JP2869063B2 - ＬＡＶに対する抗体と免疫的に反応性であるｇａｇによりコードされたペプチドの発現及び使用 - Google Patents
ＬＡＶに対する抗体と免疫的に反応性であるｇａｇによりコードされたペプチドの発現及び使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
この発明は一般に、組換技法により製造されるウイル
ス蛋白質に関し、そしてさらに詳しくはリンパ腺症関連
ウイルス（LAL）に対する抗体と免疫的に反応性である
蛋白質に関する。 従来の技術 後天性免疫不全症候群（AIDS）は日和見感染及び若干
のまれな悪性腫瘍により特徴付けられる細胞性免疫の伝
染性疾患である。 AIDSについての主たる危険群には同性愛の男性、静脈
投与剤の乱用者、輸注剤及び血液製剤の受容者、並びに
高危険個体の異性パートナー及び子供が含まれ、密接な
接触及び血液製剤を介して伝達される感染体の関与が示
唆される。 最近の証明によれば、疾患の伝染を担当する感染体は
リンパ腺症関連ウイルス（LAL）として知られる新しい
リンパ趨向性レトロウイルスである〔Barre−Sinoussi
等、Science 220:868（1983）〕。他の科学者グループ
によって類似のウイルスが報告されており〔Popovic
等、Science 224:497（1984）;Levy等、Science 225:
840（1984）;Vilmer等、Lancet １:753（1983）〕、そ
してヒトＴ−細胞リンパ趨向性ウイルスタイプIII（HTL
V−III）、AIDS関連レトロウイルス（ARV）、又は免疫
不全関連ウイルス（IDAV）と命名されている。さらに最
近のデーターは、LAV,HTLV−III,ARV、及びIDAVは、実
質的なヌクレオチドの相同性を含む幾つかの特徴を共有
し〔Wain−Hobson等、Cell 40:9（1985）;Muesing等，
Nature，313:450（1985）;Sanchez−Pescader等、Scien
ce 227:484（1985）〕、そして同じウイルスの単離体
であると考えるべきであることを示している。但し、ウ
イルス単離体間の株対株変異が存在する可能性もある。
実質的なヌクレオチドの相同性を示すことに加えて、単
離体形態、細胞病理、最適逆転写酵素活性の要求性、及
び少なくとも幾つかの抗原性に関して類似している〔Le
vy,前掲;Schupbach等、Science 224:503（1984）〕。 前記のごとく、このウイルスは血液製剤（血液、血
清、血漿、及びこれらの画分）を介して伝染し得ること
が知られており、このため、提供者がこのウイルスに暴
露されたことがあるか否かを決定するために血液製剤を
スクリーニングすることが重要である。これは、LAV及
び関連ウイルスに対する抗体の検出のためのエンザイム
−リンクドイムノソルベントアッセイ（ELISA）を含む
幾つかの方法の内任意の方法により行うことができる。
LALに対する抗体を含有する血液を有する個体は“血清
反応陽性”（seropositive）であると言われる。血清反
応陽性提供者からの血液は検出の後血液供給から除去さ
れ、こうして疾患の拡散が防止される。 LAVに暴露された個体の免疫反応は多様である。p13,p
18,p25,p36,gp43,p55,gp110等を含む幾つかのウイルス
蛋白質のいずれに対しても抗体が生産され得る〔Schupb
ach等、N.Engl. J.Med．312:265（1985）〕。すべての
個体が同じ蛋白質又は所与の蛋白質の同じエピトープに
対する抗体を生産するわけではないであろう。 血清反応陽性個体の検出は、最近行われている所で
は、幾つかの本質的な問題点を有する。これらの問題点
の内主要な点は、免疫的測定のために全体ウイルスから
抗原を単離する必要があることである。この単離は、潜
在的に感染性の生ウイルスの大量操作を必要とし、そし
てこのこと自体かなり安全性を脅やかす。さらに、調製
ごとにウイルスの収量、純度及び再現性に関する懸念が
存在する。このことが許容されない数の偽陽性及び／又
は偽陰性をもたらす。従って、血液のスクリーニング測
定において有用でありそして他の関連する利点をさらに
もたらすウイルス抗原を製造するための他の方法が当業
界において求められる。 発明の開示 要約すれば、この発明は、LAVゲノムの群特異的抗原
（gag）領域の部分、すなわちLAVに対する抗体と免疫的
に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成るDNA配
列を開示する。細菌宿主中で複製することができる組換
プラスミドも開示される。このプラスミドは、発現のた
めの原核性の転写及び翻訳シグナル、並びにリーディン
グフレームを合わせてこれに続く前記のDNA配列を含有
する。好ましい態様においては、シグナルは誘導性及び
／又は抑制性であるtrpオペロンのごときオペロンから
選択される。上記の組換プラスミドにより形質転換され
た、E.コリ（E.coli）のごとき細菌の細胞も開示され
る。 この発明の他の観点は、LAVに対する抗体と免疫的に
反応性である蛋白質の製造方法を開示する。この方法
は、細菌宿主細胞中で複製可能な組換プラスミドを細菌
宿主細胞に導入することを含んで成る。このプラスミド
は、発現のための原核性の転写及び翻訳シグナル、並び
にリーディングフレームを合わせてこれに続くLAVゲノ
ムのgag領域の部分、すなわちLAVに対する抗体と免疫的
に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成る。プラ
スミドの導入に続き細胞宿主を適当な培地中で増殖せし
める。次に蛋白質の発現を誘導し、そしてその配列の蛋
白質生成物を細菌宿主から単離する。単離に続き、蛋白
質生成物を、例えばゲル浸透クロマトグラフィーにより
精製する。 この発明の他の観点は、LAVに対する抗体の生物学的
流体中での存在を検出する方法を開示する。この方法
は、生物学的流体を、前記の組換プラスミドにより形質
転換された細菌細胞により生産された蛋白質と共にイン
キュベートし、これによって反応混合物を形成し、そし
て次にこの反応混合物を分析して抗体の存在を決定する
ことを含んで成る。好ましい態様においては、反応混合
物を分析する段階は、反応混合物を抗体に対するラベル
された特異的結合パートナーと接触せしめることを含ん
で成る。 この発明の他の観点は、生物学的流体中のLAL抗原の
存在を決定するための方法を開示し、この方法は生物学
的流体を、前記の組換プラスミドにより形質転換された
細菌細胞により生産された標識化蛋白質と共にインキュ
ベートし、そしてこれに続いて又はこれと同時に該蛋白
質に対する抗体と共にインキュベートして特異的結合を
生じさせる。次に、インキュベーションの間に形成され
た反応混合物を分析して抗体と結合した標識の量を決定
する。 前記の組換プラスミドにより形質転換された細菌細胞
により生産された蛋白質により動物を免疫感作すること
を含んで成る、LAVに対する抗体の製造方法も開示され
る。 この発明の他の観点は、LAVに対する抗体の生物学的
流体中での存在を決定するための方法を開示し、この方
法は、細菌宿主細胞中で複製することができそして発現
のための原核性の転写及び翻訳シグナルを含有する組換
プラスミドにより形質転換された細菌細胞により生産さ
れた蛋白質にラテックスビーズを接合せしめることを含
んで成る。前記シグナルに続き、LAV遺伝子のgag領域の
部分、すなわちLAVに対する抗体と免疫的に反応する蛋
白質をコードする部分を含んで成るDNA配列が存在す
る。次に、生物学的流体をビーズ／蛋白質接合体と共に
インキュベートし、これによって反応混合物を形成す
る。次に、この反応混合物を分析して抗体の存在を決定
する。 この発明において製造される蛋白質は、適当な担体又
は稀釈剤と共に使用される場合、免疫的に有効なワクチ
ン組成物を構成する。LAVゲノムのgag領域の部分を含ん
で成るDNA配列によりコードされた蛋白質の免疫的有効
量を医薬として許容される担体と共に個体に投与するこ
とにより、AIDSの原因となるウイルスにより惹起される
感染が回避され得る。 発明の実施の形態 発明を記載するに先立ち、以下に使用される幾つかの
用語の定義を記載するのが発明の理解のために有用であ
ろう。 リンパ腺症関連ウイルス（LAV）：ヒトＴ−リンパ趨向
性レトロウイルス。この発明の目的のため、ウイルスが
下記の規準を実質的に満たす場合、それをLAVと同一で
あるか又は同等のものと考える。 （ａ）Ｔ−リンパ球、特にＴ−ヘルパー細胞〔CD4+、Be
rnard等編、Leucocyte Typing,ニューヨーク，スプリン
ガーベルラーク（1984）中に定義された国際命名法に従
う〕に対して向性である； （ｂ）このウイルスは感染されたCD4+細胞に対して細胞
変性的（cytopathic）である（HTLV−Ｉ及びIIのように
形質転換的ではなく）； （ｃ）このウイルスは、Mg2+−依存性であり（最適濃度
5mM、最適pH7.8、アクチノマイシンＤにより阻害され
る）そしてオリゴ（dT）12-18をプライマーとしてその
３′LTRからの逆転写のために使用することができるRNA
−依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードす
る； （ｄ）このウイルスは、シュークロース勾配中で約1.16
の密度においてバンドを形成する； （ｆ）このウイルスは、免疫学的規準及びヌクレオチド
配列規準によりHTLV−I/IIファミリーのウイルスから区
別される（この規準によりHTLV−IIIはHTLV−I/IIファ
ミリーの一員であるとは考えられない）； （ｇ）このウイルスは、LAVのgag及びenv領域によりコ
ードされた蛋白質と免疫学的に実質的に交差反応する；
そして、 （ｈ）このウイルスは、LAVと実質的なヌクレオチド配
列の相同性（75〜100％）及びアミノ酸配列の相同性（7
5〜100％）を有する。 免疫的に反応性：抗原及び抗体が相互に特異的に、典型
的には106M-1以上、そしてしばしば108M-1以上の親和性
をもって、結合することができる場合、これらは“免疫
的に反応性である”と言われる。 形質転換、又は形質転換された：精製されたDNAの導入
により受容細胞又は微生物の遺伝子型を安定に且つ遺伝
的に変更する過程。 リンパ腺症関連ウイルス（LAV）はAIDS又はリンパ腺
症の症状を有する患者から単離することができる。この
ような患者のリンパ腺を典型的には生検採取し、そして
必要により増殖を支持するように補充された培地に入れ
る。インターロイキン−２（IL−２）又はフィトヘマグ
ルチニン（PHA）のごときマイトジエンを含有せしめる
ことができ、ヒト−インターフェロンに対する抗血清を
含めることもできる。逆転写酵素活性は典型的には約15
日の培養で表われ、ウイルスの存在が示される。非イオ
ン性洗浄を用い、次にシュークロース勾配中でバンド化
することによってウイルスを濃縮することができる。こ
れらの精製法及び他の精製法は当業者において良く知ら
れており、例えばMontehro等、J.Virology 42:1029（1
982）に記載されている。 LAVは多くの方法のいずれかにより増殖し得る。これ
はへその緒、末梢血又は骨髄由来のＴ−リンパ球中で培
養することができる。別の方法として、これは不滅化さ
れたＴ−細胞又はＢ−細胞中で増殖することができる。
例えば、Popovic等、Science 224:497（1984）；及びM
ontagnier等、Science 225:63（1984）を参照のこと。
ウイルスの増殖は通常逆転写酵素活性の存在によりモニ
ターされる。 LAVのゲノムクローンは当業界においてよく知られて
いる幾つかの方法のいずれかにより調製することがで
き、これらの方法にはHahn等、Nature 312:166（198
4）;Alizon等、Nature 312:757（1984）;Lucin等、Nat
ure 312:760（1984）；及びMuesing等、Nature 313:4
50（1985）により記載された方法が含まれるが、これら
に限定されない。 要約すれば、これらの方法の１つ（Alizon等）におい
ては健康な提供者のＴ−細胞にLAVを感染させたものか
らDNAを単離し、Hind IIIのごとき制限酵素により部分
消化し、そして得られた消化物を電気泳動的に分画す
る。完全なLVAゲノム（約9.2Kb）のサイズに相当するサ
イズの断片をゲルから溶出し、沈澱せしめ、再懸濁し、
そして適切に制限酵素処理されたベクターのアームに連
結する。連結混合物をバクテリオファージ粒子にパッケ
ージする。このバクテリオファージにより細胞を形質転
換し、そしてクローンをその場でLAV挿入部について、
適当なプローブ（例えば、LAV−RNAから調製されたcDN
A）を用いてスクリーニングする。陽性クローンから、L
AVの所望の領域を細菌プラスミドベクター、例えばpUC1
8にサブクローニングすることができる。不所望の配列
を除去し、そして発現ベクターへのクローニングを促進
する目的でいずれかの末端に追加の制限部位（ポリリン
カーの形で）を加えるためさらにサブクローニングする
のが好ましい場合がある。 次に、LAV配列を誘導性の発現ベクターにサブクロー
ニングすることができる。種々の発現ベクターが当業界
において知られており、そしてλgt11:Tn〔Hall等、Nat
ure 311:379（1984）;trpE（Eur. J.Cell Biol.31:1
71（1983）;pIN III（Masui等、Biotechnology,1984年
１月、81頁）を含む。 得られた蛋白質は部分的に精製することができ、そし
免疫源として及びイムノアッセイにおける抗原として使
用を含む種々の目的のために使用することができる。免
疫源としての使用のためには、蛋白質を緩衝液中又はア
ジュバント中で、動物、例えばマウス、ラビット、ヤギ
等に注射することができる。他の方法として、蛋白質を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、そして
注目のバンドをゲルから切り出し、すりつぶし、そして
宿主動物に注射するために緩衝液中に再懸濁することが
できる。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を
調製することができる。イムノアッセイにおける抗原と
して使用するため、蛋白質をラベル化形又は非ラベル化
形のいずれかとして使用することができる。これらが標
識される場合、ラベルは放射性同位元素、蛍光物質、酵
素、発酵剤、粒子等を包含することができる。これらの
標識及び他の標識が当業界においてよく知られており、
そして例えば米国特許出願No.3,766,162、No.3,791,93
2、No.3,817,837、No.3,996,345、及びNo.4,233,402に
記載されている。 この発明の組換蛋白質を用いる測定法は不均一法（す
なわち、分離段階を必要とする）、又は均一法であるこ
とができる。測定法が不均一法である場合、遠心分離、
濾過、クロマトグラフィー、又は磁気を含む種々の分離
手段を用いることができる。 抗体の存在について血液製剤又は他の生理的流体をス
クリーニングするための１つの好ましい測定法はELISA
である。典型的には、抗体（この場合、組換蛋白質の１
つ又はその組み合わせ）をミクロタイターウエルの表面
に吸着せしめる。次に、表面上の残留蛋白質結合部位を
適当な薬剤、例えばウシ血清アルブミン（BSA）、熱不
活性化正常ヤギ血清（NGS）、又はBLOTTO（防腐剤塩及
び消泡剤をさらに含有する脱脂粉乳の緩衝化溶液）によ
りブロックする。次に、ウエルを、特異抗体を含有する
と予想されるサンプルと共にインキュベートする。サン
プルはそのまま適用することができ、又は一層しばし
ば、通常少量の（0.1〜5.0重量％）の蛋白質、例えばBS
A,NGS又はBLOTTOを含有する緩衝化溶液中に稀釈するこ
とができる。特異的結合が起こるのに十分な時間インキ
ュベートした後、ウエルを洗浄して未結合の蛋白質を除
去し、そして次に標識された抗−ヒト免疫グロブリン
（αHuIg）と共にインキュベートする。この標識は、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP）、β−ガラ
クトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及びグルコ
ースオキシダーゼを包含する種々の酵素から選択するこ
とができる。特異的結合が生ずるのに十分な時間の後、
ウエルを再び洗浄して未結合の接合体を除去し、そして
酵素のための基質を加える。発色させ、そしてウエルの
内容物の光学濃度を視覚的に、又は装置を用いて決定す
る。 便利のため、ELISA用試薬はキットの形で供給され
る。これらのキットは、組換技法によって作られたウイ
ルス蛋白質が前吸着されるミクロタイタープレート、種
々の稀釈剤及び緩衝剤、特異的に結合した抗体を検出す
るための標識された接合体、及び他のシグナル発生試
薬、例えば酵素基質、コーファクター及び色原体を含む
ことができる。 LAVに感染された個体は、p13,p18,p25,p36,gp43,p55,
gp110等を含む多数のLAV蛋白質に対する抗体を含有す
る。すべての個体が同じ蛋白質に対する抗体を生産する
わけではないが、個々の血清は最も一貫してgag蛋白質p
25及びp18,並びにenv蛋白質gp43及びgp110と反応性であ
る。個体間の差異は疾患の進行程度を含む種々の因子に
よる。例えば、コア蛋白質に対する抗体は疾患の最も早
期には支配的であるが、しかし免疫抑制の進行と共に減
少する。これに対して、エンベロープ糖蛋白質に対する
抗体力価は疾患の後期を通じて持続すると考えられる。 応答における他の差異はウイルス蛋白質をコードする
遺伝子中の多型性（ポリモルフィズム）に基くであろ
う。LAVの異る単離体はenv蛋白質の有意な変化を有す
る。興味あることには、gag蛋白質配列は高度に保存さ
れている。 試験されたすべての血清反応陽性サンプルにおいて、
gag蛋白質の少なくとも１つ（p18又はp25）あるいはenv
蛋白質の１つ（gp43又はgp110）に対する抗体が見られ
た。しかしながら、これらの蛋白質はいずれも血清反応
陽性個体により普遍的には認識されなかった。従って、
血液を少なくとも１つのgag及び１つのeng蛋白質に対す
る抗体についてスクリーニングすることが必須のようで
ある。先行特許出願である米国出願No.721,237“Expres
sion of Immunologically Reactive Viral Proteins"に
おいて、開示されている発明は、LAVに対する抗体と免
疫的に反応性である蛋白質をコードする、LAVゲノムの
エンベロープ（env）領域の部分を用いる。本発明は、
やはりLAVに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質
をコードする、LAVゲノムのgag領域の部分を用いる。組
み合わせにおいて、gag領域によりコードされる蛋白質
及びenv領域によりコードされる蛋白質を用いて高い感
度をもって血清反応陽性個体を検出することができる。 この発明の組換蛋白質の他の用途はヒト用のワクチン
としてである。組換蛋白質は高度に精製し、そして便利
な方法で、一般に宿主kg当り１μｇ〜20mgの濃度で、製
剤化することができる。生理的に許容される担体、例え
ば無菌水、塩溶液、緩衝化塩溶液等を使用することがで
きる。助剤、例えば酸化アルミニウムを使用することも
できる。ワクチンは静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、
又は腹腔内注射により投与することができる。１回の注
射で十分な場合もあるが、一層しばしば週〜月間隔での
多数の注射が好ましい。 別の方法として、LALゲノムの領域を発現するワクチ
ニアウイルス組換体を造成することができる。例えば、
この発明の造成物をプラスミドpMM34（Mackett等、Scie
nce 227:433,1985）に挿入し、そして生ずるキメラプ
ラスミドを含有するワクチニアウイルスハイブリドを相
同組換により形成することができる。このような組換ウ
イルスワクチンによる免疫感作は、肝炎Ｂウイルス及び
水疱性口内炎ウイルスに対する動物における保護免疫を
生じさせるのに効果的であることが示されている（Smit
h等、Nature 311:578,1984）。 この方法による組換蛋白質ワクチンの使用は、病原性
微生物の不活性化調製物又は非毒性株からワクチンを構
成する必要性を除去する。 次の例において、LAV−gagのオーバラップする領域
（図３）、並びにp18のほとんど及びp25の部分を含むga
g領域の他の部分を発現のために選択した。この選択
は、p18及びp25がLAVに感染した個体からの血清と最も
再現性よく反応するgag蛋白質であるという知見に影響
された。これらの配列内での本発明者等の選択は、親水
性領域及びプロテアーゼ開裂部位（この両者は蛋白質の
表面で露出され、そして免疫原的である）の存在並びに
選択されたベクター（trpE）中での効果的な発現のため
のサイズの限界により指示された。 λJ19と称するLALゲノムクローンを細菌プラスミドベ
クターpUC18にサブクローン化した。pBT−１と称する得
られるサブクローンをさらにサブクローン化して主とし
てgag及びpol配列を含有するpSS−５及びpBS−５を得
た。 １つの方法において（例１）、gag配列をさらにpIC19
Rにサブクローン化し（プラスミドpSM002及びpBPB14が
形成される）、そして次にgag配列の領域をtrpE誘導性
発現ベクターに移した。gagDNAをtrpE遺伝子の下流にフ
レームを合わせて挿入し、この造成物によりE.コリを形
質転換した場合にtrpE−gag融合蛋白質の発現が得られ
た。生ずる蛋白質を部分的に精製し、そして既知の血清
反応陽性個体及び既知の血清反応陰性個体からの血清と
のELISAにおけるそれらの反応性により特徴付けた。pGA
G−２及びpGAG−３と称する２つの有用な造成物が固定
された。 他の方法において（例２）、gag配列の部分（bp375−
547）をpUC18ampにさらにサブクローン化した（プラス
ミド0674−14−10が形成される）。次に、gag配列の第
２領域（bp505−961）をプラスミド0674−14−10に移
し、プラスミド0674−27−38を生成せしめた。次に、ga
g配列（bp347−961）をtrpE誘導性発現ベクターpATH10
に移した。gagDNAをtrpE遺伝子の下流にフレームを合わ
せて挿入し、この造成物によりE.コリを形質転換した場
合trpE−gag融合蛋白質の発現が得られた。生じた抗体
を部分的に精製し、そして既知抗体陽性個体及び既知の
抗体陰性個体からの血清とのELISAにおけるそれらの反
応性により特徴付けた。pGAG−１と称する１つの有用な
造成物を同定した。 次の例は、制限的にではなく、例示的に与えられる。 例1. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質を発現するために幾つかの細菌発現系のい
ずれかを使用することができる。trpE系をLAV−gagの発
現のために使用した。なぜなら、これは強力な誘導性プ
ロモーターを含有するが、しかしその発現は、外来性の
（そして潜在的に毒性の）蛋白質が長期間にわたって細
菌内に蓄積しないように抑制され得るからである。 発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ及びリーデ
ィングフレームにより限定される。例えば、rtpE発現ベ
クターは、DNA挿入部が対応末端にBamH I,Hind III、又
はEcoR I制限部位を有することを必要とする。まず注目
の領域を広範囲の又は異る配置の制限部位を有する中間
体ベクターにサブクローン化することにより、一層の多
様性を得ることができる。次に、中間体ベクターにより
提供される制限部位を用いることにより、注目の領域を
発現ベクターに導入することができる。 従って、本発明者等の方策は、まずLAVゲノムgag領域
のほとんどをトランスファーベクターpIC19Rに挿入する
ことであった。次に、これらのサブクローンの種々の断
片を、ポリリンカー領域中の制限部位のリーディングフ
レームにおいてのみ異る（図２）２つのtrp発現ベクタ
ー（pJH12,pJH14）のいずれかに連結した。 1.LAVゲノムのサブクローニング a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHind III部位中の9.2KbのゲノムDNA挿入部を
含有するλファージ粒子の形で入手した。このクローン
はλJ19と称され、そしてWain−Hobson等、Cell 40:9
（1985）に記載されている。λJ19ファージ粒子をE.コ
リＫ−12のQ359株（Q359の遺伝子型はhsdRK-,hadMK+,su
pF,φ80,P2）に、Maniatis等、Molecular Cloning:A La
boratory Manual,ニューヨーク，コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー,1982、64頁の方法に従ってトラン
スフェクトした。単一プラークを拾い、そしてファージ
をプレート・ライセート法（Maniatis,前掲、65頁）に
より増幅した。37℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（100mm直
径）に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO4/50mM Tris（pH
7.5）を重層した。４℃にて12時間インキュベートした
後、液体を集めて、そして同容量のクロロホルムで２回
抽出した。 ファージ粒子を含有する得られた水相10mlに2mlの0.2
5M EDTA/2.5％ SDS/0.5M Tris（pH9）を加え、そし
てこの懸濁液を70℃にて15分間インキュベートしてファ
ージを破壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そ
してこの溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に４
℃にて12,000×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化し
た。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そして
同容量のフェノール〔pH8、1M Tris（pH8）により平衡
化したもの〕により20℃にて抽出した。次に水相を同容
量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）によ
り20℃にて抽出した。次に、水相に2.5容量の95％アル
コールを加えてDNAを沈澱せしめた。遠心した後、DNAペ
レットを乾燥し、そして10mM Tris・HCl（pH7.4）/1mM
EDTA中に再懸濁した。 b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μｇのλJ19DNAを、LAVのこ
の単離体のLTR領域においてのみ切断する制限酵素Sst I
（ベセスダ・リサーチ・ラブス，ベセスダ,MD）により
完全に消化した。この消化混合物を、0.089M Tris−ボ
レート/0.089M硼酸/1mM EDTA中0.9％アガロースを通し
て1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定し
た。このバンドをNA45紙に電気溶出した（Schleicher及
びSchuell,Keene,NH）。製造者の指示に従って、紙から
DNAを回収した。 9.1Kb Sst I断片をSst Iで消化されたベクターpUC18
に、挿入分子：ベクター分子の比を10:1にして連結し
た。E.コリHB101株を連結混合物を用いて、Maniatis
等、前掲、のCaCl2法により形質転換し、そしてLB＋ア
ンピシリン（200μg/ml）寒天プレート上にプレートし
た。 単コロニーを拾い、3mlのLB＋アンピシリン培地に稀
釈し、そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せし
めた。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、368頁）に
よりプラスミドDNAを調製した。 プラスミドDNAの制限酵素分析により決定した場合に
ポリリンカー中のEcoR I部位がLAVゲノムの５′末端に
最も近いような方法で9.1Kb Sst I挿入部を含有する１
つのコロニーを選択した。このサブクローンはpBT−１
と命名された（ATCC＃53069）（図１）。 プラスミドpBT−１から２個のサブクローンを作っ
た。第１番目（pSS−５）のため、pBT−１をSal Iで消
化し、そして再連結した。第２番目のpBS−５のため、p
BT−１をBamH I及びBgl IIで消化し、そして再連結し
た。各場合において、LAVゲノムの５′部分がベクター
と共に維持された。HB101細胞を連結されたDNAにより形
質転換し、そしてpSS−５挿入部を有するコロニー及びp
BS−５挿入部を有するコロニーを、精製されたプラスミ
ドDNAの制限分析により同定した。 次に、pSS−５及びpBS−５の領域を中間体ベクターpI
C19Rにサブクローン化した。上記のように、これは、発
現ベクターへの移行のための正しいリーディングフレー
ム内に必要な制限部位を与える。 詳しくは、pBS−５のHind III断片（LAVゲノムのbp63
1−bp1258;番号はWain−Hobson等、Cell 40:9（1985）
を、Hind III及びウシ腸ホスファターゼ処理されたpIC1
9Rに連結した（図４）。連結されたDNAをCaCl2−ショッ
クを受けたE.コリTB−１により取り込ませた。色原体基
質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−ガラ
クトシッド（シグマ）を用いて、アンピシリン耐性コロ
ニーを、gag配列の挿入によるβ−ガラクトシダーゼの
不活性化についてスクリーニングした。挿入部の方向は
プラスミドDNAをPvo IIで消化することにより決定し
た。生ずるプラスミドをpSM002と称する。 Pvu II−Bgl II断片（LAV遺伝子のbp691〜bp1642）
を、Sma I及びBgl IIで消化したpIC19Rに連結した（図
５）。連結されたDNAによりE.コリHB101を処理し、そし
て生じたアンピシリン耐性コロニーを上記の色原体によ
りスクリーニングした。候補コロニーを、プラスミドDN
Aの制限分析によりさらにスクリーニングした。生じた
プラスミドをpBPB14と称する。 2.gag配列のtrpベクターへの挿入 発現ベクターは、pBR322に挿入されたE.コリtrpオペ
ロンプロモーター、オペレーター及びtrpE遺伝子を含有
する（図２）。trpE遺伝子を最もその５′に近いBgl II
部位においてポリリンカー配列の挿入により切断した
〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。異るtrpベ
クター（pJH12及びpJH14）はポリリンカー領域内の制限
部位のリーディングフレームに従って異る。適切なベク
ターへのオープンリーディングフレームの挿入はアミノ
末端におけるtrpE配列との融合蛋白質をもたらす〔Spin
dler等、J.Virol．49:132（1984）〕。 pGAG−２（ATCC＃5311）はHind III gagサブクローン
（pSM002、図４）をBgl II及びBamH Iで消化することに
より造成した。Bgl II及びBamH I部位はpIC19Rの包囲す
るポリリンカー領域内に位置する。gag断片をゲル精製
し、そしてBamH Iで消化されたpJH12に連結した（図
４）。連結されたDNAをCaCl2ショックE.コリHB101に取
り込ませ、そしてコロニーをアンピシリン（100μg/m
l）及びトリプトファン（40μg/ml）の存在下で増殖せ
しめた。その蓄積が細菌にとって不都合である外来蛋白
質の発現を抑制するためにトリプトファンを使用した。
候補アンピシリン耐性コロニーを放射能標識されたgagD
NAプローブとのハイブリダイゼーションにより同定し
た。少量溶菌物（ミニライセート）の制限分析を用いて
挿入部の存在及び方向を確認した。 pGAG−３（ATCC53112）を、図５に示すように、PVU I
I（bp691）及びBgl II（bp1642）の間のgag領域を含有
するpBPB14のEcoR I消化により造成した。EcoR I部位は
gag配列を囲むポリリンカー配列内に存在する。gag断片
をゲル精製し、そしてEcoR I及びウシ腸ホスファターゼ
で処理したpJH14に連結した。E.コリHB101細胞を、連結
されたDNAにより形質転換し、前記のようにしてプレー
トし、そして制限分析によりスクリーニングしてpJB14
中のgag配列の存在及び方向を確認した。 B.蛋白質の発現 1.trp−gag造成物によるE.コリの形質転換 組換trp−gag発現プラスミドのそれぞれをE.コリBH10
1からE.コリC600に移した。後者が蛋白質の生産のため
に一層良好な宿主だからである。移行は、HB101の少量
溶菌物からのスーパーコイルDNAによりCaCl2−ショック
C600を形質転換することにより行った。細菌を前記のよ
うにアンピシリン及びトリプトファンの存在下でプレー
トした〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。薬剤
耐性コロニーを少量溶菌物によりスクリーニングし、適
切なプラスミドの存在を確認した。 2.trp−gag蛋白質の発現 trp発現ベクターにより形質転換されたE.コリC600の
増殖及び誘導は記載されている通りとした〔Spindler
等、J.Virol．49:132（1984）;Konopka等、J.Virol．5
1:223（1984）〕。要約すれば、トリプトファン（40μg
/ml）及びアンピシリン（100μg/ml）を含有する最少培
地に、グリセリンストックからの形質転換された細菌を
接種した。培養物を、通気しながら37℃にて一夜培養せ
しめた。次に、この一夜培養物を、アンピシリン（100
μg/ml）を含有するがしかしトリプトファンを含有しな
い新鮮な最少培地に1:100で接種した。これらの培養物
を通気しながら２〜３時間（対数期初期まで）37℃にて
増殖せしめた。誘導剤３−β−インドール酢酸（シグ
マ）を、95％エタノール中20mg/mlの新たに調製したス
トックから、最終濃度が20μg/mlとなるように加えた。 誘導された培養物を37℃にて通気しながら４〜５時間
増殖せしめ、そして次にペレット化し、そして場合によ
っては凍結した。pGAG−２及びpGAG3からの蛋白質収量
は典型的には10〜30mg/lであった。 C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した
〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。要約すれ
ば、細菌を、誘導された培養物１当り100mlの50mM Tri
s（pH7.5）/0.5mM EDTA/150mM NaCl（TNE）中に再懸
濁した。リゾチーム（シグマ）を1mg/mlの最終濃度に加
えた。０℃にて15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が
0.05％〜0.2％となるように０℃にて10分間にわたって
加えた。次に、１〜2mgのDNアーゼ（シグマ）を150mlの
DNアーゼ緩衝液（1.5M NaCl/12mM MgCl2）と共に加え
た。反応混合物を、それらがもはや粘性でなくなるま
で、通常数時間〜一夜インキュベートした。次に、8000
×ｇ、０℃にて15分間遠心分離することにより不溶性蛋
白質をペレット化した。ペレットをTNE中で２回洗浄
し、そして次に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より不溶性蛋白質の存在について分析した。クマッシー
ブリリアントブルーで染色することにより蛋白質を可視
化した。 別の方法として、約200mlからの細胞ペレットを180μ
ｌの0.14M Tris HCl（pH7.8）/6％ SDS及び20μｌの
β−メルカプトエタノール中に再懸濁し、そして95℃〜
100℃にて20分間加熱することにより、不溶性ペレット
を変性し、そして還元した。次にサンプルをスピード・
バク・コンセントレーター（サーバントインストルメン
ツ，ヒックスビル,NY）中で乾燥した。SDSを除去した
後、サンプルを次のようにして抽出した。ペレットを1m
lのアセトン／トリエチルアミン／酢酸／水（17/1/1/
1）中に再懸濁し、そして激しく渦動し、懸濁液を氷上
で１時間冷却し、濃縮し、そして上清を廃棄した。この
抽出を0.4mlの前記アセトン混合物を用いて２回、そし
て次に0.4mlのアセトンのみを用いて２回反復した。次
に、ペレットをスピード・バク・コンセントレーター中
で乾燥した。 次に、この蛋白質ペレットを1.4mlの6Mグアニジンヒ
ドロクロリド/0.1M Tris−HCl（pH8.5）/10mM DTT中
に溶解し、そして37℃にて４時間インキュベートした。
遠心によりすべての粒状物を除去した。上清に含有され
るサンプルを、6Mグアニジンヒドロクロリド/10mM EDT
A/1mM DTT中で平衡化された1.6×96cmセファクリルＳ
−300カラム（ファルマシア，ピスカトウェイ,NJ）に負
荷した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、そして溶出した
物質の吸光を280nmにて測定した。 画分をELISAにより、LAV血清陽性の血清及びE.コリ血
清陽性の血清を用いて測定してそれぞれ特異的反応性及
び汚染による反応性を決定した。前者の血清とは反応性
を示すが後者の血清とは反応性を示さない画分を使用し
て次に患者のELISAを行った。 D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−２及びpGAG−３により発現された不溶性蛋白質
調製物からのアリコートを２％ドデシル硫酸ナトリウム
/10mM Tris（pH6.8）/20％グリセリン/1.5M β−メル
カプトエタノール中に可溶化し、そしてポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動した。蛋白質をニトロセルロース
（BA85、シュライヒェル・アンド・シュエル，キーン,N
H）上に電気移送し、そしてフィルターを５％ウシ血清
アルブミン（シグマ）によりブロックした。次に、フィ
ルターをAIDS患者からプールされた、E.コリ−吸着され
たヒト血清によりプローブした。このフィルターを、HR
P−接合ヤギαHuIgにより発色せしめた。このプールは
両trp−gag融合蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白質のみ
とは反応性でなかった。 2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−２及びGAG−３蛋白質を0.05M
炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH9.6）中に最終濃度がそ
れぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/mlとなるように稀釈した。
ミクロタイター当り50μｌのアリコートを負荷し、そし
て４℃にてインキュベートした。次に、プレートをBLOT
TO（5w/v％脱脂粉乳/0.01％チメロソル/0.01％アンチホ
ームＡ、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15M塩化ナト
リウム）により１時間室温にてブロックした。血清を、
BLOTTO及びPBS（0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.3/0.15M
NaCl）の1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウエル
当り50μｌの稀釈された血清を加えて37℃にて１時間置
いた。血清を除去し、そしてプレートを３回洗浄緩衝液
（0.15M NaCl/0.05w/v％トゥイーン20）中で３回洗浄
した後、100μｌのヤギ抗−ヒトIgG/ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ接合体（50％ストックを、50mMクエ
ン酸ナトリウム/0.05％トゥイーン20/1％熱失活した正
常ヤギ血清、アンチボディーズ社，デービス,CAから入
手したものに1:10,000稀釈したもの）を加えて37℃にて
１時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを0.15
M NaCl/0.05（w/v）％トゥイーン20で３回洗浄した。1
00μl/ウエルの基質溶液（50mlの0.05Mクエン酸ナトリ
ウム、pH7.0中10mg 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン）を加えて30分間室温に置くことによりELISAを発
色せしめた。100μl/ウエルの3N H2SO4により反応を停
止し、そして450nmにおける光学濃度を自動ELISAリーダ
ーにより決定した。pGAG−２及びpGAG−３により生産さ
れた蛋白質はいずれも既知の血清反応陽性の血清のパネ
ルと反応性であることが見出された。 パネルは、２人の健康な異性愛者、LAS（リンパ腺症
の症状）及び／又は同性愛者と診断された５個体、AIDS
を有する１個体、及びAIDS患者からの血清のプールを包
含した。AIDS,LAS及び／又は同性愛個体からのすべての
血清が、全体ウイルスELISAにおいて、及びLAV抗原の放
射性ラベル化免疫沈澱により血清反応陽性であるとして
確認された。これらの血清からの結果を表１に示す。こ
れらの知見は、LAV抗原に対して反応性の血清は本発明
の細菌により発現されたgag蛋白質に対しても反応性で
あることを証明している。 3.LAVに対する血清抗体の検出のための蛍光スライド試
験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテック
スビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を
顕微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清の
アリコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベ
ートする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対
比染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバス
リップをそれぞれに適用する。 他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を試験管に入
れて患者の血清とインキュベートする。この試験管を遠
心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染色中FITC−
標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加える。試験管を
遠心し、そして上清を吸引除去する。ビーズのアリコー
トを顕微鏡スライドに置き、エタノール固定し、そして
オーバスリップを置く。 すべてのスライドを蛍光顕微鏡により試験する。試験
血清が抗体反応陽性である場合、ビーズは蛍光青色球と
して現われる。試験血清が抗体反応陰性である場合、ビ
ーズは赤色球として現われる。4.trp−gag蛋白質及びtrp−env蛋白質の組合わせの反応
性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtrp−env
蛋白質と混合した。次に、GAG−２又はGAG−３のみにつ
いて前記したのと同様にしてELISAを行った。表２は、G
AG−３とENV−３との組み合わせが、血清陽性個体を検
出するために、いずれかの蛋白質のみよりも高い感度を
示すことを示している。例2. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質の発現のために幾つかの細菌発現ベクター
のいずれかを使用することができる。trpE系をLAV−gag
配列の発現のために選択した。なぜなら、これは強力な
誘導性プロモーターを含有するが、しかしながら長期間
にわたって外来（従って潜在的に毒性である）蛋白質が
細菌内に蓄積しないようにその発現が抑制され得るから
である。 発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ及びリーデ
ィングフレームにより制限される。例えば、trpE発現ベ
クターpATH10は、DNA挿入部が適合性末端にBamH I,Cla
I,Hind III,Pst I,Sac I,Sal I,Sma I,Xba I,Xma I、又
はEcoR Iを有することを必要とする。まず、所望の領域
を、一層広範囲及び変化した配置の制限部位を有する中
間体ベクターにまずサブクローン化することにより一層
の多様性を導入する。次に、注目の領域を、中間体ベク
ターにより提供される制限部位を用いて発現ベクターに
導入する。 従って、方策はまず、LAVゲノムの所望のgag領域を移
送ベクターpUC18ampにサブクローン化することである。
次に、このサブクローンのgag配列を、gag挿入部の発現
を可能にするリーディングフレーム内に適切な制限部位
を有するポリリンカー領域を含有するtrp発現ベクターp
ATH10に連結する（図６）。 1.LAVゲノムのサブクローン化 a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHind III部位中の9.2KbゲノムDNA挿入部を含
有するλファージ粒子の形で入手した。このクローンは
λJ19と称され、そしてWain−Hobson等、Cell 40:9（1
985）に記載されている。λJ19ファージ粒子をE.コリＫ
−12のQ359株（Q359の遺伝子型はhsdRk-,hadMk+,supF,
φ80,P2）に、Maniatis等、Molecular Cloning:A Labor
atory Manual,ニューヨーク，コールドスプリングハー
バーラボラトリー,1982、64頁の方法に従ってトランス
フェクトした。単一プラークを拾い、そしてファージを
プレート・ライセート法（Maniatis,前掲、65頁）によ
り増幅した。37℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（100mm直
径）に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO4/50mM Tris（pH
7.5）を重層した。４℃にて12時間インキュベートした
後、液体を集め、そして同容量のクロロホルムで２回抽
出した。 ファージ粒子を含有する得られた水相10mlに2mlの0.2
5M EDTA/2.5％ SDS/0.5M Tris（pH9）を加え、そし
てこの懸濁液を70℃にて15分間インキュベートしてファ
ージを破壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そ
してこの溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に４
℃にて12,000×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化し
た。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そして
同容量のフェノール〔pH8、1M Tris（pH8）により平衡
化したもの〕により20℃にて抽出した。次に水相を同容
量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）によ
り20℃にて抽出した。次に、水相に2.5容量の95％アル
コールを加えてDNAを沈澱せしめた。遠心した後、DNAペ
レットを乾燥し、そして10mM Tris・HCl（pH7.4）/1mM
EDTA中に再懸濁した。 b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μｇのλJ19DNAを、LAVのこ
の単離体のLTR領域においてのみ切断する制限酵素Sst I
（ベセスダ・リサーチ・ラブス，ベセスダ,MD）により
完全に消化した。この消化混合物を、0.089M Tris−ボ
レート/0.089M硼酸/1mM EDTA中0.9％アガロースを通し
て1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定し
た。このバンドをNA45紙に電気溶出した（Schleicher及
びSchuell,Keene,NH）。製造者の指示に従って、紙から
DNAを回収した。 9.1Kb Sst I断片をSst Iで消化されたベクターpUC18
に、挿入分子：ベクター分子の比を10:1にして連結し
た。E.コリHB101株を連結混合物を用いて、Maniatis
等、前掲、のCaCl2法により形質転換し、そしてLB＋ア
ンピシリン（200μg/ml）寒天プレート上にプレートし
た。 単コロニーを拾い、3mlのLB＋アンピシリン培地に稀
釈し、そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せし
めた。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、368頁）に
よりプラスミドDNAを調製した。 プラスミドDNAの制限酵素分析により決定した場合に
ポリリンカー中のEcoR I部位がLAVゲノムの５′末端に
最も近いような方法で9.1Kb Sst I挿入部を含有する１
つのコロニーを選択した。このサブクローンはpBT−１
と命名された（ATCC＃53069）（図１）。 pBT−１をBamH I及びBgl IIで消化し、そして再連結
した。LAVゲノムの５′部分がベクターと共に維持され
た。HB101を連結されたDNAで形質転換し、そしてpBS−
５挿入部（図１参照のこと）を含むコロニーを、精製さ
れたプラスミドDNAの制限分析により同定した。 pGAGlのgagコード配列を、trp発現ベクターへの適当
な挿入のために必要な制限部位を与えるpUC18ampにサブ
クローン化した。必要なgag配列を連結するために２つ
のサブクローニング段階を必要とした。第１段階におい
て、pBS−５をSau3Aで消化し、そしてbp375からbp547
〔Wain−Hobson等、Cell 40:9（1985）に従って番号を
付与する〕にわたる172bp断片をゲル精製した。この断
片をBamH Iで消化したpUC18ampに連結した。この連結さ
れたDNAをCaCl2−ショックE.コリに取り込ませ、そして
生じたアンピシリン耐性コロニーを、色原体５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを用
いて挿入部の存在についてスクリーニングした。候補コ
ロニーをプラスミドDNAの制限分析によりスクリーニン
グした。得られたプラスミドを0674−14−10と称する。 第２段階において、0674−14−10をAcc I及びPst Iに
より制限酵素処理し、そしてbp505のAcc Iからbp961のP
st I部位にわたるpBS−５からの456bpに連結した。連結
されたDNAをCaCl3ショックIM83に取り込ませ、そしてア
ンピシリン耐性コロニーをプラスミドDNAの制限酵素分
析によりスクリーニングした。“0674−27−38"と称す
る得られたプラスミドはbp375〜bp961のgagコード配列
を含有していた（図７参照のこと）。 2.trpベクターへのgag配列の挿入 pGAG1（ATCC＃55379）を、gag配列を囲むPst I及びEc
oR Iポリリンカー制限部位において0674−27−38を消化
することによって造成した。この断片をゲル精製し、そ
してEcoR I及びPst Iで消化されたpATH10に連結した
（図８参照）。連結されたDNAをCaCl2ショックE.コリC6
00に取り込ませ、そしてアンピシリン耐性コロニーをプ
ラスミドDNAの制限酵素分析によりスクリーニングしてg
ag配列の存在を確認した。 B.蛋白質の発現 1.trp−gag蛋白質の発現 trp発現ベクターにより形質転換されたE.コリC600の
増殖及び誘導に記載されている通りとした〔Spindler
等、J.Virol．49:132（1984）;Konopka等、J.Virol．5
1:223（1984）〕。要約すれば、トリプトファン（40μg
/ml）及びアンピシリン（100μg/ml）を含有する最少培
地に、グリセリンストックからの形質転換された細菌を
接種した。培養物を、通気しながら37℃にて一夜培養せ
しめた。次に、この一夜培養物を、アンピシリン（100
μg/ml）を含有するがしかしトリプトファンを含有しな
い新鮮な最少培地に1:100で接種した。これらの培養物
を通気しながら２〜３時間（対数期初期まで）37℃にて
増殖せしめた。誘導剤３−β−インドール酢酸（シグ
マ）を、95％エタノール中20mg/mlの新たに調製したス
トックから、最終濃度が20μg/mlとなるように加えた。 誘導された培養物を37℃にて通気しながら４〜５時間
増殖せしめ、そして次にペレット化し、そして場合によ
っては凍結した。pGAG−１からの蛋白質の収量は典型的
には20〜40mg/lであった。 C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した
〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。要約すれ
ば、細菌を、誘導された培養物１当り100mlの50mM Tri
s（pH7.5）/0.5mM EDTA/150mM NaCl（TNE）中に再懸
濁した。リゾチーム（シグマ）を1mg/mlの最終濃度に加
えた。０℃にて15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が
0.05％〜0.2％となるように０℃にて10分間にわたって
加えた。次に、１〜2mgのDNアーゼ（シグマ）を150mlの
DNアーゼ緩衝液（1.5M NaCl/12mM MgCl2）と共に加え
た。反応混合物を、それらがもはや粘性でなくなるま
で、通常数時間〜一夜インキュベートした。次に、8000
×ｇ、０℃にて15分間遠心分離することにより不溶性蛋
白質をペレット化した。ペレットをTNE中で２回洗浄
し、そして次に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より不溶性蛋白質の存在について分析した。クマッシー
ブリリアントブルーで染色することにより蛋白質を可視
化した。 別の方法として、融合蛋白質をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により精製した。約200mlの細胞からの
融合蛋白質を代表する約0.5mlの不溶性ペレットを2mlの
２％デオキシコレート/1M KClで３回洗浄し、そして次
にTNEで２回洗浄した。次に、このペレットを0.4mlの５
％ SDS/100mM Tris（pH6.8）/20％グリセロール/1.4M
β−メルカプトエタノール中に渦動により再懸濁しそ
して100℃にて10分間加熱した、痕跡量の不溶物を回転
除去し、そして上清を８％ポリアクリルアミドゲルに負
荷した。蛋白質バンドを、ゲルの縁の染色マーカーレー
ンによりクマッシーブリリアントブルーを用いて可視化
した。融合蛋白質を含有するゲルの領域の切取り、そし
て0.1％ SDS/25mM Tris（pH8.0）の緩衝液を満たした
透析バックに入れた。次に、融合蛋白質をゲルから電気
泳動溶出し、そして緩衝液中に集めた。 D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−１により発現された不溶性蛋白質調製物からの
アリコートを２％ドデシル硫酸ナトリウム/100mM Tris
（pH6.8）/20％グリセリン/1.5M β−メルカプトエタ
ノール中に可溶化し、そしてポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動した。蛋白質をニトロセルロース（BA85、シ
ュライヒェル・アンド・シュエル，キーン,NH）上に電
気移送し、そしてフィルターを５％ウシ血清アルブミン
（シグマ）によりブロックした。次に、フィルターをAI
DS患者からプールされた、E.コリ−吸着されたヒト血清
によりプローブした。このフィルターを、HRP−接合ヤ
ギαHuIgにより発色せしめた。このプールは両trp−gag
融合蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白質のみとは反応性
でなかった。 2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−２及びGAG−３蛋白質を0.05M
炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH9.6）中に最終濃度がそ
れぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/mlとなるように稀釈した。
ミクロタイター当り50μｌのアリコートを負荷し、そし
て４℃にてインキュベートした。次に、プレートをBLOT
TO（5w/v％脱脂粉乳/0.01％チメロソル/0.01％アンチホ
ームＡ、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15M塩化ナト
リウム）により１時間室温にてブロックした。血清を、
BLOTTO及びPBS（0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.3/0.15M
NaCl）の1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウエル
当り50μｌの稀釈された血清を加えて37℃にて１時間置
いた。血清を除去し、そしてプレートを３回洗浄緩衝液
（0.15M NaCl/0.05w/v％トゥイーン20）中で３回洗浄
した後、100μｌのヤギ抗−ヒトIgG/ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ接合体（50％ストックを、50mMクエ
ン酸ナトリウム/0.05％トゥイーン20/1％熱失活した正
常ヤギ血清、アンチボディーズ社，デービス,CAから入
手したものに1:10,000稀釈したもの）を加えて37℃にて
１時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを0.15
M NaCl/0.05（w/v）％トゥイーン20で３回洗浄した。1
00μl/ウエルの基質溶液（50mlの0.05Mクエン酸ナトリ
ウム、pH7.0中10mg 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン）を加えて30分間室温に置くことによりELISAを発
色せしめた。100μl/ウエルの3N H2SO4により反応を停
止し、そして450nmにおける光学濃度を自動ELISAリーダ
ーにより決定した。pGAG−１により生産された蛋白質は
既知の血清反応陽性の血清のパネルと反応性であること
が見出された。 パネルはLAVに対する血清反応陽性241及びLAVに対す
る血清反応陰性271（ウイルスを基礎ELISAにより定義さ
れたもの）を含んだ。これらの血清は放射性標識された
LAV抗原の免疫沈澱により確認されていた。表３は、陽
性及び陰性血清サンプルの両者が高及び低危険群の両者
の個体から導かれることを示している。pGAG1に反応す
る抗体は、程度は異るが、すべての診断群に見出され
た。なお、pGAG1に対する反応性は、健康であるか又はA
IDSへの進行の初期段階（例えば、PGL又は永続的な一般
化されたリンパ腺症）の個体に比べ、より少数の個体に
おいて見出された。これは、LAVへの暴露の後早期にコ
アー蛋白質に対する反応性を示すが疾患の進行に従って
コアー蛋白質への反応性の喪失を示す報告と一致する。
図９は、すべての血清サンプルから得られた光学濃度の
ヒストグラムである。 pGAG1の抗原としての有用性を小測定においてELISAに
よりさらに試験した。この方法においては、env組換蛋
白質であるpENV3に対して弱い反応性を示すか又は非反
応性である血清をpGAG1との反応性について試験した。p
ENV3及びpGAG1のそれぞれ単独、並びに組合わせに対し
て試験された８個の陽性血清及び４個の陰性血清につい
て、ELISA値を表４に示す。これらの血清の内３種（14
−0085,07−3915、及び14−0100）はいずれもpENV3に対
して非反応性であるか又は弱く反応するが、しかしウイ
ルス及びpGAG1に対して非常に反応性であった。ウイル
スに弱く反応する２種類の血清（08−0030及び10−005
6）はpENV3のみ又はpGAG1のみと非常に弱い反応性を有
した。しかしながら、この両組換体との反応は、血清反
応陰性対照からより容易に区別できる陽性ELISA値を与
えた。これらの結果は、pGAG1はpENV3に対して低い反応
性を有する陽性の血清を検出するのに有用であること、
及びpGAG1とpENV3との組合わせが、血清反応陽性個体と
血清反応陰性個体との間の識別においていずれも一方よ
り効果的であることを示している。 3.LAVに対する血清抗体の検出のために蛍光スライド試
験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテック
スビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を
顕微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清の
アリコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベ
ートする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対
比染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバス
リップをそれぞれに適用する。 他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を試験管に入
れて患者の血清とインキュベートする。この試験管を遠
心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染色中FITC−
標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加える。試験管を
遠心し、そして上清を吸引除去する。ビーズのアリコー
トを顕微鏡スライドに置き、エタノール固定し、そして
オーバスリップを置く。 すべてのスライドを蛍光顕微鏡により試験する。試験
血清が抗体反応陽性である場合、ビーズは蛍光青色球と
して現われる。試験血清が抗体反応陰性である場合、ビ
ーズは赤色球として現われる。 4.trp−gag蛋白質及びtrp−env蛋白質の組合わせの反応
性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtrp−env
蛋白質と混合した。次に、GAG−１又はENV−３のみにつ
いて前記したのと同様にしてELISAを行った。表４は、G
AG−１とENV−３との組み合わせが、血清陽性個体を検
出するために、いずれかの蛋白質のみよりも高い感度を
示すことを示している。蛋白質を組み合わせた場合血清
反応陽性サンプルの内7/7が検出され、他方GAG−１又は
ENV−３のみにより検出した場合、6/7が検出された。 以上の記載から、この発明の特定の具体例を説明のた
めに記載したが、この発明の本質及び範囲を逸脱するこ
となく種々の変更を行うことができることが予想されよ
う。従って、この発明は添付された請求の範囲によるほ
か限定されるべきでない。 図面の簡単な説明 図１は、λJ19からのpSS−５及びpBS−５の造成を示
す。 図２は、ポリリンカー配列を含有するtrpE発現ベクタ
ーpJH12及びpJH14を示す。 図３は、pGAG−２及びpGAG−３中のLAV挿入部の由来
を示す。 図４は、pJH12及びpSM002からのpGAG−２の造成を示
す。 図５は、pJH14及びpBPB14からのpGAG−３の造成を示
す。 図６は、trpE発現ベクターpATH10を示し、ポリリンカ
ー領域中の開裂部位のリーディングフレームを含む。 図７は、pGAG1中LAV挿入部の由来を示す。 図８は、pBS−5,pUC18及びpATH10からpGAG1の造成を
示す。 図９は、血清サンプルから得られた光学濃度値のヒス
トグラムである。
ス蛋白質に関し、そしてさらに詳しくはリンパ腺症関連
ウイルス（LAL）に対する抗体と免疫的に反応性である
蛋白質に関する。 従来の技術 後天性免疫不全症候群（AIDS）は日和見感染及び若干
のまれな悪性腫瘍により特徴付けられる細胞性免疫の伝
染性疾患である。 AIDSについての主たる危険群には同性愛の男性、静脈
投与剤の乱用者、輸注剤及び血液製剤の受容者、並びに
高危険個体の異性パートナー及び子供が含まれ、密接な
接触及び血液製剤を介して伝達される感染体の関与が示
唆される。 最近の証明によれば、疾患の伝染を担当する感染体は
リンパ腺症関連ウイルス（LAL）として知られる新しい
リンパ趨向性レトロウイルスである〔Barre−Sinoussi
等、Science 220:868（1983）〕。他の科学者グループ
によって類似のウイルスが報告されており〔Popovic
等、Science 224:497（1984）;Levy等、Science 225:
840（1984）;Vilmer等、Lancet １:753（1983）〕、そ
してヒトＴ−細胞リンパ趨向性ウイルスタイプIII（HTL
V−III）、AIDS関連レトロウイルス（ARV）、又は免疫
不全関連ウイルス（IDAV）と命名されている。さらに最
近のデーターは、LAV,HTLV−III,ARV、及びIDAVは、実
質的なヌクレオチドの相同性を含む幾つかの特徴を共有
し〔Wain−Hobson等、Cell 40:9（1985）;Muesing等，
Nature，313:450（1985）;Sanchez−Pescader等、Scien
ce 227:484（1985）〕、そして同じウイルスの単離体
であると考えるべきであることを示している。但し、ウ
イルス単離体間の株対株変異が存在する可能性もある。
実質的なヌクレオチドの相同性を示すことに加えて、単
離体形態、細胞病理、最適逆転写酵素活性の要求性、及
び少なくとも幾つかの抗原性に関して類似している〔Le
vy,前掲;Schupbach等、Science 224:503（1984）〕。 前記のごとく、このウイルスは血液製剤（血液、血
清、血漿、及びこれらの画分）を介して伝染し得ること
が知られており、このため、提供者がこのウイルスに暴
露されたことがあるか否かを決定するために血液製剤を
スクリーニングすることが重要である。これは、LAV及
び関連ウイルスに対する抗体の検出のためのエンザイム
−リンクドイムノソルベントアッセイ（ELISA）を含む
幾つかの方法の内任意の方法により行うことができる。
LALに対する抗体を含有する血液を有する個体は“血清
反応陽性”（seropositive）であると言われる。血清反
応陽性提供者からの血液は検出の後血液供給から除去さ
れ、こうして疾患の拡散が防止される。 LAVに暴露された個体の免疫反応は多様である。p13,p
18,p25,p36,gp43,p55,gp110等を含む幾つかのウイルス
蛋白質のいずれに対しても抗体が生産され得る〔Schupb
ach等、N.Engl. J.Med．312:265（1985）〕。すべての
個体が同じ蛋白質又は所与の蛋白質の同じエピトープに
対する抗体を生産するわけではないであろう。 血清反応陽性個体の検出は、最近行われている所で
は、幾つかの本質的な問題点を有する。これらの問題点
の内主要な点は、免疫的測定のために全体ウイルスから
抗原を単離する必要があることである。この単離は、潜
在的に感染性の生ウイルスの大量操作を必要とし、そし
てこのこと自体かなり安全性を脅やかす。さらに、調製
ごとにウイルスの収量、純度及び再現性に関する懸念が
存在する。このことが許容されない数の偽陽性及び／又
は偽陰性をもたらす。従って、血液のスクリーニング測
定において有用でありそして他の関連する利点をさらに
もたらすウイルス抗原を製造するための他の方法が当業
界において求められる。 発明の開示 要約すれば、この発明は、LAVゲノムの群特異的抗原
（gag）領域の部分、すなわちLAVに対する抗体と免疫的
に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成るDNA配
列を開示する。細菌宿主中で複製することができる組換
プラスミドも開示される。このプラスミドは、発現のた
めの原核性の転写及び翻訳シグナル、並びにリーディン
グフレームを合わせてこれに続く前記のDNA配列を含有
する。好ましい態様においては、シグナルは誘導性及び
／又は抑制性であるtrpオペロンのごときオペロンから
選択される。上記の組換プラスミドにより形質転換され
た、E.コリ（E.coli）のごとき細菌の細胞も開示され
る。 この発明の他の観点は、LAVに対する抗体と免疫的に
反応性である蛋白質の製造方法を開示する。この方法
は、細菌宿主細胞中で複製可能な組換プラスミドを細菌
宿主細胞に導入することを含んで成る。このプラスミド
は、発現のための原核性の転写及び翻訳シグナル、並び
にリーディングフレームを合わせてこれに続くLAVゲノ
ムのgag領域の部分、すなわちLAVに対する抗体と免疫的
に反応する蛋白質をコードする部分を含んで成る。プラ
スミドの導入に続き細胞宿主を適当な培地中で増殖せし
める。次に蛋白質の発現を誘導し、そしてその配列の蛋
白質生成物を細菌宿主から単離する。単離に続き、蛋白
質生成物を、例えばゲル浸透クロマトグラフィーにより
精製する。 この発明の他の観点は、LAVに対する抗体の生物学的
流体中での存在を検出する方法を開示する。この方法
は、生物学的流体を、前記の組換プラスミドにより形質
転換された細菌細胞により生産された蛋白質と共にイン
キュベートし、これによって反応混合物を形成し、そし
て次にこの反応混合物を分析して抗体の存在を決定する
ことを含んで成る。好ましい態様においては、反応混合
物を分析する段階は、反応混合物を抗体に対するラベル
された特異的結合パートナーと接触せしめることを含ん
で成る。 この発明の他の観点は、生物学的流体中のLAL抗原の
存在を決定するための方法を開示し、この方法は生物学
的流体を、前記の組換プラスミドにより形質転換された
細菌細胞により生産された標識化蛋白質と共にインキュ
ベートし、そしてこれに続いて又はこれと同時に該蛋白
質に対する抗体と共にインキュベートして特異的結合を
生じさせる。次に、インキュベーションの間に形成され
た反応混合物を分析して抗体と結合した標識の量を決定
する。 前記の組換プラスミドにより形質転換された細菌細胞
により生産された蛋白質により動物を免疫感作すること
を含んで成る、LAVに対する抗体の製造方法も開示され
る。 この発明の他の観点は、LAVに対する抗体の生物学的
流体中での存在を決定するための方法を開示し、この方
法は、細菌宿主細胞中で複製することができそして発現
のための原核性の転写及び翻訳シグナルを含有する組換
プラスミドにより形質転換された細菌細胞により生産さ
れた蛋白質にラテックスビーズを接合せしめることを含
んで成る。前記シグナルに続き、LAV遺伝子のgag領域の
部分、すなわちLAVに対する抗体と免疫的に反応する蛋
白質をコードする部分を含んで成るDNA配列が存在す
る。次に、生物学的流体をビーズ／蛋白質接合体と共に
インキュベートし、これによって反応混合物を形成す
る。次に、この反応混合物を分析して抗体の存在を決定
する。 この発明において製造される蛋白質は、適当な担体又
は稀釈剤と共に使用される場合、免疫的に有効なワクチ
ン組成物を構成する。LAVゲノムのgag領域の部分を含ん
で成るDNA配列によりコードされた蛋白質の免疫的有効
量を医薬として許容される担体と共に個体に投与するこ
とにより、AIDSの原因となるウイルスにより惹起される
感染が回避され得る。 発明の実施の形態 発明を記載するに先立ち、以下に使用される幾つかの
用語の定義を記載するのが発明の理解のために有用であ
ろう。 リンパ腺症関連ウイルス（LAV）：ヒトＴ−リンパ趨向
性レトロウイルス。この発明の目的のため、ウイルスが
下記の規準を実質的に満たす場合、それをLAVと同一で
あるか又は同等のものと考える。 （ａ）Ｔ−リンパ球、特にＴ−ヘルパー細胞〔CD4+、Be
rnard等編、Leucocyte Typing,ニューヨーク，スプリン
ガーベルラーク（1984）中に定義された国際命名法に従
う〕に対して向性である； （ｂ）このウイルスは感染されたCD4+細胞に対して細胞
変性的（cytopathic）である（HTLV−Ｉ及びIIのように
形質転換的ではなく）； （ｃ）このウイルスは、Mg2+−依存性であり（最適濃度
5mM、最適pH7.8、アクチノマイシンＤにより阻害され
る）そしてオリゴ（dT）12-18をプライマーとしてその
３′LTRからの逆転写のために使用することができるRNA
−依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）をコードす
る； （ｄ）このウイルスは、シュークロース勾配中で約1.16
の密度においてバンドを形成する； （ｆ）このウイルスは、免疫学的規準及びヌクレオチド
配列規準によりHTLV−I/IIファミリーのウイルスから区
別される（この規準によりHTLV−IIIはHTLV−I/IIファ
ミリーの一員であるとは考えられない）； （ｇ）このウイルスは、LAVのgag及びenv領域によりコ
ードされた蛋白質と免疫学的に実質的に交差反応する；
そして、 （ｈ）このウイルスは、LAVと実質的なヌクレオチド配
列の相同性（75〜100％）及びアミノ酸配列の相同性（7
5〜100％）を有する。 免疫的に反応性：抗原及び抗体が相互に特異的に、典型
的には106M-1以上、そしてしばしば108M-1以上の親和性
をもって、結合することができる場合、これらは“免疫
的に反応性である”と言われる。 形質転換、又は形質転換された：精製されたDNAの導入
により受容細胞又は微生物の遺伝子型を安定に且つ遺伝
的に変更する過程。 リンパ腺症関連ウイルス（LAV）はAIDS又はリンパ腺
症の症状を有する患者から単離することができる。この
ような患者のリンパ腺を典型的には生検採取し、そして
必要により増殖を支持するように補充された培地に入れ
る。インターロイキン−２（IL−２）又はフィトヘマグ
ルチニン（PHA）のごときマイトジエンを含有せしめる
ことができ、ヒト−インターフェロンに対する抗血清を
含めることもできる。逆転写酵素活性は典型的には約15
日の培養で表われ、ウイルスの存在が示される。非イオ
ン性洗浄を用い、次にシュークロース勾配中でバンド化
することによってウイルスを濃縮することができる。こ
れらの精製法及び他の精製法は当業者において良く知ら
れており、例えばMontehro等、J.Virology 42:1029（1
982）に記載されている。 LAVは多くの方法のいずれかにより増殖し得る。これ
はへその緒、末梢血又は骨髄由来のＴ−リンパ球中で培
養することができる。別の方法として、これは不滅化さ
れたＴ−細胞又はＢ−細胞中で増殖することができる。
例えば、Popovic等、Science 224:497（1984）；及びM
ontagnier等、Science 225:63（1984）を参照のこと。
ウイルスの増殖は通常逆転写酵素活性の存在によりモニ
ターされる。 LAVのゲノムクローンは当業界においてよく知られて
いる幾つかの方法のいずれかにより調製することがで
き、これらの方法にはHahn等、Nature 312:166（198
4）;Alizon等、Nature 312:757（1984）;Lucin等、Nat
ure 312:760（1984）；及びMuesing等、Nature 313:4
50（1985）により記載された方法が含まれるが、これら
に限定されない。 要約すれば、これらの方法の１つ（Alizon等）におい
ては健康な提供者のＴ−細胞にLAVを感染させたものか
らDNAを単離し、Hind IIIのごとき制限酵素により部分
消化し、そして得られた消化物を電気泳動的に分画す
る。完全なLVAゲノム（約9.2Kb）のサイズに相当するサ
イズの断片をゲルから溶出し、沈澱せしめ、再懸濁し、
そして適切に制限酵素処理されたベクターのアームに連
結する。連結混合物をバクテリオファージ粒子にパッケ
ージする。このバクテリオファージにより細胞を形質転
換し、そしてクローンをその場でLAV挿入部について、
適当なプローブ（例えば、LAV−RNAから調製されたcDN
A）を用いてスクリーニングする。陽性クローンから、L
AVの所望の領域を細菌プラスミドベクター、例えばpUC1
8にサブクローニングすることができる。不所望の配列
を除去し、そして発現ベクターへのクローニングを促進
する目的でいずれかの末端に追加の制限部位（ポリリン
カーの形で）を加えるためさらにサブクローニングする
のが好ましい場合がある。 次に、LAV配列を誘導性の発現ベクターにサブクロー
ニングすることができる。種々の発現ベクターが当業界
において知られており、そしてλgt11:Tn〔Hall等、Nat
ure 311:379（1984）;trpE（Eur. J.Cell Biol.31:1
71（1983）;pIN III（Masui等、Biotechnology,1984年
１月、81頁）を含む。 得られた蛋白質は部分的に精製することができ、そし
免疫源として及びイムノアッセイにおける抗原として使
用を含む種々の目的のために使用することができる。免
疫源としての使用のためには、蛋白質を緩衝液中又はア
ジュバント中で、動物、例えばマウス、ラビット、ヤギ
等に注射することができる。他の方法として、蛋白質を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、そして
注目のバンドをゲルから切り出し、すりつぶし、そして
宿主動物に注射するために緩衝液中に再懸濁することが
できる。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を
調製することができる。イムノアッセイにおける抗原と
して使用するため、蛋白質をラベル化形又は非ラベル化
形のいずれかとして使用することができる。これらが標
識される場合、ラベルは放射性同位元素、蛍光物質、酵
素、発酵剤、粒子等を包含することができる。これらの
標識及び他の標識が当業界においてよく知られており、
そして例えば米国特許出願No.3,766,162、No.3,791,93
2、No.3,817,837、No.3,996,345、及びNo.4,233,402に
記載されている。 この発明の組換蛋白質を用いる測定法は不均一法（す
なわち、分離段階を必要とする）、又は均一法であるこ
とができる。測定法が不均一法である場合、遠心分離、
濾過、クロマトグラフィー、又は磁気を含む種々の分離
手段を用いることができる。 抗体の存在について血液製剤又は他の生理的流体をス
クリーニングするための１つの好ましい測定法はELISA
である。典型的には、抗体（この場合、組換蛋白質の１
つ又はその組み合わせ）をミクロタイターウエルの表面
に吸着せしめる。次に、表面上の残留蛋白質結合部位を
適当な薬剤、例えばウシ血清アルブミン（BSA）、熱不
活性化正常ヤギ血清（NGS）、又はBLOTTO（防腐剤塩及
び消泡剤をさらに含有する脱脂粉乳の緩衝化溶液）によ
りブロックする。次に、ウエルを、特異抗体を含有する
と予想されるサンプルと共にインキュベートする。サン
プルはそのまま適用することができ、又は一層しばし
ば、通常少量の（0.1〜5.0重量％）の蛋白質、例えばBS
A,NGS又はBLOTTOを含有する緩衝化溶液中に稀釈するこ
とができる。特異的結合が起こるのに十分な時間インキ
ュベートした後、ウエルを洗浄して未結合の蛋白質を除
去し、そして次に標識された抗−ヒト免疫グロブリン
（αHuIg）と共にインキュベートする。この標識は、ホ
ースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP）、β−ガラ
クトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、及びグルコ
ースオキシダーゼを包含する種々の酵素から選択するこ
とができる。特異的結合が生ずるのに十分な時間の後、
ウエルを再び洗浄して未結合の接合体を除去し、そして
酵素のための基質を加える。発色させ、そしてウエルの
内容物の光学濃度を視覚的に、又は装置を用いて決定す
る。 便利のため、ELISA用試薬はキットの形で供給され
る。これらのキットは、組換技法によって作られたウイ
ルス蛋白質が前吸着されるミクロタイタープレート、種
々の稀釈剤及び緩衝剤、特異的に結合した抗体を検出す
るための標識された接合体、及び他のシグナル発生試
薬、例えば酵素基質、コーファクター及び色原体を含む
ことができる。 LAVに感染された個体は、p13,p18,p25,p36,gp43,p55,
gp110等を含む多数のLAV蛋白質に対する抗体を含有す
る。すべての個体が同じ蛋白質に対する抗体を生産する
わけではないが、個々の血清は最も一貫してgag蛋白質p
25及びp18,並びにenv蛋白質gp43及びgp110と反応性であ
る。個体間の差異は疾患の進行程度を含む種々の因子に
よる。例えば、コア蛋白質に対する抗体は疾患の最も早
期には支配的であるが、しかし免疫抑制の進行と共に減
少する。これに対して、エンベロープ糖蛋白質に対する
抗体力価は疾患の後期を通じて持続すると考えられる。 応答における他の差異はウイルス蛋白質をコードする
遺伝子中の多型性（ポリモルフィズム）に基くであろ
う。LAVの異る単離体はenv蛋白質の有意な変化を有す
る。興味あることには、gag蛋白質配列は高度に保存さ
れている。 試験されたすべての血清反応陽性サンプルにおいて、
gag蛋白質の少なくとも１つ（p18又はp25）あるいはenv
蛋白質の１つ（gp43又はgp110）に対する抗体が見られ
た。しかしながら、これらの蛋白質はいずれも血清反応
陽性個体により普遍的には認識されなかった。従って、
血液を少なくとも１つのgag及び１つのeng蛋白質に対す
る抗体についてスクリーニングすることが必須のようで
ある。先行特許出願である米国出願No.721,237“Expres
sion of Immunologically Reactive Viral Proteins"に
おいて、開示されている発明は、LAVに対する抗体と免
疫的に反応性である蛋白質をコードする、LAVゲノムの
エンベロープ（env）領域の部分を用いる。本発明は、
やはりLAVに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質
をコードする、LAVゲノムのgag領域の部分を用いる。組
み合わせにおいて、gag領域によりコードされる蛋白質
及びenv領域によりコードされる蛋白質を用いて高い感
度をもって血清反応陽性個体を検出することができる。 この発明の組換蛋白質の他の用途はヒト用のワクチン
としてである。組換蛋白質は高度に精製し、そして便利
な方法で、一般に宿主kg当り１μｇ〜20mgの濃度で、製
剤化することができる。生理的に許容される担体、例え
ば無菌水、塩溶液、緩衝化塩溶液等を使用することがで
きる。助剤、例えば酸化アルミニウムを使用することも
できる。ワクチンは静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、
又は腹腔内注射により投与することができる。１回の注
射で十分な場合もあるが、一層しばしば週〜月間隔での
多数の注射が好ましい。 別の方法として、LALゲノムの領域を発現するワクチ
ニアウイルス組換体を造成することができる。例えば、
この発明の造成物をプラスミドpMM34（Mackett等、Scie
nce 227:433,1985）に挿入し、そして生ずるキメラプ
ラスミドを含有するワクチニアウイルスハイブリドを相
同組換により形成することができる。このような組換ウ
イルスワクチンによる免疫感作は、肝炎Ｂウイルス及び
水疱性口内炎ウイルスに対する動物における保護免疫を
生じさせるのに効果的であることが示されている（Smit
h等、Nature 311:578,1984）。 この方法による組換蛋白質ワクチンの使用は、病原性
微生物の不活性化調製物又は非毒性株からワクチンを構
成する必要性を除去する。 次の例において、LAV−gagのオーバラップする領域
（図３）、並びにp18のほとんど及びp25の部分を含むga
g領域の他の部分を発現のために選択した。この選択
は、p18及びp25がLAVに感染した個体からの血清と最も
再現性よく反応するgag蛋白質であるという知見に影響
された。これらの配列内での本発明者等の選択は、親水
性領域及びプロテアーゼ開裂部位（この両者は蛋白質の
表面で露出され、そして免疫原的である）の存在並びに
選択されたベクター（trpE）中での効果的な発現のため
のサイズの限界により指示された。 λJ19と称するLALゲノムクローンを細菌プラスミドベ
クターpUC18にサブクローン化した。pBT−１と称する得
られるサブクローンをさらにサブクローン化して主とし
てgag及びpol配列を含有するpSS−５及びpBS−５を得
た。 １つの方法において（例１）、gag配列をさらにpIC19
Rにサブクローン化し（プラスミドpSM002及びpBPB14が
形成される）、そして次にgag配列の領域をtrpE誘導性
発現ベクターに移した。gagDNAをtrpE遺伝子の下流にフ
レームを合わせて挿入し、この造成物によりE.コリを形
質転換した場合にtrpE−gag融合蛋白質の発現が得られ
た。生ずる蛋白質を部分的に精製し、そして既知の血清
反応陽性個体及び既知の血清反応陰性個体からの血清と
のELISAにおけるそれらの反応性により特徴付けた。pGA
G−２及びpGAG−３と称する２つの有用な造成物が固定
された。 他の方法において（例２）、gag配列の部分（bp375−
547）をpUC18ampにさらにサブクローン化した（プラス
ミド0674−14−10が形成される）。次に、gag配列の第
２領域（bp505−961）をプラスミド0674−14−10に移
し、プラスミド0674−27−38を生成せしめた。次に、ga
g配列（bp347−961）をtrpE誘導性発現ベクターpATH10
に移した。gagDNAをtrpE遺伝子の下流にフレームを合わ
せて挿入し、この造成物によりE.コリを形質転換した場
合trpE−gag融合蛋白質の発現が得られた。生じた抗体
を部分的に精製し、そして既知抗体陽性個体及び既知の
抗体陰性個体からの血清とのELISAにおけるそれらの反
応性により特徴付けた。pGAG−１と称する１つの有用な
造成物を同定した。 次の例は、制限的にではなく、例示的に与えられる。 例1. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質を発現するために幾つかの細菌発現系のい
ずれかを使用することができる。trpE系をLAV−gagの発
現のために使用した。なぜなら、これは強力な誘導性プ
ロモーターを含有するが、しかしその発現は、外来性の
（そして潜在的に毒性の）蛋白質が長期間にわたって細
菌内に蓄積しないように抑制され得るからである。 発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ及びリーデ
ィングフレームにより限定される。例えば、rtpE発現ベ
クターは、DNA挿入部が対応末端にBamH I,Hind III、又
はEcoR I制限部位を有することを必要とする。まず注目
の領域を広範囲の又は異る配置の制限部位を有する中間
体ベクターにサブクローン化することにより、一層の多
様性を得ることができる。次に、中間体ベクターにより
提供される制限部位を用いることにより、注目の領域を
発現ベクターに導入することができる。 従って、本発明者等の方策は、まずLAVゲノムgag領域
のほとんどをトランスファーベクターpIC19Rに挿入する
ことであった。次に、これらのサブクローンの種々の断
片を、ポリリンカー領域中の制限部位のリーディングフ
レームにおいてのみ異る（図２）２つのtrp発現ベクタ
ー（pJH12,pJH14）のいずれかに連結した。 1.LAVゲノムのサブクローニング a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHind III部位中の9.2KbのゲノムDNA挿入部を
含有するλファージ粒子の形で入手した。このクローン
はλJ19と称され、そしてWain−Hobson等、Cell 40:9
（1985）に記載されている。λJ19ファージ粒子をE.コ
リＫ−12のQ359株（Q359の遺伝子型はhsdRK-,hadMK+,su
pF,φ80,P2）に、Maniatis等、Molecular Cloning:A La
boratory Manual,ニューヨーク，コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー,1982、64頁の方法に従ってトラン
スフェクトした。単一プラークを拾い、そしてファージ
をプレート・ライセート法（Maniatis,前掲、65頁）に
より増幅した。37℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（100mm直
径）に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO4/50mM Tris（pH
7.5）を重層した。４℃にて12時間インキュベートした
後、液体を集めて、そして同容量のクロロホルムで２回
抽出した。 ファージ粒子を含有する得られた水相10mlに2mlの0.2
5M EDTA/2.5％ SDS/0.5M Tris（pH9）を加え、そし
てこの懸濁液を70℃にて15分間インキュベートしてファ
ージを破壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そ
してこの溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に４
℃にて12,000×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化し
た。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そして
同容量のフェノール〔pH8、1M Tris（pH8）により平衡
化したもの〕により20℃にて抽出した。次に水相を同容
量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）によ
り20℃にて抽出した。次に、水相に2.5容量の95％アル
コールを加えてDNAを沈澱せしめた。遠心した後、DNAペ
レットを乾燥し、そして10mM Tris・HCl（pH7.4）/1mM
EDTA中に再懸濁した。 b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μｇのλJ19DNAを、LAVのこ
の単離体のLTR領域においてのみ切断する制限酵素Sst I
（ベセスダ・リサーチ・ラブス，ベセスダ,MD）により
完全に消化した。この消化混合物を、0.089M Tris−ボ
レート/0.089M硼酸/1mM EDTA中0.9％アガロースを通し
て1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定し
た。このバンドをNA45紙に電気溶出した（Schleicher及
びSchuell,Keene,NH）。製造者の指示に従って、紙から
DNAを回収した。 9.1Kb Sst I断片をSst Iで消化されたベクターpUC18
に、挿入分子：ベクター分子の比を10:1にして連結し
た。E.コリHB101株を連結混合物を用いて、Maniatis
等、前掲、のCaCl2法により形質転換し、そしてLB＋ア
ンピシリン（200μg/ml）寒天プレート上にプレートし
た。 単コロニーを拾い、3mlのLB＋アンピシリン培地に稀
釈し、そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せし
めた。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、368頁）に
よりプラスミドDNAを調製した。 プラスミドDNAの制限酵素分析により決定した場合に
ポリリンカー中のEcoR I部位がLAVゲノムの５′末端に
最も近いような方法で9.1Kb Sst I挿入部を含有する１
つのコロニーを選択した。このサブクローンはpBT−１
と命名された（ATCC＃53069）（図１）。 プラスミドpBT−１から２個のサブクローンを作っ
た。第１番目（pSS−５）のため、pBT−１をSal Iで消
化し、そして再連結した。第２番目のpBS−５のため、p
BT−１をBamH I及びBgl IIで消化し、そして再連結し
た。各場合において、LAVゲノムの５′部分がベクター
と共に維持された。HB101細胞を連結されたDNAにより形
質転換し、そしてpSS−５挿入部を有するコロニー及びp
BS−５挿入部を有するコロニーを、精製されたプラスミ
ドDNAの制限分析により同定した。 次に、pSS−５及びpBS−５の領域を中間体ベクターpI
C19Rにサブクローン化した。上記のように、これは、発
現ベクターへの移行のための正しいリーディングフレー
ム内に必要な制限部位を与える。 詳しくは、pBS−５のHind III断片（LAVゲノムのbp63
1−bp1258;番号はWain−Hobson等、Cell 40:9（1985）
を、Hind III及びウシ腸ホスファターゼ処理されたpIC1
9Rに連結した（図４）。連結されたDNAをCaCl2−ショッ
クを受けたE.コリTB−１により取り込ませた。色原体基
質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−ガラ
クトシッド（シグマ）を用いて、アンピシリン耐性コロ
ニーを、gag配列の挿入によるβ−ガラクトシダーゼの
不活性化についてスクリーニングした。挿入部の方向は
プラスミドDNAをPvo IIで消化することにより決定し
た。生ずるプラスミドをpSM002と称する。 Pvu II−Bgl II断片（LAV遺伝子のbp691〜bp1642）
を、Sma I及びBgl IIで消化したpIC19Rに連結した（図
５）。連結されたDNAによりE.コリHB101を処理し、そし
て生じたアンピシリン耐性コロニーを上記の色原体によ
りスクリーニングした。候補コロニーを、プラスミドDN
Aの制限分析によりさらにスクリーニングした。生じた
プラスミドをpBPB14と称する。 2.gag配列のtrpベクターへの挿入 発現ベクターは、pBR322に挿入されたE.コリtrpオペ
ロンプロモーター、オペレーター及びtrpE遺伝子を含有
する（図２）。trpE遺伝子を最もその５′に近いBgl II
部位においてポリリンカー配列の挿入により切断した
〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。異るtrpベ
クター（pJH12及びpJH14）はポリリンカー領域内の制限
部位のリーディングフレームに従って異る。適切なベク
ターへのオープンリーディングフレームの挿入はアミノ
末端におけるtrpE配列との融合蛋白質をもたらす〔Spin
dler等、J.Virol．49:132（1984）〕。 pGAG−２（ATCC＃5311）はHind III gagサブクローン
（pSM002、図４）をBgl II及びBamH Iで消化することに
より造成した。Bgl II及びBamH I部位はpIC19Rの包囲す
るポリリンカー領域内に位置する。gag断片をゲル精製
し、そしてBamH Iで消化されたpJH12に連結した（図
４）。連結されたDNAをCaCl2ショックE.コリHB101に取
り込ませ、そしてコロニーをアンピシリン（100μg/m
l）及びトリプトファン（40μg/ml）の存在下で増殖せ
しめた。その蓄積が細菌にとって不都合である外来蛋白
質の発現を抑制するためにトリプトファンを使用した。
候補アンピシリン耐性コロニーを放射能標識されたgagD
NAプローブとのハイブリダイゼーションにより同定し
た。少量溶菌物（ミニライセート）の制限分析を用いて
挿入部の存在及び方向を確認した。 pGAG−３（ATCC53112）を、図５に示すように、PVU I
I（bp691）及びBgl II（bp1642）の間のgag領域を含有
するpBPB14のEcoR I消化により造成した。EcoR I部位は
gag配列を囲むポリリンカー配列内に存在する。gag断片
をゲル精製し、そしてEcoR I及びウシ腸ホスファターゼ
で処理したpJH14に連結した。E.コリHB101細胞を、連結
されたDNAにより形質転換し、前記のようにしてプレー
トし、そして制限分析によりスクリーニングしてpJB14
中のgag配列の存在及び方向を確認した。 B.蛋白質の発現 1.trp−gag造成物によるE.コリの形質転換 組換trp−gag発現プラスミドのそれぞれをE.コリBH10
1からE.コリC600に移した。後者が蛋白質の生産のため
に一層良好な宿主だからである。移行は、HB101の少量
溶菌物からのスーパーコイルDNAによりCaCl2−ショック
C600を形質転換することにより行った。細菌を前記のよ
うにアンピシリン及びトリプトファンの存在下でプレー
トした〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。薬剤
耐性コロニーを少量溶菌物によりスクリーニングし、適
切なプラスミドの存在を確認した。 2.trp−gag蛋白質の発現 trp発現ベクターにより形質転換されたE.コリC600の
増殖及び誘導は記載されている通りとした〔Spindler
等、J.Virol．49:132（1984）;Konopka等、J.Virol．5
1:223（1984）〕。要約すれば、トリプトファン（40μg
/ml）及びアンピシリン（100μg/ml）を含有する最少培
地に、グリセリンストックからの形質転換された細菌を
接種した。培養物を、通気しながら37℃にて一夜培養せ
しめた。次に、この一夜培養物を、アンピシリン（100
μg/ml）を含有するがしかしトリプトファンを含有しな
い新鮮な最少培地に1:100で接種した。これらの培養物
を通気しながら２〜３時間（対数期初期まで）37℃にて
増殖せしめた。誘導剤３−β−インドール酢酸（シグ
マ）を、95％エタノール中20mg/mlの新たに調製したス
トックから、最終濃度が20μg/mlとなるように加えた。 誘導された培養物を37℃にて通気しながら４〜５時間
増殖せしめ、そして次にペレット化し、そして場合によ
っては凍結した。pGAG−２及びpGAG3からの蛋白質収量
は典型的には10〜30mg/lであった。 C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した
〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。要約すれ
ば、細菌を、誘導された培養物１当り100mlの50mM Tri
s（pH7.5）/0.5mM EDTA/150mM NaCl（TNE）中に再懸
濁した。リゾチーム（シグマ）を1mg/mlの最終濃度に加
えた。０℃にて15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が
0.05％〜0.2％となるように０℃にて10分間にわたって
加えた。次に、１〜2mgのDNアーゼ（シグマ）を150mlの
DNアーゼ緩衝液（1.5M NaCl/12mM MgCl2）と共に加え
た。反応混合物を、それらがもはや粘性でなくなるま
で、通常数時間〜一夜インキュベートした。次に、8000
×ｇ、０℃にて15分間遠心分離することにより不溶性蛋
白質をペレット化した。ペレットをTNE中で２回洗浄
し、そして次に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より不溶性蛋白質の存在について分析した。クマッシー
ブリリアントブルーで染色することにより蛋白質を可視
化した。 別の方法として、約200mlからの細胞ペレットを180μ
ｌの0.14M Tris HCl（pH7.8）/6％ SDS及び20μｌの
β−メルカプトエタノール中に再懸濁し、そして95℃〜
100℃にて20分間加熱することにより、不溶性ペレット
を変性し、そして還元した。次にサンプルをスピード・
バク・コンセントレーター（サーバントインストルメン
ツ，ヒックスビル,NY）中で乾燥した。SDSを除去した
後、サンプルを次のようにして抽出した。ペレットを1m
lのアセトン／トリエチルアミン／酢酸／水（17/1/1/
1）中に再懸濁し、そして激しく渦動し、懸濁液を氷上
で１時間冷却し、濃縮し、そして上清を廃棄した。この
抽出を0.4mlの前記アセトン混合物を用いて２回、そし
て次に0.4mlのアセトンのみを用いて２回反復した。次
に、ペレットをスピード・バク・コンセントレーター中
で乾燥した。 次に、この蛋白質ペレットを1.4mlの6Mグアニジンヒ
ドロクロリド/0.1M Tris−HCl（pH8.5）/10mM DTT中
に溶解し、そして37℃にて４時間インキュベートした。
遠心によりすべての粒状物を除去した。上清に含有され
るサンプルを、6Mグアニジンヒドロクロリド/10mM EDT
A/1mM DTT中で平衡化された1.6×96cmセファクリルＳ
−300カラム（ファルマシア，ピスカトウェイ,NJ）に負
荷した。カラムを同じ緩衝液で溶出し、そして溶出した
物質の吸光を280nmにて測定した。 画分をELISAにより、LAV血清陽性の血清及びE.コリ血
清陽性の血清を用いて測定してそれぞれ特異的反応性及
び汚染による反応性を決定した。前者の血清とは反応性
を示すが後者の血清とは反応性を示さない画分を使用し
て次に患者のELISAを行った。 D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−２及びpGAG−３により発現された不溶性蛋白質
調製物からのアリコートを２％ドデシル硫酸ナトリウム
/10mM Tris（pH6.8）/20％グリセリン/1.5M β−メル
カプトエタノール中に可溶化し、そしてポリアクリルア
ミドゲル上で電気泳動した。蛋白質をニトロセルロース
（BA85、シュライヒェル・アンド・シュエル，キーン,N
H）上に電気移送し、そしてフィルターを５％ウシ血清
アルブミン（シグマ）によりブロックした。次に、フィ
ルターをAIDS患者からプールされた、E.コリ−吸着され
たヒト血清によりプローブした。このフィルターを、HR
P−接合ヤギαHuIgにより発色せしめた。このプールは
両trp−gag融合蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白質のみ
とは反応性でなかった。 2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−２及びGAG−３蛋白質を0.05M
炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH9.6）中に最終濃度がそ
れぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/mlとなるように稀釈した。
ミクロタイター当り50μｌのアリコートを負荷し、そし
て４℃にてインキュベートした。次に、プレートをBLOT
TO（5w/v％脱脂粉乳/0.01％チメロソル/0.01％アンチホ
ームＡ、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15M塩化ナト
リウム）により１時間室温にてブロックした。血清を、
BLOTTO及びPBS（0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.3/0.15M
NaCl）の1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウエル
当り50μｌの稀釈された血清を加えて37℃にて１時間置
いた。血清を除去し、そしてプレートを３回洗浄緩衝液
（0.15M NaCl/0.05w/v％トゥイーン20）中で３回洗浄
した後、100μｌのヤギ抗−ヒトIgG/ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ接合体（50％ストックを、50mMクエ
ン酸ナトリウム/0.05％トゥイーン20/1％熱失活した正
常ヤギ血清、アンチボディーズ社，デービス,CAから入
手したものに1:10,000稀釈したもの）を加えて37℃にて
１時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを0.15
M NaCl/0.05（w/v）％トゥイーン20で３回洗浄した。1
00μl/ウエルの基質溶液（50mlの0.05Mクエン酸ナトリ
ウム、pH7.0中10mg 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン）を加えて30分間室温に置くことによりELISAを発
色せしめた。100μl/ウエルの3N H2SO4により反応を停
止し、そして450nmにおける光学濃度を自動ELISAリーダ
ーにより決定した。pGAG−２及びpGAG−３により生産さ
れた蛋白質はいずれも既知の血清反応陽性の血清のパネ
ルと反応性であることが見出された。 パネルは、２人の健康な異性愛者、LAS（リンパ腺症
の症状）及び／又は同性愛者と診断された５個体、AIDS
を有する１個体、及びAIDS患者からの血清のプールを包
含した。AIDS,LAS及び／又は同性愛個体からのすべての
血清が、全体ウイルスELISAにおいて、及びLAV抗原の放
射性ラベル化免疫沈澱により血清反応陽性であるとして
確認された。これらの血清からの結果を表１に示す。こ
れらの知見は、LAV抗原に対して反応性の血清は本発明
の細菌により発現されたgag蛋白質に対しても反応性で
あることを証明している。 3.LAVに対する血清抗体の検出のための蛍光スライド試
験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテック
スビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を
顕微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清の
アリコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベ
ートする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対
比染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバス
リップをそれぞれに適用する。 他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を試験管に入
れて患者の血清とインキュベートする。この試験管を遠
心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染色中FITC−
標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加える。試験管を
遠心し、そして上清を吸引除去する。ビーズのアリコー
トを顕微鏡スライドに置き、エタノール固定し、そして
オーバスリップを置く。 すべてのスライドを蛍光顕微鏡により試験する。試験
血清が抗体反応陽性である場合、ビーズは蛍光青色球と
して現われる。試験血清が抗体反応陰性である場合、ビ
ーズは赤色球として現われる。4.trp−gag蛋白質及びtrp−env蛋白質の組合わせの反応
性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtrp−env
蛋白質と混合した。次に、GAG−２又はGAG−３のみにつ
いて前記したのと同様にしてELISAを行った。表２は、G
AG−３とENV−３との組み合わせが、血清陽性個体を検
出するために、いずれかの蛋白質のみよりも高い感度を
示すことを示している。例2. A.trp−gag発現ベクターの造成 外来蛋白質の発現のために幾つかの細菌発現ベクター
のいずれかを使用することができる。trpE系をLAV−gag
配列の発現のために選択した。なぜなら、これは強力な
誘導性プロモーターを含有するが、しかしながら長期間
にわたって外来（従って潜在的に毒性である）蛋白質が
細菌内に蓄積しないようにその発現が抑制され得るから
である。 発現ベクターはそれらの制限部位のタイプ及びリーデ
ィングフレームにより制限される。例えば、trpE発現ベ
クターpATH10は、DNA挿入部が適合性末端にBamH I,Cla
I,Hind III,Pst I,Sac I,Sal I,Sma I,Xba I,Xma I、又
はEcoR Iを有することを必要とする。まず、所望の領域
を、一層広範囲及び変化した配置の制限部位を有する中
間体ベクターにまずサブクローン化することにより一層
の多様性を導入する。次に、注目の領域を、中間体ベク
ターにより提供される制限部位を用いて発現ベクターに
導入する。 従って、方策はまず、LAVゲノムの所望のgag領域を移
送ベクターpUC18ampにサブクローン化することである。
次に、このサブクローンのgag配列を、gag挿入部の発現
を可能にするリーディングフレーム内に適切な制限部位
を有するポリリンカー領域を含有するtrp発現ベクターp
ATH10に連結する（図６）。 1.LAVゲノムのサブクローン化 a.ファージDNAの調製 完全なLAVゲノムをパスツール研究所から、ファージ
λL47.1のHind III部位中の9.2KbゲノムDNA挿入部を含
有するλファージ粒子の形で入手した。このクローンは
λJ19と称され、そしてWain−Hobson等、Cell 40:9（1
985）に記載されている。λJ19ファージ粒子をE.コリＫ
−12のQ359株（Q359の遺伝子型はhsdRk-,hadMk+,supF,
φ80,P2）に、Maniatis等、Molecular Cloning:A Labor
atory Manual,ニューヨーク，コールドスプリングハー
バーラボラトリー,1982、64頁の方法に従ってトランス
フェクトした。単一プラークを拾い、そしてファージを
プレート・ライセート法（Maniatis,前掲、65頁）によ
り増幅した。37℃にて９時間のインキュベーションの
後、コンフルエントプラークを含むプレート（100mm直
径）に5mlの100mM NaCl/20mM MgSO4/50mM Tris（pH
7.5）を重層した。４℃にて12時間インキュベートした
後、液体を集め、そして同容量のクロロホルムで２回抽
出した。 ファージ粒子を含有する得られた水相10mlに2mlの0.2
5M EDTA/2.5％ SDS/0.5M Tris（pH9）を加え、そし
てこの懸濁液を70℃にて15分間インキュベートしてファ
ージを破壊した。2.5mlの8M酢酸カリウムを添加し、そ
してこの溶液を氷上で15分間インキュベートし、次に４
℃にて12,000×ｇ分間遠心して蛋白質をペレット化し
た。上清を50mlのポリプロピレン遠心管に移し、そして
同容量のフェノール〔pH8、1M Tris（pH8）により平衡
化したもの〕により20℃にて抽出した。次に水相を同容
量のクロロホルム／イソアミルアルコール（24:1）によ
り20℃にて抽出した。次に、水相に2.5容量の95％アル
コールを加えてDNAを沈澱せしめた。遠心した後、DNAペ
レットを乾燥し、そして10mM Tris・HCl（pH7.4）/1mM
EDTA中に再懸濁した。 b.gag領域のサブクローニング 上記A.1.aで調製した約12μｇのλJ19DNAを、LAVのこ
の単離体のLTR領域においてのみ切断する制限酵素Sst I
（ベセスダ・リサーチ・ラブス，ベセスダ,MD）により
完全に消化した。この消化混合物を、0.089M Tris−ボ
レート/0.089M硼酸/1mM EDTA中0.9％アガロースを通し
て1V/cmにて電気泳動した。臭化エチジウムにより染色
した後、9.1Kb断片の位置を分子量標準に関して決定し
た。このバンドをNA45紙に電気溶出した（Schleicher及
びSchuell,Keene,NH）。製造者の指示に従って、紙から
DNAを回収した。 9.1Kb Sst I断片をSst Iで消化されたベクターpUC18
に、挿入分子：ベクター分子の比を10:1にして連結し
た。E.コリHB101株を連結混合物を用いて、Maniatis
等、前掲、のCaCl2法により形質転換し、そしてLB＋ア
ンピシリン（200μg/ml）寒天プレート上にプレートし
た。 単コロニーを拾い、3mlのLB＋アンピシリン培地に稀
釈し、そして一定振とうのもとで37℃にて一夜増殖せし
めた。アルカリ溶菌法（Maniatis等、前掲、368頁）に
よりプラスミドDNAを調製した。 プラスミドDNAの制限酵素分析により決定した場合に
ポリリンカー中のEcoR I部位がLAVゲノムの５′末端に
最も近いような方法で9.1Kb Sst I挿入部を含有する１
つのコロニーを選択した。このサブクローンはpBT−１
と命名された（ATCC＃53069）（図１）。 pBT−１をBamH I及びBgl IIで消化し、そして再連結
した。LAVゲノムの５′部分がベクターと共に維持され
た。HB101を連結されたDNAで形質転換し、そしてpBS−
５挿入部（図１参照のこと）を含むコロニーを、精製さ
れたプラスミドDNAの制限分析により同定した。 pGAGlのgagコード配列を、trp発現ベクターへの適当
な挿入のために必要な制限部位を与えるpUC18ampにサブ
クローン化した。必要なgag配列を連結するために２つ
のサブクローニング段階を必要とした。第１段階におい
て、pBS−５をSau3Aで消化し、そしてbp375からbp547
〔Wain−Hobson等、Cell 40:9（1985）に従って番号を
付与する〕にわたる172bp断片をゲル精製した。この断
片をBamH Iで消化したpUC18ampに連結した。この連結さ
れたDNAをCaCl2−ショックE.コリに取り込ませ、そして
生じたアンピシリン耐性コロニーを、色原体５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシドを用
いて挿入部の存在についてスクリーニングした。候補コ
ロニーをプラスミドDNAの制限分析によりスクリーニン
グした。得られたプラスミドを0674−14−10と称する。 第２段階において、0674−14−10をAcc I及びPst Iに
より制限酵素処理し、そしてbp505のAcc Iからbp961のP
st I部位にわたるpBS−５からの456bpに連結した。連結
されたDNAをCaCl3ショックIM83に取り込ませ、そしてア
ンピシリン耐性コロニーをプラスミドDNAの制限酵素分
析によりスクリーニングした。“0674−27−38"と称す
る得られたプラスミドはbp375〜bp961のgagコード配列
を含有していた（図７参照のこと）。 2.trpベクターへのgag配列の挿入 pGAG1（ATCC＃55379）を、gag配列を囲むPst I及びEc
oR Iポリリンカー制限部位において0674−27−38を消化
することによって造成した。この断片をゲル精製し、そ
してEcoR I及びPst Iで消化されたpATH10に連結した
（図８参照）。連結されたDNAをCaCl2ショックE.コリC6
00に取り込ませ、そしてアンピシリン耐性コロニーをプ
ラスミドDNAの制限酵素分析によりスクリーニングしてg
ag配列の存在を確認した。 B.蛋白質の発現 1.trp−gag蛋白質の発現 trp発現ベクターにより形質転換されたE.コリC600の
増殖及び誘導に記載されている通りとした〔Spindler
等、J.Virol．49:132（1984）;Konopka等、J.Virol．5
1:223（1984）〕。要約すれば、トリプトファン（40μg
/ml）及びアンピシリン（100μg/ml）を含有する最少培
地に、グリセリンストックからの形質転換された細菌を
接種した。培養物を、通気しながら37℃にて一夜培養せ
しめた。次に、この一夜培養物を、アンピシリン（100
μg/ml）を含有するがしかしトリプトファンを含有しな
い新鮮な最少培地に1:100で接種した。これらの培養物
を通気しながら２〜３時間（対数期初期まで）37℃にて
増殖せしめた。誘導剤３−β−インドール酢酸（シグ
マ）を、95％エタノール中20mg/mlの新たに調製したス
トックから、最終濃度が20μg/mlとなるように加えた。 誘導された培養物を37℃にて通気しながら４〜５時間
増殖せしめ、そして次にペレット化し、そして場合によ
っては凍結した。pGAG−１からの蛋白質の収量は典型的
には20〜40mg/lであった。 C.trp−gag蛋白質の単離及び精製 上記の細胞ペレットから融合蛋白質を部分精製した
〔Konopka等、J.Virol．51:223（1984）〕。要約すれ
ば、細菌を、誘導された培養物１当り100mlの50mM Tri
s（pH7.5）/0.5mM EDTA/150mM NaCl（TNE）中に再懸
濁した。リゾチーム（シグマ）を1mg/mlの最終濃度に加
えた。０℃にて15分間の後、NP40を混合物に最終濃度が
0.05％〜0.2％となるように０℃にて10分間にわたって
加えた。次に、１〜2mgのDNアーゼ（シグマ）を150mlの
DNアーゼ緩衝液（1.5M NaCl/12mM MgCl2）と共に加え
た。反応混合物を、それらがもはや粘性でなくなるま
で、通常数時間〜一夜インキュベートした。次に、8000
×ｇ、０℃にて15分間遠心分離することにより不溶性蛋
白質をペレット化した。ペレットをTNE中で２回洗浄
し、そして次に変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より不溶性蛋白質の存在について分析した。クマッシー
ブリリアントブルーで染色することにより蛋白質を可視
化した。 別の方法として、融合蛋白質をSDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により精製した。約200mlの細胞からの
融合蛋白質を代表する約0.5mlの不溶性ペレットを2mlの
２％デオキシコレート/1M KClで３回洗浄し、そして次
にTNEで２回洗浄した。次に、このペレットを0.4mlの５
％ SDS/100mM Tris（pH6.8）/20％グリセロール/1.4M
β−メルカプトエタノール中に渦動により再懸濁しそ
して100℃にて10分間加熱した、痕跡量の不溶物を回転
除去し、そして上清を８％ポリアクリルアミドゲルに負
荷した。蛋白質バンドを、ゲルの縁の染色マーカーレー
ンによりクマッシーブリリアントブルーを用いて可視化
した。融合蛋白質を含有するゲルの領域の切取り、そし
て0.1％ SDS/25mM Tris（pH8.0）の緩衝液を満たした
透析バックに入れた。次に、融合蛋白質をゲルから電気
泳動溶出し、そして緩衝液中に集めた。 D.trp−gag蛋白質の免疫的反応性 1.ウエスタンブロットによる分析 pGAG−１により発現された不溶性蛋白質調製物からの
アリコートを２％ドデシル硫酸ナトリウム/100mM Tris
（pH6.8）/20％グリセリン/1.5M β−メルカプトエタ
ノール中に可溶化し、そしてポリアクリルアミドゲル上
で電気泳動した。蛋白質をニトロセルロース（BA85、シ
ュライヒェル・アンド・シュエル，キーン,NH）上に電
気移送し、そしてフィルターを５％ウシ血清アルブミン
（シグマ）によりブロックした。次に、フィルターをAI
DS患者からプールされた、E.コリ−吸着されたヒト血清
によりプローブした。このフィルターを、HRP−接合ヤ
ギαHuIgにより発色せしめた。このプールは両trp−gag
融合蛋白質と反応性であるがtrpE蛋白質のみとは反応性
でなかった。 2.ELISAによる分析 カラム精製されたGAG−２及びGAG−３蛋白質を0.05M
炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（pH9.6）中に最終濃度がそ
れぞれ0.3μg/ml及び3.4μg/mlとなるように稀釈した。
ミクロタイター当り50μｌのアリコートを負荷し、そし
て４℃にてインキュベートした。次に、プレートをBLOT
TO（5w/v％脱脂粉乳/0.01％チメロソル/0.01％アンチホ
ームＡ、0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.2/0.15M塩化ナト
リウム）により１時間室温にてブロックした。血清を、
BLOTTO及びPBS（0.01Mリン酸ナトリウム、pH7.3/0.15M
NaCl）の1:1混合物により1:100稀釈し、そしてウエル
当り50μｌの稀釈された血清を加えて37℃にて１時間置
いた。血清を除去し、そしてプレートを３回洗浄緩衝液
（0.15M NaCl/0.05w/v％トゥイーン20）中で３回洗浄
した後、100μｌのヤギ抗−ヒトIgG/ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼ接合体（50％ストックを、50mMクエ
ン酸ナトリウム/0.05％トゥイーン20/1％熱失活した正
常ヤギ血清、アンチボディーズ社，デービス,CAから入
手したものに1:10,000稀釈したもの）を加えて37℃にて
１時間置いた。接合体を除去し、そしてプレートを0.15
M NaCl/0.05（w/v）％トゥイーン20で３回洗浄した。1
00μl/ウエルの基質溶液（50mlの0.05Mクエン酸ナトリ
ウム、pH7.0中10mg 3,3′,5,5′−テトラメチルベンジ
ジン）を加えて30分間室温に置くことによりELISAを発
色せしめた。100μl/ウエルの3N H2SO4により反応を停
止し、そして450nmにおける光学濃度を自動ELISAリーダ
ーにより決定した。pGAG−１により生産された蛋白質は
既知の血清反応陽性の血清のパネルと反応性であること
が見出された。 パネルはLAVに対する血清反応陽性241及びLAVに対す
る血清反応陰性271（ウイルスを基礎ELISAにより定義さ
れたもの）を含んだ。これらの血清は放射性標識された
LAV抗原の免疫沈澱により確認されていた。表３は、陽
性及び陰性血清サンプルの両者が高及び低危険群の両者
の個体から導かれることを示している。pGAG1に反応す
る抗体は、程度は異るが、すべての診断群に見出され
た。なお、pGAG1に対する反応性は、健康であるか又はA
IDSへの進行の初期段階（例えば、PGL又は永続的な一般
化されたリンパ腺症）の個体に比べ、より少数の個体に
おいて見出された。これは、LAVへの暴露の後早期にコ
アー蛋白質に対する反応性を示すが疾患の進行に従って
コアー蛋白質への反応性の喪失を示す報告と一致する。
図９は、すべての血清サンプルから得られた光学濃度の
ヒストグラムである。 pGAG1の抗原としての有用性を小測定においてELISAに
よりさらに試験した。この方法においては、env組換蛋
白質であるpENV3に対して弱い反応性を示すか又は非反
応性である血清をpGAG1との反応性について試験した。p
ENV3及びpGAG1のそれぞれ単独、並びに組合わせに対し
て試験された８個の陽性血清及び４個の陰性血清につい
て、ELISA値を表４に示す。これらの血清の内３種（14
−0085,07−3915、及び14−0100）はいずれもpENV3に対
して非反応性であるか又は弱く反応するが、しかしウイ
ルス及びpGAG1に対して非常に反応性であった。ウイル
スに弱く反応する２種類の血清（08−0030及び10−005
6）はpENV3のみ又はpGAG1のみと非常に弱い反応性を有
した。しかしながら、この両組換体との反応は、血清反
応陰性対照からより容易に区別できる陽性ELISA値を与
えた。これらの結果は、pGAG1はpENV3に対して低い反応
性を有する陽性の血清を検出するのに有用であること、
及びpGAG1とpENV3との組合わせが、血清反応陽性個体と
血清反応陰性個体との間の識別においていずれも一方よ
り効果的であることを示している。 3.LAVに対する血清抗体の検出のために蛍光スライド試
験 上記のようにして製造された可溶性蛋白質をラテック
スビーズに接合せしめ、そして蛋白質／ビーズ調製物を
顕微鏡スライド上にエタノール固定する。患者の血清の
アリコートをスライド上で蛋白質／ビーズとインキュベ
ートする。スライドを洗浄し、そしてエバン・ブルー対
比染色液中FITC−標識した抗−ヒト免疫グロブリンを加
える。スライドを洗浄し、そして封入媒体及びオーバス
リップをそれぞれに適用する。 他の方法として、蛋白質／ビーズ調製物を試験管に入
れて患者の血清とインキュベートする。この試験管を遠
心し、洗浄し、そしてエバンスブルー対比染色中FITC−
標識された抗−ヒト免疫グロブリンを加える。試験管を
遠心し、そして上清を吸引除去する。ビーズのアリコー
トを顕微鏡スライドに置き、エタノール固定し、そして
オーバスリップを置く。 すべてのスライドを蛍光顕微鏡により試験する。試験
血清が抗体反応陽性である場合、ビーズは蛍光青色球と
して現われる。試験血清が抗体反応陰性である場合、ビ
ーズは赤色球として現われる。 4.trp−gag蛋白質及びtrp−env蛋白質の組合わせの反応
性 ミクロタイターウエル中でtrp−gag蛋白質をtrp−env
蛋白質と混合した。次に、GAG−１又はENV−３のみにつ
いて前記したのと同様にしてELISAを行った。表４は、G
AG−１とENV−３との組み合わせが、血清陽性個体を検
出するために、いずれかの蛋白質のみよりも高い感度を
示すことを示している。蛋白質を組み合わせた場合血清
反応陽性サンプルの内7/7が検出され、他方GAG−１又は
ENV−３のみにより検出した場合、6/7が検出された。 以上の記載から、この発明の特定の具体例を説明のた
めに記載したが、この発明の本質及び範囲を逸脱するこ
となく種々の変更を行うことができることが予想されよ
う。従って、この発明は添付された請求の範囲によるほ
か限定されるべきでない。 図面の簡単な説明 図１は、λJ19からのpSS−５及びpBS−５の造成を示
す。 図２は、ポリリンカー配列を含有するtrpE発現ベクタ
ーpJH12及びpJH14を示す。 図３は、pGAG−２及びpGAG−３中のLAV挿入部の由来
を示す。 図４は、pJH12及びpSM002からのpGAG−２の造成を示
す。 図５は、pJH14及びpBPB14からのpGAG−３の造成を示
す。 図６は、trpE発現ベクターpATH10を示し、ポリリンカ
ー領域中の開裂部位のリーディングフレームを含む。 図７は、pGAG1中LAV挿入部の由来を示す。 図８は、pBS−5,pUC18及びpATH10からpGAG1の造成を
示す。 図９は、血清サンプルから得られた光学濃度値のヒス
トグラムである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(31)優先権主張番号 ７６３４６０
(32)優先日 1985年８月７日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ８２８８２８
(32)優先日 1986年２月12日
(33)優先権主張国 米国
（ＵＳ）
(72)発明者 マクアードル，スーザン
アメリカ合衆国，ワシントン 98105,
シアトル，エヌ．イー．アパートメント
デイー．，フオース アベニユ 3911
(72)発明者 トラビス，ブルース，マクフアーランド
アメリカ合衆国，ワシントン 98115,
シアトル，トウエンテイーナインス ア
ベニユ ノースイースト 6029
(72)発明者 ワード，パメラ，ジユーン
アメリカ合衆国，ワシントン 98121,
シアトル，フア−スト アベニユ 3005
(56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，313（1985年２月）
ｐ．450−458
Ｓｃｉｅｎｃｅ，225（1984） ｐ.
321−323
Ｓｃｉｅｎｃｅ，228（1985年４月５
日） ｐ．93−96
Ｃｅｌｌ，40［１］（1985年１月）
ｐ．９−17
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．LAVゲノムのgag領域の部分であって、LAVのbp375−
bp961、bp631−bp1224、又はbp691−bp1642に対応し且
つLAVに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質をコ
ードする部分であるDNA。 ２．bp631−bp1224（pGAG−２）である請求項１に記載
のDNA。 ３．bp375−bp961（pGAG−１）である請求項１に記載の
DNA。 ４．bp691−bp1642（pGAG−３）である請求項１に記載
のDNA。 ５．LAVゲノムのgag領域の部分であって、LAVのbp375−
bp961、bp631−bp1224、又はbp691−bp1642に対応し且
つLAVに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質をコ
ードする部分であるDNAを有する組換えプラスミド。 ６．trpオペロン由来の発現のための転写及び翻訳シグ
ナルをさらに含んで成る請求項５に記載のプラスミド。 ７．LAVゲノムのgag領域の部分であって、LAVのbp375−
bp961、bp631−bp1224、又はbp691−bp1642に対応し且
つLAVに対する抗体と免疫的に反応性である蛋白質をコ
ードする部分であるDNAを有する組換えプラスミドによ
り形質転換された細菌細胞。 ８．大腸菌である、請求項７に記載の細菌細胞。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72123785A | 1985-04-08 | 1985-04-08 | |
| US763460 | 1986-02-12 | ||
| US721237 | 1986-02-12 | ||
| US828828 | 1986-02-12 | ||
| US753769 | 1986-02-12 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10230393A Division JP3095219B2 (ja) | 1985-04-08 | 1998-08-17 | ＬＡＶに対する抗体と反応性であるｇａｇによりコードされたペプチド及びその使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62502723A JPS62502723A (ja) | 1987-10-22 |
| JP2869063B2 true JP2869063B2 (ja) | 1999-03-10 |
Family
ID=24897100
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61502078A Expired - Lifetime JP2869063B2 (ja) | 1985-04-08 | 1986-04-07 | ＬＡＶに対する抗体と免疫的に反応性であるｇａｇによりコードされたペプチドの発現及び使用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5328835A (ja) |
| JP (1) | JP2869063B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| ES2341429T3 (es) * | 1999-12-23 | 2010-06-21 | Medical Research Council | Mejoras en las respuestas inmunitarias al vih o relacionadas con las mismas. |
Family Cites Families (6)
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|---|---|---|---|---|
| US4520113A (en) * | 1984-04-23 | 1985-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions |
| US9328391B1 (en) * | 1984-08-22 | 2016-05-03 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Cloning and expression of HIV-1 DNA |
| DE3583293D1 (de) * | 1984-10-18 | 1991-07-25 | Pasteur Institut | Lymphadenopathie-assoziierte huellenantigene und deren verwendungen. |
| CA1341423C (en) * | 1984-10-31 | 2003-03-04 | Paul A. Luciw | Recombinant proteins of viruses associated with lymphadenopathy syndrome and/or acquired immune deficiency syndrome |
| DE3588134T2 (de) * | 1984-12-24 | 1997-03-20 | Genentech Inc | Fusionen von AIDS-verwandten Polypeptiden |
| US4774175A (en) * | 1985-03-01 | 1988-09-27 | Centocor, Inc. | Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III |
-
1986
- 1986-04-07 JP JP61502078A patent/JP2869063B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-08-24 US US07/933,980 patent/US5328835A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ，４０［１］（１９８５年１月） ｐ．９−１７ |
| Ｎａｔｕｒｅ，３１３（１９８５年２月） ｐ．４５０−４５８ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２５（１９８４） ｐ．３２１−３２３ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８（１９８５年４月５日） ｐ．９３−９６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5328835A (en) | 1994-07-12 |
| JPS62502723A (ja) | 1987-10-22 |
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