JPH09504685A

JPH09504685A - Ｈａｒｄｓウイルスの組換えｄｎａ抗原を製造する分子クローン

Info

Publication number: JPH09504685A
Application number: JP7507696A
Authority: JP
Inventors: ジェル，ブライアン; ジェニソン，スティーヴ
Original assignee: ユニバシティオブニューメキシコ
Priority date: 1993-08-25
Filing date: 1994-08-25
Publication date: 1997-05-13
Also published as: US5837441A; AU7671794A; WO1995006250A1; EP0714513A4; US6316250B1; CA2168030A1; EP0714513A1; AU697470B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、分子クローン中に表現のためのHARDSウイルスｒＤＮＡを提供する。表現された生成物は、HARDSウイルス及び関連のハンタウイルスのための免疫診断法、予防剤及び治療剤に有用である。特に、関心のあるものは、HARDSウイルスＧ１たんぱく質のタイプ−特異性のエピトープ体及びHARDSウイルスに対する抗体に相互反応性のHARDSウイルスＮたんぱく質の優性エピトープ体及びその関連の、本発明によりｃＤＮＡクローンで表現されたハンタウイルスＰＨＶである。

Description

【発明の詳細な説明】 HARDSウイルスの組換えＤＮＡ抗原を製造する分子クローン発明の背景技術１．発明の分野本発明は、HARDSウイルス、ハンタウイルス(Hantavirus)-関連(Associated)呼吸(Respiratory)困難(Distress)症候群(Syndrome)に関する。ニューメキシコ州、アリゾナ州、ユタ州、コロラド州の州境により形成される４コーナーの原住民に感染する、説明できない大人の呼吸困難症候の流行病が、１９９３年５月に認識された。この病気は、熱、筋痛症、また、場合により、１〜５日間続く結膜炎の前徴の病気で、その後に、深刻で急性の病気となる、肺動脈の浮腫及びショックにより特徴づけられるものである。連邦U.S.のＣＤＣに従うと、１９９３年７月２７日に、流行性が認められたので、この病気と診断された１８人の患者のうち１４人（７８％）に、窒息死が、生じた。症状は、新しく同定されたハンタウイルスのウイルス、即ち、HARDSウイルスと称される(また、ＨＨＶ及び４コーナーウイルス或いはＦＣＶと称される)もののウイルス感染により生じたものと決められた。ＣＤＣによると、このウイルスの優性ベクターは、めくらねずみ(deer mouce)のPeromyscus maniculatusであり、それは、米国西南部に生息し、この領域で、HARDS感染を広げる可能性を有するものである。この感染は、２つの段階で進む。第１の段階、即ち、前兆では、熱、筋肉痛及び咳のような不特定の以上が生じ、HARDSウイルス感染とインフルエンザとは区別でき、"連鎖のど(Strep throat)"及び他の上部呼吸感染異常がある。前兆感染は、短く、次に、１〜５日間、HARDSウイルス感染の第２段階になり、それは、しばしば死亡に至る肺動脈の病気とショックを特徴とする。肺動脈の浮腫が生じるまでに、しばしば、他の微生物による感染から区別できるが、多くの権威者は、能力のある抗−HARDS活性を持つ抗〜ウイルスにより効果的に処理されるには、HARDSウイルスについては、遅過ぎる段階と考える。従って、HARDSウイルスの存在についての迅速な診断テストの必要性は、特に急務である。どの患者がHARDSウイルスにかかっているかを決めるについて臨床医を助けるに加えて、入院と処理の必要があり、HARDSウイルスについての特異性−テストは、病気の蔓延と広がりを管理する努力が公衆衛生当局に求められる。HARDSウイルスについての特異性テストは、齧歯動物のサーベイランス、HARDS ウイルス感染の流行と伝搬の研究及び他の研究活動の助けになるものである。このようなテストは、齧歯動物の数でのHARDSウイルスの領域を決定でき、何処の人口のものが、HARDSウイルス感染の危険にあるかの正確な情報を得ることができる。関連技術の検討１．ウイルス特性６月の上旬まで、新たな症状の犠牲者があったこと、その病気の間に、ＩｇＭ抗体は、ブンヤウイルス(Bunyaviuses)のハンタウイルス遺伝子の２種の１つ或いは両方に反応したものと認められた。これらのウイルスは、ヒトの病気、流行性腎臓病（ヨーロッパ）及びソウルウイルス、韓国で最初に同定されたノルウエイねずみのウイルスが起こす、ピュウマラ(Puumala)ウイルス、畑鼠ウイルスとして知られるものである。アトランタ、ジョージア州U.S.A.のＣＤＣの科学者は、新しいウイルスから分子クローン及び限定された配列情報を得ることができた。その配列情報は、新しいウイルスがHARDSウイルスであるという考えを裏付け；そして、ハンタウイルスの間の最も近い親類は、ピュウマラ(Puumala)ウイルスそして、プロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルス（ＰＨＶ）として知られる他の齧歯動物ウイルスであろうと示唆していた。２．HARDSウイルス感染の診断他のハンタウイルスにより生じた急性感染を診断するための標準的な方法は、酵素−結合の免疫溶解検定体（ＥＩＡ）を通して、疑惑のウイルスについて、ＩｇＭ抗体を検出するものである。これを行なうために、疑惑のウイルスを組織媒体中で生長せしめる必要があり；このような感染細胞培養物は、患者の血清のＩｇＭが反応するものについてのウイルス抗原の源である。従って、例えば、ハンタアンウイルス（韓国及び中国で生じた）により感染された疑惑のものの患者からの血清は、ハンタアンウイルス−感染細胞のリゼイトで培養される。そして、免疫複合体が、他の抗体から検出される。ＣＤＣ或いは他のものによる培養物中でHARDSウイルスを生長させる多くの試みにもかかわらず、免疫反応性の血清抗体の検定のためのウイルス抗原の製造に適する培養物は、得られず、そして、HARDSウイルスに感染したものは、次のルートの１つで診断されてきた。（ａ）ピュウマラウイルス或いはソウルウイルスから誘導された抗原と弱く”相互反応”することが示されたHARDSウイルスについての抗体が、感染患者中で形成される。この方法は、流行病のサ−ベイランスに有用であるが、患者が臨床的病気になる前及び死亡の近く、或いは感染から回復の前に、HARDS感染を診断することができるほど感受性はないことが証明された。HARDSウイルス感染は、他のハンタウイルス感染に伴って見られるものよりも、ブリスク抗体反応性がいくらか弱いようである。（ｂ）ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）．ＣＤＣの科学者は、１９９３年６月にHA RDS感染の診断のＰＣＲ方法を開発した。ウイルスＭセグメントのＧ２遺伝子の少量を、酵素逆転転写を用いて、ＤＮＡにコピーし、そして、大量のＤＮＡに増幅した。増幅されたＤＮＡ（１８５ｂｐ）が、アガロ−ゼゲル上で検出された。この技術を、ニュ−メキシコ州、アルバカ−キのＵＮＭ病院にいる患者に適用すると、その限りにおいて、既知の虚偽−ポジテイブテストなしでも、感染患者の〜９０％の末梢血細胞について検出できることが分かった。この方法は、少々遅く（血の受け取りとウイルスの検出の間に３６時間ある）、虚偽−ネガテイブテストにかけ、多分、ＰＣＲプライマのアンニ−ルを防止するように、感染患者間でのウイルスを十分に差異があるようにできるものである。ＰＣＲの使用では更に虚偽−ポジテイブテストに関心がある。この問題は、実験室で、表面、遠心分離器、ゲル装置等上に存在する増幅されたウイルスＤＮＡの少量が、ＰＣＲ反応の製造中に使用された試験管中にある場合に、生じるものである。汚染ＤＮＡにより、次のＰＣＲ反応のための優秀な鋳型が作られ、そして、感染されていない患者での虚偽ポジテイブテストを、著しく危険にするものである。その危険は、増幅されたウイルスＤＮＡを研究し、分析する場合に、” プレ−ＰＣＲ”活性（例えば、ＲＮＡが、HARDSウイルスのテストされるべき患者の血から作られる）及び”ポスト−ＰＣＲ”活性に用いられたものを厳密にかつ厳格に物理的に分離することにより、低減できる。然し乍ら、この分離は、十分でない。多くの場合、ボナファイド(bona fide)ターゲットを添加する前に、汚染鋳型ＤＮＡを破壊する紫外線により、増幅の前に、ＰＣＲカクテイルを照射することは、助けとなる。然し乍ら、ＵＶ照射が、汚染ＤＮＡが、少なくとも３００塩基の長さであると思われる場合に、この理由により、はるかに効果的である。ＣＤＣプロトコルにより作られた１８５塩基対による汚染が、ＵＶ照射により十分に”殺菌”されないようである。より大きなＰＣＲターゲットの必要性は、ＰＣＲ汚染除去での最も良い多くの解決策により、要請されている。(Natur e 343:27，1990) ＰＣＲ（現在の形式）の費用、遅い全体回転時間及び労働強化により、ハンタウイルス感染を迅速に診断するという２次的に最適な解決法が可能になる。それにもかかわらず、ＰＣＲは、精密な血清学（抗原或いは抗体）テストが利用できる前に、可能な最良の解決法であろう。（ｃ）免疫ヒストケミストリ．組織（肺或いは腎臓）を、特異性のモノクローン抗体、元々、生じたピュウマラウイルスに対して抗体を接することにより、検出することが可能である。この方法は、検死で得られた患者組織中のＣＤＣにより、使用されたが、生きている患者からの新鮮な血試料中で診断するに効果的な手段がないようである。従って、HARDSウイルスからＲＮＡ或いはHARDSウイルスに対する抗体を、特に、治療的な血清学試料のために、検出するための急速な方法を提供することが、所望されている。免疫検定適用に適する高い抗原性を有するウイルス抗原を多量にある信頼性のある源が、特に望ましい。図面の簡単な説明図１は、次のウイルスたんぱく質が、融合部分としてあるTrp Ｅたんぱく質分子を発現するために誘導された大腸菌培養物から誘導された不溶性のたんぱく質部分のリゼイトを含有するウエスタンブロット隔膜（ＢＬＯＴＡ）をプルーブするために用いた患者Ｈ（最近、HARDSの治療ケースから回復した）からの血清のタイプ−特異性の血清反応性を示す。（ａ）クローンp3H226 G1 1275 CR-1 中のHARDSウイルスＧ１遺伝子の１２７５ｎｔによりエンコードされたたんぱく質；（ｂ）ピュウマラウイルス株Ｐ３６０の全Ｇ１遺伝子；（ｃ）ピュウマラウイルス株Ｐ３６０の全Ｎたんぱく質；（ｄ）融合ウイルス域のないたんぱく質ｐ３７^{trp E}。Ｍ＝分子量のマーカーは、そのバンドが、この例示のものを再製しないものである。ＢＬＯＴＢは、参照物である。ブロットは、患者血清、アルカリフォスファターゼ−接合の山羊抗−ヒトＩｇＧ及びアルカリフォスファターゼを検出するための色素反応剤により順次プルーブされた。患者Ｈの血清は、HARDSウイルスＧ１たんぱく質とブリスク反応したが、関連のピュウマラウイルスのＧ１たんぱく質とは全然反応しない。患者Ｈ血清は、ピュウマラウイルスＮたんぱく質と強く反応した。感染していないヒトの参照の血清は、たんぱく質を認識しない、また、血清は、それ自体により、Trp Ｅたんぱく質を認識しない。図２は、その最も近い既知のハンタウイルス親類、プロスペクトヒル(Prosp ect Hill)ウイルス("PHILL";GenBank X55128)及びピュウマラウイルス株P360("P UUMALA";GenBank X61035)のものを有するHARDSウイルスクローンp3H226 Ｓ 1129 CR-7("NMHV")によりエンコードされたたんぱく質の配列を示す。同定領域は、星印で示される。非常に似ている多くの領域が存在し、例えば、ＮＨＭＶ座標３７と１９３の間に非常に相同性のある領域があることに留意される。これらの領域は、広く相互−反応性のあるエピトープ体のためのロ−カスであるようである。アミノ酸１９４と２６４の間のような他の領域は、Ｎ内で、より分岐された、かけられたタイプ−特異性のエピトープ体である。図３は、最も近いハンタウイルス親類、プロスペクトヒル("PHILL",GenBank X55129)及びピュウマラウイルス株P360("PUUMALA",L08755)のものを有するHARD Sウイルスクローンp3H226 G1 1275 CR-1によりエンコードされたたんぱく質(部分的配列)の配置を示す。Ｇ１のこの領域において、広く反応性のあるエピトープ体は、計測され、HARDS感染に特異化されると見られる、少なくとも１つの能力あるエピトープ体が、見かった。HARDSウイルスと座標３６〜９３の間のような、その親類との間には、顕著な差異のある領域がいくつかあることに留意するべきである。図４は、その増幅（図示なし）に使用されたプライマにより成されたp3H226 Ｓ 1129 CR-7の完全なヌクレオチド配列を示す。図５は、３つの方法の配位結合によるp3H226 Ｓ 1229 pATH-1の製造を示す。図６は、p3H226 Ｇ１ 1275 CR-1のＨＨＶ−特異性の部分（増幅に用いられたプライマ配列のない）の完全なヌクレオチド配列を示す。優性のＧ７エピトープ体（アミノ酸配列ＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ）をエンコードするＤＮＡの配列は、顕著である。図７は、p3H226 Ｓ 419 CR-1及びp3H226 Ｓ 1129 CR-7から増幅されたＦＣＶ配列の配位結合により構築されたp3H226 Ｓ 1229 pATH-7のＦＣＶＤＮＡインサートの完全なヌクレオチド配列を示す。Xho Ｉサイトを特異化する人工的に修正した配列（然し乍ら、Ｎ遺伝子によりエンコードされたたんぱく質を修正していない）は、顕著である。図８は、優性のＮたんぱく質エピトープ体のアミノ酸１〜１００（Ｂ）にエンコードするクローンp3H226 Ｓ 317(Ａ)のＨＨＶＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を示す。図９は、２つのHARDS患者血清（パネルＡとＢ）或いは参照の血清（パネルＣ）と、p3H226 Ｓ 317 pATH-1から誘導されたカルボキシ−対−アミノ末端ネストされた欠失連のウエスタン免疫ブロットの例示を示す。発現たんぱく質は、p3H2 26 Ｓ 317 pATH-1（レ−ン１）からのもの、及び、HARDS患者血清抗体（レ−ン２〜８）と反応されるべきサイズを小さくした６個のたんぱく質の連である。ＨＨＶＮたんぱく質の優性流行病のカルボキシ−末端は、クローン７中に存在するが、クローン８には存在しないＤＮＡ配列によりエンコードされる。図１０は、ｈｈｖ（３Ｈ２２６）Ｍセグメント、残査３３５１の１〜３３５１の主要部の配列を示す。発明の概要本発明は、HARDSウイルスの１つ以上の高い抗原性のあるたんぱく質域をエンコードする、分子クローン化されたウイルスＤＮＡインサートを提供する。適当な発現ベクター中でのこれらのインサートの発現により、HARDSウイルスのＮ、Ｇ１及びＧ２カプシド抗原からのウイルスたんぱく質或いはオリゴペプチドを大量に生産し、免疫優性で、タイプ−同定のウイルスエピトープ体を同定し、単離することが可能である。本発明のたんぱく質／オリゴペプチドは、通常の方法により、合成できる。得られた抗原は、HARDS抗体（例えば、患者の血試料中の）の存在を免疫検定するに特に有用であり、そして、HARDSウイルス感染の診断、処理及び予防のための免疫システム中で、HARDSウイルスに対しての抗体の製造に、有用である。発明の詳細な説明ハンタウイルスゲノム、Ｍセグメント（外被糖たんぱく質Ｇ１とＧ２をエンコードする）及びＳセグメント（ヌクレオカプシドたんぱく質、Ｎをエンコードする）の３つのセグメントで、ハンタウイルスカプシドの重要な抗原のすべて或いはほどんど全てをエンコードするようである。現在の努力では、HARDSウイルスのＭとＳのセグメントのコーディング配列の多くものが、HARDSに感染した患者の鋳型ウイルスＲＮＡとして、使用して、分子的にクローン化される。クローンは、次のようにして得られた。ピュウマラ及びＰＨＶ(GenBank配列データベースを通して、ＮＣＢＩ[National Center for Biotechnology Informati on]で入手できる情報、National Library of Medicine[National Institutes of Health],ロックビル、メリ−ランド州、USAで入手できる情報)のＭとＳセグメントの補填ＤＮＡのヌクレオチド配列をスキャンニングすることにより、２つのウイルスの間に保存された配列の〜２０ｎｔの多数の短い領域が同定された。血清学タイプの新しいハンタウイルスも保持されているという理論に基づいて、それらの配列或いはその補填物に相当している、これらの保存された配列、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを作った。このようなオリゴヌクレオチドを種々に組合せたものは、逆転転写／ポリメラーゼ鎖反応中（実施例参照）のプライマとして用いた。HARDSウイルス鋳型は、典型的な治療特性とHARDSウイルス感染の毒素特性で死亡した患者3H226とMHARの肺ＲＮＡにより提供された(New Mexico Office of t he Medical Investigator)。プライマは、バクテリア発現ベクターに容易にクローン化するＰＣＲ生成物を作るように設計された、即ち、外来のＤＮＡインサートによりエンコードされたたんぱく質を容易に生成できるように設計されたプラスミドを作るものである。ここで、選択されたＤＮＡオリゴヌクレオチド配列（或いは、その補填物）を増幅するために用いられたタイプのポリメラーゼ鎖反応は、良く知られており、適当な方法を用いることができる。また、増幅されない配列を、用いて、本発明のインサートを提供するHARDSウイルスＲＮＡ鋳型に対して反応するためにＤＮＡ配列を提供し、選択された他の方法も用いることができる。ＰＣＲ／逆転転写システムにおいて使用するためのプライマ対は、関心のあるＤＮＡ領域を良好に増幅するために選択される。ＰＣＲ生成物をクローン化する種々の方法は、周知であり、適当な方法を用いることができる。”ＴＡクローニング”（ベクター制限サイト及びＰＣＲ生成物の間の単一Ｔ：Ａ塩基対の導入のための）として既知の特に有用な方法は、Nucl.Acids Res．19:1154,1156(1991) に説明され；他の有用なＰＣＲクローニング法も、そこに説明される。クローニングは、Inbitrogenから入手可能なTAクローニングキットのような"スクラッチから(from scratch)"で、或いは市販のクローニングシステムで行なうことができる。従米技術で知られるように、ＰＣＲ生成物は、抗原ウイルスたんぱく質を多量に生産することができる発現ベクターにクローン化される。種々の発現ベクターが、用いられ、バクテリア発現ベクター（プラスミド）及びイ−スト及び補乳動物細胞のための杆菌ウイルス及び発現ベクターのような成熟細胞のためのベクターを含み、それらは、ネイテイブのウイルスたんぱく質のグリコシル化のようなポスト翻訳修正の複製を改良するものである。本発明は、本発明の分子クローンを作るために用いられる方法に広く依存していない且つ、用いた発現ベクター或いはホスト細胞に依存していない。そして、記載されたものは、例示である。たんぱく質発現は、ハンタウイルス・インサートによりエンコードされたたんぱく質の高いレベルの発現が得られるまでに、種々のプロモ−タ及びホスト細胞株をトライ−アンド−エラ−の手法を適用することにより最適化できる。例示のプロモ−タは、trp Ｅ融合たんぱく質(Methods Enzymol．194:477〜90，1991)；或いはＤＨＦＲ(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA，USA)；mal Ｅ(New England Biol abs.，Beverly，MA．USA)或いはバクテリアファ−ジＴ７（Dr．W．Stud1er，Col d Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY．USA)の構築のための多重クローニングサイトを有する高い発現ベクターを作るためのベクターのpATH連と接合したtrp Ｅプロモ−タを含む。クローン化されたＰＣＲ生成物（発現ベクターと配位結合したＰＣＲ生成物）を相当するホスト細胞中にサブクローン化した後に、高い抗原性と特異性或いは意図する適用に関連の他の特徴のたんぱく質の高い発現できるクローンを選択する通常の方法で細胞をスクリーンする。免疫特性のためにスクリーンすることは、通常の方法で容易に為され、即ち、酵素−結合の免疫検定体、放射性免疫検定体或いは免疫ブロット(例えば,Science 244:359〜362，1989及びAnn．Int．Med ．115:644〜649,1991を参照)のような免疫検定処理法で、HARDSウイルス抗体に対して組換え抗原を検定することにより、通常の方法で容易にすることができる。本発明の一具体例において、多重プライマ対を試した後に、１０のプライマ対が、同定され、HARDSウイルスの１以上の優性のエピトープ体（高い抗原性のたんぱく質領域）をエンコードすると判断された５つの大きな領域をうまく増幅する（そして、クローン化することが可能になり）ことができた。これらの領域は、ほとんどすべてのヌクレオカプチドたんぱく質”Ｎ”（ＰＨＶの座標１４１〜１２７２のｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ；HARDSウイルス遺体の正確な座標は知られないが、多分、ＰＨＶのものと同様なものである）；をエンコードするＳセグメント部分を含む；そして、ＰＨＶの座標１３２〜１４０７(クローン"3H226 Ｇ1 1275 ")により結合されたＭセグメント域；ＰＨＶの１５３５〜２７６０("3H226 Ｍ 1 225")；１３１７〜３３５５("3H226 M 2038")及びPＨＶの３００４〜３３９６(" MHAR G2 392")をエンコードする。HARDSウイルス配列の２４１ｎｔは、座標２７６２と３００３の間にあることが、ＣＤＣの発明者により提供された。上記の５つの領域（”インサード”）のすべてが、クローニングベクターｐＣＲII(Invitrogen社)中にＴＡクローニングによりクローン化された。すべてのインサートは、ＤＮＡインサートによりエンコードされたたんぱく質を”発現する ”（大量に作ること）目的のために、バクテリア発現ベクターpATH１０、pATH２１、pATH２３及び／或いはｐＱＥ６０にサブクローン化された。実施例は、用いた方法の詳細を説明する。本発明の利用性本発明の生成物は、HARDSウイルスｒＤＮＡ自体を含み、ＤＮＡインサート（H ARDSウイルスｃＤＮＡは、発現ベクターと配位結合しており、ウイルスcＤＮＡＰＣＲ生成物を含む）そして、ホスト細胞は、ＤＮＡインサートを含み、診断、予防及び治療のため、特に、HARDSウイルスに対して保護するワクチンのための免疫検定のための、抗原たんぱく質或いはオリゴヌクレオチドの製造に広く有用なものである。本発明による抗原性エピトープ体は、HARDSウイルスに特に高い特異性のあるタイプ特異性のエピトープ体と、HARDSウイルス及びプロスペクトヒル・ウイルスのような他のハンタウイルスに強く反応性のある優性エピトープ体の両方を含む。Ｎたんぱく質は、Ｇ１たんぱく質抗原と組合せて、HARDS ウイルスの分岐株を検出し、そして、感染性を特徴づけるに特に有用であることが証明され、特に、異なるウイルス株の間に生じるＧ１−包含のタイプ−特異性の抗原内の抗原変種のために、有用である。抗体／抗原親和カペア本発明の分子クローンから入手でき、所望の特性に選択される相同性のウイルスたんぱく質が大量にあると、発明を、既知の技術による抗原に対して生じたｒＤＮＡ抗原或いは抗体（モノクロナール及びポリクロナール）のどちらも用いる治療の免疫検定体及び免疫治療法にするものである。ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＲＩＢＡ、免疫螢光検定及びウエスタンブロット検定のようなトレーサー標識の抗体或いは抗原を用いる免疫検定は、例示であり、親和力精製、標準的膠着及び免疫沈殿検定体のようにすることができる。治療のため、或いは、ベクター中の病気の拡散を評価するためのどちらかの、哺乳動物の血試料中のHARDSウイルスに対して、抗体の存在を検出するためのＤＮＡ抗原を用いる血清学検定が、特に関心がある。そのような血清学検定の１つは、実施例ＩＩＩに詳細に説明される。また、特に関心のあるものは、ＥＩＡシステムのような特異性の信号を増幅するためのＤＮＡ抗原を使用することである。本発明のｅＤＮＡ抗原を補填する抗体は、HARDSウイルスに対して受動的な免疫化の源になる。ウイルスに接した後に、このような予防間隔が、ラビイ或いは肝炎Ｂウイルスに接したことと結合して、予め、用いたものである。ｒＤＮＡ抗原に対する抗体は、ここで参考文献とするMethod in Immunology,G arvey等,eds;W.A.Benjamin,Inc.Reading,MA.USA.1977の記載されるものような教科書の処理法により容易に作られる。免疫検定体中に説明されるHARDSウイルスｒＤＮＡを利用することは、培養された細胞から誘導されたネイテイブHARDSウイルス抗原を入手できないので、非常に重要である。然し乍ら、そのような組織培養物が開発される場合、組換え抗原が、信頼性よく、再現性よく、近接のウイルス間を区別できるような特別のタスクのために設計できるので、本発明のｒＤＮＡ抗原は、より、ネイテイブの抗原より優れていると良く証明されるものである。ワクチン開発での使用 HARDSウイルスの抗原ドメインの大部分をエンコードする分子クローンは、重要なワクチン反応剤である。例えば、HARDS抗原は、ワクチン或いは他の異種性のウイルス及び複製機構を抑制しながら、培養細胞中に発現できる。そして、既知の原理により、生きている或いは殺された−ウイルス・ワクチン抗原を作るために、使用される。更に、HARDSウイルスＤＮＡは、”裸のＤＮＡ・ワクチン” のための基体として、使用でき、例えば、精製されたHARDSウイルスＤＮＡを、ヒト或いは動物中に筋肉注射することによる免疫化として使用できる。更に、杆菌ウイルス、イースト或いは大腸菌中に発現された精製HARDSウイルスたんぱく質は、ヒト或いは動物を免疫化するに用いることができる。従来知られるように、抗原の免疫性が、必要により、ハプテンとカップリングすることにより、増大できる。本発明のワクチンは、タイプ−特異性のエピトープ体或いはタイプ−特異性のエピトープ体と相互−反応性のエピトープ体の組合せを有する。実施例区画ＩＩ．実験法Ａ．ＰＣＲプライマの設計次の領域は、領域として、高い度のヌクレオチド配列相同性を有するように、プロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルスＭセグメント("PHV;GenBank番号X5 5129)及びピュウマラ株K27("PUUM";GenBank番号M14627)の間に配置することにより、プライマ合成するための候補として同定された。次のプライマが、同様のプランで設計されたが、ＰＨＶ(GenBank X55128)のＳセグメント或いはピュウマラウイルス(Genbank M32750)を、プライマ設計の鋳型として用いる。プロスペクトヒルとピュウマラウイルスの間に配列同様性に基づいてすべて設計された、上記のプライマに加えて、HARDSウイルス自体（3H226 G1 1275クローンの３’位置）から得られたヌクレオチド配列からの２つのプライマを設計した。これらは、Ｂ．反応混合物及び条件：逆転転写及び”第１回”ＰＣＲ最初の反応混合物（逆転転写及びその後のＰＣＲ熱サイクル）は、次のようである。すべての混合物は、各々１０ｐモルのプライマ（実施例II参照）（例外的に、ＭＨＡＲＧ３９２反応物は、各々５０ｐモルのプライマを有した）；１．７ｍＭの２−メルカプトエタノール；１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂；１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；５０ｍＭのＫＣｌ；各々、２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰ；１０単位のＡＭＶ逆転転写酵素(Boehringer- Mannheim)、及び２．５単位のAmpliTaq(TM)のＤＮＡポリメラーゼ(Perkin-Elmer )を、１００μｌの最終容量にする。すべての反応剤を、０．６mlのEppendorf管に添加した後、管を、３滴の鉱油(Perkin-ELmer)で重ねた、そして、最終サイクラーに入れた。各々の管は、４２℃に１時間加熱し、次に、各サイクル当り９４ °−３７°−７２°に各々１分間、１分間及び３或いは４分間に、８サイクルして、次に、９４°−４０°−７２°の（各々１分間、１分間及３或いは４分間）、３２〜４２以上のサイクルで処理した。Ｃ．”第２回”ＰＣＲ上記の最初の増幅の後に、ＭＨＡＲＧ２３９２増幅を除いて、すべての試料に、”ネステイング”ＰＣＲ反応の形式にかけた。その中で、増幅された生成物は、更に、増幅の第１回において用いたものに内部のものを用いることにより更に増幅された。3H226 Ｍ 1225反応の場合、アンチセンス・プライマは、第１回で用いたプライマと同じであり、3H226 Ｓ 1229、3H226 Ｍ 2038、3H226 Ｇ１ 1275の第２回の増幅は、全く新しいプライマセットで再増幅された；各々”第２回”プライマを各々５０ｐモルを用いた；そして、反応成分は、第１回のものと同じである（２−メルカプトエタノール或いは逆転転写酵素を添加することを除いて）。 ”第２回”ＰＣＲ生成物は、９４°−４０°−７２°に（各々１分間、１分間及び３分間に）の熱サイクルを８サイクルして、次に、９４°−４２°−７２° に（各々１分間、１分間及び３或いは４分間に）のサルクルを、３２〜３８サイクル行なった。次に、反応物を、７０°に１０分間に伸長工程にかけた。次に、第２回のＤＮＡ生成物（或いはＭＨＡＲＧ２３９２の場合、第１回のもの）は、１．２〜１．６％アガロ−ズゲル上に載せて、１時間、８０Ｖで電気泳動させて、そして、適当な分子量の帯域を、カミソリ刃で検査した。ヨウ化ナトリウム溶液中にゲルを溶解した後に、ＤＮＡを、ゲルから、ガラス−ミルク樹脂(Qia ex樹脂,Qiagen Inc.,9529Elton Ave.,Chatsworth,CA 91311)で抽出した。Ｄ．ＰＣＲ生成物及び細胞形質転換のクローニング樹脂(Qiaex樹脂についての指示書に従って)を洗浄した後に、ＰＣＲ生成物は、１０μｌの滅菌中に取った。そして、５〜１０μｌを、製造者の指示書に従って(Invitrogen Corp.，San Diego，CA，USA)、ｐＣＲＩＩベクターに配位結合させた。１０μｌの配位混合物の１μｌを、製造者の指示書(Invitrogen)に従って、大腸菌に転写するのに用いた。そして、転写された細胞を、５０μｇ／mlのアンピシリン及び０．００５％Ｘ−Ｇａｌを含有するＬＢ培体上に載せ；そのプレートを、３７°で一昼夜培養した。清浄なコロニーを、次の朝、プレートから選択し、５０μｇ／mlのアンピシリン含有のＬＢ媒体４ml中に展開せしめた。プラスミドＤＮＡは、標準的な方法により、培養物から作られた。次に、種々の制限酵素により消化せしめ、正確なインサートが得られるようにした。正確な制限酵素消化パターンを有するようなクローンを、US BiochemicalsでのSeguena se(TM)配列システムの製造者に従って）、ＤＮＡ配列化にかけた。そして、新規なハンタウイルスのために適する特性を有するＤＮＡが、増幅され、クローン化されたことが証明された。特に、前記のハンタウイルスプロスペクトヒル、ピュウマラ及びソウル・ウイルスと強く同性のある（然し乍ら、同じものでない）もの及び、ヌクレオチド配列から予想できる、たんぱく質生成物の保存物を見つけた。使用のために、形質転換細胞は、上記のような、たんぱく質生成のための通常の処理法によりスクリーンされ、そして、生成物は、所望の特性を有するようにスクリーンされる。ＩＩ．クローンの説明次の表は、上記から得られた５つの例示のクローンの各々の特性を説明する。 III.HARDSウイルス抗体のための血清学的免疫検定体Ａ．抗体の製造本発明の抗−HARDS抗体を上げるために、上記で説明されるように、実施例ＩＤで得られたｒＤＮＡ抗原を、周知の方法で、通常のルートで（普通、腹腔内に）、ホスト動物に投与される。次に、ホスト免疫グロブリンを、通常の方法で、例えば、免疫化された非溶解性の抗原の免疫吸着で、親和力クロマトグラフィにより、抗原−特異性−抗体のためのスクリーンされた。代替できるスクリーン技術には、通常のスクリーン免疫検定法での、トレーサー標識抗原或いはトレーサー標識抗グロブリンを使用すること、典型的には、抗体の特異性を評価するための、生成物免疫体−抗体複合体の沈殿形成及び、共存するトレーサーの定量によるものである。特に重要なものは、酵素−結合の検定体処理法であり、酵素の基体、酵素活性に反応する染色物を含むシステム中でのパ−オキシダ−ゼのような免疫反応性−結合の酵素を用いた標準的なＥＬＩＳＡプロトコールのような酵素 −結合の検定体処理であり、標準的なＲＩＡプロトコール及びウエスタンブロット免疫検定体のような放射性異性体結合の検定体である。Ｂ．マイクロ滴定皿マイクロ滴定皿の凹部は、HARDSウイルスに対して展開された血清試料抗体の免疫化のために、ヒトＩｇＭに直接に対応する山羊ＩｇＧで被膜されている。Ｃ．HARDSウイルス抗体のための酵素免疫検定血液試料を、ＩｇＧ−処理のマイクロ滴定凹部にかけ；次に、その凹部を洗浄し、上記の試料ＩＤから、精製された（任意に、溶解した）ｒＤＮＡ抗原で処理し、HARDSウイルス抗体に基本的に特異性のあるように選択される。洗浄後、凹部を、上記のＡで製造された、ビオチン標識された抗−HARDS組換え抗原うさぎ抗体で処理する。ストレプタビヂン−共役のアルカリ・フォスファターゼを、結合ビオチン−標識の抗体の検出に用いる。色素体アルカリ・フォスファターゼ基体は、共役体のストレプタビヂン部分を通して、ビオチンと結合したアルカリ・フォスファターゼを検出するために用いられる。Ｄ．支持データ血清試料が、４人の患者でテストされた（その２人は、入院後１〜７日内にテストされ、即ち、”急性”であり、その２人は、入院後２２〜２３日でテストされ、即ち、”回復期”である）。これらの血清試料は、ウエスタン免疫ブロット検定体中の特異性の抗体の存在について、テストされた。ウエスタン・ブロット上に存在する抗原ターゲットは、HARDSウイルスのＧ１とＮクローンによりエンコードされた部分を含有したバクテリア融合たんぱく質である。バクテリア融合たんぱく質は、誘導性の組換え発現プラスミドを含有した大腸菌のリゼイトから作られた。ウエスタン・ブロット隔膜上に含有されるウイルス融合たんぱく質は、（ａ）発現プラスミドpATH23（ＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ）中にサブクローンされたクローン3H226 G1 1275 CR-1のHARDSウイルスＧ１配列によりエンコードされたたんぱく質；（ｂ）ピュウマラ(Puumala)ウイルス株Ｐ３６０の全Ｇ１たんぱく質；（ｃ）ピュウマラ(Puumala)ウイルス株Ｐ３６０の全Ｎたんぱく質；及び（ｄ）融合されたウイルス領域のないたんぱく質ｐ３７^{trp E}を含む。隔膜が、ヒト血清試料で培養された後に、隔膜を洗浄し、アルカリ・フォスファターゼ −共役の山羊抗−ヒトＩｇＧ（すべて４人のヒト血清）で培養した或いは、山羊抗−ヒトＩｇＭ（４人のうちの３人のヒト血清）で培養された。各々の場合、HA RDSに感染していない人からのネガテブ参照ヒト血清を、並行に、複製のウエスタン・ブロット隔膜をプルーブするために用いた。図１は、４人の抗体により示された典型的なパターンを示す。４人すべての血清試料は、容易に検出でき、特異化された抗−ハンタウイルスＩｇＧ反応性を示したが、その３つは、すべて、抗−ハンタウイルスＩｇＭについてテストされた。特に、著しいものは、Ｇ１１２７５（HARDSウイルス）たんぱく質は、HARDS ウイルス感染（ＩｇＭ及びＩｇＧ）を持つすべてのテストされた患者からの抗体と強く反応したことが観察されたことであるが、然し、ピュウマラ(Puumala)ウイルスの同等な領域は、４人すべてのHARDS感染血清抗体とも認められなかった。逆に、ピュウマラ・ウイルスのＮたんぱく質は、テストされた各HARDS患者のＩｇＧ及びＩｇＭと強く反応し、ハンタウイルスＮたんぱく質は、すべての関連のハンタウイルスに対しての抗体により認められるエピトープ体を含有しているという仮説を裏付けしている。ネガチブ参照血清は、ウイルス−特異性の帯域を認めなく、血清は、Trp Ｅたんぱく質は、融合ウイルスたんぱく質部分がないときに、発現していることを認識しなかった。ピュウマラ(Puumala)ウイルスＮたんぱく質が、HARDS抗血清により、よく認識されていたために、Ｎたんぱく質の大部分をエンコードしているクローンp3H226 1129 CR-7のインサート、HARDSウイルス・クローンは、Trp Ｅ融合たんぱく質として発現されており、ピュウマラ(Puumala)ウイルスＮたんぱく質中に存在するエピトープ体を含有しているものであることを意図している。また、HARDSウイルスＮたんぱく質は、同類のウイルスから誘導されるものであるので、抗−HA RDSウイルス血清でプルーブされたときには、更に、或いは、ピュウマラ(Puumal a)ウイルスＮたんぱく質よりも能力があるエピトープ体を有することが明らかにされることを意図している。関連のHARDSウイルスクローンのヌクレオチド配列(及び予想されたアミノ酸配列)は、Ｇ１遺伝子は、ウイルス−特異性のエピトープ体をエンコードし、Ｎ遺伝子は、より広く活性であるエピトープ体をエンコードしているという理論を裏付けている。HARDSウイルスＮたんぱく質は、HARDSウイルスとその関連のピュウマラとプロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルスの間に強く保存された(図２ )が、HARDSウイルスのＧ１たんぱく質の多くの領域は、ピュウマラ(Puumala)とプロスペクトヒル(Prospect Hill)の同類の領域にほとんど配位されていない（図３）。一般的に、分散たんぱく質に接することにより生成された抗体は、相互反応しないが、非常に関連したたんぱく質が、そのたんぱく質基の数個と認識する（即ち、相互−反応性である）抗体を引き出す傾向があることが期待できる。区画II IV.実験方法：Ａ．Trp E-HARDS Ｇ１たんぱく質発現が可能になるように設計されたpATH23− 基づく発現構築物の製造（他のｐＣＲIIクローンから他の発現構築物を生成するために用いる方法の例）クローンp3H226 G1 1275 CR-1を、制限酵素Hind III及びXba Ｉで切断した。そして、得られた１．３キロ塩基(kb)のインサートを、１％の電気泳動したアガロ−ゼゲルで切断した。pATH２３ベクター[Method Enzymol．194;477-90，1991 参照]は、同じ酵素で消化され、そして、消化生成物（〜３．９ｋｂ）は、ゲルから同様に精製された。1.3kb HARDSウイルス帯域("挿入物：インサート")は、酵素−消化のベクターと混合され、Hind III及びXba Ｉ−生成の末端は、標準的な技術により、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより結合された。リガーゼ結合混合物は、有能な大腸菌、株ＪＭ１０１を形質転換するために用いられ、次に、バクテリアは、ＬＢ培地、１．４％のアガローゼと５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するプレート上に接地された。コロニーを採取し、３７°で引き伸ばされ、一方、５０μｇ／mlのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で、３００ｒｐｍで撹拌して、プラスミドＤＮＡを標準的な方法で単離した。クローニングが成功したことが証明されたが、得られたプラスミド・クローンp3H226 G1 1275 pATH-1を、制限酵素により切断し、約１３００ｎｔのインサート及び３．９ｋｂのベクター帯域を遊離するものである。これが、観察されたものである。Ｂ．プウマラウイルスでエンコードされた融合タンパクの製造プウマラウイルス株Ｐ３６０の全Ｍ及びＳセグメントの分子クローンは、メリーランド州、フレデリックの米国陸軍の感染病研究所のコニ− シュマルジョン (Connie Schmaljohn)博士から得られた。分子クローンシュマルジョン博士は、ピュウマラウイルスのこれらのたんぱく質の発現にためにpATH発現構築物を生成するために用いられた。そのウイルスは、生成されたHARDSウイルスクローンと同類である。これらの構築物は、HARDSウイルス及びその関連体で感染されたヒト及び動物の免疫反応中で、相互反応の程度を確認する手段となる。Ｃ．Trp E-G1融合たんぱく質発現の誘導 Trp Ｅ−ハンタウイルス融合たんぱく質を発現し、精製するために用いる方法は、互いに融合するたんぱく質、或いは融合しないネイチブ抗原として、大量のハンタウイルスたんぱく質を作るために使用する方法の１つとして、提供される。融合たんぱく質或いは融合されないｐ３７^{trp E}のたんぱく質発現及び部分的精製が、説明のように(Methods Enzymol 194:477〜90)行なわれた。簡単に言えば、大腸菌細胞(株ＪＭ１０１)は、プラスミドp3H226 G1 1275 pATH-1を持っており、１ｍＭのＭｇＳＯ₄、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂、０．２％のグルコース、１０μｇ／mlのチアミン、５０μｇ／mlのアンピシリン、０．５％のカサミノ酸及び３０μｇ／mlのＬ−トリプトファンで補給された５mlのＭ９最小培地中に、展開された。静置された相生長を達成した後、培養物を、４５mlのＭ９／カサミノ酸欠乏外因性のトリプトファンに添加し、３００rpmで撹拌しながら、３０° で１時間生長させた。この点で、インドール酢酸を添加し、５μｇ／mlの最終濃度にし、誘導を、４〜１８時間、３０°で連続的に撹拌して、行なった。細胞は、遠心分離法により、濃縮され、氷上で、５０mMのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、５ｍＭのＥＤＴＡ及び２０ｍｇのリソチームを含有する緩衝塩物１０ｍｌ中に懸濁された。懸濁された細胞は、デタージェント・トリトンＸ−１００を添加し、０．８％の最終濃度にすることにより、溶解された。そして、ＮａＣｌを含有し、３００ｍＭの最終濃度にした。不溶性のたんぱく質部分を、氷上で、３０分間で、沈殿させ、次に、溶解しないで残った細胞を、超音波処理により、分裂せしめた。更に、氷上で３０分間沈殿せしめた後、不溶性のたんぱく質を、16,000× gで、１０分間の遠心分離法により、沈殿処理した。沈殿物を、０．５％のＳＤＳと５％のベータメルカプトエタノールを含有するラエムリ(Laemmli)緩衝塩０．５ml中に再懸濁せしめた。ハンタウイルスたんぱく質の濃度は、融合たんぱく質を、ＳＤＳ−ポリアルクリルアミドゲル電気泳動により、汚染バクテリア精製物から分離し、そして、融合たんぱく質帯域の肉眼で観察することにより、融合たんぱく質量を測定することにより、計算された。 IV.ウエスタンブロット検定上記で得られた組換体ｐ３７^{trp E}−ウイルス融合たんぱく質約５μｇ（或いはｐ３７^{trp E}自体）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための１２．５％ポリアクリルアミドゲルのレ−ン当りに載せる。２００Ｖ、４５分で電気泳動分離した後、ゲルをウエスタンブロット電気泳動移送装置中に置いた。そして、ニトロセルロ−ズ膜上に、４°で、１００Ｖ、１時間で電気泳動移送されたたんぱく質は、陽極に向かって移送されたゲルたんぱく質を有する。ウエスタン・ブロット検定体中のプルーブとして用いる血清は、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．５と０．５ＭのＮａＣｌ（”ＴＢＳ”）と、１％の粉末ミルク（カルネイション）、５％のリゼイト化大腸菌抗原（後記）、０．１％のトリトンＸ−１００及び０．１％のデオキシコール酸を含有するバッファ中で４° で一昼夜培養することにより、大腸菌抗原に対して、１：２００の濃度で、予備吸着された。大腸菌抗原は、上記のように、１００mlのＪＭ１０１細胞の中で、４時間、ｐ３７^{trp E}を誘導することにより作られた；細胞は、次に、３０００ ×ｇで、１０分間遠心分離で、沈殿せしめ、沈殿物を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２％ＳＤＳと５ｍＭのＥＤＴＡを含有する３．６mlのバッファ中に懸濁した。細胞は、超音波処理により、加熱して、溶解せしめ、沸騰水浴中で、５分間加熱して、上記の予備吸着のバッファ中に添加されて、最終濃度５％にした。予備吸着のバッファの正確な含有量は、必要により、調整され、そして、たんぱく質発現の各システムのために最適にされ、抗体特異性と検査される免疫グロブリンのサブタイプにより、最適化された。隔膜は、トレイ上に置かれ、そして、ＴＢＳ洗浄バッファ中の１％粉末ミルク中に、３０分間で、室温で浸漬せしめることにより、予備処理された。ミルクバッファを除去した後に、血清／予備吸着のバッファを、トレイに添加し、一昼夜、４°で、撹拌しながら、培養した。朝に、血清／予備吸着混合物を除去し、隔膜を、洗浄バッファで、３度洗浄した。アルカリ・フォスファターゼ−共役の山羊抗−ヒトの抗体は、ヒトＩｇＧ或いはＩｇＭ（デタージェントある、なしでのＴＢＳ中の１％ミルク中に、１：１０００で希釈した）に対するもので、隔膜に積層するために用いられ、そして、抗−ヒトＩｇ抗体は、２時間、室温で、結合できるものである。次に、隔膜を３度洗浄バッファで洗浄し、そして、次に、アルカリ・フォスファターゼの存在下で、色素体生成物を作る基体（ニトロ・ブルーテトラゾリウム及びＢＣＩＰ）に接せしめた。十分に色素展開した（３〜２０分間）後に、隔膜を、水中で、繰り返し洗浄し、残査基体を除去した。 VI.結論１．HARDSウイルス(p3H226 G1 1275 CR-1)のcＤＮＡクローンの１つから発現されたＧ１−エンコードされたたんぱく質は、HARDSウイルスに感染された患者からの抗体により認識される抗原エピトープ体を含有するが、近い関係のハンタウイルス（例えば、ピュウマラ(Puumala)）に感染した患者からの抗体では認識されないエピトープ体である。２．HARDSウイルス（クローン p3H226 S 1129 CR-7，図１)のＮ−エンコードされたたんぱく質は、HARDSウイルス感染に応答して作られたヒト抗体により認識され、そして、近い関係のハンタウイルス（例えば、ピュウマラ・ウイルス）の感染に応答して作られた抗体と反応する、広い反応性のあるエピトープ体を含有する。この抗原は、ＲＮＡ HARDSウイルスとその関係物の感染物に迅速な感度のあり、特異に検出するために、特に、優性の抗原であるようである。特に、Ｇ１−エンコードされたタイプの特異性の抗原内の抗原性変更が、異なる株の間で生じる場合に、それは、HARDSウイルスの分散株の感染物を検出し、そして、特徴づけるにおいて、特に有用であることを証明するべきである。３．関係のハンタウイルス各々のＧ１の”HARDS-特異性のエピトープ体”領域は、抗体を取り出すウイルスに特異性のある抗体を取り出すものである比較エピトープ体を持つものである。これは、見出されるとき、新規なハンタウイルスに伸ばされ、それにより、ハンタウイルス遺伝子の古い或いは新規なものから、Ｇ１エピトープ体領域を増幅するためのＰＣＲ−基づく方法を開発することが可能になり、このクラスの新規な毒素にためのタイプ−特異性の診断キットを非常に急速に展開することを可能にする。４．ここに挙げたHARDSウイルスの抗原性エピトープ体を含有するＧ１とＮのたんぱく質を説明すると、既知の方法により、ウイルスに感染した組織培養物から、ウイルス抗原を用意に同定でき、単離できる。更に、上記のたんぱく質の等価物の合成は、上記のように、所望により、テキストブックの実験で容易にできるものである。 HARDSウイルスのＧ１とＮのたんぱく質中で同定された、説明されたエピトープ体は、アミノ酸の非常に限定された配列により、決められるようである。優性エピトープ体は、HARDSウイルス配列の２０〜３０個以下のアミノ酸の中に含有されるものと期待される。共発明者の実験及びその他（ハンタウイルス以外について研究した者）の実験により、他のハンタウイルスは、HARDSウイルスのタイプ特異性のエピトープ体を含有する同類であるＧ１領域内に、タイプ−特異性のエピトープ体を有することを証明するものと期待されている。優性エピトープ体をエンコードしているヌクレオチド配列を側面に有する保存されたプライマを使用して、増幅を可能にするＰＣＲシステムで、新規なハンタウイルスの免疫優性の領域は、既知の原理により、このように、展開できる。区画III IV.実験方法Ａ．HARDSウイルスＳセグメントヌクレオチド配列の増幅ヌクレオチド位置４〜４２３を示すHARDSウイルス（ＨＨＶ）Ｓセグメントの付加的部分は、クローン化され、クローンp3H226 Ｓ 419 CR-1を作る。このクローンは、ＨＨＶＮたんぱく質の開始ＡＴＧを含有する。前記のＳセグメント・クローンを積層していないp3H226 Ｓ 419CR-1のその部分のヌクレオチド配列、p 3H226 Ｓ 1129 CR-7が決定された。これらの配列に基づいて、都合よく増幅でき、新規のクローンの第１の１００アミノ酸をサブクローンし、発現することができるＰＣＲプライマが設計できる。この（検出）プライマは、配列ＴＡＣＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧを有し、ここで、結合されたヌクレオチドは、酵素Hind IIIのための認識サイトを作りあげ、そして、Ｎたんぱく質に開始メチオニンをエンコードするＡＴＧから始まる、確実なＨＨＶ配列が続くものである。ＨＨＶのＮ−終端の１００アミノ酸を増幅し、サブクローン化するために、アンチセンス・プライマは、配列５’ＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧ３’を有するように設計された。このプライマは、ネイチブ配列の５’ＣＴＡＧＡＡが、配列ＣＴＣＧＡＧで置換されること以外、確実なＨＨＶ配列に基くものである。このパリンドローム配列の補体は、上記のプライマ配列中で結合される。ＣＴＣＧＡＧは、制限酵素Xho Ｉのための認識サイトを特異化するが、Ｎ遺伝子によりエンコードされたたんぱく質の配列を変えるものではない。上記のセンス及びアンチセンス・プライマにp3H226 Ｓ 419CR-1を増幅した後、３１７ｂｐ生成物が得られ、Hind IIIとXho Ｉで消化された。pATH２３のプラスミド誘導体、pATH HT-1と称されるものも、同じ２つの酵素で、消化された。（pATH HT-1は、pATH２３を、Xba Ｉ及びＫｐｎＩで消化することにより、元々作られ、各々のサイト上に、Xho Ｉサイト、及び６ヒスチジンコドン内部に、Xba Ｉ及びＫｐｎＩの”付着性端末”を有するように、設計された２重鎖のオリゴヌクレオチドを挿入する。）ＰＣＲ生成物、今や、消化後は、約２９９ｎｔの長さであるものは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、pATH HT-1中に挿入された。得られた発現構築物は、誘導後は、約５２ｋＤ見掛けＭＷ（ＡＭＷ）の重複溶解性たんぱく質を作るもので、"p3H226 Ｓ 317 pATH-1"と称するものである。以下で論じるように、誘導により作られた融合たんぱく質生成物中に含有されたＨＨＶＮたんぱく質の１００ＡＡは、HARDSウイルス感染のヒトのための可能性のある抗原エピトープ体を隠し持っているものである。Ｂ．trpE-HHV N-たんぱく溶融たんぱくの製造のための発現構築物の製造発現クローンは、ＨＨＶＮたんぱく質の第１の４０７のアミノ酸を発現するための構築された。プラスミドp3H226 Ｓ 1129 CR-7は、下流にあるが、ＨＨＶクローンp3H226 Ｓ 317 pATH-1のものと重なるＮたんぱく質遺伝子のコーディング配列を含む。p3H226 Ｓ 317 pATH-1のコーディング配列は、p3H226 Ｓ 1129 C R-7の配列と結合されて、より大きな発現構築を形成し、それは、単一のたんぱく質分子中に存在するＨＨＶＮ遺伝子ＤＮＡのすべての発現を可能にする。それを行なうために、ＰＣＲのためのセンス・プライマを製造し、p3H226 Ｓ 317 pATH-1を作るために用いられるアンチセンス・プライマに重なる。重なる領域は、人工的なXho Ｉサイトである。増幅するためのセンス・プライマは、従って、ＡＴＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧであった。アンチセンス・プライマのために、p3H226 Ｓ 1129 CR-7を作るために元々用いるプライマの新規なものは、選択された。Han Ｓ１２７２の新規なもの−プライマは、古いものとは異なり、その５’端に近い制限酵素Xba Ｉのための認識サイト：ＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣを含有するものである。 p3H1226 Ｓ 1129 CR-7を鋳型として用いて、約９００ｂｐの増幅物（アンプリマ）は、上記の２つのプライマを有するＰＣＲにより作られた。アンプリマは、 Xho Ｉ及びXba Ｉにより消化され、〜２９９ｂｐ Hind III／Xho Ｉに配位結合され、上記の（ａ）に記載された消化されたアンプリマ、pATH HT-1、Hind III 及びXba Ｉで消化されたものである。”３つの方法”の配位結合が、生じた（図５）。得られた生成物は、p3H226 Ｓ 1229 pATH-7と称された（図７）。それは、互いに適切な距離をもって間隔をとった２つのXho Ｉサイトと１つのHind-IIIサイトを含む正しい制限マップを有するように示され、標準的な誘導法の後に、ＡＭＷ〜７５−７８ｋＤの不溶性のtrp Ｅ融合たんぱく質を多量に作る。他のtrp Ｅ−ＨＨＶＮたんぱく質融合たんぱく質を作る発現構築物が作られた。p3H226 Ｓ 1129 CR-7のインサートは、サブクローン化され、pATH１０にされ、p3H226 Ｓ 1129 pATH-1を作るために、そして、p3H226 Ｓ 1129 CR-7の〜７５０ bp Eco-RI Eco RIフラグメントをpATHにサブクローン化し、p3H226 Ｓ RI pATH-1を作るために、用いられた。これらの発現構築物の両方は、不溶性trp Ｅ −ＨＨＶＮたんぱく質融合物を多量に作り、それは、p3H226 Ｓ 1229 pATH-7 により作られたＨＨＶＮたんぱく質の部分を含有するものである。Ｃ．ＰＨＶ融合たんぱく質の製造のための発現構築物の製造クローンp3H226 G1 1275 CR-1及びp3H226 Ｓ 1129 CR-7のHHV配列に相当するプロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルス（ＰＨＶ）ゲノムの２つの部分は、クローン化され、２つのＨＨＶクローン内に同定された抗原エピトープ体が、ＨＨＶの最も近い親類、ＰＨＶと相互反応するか否かを見るために用いられた。ＰＨＶ鋳型は、１９９３年７月に、National Institutes of HealthのRichard Y anagiharaから貰ったものとして得たウイルスストックから誘導された。Yanagih araのＰＨＶストックは、ＶｅｒｏＥ６細胞に感染するために用いられ、ＰＨＶは、ユニバシテイオブニューメキシコの生安全の３部門中で伝搬された。ＰＨＶｃＤＮＡは、ＨＨＶの相当する部分（上記）をクローン化するに用いたものと同じ条件下で感染培養物から作られたＲＮＡから、クローン化された。得られたクローンは、pPHV G1 1275 CR-1及びpPHV S 1129 CR-1と証された。ＰＨＶインサートは、ｐＣＲＩＩベクターから移動され、pATH発現構築物p3H226 G 1 1275 pATH-1及びp3H226 Ｓ 1129 pATH-1を作るために用いたとほぼ同じ方法により、pATH発現ベクター中に移転せしめた。発現構築物は、適当なサイズの不溶性trp Ｅ融合たんぱく質を作るために良好なものであることが証明された。Ｄ．ＨＨＶＧ１エピトープ体１２７５ｎｔＨＨＶＧ１の遺伝子クローンのたんぱく質生成物により特異化された優性エピトープ体の位置は、２３のアミノ酸内に決められた。そのエピトープ体に反応する抗体は、ＨＨＶ感染に特定すると見出された：HARDS患者からの血清試料は、ＰＨＶの1275nt Ｇ１たんぱく質中に、決定因子を認めない（ HARDS患者は、ピュウマラウイルスＧ１たんぱく質と相互反応性の抗体がない；上記のIIIＤ参照）。ＨＨＶＧ１のエピトープ体をマッピングするために、(Promega Erase-a-Bas e（TM）システム,Promega Corp;Gene 28;351〜359,1984参照)、インサートの３ ’端でのサイトを認識する制限酵素を線形化した後に、プラスミドp3H226 G1 12 75 pATH-1の〜２０の連エキソヌクレアーゼ／Ｓ１ヌクレアーゼ欠失を作った。各々の新規な欠失構築物は、相当するTrp Ｅ−ＨＨＶＧ１融合たんぱく質を発現するように誘導された。一連の融合たんぱく質は、見掛けＭＷにより特徴づけられ、種々のサイズのたんぱく質を選択して、ウエスタン・ブロット分折のためのニトロセルロース隔膜に移転された。ウエスタン・ブロット薄膜は、ＨＨＶ感染からの回復している２人各々からの血清試料でプルーブされ、アルカリ・フォスファターゼ−共役の山羊の抗−ヒトＩｇＧでプルーブされた。HARDS患者血清試料との反応性を示す一連のもので、最も小さいたんぱく質は、Ｇ１（ＰＨＶＭセグメント共役子を用いて、ＰＨＶの開始メチオニンで始まる）のアミノ酸３７〜９１を決めるＤＮＡ配列を含有するクローンの生成物であった。両方の患者の血清試料は、その切り詰められたたんぱく質と強い反応性があるが、アミノ酸３７〜６６を含有した欠失鎖の隣の最も大きなものにより作られたたんぱく質と反応性がないものであった。このことから、ＨＨＶ感染の患者により認識されるp3H226 G1 1275 pATH-1のたんぱく質生成物のエピトープ体は、Ｇ１たんぱく質のアミノ酸６６〜９１の間にあるものと結論された。たんぱく質のその部分のアミノ酸配列は、ＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳである。ヒトからのネガテブの参照血清試料は、欠失鎖の部材のたんぱく質生成物に対して反応がないＨＨＶに接していないものと仮定してあった。ＰＨＶクローンpPHV G1 1275 pATH-1及びpPHV Ｓ 1129 pATH-1のたんぱく質生成物は、ＨＨＶ感染から回復しつつある２人の患者の血清試料に対して反応性について、テストされた。pPHV Ｓ 1129 pATH-1のＮたんぱく質生成物に対して穏やかな反応性が観測された（ＨＨＶＮ遺伝子クローンp3H226 Ｓ 1129 pATH-1 の生成物で見られるよりも小さなブリスクであるが）、然し乍ら、pPHV G1 1275 pATH-1（Ｃ、上記）の生成物に対して反応性がない。これらの結果から、ＨＨＶで感染されたヒトは、他のハンタ・ウイルス（ピュウマラ(Puumala)とＰＨＶ）と相互反応しないＨＨＶＧ１たんぱく質に対して抗体を生成したことが確認された。従って、上記のＨＨＶＧ１たんぱく質エピトープ体は、抗体−特異性で、そして、ＰＨＶ感染、ピュウマラ・ウイルス感染或いは同定されるべき他のハンタウイルス感染に応答して、抗体からのＨＨＶ感染に対して応答する抗体を区別するために、非常に有用であるＨＨＶである。Ｅ．ＨＨＶＮ−たんぱく質エピトープ体−発現構築体及び抗原活性ヒトのＨＨＶ感染の血清学検定体中で独立に使用できるＨＨＶＮたんぱく質の少なくとも２つの独立のエピトープ体が、同定された。ＨＨＶＮたんぱく質の異なるドメインを発現するように設計された４つのプラスミド構築物が、上記のように生成されたものである。上記にない更なるクローンは、インサートの３ ’２６２ｎｔ及びp3H226 Ｓ 1129 CR-7の３’ＰＣＲプライマのみを特異化してい、p3H226 Ｓ 238 pATH-1と呼ばれる。次の表は、５つのクローンの特性を示す。融合たんぱく質が、各々の構築物から多量に作られ、HARDS感染患者からの血清ＩｇＧ抗体を検出するために、ウエスタン・ブロット製剤中に用いられた。急性の（５）或いは回復期の（３）のＨＨＶ感染患者からの８つの血清試料各々について、強力で、特異の血清学活性が、p3H226 Ｓ 317 pATH-1の５２ｋＤ生成物及びp3H226 Ｓ 1229 pATH-7の７８ｋＤ生成物に対して示された。然し乍ら、p3H 226 Ｓ 238 pATH-1の４５ｋＤ生成物に対しては活性がない。テストされたすべてのＨＨＶ／HARDS血清は、完全なピュウマラＮたんぱく質に対して活性であるが、確実なＨＨＶＮ遺伝子クローンによりエンコードされたたんぱく質と比べ、減少された強度であった。正常な血液ドナーからのネガテブ参照血清は、いかなる組換融合たんぱく質とも認識しなく、血清は、ＨＨＶ融合部分を欠くｐ３７^{trp E} と反応しない。これらの研究から、ＨＨＶＮたんぱく質の第１の４０７アミノ酸は、少なくとも１つの能力のあるエピトープ体を含有すること、そして、少なくとも１つのこれらのエピトープ体が、第１の１００アミノ酸中に存在することが分かる。エピトープ体は、アミノ酸３２２〜４０７中に存在しないと判断された。第２の実験では、上記の構築物のすべて（顕著なエピトープ体をエンコードしないようなp3H226 Ｓ 238 pATH-1を除いて）により、ＨＨＶ−HARDSで感染した２人の患者からの回復血清試料を、プルーブとして、用いて、発現されたたんぱく質の反応性を検査した。アミノ酸１〜４０７について強力で特定の反応性を再び観察し、アミノ酸１〜１００についての強力な反応性と同様であった。両方に対して穏やかなＩｇＧ血清学反応を、p3H226 Ｓ RI pATH-1及びp3H226 Ｓ 1129 pATH-1の生成物について観測した。優性な抗原決定子は、既に、配位されてい、構築物が、p3H226 Ｓ 317 pATH-1のもの重なる配列を有しないので、p3H226 Ｓ RI pATH-1の生成物の反応性は、顕著である。ネガテブ参照血清は、融合たんぱく質を認識しなく、血清は、ＨＨＶ融合部分を欠けるｐ３７^{trp E}を認識しなかった。これらの実験により、感染患者は、ＨＨＶＮたんぱく質の少なくとも２つの特異性のあるエピトープ体を反応することが分かった。１つのこのようなエピトーブ体は、第１の１００のアミノ酸内に配位されてい、そして、他は、アミノ酸１５５〜４０７により対している。たんぱく質座標３２２〜４０７の抗原活性がないことに基づいて、１５５〜４０７の間のエピトープ体は、アミノ酸１５５と３２１にあるようである。Ｎの第２のエピトープ体（ＡＡ１５５と３２１）の同定は、前記の２−抗原ウエスタン・ブロットについて改良すべき、”３−抗原”組換診断システムを開発することが可能にする。Ｆ．HARDSウイルス抗体の検出展開された２−抗原の組換ウエスタン・ブロット検定体は、感染の初期の段階でさえ、ＨＨＶに感染した患者からの血清ＩｇＧ或いはＩｇＭ抗体を検出するために用いられ、そして、急性のＨＨＶ感染の信頼性のある診断法に用いられる。３０の血清試料についてのブラインド研究で、その２０は、前にＨＨＶにさらされていないコントロール患者から誘導され、その１０は、HARDSを示したＨＨＶ感染した８人の患者からのものである。第２の抗体として、アルカリ・フォスファターゼ−共役山羊抗−ヒトＩｇＧ或いは−ＩｇＭを用いて、結合抗体が、HARD Sの患者（ＨＨＶＧ１とピュウマラ・ウイルスＮたんぱく質の両方に反応性ある）からの１０の試料すべてから検出できた。１０人の患者すべては、ＩｇＧの両方の抗原に反応性があった；１０人のうち９人は、ＩｇＭの両方の抗原に反応性があった。コントロールのうち、１人は、単離されたピュウマラＮたんぱく質にＩｇＧ反応性を示した：ｓ／ｈｅは、”中間体”として標識され、非感染として正確に同定された。ピュウマラ・ウイルスから誘導されたＮたんぱく質について、ブラインド研究を行なったが、そのデータでは、ＨＨＶＮたんぱく質は、ピュウマラＮたんぱく質よりも強く、ＨＨＶ感染の患者からの血清試料に反応することが証明され、そして、ＨＨＶ感染のより感度があるインジケータであることが証明された。区画ＩＶ HARDSの正確な段階での３１の患者からの血清試料（すべて、病院の許可２〜３日で、７の患者の場合、その死亡とそれによる解剖）を試験した。すべての試料は、クローンp3H226 Ｓ 1229 pATH-7及びp3H226 Ｓ 317 pATH-1によりエンコードされたHARDSウイルスＮたんぱく質のその部分で、ウエスタン・ブロットによるＩｇＭとＩｇＧ反応性を有する。３１個の３１及び３１個の２６は、各々、Ｇ１たんぱく質発現構築p3H226 G1 1275 pATH-1によりエンコードされたたんぱく質について、ＩｇＧ或いはＩｇＭ反応性を有する。ＨＨＶＮたんぱく質の優性エピトープ体は、第１の１１０のアミノ酸内に含有されるようである。Ａ．クローンp3H226 Ｓ 317 pATH-1によりエンコードされた１以上のエピトープ体は、プロスペクトヒルウイルス（ＰＨＶ）Ｎたんぱく質の同類の部分（即ち、最初の１１０のアミノ酸）と相互反応性があると判定。ＰＨＶＮたんぱく質遺伝子のその部分が、上記のように、ＰＨＶ−感染のＶｅｒｏ細胞培養物から作られたＲＮＡを用いて、逆転転写酵素（トランスリプターゼ）ＰＣＲによりクローン化された。ＰＨＶにセンス・プライマは、ＰＨＶｃＤＮＡの増幅のために特に合成され、ＴＡＣＴＡＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＣＡＧＧＧＡの配列を有した。アンチセンス・プライマは、ＨＨＶｃＤＮＡの相当する部分を増幅するために上記で使用されたものと同じものであり、配列ＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧを有した。増幅されたＤＮＡは、ゲル精製され、制限酵素ＳａｌＩ及びXho Ｉで消化され（上記のプライマ中に存在する認識サイト）、そして、ＳａｌＩ−及びXho Ｉ−消化pATH HT-1に直接にクローン化された。得られた構築物は、pPHV Ｓ 317 pATH-1と称された。 Trp Ｅ融合たんぱく質は、標準的なプロトコールに従って、ＰＨＶから得られたpPHV Ｓ 317 pATH-1と呼ばれた。結論：ＨＨＶの第１の１１０アミノ酸内に含有される優性エピトープ体は、そのＰＨＶ同類と相互反応性がある。Ｂ．プラスミドクローンp3H226 Ｓ 317 pATH-1によりエンコードされたＮ−たんぱく質の優性エピトープ体の位置マッピングは、このクローンのＤＮＡ・インサートの３’と５’の欠乏の巣にしたものを作り、そして、たんぱく質(Gene 28:351〜359,1984)として、切断された挿入物を発現することにより、達成された。図９は、HARDSの２人の患者（パネルＡ及びＢ）或いは感染されていないコントロール（パネルＣ）からの血清（１：２００希釈度）を有するネストされた欠失鎖の種々の部分から発現された trp Ｅ融合たんぱく質を反応せしめることにより作られたウエスタン・ブロットを示す。この欠失鎖は、p3H226 Ｓ 317 pATH-1プラスミドを、ＨＨＶヌクレオカプシド遺伝子インサートのポリ結合配列配位３’中で線形化し、そして、ウイルスｃＤＮＡの３’端を消化し、エキソヌクレアーゼIII で変えることにより、作られた。たんぱく質鎖は、サイズの大きな、大きなＣ−末端欠失部を有するように作られ、そして、サイズの小さなそして小さなものであった。欠失鎖はいくつかの部材は、テストされた５人のHARDS患者からの血清試料と反応性を有した。５人のHARDS血清試料と反応性のある小さなたんぱく質は、ＨＨＶＮたんぱく質のアミノ酸１〜５９を含有した。逆に、Ｎたんぱく質欠失鎖の次に小さな部材は、HARDS患者血清試料と反応しないものである。そのクローンのヌクレオチド配列は、ＨＨＶＮたんぱく質のアミノ酸１〜４１をエンコードすることを証明する。これらの研究により、ＨＨＶＮたんぱく質の優性エピトープ体のカルボキシ末端基は、アミノ酸４１と５９にあることが分かった。エピトープ体のアミノ末端部を、p3H226 Ｓ 317 pATH-1からのアミノ−末端欠失鎖を作ることによりマッピングした。この連続体は、p3H226 Ｓ 317 pATH-1鋳型からのＤＮＡをＰＣＲ増幅できるように設計された選択されたセンス・プライマを合成し、p3H226 Ｓ 317 pATH-1を作るに元々用いた同じアンチセンス・プライマを用いることにより、構築された。センス・プライマが設計され、増幅されあＤＮＡからの作られたpATH HT-1サブクローンが、Ｎたんぱく質のアミノ末端基の種々の量のないフレームないのtrp Ｅ融合たんぱく質をエンコードするようにされる。テストされた５つのＨＰＳ血清試料のうち２つについて、ＨＨＶＮＩｇＧ抗体は、アミノ−対−カルボキシ末端欠失構築部p3H226-Ｓ-NEx91(aa17-aa110) と反応したが、p3H226-Ｓ-CEx136(aa32-aa110)と反応しなかった。これらの反応性は、ａａ１７とａａ３２の間のエピトープ体のアミノ末端基境界に存在した。これらの２つの血清試料について、エピトープ体マッピングデータにより、エピトーブ体は、ＨＨＶＮａａ１７とａａ５９の間にあることが示される。このセグメントのアミノ酸配列は、ＱＬＶＴＡＲＱＫＬＫＤＡＥＲＡＶＥＬＤＰＤＤＶＮＫＳＴＬＱＳＲＲＡＡＶＳＡＬＥＴＫＬＧである。ＰＨＶ及びピュウマラウイルスＮたんぱく質の相当する部分の配列は、ＱＬＶＩＡＲＱＫＬＫＥＡＥＲＴＶＥＶＤＰＤＤＶＮＫＳＴＬＱＳＲＲＳＡＶＳＴＬＥＤＫＬＡ及びＱＬＶＶＡＲＱＫＬＫＤＡＥＲＡＶＥＶＹＰＤＤＶＮＫＮＴＬＱＡＲＱＱＴＶＳＡＬＥＤＫＬＡである。テストされた他の３つのＨＰＳ血清試料について、抗体反応性は、テストされた（ａａ６０まで延びる）アミノ−対−カルボキシ末端基欠失クローンのすべてについて観察された。これらの反応性により、p3H226-Ｓ-330のＮセグメントは、ａａ１７とａａ５９の間のエピトープ体に関するカルボキシ末端基の近くに配置された第２の抗体−反応性のエピトープ体を含有することが分かる。上記のデータは、ａａ１７とａａ５９の間に配置されたＮエピトープ体が、ＰＨＶＮとピュウマラウイルスＮたんぱく質を有するＨＨＶＮ抗体の相互−反応性について責任がある優性エピトープ体であることを示唆している。Ｃ．ＨＨＶＮたんぱく質の優性エピトープ体に対する血清反応性反応性は、ＨＨＶ感染に特異化される。１２８の参照目的物から得られた血清試料を、ＨＨＶ及びＧ１たんぱく質に対するＩｇＧ抗体反応の試験にかけた。上記のＨＰＳの場合とは逆に、参照血清試料（０．８％）の１つのみが、ＨＨＶＮ及びＨＨＶＧ１組換たんぱく質の両方に対して抗体を含有していた。１２８の参照の血清試料のうちの９つ（７％）は、ＨＨＶＮたんぱく質と反応した抗体を含有した。参照のものの間にあるＮ抗体反応性は、確認されたＨＨＶ−誘導抗体により認識されたエピトープ体とは異なる抗原サイトに対してマップした。従って、参照のものの間にあるＮ反応性は、遠くの認識されたいないＨＨＶ感染物から得られるものではないようである。これらのＮ反応性は、異なる、多分、非特徴の、ハンタウイルスの感染物により誘導された相互−反応の抗体を表示している。それらは、ＨＨＶＮたんぱく質中のエピトープ体と偶発的に相互反応する無関係の抗原により誘導される抗体を表示しているようである。これらの抗体は、ＨＨＶ−誘導の抗体により認識された優性Ｎエピトープ体とは異なるエピトープ体を認識すると観察されるが、それが、真正のポジテイブＨＨＶＮ抗体の反応性を、虚偽のポジテイブ反応性から区別する手段になる。Ｄ．Ｇ１たんぱく質マッピング１２７５ｎｔＨＨＶＧ１遺伝子クローンのたんぱく質生成物により特定された優性エピトープ体のカルボキシ末端境界の位置が、２３のアミノ酸内に決められた。エピトープ体のカルボキシ末端基は、p3H226 Ｇ１ 1275 pATH-1のＨＨＶインサートの３’端の欠失のネストされた一連のものを製造することによりマッピングされた。同様の方法を用いて、p3H226 Ｇ１ 1275 pATH-1インサートの５’欠失のものの一連のものを製造した。後者の一連のものは、Ｇ１たんぱく質エピトープ体のアミノ−末端の境界をマッピングするために用いられる。ＨＨＶＧ１−反応性抗体は、p3H226-Ｍ-NEx222たんぱく質(aa59〜aa452)と反応したが、p3H226-Ｍ-NEx297たんぱく質(aa84〜aa452)とは反応しない。アミノ酸配位８４を超えて、欠失された、すべてのアミノ−対−カルボキシ末端基欠失構築物は、ＨＨＶＧ１−反応性抗体と反応しない。従って、タイプ−特異性のエピトープ体のアミノ末端基の境界は、アミノ酸配位５９と８４の間にある。上記にあるカルボキシ末端基欠失の一連のものからのマッピングデータと接合をとると、Ｇ１免疫活性は、ａａ５９とａａ８９の間の単一セグメントに配置された（アミノ酸配列の配位は、プロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルスの配列中に相同性の位置に関して決められる）。ポリペプチド・セグメントは、アミノ酸配列ＬＫＩＥＳＳＤＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳを有する。この配列は、プロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルス（ＬＫＬＥＳＳＣＮＦＤＶＨＴＳＳＡＴＱＱＡＶＴＫＷＴＷＥＫＫＡＤ）及びピュウマラ・ウイルス（ＬＫＬＥＳＳＣＮＦＤＬＨＴＳＴＡＧＱＱＳＦＴＫＷＴＷＥＩＫＧＤ）の相同性の領域から分岐したものである。このセグメント内でのアミノ酸配列の修正の程度は、ＨＨＶＧ１−反応性抗体が、ＰＨＶ及びピュウマラ・ウイルスのＧ１たんぱく質の相同性領域と相互反応しないという観察と合致している。以下の請求の範囲において、用語”たんぱく質”は、たんぱく質フラグメント（オリゴペプチド）も含む。請求された配列は、その意図する用途の生成物の特性に基本的に悪影響しない限り、変更或いは修正を持った配列を含む。ペプチド合成の人工産物は、その例示である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年３月２３日【補正内容】図面の簡単な説明図１は、その最も近い既知のハンタウイルス親類、プロスペクトヒル(Prosp ect Hill)ウイルス("PHILL";GenBank X55128)及びピュウマラウイルス株P360("P UUMALA";GenBank X61035)のものを有するHARDSウイルスクローンp3H226 Ｓ 1129 CR-7("NMHV")によりエンコードされたたんぱく質の配列を示す。同定領域は、星印で示される。非常に似ている多くの領域が存在し、例えば、ＮＨＭＶ座標３７と１９３の間に非常に相同性のある領域があることに留意される。これらの領域は、広く相互−反応性のあるエピトープ体のためのローカスであるようである。アミノ酸１９４と２６４の間のような他の領域は、Ｎ内で、より分岐された、かけられたタイプ−特異性のエピトープ体である。図２は、最も近いハンタウイルス親類、プロスペクトヒル("PHILL",GenBank X55129)及びピュウマラウイルス株P360("PUUMALA",L08755)のものを有するHARD Sウイルスクローンp3H226 G1 1275 CR-1によりエンコードされたたんぱく質(部分的配列)の配置を示す。Ｇ１のこの領域において、広く反応性のあるエピトープ体は、計測され、HARDS感染に特異化されると見られる、少なくとも１つの能力あるエピトープ体が、見かった。HARDSウイルスと座標３６〜９３の間のような、その親類との間には、顕著な差異のある領域がいくつかあることに留意するべきである。図３は、その増幅（図示なし）に使用されたプライマにより成されたp3H226 Ｓ 1129 CR-7の完全なヌクレオチド配列を示す。図４は、３つの方法の配位結合によるp3H226 Ｓ 1229 pATH-1の製造を示す。図５は、p3H226 Ｇ１ 1275 CR-1のＨＨＶ−特異性の部分（増幅に用いられたプライマ配列のない）の完全なヌクレオチド配列を示す。優性のＧ７エピトープ体（アミノ酸配列ＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ）をエンコードするＤＮＡの配列は、顕著である。図６は、p3H226 Ｓ 419 CR-1及びp3H226 Ｓ 1129 CR-7から増輻されたＦＣＶ配列の配位結合により構築されたp3H226 Ｓ 1229 pATH-7のＦＣＶＤＮＡインサートの完全なヌクレオチド配列を示す。Xho Ｉサイトを特異化する人工的に修正した配列（然し乍ら、Ｎ遺伝子によりエンコードされたたんぱく質を修正していない）は、顕著である。図７は、優性のＮたんぱく質エピトープ体のアミノ酸１〜１００（Ｂ）にエンコードするクローンp3H226 Ｓ 317(Ａ)のＨＨＶＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を示す。図８は、ｈｈｖ（３Ｈ２２６）Ｍセグメント、残査３３５１の１〜３３５１の主要部の配列を示す。ストレプタビヂン−共役のアルカリ・フォスファターゼを、結合ビオチン−標識の抗体の検出に用いる。色素体アルカリ・フォスファターゼ基体は、共役体のストレプタビヂン部分を通して、ビオチンと結合したアルカリ・フォスファターゼを検出するために用いられる。Ｄ．支持データ血清試料が、４人の患者でテストされた（その２人は、入院後１〜７日内にテストされ、即ち、”急性”であり、その２人は、入院後２２〜２３日でテストされ、即ち、”回復期”である）。これらの血清試料は、ウエスタン免疫ブロット検定体中の特異性の抗体の存在について、テストされた。ウエスタン・ブロット上に存在する抗原ターゲットは、HARDSウイルスのＧ１とＮクローンによりエンコードされた部分を含有したバクテリア融合たんぱく質である。バクテリア融合たんぱく質は、誘導性の組換え発現プラスミドを含有した大腸菌のリゼイトから作られた。ウエスタン・ブロット隔膜上に含有されるウイルス融合たんぱく質は、（ａ）発現プラスミドpATH 23（ＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ）中にサブクローンされたクローン3H226 G1 1275 CR-1のHARDSウイルスＧ１配列によりエンコードされたたんぱく質；（ｂ）ピュウマラ(Puumala)ウイルス株Ｐ３６０の全Ｇ１たんぱく質；（ｃ）ピュウマラ(Puumala)ウイルス株Ｐ３６０の全Ｎたんぱく質；及び（ｄ）融合されたウイルス領域のないたんぱく質ｐ３７^{wus H}を含む。隔膜が、ヒト血清試料で培養された後に、隔膜を洗浄し、アルカリ・フォスファターゼ−共役の山羊抗−ヒトＩｇＧ（すべて４人のヒト血清）で培養した或いは、山羊抗−ヒトＩｇＭ（４人のうちの３人のヒト血清）で培養された。各々の場合、 HARDSに感染していない人からのネガテブ参照ヒト血清を、並行に、複製のウエスタン・ブロット隔膜をプルーブするために用いた。４人の抗体が分析された。４人すべての血清試料は、容易に検出でき、特異化された抗−ハンタウイルスＩｇＧ反応性を示したが、その３つは、すべて、抗− ハンタウイルスＩｇＭについてテストされた。特に、著しいものは、Ｇ１１２７５（HARDSウイルス）たんぱく質は、HARDSウイルス感染（ＩｇＭ及びＩｇＧ）を持つすべてのテストされた患者からの抗体と強く反応したことが観察されたことであるが、然し、ピュウマラ(Puumala)ウイルスの同等な領域は、４人すべてのHARDS感染血清抗体とも認められなかった。逆に、ピュウマラ・ウイルスのＮたんぱく質は、テストされた各HARDS患者のＩｇＧ及びＩｇＭと強く反応し、ハンタウイルスＮたんぱく質は、すべての関連のハンタウイルスに対しての抗体により認められるエピトープ体を含有しているという仮説を裏付けしている。ネガチブ参照血清は、ウイルス−特異性の帯域を認めなく、血清は、Trp Ｅたんぱく質は、融合ウイルスたんぱく質部分がないときに、発現していることを認識しなかった。ピュウマラ(Puumala)ウイルスＮたんぱく質が、HARDS抗血清により、よく認識されていたために、Ｎたんぱく質の大部分をエンコードしているクローンp3H226 1129 CR-7のインサート、HARDSウイルス・クローンは、Trp Ｅ融合たんぱく質として発現されており、ピュウマラ(Puumala)ウイルスＮたんぱく質中に存在するエピトープ体を含有しているものであることを意図している。また、HARDSウイルスＮたんぱく質は、同類のウイルスから誘導されるものであるので、抗−HA RDSウイルス血清でプルーブされたときには、更に、或いは、ピュウマラ(Puumal a)ウイルスＮたんぱく質よりも能力があるエピトープ体を有することが明らかにされることを意図している。関連のHARDSウイルスクローンのヌクレオチド配列(及び予想されたアミノ酸配列)は、Ｇ１遺伝子は、ウイルス−特異性のエピトープ体をエンコードし、Ｎ遺伝子は、より広く活性であるエピトープ体をエンコードしているという理論を裏付けている。HARDSウイルスＮたんぱく質は、HARDSウイルスとその関連のピュウマラとプロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルスの間に強く保存された(図１ )が、HARDSウイルスのＧ１たんぱく質の多くの領域は、ピュウマラ(Puumala)とプロスペクトヒル(Prospect Hill)の同類の領域にほとんど配位されていない（図２）。一般的に、分散たんぱく質に接することにより生成された抗体は、相互反応しないが、非常に関連したたんぱく質が、そのたんぱく質基の数個と認識する（即ち、相互−反応性である）抗体を引き出す傾向があることが期待できる。区画II IV.実験方法：Ａ．Trp E-HARDS Ｇ１たんぱく質発現が可能になるように設計されたpATH23− 基づく発現構築物の製造（他のｐＣＲIIクローンから他の発現構築物を生成するために用いる方法の例）（pATH HT-1は、pATH２３を、Xba Ｉ及びＫｐｎＩで消化することにより、元々作られ、各々のサイト上に、Xho Ｉサイト、及び６ヒスチジンコドン内部に、Xba Ｉ及びＫｐｎＩの”付着性端末”を有するように、設計された２重鎖のオリゴヌクレオチドを挿入する。）ＰＣＲ生成物、今や、消化後は、約２９９ｎｔの長さであるものは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、pATH HT-1中に挿入された。得られた発現構築物は、誘導後は、約５２ｋＤ見掛けＭＷ（ＡＭＷ）の重複溶解性たんぱく質を作るもので、"p3H226 Ｓ 317 pATH-1"と称するものである。以下で論じるように、誘導により作られた融合たんぱく質生成物中に含有されたＨＨＶＮたんぱく質の１００ＡＡは、HARDSウイルス感染のヒトのための可能性のある抗原エピトープ体を隠し持っているものである。Ｂ．trpE-HHV N-たんぱく溶融たんぱくの製造のための発現構築物の製造発現クローンは、ＨＨＶＮたんぱく質の第１の４０７のアミノ酸を発現するための構築された。プラスミドp3H226 Ｓ 1129 CR-7は、下流にあるが、ＨＨＶクローンp3H226 Ｓ 317 pATH-1のものと重なるＮたんぱく質遺伝子のコーディング配列を含む。p3H226 Ｓ 317 pATH-1のコーディング配列は、p3H226 Ｓ 1129 C R-7の配列と結合されて、より大きな発現構築を形成し、それは、単一のたんぱく質分子中に存在するＨＨＶＮ遺伝子ＤＮＡのすべての発現を可能にする。それを行なうために、ＰＣＲのためのセンス・プライマを製造し、p3H226 Ｓ 317 pATH-1を作るために用いられるアンチセンス・プライマに重なる。重なる領域は、人工的なXho Ｉサイトである。増幅するためのセンス・プライマは、従って、ＡＴＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＡＡＡＣＡＧであった。アンチセンス・プライマのために、p3H226 Ｓ 1129 CR-7を作るために元々用いるプライマの新規なものは、選択された。Han Ｓ１２７２の新規なもの−プライマは、古いものとは異なり、その５’端に近い制限酵素Xba Ｉのための認識サイト：ＧＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣを含有するものである。 p3H226 Ｓ 1129 CR-7を鋳型として用いて、約９００ｂｐの増輻物（アンプリマ）は、上記の２つのプライマを有するＰＣＲにより作られた。アンプリマは、 Xho Ｉ及びXba Ｉにより消化され、〜２９９ｂｐ Hind III／Xho Ｉに配位結合され、上記の（ａ）に記載された消化されたアンプリマ、pATH HT-1、Hind III 及びXba Ｉで消化されたものである。”３つの方法”の配位結合が、生じた（図４）。得られた生成物は、p3H226 Ｓ 1229 pATH-7と称された（図６）。それは、互いに適切な距離をもって間隔をとった２つのXho Ｉサイトと１つのHind-IIIサイトを含む正しい制限マップを有するように示され、標準的な誘導法の後に、ＡＭＷ〜７５−７８ｋＤの不溶性のtrp Ｅ融合たんぱく質を多量に作る。他のtrp Ｅ−ＨＨＶＮたんぱく質融合たんぱく質を作る発現構築物が作られた。p3H226 Ｓ 1129 CR-7のインサートは、サブクローン化され、pATH１０にされ、p3H226 Ｓ 1129 pATH-1を作るために、そして、p3H226 Ｓ 1129 CR-7の〜７５０ bp Eco-RI Eco RIフラグメントをpATHにサブクローン化し、p3H226 Ｓ RI pATH-1を作るために、用いられた。これらの発現構築物の両方は、不溶性trp Ｅ −ＨＨＶＮたんぱく質融合物を多量に作り、それは、p3H226 Ｓ 1229 pATH-7 により作られたＨＨＶＮたんぱく質の部分を含有するものである。Ｃ．ＰＨＶ融合たんぱく質の製造のための発現構築物の製造クローンp3H226 G1 1275 CR-1及びp3H226 Ｓ 1129 CR-7のHHV配列に相当するプロスペクトヒル(Prospect Hill)ウイルス（ＰＨＶ）ゲノムの２つの部分は、クローン化され、２つのＨＨＶクローン内に同定された抗原エピトープ体が、ＨＨＶの最も近い親類、ＰＨＶと相互反応するか否かを見るために用いられた。ＰＨＶ鋳型は、１９９３年７月に、National Institutes of HealthのRichard Y anagiharaから貰ったものとして得たウイルスストックから誘導された。Yanagih araのＰＨＶストックは、ＶｅｒｏＥ６細胞に感染するために用いられ、ＰＨＶは、ユニバシテイオブニューメキシコの生安全の３部門中で伝搬された。ＰＨＶｃＤＮＡは、ＨＨＶの相当する部分（上記）をクローン化するに用いたものと同じ条件下で感染培養物から作られたＲＮＡから、クローン化された。得られたクローンは、pPHV G1 1275 CR-1及びpPHV S 1129 CR-1と証された。ＰＨＶインサートは、ｐＣＲＩＩベクターから移動され、pATH発現構築物p3H226 G1 1275 pATH-1及びp3H226 Ｓ 1129 pATH-1を作るために用いたとほぼ同じ方法により、pATH発現ベクター中に移転せしめた。発現構築物は、適当なサイズの不溶性 trp Ｅ融合たんぱく質を作るために良好なものであることが証明された。Ｇ１たんぱく質発現構築p3H226 G1 1275 pATH-1によりエンコードされたたんぱく質について、ＩｇＧ或いはＩｇＭ反応性を有する。ＨＨＶＮたんぱく質の優性エピトープ体は、第１の１１０のアミノ酸内に含有されるようである。Ａ．クローンp3H226 Ｓ 317 pATH-1によりエンコードされた１以上のエピトープ体は、プロスペクトヒルウイルス（ＰＨＶ）Ｎたんぱく質の同類の部分（即ち、最初の１１０のアミノ酸）と相互反応性があると判定。ＰＨＶＮたんぱく質遺伝子のその部分が、上記のように、ＰＨＶ−感染のＶｅｒｏ細胞培養物から作られたＲＮＡを用いて、逆転転写酵素（トランスリプターゼ）ＰＣＲによりクローン化された。ＰＨＶにセンス・プライマは、ＰＨＶｃＤＮＡの増輻のために特に合成され、ＴＡＣＴＡＣＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＡＴＧＡＧＣＣＡＡＣＴＣＡＧＧＧＡの配列を有した。アンチセンス・プライマは、ＨＨＶｃＤＮＡの相当する部分を増幅するために上記で使用されたものと同じものであり、配列ＴＧＧＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＴＡＣＡＴＣＡＡＧを有した。増幅されたＤＮＡは、ゲル精製され、制限酵素ＳａｌＩ及びXho Ｉで消化され（上記のプライマ中に存在する認識サイト）、そして、ＳａｌＩ−及びXho Ｉ−消化pATH HT-1に直接にクローン化された。得られた構築物は、pPHV Ｓ 317 pATH-1と称された。 Trp Ｅ融合たんぱく質は、標準的なプロトコールに従って、ＰＨＶから得られたpPHV Ｓ 317 pATH-1と呼ばれた。結論：ＨＨＶの第１の１１０アミノ酸内に含有される優性エピトープ体は、そのＰＨＶ同類と相互反応性がある。Ｂ．プラスミドクローンp3H226 Ｓ 317 pATH-1によりエンコードされたＮ−たんぱく質の優性エピトープ体の位置マッピングは、このクローンのＤＮＡ・インサートの３’と５’の欠乏の巣にしたものを作り、そして、たんぱく質(Gene 28:351〜359,1984)として、切断された挿入物を発現することにより、達成された。ウエスタン・ブロットは、HARD Sの２人の患者（パネルＡ及びＢ）或いは感染されていないコントロール（パネルＣ）からの血清（１：２００希釈度）を有するネストされた欠失鎖の種々の部分から発現されたtrp Ｅ融合たんぱく質を反応せしめることにより作られた。【図１】【図１】【図２】【図３】【図４】【図５】【図６】【図７】【図８】【図８】【図８】【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年７月２８日【補正内容】請求の範囲１．HARDSウイルスＲＮＡヌクレオチド配列或いはそのＤＮＡコピーによりエンコードされた純粋たんぱく質。２．HARDSウイルスＳセグメントのＮたんぱく質コーディング配列或いはHARDSウイルスＭセグメントのＧ１或いはＧ２糖たんぱく質コーディング配列によりエンコードされた請求項１に記載のたんぱく質。３．HARDSウイルスの優性の或いはタイプ−特異性の抗原エピトープ体を有する請求項１に記載のたんぱく質。４．HARDSウイルス抗原のためのエンコードする組換え体ＤＮＡ。５．抗原がHARDSウイルスに反応する１以上の優性のエピトープ体及び１以上の他のハンタウイルス組織或いは血液抗体を含有する請求項４に記載のｒＤＮＡ。６．抗原が、HARDSウイルス組織或いは血液抗体に対して基本的に特異であることを特徴とする請求項４に記載のｒＤＮＡ。７．血液抗体は、ＩｇＭ或いはＩｇＧであることを特徴とする請求項５に記載のｒＤＮＡ。８．請求項４に記載のｒＤＮＡを含有する発現ベクターを有するｃＤＮＡインサート。９．表現ベクターがプラスミドである請求項８に記載のＤＮＡインサート。１０．表現ベクターが、次のプラスミドである請求項９に記載のＤＮＡインサート。プラスミド３Ｈ２２６−Ｓ１１２９ＣＲ−７（ＡＴＣＣ♯７５５２２）；プラスミド３Ｈ２２６−Ｍ２０３８ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５３２）；プラスミド３Ｈ２２６−Ｍ１２２５ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５２５）；プラスミド３Ｈ２２６-G1-１２７５ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５２４）；プラスミドＭＨＡＲ−Ｇ２−３９２ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５２３）；及びプラスミド３Ｈ２２６−Ｓ１２２９（ＡＴＣＣ♯７５５６１）。１１．ベクターが、バクロウイルス(baculovirus)、イースト或いは哺乳類細胞ベクターである請求項８に記載のＤＮＡインサート。１２．請求項４に記載の組換体ＤＮＡを表現している形質転換或いは形質変換ホスト細胞。１３．請求項５或いは６に記載の組換体ＤＮＡを表現する形質転換或いは形質変換のホストバクテリア。１４．バクテリア或いは成熟核細胞を有する請求項１２に記載のホスト細胞。１５．該細胞は、バクロウイルス(baculovirus)、イースト或いは哺乳類細胞ベクターである請求項１２に記載のホスト細胞。１６．請求項１２に記載のホスト細胞により表現されたHARDSウイルスｒＤＮＡ抗原。１７．請求項３に記載のｒＤＮＡ抗原エピト−プに対する抗体。１８．請求項８に記載の表現ベクターを含有する分子クローン。１９．請求項１０に記載の表現ベクターを含有する分子クローン。２０．少なくとも１つの請求項３に記載の抗原を、反応剤として、用いた免疫検定体。２１．請求項１７に記載の抗体を、反応剤として、用いた免疫検定体。２２．酵素−結合の検定体である請求項２０に記載の免疫検定体。２３．HARDSウイルスに対する血清抗体のための検定体である請求項２０に記載の免疫検定体。２４．ウエスタン免疫ブロット検定体である請求項２０に記載の免疫検定体。２５．ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列である請求項１に記載のたんぱく質。２６．ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である請求項１に記載のたんぱく質。２７．Ｇ１たんぱく質コーディング配列によりエンコードされた請求項２に記載のたんぱく質。２８．HARDSウイルスタイプ特異性の抗原エピトープ体である請求項２７に記載のたんぱく質。２９．Ｇ１たんぱく質のアミノ酸６１−９１、或いはその一部を有する請求項２８に記載のたんぱく質。３０．アミノ酸配列ＬＫＩＥＳＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２８に記載のたんぱく質。３１．Ｇ１たんぱく質のアミノ酸３１から９１、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２８に記載のたんぱく質。３２．アミノ酸配列ＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２８に記載のたんぱく質。３３．ヌクレオチドコーディング配列が、配列ＴＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴ、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２７に記載のたんぱく質。３４．HARDSウイルスＭセグメントのＧ１たんぱく質アミノ酸配列のための配列コーディングをコードするヌクレオチドを有する請求項４に記載のｒＤＮＡ。３５．ヌクレオチドコーディング配列は、ＴＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴを有することを特徴とする請求項３６に記載のｒＤＮＡ。３６．ヌクレオチドコーディング配列は、Ｇ１たんぱく質のアミノ酸６６〜９１のためのエンコードしていることを特徴とする請求項３６に記載のｒＤＮＡ。３７．ヌクレオチドコーディング配列は、アミノ酸配列ＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ、或いはその一部のためにエンコードしていることを特徴とする請求項３６に記載のｒＤＮＡ。３８．Ｎたんぱく質コーディング配列によりエンコードされた請求項２に記載のたんぱく質。３９．HARDSウイルスに対して基本的に特異性を有する優性抗原エピトープ体及びHARDSウイルスＮたんぱく質コーディング配列に対して同類のヌクレオチドコーディング配列により特徴づけられた少なくとも１つの他のハンタウイルスを有する請求項３８に記載のたんぱく質。４０．Ｎたんぱく質のアミノ酸１７〜５９、或いはその一部を有することを特徴とする請求項３９に記載のたんぱく質。４１．アミノ酸配列ＱＬＶＴＡＲＱＫＬＫＤＡＥＲＡＶＥＬＤＰＤＤＶＮＫＳＴＬＱＳＲＲＡＡＶＳＡＬＥＴＫＬＧ、或いはその一部を有する請求項４０に記載のたんぱく質。４２．Ｎたんぱく質のアミノ酸１５５〜３２１、或いはその一部を有することを特徴とする請求項３９に記載のたんぱく質。４３．FIARDSウイルスＳセグメントのＮたんぱく質アミノ酸配列のためコードするヌクレオチドコーディング配列を有することを特徴とする請求項４に記載のｒＤＮＡ。４４．ヌクレオチドコーディング配列は、図４に示す配列の一部を少なくとも有することを特徴とする請求項４３に記載のｒＤＮＡ。４５．反応剤として、請求項２８に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４６．反応剤として、請求項３９に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４７．反応剤として、請求項３２に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４８．反応剤として、請求項４１に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４９．免疫体として、請求項２８に記載のたんぱく質を有することを特徴とするワクチン。５０．免疫体として、請求項３９に記載のたんぱく質を有することを特徴とするワクチン。５１．免疫体として、請求項３２に記載のたんぱく質を有することを特徴とするワクチン。５２．請求項４１に記載のたんぱく質を、免疫体として、有することを特徴とするワクチン。５３．診断免疫反応剤として、請求項３に記載のHARDSウイルス抗原エピトープ体、或いはその抗体を、診断のための量、生体中或いは試験管中に含有することを特徴とするHARDSウイルスの検出のための診断キット。５４．免疫反応剤は、抗原／抗体複合体を有する免疫生成体の検出を促進するように、標識されていることを特徴とする請求項５３に記載の診断キット。５５．クローンＡＴＣＣ♯７５５２２、７５５３２、７５５２５、７５５２４、７５５２３或いは７５５６１により表現されたことを特徴とする請求項１に記載のたんぱく質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 21/08 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ 33/569 Ｌ 33/569 9283−4ＣＡ６１Ｋ 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/76 9284−4Ｃ 39/395 Ｄ 39/395 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号０８／１４１，０３５ (32)優先日 1993年10月26日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／２１０，７６２ (32)優先日 1994年３月22日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジェニソン，スティーヴアメリカ合衆国ニューメキシコ州 87120 アルバカーキィーノースウエストコールピカフロー 8371

Claims

【特許請求の範囲】１．HARDSウイルスＲＮＡヌクレオチド配列或いはそのＤＮＡコピーによりエンコードされた純粋たんぱく質。２．HARDSウイルスＳセグメントのＮたんぱく質コーディング配列或いはHARDSウイルスＭセグメントのＧ１或いはＧ２糖たんぱく質コーディング配列によりエンコードされた請求項１に記載のたんぱく質。３．HARDSウイルスの優性の或いはタイプ−特異性の抗原エピトープ体を有する請求項１に記載のたんぱく質。４．HARDSウイルス抗原のためのエンコードする組換え体ＤＮＡ。５．抗原がHARDSウイルスに反応する１以上の優性のエピトープ体及び１以上の他のハンタウイルス組織或いは血液抗体を含有する請求項４に記載のｒＤＮＡ。６．抗原が、HARDSウイルス組織或いは血液抗体に対して基本的に特異であることを特徴とする請求項４に記載のｒＤＮＡ。７．血液抗体は、ＩｇＭ或いはＩｇＧであることを特徴とする請求項５に記載のｒＤＮＡ。８．請求項４に記載のｒＤＮＡを含有する発現ベクターを有するｃＤＮＡインサート。９．表現ベクターがプラスミドである請求項８に記載のＤＮＡインサート。１０．表現ベクターが、次のプラスミドである請求項９に記載のＤＮＡインサート。プラスミド３Ｈ２２６−Ｓ１１２９ＣＲ−７（ＡＴＣＣ♯７５５２２）；プラスミド３Ｈ２２６−Ｍ２０３８ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５３２）；プラスミド３Ｈ２２６−Ｍ１２２５ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５２５）；プラスミド３Ｈ２２６-G1-１２７５ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５２４）；プラスミドＭＨＡＲ−Ｇ２−３９２ＣＲ−１（ＡＴＣＣ♯７５５２３）；及びプラスミド３Ｈ２２６−Ｓ１２２９（ＡＴＣＣ♯７５５６１）。１１．ベクターが、バクロウイルス(baculovirus)、イ−スト或いは哺乳類細胞ベクターである請求項８に記載のＤＮＡインサート。１２．請求項４に記載の組換体ＤＮＡを表現している形質転換或いは形質変換ホスト細胞。１３．請求項５或いは６に記載の組換体ＤＮＡを表現する形質転換或いは形質変換のホストバクテリア。１４．バクテリア或いは成熟核細胞を有する請求項１２に記載のホスト細胞。１５．該細胞は、バクロウイルス(baculovirus)、イ−スト或いは咄孔類細胞ベクターである請求項１２に記載のホスト細胞。１６．請求項１２に記載のホスト細胞により表現されたHARDSウイルスｒＤＮＡ抗原。１７．請求項３に記載のｒＤＮＡ抗原エピト−プに対する抗体。１８．請求項８に記載の表現ベクターを含有する分子クローン。１９．請求項１０に記載の表現ベクターを含有する分子クローン。２０．少なくとも１つの請求項３に記載の抗原を、反応剤として、用いた免疫検定体。２１．請求項１７に記載の抗体を、反応剤として、用いた免疫検定体。２２．酵素−結合の検定体である請求項２０に記載の免疫検定体。２３．HARDSウイルスに対する血清抗体のための検定体である請求項２０に記載の免疫検定体。２４．ウエスタン免疫ブロット検定体である請求項２０に記載の免疫検定体。２５．ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列である請求項１に記載のたんぱく質。２６．ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列である請求項１に記載のたんぱく質。２７．Ｇ１たんぱく質コーディング配列によりエンコードされた請求項２に記載のたんぱく質。２８．HARDSウイルスタイプ特異性の抗原エピトープ体である請求項２７に記載のたんぱく質。２９．Ｇ１たんぱく質のアミノ酸６１−９１、或いはその一部を有する請求項２８に記載のたんぱく質。３０．アミノ酸配列ＬＫＩＥＳＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２８に記載のたんぱく質。３１．Ｇ１たんぱく質のアミノ酸３１から９１、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２８に記載のたんぱく質。３２．アミノ酸配列ＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２８に記載のたんぱく質。３３．ヌクレオチドコーディング配列が、配列ＴＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴ、或いはその一部を有することを特徴とする請求項２７に記載のたんぱく質。３４．HARDSウイルスＭセグメントのＧ１たんぱく質アミノ酸配列のための配列コーディングをコードするヌクレオチドを有する請求項４に記載のｒＤＮＡ。３５．ヌクレオチドコーディング配列は、ＴＣＴＴＧＴＡＡＴＴＴＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＴＴＧＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＧＴＴを有することを特徴とする請求項３６に記載のｒＤＮＡ。３６．ヌクレオチドコーディング配列は、Ｇ１たんぱく質のアミノ酸６６〜９１のためのエンコードしていることを特徴とする請求項３６に記載のｒＤＮＡ。３７．ヌクレオチドコーディング配列は、アミノ酸配列ＳＣＮＦＤＬＨＶＰＡＴＴＴＱＫＹＮＱＶＤＷＴＫＫＳＳ、或いはその一部のためにエンコードしていることを特徴とする請求項３６に記載のｒＤＮＡ。３８．Ｎたんぱく質コーディング配列によりエンコードされた請求項２に記載のたんぱく質。３９．HARDSウイルスに対して基本的に特異性を有する優性抗原エピトープ体及びHARDSウイルスＮたんぱく質コーディング配列に対して同類のヌクレオチドコーディング配列により特徴づけられた少なくとも１つの他のハンタウイルスを有する請求項４０に記載のたんぱく質。４０．Ｎたんぱく質のアミノ酸１７〜５９、或いはその一部を有することを特徴とする請求項３９に記載のたんぱく質。４１．アミノ酸配列ＱＬＶＴＡＲＱＫＬＫＤＡＥＲＡＶＥＬＤＰＤＤＶＮＫＳＴＬＱＳＲＲＡＡＶＳＡＬＥＴＫＬＧ、或いはその一部を有する請求項４０に記載のたんぱく質。４２．Ｎたんぱく質のアミノ酸１５５〜３２１、或いはその一部を有することを特徴とする請求項３９に記載のたんぱく質。４３．HARDSウイルスＳセグメントのＮたんぱく質アミノ酸配列のためコードするヌクレオチドコーディング配列を有することを特徴とする請求項４に記載のｒＤＮＡ。４４．ヌクレオチドコーディング配列は、図４に示す配列の一部を少なくとも有することを特徴とする請求項４３に記載のｒＤＮＡ。４５．反応剤として、請求項２８に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４６．反応剤として、請求項３９に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４７．反応剤として、請求項３２に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４８．反応剤として、請求項４１に記載のたんぱく質、或いはその抗体を用いることを特徴とする免疫検定体。４９．免疫体として、請求項２８に記載のたんぱく質を有することを特徴とするワクチン。５０．免疫体として、請求項３９に記載のたんぱく質を有することを特徴とするワクチン。５１．免疫体として、請求項３２に記載のたんぱく質を有することを特徴とするワクチン。５２．請求項４１に記載のたんぱく質を、免疫体として、有することを特徴とするワクチン。５３．診断免疫反応剤として、請求項３に記載のHARDSウイルス抗原エピトープ体、或いはその抗体を、診断のための量、生体中或いは試験管中に含有することを特徴とするHARDSウイルスの検出のための診断キット。５４．免疫反応剤は、抗原／抗体複合体を有する免疫生成体の検出を促進するように、標識されていることを特徴とする請求項５３に記載の診断キット。５５．クローンＡＴＣＣ♯７５５２２、７５５３２、７５５２５、７５５２４、７５５２３或いは７５５６１により表現されたことを特徴とする請求項１に記載のたんぱく質。