JP2005139204A - Ｈｉｖウイルスに対して免疫反応性である抗体の検出用の合成抗原 - Google Patents

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Abstract

【課題】 新規ポリペプチド、およびそれをコードする組換えポリヌクレオチド配列の提供。
【解決手段】 本ポリペプチドは、エイズ（AIDS）関連ウイルスの免疫学上重要な断片と実質的に同じ配列を有する。このポリペプチドは、ウイルスへのヒト宿主の暴露の測定試薬として利用できる。特に着目されるのは、血液製剤をスクリーニングするに際してのポリペプチドの使用である。
【選択図】 なし

Description

発明の分野
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）および／または２型（ＨＩＶ−２）（本明細書中で用いる時、型を言及しないで使用する「ＨＩＶ」はいずれか一方または両方の型を意味する）に関連する抗体を検出するのに有用な合成ポリペプチド、組換えポリペプチドおよびそれをコードする組換えポリヌクレオチド配列に関し、そして特にＨＩＶポリメラーゼ領域の遺伝子産物の抗原エピトープを模倣した合成ポリペプチドに関する。
発明の背景
この出願は、1997年８月１日出願の米国特許出願第08/904,826号明細書の一部係属出願であり、前記出願の開示は参考として本明細書中に組み込まれる。
ヒト免疫不全ウイルス１型と２型（ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２）は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）を引き起こすことが知られている。両ウイルスとも見かけ上は同様な感染形態を示す。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は共にアフリカのエイズ患者から1980年代初めに単離された。その後、世界中のほとんどの国で症例が見つかっている。ＨＩＶウイルスは急速な遺伝的浮動を示すので、広範囲に多様性の株が出現し続けている。よって、変異株の検出と治療は挑戦的であり且つ困難であるとわかった。
ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に対して反応性の抗体を有する個体は、常用のサンドイッチELISA 方式のイムノアッセイにより決定される。それらのアッセイは、ウイルス溶解物、レトロウイルスタンパク質または天然もしくは合成ポリペプチドから構成され得る固定化ウイルス抗原を含んで成り、それの抗原をＨＩＶ抗体を含む疑いのある血液または血清成分と接触させる。現存する商業ベースの試験は、血液製剤中へのＨＩＶウイルスの伝染をかなり低減したけれども、各試験の構成は幾つかの欠点を有する場合がある。
ウイルス溶解物試験の考えられる欠点としては次のものが挙げられる：大量の生存している感染性ウイルスを増殖させそして処理する必要性があること；生存ウイルスが試験材料中に混入する可能性があること；得られるウイルス溶解物の性質が変動的であること；そして追加の確認試験を必要とする相当数の偽陽性結果や偽陰性結果を生じること。これらの欠点は抗原として単離されたウイルスタンパク質を使用する場合にも伴い得る。
ＨＩＶウイルスの抗原エピトープを免疫学的に模倣するように作製することができる合成ポリペプチド（本明細書中で使用する「合成ポリペプチド」および「ポリペプチド」は、合成ポリペプチド、組換えポリペプチドまたはポリペプチドのいずれか１つ、全部または任意の組合せを意味する）の使用は、上記欠点の幾つかを回避することができる。診断アッセイにおける合成ポリペプチド（長さが60残基以下）の使用に伴う一種の懸念は、おそらくウイルスエピトープの限定された提示のために、ウイルス抗原の遺伝的浮動がそれらのアッセイを使ったＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２感染血清の検出の失敗を引き起こし得るという考えである。そのような現象に対して保護する１つの方法は、ウイルスゲノムの異なる免疫優性領域由来のポリペプチドを含めることである。よって、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のpol 遺伝子産物の免疫優性領域を免疫学的に模倣した合成ポリペプチドは、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のenv , gag およびpol タンパク質を模倣した既に記載されているポリペプチドへの重要な付加物である。米国特許第4,629,783 号および同第5,075,211 号明細書は、ＨＩＶ−１の抗原決定基を模倣した合成ポリペプチドを記載しいる。Cosand米国特許第5,075,211 号明細書は、pol 領域由来のＨＩＶ−１タンパク質の抗原エピトープを免疫学的に模倣した合成ポリペプチドを記載しており、そのうちの２つのポリペプチドが本発明のポリペプチドと類似している。血液スクリーニングアッセイでは、アッセイ法に使用する抗原の免疫反応性が大きければ大きいほど、患者試料中に存在するＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の新規変異体または亜型に対する抗体が未検出のままである可能性がより低くなる。
米国特許第5,306,466 号明細書は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なり且つ別個のものであると最初は信じられていた「ＨＩＶ−３レトロウイルス」を記載している。研究者がはＨＩＶ−３レトロウイルスが単にＨＩＶ−１の特定の亜型であることを決定して以来、今はＯ亜型またはＯ群と呼ばれている〔R. De Leys他, J. Virol. 1207-1216 (1990) ; L.G. Gurtler 他, J. Virol. 1581-1585 (1994)〕。
様々なＨＩＶ−１分離株を比較することにより、研究者らはゲノムには高度に可変性である領域もあり、または適度に十分保存されている領域もあることを証明した。ＨＩＶ−２にも同様な多形性が観察されている。
ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２ウイルスの伝染および病気状態にて見かけ上の類似点があるにもかかわらず、それらの遺伝的多様性に基づいて両ウイルス型は区別されている。今日、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２はＨＩＶ系統樹の２本の主枝を構成している。ＤＮＡハイブリダイゼーション研究は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の間には広範囲に渡り相同性領域が存在するが、他の領域は非常に多様に見えることを示唆している〔Clavel他, Science 233:343 (1986)〕。実際、ＨＩＶ−２はＨＩＶ−１と全体で約40％の相同性しか持たないことが示されており、エンベロープ糖タンパク質間でほとんど免疫交差反応性を示さないことも実験により証明されている。それらのウイルス間での限定された血清学的交差反応性のため、ＨＩＶ−１抗原に基づいたスクリーニングアッセイではヒト血清におけるＨＩＶ−２感染のスクリーニングや診断には不十分である。
発明の要約
ポリメラーゼ領域中にコードされるＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２タンパク質の免疫優性領域を模倣することができるポリペプチド配列を同定した。それらの合成ポリペプチド、組換えポリペプチドおよびそれをコードする組換えポリヌクレオチド配列は、ＨＩＶウイルスへの暴露についての血液および血液製剤のスクリーニング用の試薬の調製に有用である。これらのポリペプチドは、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２ウイルスに対する抗体の検出のための様々な特異的結合アッセイにおいて利用でき、またはワクチン組成物中での免疫原として利用できる。
特定の実施形態の具体的説明
それぞれＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２レトロウイルスによりコードされるタンパク質、特にウイルスゲノムのポリメラーゼ領域中にコードされるタンパク質、を免疫学的に模倣した新規ポリペプチドが提供される。本発明の各ポリペプチドは、ポリペプチド中に保存的または非保存的置換を導入することにより変更されてもよく、普通は数で20％未満、より普通には10％未満のアミノ酸が置換されてもよい。その領域が構造的に多形性であると認められるような状況では、異なるレトロウイルス株の異なるエピトープを一層効果的に模倣するように１または複数の特定アミノ酸を変更することが望ましいかもしれない。多くの場合、化学的安定性を提供するために、メチオニンをノルロイシン (Nor)に置き換えることができる。
本発明のポリペプチド中に適当なアミノ酸置換を選択するのに特に有用な一手段は、１または複数のウイルス分離株中に天然に存在する置換であろう。
一般に、「ポリペプチド」または「ペプチド」という語は、生物活性を有するアミノ酸分子の連続鎖を意味する。この用語は何か特定の長さの生成物に関連づけられるわけではない。
本発明において使用するポリペプチドは、その化合物がＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２レトロウイルスの少なくとも１つの株のpol 領域のエピトープを免疫学的に模倣できる限り、ある特定のＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ポリペプチド配列と同一である必要はない。従って、本発明のポリペプチドは、上述したように様々な変更、例えば挿入、削除および保存的または非保存的置換を含むように変更することができ、そのような変更はそれらの使用に際して何らかの有利性に備えるかもしれない。保存的置換とは、gly, ala ; val, ile, leu ; asp, glu ; asn, gln ; ser, thr ; lys, arg ; phe, tyr および nor, met といったグループ内での置換を意味する。通常、配列は、本発明のポリペプチドを便利に固定化できる「アーム」を提供する目的でいずれかの末端に追加のアミノ酸が付加される場合を除いて、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２レトロウイルスの少なくとも１つの株の配列から20％以上は異ならないであろう。このアームは通常は長さが少なくとも１アミノ酸であるが50以上のアミノ酸であってもよく、しばしば１〜10アミノ酸であろう。アミノ酸配列がアミノ酸残基の置換、付加または削除により変更されているポリペプチドは、未変更のポリペプチドの免疫反応性の実質上全部を保持すべきであり、免疫反応性は放射性免疫沈澱法、免疫蛍光法またはエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ法により便利に測定することができる。
更に、ポリペプチドを互いに連結する際の容易性、支持体または大きなポリペプチドへの結合、ポリペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的性質の変更等に備えて、オリゴペプチドまたはポリペプチドの末端に１または複数のアミノ酸を付加してもよい。
結合に有用な官能基を提供するためにチロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸をポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入してもよい。別のポリペプチドへの共有結合を促進するため、または例えば酸化により二量体を形成させるためにはシステインが特に好ましい。ポリマーを形成させるためには、分子中に少なくとも２つのシステイン残基を存在させるのが好ましく、好ましくはポリペプチドの末端部分に付加されたシステイン残基を利用することによりそれらを結合させる。介在アミノ酸スペーサーとシステインとの組合せも有用である。例えば、２つのシステイン残基を１または複数のアミノ酸残基により互いに隔てることができる。グリシン残基が特に有用であり、アミノ酸間に１〜３個のグリシン残基を使用することができる。リジン残基もリンカーとして有用であることがわかっており、１〜３個のリジン残基を単独でまたは他のアミノ酸と組み合わせて使用してポリペプチドを固相に結合させることができる。
その上、本発明のポリペプチド配列は、安定性を提供するため、支持体もしくは別の分子への連結もしくは結合に備えて疎水性を増加させるため、または重合のため、末端ＮＨ2 のアシル化により、例えばアセチル化もしくはチオグリコール酸アミド化により、末端カルボキシのアミド化により、例えばアンモニアもしくはメチルアミンを使ったアミド化により変更した後に、天然の配列を異なってもよい。
ＨＩＶ−１のポリメラーゼ領域から誘導した本発明のポリペプチドを下記に記載する。ＨＩＶ−１ポリペプチドファミリーは、塩基対（bp）4448〜（bp）4584（GenBank HIVBRUCGの番号付け法；受入れ番号 K02013, BRU分離株）を包含するゲノムポリヌクレオチド配列（LAI またはBRU 分離株）によりコードされるか、またはアミノ酸残基番号約940 〜約 985のpol 転写解読枠中にコードされる。
ポリペプチドＩは次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドII（BRU124EXとも称する）は次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
本発明の別のポリペプチドであるポリペプチド III（BRU124F1X とも称する）は次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドIV（BRU124F3X とも称する）は次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のいずれかのＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
ＨＩＶ−２のポリメラーゼ領域から誘導した本発明のポリペプチドを下記に記載する。ROD124E1とも称するポリペプチドＶは、塩基対（bp）4694〜（bp）4861（GenBank HIV2ROD の番号付け法；受入れ番号 M15390, HIV-2ROD 分離株）を包含するＨＩＶ−２ゲノムのポリヌクレオチド配列によりコードされるか、またはアミノ酸残基番号約956 〜1001のpol 転写解読枠中にコードされる。
ポリペプチドＶは次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
ROD124EXとも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドVIは次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
ROD124C2X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドVII は次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
ROD124C1X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドVIIIは次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
ROD123C3X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドIXは次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｘは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
POL2A1とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドＸは次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
POD124C5X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドXIは次のポリペプチド配列を有する：
Figure 2005139204
（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１もしくは複数の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ2 である）。
特に着目されるのは、ジスルフィド結合または更に長い結合による２つのポリペプチドもしくはオリゴペプチドまたはその組合せを連結させるために、末端アミノ基等をアシル化するのに使われるシステインもしくはチオグリコール酸のメルカプト基を使用することである。これを達成するために、ビス−ハロアセチル基を有する化合物、ニトロアリールハライド、または試薬がチオ基に特異的である同様の他の化合物などを使用することができる。よって、異なるポリペプチドまたはオリゴペプチドの２つのメルカプト基の間の結合は単結合であるか、または少なくとも２個、通常は少なくとも４個であり且つ約16個以下、通常は約14個以下の炭素原子を有する連結基であることができる。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードするウイルスゲノム領域を、常用の組換えＤＮＡ技術によりクローニングしそして発現させることができる。この技術としては、ＰＣＲ媒介クローニングの他に、着目のポリペプチドをコードする一本鎖ポリヌクレオチド鎖の合成が挙げられる。一般に Maniatis 他, Molecular Cloning, A Laboratory Manual CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 を参照のこと。
ポリペプチド断片の発現にはポリヌクレオチド配列からの断片を使用することができ、変更された１もしくは複数のコドンが同一アミノ酸をコードするような保存的塩基置換を行うことができ、またはアミノ酸配列中に得られるアミノ酸が保存的もしくは非保存的置換であるようなコード配列中の非保存的置換を行うことができる（上述）。
コード配列を５′末端もしくは３′末端または両末端のところで延長して、エピトープ部位を維持しながらポリペプチドを延長することができる。この延長は例えば酵素のような標識への結合のため、このペプチドと別のポリペプチドとを同じ鎖中に一緒に連結せしめるため、抗原活性を提供するため、等に使われるアームを提供する。
発現に備えて、コード配列には開始および終止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域並びに普通は複製系が提供され、細胞宿主、例えば原核生物もしくは真核生物、細菌、酵母、哺乳動物などでの発現のための発現ベクターが提供されるだろう。
ＤＮＡ配列それ自体、その断片、またはそれより長い配列、通常は少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも18塩基の配列を、レトロウイルスＲＮＡまたはプロウイルスＤＮＡの検出用のプローブとして使用することができる。多数の技術、例えばGrunstein-Hogness 技術、サザン技術、ノーザン技術、ドットブロット、それらの改良法、並びに他の方法論が記載されている。例えば、WO 83/02277 および Berent 他, Biotechniques (1985) 3:208を参照のこと。
ポリペプチドは融合タンパク質として調製することができるが、ポリペプチドは融合ポリペプチドのＮ末端であってもＣ末端であってもよい。一般に、着目のポリペプチドは「翻訳融合体」として発現される。翻訳融合体は、発現されるタンパク質のアミノ末端がＥ．コリまたは別の既知発現系中で容易に発現される「パートナー」タンパク質に結合していることを意味する。融合体は精製用標識または「ハンドル」を含んでもよい。
そのような融合系の一例は、グルタチオン−アガロース樹脂上でのアフィニティー精製に使用できるタンパク質をコードするグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子の一部分の使用である。この融合系は市販されているpGEXプラスミド(Pharmacia) の中に見つけられる。第二の例は、融合パートナーとしてのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の一部分とハンドルとしての６個のヒスチジン残基をコードする配列の使用である。この「His 標識」は、発現された融合タンパク質をNi−NTA （ニッケル）クロマトグラフィーにより精製可能にする。この融合系は市販されている pQE42プラスミド(QIAGEN)中に見つけられる。同様に、チオレドキシンコード配列中に作製された３つのヒスチジン残基から成る「His パッチ」を有するＥ．コリのチオレドキシン遺伝子の一部分も、発現されたタンパク質をNi−NTA クロマトグラフィーにより精製できるようにする。この融合系は市販のpThioHisA プラスミド (Invitrogen) 中に見つけられる。
得られた融合タンパク質はそれ自体で試薬としてそのまま使用できるし、本発明のポリペプチドを融合タンパク質中の残りの配列の全部もしくは一部から開裂させることもできる。内部メチオニンを全く含まないポリペプチドでは、融合部位のところにメチオニンを導入することにより、臭化シアンを使って該ポリペプチドを開裂させることができる。内部メチオニンが存在する場合には、タンパク質分解開裂部位に例えばポリリジンおよび／またはアルギニンまたはそれの組合せを提供する必要があるだろう。あるいは、内部メチオニンをロイシンのようなアミノ酸により置き換え、そして臭化シアン開裂用にＮ末端メチオニンを付加することができる。ジペプチダーゼを含む多種多様なプロテアーゼが周知であり、適当なプロセシングシグナルを適切な位置に導入することができる。１または複数の無関係のアミノ酸の存在は本発明のポリペプチドの有用性を害さないであろうから、開裂を確実にするためにプロセシングシグナルが縦列の反復を有してもよい。
ＨＩＶ−１のポリメラーゼ領域由来の多数のポリペプチドをコードする本発明の組換えポリヌクレオチドを下記に記載する。これらの配列は、ＨＩＶ−１ウイルス溶解物に確認される、塩基対（bp）2549〜（bp）3139および塩基対（bp）4391〜（bp）4648を包含するＨＩＶ−１ゲノムポリヌクレオチド配列（ＬＡＩ分離株）から誘導される。
pol23 としても知られるポリヌクレオチド配列Ｉは次の配列を有する：
Figure 2005139204
この配列は下記のアミノ酸をコードする。（この教示により縛られずに、イタリック体で示したアミノ酸は生成ポリペプチドの免疫反応性にとって特に重要な残基を表すと思われる。）
ポリヌクレオチド配列 (I) pol23によりコードされる (XII)pol23-aaポリペプチド
Figure 2005139204
pol7とも称する本発明の別のポリヌクレオチド配列であるポリヌクレオチド配列IIは次の配列を有する：
Figure 2005139204
この配列は下記のアミノ酸配列をコードする。（イタリック体で示したアミノ酸は本明細書中に開示するポリペプチドBRU124F3X を表す。）
ポリヌクレオチド配列 (II) pol7によりコードされる (XIII)pol7-aaポリペプチド
Figure 2005139204
本発明のポリペプチドは可溶性巨大分子（例えば５kDal以上）に連結して使用することができる。便利には、担体は、それに対する抗体がヒト血清中におそらく見つからないであろう天然のまたは合成のポリ（アミノ酸）であることができる。代表的なポリペプチドとしてはポリ−Ｌ−リジン、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、ウシγグロブリンなどが挙げられる。主として便利性と入手可能性により選択される。
そのような接合体には、少なくとも１つの本発明のポリペプチドが巨大分子あたり少なくとも１分子存在し且つ巨大分子0.5 kDalあたり約１以下、通常は巨大分子2 kDalあたり約１以下の分子が存在するだろう。複数の異なるポリペプチドが同じ巨大分子に連結されてもよい。
結合方式は、通常のものであり、ｐ−マレイミド安息香酸、ｐ−メチルジチオ安息香酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、グルタルアルデヒド等のような試薬を使用する。結合はＮ末端、Ｃ末端、または分子の末端から中間的な部位のいずれかで起こる。本発明のポリペプチドは連結により誘導体化することができ、または支持体に結合した状態で連結させることができる。
本発明のポリペプチドは、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２またはそれの抗原に対する抗体を検出するためのアッセイ試薬として使用することができる。ポリペプチドはそれらの用途に依存して標識したまたは未標識の試薬として使用することができる（標識とは、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する分子を意味する）。様々な標識が使用でき、例えば放射性核種、酵素、蛍光体、化学発光体、酵素基質、酵素補因子もしくは阻害剤、粒子、例えば磁性粒子、リガンドとレセプターの組合せ、例えばビオチンとアビジンの組合せなどを使用できる。その上、ポリペプチドを表面、例えばマイクロウエルプレート、ガラスビーズ、クロマトグラフィー表面、例えば紙、セルロース、シリカゲルなどへの結合のために様々な方法で変更することができる。ポリペプチドを別の分子にまたは表面に結合せしめる特定の方法は常法であり、文献中にその実例が見つかる。例えば、米国特許第4,371,515 号、同第4,487,715 号明細書およびその中に引用された特許明細書を参照のこと。
様々なアッセイプロトコルをレトロウイルスタンパク質に対する抗体またはレトロウイルスタンパク質それ自体の存在を検出するために使用できる。特に着目されるのは、検出可能なシグナルに備える標識を有する標識された試薬としてポリペプチドを使用するもの、またはポリペプチドを直接または間接的に表面に結合させ、そこで試料中の抗体またはポリペプチドが表面上の前記ポリペプチドに結合するようになるというものである。次いで、ヒト免疫グロブリンに特異的な異種抗体、通常はヒトIgＭとIgＧの両方を使用することにより、または免疫複合体に特異的な標識タンパク質、例えばＲＦ因子もしくはＳ．アウレウス（S. aureus ）プロテインＡを使用することにより、該ポリペプチドに結合したヒト抗体の存在を検出することができる。
様々な不均一プロトコル、例えば競合型または非競合型不均一プロトコルを使用できる。ポリペプチドを表面または支持体（総称的に「支持体」）に結合させ、そして標識抗体を限定量の結合したポリペプチドを目当てに試料中の抗体と競争させる。支持体に結合した標識の量が試料中の競合抗体の量に関連づけられる。
異種抗ヒト抗体、例えばIgＧとIgＭのＦｃ領域に対する抗体（免疫グロブリン）を支持体に結合できる。試料を免疫グロブリンおよび標識ポリペプチドと接触させ、それにより支持体に結合した標識ポリペプチドの量が同族の(cognate) 抗体の存在を示すことになる。
あるいは均一アッセイを使用できる。均一アッセイでは、ポリペプチドを酵素、蛍光体または他の標識に結合させ、前記ポリペプチドへの抗体の結合が、特異的結合ペア複合体に関係する標識と前記複合体に関係しない標識とを区別することができるようになる。そのような技術を用いたアッセイについては、例えば米国特許第3,817,837 号；同第3,850,752 号；同第3,901,654 号；同第3,935,074 号；同第3,984,533 号；同第3,996,345 号；同第4,034,074 号および同第4,098,876 号明細書を参照のこと。これらの開示は参考として本明細書中に組み込まれる。
本発明の一例として、本発明のポリペプチドを蛍光分子、例えばフルオレセイン、ローダミンまたはウンベリフェロンに接合させることができる。このアッセイでは、蛍光偏光が複合体形成したポリペプチド接合体と複合体未形成のポリペプチド接合体とで異なる。蛍光偏光の変化を測定する装置が利用可能であり、例えば Abbott Laboratories, Chicago, Illinois により供給されるTDx が利用可能である。
アッセイ技術の典型は、試料容器、例えばマイクロウエルプレートウエルの使用であり、本発明のポリペプチドまたはそれの接合体が容器の底および／または壁に共有結合によりまたは非共有結合により付着する。試料、通常は適当に緩衝化された媒質中に希釈したヒト血液または血清試料を容器に添加し、そしてポリペプチドと試料中のいずれかの同族抗体との間の複合体形成を可能にするのに十分な時間維持する。上清を除去し、そして容器を洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去する。
前記複合体に特異的に結合する標識特異的結合タンパク質が検出に使われる。適当に緩衝化された培地中のヒト免疫グロブリンに対する異種抗血清、特に抗（ヒトIgＭおよびIgＧ）を前記容器に添加する。異種抗血清は通常は検出可能な標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識されるだろう。次いで標識を検出する。例えば、酵素を使用する場合、非特異的に結合した酵素標識を除去した後、現像液を添加する。現像液は酵素基質と恐らく酵素補因子、色素原などを含み、それらは反応すると比色法により、蛍光測定法によりまたは光子計数測定法によりそれぞれ検出することができる着色生成物、蛍光生成物または化学発光生成物を提供するだろう。
ポリペプチドは様々な方法で調製することができる。ポリペプチドは、その比較的短い長さのために、既知プロトコルに従って溶液中でまたは固体支持体上で合成することができる。例えば、Stewart & Young, Solid Phase Polypeptide Synthesis, 第２版，Pierce Chemical Co., 1984 ；およびTam 他, J. Am. Chem. Soc. (1983) 105: 6442を参照のこと。
あるいは、本明細書中で検討するように、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリペプチドをコードする一本鎖またはそれに実質的に相補的な鎖を使って組換えポリペプチド配列を調製することができる（例えば、Maniatis他, 前掲を参照のこと）。
アッセイの性質に依存して、生理学的試料、例えば唾液、血液、血漿または血清をアッセイ媒質（通常は様々な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液などの１つを使った水性緩衝培地であろう）中への希釈により予め調製しておくことができる。好ましい希釈剤は150 mMクエン酸ナトリウム中の５％w/v 脱脂粉乳、0.01％Proclin 300 、0.005 ％ Antiform A である。通常、ｐＨは約６〜９の範囲内であろう。次いで適当なプロトコルに従って試料を試薬と混合し、結合を考慮した十分な時間の間維持する。不均一系を用いる時には、一般に結合段階の後で洗浄を行って非特異的結合を最少にする。この手順の終わりに常法に従って標識を検出する。
アッセイにおける本発明のポリペプチドおよびその類似体の使用の他に、本発明のポリペプチドはそれ自体でまたはワクチンへ組合せて用途を見つけることができる。該ポリペプチドは、一般に１μg 〜20 mg ／kg宿主の範囲の濃度で、常法により製剤化することができる。生理学的に許容される媒質、例えば無菌蒸留水、食塩水、リン酸緩衝化食塩水などを担体として使用してもよい。水酸化アルミニウムゲルなどのようなアジュバントを使用してもよい。投与は注射、例えば筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内注射によることができる。投与は１回または複数回であり、普通は１〜４週間間隔で行われる。
８つの既知ＨＩＶ−１陽性血清（即ちGS91-[034,037,042,046,049,052,056 および067], 11230, 11424, 11527, 11532および11535 ；ウエスタンブロット全バンド陽性）に対する、ＨＩＶ−１抗原を免疫学的に模倣した上記ポリペプチドＩ〜IVの免疫反応性を調べた。その結果を実施例２の第１Ａ表に示す。上記に挙げたポリペプチドの全てがそれらの試料に対して高度に免疫反応性であった。
同様に、５つの既知ＨＩＶ−２陽性血清（即ち92099,92100,P-83,P-84 およびp-86；ウエスタンブロット全バンド陽性）に対する、ＨＩＶ−２抗原を模倣した上記ポリペプチドの各々の免疫反応性も調べ、その結果を実施例２の第１Ｂ表に示す。糖タンパク質（gp）ポリペプチド 41-2-3GC （同時係属米国特許出願第08/268,388号の主題である非グリコシル化ポリペプチド）は、５つの試料全てに対して高度に反応性であった。最大反応性のポリペプチドはROD 124C2XとROD 124C5Xであった。それらは５つの試料全部に反応性であった。
実施例１−ＨＩＶ polポリペプチドの合成
0.35ミリモルのｐ−メチルベンゾヒドリルアミン樹脂（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）上にｔ−ブチルオキシカルボニル保護アミノ酸を連続カップリングすることにより一連のＨＩＶ polポリペプチドを合成した。標準ベンジル型基によりアミノ酸側鎖の保護を行った。トリプトファン残基はホルミル成分により保護した。合成が完了したポリペプチドを脱保護し、そして標準のＨＦ法またはTam 他の低−高ＨＦ法（J. Amer. Chem. Soc. 105:6442, 1993）により樹脂から開裂させた。開裂させたポリペプチドを50％酢酸中で樹脂から抽出し、そして溶出溶媒として20％酢酸を使ってSephadex G-25 クロマトグラフィーにかけた。ポリペプチドを含有する画分をプールし、凍結乾燥させた。
実施例２−pol ポリペプチドの免疫反応性
本発明のポリペプチドを米国特許第4,629,783 号明細書に既に記載された通りにELISA によって免疫反応性について試験した。簡単に言えば、本発明のポリペプチドの0.5 mg/ml 原液を２Ｍ尿素／５％酢酸中に調製した。12 ml の1.2 ％酢酸を15 ml ポリプロプレン試験管中に入れ、その試験管に48μl の前記ポリペプチド原液を添加し、そして混合した（「コーティング溶液」）。マイクロウエルプレートのウエルを前記ポリペプチドのコーティング液 100μl で満たし、そこに100 μl ／ウエルの0.24Ｍ炭酸塩／0.2 N NaOHを添加し、コーティング溶液のpHをアルカリ性pHに高めた。プレートにカバーをし、そして室温で一晩放置しておいた。コーティング溶液を吸引により取り除いた後、300 μl ／ウエルのプレートブロック溶液（１L あたり25 gの脱脂粉乳、14.7 gのクエン酸ナトリウム二水和物, 8.47 gの塩化ナトリウムおよび0.05 ml のAntiform A, 1.0 ml Kathon GC/ICPを含有する）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロック溶液を吸引により取り除いた後、プレートをすぐに使用するかまたは風乾して後の使用のために保存した。イムノアッセイを実施するためには、血漿試料を被検体希釈剤〔１L あたり44.1 gのクエン酸ナトリウム二水和物, 1.2 mlのTween 20, 50 gの脱脂粉乳, 0.05 ml のAntiform A, 50 ml のヤギ血清, 58.6 gの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸，92.9 gのトリエタノールアミン塩酸塩, 1 mlのProclin 300 を含む〕中に20倍希釈し、その希釈液100 μl を各ウエルに添加した。試料を37℃で30分間インキュベートし、次いで除去し、そしてウエルを0.1 M NaCl／0.05％Tween 20（350 μl ／回）で５回洗浄した。１％正常ヤギ血清を含むクエン酸緩衝液 pH 7.0 中に希釈したヤギ抗ヒトIg−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体 100μl を37℃で30分間各ウエルに添加した後、上記と同様に５回洗浄した。室温で30分間100 μl ／ウエルの基質溶液（クエン酸／リン酸緩衝液, pH 6.0中の80μg/mlテトラメチルベンジジン, 0.0015％過酸化水素）を添加することにより、ELISA アッセイを開始した。ウエルあたり100 μl の1 N H2SO4 を添加することにより反応を停止させ、そして自動ELISA リーダーにより450 nmと630 nmの光学濃度の比を測定した。陽性結果に関するカットオフ値は、少なくとも３つの既知の陰性試料から得られた平均吸光度を0.200 上回る吸光単位に設定した。
第１Ａ表の結果は、本発明のポリペプチドとＨＩＶ−１陽性および陰性試料との反応性を示す。ここでＨＩＶ−１陽性試料はGS91-(034, 037, 042, 046, 049, 052, 056, 067), 11230, 11424, 11527, 11532 および11535 であり、そして陰性試料はPS1059〜PS1062, PS1068, PS1071およびD21 〜D25 である。
Figure 2005139204
* 試料は異なるポリペプチド間で吸光度を比較できるようにするために、1/20の代わりに1/40希釈した。GS-91-(034, 037, 042, 046, 049, 052, 056, 067), 11230, 11424, 11527, 11532および11535 は既知のＨＩＶ−１陽性試料であり；試料PS1059〜PS1062, PS1068, PS1071およびD21 〜D25 は既知のＨＩＶ−１陰性試料である。
**強調した値は、0.200 ＋陰性平均値により設定されたカットオフ値に基づいて陽性である値を示す。カットオフ値＝0.238 （BRU124EXを除く）。BRU124EXのカットオフ値＝0.254 。
*** BRU124EXの反応性についての試験は、別の日に異なる試料を使って別個に行った。
n.d.＝実施せず（または試験せず）。
第１Ｂ表の結果は、本発明のポリペプチドとＨＩＶ−２陽性および陰性試料との反応性を示す。ここでＨＩＶ−２陽性試料は 92099, 92100, P-83, P-84 およびP-86であり、そして陰性試料はNBD1, NBD2, NBD3およびNBD4である。
Figure 2005139204
強調した値は0.200 ＋陰性平均値により設定されたカットオフ値に基づいて陽性である値である。カットオフ値＝0.256 。
既知の陽性試料は92099, 92100, P-83, P-84およびP-86であり、既知の陰性試料はNBD1, NBD2, NBD3およびNBD4である。
pol ポリペプチドを含めることによるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体検出の特異性の改善は、第１Ｃ表に示す実験結果により証明される。この実験では、米国特許第5,439,792 号明細書（その開示は参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されたように、pol ポリペプチドを個別にまたはエンベロープ特異的ポリペプチドと一緒にマイクロウエルプレート上にコーティングした。個別のpol ポリペプチドによるプレートコーティングの場合、前記ポリペプチドを1.0 μg/mlの濃度でコーティングした。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ポリペプチドとの混合物のプレートコーティングの場合、前記ポリペプチドをコーティング緩衝液中に次の濃度で一緒に混合した：ＨＩＶ−１エンベロープポリペプチド（MNGCと命名）を1.23μg/ml、ＨＩＶ−２エンベロープポリペプチド（41-2-3GCと命名）を0.64μg/ml、BRU124F3X を0.25μg/ml、およびROD124C5X を0.125 μg/ml。ポリペプチドコーティング手順は前の「免疫反応性」の項目に記載したのと同じであった。試験した試料は既知のＨＩＶ−１試料（ウエスタンブロット全バンド陽性試料）（即ち、SAL040, SAL041, SAL059, SAL063, SAL064）、既知のＨＩＶ−２試料（ウエスタンブロット全バンド陽性試料）（即ち、52, GB92000128, GB92000152, GB92000154, GB92000158）、ＨＩＶ−１不確定試料（即ち、B3113, B5813, B5885, B7045, C000127, C000214, C000455 ）およびＨＩＶ−２不確定試料（即ち、B3123, B5605, B5810, B5826, B5832, B5875, B6312 ）である。Genetic Systems （商標）HIV-1/HIV-2 Peptide EIA Kit (Sanofi Diagnostics Pasteur, Inc., Redmond, Washingtonより入手可能）において使われる対照試料、即ちＨＩＶ−１陽性対照（PC-1）、ＨＩＶ−２陽性対照（PC-2）および陰性対照（NC）も含めた。既知の陽性試料と不確定試料の両方を市販のウイルス溶解物試験である Genetic Systems（商標）HIV-1/HIV-2 EIA (Sanofi Diagnostics Pasteur, Inc., Redmond, Washington）においても試験した。
Figure 2005139204
Figure 2005139204
* 4 ペプチド＝MNGC (1.23μg/ml); 41-2-3GC (0.64 μg/ml); BRU124F3X (0.25μg/ml); ROD124C5X (0.125 μg/ml)
HIV-1pol(BRU124F3X) のみとHIV-2pol(124C5X)のみ＝各々1.0 μg/ml
HIV-1 & HIV-2 WB Pos. ＝全バンドウエスタンブロット陽性試料
HIV-1 & HIV-2 不確定＝ウエスタンブロット不確定試料
** Pos/Neg欄中、P ＝陽性；N ＝陰性；FP＝偽陽性
*** Genetic Systems （商標）HIV-1/2 EIA (FDA承認)
第１Ｃ表は、単独のpol ポリペプチドをコーティングしたプレートまたは４つのポリペプチド全部をコーティングしたプレートを使った時、既知のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２陽性試料の全てが陽性結果を示したことを証明する。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２不確定試料はいずれも、単独のpol ポリペプチドをコーティングしたプレートまたは４つのポリペプチド全部をコーティングしたプレートを使った時、陰性結果を示した。ウイルス溶解物を使用するＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２ ＥＩＡを使って試験すると、不確定試料は高度に陽性の結果を示した。これらの結果は、本発明のpol ポリペプチドを含めたポリペプチドＥＩＡがＨＩＶ陽性試料を検出するのに高感度であり且つ特異的であることを非常に明確に証明する。
実施例３−pol23 とpol7のクローニング
pol23 およびpol7組換え体の両者をまずpGEX系 (Pharmacia)中でクローニングした。次いでクローニングした挿入断片を、遺伝子発現の分析を単純化するために「精製ハンドル」を提供する別の発現ベクターに移した。
組換え体：pGEX/pol23
ＨＩＶ−１ LAI株ウイルス溶解物より単離したＨＩＶ−１ウイルスＤＮＡを鋳型として使ってそして次のプライマー対：
5' AGCACCATGGGGATCCCAGGGATTAGATATCAGTACAATG 3'および
5' AGTCAGAATTCATTGGCCTTGCCCCTGCTT 3'
を使ってＰＣＲ生成物を作製した。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼの誤りによる突然変異の可能性を最少にするためにUlTma ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を使った。ＰＣＲ生成物を制限酵素 BamHIとEcoRI で消化し、そしてBamHI とEcoRI で消化したpGEX 5X-1 (Pharmacia) 中に挿入した。連結混合物を用いてＥ．コリ DH11Sを形質転換せしめ、そしてアンピシリン耐性コロニーを選択した（Maniatis, 前掲を参照のこと）。
挿入断片含有コロニーをまずコロニー−ＰＣＲにより同定した。この後、増殖、プラスミド単離1)および制限分析を行って、候補のクローンが推定通りの制限部位を含むことを証明した（Maniatis, 前掲を参照のこと）。得られたクローンのプラスミド地図を図１に与える。
1)Ｌブロス＋100 mg/ml アンピシリン中で37℃で一晩増殖させた組換え細菌培養物から、QIAwell 8 Plus Plasmid Kit (QIAGEN) を使ってプラスミドＤＮＡを調製した。
組換え体：pGEX/pol7.0
上述したのと同様に、ＨＩＶ−１ウイルスＤＮＡ鋳型と次のプライマー対：
5' AGCACCATGGGGATCCCCTACAGTGCAGGGGAAAGAATA 3' および
5' GACTAGTCGACTCAATCATCACCTGCCATCTG 3'
を使ってＰＣＲ生成物を作製した。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼの誤りによる突然変異の可能性を最少にするためにUlTma ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）を使った。ＰＣＲ生成物を制限酵素 BamHIとSalIで消化し、そしてBamHI とSalIで消化したpGEX 5X-1 中に挿入した。連結混合物を用いてＥ．コリ DH11Sを形質転換せしめ、そしてアンピシリン耐性コロニーを選択した。
挿入断片含有コロニーをまずコロニー−ＰＣＲにより同定した。この後、増殖、プラスミド単離および制限分析を行って、候補のクローンが推定通りの制限部位を含むことを証明した。得られたクローンのプラスミド地図を図２に与える。
発現ベクター pQE42およびpThioHisA 中へのpGEX/pol23およびpGEX/pol7.0 のサブクローニング
BamHI とSalI酵素での消化により、pGEX/pol23およびpGEX/pol7.0 から挿入断片ＤＮＡを調製した。市販の発現ベクター pThioHisA (Invitrogen) とpQE42 (QIAGEN)を各々 BglII2)およびSalI酵素で消化した。別々の連結反応として、各挿入断片を各ベクターに連結せしめた（Maniatis, 前掲）。再びＥ．コリ宿主株DH11S 中でアンピシリン耐性形質転換体を選択した。クローンの素性をコロニー−ＰＣＲと精製プラスミドＤＮＡの制限分析により確認した。得られた組換え体をpQE/pol23, pQE/pol7.0, pThioHis/pol23 および pThioHis/pol7.0と命名した（得られたクローンのプラスミド地図をそれぞれ図３〜６に与える）。
2)BamHI とBglII 酵素は連結によって接合できる粘着末端を生じることに注目。
実施例４−実施例３クローンのタンパク質発現
tac プロモーターを使う３つのプラスミド発現系 pGEX, pThioHisAおよびpQE42 は全て、グルコースにより負に調節され（シャットオフ）そしてラクトース類似体IPTGにより正に調節される（ターンオン）。
600 nmの光学濃度が２〜６に達するまで、各組換え体pQE/pol23, pQE/pol7.0, pThioHis/pol23 および pThioHis/pol7.0の25 ml 培養物を完全Ｔブロス＋100 mg/ml アンピシリン, 1.0 ％グルコース中で37℃で（振盪しながら）増殖させた。次いで細胞をペレットにし、組換え融合タンパク質の発現を誘導するために１mM IPTG を含む新鮮なグルコース不含有培地中に再懸濁した。更に２時間インキュベーション後、誘導した培養物を2000 rpmで10分間の遠心により収得した。得られた上清培地を捨て、細胞ペレットを−70℃で凍結させた。
凍結したペレットを解凍しそして20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.8と500 mM NaCl から成る水性媒質 2.0 ml 中に再懸濁した。ドライアイス／エタノール浴中での凍結と湯浴中での解凍の２サイクルおよび10回の連続した短い音波処理により細胞を溶解させた。得られた溶解物を、ペレットになるまでエッペンドルフ遠心管中で最高速度で遠心した。溶解物の上清とペレットを次の精製に使った。
pQE/pol23, pQE/pol7.0 ：Ni-NTA精製
これらの組換え体については、20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.8と８Ｍ尿素を含む水性緩衝液中に溶解物ペレットを溶かした。この懸濁液を同緩衝液で予め平衡化しておいた Ni-NTA アガロース(QIAGEN)に結合させた。同緩衝液を使って未結合材料を洗い落とした。次いで結合したタンパク質を、20 mM リン酸ナトリウム, 6.4 Ｍ尿素および100 mM EDTA を含む水性緩衝液を用いて溶出させた。得られた精製融合タンパク質をSDS-PAGEにより分析した。
溶解物上清も下記に示す方法を使って精製した。しかしながら、組換えタンパク質は溶解物ペレット中により高レベルで観察された。
pThioHis/pol23, pThioHis/pol7.0 ：Ni-NTA精製
これらの組換え体については、溶解物上清を20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.8と500 mM NaCl を含む水性緩衝液中で予め平衡化しておいた Ni-NTA に結合させた。同緩衝液を使って未結合材料を洗い落とし、次に水性洗浄緩衝液（20 mM リン酸ナトリウム, pH 6.0, 500 mM NaCl ）を使って再洗浄した。
洗浄緩衝液中の増加する濃度のイミダゾール（50 mM, 200 mM, 350 mM, 500 mM ）を使って、連続する４段階において結合したタンパク質を溶出させた。SDS-PAGE分析は、350 mMイミダゾールがこれらの組換え体に最適な溶出条件であることを示した。
SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析
標準実験プロトコルを使って、得られた部分精製融合タンパク質の試料をSDS-PAGEにより分離した。Novex ４〜20％ポリアクリルアミド勾配ゲルを使った。
どの場合でも、第２表に示すように、組換え融合タンパク質は推定サイズの近くに移動することが観察された。
Figure 2005139204
分離したタンパク質をウエスタンブロット分析用にニトロセルロース支持体へと移行させた。電気泳動したタンパク質をニトロセルロース膜へと移行させるのには半乾式電気泳動移行法（Harlow & Lane, Antibodies, a laboratory manual, 488-489 頁）を使った。
移行後、膜をBlotto (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5.0 ％脱脂粉乳, 0.1 ％Tween-20）を使って４℃で一晩かまたは室温で１時間のいずれかでブロックした。ブロック剤を除去した後、Blotto中に希釈した第一抗体3)と共に膜をインキュベートした。次いで第一抗体溶液を捨て、Blottoを使ってブロットを５分間ずつ４回洗浄した。第二抗体−酵素接合体4)を添加し、室温で30分間インキュベートした。30分後、第二抗体を捨て、そしてブロットを前と同様に４回洗浄した。この後、水ですすぎ、そして発色基質溶液5)を添加した。
バンドが出現した後で水洗することにより色の発色を停止させた。pQE/pol23 とpThioHis/pol23の両タンパク質バンドがウエスタンブロット上で一方のマウスモノクローナル抗体を使った時に反応し、pQE/pol7.0とpThioHis/pol7.0 の両タンパク質バンドは他方のマウス抗体と反応した。ヒトＨＩＶ−１陽性血清を使った場合には４つのバンド全部が検出された。
3)ＨＩＶ polに対する２つのマウスモノクローナル抗体を１：4000希釈倍率で使用した。ＨＩＶに対して陽性のヒト血清を１：500 希釈倍率で使用した。
4)第二抗体接合体は、第一抗体がマウスモノクローナル抗体である場合にはBlotto中の西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス抗体（１：2000）であり、第一抗体がヒト血清である場合にはBlotto中のアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒト抗体（１：2000）であった。
5)西洋ワサビペルオキシダーゼ第二抗体接合体と共に使用した基質はテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）(Vector Labs) であり、アルカリホスファターゼ第二抗体接合体と共に使用した基質は BCIP/NBT 一成分基質（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. ）であった。
実施例５−酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）試験
ＥＩＡプレートを部分精製済組換え融合タンパク質でコーティングした。各試料は15 mM 炭酸／35 mM 重炭酸コーティング緩衝液 pH 9.6 中の１：500 の希釈倍率で室温で一晩コーティングした。コーティングしたプレートを「オン／オフ」ブロックし（2.5 ％脱脂粉乳）、４％ショ糖溶液を使って「オン／オフ」コーティングし、そして一晩風乾した。調製したら、プレートをシールパウチ中で乾燥保存することができる。
各組換え融合タンパク質を16個のＨＩＶ−１陽性試料、８個の正常提供者試料および４個のＥ．コリ反応性試料について試験した。Ｅ．コリ反応性試料は、Ｅ．コリ溶解物からのタンパク質に対して高い反応性を有することが以前に証明されている試料である。本発明者らが観察したＨＩＶ−１陽性試料との反応性が、組換えポリペプチドに特異的であり且つ混入したＥ．コリタンパク質に対して向けられたものでないことを保証するためにそれらを含めた。
簡単に言えば、試料を試料希釈剤〔１Ｌあたり44.1 gのクエン酸ナトリウム二水和物, 1.2 mlのTween 20, 50 ng の脱脂粉乳, 0.05 ml のAntiform A, 50 ml のヤギ血清, 58.6 gの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸, 92.9 gのトリエタノールアミン塩酸塩, 1 mlのProclin 300 を含有する〕中に１：101 希釈し、生じた混合物の200 μl を予め調製しておいたプレートの各ウエルに添加した。プレートにカバーをし、37±１℃で60分間インキュベートした。各ウエルから液体を吸引し、プレートを洗浄溶液（0.1 M NaCl／0.05％Tween 20）で最低５回洗浄した。
100 mlの接合体溶液（１％正常ヤギ血清を含むクエン酸緩衝液 pH 7.0 中に希釈したヤギ抗ヒトIg−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体）を各ウエルに添加した。次いでプレートにカバーをし、37±１℃で60分間インキュベートした。インキュベーション後、各ウエルから液体を吸引し、そしてプレートを洗浄溶液で最低５回洗浄した。
色原体溶液（クエン酸／リン酸緩衝液 pH 6.0 中、80μg/mlのテトラメチルベンジジン, 0.0015％過酸化水素）100 μl を各ウエルに添加した。次いでプレートにカバーをし、遮光下で室温で30分間インキュベートした。カバーを取り、100 μl の停止試薬（1N H2SO4）を添加した後、プレートの450 nmの吸光度と、比較参照として615 nm〜630 nmの吸光度を読み取った。450 nm対630 nmの光学濃度の比を計算した。陽性結果のカットオフ値は、少なくとも３つの既知の陰性試料から得られた平均吸光度を0.200 上回る吸光単位に設定した。これらの実験の結果を第３表に与える。
Figure 2005139204
上記結果から、本発明のポリペプチドの１つまたは組合せを使うことにより、ＨＩＶに対する抗体の存在についての高感度で且つ高精度の試験が提供されることは明らかである。本発明のポリペプチドをそれ自体でまたはスクリーニングアッセイや確認試験と組み合わせて使用でき、一方で完全溶解物または完全抗原を独立した手順として使用することができる。本発明のポリペプチドは、スクリーニングアッセイや確認試験においてＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のエンベロープ領域またはgag 領域から誘導されたポリペプチドまたはタンパク質と組み合わせて使用することもできる。更に、該ポリペプチドの特異性のために、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列もＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいて同様な特異性を示すだろうと期待できる。
本発明を十分記載してきたが、特許請求の範囲および精神より逸脱することなくそれに多くの変更や改良を行えることは当業者に明白であろう。
図１は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpGEX/pol23のプラスミド地図を示す。 図２は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpGEX/pol7 のプラスミド地図を示す。 図３は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpQE/pol23 のプラスミド地図を示す。 図４は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpQE/pol7のプラスミド地図を示す。 図５は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpThioHis/pol23のプラスミド地図を示す。 図６は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpThioHis/pol7 のプラスミド地図を示す。

Claims (22)

  1. 体液中のＨＩＶに対する抗体の存在を測定する方法であって、以下のステップ：
    (a) 免疫特異的結合を可能にする条件下で、上記体液と下記のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     ｛上記配列中、Ｗはポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、又は当該ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１若しくは複数の追加のアミノ酸であり、当該追加のアミノ酸は担体タンパク質又は支持体への当該ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly 又はLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cysであるか、又は結合を促進するために付加された１若しくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨ又はＮＨである。｝を有する少なくとも１つのポリペプチド又はタンパク質を含有する組成物とを接触させて反応混合物を形成せしめ；及び
    (b) 当該ポリペプチドと当該体液中の抗体成分との間に免疫特異的結合が生じたかどうかを測定し、ここで免疫複合体が形成されそして当該免疫複合体の検出が当該体液中のＨＩＶに対する抗体の存在を指標する；
    を含む前記方法。
  2. 前記ポリペプチド又はタンパク質が以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリペプチド又はタンパク質が以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記ポリペプチド又はタンパク質が以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ポリペプチド又はタンパク質が以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１に記載の方法。
  6. 配列中、Ｗがアミノ末端ＮＨ2 基のＨであり、ＺがＯＨであり、そしてＸとＹが存在しない、請求項１に記載の方法。
  7. 前記ポリペプチドが担体巨大分子に結合されている、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ポリペプチドが固定化されている、請求項１に記載の方法。
  9. 前記免疫特異的結合が免疫沈降により検出される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記組成物が、ＨＩＶ−１のポリメラーゼ・タンパク質から選ばれる少なくとも１つのポリペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. 前記組成物が、ＨＩＶ−１のエンベロープ・タンパク質から選ばれる少なくとも１のポリペプチド、及びＨＩＶ−２のエンベロープ・タンパク質から選ばれる少なくとも１のポリペプチドをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ポリペプチドがアミノ酸残基の置換、付加又は欠失により修飾されるが、修飾後のポリペプチドが未修飾のポリペプチドの免疫反応性の実質的に全部を保持している、請求項１に記載の方法。
  13. 前記免疫反応性が、放射性免疫沈降法、免疫蛍光法、及びエンザイムリンクド・イムノソルベント・アッセイ法から成る群より選ばれる方法により計測される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ポリペプチド又はタンパク質と前記体液中の抗体成分との間の免疫特異的結合が、以下の：
    (i) 前記免疫反応混合物中に形成された免疫複合体から未結合成分を除去し；
    (ii) 前記免疫反応混合物に標識抗体を添加し、ここで前記標識抗体が免疫複合体の一成分に免疫特異的に結合することができそして前記標識が検出可能なシグナルを提供し；そして
    (iii) 前記標識抗体が前記免疫複合体に結合するかどうかを測定する
    より検出される、請求項１に記載の方法。
  15. 前記標識が、酵素基質、放射性標識、又は蛍光標識の添加により検出される酵素を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ＨＩＶ抗体に対して免疫反応性であるポリペプチド組成物であって、当該ポリペプチドが、下記アミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     ｛上記配列中、Ｗはポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基のＨであるか、又は当該ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ2 基に結合した１若しくは複数の追加のアミノ酸であり、当該追加のアミノ酸は担体タンパク質又は支持体への当該ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly 又はLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cysであるか又は結合を促進するために付加された１若しくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨ又はＮＨ2 であり；但し、ＨＩＶ抗体に対する免疫反応性が保持される限りにおいて上記配列中にアミノ酸が挿入、欠失又は置換されてもよい。｝により表される、前記組成物。
  17. 配列中、Ｗがアミノ末端ＮＨ2基のＨであり、ＺがＯＨであり、そしてＸとＹが存在しない、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記ポリペプチドが以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１６に記載のポリペプチド組成物。
  19. 前記ポリペプチドが以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１６に記載のポリペプチド組成物。
  20. 前記ポリペプチドが以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１６に記載のポリペプチド組成物。
  21. 前記ポリペプチドが以下のアミノ酸配列：
    Figure 2005139204
     により表される、請求項１６に記載のポリペプチド組成物。
  22. 前記ポリペプチドが、１又は複数のアミノ酸残基の置換、付加又は欠失により修飾され、当該修飾されたポリペプチドが、その修飾されていないポリペプチドと実質的に等価なＨＩＶ抗体免疫反応性を有する、請求項１６に記載のポリペプチド組成物。
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