ19と称され、そして Wain-Ho
bson等、Cell 40:9(1985)に記載されてい
る。λJ19ファージ粒子をE.コリK−12のQ35
9株(Q359の遺伝子型はhsdRK- ,hadMK
+ ,supF,φ80,P2)に、Maniatis等、 Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual,ニューヨーク,
コールドスプリングハーバーラボラトリー,1982、
64頁の方法に従ってトランスフェクトした。単一プラ
ークを拾い、そしてファージをプレート・ライセート法
(Maniatis,前掲、65頁)により増幅した。 【0039】37℃にて9時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート(100mm
直径)に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO
4 /50mM Tris(pH7.5)を重層した。4℃に
て12時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで2回抽出した。 【0040】ファージ粒子を含有する得られた水相10
mlに2mlの0.25M EDTA/2.5% SDS/
0.5M Tris(pH9)を加え、そしてこの懸濁液
を70℃にて15分間インキュベートしてファージを破
壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に4℃
にて12,000×g分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH8、1M Tris(pH
8)により平衡化したもの〕により20℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム/イソアミルアル
コール(24:1)により20℃にて抽出した。次に、
水相に2.5容量の95%アルコールを加えてDNAを
沈澱せしめた。遠心した後、DNAペレットを乾燥し、
そして10mM Tris・HCl(pH7.4)/1mM
EDTA中に再懸濁した。 【0041】b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μgのλJ19DNA
を、LAVのこの単離体のLTR領域においてのみ切断
する制限酵素SstI(ベセスダ・リサーチ・ラブス,
ベセスダ,MD)により完全に消化した。この消化混合
物を、0.089M Tris−ボレート/0.089
M硼酸/1mM EDTA中0.9%アガロースを通して
1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをNA45紙に電気溶出した(Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からDNAを回収した。 【0042】9.1Kb SstI断片をSstIで消化
されたベクターpUC18に、挿入分子:ベクター分子
の比を10:1にして連結した。E.コリHB101株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のCaCl
2 法により形質転換し、そしてLB+アンピシリン(2
00μg/ml)寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、3mlのLB+アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法(Maniatis等、前掲、368頁)に
よりプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAの
制限酵素分析により決定した場合にポリリンカー中のE
coRI部位がLAVゲノムの5′末端に最も近いよう
な方法で9.1Kb SstI挿入部を含有する1つのコ
ロニーを選択した。このサブクローンはpBT−1と命
名された(ATCC#53069)(図1)。 【0043】プラスミドpBT−1から2個のサブクロ
ーンを作った。第1番目(pSS−5)のため、pBT
−1をSalIで消化し、そして再連結した。第2番目
のpBS−5のため、pBT−1をBamHI及びBg
lIIで消化し、そして再連結した。各場合において、L
AVゲノムの5′部分がベクターと共に維持された。H
B101細胞を連結されたDNAにより形質転換し、そ
してpSS−5挿入部を有するコロニー及びpBS−5
挿入部を有するコロニーを、精製されたプラスミドDN
Aの制限分析により同定した。 【0044】次に、pSS−5及びpBS−5の領域を
中間体ベクターpIC19Rにサブクローン化した。上
記のように、これは、発現ベクターへの移行のための正
しいリーディングフレーム内に必要な制限部位を与え
る。詳しくは、pBS−5のHindIII 断片(LAV
ゲノムのbp631−bp1258;番号は Wain-Hobs
on等、Cell 40:9(1985)を、HindIII 及
びウシ腸ホスファターゼ処理されたpIC19Rに連結
した(図4)。連結されたDNAをCaCl2 −ショッ
クを受けたE.コリTB−1により取り込ませた。色原
体基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドール−β−
ガラクトシッド(シグマ)を用いて、アンピシリン耐性
コロニーを、gag配列の挿入によるβ−ガラクトシダ
ーゼの不活性化についてスクリーニングした。挿入部の
方向はプラスミドDNAをPvoIIで消化することによ
り決定した。生ずるプラスミドをpSM002と称す
る。 【0045】PvuII−BglII断片(LAV遺伝子の
bp691〜bp1642)を、SmaI及びBglII
で消化したpIC19Rに連結した(図5)。連結され
たDNAによりE.コリHB101を処理し、そして生
じたアンピシリン耐性コロニーを上記の色原体によりス
クリーニングした。候補コロニーを、プラスミドDNA
の制限分析によりさらにスクリーニングした。生じたプ
ラスミドをpBPB14と称する。 【0046】2.gag配列のtrpベクターへの挿入 発現ベクターは、pBR322に挿入されたE.コリt
rpオペロンプロモーター、オペレーター及びtrpE
遺伝子を含有する(図2)。trpE遺伝子を最もその
5′に近いBglII部位においてポリリンカー配列の挿
入により切断した〔 Konopka等、J. Virol. 51:22
3(1984)〕。異るtrpベクター(pJH12及
びpJH14)はポリリンカー領域内の制限部位のリー
ディングフレームに従って異る。適切なベクターへのオ
ープンリーディングフレームの挿入はアミノ末端におけ
るtrpE配列との融合蛋白質をもたらす〔Spindler
等、J. Virol. 49:132(1984)〕。 【0047】pGAG−2(ATCC#53111)は
HindIII gagサブクローン(pSM002、図
4)をBglII及びBamHIで消化することにより造
成した。BglII及びBamHI部位はpIC119R
の包囲するポリリンカー領域内に位置する。gag断片
をゲル精製し、そしてBamHIで消化されたpJH1
2に連結した(図4)。連結されたDNAをCaCl2
ショックE.コリHB101に取り込ませ、そしてコロ
ニーをアンピシリン(100μg/ml)及びトリプトフ
ァン(40μg/ml)の存在下で増殖せしめた。その蓄
積が細菌にとって不都合である外来蛋白質の発現を抑制
するためにトリプトファンを使用した。候補アンピシリ
ン耐性コロニーを放射能標識されたgagDNAプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより同定した。少量溶
菌物(ミニライセート)の制限分析を用いて挿入部の存
在及び方向を確認した。 【0048】pGAG−3(ATCC53112)を、
図5に示すように、PVUII(bp691)及びBgl
II(bp1642)の間のgag領域を含有するpBP
B14のEcoRI消化により造成した。EcoRI部
位はgag配列を囲むポリリンカー配列内に存在する。
gag断片をゲル精製し、そしてEcoRI及びウシ腸
ホスファターゼで処理したpJH14に連結した。E.
コリHB101細胞を、連結されたDNAにより形質転
換し、前記のようにしてプレートし、そして制限分析に
よりスクリーニングしてpJH14中のgag配列の存
在及び方向を確認した。 【0049】B.蛋白質の発現 1.trp−gag造成物によるE.コリの形質転換 組換trp−gag発現プラスミドのそれぞれをE.コ
リHB101からE.コリC600に移した。後者が蛋
白質の生産のために一層良好な宿主だからである。移行
は、HB101の少量溶菌物からのスーパーコイルDN
AによりCaCl2 −ショックC600を形質転換する
ことにより行った。細菌を前記のようにアンピシリン及
びトリプトファンの存在下でプレートした〔 Konopka
等、J. Virol. 51:223(1984)〕。薬剤耐性
コロニーを少量溶菌物によりスクリーニングし、適切な
プラスミドの存在を確認した。 【0050】2.trp−gag蛋白質の発現 trp 発現ベクターにより形質転換されたE.コリC6
00の増殖及び誘導は記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. 49:132(1984); Konop
ka等、J. Virol. 51:223(1984)〕。要約す
れば、トリプトファン(40μg/ml)及びアンピシリ
ン(100μg/ml)を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら37℃にて一夜培養せしめた。次
に、この一夜培養物を、アンピシリン(100μg/m
l)を含有するがしかしトリプトファンを含有しない新
鮮な最少培地に1:100で接種した。 【0051】これらの培養物を通気しながら2〜3時間
(対数期初期まで)37℃にて増殖せしめた。誘導剤3
−β−インドール酢酸(シグマ)を、95%エタノール
中20mg/mlの新たに調製したストックから、最終濃度
が20μg/mlとなるように加えた。誘導された培養物
を37℃にて通気しながら4〜5時間増殖せしめ、そし
て次にペレット化し、そして場合によっては凍結した。
pGAG−2及びpGAG3からの蛋白質収量は典型的
には10〜30mg/lであった。 【0052】C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.51:223(1984)〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物l当り100mlの
50mM Tris(pH7.5)/0.5mM EDTA/
150mM NaCl(TNE)中に再懸濁した。リゾチ
ーム(シグマ)を1mg/mlの最終濃度に加えた。0℃に
て15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が0.0
5%〜0.2%となるように0℃にて10分間にわたっ
て加えた。 【0053】次に、1〜2mgのDNアーゼ(シグマ)を
150mlのDNアーゼ緩衝液(1.5M NaCl/1
2mM MgCl2 )と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、8000×g、0℃にて15分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをTNE中で2回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【0054】別の方法として、約200mlからの細胞ペ
レットを180μlの0.14MTris HCl(pH
7.8)/6% SDS及び20μlのβ−メルカプト
エタノール中に再懸濁し、そして95℃〜100℃にて
20分間加熱することにより、不溶性ペレットを変性
し、そして還元した。次にサンプルをスピード・バク・
コンセントレーター(サーバントインストルメンツ,ヒ
ックスビル,NY)中で乾燥した。SDSを除去した
後、サンプルを次のようにして抽出した。ペレットを1
mlのアセトン/トリエチルアミン/酢酸/水(17/1
/1/1)中に再懸濁し、そして激しく渦動し、懸濁液
を氷上で1時間冷却し、濃縮し、そして上清を廃棄し
た。この抽出を0.4mlの前記アセトン混合物を用いて
2回、そして次に0.4mlのアセトンのみを用いて2回
反復した。次に、ペレットをスピード・バク・コンセン
トレーター中で乾燥した。 【0055】次に、この蛋白質ペレットを1.4mlの6
Mグアニジンヒドロクロリド/0.1M Tris−H
Cl(pH8.5)/10mM DTT中に溶解し、そして
37℃にて4時間インキュベートした。遠心によりすべ
ての粒状物を除去した。上清に含有されるサンプルを、
6Mグアニジンヒドロクロリド/10mM EDTA/1
mM DTT中で平衡化された1.6×96cmセファクリ
ルS−300カラム(ファルマシア,ピスカトウェイ,
NJ)に負荷した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、そし
て溶出した物質の吸光を280nmにて測定した。画分を
ELISAにより、LAV血清陽性の血清及びE.コリ
血清陽性の血清を用いて測定してそれぞれ特異的反応性
及び汚染による反応性を決定した。前者の血清とは反応
性を示すが後者の血清とは反応性を示さない画分を使用
して次に患者のELISAを行った。 【0056】D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−2及びpGAG−3により発現された不溶性
蛋白質調製物からのアリコートを2%ドデシル硫酸ナト
リウム/100mM Tris(pH6.8)/20%グリ
セリン/1.5M β−メルカプトエタノール中に可溶
化し、そしてポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し
た。蛋白質をニトロセルロース(BA85、シュライヒ
ェル・アンド・シュエル,キーン,NH)上に電気移送
し、そしてフィルターを5%ウシ血清アルブミン(シグ
マ)によりブロックした。次に、フィルターをAIDS
患者からプールされた、E.コリ−吸着されたヒト血清
によりプローブした。このフィルターを、HRP−接合
ヤギαHuIgにより発色せしめた。このプールは両t
rp−gag融合蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白
質のみとは反応性でなかった。 【0057】2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−2及びGAG−3蛋白質を
0.05M炭酸塩/炭酸水素塩緩衝液(pH9.6)中に
最終濃度がそれぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り50μlの
アリコートを負荷し、そして4℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをBLOTTO(5w/v%脱脂粉
乳/0.01%チメロソル/0.01%アンチホーム
A、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15
M塩化ナトリウム)により1時間室温にてブロックし
た。 【0058】血清を、BLOTTO及びPBS(0.0
1Mリン酸ナトリウム、pH7.3/0.15M NaC
l)の1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウ
エル当り50μlの稀釈された血清を加えて37℃にて
1時間置いた。血清を除去し、そしてプレートを3回洗
浄緩衝液(0.15M NaCl/0.05w/v%ト
ゥイーン20)中で3回洗浄した後、100μlのヤギ
抗−ヒトIgG/ホースラディッシュパーオキシダーゼ
接合体(50%ストックを、50mMクエン酸ナトリウム
/0.05%トゥイーン20/1%熱失活した正常ヤギ
血清、アンチボディーズ社,デービス,CAから入手し
たものに1:10,000稀釈したもの)を加えて37
℃にて1時間置いた。 【0059】接合体を除去し、そしてプレートを0.1
5M NaCl/0.05(w/v)%トゥイーン20
で3回洗浄した。100μl/ウエルの基質溶液(50
mlの0.05Mクエン酸ナトリウム、pH7.0中10mg
3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン)を加
えて30分間室温に置くことによりELISAを発色せ
しめた。100μl/ウエルの3N H2 SO4 により
反応を停止し、そして450nmにおける光学濃度を自動
ELISAリーダーにより決定した。pGAG−2及び
pGAG−3により生産された蛋白質はいずれも既知の
血清反応陽性の血清のパネルと反応性であることが見出
された。 【0060】パネルは、2人の健康な異性愛者、LAS
(リンパ腺症の症状)及び/又は同性愛者と診断された
5個体、AIDSを有する1個体、及びAIDS患者か
らの血清のプールを包含した。AIDS,LAS及び/
又は同性愛個体からのすべての血清が、全体ウイルスE
LISAにおいて、及びLAV抗原の放射性ラベル化免
疫沈澱により血清反応陽性であるとして確認された。こ
れらの血清からの結果を表1に示す。これらの知見は、
LAV抗原に対して反応性の血清は本発明の細菌により
発現されたgag蛋白質に対しても反応性であることを
証明している。 【0061】3.LAVに対する血清抗体の検出のため
の蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質/ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質/ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【0062】他の方法として、蛋白質/ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中FITC−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【0063】 【表1】 【0064】4.trp−gag蛋白質及びtrp−e
nv蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtr
p−env蛋白質と混合した。次に、GAG−2又はG
AG−3のみについて前記したのと同様にしてELIS
Aを行った。表2は、GAG−3とENV−3との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。 【0065】 【表2】 【0066】例2. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質の発現のために幾つかの細菌発現ベクターの
いずれかを使用することができる。trpE系をLAV
−gag配列の発現のために選択した。なぜなら、これ
は強力な誘導性プロモーターを含有するが、しかしなが
ら長期間にわたって外来(従って潜在的に毒性である)
蛋白質が細菌内に蓄積しないようにその発現が抑制され
得るからである。 【0067】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより制限される。例えば、
trpE発現ベクターpATH10は、DNA挿入部が
適合性末端にBamHI,ClaI,HindIII ,P
stI,SacI,SalI,SmaI,XbaI,X
maI、又はEcoRIを有することを必要とする。ま
ず、所望の領域を、一層広範囲及び変化した配置の制限
部位を有する中間体ベクターにまずサブクローン化する
ことにより一層の多様性を導入する。次に、注目の領域
を、中間体ベクターにより提供される制限部位を用いて
発現ベクターに導入する。 【0068】従って、方策はまず、LAVゲノムの所望
のgag領域を移送ベクターpUC18ampにサブク
ローン化することである。次に、このサブクローンのg
ag配列を、gag挿入部の発現を可能にするリーディ
ングフレーム内に適切な制限部位を有するポリリンカー
領域を含有するtrp発現ベクターpATH10に連結
する(図6)。 【0069】1.LAVゲノムのサブクローン化 a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHindIII 部位中の9.2KbゲノムD
NA挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手した。
このクローンはλJ19と称され、そして Wain-Hobson
等、Cell 40:9(1985)に記載されている。λ
J19ファージ粒子をE.コリK−12のQ359株
(Q359の遺伝子型はhsdRk- ,hadMk+ ,
supF,φ80,P2)に、Maniatis等、 Molecular
Cloning: A Laboratory Manual,ニューヨーク,コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー,1982、64
頁の方法に従ってトランスフェクトした。 【0070】単一プラークを拾い、そしてファージをプ
レート・ライセート法(Maniatis,前掲、65頁)によ
り増幅した。37℃にて9時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート(100mm
直径)に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO
4 /50mM Tris(pH7.5)を重層した。4℃に
て12時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで2回抽出した。 【0071】ファージ粒子を含有する得られた水相10
mlに2mlの0.25M EDTA/2.5% SDS/
0.5M Tris(pH9)を加え、そしてこの懸濁液
を70℃にて15分間インキュベートしてファージを破
壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に4℃
にて12,000×g分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH8、1M Tris(pH
8)により平衡化したもの〕により20℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム/イソアミルアル
コール(24:1)により20℃にて抽出した。次に、
水相に2.5容量の95%アルコールを加えてDNAを
沈澱せしめた。遠心した後、DNAペレットを乾燥し、
そして10mM Tris・HCl(pH7.4)/1mM
EDTA中に再懸濁した。 【0072】b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μgのλJ19DNA
を、LAVのこの単離体のLTR領域においてのみ切断
する制限酵素SstI(ベセスダ・リサーチ・ラブス,
ベセスダ,MD)により完全に消化した。この消化混合
物を、0.089M Tris−ボレート/0.089
M硼酸/1mM EDTA中0.9%アガロースを通して
1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをNA45紙に電気溶出した(Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からDNAを回収した。 【0073】9.1Kb SstI断片をSstIで消化
されたベクターpUC18に、挿入分子:ベクター分子
の比を10:1にして連結した。E.コリHB101株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のCaCl
2 法により形質転換し、そしてLB+アンピシリン(2
00μg/ml)寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、3mlのLB+アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法(Maniatis等、前掲、368頁)に
よりプラスミドDNAを調製した。 【0074】プラスミドDNAの制限酵素分析により決
定した場合にポリリンカー中のEcoRI部位がLAV
ゲノムの5′末端に最も近いような方法で9.1Kb S
stI挿入部を含有する1つのコロニーを選択した。こ
のサブクローンはpBT−1と命名された(ATCC#
53069)(図1)。pBT−1をBamHI及びB
glIIで消化し、そして再連結した。LAVゲノムの
5′部分がベクターと共に維持された。HB101を連
結されたDNAで形質転換し、そしてpBS−5挿入部
(図1参照のこと)を含むコロニーを、精製されたプラ
スミドDNAの制限分析により同定した。 【0075】pGAG1のgagコード配列を、trp
発現ベクターへの適当な挿入のために必要な制限部位を
与えるpUC18ampにサブクローン化した。必要な
gag配列を連結するために2つのサブクローニング段
階を必要とした。第1段階において、pBS−5をSa
u3Aで消化し、そしてbp375からbp547〔Wa
in-Hobson等、 Cell 40:9(1985)に従って番
号を付与する〕にわたる172bp断片をゲル精製し
た。この断片をBamHIで消化したpUC18amp
に連結した。この連結されたDNAをCaCl2 −ショ
ックE.コリに取り込ませ、そして生じたアンピシリン
耐性コロニーを、色原体5−ブロモ−4−クロロ−3−
インドリル−β−ガラクトシドを用いて挿入部の存在に
ついてスクリーニングした。候補コロニーをプラスミド
DNAの制限分析によりスクリーニングした。得られた
プラスミドを0674−14−10と称する。 【0076】第2段階において、0674−14−10
をAccI及びPstIにより制限酵素処理し、そして
bp505のAccIからbp961のPstI部位に
わたるpBS−5からの456bpに連結した。連結さ
れたDNAをCaCl3 ショックJM83に取り込ま
せ、そしてアンピシリン耐性コロニーをプラスミドDN
Aの制限酵素分析によりスクリーニングした。“067
4−27−38”と称する得られたプラスミドはbp3
75〜bp961のgagコード配列を含有していた
(図7参照のこと)。 【0077】2.trpベクターへのgag配列の挿入 pGAG1(ATCC#53379)を、gag配列を
囲むPstI及びEcoRIポリリンカー制限部位にお
いて0674−27−38を消化することによって造成
した。この断片をゲル精製し、そしてEcoRI及びP
stIで消化されたpATH10に連結した(図8参
照)。連結されたDNAをCaCl2 ショックE.コリ
C600に取り込ませ、そしてアンピシリン耐性コロニ
ーをプラスミドDNAの制限酵素分析によりスクリーニ
ングしてgag配列の存在を確認した。 【0078】B.蛋白質の発現 1.trp−gag蛋白質の発現 trp 発現ベクターにより形質転換されたE.コリC6
00の増殖及び誘導に記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. 49:132(1984); Konop
ka等、J. Virol. 51:223(1984)〕。要約す
れば、トリプトファン(40μg/ml)及びアンピシリ
ン(100μg/ml)を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら37℃にて一夜培養せしめた。 【0079】次に、この一夜培養物を、アンピシリン
(100μg/ml)を含有するがしかしトリプトファン
を含有しない新鮮な最少培地に1:100で接種した。
これらの培養物を通気しながら2〜3時間(対数期初期
まで)37℃にて増殖せしめた。誘導剤3−β−インド
ール酢酸(シグマ)を、95%エタノール中20mg/ml
の新たに調製したストックから、最終濃度が20μg/
mlとなるように加えた。誘導された培養物を37℃にて
通気しながら4〜5時間増殖せしめ、そして次にペレッ
ト化し、そして場合によっては凍結した。pGAG−1
からの蛋白質の収量は典型的には20〜40mg/lであ
った。 【0080】C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.51:223(1984)〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物l当り100mlの
50mM Tris(pH7.5)/0.5mM EDTA/
150mM NaCl(TNE)中に再懸濁した。リゾチ
ーム(シグマ)を1mg/mlの最終濃度に加えた。0℃に
て15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が0.0
5%〜0.2%となるように0℃にて10分間にわたっ
て加えた。 【0081】次に、1〜2mgのDNアーゼ(シグマ)を
150mlのDNアーゼ緩衝液(1.5M NaCl/1
2mM MgCl2 )と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、8000×g、0℃にて15分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをTNE中で2回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【0082】別の方法として、融合蛋白質をSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。約200
mlの細胞からの融合蛋白質を代表する約0.5mlの不溶
性ペレットを2mlの2%デオキシコレート/1M KC
lで3回洗浄し、そして次にTNEで2回洗浄した。次
に、このペレットを0.4mlの5% SDS/100mM
Tris(pH6.8)/20%グリセロール/1.4
M β−メルカプトエタノール中に渦動により再懸濁し
そして100℃にて10分間加熱した。痕跡量の不溶物
を回転除去し、そして上清を8%ポリアクリルアミドゲ
ルに負荷した。蛋白質バンドを、ゲルの縁の染色マーカ
ーレーンによりクマッシーブリリアントブルーを用いて
可視化した。融合蛋白質を含有するゲルの領域を切取
り、そして0.1% SDS/25mM Tris(pH
8.0)の緩衝液を満たした透析バッグに入れた。次
に、融合蛋白質をゲルから電気泳動溶出し、そして緩衝
液中に集めた。 【0083】D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−1により発現された不溶性蛋白質調製物から
のアリコートを2%ドデシル硫酸ナトリウム/100mM
Tris(pH6.8)/20%グリセリン/1.5M
β−メルカプトエタノール中に可溶化し、そしてポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した。蛋白質をニトロ
セルロース(BA85、シュライヒェル・アンド・シュ
エル,キーン,NH)上に電気移送し、そしてフィルタ
ーを5%ウシ血清アルブミン(シグマ)によりブロック
した。次に、フィルターをAIDS患者からプールされ
た、E.コリ−吸着されたヒト血清によりプローブし
た。このフィルターを、HRP−接合ヤギαHuIgに
より発色せしめた。このプールは両trp−gag融合
蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白質のみとは反応性
でなかった。 【0084】2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−2及びGAG−3蛋白質を
0.05M炭酸塩/炭酸水素塩緩衝液(pH9.6)中に
最終濃度がそれぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り50μlの
アリコートを負荷し、そして4℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをBLOTTO(5w/v%脱脂粉
乳/0.01%チメロソル/0.01%アンチホーム
A、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15
M塩化ナトリウム)により1時間室温にてブロックし
た。血清を、BLOTTO及びPBS(0.01Mリン
酸ナトリウム、pH7.3/0.15M NaCl)の
1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウエル当
り50μlの稀釈された血清を加えて37℃にて1時間
置いた。 【0085】血清を除去し、そしてプレートを3回洗浄
緩衝液(0.15M NaCl/0.05w/v%トゥ
イーン20)中で3回洗浄した後、100μlのヤギ抗
−ヒトIgG/ホースラディッシュパーオキシダーゼ接
合体(50%ストックを、50mMクエン酸ナトリウム/
0.05%トゥイーン20/1%熱失活した正常ヤギ血
清、アンチボディーズ社,デービス,CAから入手した
ものに1:10,000稀釈したもの)を加えて37℃
にて1時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを
0.15M NaCl/0.05(w/v)%トゥイー
ン20で3回洗浄した。100μl/ウエルの基質溶液
(50mlの0.05Mクエン酸ナトリウム、pH7.0中
10mg 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジ
ン)を加えて30分間室温に置くことによりELISA
を発色せしめた。100μl/ウエルの3N H2 SO
4 により反応を停止し、そして450nmにおける光学濃
度を自動ELISAリーダーにより決定した。pGAG
−1により生産された蛋白質は既知の血清反応陽性の血
清のパネルと反応性であることが見出された。 【0086】パネルはLAVに対する血清反応陽性24
1及びLAVに対する血清反応陰性271(ウイルスを
基礎ELISAにより定義されたもの)を含んだ。これ
らの血清は放射性標識されたLAV抗原の免疫沈澱によ
り確認されていた。表3は、陽性及び陰性血清サンプル
の両者が高及び低危険群の両者の個体から導かれること
を示している。pGAG1に反応する抗体は、程度は異
るが、すべての診断群に見出された。なお、pGAG1
に対する反応性は、健康であるか又はAIDSへの進行
の初期段階(例えば、PGL又は永続的な一般化された
リンパ腺症)の個体に比べ、より少数の個体において見
出された。これは、LAVへの暴露の後早期にコアー蛋
白質に対する反応性を示すが疾患の進行に従ってコアー
蛋白質への反応性の喪失を示す報告と一致する。図9
は、すべての血清サンプルから得られた光学濃度のヒス
トグラムである。 【0087】pGAG1の抗原としての有用性を小測定
においてELISAによりさらに試験した。この方法に
おいては、env組換蛋白質であるpENV3に対して
弱い反応性を示すか又は非反応性である血清をpGAG
1との反応性について試験した。pENV3及びpGA
G1のそれぞれ単独、並びに組合わせに対して試験され
た8個の陽性血清及び4個の陰性血清について、ELI
SA値を表4に示す。これらの血清の内3種(14−0
085,07−3915、及び14−0100)はいず
れもpENV3に対して非反応性であるか又は弱く反応
するが、しかしウイルス及びpGAG1に対して非常に
反応性であった。 【0088】ウイルスに弱く反応する2種類の血清(0
8−0030及び10−0056)はpENV3のみ又
はpGAG1のみと非常に弱い反応性を有した。しかし
ながら、この両組換体との反応は、血清反応陰性対照か
らより容易に区別できる陽性ELISA値を与えた。こ
れらの結果は、pGAG1はpENV3に対して低い反
応性を有する陽性の血清を検出するのに有用であるこ
と、及びpGAG1とpENV3との組合わせが、血清
反応陽性個体と血清反応陰性個体との間の識別において
いずれか一方より効果的であることを示している。 【0089】 【表3】 【0090】3.LAVに対する血清抗体の検出のため
に蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質/ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質/ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【0091】他の方法として、蛋白質/ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中FITC−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【0092】4.trp−gag蛋白質及びtrp−e
nv蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtr
p−env蛋白質と混合した。次に、GAG−1又はE
NV−3のみについて前記したのと同様にしてELIS
Aを行った。表4は、GAG−1とENV−3との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。蛋
白質を組み合わせた場合血清反応陽性サンプルの内7/
7が検出され、他方GAG−1又はENV−3のみによ
り検出した場合、6/7が検出された。 【0093】 【表4】 【0094】以上の記載から、この発明の特定の具体例
を説明のために記載したが、この発明の本質及び範囲を
逸脱することなく種々の変更を行うことができることが
予想されよう。従って、この発明は添付された請求の範
囲によるほか限定されるべきでない。
により製造されるウイルス蛋白質に関し、そしてさらに
詳しくはリンパ腺症関連ウイルス(LAL)に対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質に関する。 【0002】 【従来の技術】後天性免疫不全症候群(AIDS)は日
和見感染及び若干のまれな悪性腫瘍により特徴付けられ
る細胞性免疫の伝染性疾患である。AIDSについての
主たる危険群には同性愛の男性、静脈投与剤の乱用者、
輸注剤及び血液製剤の受容者、並びに高危険個体の異性
パートナー及び子供が含まれ、密接な接触及び血液製剤
を介して伝達される感染体の関与が示唆される。 【0003】最近の証明によれば、疾患の伝染を担当す
る感染体はリンパ腺症関連ウイルス(LAL)として知
られる新しいリンパ趨向性レトロウイルスである〔Barr
e-Sinoussi等、 Science 220:868(198
3)〕。他の科学者グループによって類似のウイルスが
報告されており〔 Popovic等、 Science 224:49
7(1984);Levy等、 Science 225:840
(1984);Vilmer等、Lancet 1:753(198
3)〕、そしてヒトT−細胞リンパ趨向性ウイルスタイ
プ III(HTLV−III )、AIDS関連レトロウイル
ス(ARV)、又は免疫不全関連ウイルス(IDAV)
と命名されている。 【0004】さらに最近のデーターは、LAV,HTL
V−III ,ARV、及びIDAVは、実質的なヌクレオ
チドの相同性を含む幾つかの特徴を共有し〔 Wain-Hobs
on等、Cell 40:9(1985); Muesing等,Natu
re,313:450(1985);Sanchez-Pescader
等、 Science 227:484(1985)〕、そして
同じウイルスの単離体であると考えるべきであることを
示している。但し、ウイルス単離体間の株対株変異が存
在する可能性もある。実質的なヌクレオチドの相同性を
示すことに加えて、単離体形態、細胞病理、最適逆転写
酵素活性の要求性、及び少なくとも幾つかの抗原性に関
して類似している〔Levy, 前掲; Schupbach等、 Scien
ce 224:503(1984)〕。 【0005】前記のごとく、このウイルスは血液製剤
(血液、血清、血漿、及びこれらの画分)を介して伝染
し得ることが知られており、このため、提供者がこのウ
イルスに暴露されたことがあるか否かを決定するために
血液製剤をスクリーニングすることが重要である。これ
は、LAV及び関連ウイルスに対する抗体の検出のため
のエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセイ(E
LISA)を含む幾つかの方法の内任意の方法により行
うことができる。LALに対する抗体を含有する血液を
有する個体は“血清反応陽性”(seropositive) である
と言われる。血清反応陽性提供者からの血液は検出の後
血液供給から除去され、こうして疾患の拡散が防止され
る。 【0006】LAVに暴露された個体の免疫反応は多様
である。p13,p18,p25,p36,gp43,
p55,gp110等を含む幾つかのウイルス蛋白質の
いずれに対しても抗体が生産され得る〔 Schupbach等、
N. Engl. J. Med. 312:265(1985)〕。す
べての個体が同じ蛋白質又は所与の蛋白質の同じエピト
ープに対する抗体を生産するわけではないであろう。 【0007】血清反応陽性個体の検出は、最近行われて
いる所では、幾つかの本質的な問題点を有する。これら
の問題点の内主要な点は、免疫的測定のために全体ウイ
ルスから抗原を単離する必要があることである。この単
離は、潜在的に感染性の生ウイルスの大量操作を必要と
し、そしてこのこと自体かなり安全性を脅やかす。さら
に、調製ごとにウイルスの収量、純度及び再現性に関す
る懸念が存在する。このことが許容されない数の偽陽性
及び/又は偽陰性をもたらす。従って、血液のスクリー
ニング測定において有用でありそして他の関連する利点
をさらにもたらすウイルス抗原を製造するための他の方
法が当業界において求められる。 【0008】 【発明の開示】要約すれば、この発明は、LAVゲノム
の群特異的抗原(gag)領域の部分、すなわちLAV
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成るDNA配列を開示する。細菌宿主中で複
製することができる組換プラスミドも開示される。この
プラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シグ
ナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに続
く前記のDNA配列を含有する。好ましい態様において
は、シグナルは誘導性及び/又は抑制性であるtrpオ
ペロンのごときオペロンから選択される。上記の組換プ
ラスミドにより形質転換された、E.コリ(E. coli )
のごとき細菌の細胞も開示される。 【0009】この発明の他の観点は、LAVに対する抗
体と免疫的に反応性である蛋白質の製造方法を開示す
る。この方法は、細菌宿主細胞中で複製可能な組換プラ
スミドを細菌宿主細胞に導入することを含んで成る。こ
のプラスミドは、発現のための原核性の転写及び翻訳シ
グナル、並びにリーディングフレームを合わせてこれに
続くLAVゲノムのgag領域の部分、すなわちLAV
に対する抗体と免疫的に反応する蛋白質をコードする部
分を含んで成る。プラスミドの導入に続き細菌宿主を適
当な培地中で増殖せしめる。次に蛋白質の発現を誘導
し、そしてその配列の蛋白質生成物を細菌宿主から単離
する。単離に続き、蛋白質生成物を、例えばゲル浸透ク
ロマトグラフィーにより精製する。 【0010】この発明の他の観点は、LAVに対する抗
体の生物学的流体中での存在を検出する方法を開示す
る。この方法は、生物学的流体を、前記の組換プラスミ
ドにより形質転換された細菌細胞により生産された蛋白
質と共にインキュベートし、これによって反応混合物を
形成し、そして次にこの反応混合物を分析して抗体の存
在を決定することを含んで成る。好ましい態様において
は、反応混合物を分析する段階は、反応混合物を抗体に
対するラベルされた特異的結合パートナーと接触せしめ
ることを含んで成る。 【0011】この発明の他の観点は、生物学的流体中の
LAL抗原の存在を決定するための方法を開示し、この
方法は生物学的流体を、前記の組換プラスミドにより形
質転換された細菌細胞により生産された標識化蛋白質と
共にインキュベートし、そしてこれに続いて又はこれと
同時に該蛋白質に対する抗体と共にインキュベートして
特異的結合を生じさせる。次に、インキュベーションの
間に形成された反応混合物を分析して抗体と結合した標
識の量を決定する。前記の組換プラスミドにより形質転
換された細菌細胞により生産された蛋白質により動物を
免疫感作することを含んで成る、LAVに対する抗体の
製造方法も開示される。 【0012】この発明の他の観点は、LAVに対する抗
体の生物学的流体中での存在を決定するための方法を開
示し、この方法は、細菌宿主細胞中で複製することがで
きそして発現のための原核性の転写及び翻訳シグナルを
含有する組換プラスミドにより形質転換された細菌細胞
により生産された蛋白質にラテックスビーズを接合せし
めることを含んで成る。前記シグナルに続き、LAV遺
伝子のgag領域の部分、すなわちLAVに対する抗体
と免疫的に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成
るDNA配列が存在する。次に、生物学的流体をビーズ
/蛋白質接合体と共にインキュベートし、これによって
反応混合物を形成する。次に、この反応混合物を分析し
て抗体の存在を決定する。 【0013】この発明において製造される蛋白質は、適
当な担体又は稀釈剤と共に使用される場合、免疫的に有
効なワクチン組成物を構成する。LAVゲノムのgag
領域の部分を含んで成るDNA配列によりコードされた
蛋白質の免疫的有効量を医薬として許容される担体と共
に個体に投与することにより、AIDSの原因となるウ
イルスにより惹起される感染が回避され得る。 【0014】 【発明の実施の形態】発明を記載するに先立ち、以下に
使用される幾つかの用語の定義を記載するのが発明の理
解のために有用であろう。リンパ腺症関連ウイルス(LAV) :ヒトT−リンパ趨
向性レトロウイルス。 この発明の目的のため、ウイルスが下記の規準を実質的
に満たす場合、それをLAVと同一であるか又は同等の
ものと考える。 【0015】(a)T−リンパ球、特にT−ヘルパー細
胞〔CD4+ 、 Bernard等編、Leucocyte Typing, ニュ
ーヨーク,スプリンガーベルラーク(1984)中に定
義された国際命名法に従う〕に対して向性である; (b)このウイルスは感染されたCD4+ 細胞に対して
細胞変性的(cytopathic) である(HTLV−I及びII
のように形質転換的ではなく); (c)このウイルスは、Mg2+−依存性であり(最適濃
度5mM、最適pH7.8、アクチノマイシンDにより阻害
される)そしてオリゴ(dT)12-18 をプライマーとし
てその3′LTRからの逆転写のために使用することが
できるRNA−依存性DNAポリメラーゼ(逆転写酵
素)をコードする; (d)このウイルスは、シュークロース勾配中で約1.
16の密度においてバンドを形成する; 【0016】(f)このウイルスは、免疫学的規準及び
ヌクレオチド配列規準によりHTLV−I/IIファミリ
ーのウイルスから区別される(この規準によりHTLV
−III はHTLV−I/IIファミリーの一員であるとは
考えられない); (g)このウイルスは、LAVのgag及びenv領域
によりコードされた蛋白質と免疫学的に実質的に交差反
応する;そして、 (h)このウイルスは、LAVと実質的なヌクレオチド
配列の相同性(75〜100%)及びアミノ酸配列の相
同性(75〜100%)を有する。免疫的に反応性 :抗原及び抗体が相互に特異的に、典型
的には106 M-1以上、そしてしばしば108 M-1以上
の親和性をもって、結合することができる場合、これら
は“免疫的に反応性である”と言われる。 【0017】形質転換、又は形質転換された:精製され
たDNAの導入により受容細胞又は微生物の遺伝子型を
安定に且つ遺伝的に変更する過程。 リンパ腺症関連ウイルス(LAV)はAIDS又はリン
パ腺症の症状を有する患者から単離することができる。
このような患者のリンパ腺を典型的には生検採取し、そ
して必要により増殖を支持するように補充された培地に
入れる。インターロイキン−2(IL−2)又はフィト
ヘマグルチニン(PHA)のごときマイトジエンを含有
せしめることができ、ヒト−インターフェロンに対する
抗血清を含めることもできる。逆転写酵素活性は典型的
には約15日の培養で表われ、ウイルスの存在が示され
る。非イオン性洗浄を用い、次にシュークロース勾配中
でバンド化することによってウイルスを濃縮することが
できる。これらの精製法及び他の精製法は当業者におい
て良く知られており、例えばMontehro等、 J. Virology
42:1029(1982)に記載されている。 【0018】LAVは多くの方法のいずれかにより増殖
し得る。これはへその緒、末梢血又は骨髄由来のT−リ
ンパ球中で培養することができる。別の方法として、こ
れは不滅化されたT−細胞又はB−細胞中で増殖するこ
とができる。例えば、 Popovic等、 Science 224:
497(1984);及びMontagnier等、 Science22
5:63(1984)を参照のこと。ウイルスの増殖は
通常逆転写酵素活性の存在によりモニターされる。LA
Vのゲノムクローンは当業界においてよく知られている
幾つかの方法のいずれかにより調製することができ、こ
れらの方法にはHahn等、Nature 312:166(19
84);Alizon等、Nature 312:757(198
4); Lucin等、Nature 312:760(198
4);及び Muesing等、Nature 313:450(19
85)により記載された方法が含まれるが、これらに限
定されない。 【0019】要約すれば、これらの方法の1つ(Alizon
等)においては健康な提供者のT−細胞にLAVを感染
させたものからDNAを単離し、HindIII のごとき
制限酵素により部分消化し、そして得られた消化物を電
気泳動的に分画する。完全なLVAゲノム(約9.2K
b) のサイズに相当するサイズの断片をゲルから溶出
し、沈澱せしめ、再懸濁し、そして適切に制限酵素処理
されたベクターのアームに連結する。連結混合物をバク
テリオファージ粒子にパッケージする。 【0020】このバクテリオファージにより細胞を形質
転換し、そしてクローンをその場でLAV挿入部につい
て、適当なプローブ(例えば、LAV−RNAから調製
されたcDNA)を用いてスクリーニングする。陽性ク
ローンから、LAVの所望の領域を細菌プラスミドベク
ター、例えばpUC18にサブクローニングすることが
できる。不所望の配列を除去し、そして発現ベクターへ
のクローニングを促進する目的でいずれかの末端に追加
の制限部位(ポリリンカーの形で)を加えるためさらに
サブクローニングするのが好ましい場合がある。 【0021】次に、LAV配列を誘導性の発現ベクター
にサブクローニングすることができる。種々の発現ベク
ターが当業界において知られており、そしてλgt1
1:Tn〔Hall等、Nature 311:379(198
4);trpE(Eur. J. CellBiol. 31:171
(1983);pIN III( Masui等、 Biotechnolog
y, 1984年1月、81頁)を含む。 【0022】得られた蛋白質は部分的に精製することが
でき、そして免疫源として及びイムノアッセイにおける
抗原としての使用を含む種々の目的のために使用するこ
とができる。免疫源としての使用のためには、蛋白質を
緩衝液中又はアジュバント中で、動物、例えばマウス、
ラビット、ヤギ等に注射することができる。他の方法と
して、蛋白質をポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製し、そして注目のバンドをゲルから切り出し、すり
つぶし、そして宿主動物に注射するために緩衝液中に再
懸濁することができる。ポリクローナル抗体又はモノク
ローナル抗体を調製することができる。 【0023】イムノアッセイにおける抗原として使用す
るため、蛋白質をラベル化形又は非ラベル化形のいずれ
かとして使用することができる。これらが標識される場
合、ラベルは放射性同位元素、蛍光物質、酵素、発酵
剤、粒子等を包含することができる。これらの標識及び
他の標識が当業界においてよく知られており、そして例
えば米国特許出願 No.3,766,162、 No.3,7
91,932、 No.3,817,837、 No.3,99
6,345、及び No.4,233,402に記載されて
いる。この発明の組換蛋白質を用いる測定法は不均一法
(すなわち、分離段階を必要とする)、又は均一法であ
ることができる。測定法が不均一法である場合、遠心分
離、濾過、クロマトグラフィー、又は磁気を含む種々の
分離手段を用いることができる。 【0024】抗体の存在について血液製剤又は他の生理
的流体をスクリーニングするための1つの好ましい測定
法はELISAである。典型的には、抗体(この場合、
組換蛋白質の1つ又はその組み合わせ)をミクロタイタ
ーウエルの表面に吸着せしめる。次に、表面上の残留蛋
白質結合部位を適当な薬剤、例えばウシ血清アルブミン
(BSA)、熱不活性化正常ヤギ血清(NGS)、又は
BLOTTO(防腐剤塩及び消泡剤をさらに含有する脱
脂粉乳の緩衝化溶液)によりブロックする。次に、ウエ
ルを、特異抗体を含有すると予想されるサンプルと共に
インキュベートする。サンプルはそのまま適用すること
ができ、又は一層しばしば、通常少量の(0.1〜5.
0重量%)の蛋白質、例えばBSA,NGS又はBLO
TTOを含有する緩衝化溶液中に稀釈することができ
る。 【0025】特異的結合が起こるのに十分な時間インキ
ュベートした後、ウエルを洗浄して未結合の蛋白質を除
去し、そして次に標識された抗−ヒト免疫グロブリン
(αHuIg)と共にインキュベートする。この標識
は、ホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)、
β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及
びグルコースオキシダーゼを包含する種々の酵素から選
択することができる。特異的結合が生ずるのに十分な時
間の後、ウエルを再び洗浄して未結合の接合体を除去
し、そして酵素のための基質を加える。発色させ、そし
てウエルの内容物の光学濃度を視覚的に、又は装置を用
いて決定する。 【0026】便利のため、ELISA用試薬はキットの
形で供給される。これらのキットは、組換技法によって
作られたウイルス蛋白質が前吸着されるミクロタイター
プレート、種々の稀釈剤及び緩衝剤、特異的に結合した
抗体を検出するための標識された接合体、及び他のシグ
ナル発生試薬、例えば酵素基質、コ−ファクター及び色
原体を含むことができる。 【0027】LAVに感染された個体は、p13,p1
8,p25,p36,gp43,p55,gp110等
を含む多数のLAV蛋白質に対する抗体を含有する。す
べての個体が同じ蛋白質に対する抗体を生産するわけで
はないが、個々の血清は最も一貫してgag蛋白質p2
5及びp18,並びにenv蛋白質gp43及びgp1
10と反応性である。個体間の差異は疾患の進行程度を
含む種々の因子による。例えば、コア蛋白質に対する抗
体は疾患の最も早期には支配的であるが、しかし免疫抑
制の進行と共に減少する。これに対して、エンベロープ
糖蛋白質に対する抗体力価は疾患の後期を通じて持続す
ると考えられる。 【0028】応答における他の差異はウイルス蛋白質を
コードする遺伝子中の多型性(ポリモルフィズム)に基
くであろう。LAVの異る単離体はenv蛋白質の有意
な変化を有する。興味あることには、gag蛋白質配列
は高度に保存されている。試験されたすべての血清反応
陽性サンプルにおいて、gag蛋白質の少なくとも1つ
(p18又はp25)あるいはenv蛋白質の1つ(g
p43又はgp110)に対する抗体が見られた。しか
しながら、これらの蛋白質はいずれも血清反応陽性個体
により普遍的には認識されなかった。 【0029】従って、血液を少なくとも1つのgag及
び1つのeng蛋白質に対する抗体についてスクリーニ
ングすることが必須のようである。先行特許出願である
米国出願 No.721,237 "Expression of Immunolo
gically Reactive Viral Proteins"において、開示され
ている発明は、LAVに対する抗体と免疫的に反応性で
ある蛋白質をコードする、LAVゲノムのエンベロープ
(env)領域の部分を用いる。本発明は、やはりLA
Vに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質をコード
する、LAVゲノムのgag領域の部分を用いる。組み
合わせにおいて、gag領域によりコードされる蛋白質
及びenv領域によりコードされる蛋白質を用いて高い
感度をもって血清反応陽性個体を検出することができ
る。 【0030】この発明の組換蛋白質の他の用途はヒト用
のワクチンとしてである。組換蛋白質は高度に精製し、
そして便利な方法で、一般に宿主kg当り1μg〜20mg
の濃度で、製剤化することができる。生理的に許容され
る担体、例えば無菌水、塩溶液、緩衝化塩溶液等を使用
することができる。助剤、例えば酸化アルミニウムを使
用することもできる。ワクチンは静脈注射、皮下注射、
筋肉内注射、又は腹腔内注射により投与することができ
る。1回の注射で十分な場合もあるが、一層しばしば週
〜月間隔での多数の注射が好ましい。 【0031】別の方法として、LALゲノムの領域を発
現するワクチニアウイルス組換体を造成することができ
る。例えば、この発明の造成物をプラスミドpMM34
( Mackett等、 Science 227:433,1985)
に挿入し、そして生ずるキメラプラスミドを含有するワ
クチニアウイルスハイブリドを相同組換により形成する
ことができる。このような組換ウイルスワクチンによる
免疫感作は、肝炎Bウイルス及び水疱性口内炎ウイルス
に対する動物における保護免疫を生じさせるのに効果的
であることが示されている( Smith等、Nature 31
1:578,1984)。 【0032】この方法による組換蛋白質ワクチンの使用
は、病原性微生物の不活性化調製物又は非毒性株からワ
クチンを構成する必要性を除去する。次の例において、
LAV−gagのオーバラップする領域(図3)、並び
にp18のほとんど及びp25の部分を含むgag領域
の他の部分を発現のために選択した。この選択は、p1
8及びp25がLAVに感染した個体からの血清と最も
再現性よく反応するgag蛋白質であるという知見に影
響された。これらの配列内での本発明者等の選択は、親
水性領域及びプロテアーゼ開裂部位(この両者は蛋白質
の表面で露出され、そして免疫原的である)の存在並び
に選択されたベクター(trpE)中での効果的な発現
のためのサイズの限界により指示された。 【0033】λJ19と称するLALゲノムクローンを
細菌プラスミドベクターpUC18にサブクローン化し
た。pBT−1と称する得られるサブクローンをさらに
サブクローン化して主としてgag及びpol配列を含
有するpSS−5及びpBS−5を得た。1つの方法に
おいて(例1)、gag配列をさらにpIC19Rにサ
ブクローン化し(プラスミドpSM002及びpBPB
14が形成される)、そして次にgag配列の領域をt
rpE誘導性発現ベクターに移した。gagDNAをt
rpE遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入し、この
造成物によりE.コリを形質転換した場合にtrpE−
gag融合蛋白質の発現が得られた。生ずる蛋白質を部
分的に精製し、そして既知の血清反応陽性個体及び既知
の血清反応陰性個体からの血清とのELISAにおける
それらの反応性により特徴付けた。pGAG−2及びp
GAG−3と称する2つの有用な造成物が同定された。 【0034】他の方法において(例2)、gag配列の
部分(bp375−547)をpUC18ampにさら
にサブクローン化した(プラスミド0674−14−1
0が形成される)。次に、gag配列の第2領域(bp
505−961)をプラスミド0674−14−10に
移し、プラスミド0674−27−38を生成せしめ
た。次に、gag配列(bp347−961)をtrp
E誘導性発現ベクターpATH10に移した。gagD
NAをtrpE遺伝子の下流にフレームを合わせて挿入
し、この造成物によりE.コリを形質転換した場合tr
pE−gag融合蛋白質の発現が得られた。生じた抗体
を部分的に精製し、そして既知抗体陽性個体及び既知の
抗体陰性個体からの血清とのELISAにおけるそれら
の反応性により特徴付けた。pGAG−1と称する1つ
の有用な造成物を同定した。次の例は、制限的にではな
く、例示的に与えられる。 【0035】例1. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質を発現するために幾つかの細菌発現系のいず
れかを使用することができる。trpE系をLAV−g
agの発現のために使用した。なぜなら、これは強力な
誘導性プロモーターを含有するが、しかしその発現は、
外来性の(そして潜在的に毒性の)蛋白質が長期間にわ
たって細菌内に蓄積しないように抑制され得るからであ
る。 【0036】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより限定される。例えば、
trpE発現ベクターは、DNA挿入部が対応末端にB
amHI,HindIII 、又はEcoRI制限部位を有
することを必要とする。まず注目の領域を広範囲の又は
異る配置の制限部位を有する中間体ベクターにサブクロ
ーン化することにより、一層の多様性を得ることができ
る。次に、中間体ベクターにより提供される制限部位を
用いることにより、注目の領域を発現ベクターに導入す
ることができる。 【0037】従って、本発明者等の方策は、まずLAV
ゲノムのgag領域のほとんどをトランスファーベクタ
ーpIC19Rに挿入することであった。次に、これら
のサブクローンの種々の断片を、ポリリンカー領域中の
制限部位のリーディングフレームにおいてのみ異る(図
2)2つのtrp発現ベクター(pJH12,pJH1
4)のいずれかに連結した。 【0038】1.LAVゲノムのサブクローニング a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHindIII 部位中の9.2Kbのゲノム
DNA挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手し
た。このクローンはλJ19と称され、そして Wain-Ho
bson等、Cell 40:9(1985)に記載されてい
る。λJ19ファージ粒子をE.コリK−12のQ35
9株(Q359の遺伝子型はhsdRK- ,hadMK
+ ,supF,φ80,P2)に、Maniatis等、 Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual,ニューヨーク,
コールドスプリングハーバーラボラトリー,1982、
64頁の方法に従ってトランスフェクトした。単一プラ
ークを拾い、そしてファージをプレート・ライセート法
(Maniatis,前掲、65頁)により増幅した。 【0039】37℃にて9時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート(100mm
直径)に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO
4 /50mM Tris(pH7.5)を重層した。4℃に
て12時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで2回抽出した。 【0040】ファージ粒子を含有する得られた水相10
mlに2mlの0.25M EDTA/2.5% SDS/
0.5M Tris(pH9)を加え、そしてこの懸濁液
を70℃にて15分間インキュベートしてファージを破
壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に4℃
にて12,000×g分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH8、1M Tris(pH
8)により平衡化したもの〕により20℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム/イソアミルアル
コール(24:1)により20℃にて抽出した。次に、
水相に2.5容量の95%アルコールを加えてDNAを
沈澱せしめた。遠心した後、DNAペレットを乾燥し、
そして10mM Tris・HCl(pH7.4)/1mM
EDTA中に再懸濁した。 【0041】b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μgのλJ19DNA
を、LAVのこの単離体のLTR領域においてのみ切断
する制限酵素SstI(ベセスダ・リサーチ・ラブス,
ベセスダ,MD)により完全に消化した。この消化混合
物を、0.089M Tris−ボレート/0.089
M硼酸/1mM EDTA中0.9%アガロースを通して
1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをNA45紙に電気溶出した(Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からDNAを回収した。 【0042】9.1Kb SstI断片をSstIで消化
されたベクターpUC18に、挿入分子:ベクター分子
の比を10:1にして連結した。E.コリHB101株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のCaCl
2 法により形質転換し、そしてLB+アンピシリン(2
00μg/ml)寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、3mlのLB+アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法(Maniatis等、前掲、368頁)に
よりプラスミドDNAを調製した。プラスミドDNAの
制限酵素分析により決定した場合にポリリンカー中のE
coRI部位がLAVゲノムの5′末端に最も近いよう
な方法で9.1Kb SstI挿入部を含有する1つのコ
ロニーを選択した。このサブクローンはpBT−1と命
名された(ATCC#53069)(図1)。 【0043】プラスミドpBT−1から2個のサブクロ
ーンを作った。第1番目(pSS−5)のため、pBT
−1をSalIで消化し、そして再連結した。第2番目
のpBS−5のため、pBT−1をBamHI及びBg
lIIで消化し、そして再連結した。各場合において、L
AVゲノムの5′部分がベクターと共に維持された。H
B101細胞を連結されたDNAにより形質転換し、そ
してpSS−5挿入部を有するコロニー及びpBS−5
挿入部を有するコロニーを、精製されたプラスミドDN
Aの制限分析により同定した。 【0044】次に、pSS−5及びpBS−5の領域を
中間体ベクターpIC19Rにサブクローン化した。上
記のように、これは、発現ベクターへの移行のための正
しいリーディングフレーム内に必要な制限部位を与え
る。詳しくは、pBS−5のHindIII 断片(LAV
ゲノムのbp631−bp1258;番号は Wain-Hobs
on等、Cell 40:9(1985)を、HindIII 及
びウシ腸ホスファターゼ処理されたpIC19Rに連結
した(図4)。連結されたDNAをCaCl2 −ショッ
クを受けたE.コリTB−1により取り込ませた。色原
体基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドール−β−
ガラクトシッド(シグマ)を用いて、アンピシリン耐性
コロニーを、gag配列の挿入によるβ−ガラクトシダ
ーゼの不活性化についてスクリーニングした。挿入部の
方向はプラスミドDNAをPvoIIで消化することによ
り決定した。生ずるプラスミドをpSM002と称す
る。 【0045】PvuII−BglII断片(LAV遺伝子の
bp691〜bp1642)を、SmaI及びBglII
で消化したpIC19Rに連結した(図5)。連結され
たDNAによりE.コリHB101を処理し、そして生
じたアンピシリン耐性コロニーを上記の色原体によりス
クリーニングした。候補コロニーを、プラスミドDNA
の制限分析によりさらにスクリーニングした。生じたプ
ラスミドをpBPB14と称する。 【0046】2.gag配列のtrpベクターへの挿入 発現ベクターは、pBR322に挿入されたE.コリt
rpオペロンプロモーター、オペレーター及びtrpE
遺伝子を含有する(図2)。trpE遺伝子を最もその
5′に近いBglII部位においてポリリンカー配列の挿
入により切断した〔 Konopka等、J. Virol. 51:22
3(1984)〕。異るtrpベクター(pJH12及
びpJH14)はポリリンカー領域内の制限部位のリー
ディングフレームに従って異る。適切なベクターへのオ
ープンリーディングフレームの挿入はアミノ末端におけ
るtrpE配列との融合蛋白質をもたらす〔Spindler
等、J. Virol. 49:132(1984)〕。 【0047】pGAG−2(ATCC#53111)は
HindIII gagサブクローン(pSM002、図
4)をBglII及びBamHIで消化することにより造
成した。BglII及びBamHI部位はpIC119R
の包囲するポリリンカー領域内に位置する。gag断片
をゲル精製し、そしてBamHIで消化されたpJH1
2に連結した(図4)。連結されたDNAをCaCl2
ショックE.コリHB101に取り込ませ、そしてコロ
ニーをアンピシリン(100μg/ml)及びトリプトフ
ァン(40μg/ml)の存在下で増殖せしめた。その蓄
積が細菌にとって不都合である外来蛋白質の発現を抑制
するためにトリプトファンを使用した。候補アンピシリ
ン耐性コロニーを放射能標識されたgagDNAプロー
ブとのハイブリダイゼーションにより同定した。少量溶
菌物(ミニライセート)の制限分析を用いて挿入部の存
在及び方向を確認した。 【0048】pGAG−3(ATCC53112)を、
図5に示すように、PVUII(bp691)及びBgl
II(bp1642)の間のgag領域を含有するpBP
B14のEcoRI消化により造成した。EcoRI部
位はgag配列を囲むポリリンカー配列内に存在する。
gag断片をゲル精製し、そしてEcoRI及びウシ腸
ホスファターゼで処理したpJH14に連結した。E.
コリHB101細胞を、連結されたDNAにより形質転
換し、前記のようにしてプレートし、そして制限分析に
よりスクリーニングしてpJH14中のgag配列の存
在及び方向を確認した。 【0049】B.蛋白質の発現 1.trp−gag造成物によるE.コリの形質転換 組換trp−gag発現プラスミドのそれぞれをE.コ
リHB101からE.コリC600に移した。後者が蛋
白質の生産のために一層良好な宿主だからである。移行
は、HB101の少量溶菌物からのスーパーコイルDN
AによりCaCl2 −ショックC600を形質転換する
ことにより行った。細菌を前記のようにアンピシリン及
びトリプトファンの存在下でプレートした〔 Konopka
等、J. Virol. 51:223(1984)〕。薬剤耐性
コロニーを少量溶菌物によりスクリーニングし、適切な
プラスミドの存在を確認した。 【0050】2.trp−gag蛋白質の発現 trp 発現ベクターにより形質転換されたE.コリC6
00の増殖及び誘導は記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. 49:132(1984); Konop
ka等、J. Virol. 51:223(1984)〕。要約す
れば、トリプトファン(40μg/ml)及びアンピシリ
ン(100μg/ml)を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら37℃にて一夜培養せしめた。次
に、この一夜培養物を、アンピシリン(100μg/m
l)を含有するがしかしトリプトファンを含有しない新
鮮な最少培地に1:100で接種した。 【0051】これらの培養物を通気しながら2〜3時間
(対数期初期まで)37℃にて増殖せしめた。誘導剤3
−β−インドール酢酸(シグマ)を、95%エタノール
中20mg/mlの新たに調製したストックから、最終濃度
が20μg/mlとなるように加えた。誘導された培養物
を37℃にて通気しながら4〜5時間増殖せしめ、そし
て次にペレット化し、そして場合によっては凍結した。
pGAG−2及びpGAG3からの蛋白質収量は典型的
には10〜30mg/lであった。 【0052】C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.51:223(1984)〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物l当り100mlの
50mM Tris(pH7.5)/0.5mM EDTA/
150mM NaCl(TNE)中に再懸濁した。リゾチ
ーム(シグマ)を1mg/mlの最終濃度に加えた。0℃に
て15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が0.0
5%〜0.2%となるように0℃にて10分間にわたっ
て加えた。 【0053】次に、1〜2mgのDNアーゼ(シグマ)を
150mlのDNアーゼ緩衝液(1.5M NaCl/1
2mM MgCl2 )と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、8000×g、0℃にて15分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをTNE中で2回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【0054】別の方法として、約200mlからの細胞ペ
レットを180μlの0.14MTris HCl(pH
7.8)/6% SDS及び20μlのβ−メルカプト
エタノール中に再懸濁し、そして95℃〜100℃にて
20分間加熱することにより、不溶性ペレットを変性
し、そして還元した。次にサンプルをスピード・バク・
コンセントレーター(サーバントインストルメンツ,ヒ
ックスビル,NY)中で乾燥した。SDSを除去した
後、サンプルを次のようにして抽出した。ペレットを1
mlのアセトン/トリエチルアミン/酢酸/水(17/1
/1/1)中に再懸濁し、そして激しく渦動し、懸濁液
を氷上で1時間冷却し、濃縮し、そして上清を廃棄し
た。この抽出を0.4mlの前記アセトン混合物を用いて
2回、そして次に0.4mlのアセトンのみを用いて2回
反復した。次に、ペレットをスピード・バク・コンセン
トレーター中で乾燥した。 【0055】次に、この蛋白質ペレットを1.4mlの6
Mグアニジンヒドロクロリド/0.1M Tris−H
Cl(pH8.5)/10mM DTT中に溶解し、そして
37℃にて4時間インキュベートした。遠心によりすべ
ての粒状物を除去した。上清に含有されるサンプルを、
6Mグアニジンヒドロクロリド/10mM EDTA/1
mM DTT中で平衡化された1.6×96cmセファクリ
ルS−300カラム(ファルマシア,ピスカトウェイ,
NJ)に負荷した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、そし
て溶出した物質の吸光を280nmにて測定した。画分を
ELISAにより、LAV血清陽性の血清及びE.コリ
血清陽性の血清を用いて測定してそれぞれ特異的反応性
及び汚染による反応性を決定した。前者の血清とは反応
性を示すが後者の血清とは反応性を示さない画分を使用
して次に患者のELISAを行った。 【0056】D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−2及びpGAG−3により発現された不溶性
蛋白質調製物からのアリコートを2%ドデシル硫酸ナト
リウム/100mM Tris(pH6.8)/20%グリ
セリン/1.5M β−メルカプトエタノール中に可溶
化し、そしてポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し
た。蛋白質をニトロセルロース(BA85、シュライヒ
ェル・アンド・シュエル,キーン,NH)上に電気移送
し、そしてフィルターを5%ウシ血清アルブミン(シグ
マ)によりブロックした。次に、フィルターをAIDS
患者からプールされた、E.コリ−吸着されたヒト血清
によりプローブした。このフィルターを、HRP−接合
ヤギαHuIgにより発色せしめた。このプールは両t
rp−gag融合蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白
質のみとは反応性でなかった。 【0057】2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−2及びGAG−3蛋白質を
0.05M炭酸塩/炭酸水素塩緩衝液(pH9.6)中に
最終濃度がそれぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り50μlの
アリコートを負荷し、そして4℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをBLOTTO(5w/v%脱脂粉
乳/0.01%チメロソル/0.01%アンチホーム
A、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15
M塩化ナトリウム)により1時間室温にてブロックし
た。 【0058】血清を、BLOTTO及びPBS(0.0
1Mリン酸ナトリウム、pH7.3/0.15M NaC
l)の1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウ
エル当り50μlの稀釈された血清を加えて37℃にて
1時間置いた。血清を除去し、そしてプレートを3回洗
浄緩衝液(0.15M NaCl/0.05w/v%ト
ゥイーン20)中で3回洗浄した後、100μlのヤギ
抗−ヒトIgG/ホースラディッシュパーオキシダーゼ
接合体(50%ストックを、50mMクエン酸ナトリウム
/0.05%トゥイーン20/1%熱失活した正常ヤギ
血清、アンチボディーズ社,デービス,CAから入手し
たものに1:10,000稀釈したもの)を加えて37
℃にて1時間置いた。 【0059】接合体を除去し、そしてプレートを0.1
5M NaCl/0.05(w/v)%トゥイーン20
で3回洗浄した。100μl/ウエルの基質溶液(50
mlの0.05Mクエン酸ナトリウム、pH7.0中10mg
3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジン)を加
えて30分間室温に置くことによりELISAを発色せ
しめた。100μl/ウエルの3N H2 SO4 により
反応を停止し、そして450nmにおける光学濃度を自動
ELISAリーダーにより決定した。pGAG−2及び
pGAG−3により生産された蛋白質はいずれも既知の
血清反応陽性の血清のパネルと反応性であることが見出
された。 【0060】パネルは、2人の健康な異性愛者、LAS
(リンパ腺症の症状)及び/又は同性愛者と診断された
5個体、AIDSを有する1個体、及びAIDS患者か
らの血清のプールを包含した。AIDS,LAS及び/
又は同性愛個体からのすべての血清が、全体ウイルスE
LISAにおいて、及びLAV抗原の放射性ラベル化免
疫沈澱により血清反応陽性であるとして確認された。こ
れらの血清からの結果を表1に示す。これらの知見は、
LAV抗原に対して反応性の血清は本発明の細菌により
発現されたgag蛋白質に対しても反応性であることを
証明している。 【0061】3.LAVに対する血清抗体の検出のため
の蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質/ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質/ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【0062】他の方法として、蛋白質/ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中FITC−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【0063】 【表1】 【0064】4.trp−gag蛋白質及びtrp−e
nv蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtr
p−env蛋白質と混合した。次に、GAG−2又はG
AG−3のみについて前記したのと同様にしてELIS
Aを行った。表2は、GAG−3とENV−3との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。 【0065】 【表2】 【0066】例2. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質の発現のために幾つかの細菌発現ベクターの
いずれかを使用することができる。trpE系をLAV
−gag配列の発現のために選択した。なぜなら、これ
は強力な誘導性プロモーターを含有するが、しかしなが
ら長期間にわたって外来(従って潜在的に毒性である)
蛋白質が細菌内に蓄積しないようにその発現が抑制され
得るからである。 【0067】発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ
及びリーディングフレームにより制限される。例えば、
trpE発現ベクターpATH10は、DNA挿入部が
適合性末端にBamHI,ClaI,HindIII ,P
stI,SacI,SalI,SmaI,XbaI,X
maI、又はEcoRIを有することを必要とする。ま
ず、所望の領域を、一層広範囲及び変化した配置の制限
部位を有する中間体ベクターにまずサブクローン化する
ことにより一層の多様性を導入する。次に、注目の領域
を、中間体ベクターにより提供される制限部位を用いて
発現ベクターに導入する。 【0068】従って、方策はまず、LAVゲノムの所望
のgag領域を移送ベクターpUC18ampにサブク
ローン化することである。次に、このサブクローンのg
ag配列を、gag挿入部の発現を可能にするリーディ
ングフレーム内に適切な制限部位を有するポリリンカー
領域を含有するtrp発現ベクターpATH10に連結
する(図6)。 【0069】1.LAVゲノムのサブクローン化 a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHindIII 部位中の9.2KbゲノムD
NA挿入部を含有するλファージ粒子の形で入手した。
このクローンはλJ19と称され、そして Wain-Hobson
等、Cell 40:9(1985)に記載されている。λ
J19ファージ粒子をE.コリK−12のQ359株
(Q359の遺伝子型はhsdRk- ,hadMk+ ,
supF,φ80,P2)に、Maniatis等、 Molecular
Cloning: A Laboratory Manual,ニューヨーク,コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー,1982、64
頁の方法に従ってトランスフェクトした。 【0070】単一プラークを拾い、そしてファージをプ
レート・ライセート法(Maniatis,前掲、65頁)によ
り増幅した。37℃にて9時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート(100mm
直径)に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO
4 /50mM Tris(pH7.5)を重層した。4℃に
て12時間インキュベートした後、液体を集め、そして
同容量のクロロホルムで2回抽出した。 【0071】ファージ粒子を含有する得られた水相10
mlに2mlの0.25M EDTA/2.5% SDS/
0.5M Tris(pH9)を加え、そしてこの懸濁液
を70℃にて15分間インキュベートしてファージを破
壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そして
この溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に4℃
にて12,000×g分間遠心して蛋白質をペレット化
した。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そ
して同容量のフェノール〔pH8、1M Tris(pH
8)により平衡化したもの〕により20℃にて抽出し
た。次に水相を同容量のクロロホルム/イソアミルアル
コール(24:1)により20℃にて抽出した。次に、
水相に2.5容量の95%アルコールを加えてDNAを
沈澱せしめた。遠心した後、DNAペレットを乾燥し、
そして10mM Tris・HCl(pH7.4)/1mM
EDTA中に再懸濁した。 【0072】b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μgのλJ19DNA
を、LAVのこの単離体のLTR領域においてのみ切断
する制限酵素SstI(ベセスダ・リサーチ・ラブス,
ベセスダ,MD)により完全に消化した。この消化混合
物を、0.089M Tris−ボレート/0.089
M硼酸/1mM EDTA中0.9%アガロースを通して
1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定
した。このバンドをNA45紙に電気溶出した(Schlei
cher及びSchuell, Keene, NH) 。製造者の指示に従っ
て、紙からDNAを回収した。 【0073】9.1Kb SstI断片をSstIで消化
されたベクターpUC18に、挿入分子:ベクター分子
の比を10:1にして連結した。E.コリHB101株
を連結混合物を用いて、Maniatis等、前掲、のCaCl
2 法により形質転換し、そしてLB+アンピシリン(2
00μg/ml)寒天プレート上にプレートした。単コロ
ニーを拾い、3mlのLB+アンピシリン培地に稀釈し、
そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せしめ
た。アルカリ溶菌法(Maniatis等、前掲、368頁)に
よりプラスミドDNAを調製した。 【0074】プラスミドDNAの制限酵素分析により決
定した場合にポリリンカー中のEcoRI部位がLAV
ゲノムの5′末端に最も近いような方法で9.1Kb S
stI挿入部を含有する1つのコロニーを選択した。こ
のサブクローンはpBT−1と命名された(ATCC#
53069)(図1)。pBT−1をBamHI及びB
glIIで消化し、そして再連結した。LAVゲノムの
5′部分がベクターと共に維持された。HB101を連
結されたDNAで形質転換し、そしてpBS−5挿入部
(図1参照のこと)を含むコロニーを、精製されたプラ
スミドDNAの制限分析により同定した。 【0075】pGAG1のgagコード配列を、trp
発現ベクターへの適当な挿入のために必要な制限部位を
与えるpUC18ampにサブクローン化した。必要な
gag配列を連結するために2つのサブクローニング段
階を必要とした。第1段階において、pBS−5をSa
u3Aで消化し、そしてbp375からbp547〔Wa
in-Hobson等、 Cell 40:9(1985)に従って番
号を付与する〕にわたる172bp断片をゲル精製し
た。この断片をBamHIで消化したpUC18amp
に連結した。この連結されたDNAをCaCl2 −ショ
ックE.コリに取り込ませ、そして生じたアンピシリン
耐性コロニーを、色原体5−ブロモ−4−クロロ−3−
インドリル−β−ガラクトシドを用いて挿入部の存在に
ついてスクリーニングした。候補コロニーをプラスミド
DNAの制限分析によりスクリーニングした。得られた
プラスミドを0674−14−10と称する。 【0076】第2段階において、0674−14−10
をAccI及びPstIにより制限酵素処理し、そして
bp505のAccIからbp961のPstI部位に
わたるpBS−5からの456bpに連結した。連結さ
れたDNAをCaCl3 ショックJM83に取り込ま
せ、そしてアンピシリン耐性コロニーをプラスミドDN
Aの制限酵素分析によりスクリーニングした。“067
4−27−38”と称する得られたプラスミドはbp3
75〜bp961のgagコード配列を含有していた
(図7参照のこと)。 【0077】2.trpベクターへのgag配列の挿入 pGAG1(ATCC#53379)を、gag配列を
囲むPstI及びEcoRIポリリンカー制限部位にお
いて0674−27−38を消化することによって造成
した。この断片をゲル精製し、そしてEcoRI及びP
stIで消化されたpATH10に連結した(図8参
照)。連結されたDNAをCaCl2 ショックE.コリ
C600に取り込ませ、そしてアンピシリン耐性コロニ
ーをプラスミドDNAの制限酵素分析によりスクリーニ
ングしてgag配列の存在を確認した。 【0078】B.蛋白質の発現 1.trp−gag蛋白質の発現 trp 発現ベクターにより形質転換されたE.コリC6
00の増殖及び誘導に記載されている通りとした〔Spin
dler等、J. Virol. 49:132(1984); Konop
ka等、J. Virol. 51:223(1984)〕。要約す
れば、トリプトファン(40μg/ml)及びアンピシリ
ン(100μg/ml)を含有する最少培地に、グリセリ
ンストックからの形質転換された細菌を接種した。培養
物を、通気しながら37℃にて一夜培養せしめた。 【0079】次に、この一夜培養物を、アンピシリン
(100μg/ml)を含有するがしかしトリプトファン
を含有しない新鮮な最少培地に1:100で接種した。
これらの培養物を通気しながら2〜3時間(対数期初期
まで)37℃にて増殖せしめた。誘導剤3−β−インド
ール酢酸(シグマ)を、95%エタノール中20mg/ml
の新たに調製したストックから、最終濃度が20μg/
mlとなるように加えた。誘導された培養物を37℃にて
通気しながら4〜5時間増殖せしめ、そして次にペレッ
ト化し、そして場合によっては凍結した。pGAG−1
からの蛋白質の収量は典型的には20〜40mg/lであ
った。 【0080】C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した〔 K
onopka等、J. Virol.51:223(1984)〕。要
約すれば、細菌を、誘導された培養物l当り100mlの
50mM Tris(pH7.5)/0.5mM EDTA/
150mM NaCl(TNE)中に再懸濁した。リゾチ
ーム(シグマ)を1mg/mlの最終濃度に加えた。0℃に
て15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が0.0
5%〜0.2%となるように0℃にて10分間にわたっ
て加えた。 【0081】次に、1〜2mgのDNアーゼ(シグマ)を
150mlのDNアーゼ緩衝液(1.5M NaCl/1
2mM MgCl2 )と共に加えた。反応混合物を、それ
らがもはや粘性でなくなるまで、通常数時間〜一夜イン
キュベートした。次に、8000×g、0℃にて15分
間遠心分離することにより不溶性蛋白質をペレット化し
た。ペレットをTNE中で2回洗浄し、そして次に変性
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により不溶性蛋白質の
存在について分析した。クマッシーブリリアントブルー
で染色することにより蛋白質を可視化した。 【0082】別の方法として、融合蛋白質をSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動により精製した。約200
mlの細胞からの融合蛋白質を代表する約0.5mlの不溶
性ペレットを2mlの2%デオキシコレート/1M KC
lで3回洗浄し、そして次にTNEで2回洗浄した。次
に、このペレットを0.4mlの5% SDS/100mM
Tris(pH6.8)/20%グリセロール/1.4
M β−メルカプトエタノール中に渦動により再懸濁し
そして100℃にて10分間加熱した。痕跡量の不溶物
を回転除去し、そして上清を8%ポリアクリルアミドゲ
ルに負荷した。蛋白質バンドを、ゲルの縁の染色マーカ
ーレーンによりクマッシーブリリアントブルーを用いて
可視化した。融合蛋白質を含有するゲルの領域を切取
り、そして0.1% SDS/25mM Tris(pH
8.0)の緩衝液を満たした透析バッグに入れた。次
に、融合蛋白質をゲルから電気泳動溶出し、そして緩衝
液中に集めた。 【0083】D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−1により発現された不溶性蛋白質調製物から
のアリコートを2%ドデシル硫酸ナトリウム/100mM
Tris(pH6.8)/20%グリセリン/1.5M
β−メルカプトエタノール中に可溶化し、そしてポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動した。蛋白質をニトロ
セルロース(BA85、シュライヒェル・アンド・シュ
エル,キーン,NH)上に電気移送し、そしてフィルタ
ーを5%ウシ血清アルブミン(シグマ)によりブロック
した。次に、フィルターをAIDS患者からプールされ
た、E.コリ−吸着されたヒト血清によりプローブし
た。このフィルターを、HRP−接合ヤギαHuIgに
より発色せしめた。このプールは両trp−gag融合
蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白質のみとは反応性
でなかった。 【0084】2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−2及びGAG−3蛋白質を
0.05M炭酸塩/炭酸水素塩緩衝液(pH9.6)中に
最終濃度がそれぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/ml
となるように稀釈した。ミクロタイター当り50μlの
アリコートを負荷し、そして4℃にてインキュベートし
た。次に、プレートをBLOTTO(5w/v%脱脂粉
乳/0.01%チメロソル/0.01%アンチホーム
A、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15
M塩化ナトリウム)により1時間室温にてブロックし
た。血清を、BLOTTO及びPBS(0.01Mリン
酸ナトリウム、pH7.3/0.15M NaCl)の
1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウエル当
り50μlの稀釈された血清を加えて37℃にて1時間
置いた。 【0085】血清を除去し、そしてプレートを3回洗浄
緩衝液(0.15M NaCl/0.05w/v%トゥ
イーン20)中で3回洗浄した後、100μlのヤギ抗
−ヒトIgG/ホースラディッシュパーオキシダーゼ接
合体(50%ストックを、50mMクエン酸ナトリウム/
0.05%トゥイーン20/1%熱失活した正常ヤギ血
清、アンチボディーズ社,デービス,CAから入手した
ものに1:10,000稀釈したもの)を加えて37℃
にて1時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを
0.15M NaCl/0.05(w/v)%トゥイー
ン20で3回洗浄した。100μl/ウエルの基質溶液
(50mlの0.05Mクエン酸ナトリウム、pH7.0中
10mg 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジジ
ン)を加えて30分間室温に置くことによりELISA
を発色せしめた。100μl/ウエルの3N H2 SO
4 により反応を停止し、そして450nmにおける光学濃
度を自動ELISAリーダーにより決定した。pGAG
−1により生産された蛋白質は既知の血清反応陽性の血
清のパネルと反応性であることが見出された。 【0086】パネルはLAVに対する血清反応陽性24
1及びLAVに対する血清反応陰性271(ウイルスを
基礎ELISAにより定義されたもの)を含んだ。これ
らの血清は放射性標識されたLAV抗原の免疫沈澱によ
り確認されていた。表3は、陽性及び陰性血清サンプル
の両者が高及び低危険群の両者の個体から導かれること
を示している。pGAG1に反応する抗体は、程度は異
るが、すべての診断群に見出された。なお、pGAG1
に対する反応性は、健康であるか又はAIDSへの進行
の初期段階(例えば、PGL又は永続的な一般化された
リンパ腺症)の個体に比べ、より少数の個体において見
出された。これは、LAVへの暴露の後早期にコアー蛋
白質に対する反応性を示すが疾患の進行に従ってコアー
蛋白質への反応性の喪失を示す報告と一致する。図9
は、すべての血清サンプルから得られた光学濃度のヒス
トグラムである。 【0087】pGAG1の抗原としての有用性を小測定
においてELISAによりさらに試験した。この方法に
おいては、env組換蛋白質であるpENV3に対して
弱い反応性を示すか又は非反応性である血清をpGAG
1との反応性について試験した。pENV3及びpGA
G1のそれぞれ単独、並びに組合わせに対して試験され
た8個の陽性血清及び4個の陰性血清について、ELI
SA値を表4に示す。これらの血清の内3種(14−0
085,07−3915、及び14−0100)はいず
れもpENV3に対して非反応性であるか又は弱く反応
するが、しかしウイルス及びpGAG1に対して非常に
反応性であった。 【0088】ウイルスに弱く反応する2種類の血清(0
8−0030及び10−0056)はpENV3のみ又
はpGAG1のみと非常に弱い反応性を有した。しかし
ながら、この両組換体との反応は、血清反応陰性対照か
らより容易に区別できる陽性ELISA値を与えた。こ
れらの結果は、pGAG1はpENV3に対して低い反
応性を有する陽性の血清を検出するのに有用であるこ
と、及びpGAG1とpENV3との組合わせが、血清
反応陽性個体と血清反応陰性個体との間の識別において
いずれか一方より効果的であることを示している。 【0089】 【表3】 【0090】3.LAVに対する血清抗体の検出のため
に蛍光スライド試験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテックス
ビーズに接合せしめ、そして蛋白質/ビーズ調製物を顕
微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清のア
リコートをスライド上で蛋白質/ビーズとインキュベー
トする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対比
染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを
加える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバ
スリップをそれぞれに適用する。 【0091】他の方法として、蛋白質/ビーズ調製物を
試験管に入れて患者の血清とインキュベートする。この
試験管を遠心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染
色中FITC−標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。試験管を遠心し、そして上清を吸引除去する。ビ
ーズのアリコートを顕微鏡スライドに置き、エタノール
固定し、そしてオーバスリップを置く。すべてのスライ
ドを蛍光顕微鏡により試験する。試験血清が抗体反応陽
性である場合、ビーズは蛍光青色球として現われる。試
験血清が抗体反応陰性である場合、ビーズは赤色球とし
て現われる。 【0092】4.trp−gag蛋白質及びtrp−e
nv蛋白質の組合わせの反応性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtr
p−env蛋白質と混合した。次に、GAG−1又はE
NV−3のみについて前記したのと同様にしてELIS
Aを行った。表4は、GAG−1とENV−3との組み
合わせが、血清陽性個体を検出するために、いずれかの
蛋白質のみよりも高い感度を示すことを示している。蛋
白質を組み合わせた場合血清反応陽性サンプルの内7/
7が検出され、他方GAG−1又はENV−3のみによ
り検出した場合、6/7が検出された。 【0093】 【表4】 【0094】以上の記載から、この発明の特定の具体例
を説明のために記載したが、この発明の本質及び範囲を
逸脱することなく種々の変更を行うことができることが
予想されよう。従って、この発明は添付された請求の範
囲によるほか限定されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、λJ19からのpSS−5及びpBS
−5の造成を示す。 【図2】図2は、ポリリンカー配列を含有するtrpE
発現ベクターpJH12及びpJH14を示す。 【図3】図3は、pGAG−2及びpGAG−3中のL
AV挿入部の由来を示す。 【図4】図4は、pJH12及びpSM002からのp
GAG−2の造成を示す。 【図5】図5は、pJH14及びpBPB14からのp
GAG−3の造成を示す。 【図6】図6は、trpE発現ベクターpATH10を
示し、ポリリンカー領域中の開裂部位のリーディングフ
レームを含む。 【図7】図7は、pGAG1中LAV挿入部の由来を示
す。 【図8】図8は、pBS−5,pUC18及びpATH
10からのpGAG1の造成を示す。 【図9】図9は、血清サンプルから得られた光学濃度値
のヒストグラムである。
−5の造成を示す。 【図2】図2は、ポリリンカー配列を含有するtrpE
発現ベクターpJH12及びpJH14を示す。 【図3】図3は、pGAG−2及びpGAG−3中のL
AV挿入部の由来を示す。 【図4】図4は、pJH12及びpSM002からのp
GAG−2の造成を示す。 【図5】図5は、pJH14及びpBPB14からのp
GAG−3の造成を示す。 【図6】図6は、trpE発現ベクターpATH10を
示し、ポリリンカー領域中の開裂部位のリーディングフ
レームを含む。 【図7】図7は、pGAG1中LAV挿入部の由来を示
す。 【図8】図8は、pBS−5,pUC18及びpATH
10からのpGAG1の造成を示す。 【図9】図9は、血清サンプルから得られた光学濃度値
のヒストグラムである。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
C12R 1:19)
(31)優先権主張番号 828828
(32)優先日 昭和61年2月12日(1986.2.12)
(33)優先権主張国 米国(US)
(72)発明者 コサンド,ウェスレイ
アメリカ合衆国,ワシントン 98011,
ボーテル,ノースイースト ワンハンド
レッドフィフティセカンド ストリート
9022
(72)発明者 マクアードル,スーザン
アメリカ合衆国,ワシントン 98105,
シアトル,エヌ.イー.アパートメント
ディー.,フォース アベニュ 3911
(72)発明者 トラビス,ブルース,マクファーランド
アメリカ合衆国,ワシントン 98115,
シアトル,トゥエンティーナインス ア
ベニュ ノースイースト 6029
(72)発明者 ワード,パメラ,ジューン
アメリカ合衆国,ワシントン 98121,
シアトル,ファースト アベニュ 3005
(56)参考文献 特開 昭64−63392(JP,A)
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 15/00 - 15/90
BIOSIS(DIALOG)
WPI(DIALOG)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1. LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチド。 2. bp631-bp1224(pGAG-2)によりコードされている請
求項1に記載のポリペプチド。 3. bp375-bp961(pGAG-1)によりコードされている請
求項1に記載のポリペプチド。 4. bp691-bp1642(pGAG-3)によりコードされている請
求項1に記載のポリペプチド。 5. LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドの
製造方法において、上記ポリペプチドをコードする DNA
及び発現制御配列を含んで成る発現ベクターにより形質
転換された宿主細胞を培養し、該培養物から前記ポリペ
プチドを単離する、ことを特徴とする方法。 6.前記ポリペプチドを単離した後、該生成物をゲル浸
透クロマトグラフィーによりさらに精製することを含ん
で成る請求項5に記載の方法。 7.前記制御配列が trpオペロンに由来する請求項5又
は6に記載の方法。 8. LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドを
含んで成る、 LAV/HTLV-IIIに対する抗体の生物学的液
体中での存在を決定するための測定において使用するた
めの試薬。 9. LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp
1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ L
AVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドを
含んで成る、生物学的液体中での LAV/HTLV-III抗体の
存在を決定するための測定において使用するための試
薬。 10. LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-
bp1224、又はbp691-bp1642によりコードされており且つ
LAVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチド
を含んで成る、 LAV/HTLV-IIIに対する抗体の製造にお
いて使用するための免疫原。 11. LAV/HTLV-IIIに対する抗体の生物学的液体中
での存在を決定するための、2種類以上の蛋白質を含ん
で成る蛋白質組成物において、その少なくとも1つが、
LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、bp631-bp1224、
又はbp691-bp1642によりコードされており且つ LAVに対
する抗体と免疫的に反応性であるポリペプチドであるこ
とを特徴とする組成物。 12.生物学的液体中での LAV/HTLV-III抗原の存在を
決定するための測定において使用するための2種類以上
の蛋白質を含んで成る蛋白質組成物において、その少な
くとも1つが、 LAVゲノムの gag領域の bp375-bp961、
bp631-bp1224、又はbp691-bp1642によりコードされてお
り且つ LAVに対する抗体と免疫的に反応性であるポリペ
プチドであることを特徴とする組成物。
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US721237 | 1985-04-08 | ||
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US753769 | 1985-07-10 | ||
US76346085A | 1985-08-07 | 1985-08-07 | |
US763460 | 1985-08-07 | ||
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FR2593519B1 (fr) * | 1985-09-25 | 1994-01-07 | Oncogen | Vaccin contre le syndrome immunodeficitaire acquis et intermediaires pour la preparation de ce vaccin |
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