JP2001512037A

JP2001512037A - Ｈｉｖウイルスに対して免疫反応性である抗体の検出用の合成抗原

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Publication number: JP2001512037A
Application number: JP2000505338A
Authority: JP
Inventors: エフ．コールマン，パトリック; スー，ピーターチョン−ダグ; モンジ，ノブオ; コール，キャロル−アン; カンプゴショーン，アリス
Original assignee: ジェネティックシステムズコーポレイション
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2001-08-21
Anticipated expiration: 2018-07-31
Also published as: CA2298438C; EP1000177A4; AU8686098A; JP4166940B2; AU753780B2; US7144697B1; ES2344926T3; EP1878805B1; ATE360709T1; CA2298438A1; WO1999006599A1; DE69837666D1; EP1878805A3; ATE467690T1; JP2005139204A; DE69837666T2; EP1000177B1; EP1000177A1; EP1878805A2; ES2286854T3

Abstract

(57)【要約】新規ポリペプチド、およびそれをコードする組換えポリヌクレオチド配列が提供される。このポリペプチドは、エイズ（AIDS）関連ウイルスの免疫学上重要な断片と実質的に同じ配列を有する。このポリペプチドは、ウイルスへのヒト宿主の暴露の測定試薬として利用できる。特に着目されるのは、血液製剤をスクリーニングするに際してのポリペプチドの使用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）および／または２型（Ｈ
ＩＶ−２）（本明細書中で用いる時、型を言及しないで使用する「ＨＩＶ」はい
ずれか一方または両方の型を意味する）に関連する抗体を検出するのに有用な合
成ポリペプチド、組換えポリペプチドおよびそれをコードする組換えポリヌクレ
オチド配列に関し、そして特にＨＩＶポリメラーゼ領域の遺伝子産物の抗原エピ
トープを模倣した合成ポリペプチドに関する。

【０００２】発明の背景この出願は、1997年８月１日出願の米国特許出願第08/904,826号明細書の一部
係属出願であり、前記出願の開示は参考として本明細書中に組み込まれる。

【０００３】ヒト免疫不全ウイルス１型と２型（ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２）は後天性免疫不
全症候群（ＡＩＤＳ、エイズ）を引き起こすことが知られている。両ウイルスと
も見かけ上は同様な感染形態を示す。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は共にアフリカの
エイズ患者から1980年代初めに単離された。その後、世界中のほとんどの国で症
例が見つかっている。ＨＩＶウイルスは急速な遺伝的浮動を示すので、広範囲に
多様性の株が出現し続けている。よって、変異株の検出と治療は挑戦的であり且
つ困難であるとわかった。

【０００４】ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２に対して反応性の抗体を有する個体は、
常用のサンドイッチELISA 方式のイムノアッセイにより決定される。それらのア
ッセイは、ウイルス溶解物、レトロウイルスタンパク質または天然もしくは合成
ポリペプチドから構成され得る固定化ウイルス抗原を含んで成り、それの抗原を
ＨＩＶ抗体を含む疑いのある血液または血清成分と接触させる。現存する商業ベ
ースの試験は、血液製剤中へのＨＩＶウイルスの伝染をかなり低減したけれども
、各試験の構成は幾つかの欠点を有する場合がある。

【０００５】ウイルス溶解物試験の考えられる欠点としては次のものが挙げられる：大量の
生存している感染性ウイルスを増殖させそして処理する必要性があること；生存
ウイルスが試験材料中に混入する可能性があること；得られるウイルス溶解物の
性質が変動的であること；そして追加の確認試験を必要とする相当数の偽陽性結
果や偽陰性結果を生じること。これらの欠点は抗原として単離されたウイルスタ
ンパク質を使用する場合にも伴い得る。

【０００６】ＨＩＶウイルスの抗原エピトープを免疫学的に模倣するように作製することが
できる合成ポリペプチド（本明細書中で使用する「合成ポリペプチド」および「
ポリペプチド」は、合成ポリペプチド、組換えポリペプチドまたはポリペプチド
のいずれか１つ、全部または任意の組合せを意味する）の使用は、上記欠点の幾
つかを回避することができる。診断アッセイにおける合成ポリペプチド（長さが
60残基以下）の使用に伴う一種の懸念は、おそらくウイルスエピトープの限定さ
れた提示のために、ウイルス抗原の遺伝的浮動がそれらのアッセイを使ったＨＩ
Ｖ−１またはＨＩＶ−２感染血清の検出の失敗を引き起こし得るという考えであ
る。そのような現象に対して保護する１つの方法は、ウイルスゲノムの異なる免
疫優性領域由来のポリペプチドを含めることである。よって、ＨＩＶ−１および
ＨＩＶ−２のpol 遺伝子産物の免疫優性領域を免疫学的に模倣した合成ポリペプ
チドは、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２のenv , gag およびpol タンパク質を模倣した
既に記載されているポリペプチドへの重要な付加物である。米国特許第4,629,78
3 号および同第5,075,211 号明細書は、ＨＩＶ−１の抗原決定基を模倣した合成
ポリペプチドを記載しいる。Cosand米国特許第5,075,211 号明細書は、pol 領域
由来のＨＩＶ−１タンパク質の抗原エピトープを免疫学的に模倣した合成ポリペ
プチドを記載しており、そのうちの２つのポリペプチドが本発明のポリペプチド
と類似している。血液スクリーニングアッセイでは、アッセイ法に使用する抗原
の免疫反応性が大きければ大きいほど、患者試料中に存在するＨＩＶ−１または
ＨＩＶ−２の新規変異体または亜型に対する抗体が未検出のままである可能性が
より低くなる。

【０００７】米国特許第5,306,466 号明細書は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とは異なり且
つ別個のものであると最初は信じられていた「ＨＩＶ−３レトロウイルス」を記
載している。研究者がはＨＩＶ−３レトロウイルスが単にＨＩＶ−１の特定の亜
型であることを決定して以来、今はＯ亜型またはＯ群と呼ばれている〔R. De Le
ys他, J. Virol. 1207-1216 (1990) ; L.G. Gurtler 他, J. Virol. 1581-1585
(1994)〕。

【０００８】様々なＨＩＶ−１分離株を比較することにより、研究者らはゲノムには高度に
可変性である領域もあり、または適度に十分保存されている領域もあることを証
明した。ＨＩＶ−２にも同様な多形性が観察されている。

【０００９】ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２ウイルスの伝染および病気状態にて見かけ上の類似点
があるにもかかわらず、それらの遺伝的多様性に基づいて両ウイルス型は区別さ
れている。今日、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２はＨＩＶ系統樹の２本の主枝を構成し
ている。ＤＮＡハイブリダイゼーション研究は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の間に
は広範囲に渡り相同性領域が存在するが、他の領域は非常に多様に見えることを
示唆している〔Clavel他, Science 233:343 (1986)〕。実際、ＨＩＶ−２はＨＩ
Ｖ−１と全体で約40％の相同性しか持たないことが示されており、エンベロープ
糖タンパク質間でほとんど免疫交差反応性を示さないことも実験により証明され
ている。それらのウイルス間での限定された血清学的交差反応性のため、ＨＩＶ
−１抗原に基づいたスクリーニングアッセイではヒト血清におけるＨＩＶ−２感
染のスクリーニングや診断には不十分である。

【００１０】発明の要約ポリメラーゼ領域中にコードされるＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２タンパク質の
免疫優性領域を模倣することができるポリペプチド配列を同定した。それらの合
成ポリペプチド、組換えポリペプチドおよびそれをコードする組換えポリヌクレ
オチド配列は、ＨＩＶウイルスへの暴露についての血液および血液製剤のスクリ
ーニング用の試薬の調製に有用である。これらのポリペプチドは、ＨＩＶ−１お
よび／またはＨＩＶ−２ウイルスに対する抗体の検出のための様々な特異的結合
アッセイにおいて利用でき、またはワクチン組成物中での免疫原として利用でき
る。

【００１１】特定の実施形態の具体的説明それぞれＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２レトロウイルスによりコードされるタン
パク質、特にウイルスゲノムのポリメラーゼ領域中にコードされるタンパク質、
を免疫学的に模倣した新規ポリペプチドが提供される。本発明の各ポリペプチド
は、ポリペプチド中に保存的または非保存的置換を導入することにより変更され
てもよく、普通は数で20％未満、より普通には10％未満のアミノ酸が置換されて
もよい。その領域が構造的に多形性であると認められるような状況では、異なる
レトロウイルス株の異なるエピトープを一層効果的に模倣するように１または複
数の特定アミノ酸を変更することが望ましいかもしれない。多くの場合、化学的
安定性を提供するために、メチオニンをノルロイシン (Nor)に置き換えることが
できる。

【００１２】本発明のポリペプチド中に適当なアミノ酸置換を選択するのに特に有用な一手
段は、１または複数のウイルス分離株中に天然に存在する置換であろう。一般に、「ポリペプチド」または「ペプチド」という語は、生物活性を有する
アミノ酸分子の連続鎖を意味する。この用語は何か特定の長さの生成物に関連づ
けられるわけではない。

【００１３】本発明において使用するポリペプチドは、その化合物がＨＩＶ−１またはＨＩ
Ｖ−２レトロウイルスの少なくとも１つの株のpol 領域のエピトープを免疫学的
に模倣できる限り、ある特定のＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ポリペプチド配列と
同一である必要はない。従って、本発明のポリペプチドは、上述したように様々
な変更、例えば挿入、削除および保存的または非保存的置換を含むように変更す
ることができ、そのような変更はそれらの使用に際して何らかの有利性に備える
かもしれない。保存的置換とは、gly, ala ; val, ile, leu ; asp, glu ; asn,
gln ; ser, thr ; lys, arg ; phe, tyr および nor, met といったグループ内
での置換を意味する。通常、配列は、本発明のポリペプチドを便利に固定化でき
る「アーム」を提供する目的でいずれかの末端に追加のアミノ酸が付加される場
合を除いて、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２レトロウイルスの少なくとも１つの株
の配列から20％以上は異ならないであろう。このアームは通常は長さが少なくと
も１アミノ酸であるが50以上のアミノ酸であってもよく、しばしば１〜10アミノ
酸であろう。アミノ酸配列がアミノ酸残基の置換、付加または削除により変更さ
れているポリペプチドは、未変更のポリペプチドの免疫反応性の実質上全部を保
持すべきであり、免疫反応性は放射性免疫沈澱法、免疫蛍光法またはエンザイム
リンクドイムノソルベントアッセイ法により便利に測定することができる。

【００１４】更に、ポリペプチドを互いに連結する際の容易性、支持体または大きなポリペ
プチドへの結合、ポリペプチドまたはオリゴペプチドの物理的または化学的性質
の変更等に備えて、オリゴペプチドまたはポリペプチドの末端に１または複数の
アミノ酸を付加してもよい。

【００１５】結合に有用な官能基を提供するためにチロシン、システイン、リジン、グルタ
ミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸をポリペプチドのＣ末端またはＮ末
端に導入してもよい。別のポリペプチドへの共有結合を促進するため、または例
えば酸化により二量体を形成させるためにはシステインが特に好ましい。ポリマ
ーを形成させるためには、分子中に少なくとも２つのシステイン残基を存在させ
るのが好ましく、好ましくはポリペプチドの末端部分に付加されたシステイン残
基を利用することによりそれらを結合させる。介在アミノ酸スペーサーとシステ
インとの組合せも有用である。例えば、２つのシステイン残基を１または複数の
アミノ酸残基により互いに隔てることができる。グリシン残基が特に有用であり
、アミノ酸間に１〜３個のグリシン残基を使用することができる。リジン残基も
リンカーとして有用であることがわかっており、１〜３個のリジン残基を単独で
または他のアミノ酸と組み合わせて使用してポリペプチドを固相に結合させるこ
とができる。

【００１６】その上、本発明のポリペプチド配列は、安定性を提供するため、支持体もしく
は別の分子への連結もしくは結合に備えて疎水性を増加させるため、または重合
のため、末端ＮＨ₂のアシル化により、例えばアセチル化もしくはチオグリコー
ル酸アミド化により、末端カルボキシのアミド化により、例えばアンモニアもし
くはメチルアミンを使ったアミド化により変更した後に、天然の配列を異なって
もよい。

【００１７】ＨＩＶ−１のポリメラーゼ領域から誘導した本発明のポリペプチドを下記に記
載する。ＨＩＶ−１ポリペプチドファミリーは、塩基対（bp）4448〜（bp）4584
（GenBank HIVBRUCGの番号付け法；受入れ番号 K02013, BRU分離株）を包含する
ゲノムポリヌクレオチド配列（LAI またはBRU 分離株）によりコードされるか、
またはアミノ酸残基番号約940 〜約 985のpol 転写解読枠中にコードされる。

【００１８】ポリペプチドＩは次のポリペプチド配列を有する：

【化２０】

【００１９】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００２０】本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドII（BRU124EXとも称する）は次
のポリペプチド配列を有する：

【化２１】

【００２１】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００２２】本発明の別のポリペプチドであるポリペプチド III（BRU124F1X とも称する）
は次のポリペプチド配列を有する：

【化２２】

【００２３】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００２４】本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドIV（BRU124F3X とも称する）は
次のポリペプチド配列を有する：

【化２３】

【００２５】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のいずれかのＨであ
るか、または前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数
の追加のアミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体へ
の前記ポリペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-
Gly-Gly またはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合
を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨ
またはＮＨ₂ である）。

【００２６】ＨＩＶ−２のポリメラーゼ領域から誘導した本発明のポリペプチドを下記に記
載する。ROD124E1とも称するポリペプチドＶは、塩基対（bp）4694〜（bp）4861
（GenBank HIV2ROD の番号付け法；受入れ番号 M15390, HIV-2ROD 分離株）を包
含するＨＩＶ−２ゲノムのポリヌクレオチド配列によりコードされるか、または
アミノ酸残基番号約956 〜1001のpol 転写解読枠中にコードされる。

【００２７】ポリペプチドＶは次のポリペプチド配列を有する：

【化２４】

【００２８】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００２９】 ROD124EXとも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドVIは次のポ
リペプチド配列を有する：

【化２５】

【００３０】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００３１】 ROD124C2X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドVII は次
のポリペプチド配列を有する：

【化２６】

【００３２】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００３３】 ROD124C1X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドVIIIは次
のポリペプチド配列を有する：

【化２７】

【００３４】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００３５】 ROD123C3X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドIXは次の
ポリペプチド配列を有する：

【化２８】

【００３６】（上記配列中、Ｘは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｙは存在しないか、Cys であるか、
または結合を促進するために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そし
てＺはＯＨまたはＮＨ₂ である）。

【００３７】 POL2A1とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドＸは次のポリ
ペプチド配列を有する：

【化２９】

【００３８】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００３９】 POD124C5X とも称する本発明の別のポリペプチドであるポリペプチドXIは次の
ポリペプチド配列を有する：

【化３０】

【００４０】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）。

【００４１】特に着目されるのは、ジスルフィド結合または更に長い結合による２つのポリ
ペプチドもしくはオリゴペプチドまたはその組合せを連結させるために、末端ア
ミノ基等をアシル化するのに使われるシステインもしくはチオグリコール酸のメ
ルカプト基を使用することである。これを達成するために、ビス−ハロアセチル
基を有する化合物、ニトロアリールハライド、または試薬がチオ基に特異的であ
る同様の他の化合物などを使用することができる。よって、異なるポリペプチド
またはオリゴペプチドの２つのメルカプト基の間の結合は単結合であるか、また
は少なくとも２個、通常は少なくとも４個であり且つ約16個以下、通常は約14個
以下の炭素原子を有する連結基であることができる。

【００４２】あるいは、本発明のポリペプチドをコードするウイルスゲノム領域を、常用の
組換えＤＮＡ技術によりクローニングしそして発現させることができる。この技
術としては、ＰＣＲ媒介クローニングの他に、着目のポリペプチドをコードする
一本鎖ポリヌクレオチド鎖の合成が挙げられる。一般に Maniatis 他, Molecula
r Cloning, A Laboratory Manual CSH, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982
を参照のこと。

【００４３】ポリペプチド断片の発現にはポリヌクレオチド配列からの断片を使用すること
ができ、変更された１もしくは複数のコドンが同一アミノ酸をコードするような
保存的塩基置換を行うことができ、またはアミノ酸配列中に得られるアミノ酸が
保存的もしくは非保存的置換であるようなコード配列中の非保存的置換を行うこ
とができる（上述）。

【００４４】コード配列を５′末端もしくは３′末端または両末端のところで延長して、エ
ピトープ部位を維持しながらポリペプチドを延長することができる。この延長は
例えば酵素のような標識への結合のため、このペプチドと別のポリペプチドとを
同じ鎖中に一緒に連結せしめるため、抗原活性を提供するため、等に使われるア
ームを提供する。

【００４５】発現に備えて、コード配列には開始および終止コドン、プロモーターおよびタ
ーミネーター領域並びに普通は複製系が提供され、細胞宿主、例えば原核生物も
しくは真核生物、細菌、酵母、哺乳動物などでの発現のための発現ベクターが提
供されるだろう。

【００４６】ＤＮＡ配列それ自体、その断片、またはそれより長い配列、通常は少なくとも
15塩基、好ましくは少なくとも18塩基の配列を、レトロウイルスＲＮＡまたはプ
ロウイルスＤＮＡの検出用のプローブとして使用することができる。多数の技術
、例えばGrunstein-Hogness 技術、サザン技術、ノーザン技術、ドットブロット
、それらの改良法、並びに他の方法論が記載されている。例えば、WO 83/02277
および Berent 他, Biotechniques (1985) 3:208を参照のこと。

【００４７】ポリペプチドは融合タンパク質として調製することができるが、ポリペプチド
は融合ポリペプチドのＮ末端であってもＣ末端であってもよい。一般に、着目の
ポリペプチドは「翻訳融合体」として発現される。翻訳融合体は、発現されるタ
ンパク質のアミノ末端がＥ．コリまたは別の既知発現系中で容易に発現される「
パートナー」タンパク質に結合していることを意味する。融合体は精製用標識ま
たは「ハンドル」を含んでもよい。

【００４８】そのような融合系の一例は、グルタチオン−アガロース樹脂上でのアフィニテ
ィー精製に使用できるタンパク質をコードするグルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ遺伝子の一部分の使用である。この融合系は市販されているpGEXプラスミド
(Pharmacia) の中に見つけられる。第二の例は、融合パートナーとしてのジヒド
ロ葉酸レダクターゼ遺伝子の一部分とハンドルとしての６個のヒスチジン残基を
コードする配列の使用である。この「His 標識」は、発現された融合タンパク質
をNi−NTA （ニッケル）クロマトグラフィーにより精製可能にする。この融合系
は市販されている pQE42プラスミド(QIAGEN)中に見つけられる。同様に、チオレ
ドキシンコード配列中に作製された３つのヒスチジン残基から成る「His パッチ
」を有するＥ．コリのチオレドキシン遺伝子の一部分も、発現されたタンパク質
をNi−NTA クロマトグラフィーにより精製できるようにする。この融合系は市販
のpThioHisA プラスミド (Invitrogen) 中に見つけられる。

【００４９】得られた融合タンパク質はそれ自体で試薬としてそのまま使用できるし、本発
明のポリペプチドを融合タンパク質中の残りの配列の全部もしくは一部から開裂
させることもできる。内部メチオニンを全く含まないポリペプチドでは、融合部
位のところにメチオニンを導入することにより、臭化シアンを使って該ポリペプ
チドを開裂させることができる。内部メチオニンが存在する場合には、タンパク
質分解開裂部位に例えばポリリジンおよび／またはアルギニンまたはそれの組合
せを提供する必要があるだろう。あるいは、内部メチオニンをロイシンのような
アミノ酸により置き換え、そして臭化シアン開裂用にＮ末端メチオニンを付加す
ることができる。ジペプチダーゼを含む多種多様なプロテアーゼが周知であり、
適当なプロセシングシグナルを適切な位置に導入することができる。１または複
数の無関係のアミノ酸の存在は本発明のポリペプチドの有用性を害さないであろ
うから、開裂を確実にするためにプロセシングシグナルが縦列の反復を有しても
よい。

【００５０】ＨＩＶ−１のポリメラーゼ領域由来の多数のポリペプチドをコードする本発明
の組換えポリヌクレオチドを下記に記載する。これらの配列は、ＨＩＶ−１ウイ
ルス溶解物に確認される、塩基対（bp）2549〜（bp）3139および塩基対（bp）43
91〜（bp）4648を包含するＨＩＶ−１ゲノムポリヌクレオチド配列（ＬＡＩ分離
株）から誘導される。

【００５１】 pol23 としても知られるポリヌクレオチド配列Ｉは次の配列を有する：

【化３１】

【００５２】この配列は下記のアミノ酸をコードする。（この教示により縛られずに、イタ
リック体で示したアミノ酸は生成ポリペプチドの免疫反応性にとって特に重要な
残基を表すと思われる。）ポリヌクレオチド配列 (I) pol23によりコードされる (XII)pol23-aaポリペプ
チド

【化３２】

【００５３】 pol7とも称する本発明の別のポリヌクレオチド配列であるポリヌクレオチド配
列IIは次の配列を有する：

【化３３】

【００５４】この配列は下記のアミノ酸配列をコードする。（イタリック体で示したアミノ
酸は本明細書中に開示するポリペプチドBRU124F3X を表す。）ポリヌクレオチド配列 (II) pol7によりコードされる (XIII)pol7-aaポリペプ
チド

【化３４】

【００５５】本発明のポリペプチドは可溶性巨大分子（例えば５kDal以上）に連結して使用
することができる。便利には、担体は、それに対する抗体がヒト血清中におそら
く見つからないであろう天然のまたは合成のポリ（アミノ酸）であることができ
る。代表的なポリペプチドとしてはポリ−Ｌ−リジン、ウシ血清アルブミン、ア
オガイヘモシアニン、ウシγグロブリンなどが挙げられる。主として便利性と入
手可能性により選択される。

【００５６】そのような接合体には、少なくとも１つの本発明のポリペプチドが巨大分子あ
たり少なくとも１分子存在し且つ巨大分子0.5 kDalあたり約１以下、通常は巨大
分子2 kDalあたり約１以下の分子が存在するだろう。複数の異なるポリペプチド
が同じ巨大分子に連結されてもよい。

【００５７】結合方式は、通常のものであり、ｐ−マレイミド安息香酸、ｐ−メチルジチオ
安息香酸、無水マレイン酸、無水コハク酸、グルタルアルデヒド等のような試薬
を使用する。結合はＮ末端、Ｃ末端、または分子の末端から中間的な部位のいず
れかで起こる。本発明のポリペプチドは連結により誘導体化することができ、ま
たは支持体に結合した状態で連結させることができる。

【００５８】本発明のポリペプチドは、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２またはそれの抗原に
対する抗体を検出するためのアッセイ試薬として使用することができる。ポリペ
プチドはそれらの用途に依存して標識したまたは未標識の試薬として使用するこ
とができる（標識とは、直接または間接的に検出可能なシグナルを提供する分子
を意味する）。様々な標識が使用でき、例えば放射性核種、酵素、蛍光体、化学
発光体、酵素基質、酵素補因子もしくは阻害剤、粒子、例えば磁性粒子、リガン
ドとレセプターの組合せ、例えばビオチンとアビジンの組合せなどを使用できる
。その上、ポリペプチドを表面、例えばマイクロウエルプレート、ガラスビーズ
、クロマトグラフィー表面、例えば紙、セルロース、シリカゲルなどへの結合の
ために様々な方法で変更することができる。ポリペプチドを別の分子にまたは表
面に結合せしめる特定の方法は常法であり、文献中にその実例が見つかる。例え
ば、米国特許第4,371,515 号、同第4,487,715 号明細書およびその中に引用され
た特許明細書を参照のこと。

【００５９】様々なアッセイプロトコルをレトロウイルスタンパク質に対する抗体またはレ
トロウイルスタンパク質それ自体の存在を検出するために使用できる。特に着目
されるのは、検出可能なシグナルに備える標識を有する標識された試薬としてポ
リペプチドを使用するもの、またはポリペプチドを直接または間接的に表面に結
合させ、そこで試料中の抗体またはポリペプチドが表面上の前記ポリペプチドに
結合するようになるというものである。次いで、ヒト免疫グロブリンに特異的な
異種抗体、通常はヒトIgＭとIgＧの両方を使用することにより、または免疫複合
体に特異的な標識タンパク質、例えばＲＦ因子もしくはＳ．アウレウス（S. aur eus ）プロテインＡを使用することにより、該ポリペプチドに結合したヒト抗体
の存在を検出することができる。

【００６０】様々な不均一プロトコル、例えば競合型または非競合型不均一プロトコルを使
用できる。ポリペプチドを表面または支持体（総称的に「支持体」）に結合させ
、そして標識抗体を限定量の結合したポリペプチドを目当てに試料中の抗体と競
争させる。支持体に結合した標識の量が試料中の競合抗体の量に関連づけられる
。

【００６１】異種抗ヒト抗体、例えばIgＧとIgＭのＦｃ領域に対する抗体（免疫グロブリン
）を支持体に結合できる。試料を免疫グロブリンおよび標識ポリペプチドと接触
させ、それにより支持体に結合した標識ポリペプチドの量が同族の(cognate) 抗
体の存在を示すことになる。

【００６２】あるいは均一アッセイを使用できる。均一アッセイでは、ポリペプチドを酵素
、蛍光体または他の標識に結合させ、前記ポリペプチドへの抗体の結合が、特異
的結合ペア複合体に関係する標識と前記複合体に関係しない標識とを区別するこ
とができるようになる。そのような技術を用いたアッセイについては、例えば米
国特許第3,817,837 号；同第3,850,752 号；同第3,901,654 号；同第3,935,074
号；同第3,984,533 号；同第3,996,345 号；同第4,034,074 号および同第4,098,
876 号明細書を参照のこと。これらの開示は参考として本明細書中に組み込まれ
る。

【００６３】本発明の一例として、本発明のポリペプチドを蛍光分子、例えばフルオレセイ
ン、ローダミンまたはウンベリフェロンに接合させることができる。このアッセ
イでは、蛍光偏光が複合体形成したポリペプチド接合体と複合体未形成のポリペ
プチド接合体とで異なる。蛍光偏光の変化を測定する装置が利用可能であり、例
えば Abbott Laboratories, Chicago, Illinois により供給されるTDx が利用可
能である。

【００６４】アッセイ技術の典型は、試料容器、例えばマイクロウエルプレートウエルの使
用であり、本発明のポリペプチドまたはそれの接合体が容器の底および／または
壁に共有結合によりまたは非共有結合により付着する。試料、通常は適当に緩衝
化された媒質中に希釈したヒト血液または血清試料を容器に添加し、そしてポリ
ペプチドと試料中のいずれかの同族抗体との間の複合体形成を可能にするのに十
分な時間維持する。上清を除去し、そして容器を洗浄して非特異的に結合したタ
ンパク質を除去する。

【００６５】前記複合体に特異的に結合する標識特異的結合タンパク質が検出に使われる。
適当に緩衝化された培地中のヒト免疫グロブリンに対する異種抗血清、特に抗（
ヒトIgＭおよびIgＧ）を前記容器に添加する。異種抗血清は通常は検出可能な標
識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識されるだろう。次いで標識を検
出する。例えば、酵素を使用する場合、非特異的に結合した酵素標識を除去した
後、現像液を添加する。現像液は酵素基質と恐らく酵素補因子、色素原などを含
み、それらは反応すると比色法により、蛍光測定法によりまたは光子計数測定法
によりそれぞれ検出することができる着色生成物、蛍光生成物または化学発光生
成物を提供するだろう。

【００６６】ポリペプチドは様々な方法で調製することができる。ポリペプチドは、その比
較的短い長さのために、既知プロトコルに従って溶液中でまたは固体支持体上で
合成することができる。例えば、Stewart & Young, Solid Phase Polypeptide S
ynthesis, 第２版，Pierce Chemical Co., 1984 ；およびTam 他, J. Am. Chem. Soc. (1983) 105: 6442を参照のこと。

【００６７】あるいは、本明細書中で検討するように、組換えＤＮＡ技術を使用して、ポリ
ペプチドをコードする一本鎖またはそれに実質的に相補的な鎖を使って組換えポ
リペプチド配列を調製することができる（例えば、Maniatis他, 前掲を参照のこ
と）。

【００６８】アッセイの性質に依存して、生理学的試料、例えば唾液、血液、血漿または血
清をアッセイ媒質（通常は様々な緩衝液、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液な
どの１つを使った水性緩衝培地であろう）中への希釈により予め調製しておくこ
とができる。好ましい希釈剤は150 mMクエン酸ナトリウム中の５％w/v 脱脂粉乳
、0.01％Proclin 300 、0.005 ％ Antiform A である。通常、ｐＨは約６〜９の
範囲内であろう。次いで適当なプロトコルに従って試料を試薬と混合し、結合を
考慮した十分な時間の間維持する。不均一系を用いる時には、一般に結合段階の
後で洗浄を行って非特異的結合を最少にする。この手順の終わりに常法に従って
標識を検出する。

【００６９】アッセイにおける本発明のポリペプチドおよびその類似体の使用の他に、本発
明のポリペプチドはそれ自体でまたはワクチンへ組合せて用途を見つけることが
できる。該ポリペプチドは、一般に１μg 〜20 mg ／kg宿主の範囲の濃度で、常
法により製剤化することができる。生理学的に許容される媒質、例えば無菌蒸留
水、食塩水、リン酸緩衝化食塩水などを担体として使用してもよい。水酸化アル
ミニウムゲルなどのようなアジュバントを使用してもよい。投与は注射、例えば
筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内注射によることができる。投与は１回または複数
回であり、普通は１〜４週間間隔で行われる。

【００７０】８つの既知ＨＩＶ−１陽性血清（即ちGS91-[034,037,042,046,049,052,056 お
よび067], 11230, 11424, 11527, 11532および11535 ；ウエスタンブロット全バ
ンド陽性）に対する、ＨＩＶ−１抗原を免疫学的に模倣した上記ポリペプチドＩ
〜IVの免疫反応性を調べた。その結果を実施例２の第１Ａ表に示す。上記に挙げ
たポリペプチドの全てがそれらの試料に対して高度に免疫反応性であった。

【００７１】同様に、５つの既知ＨＩＶ−２陽性血清（即ち92099,92100,P-83,P-84 および
p-86；ウエスタンブロット全バンド陽性）に対する、ＨＩＶ−２抗原を模倣した
上記ポリペプチドの各々の免疫反応性も調べ、その結果を実施例２の第１Ｂ表に
示す。糖タンパク質（gp）ポリペプチド 41-2-3GC （同時係属米国特許出願第08
/268,388号の主題である非グリコシル化ポリペプチド）は、５つの試料全てに対
して高度に反応性であった。最大反応性のポリペプチドはROD 124C2XとROD 124C
5Xであった。それらは５つの試料全部に反応性であった。

【００７２】実施例１ −ＨＩＶ polポリペプチドの合成 0.35ミリモルのｐ−メチルベンゾヒドリルアミン樹脂（Applied Biosystems I
nc., Foster City, CA）上にｔ−ブチルオキシカルボニル保護アミノ酸を連続カ
ップリングすることにより一連のＨＩＶ polポリペプチドを合成した。標準ベン
ジル型基によりアミノ酸側鎖の保護を行った。トリプトファン残基はホルミル成
分により保護した。合成が完了したポリペプチドを脱保護し、そして標準のＨＦ
法またはTam 他の低−高ＨＦ法（J. Amer. Chem. Soc. 105:6442, 1993）により
樹脂から開裂させた。開裂させたポリペプチドを50％酢酸中で樹脂から抽出し、
そして溶出溶媒として20％酢酸を使ってSephadex G-25 クロマトグラフィーにか
けた。ポリペプチドを含有する画分をプールし、凍結乾燥させた。

【００７３】実施例２ −pol ポリペプチドの免疫反応性本発明のポリペプチドを米国特許第4,629,783 号明細書に既に記載された通り
にELISA によって免疫反応性について試験した。簡単に言えば、本発明のポリペ
プチドの0.5 mg/ml 原液を２Ｍ尿素／５％酢酸中に調製した。12 ml の1.2 ％酢
酸を15 ml ポリプロプレン試験管中に入れ、その試験管に48μl の前記ポリペプ
チド原液を添加し、そして混合した（「コーティング溶液」）。マイクロウエル
プレートのウエルを前記ポリペプチドのコーティング液 100μl で満たし、そこ
に100 μl ／ウエルの0.24Ｍ炭酸塩／0.2 N NaOHを添加し、コーティング溶液の
pHをアルカリ性pHに高めた。プレートにカバーをし、そして室温で一晩放置して
おいた。コーティング溶液を吸引により取り除いた後、300 μl ／ウエルのプレ
ートブロック溶液（１L あたり25 gの脱脂粉乳、14.7 gのクエン酸ナトリウム二
水和物, 8.47 gの塩化ナトリウムおよび0.05 ml のAntiform A, 1.0 ml Kathon
GC/ICPを含有する）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ブロック溶液
を吸引により取り除いた後、プレートをすぐに使用するかまたは風乾して後の使
用のために保存した。イムノアッセイを実施するためには、血漿試料を被検体希
釈剤〔１L あたり44.1 gのクエン酸ナトリウム二水和物, 1.2 mlのTween 20, 50
gの脱脂粉乳, 0.05 ml のAntiform A, 50 ml のヤギ血清, 58.6 gの２−（Ｎ−
モルホリノ）エタンスルホン酸，92.9 gのトリエタノールアミン塩酸塩, 1 mlの
Proclin 300 を含む〕中に20倍希釈し、その希釈液100 μl を各ウエルに添加し
た。試料を37℃で30分間インキュベートし、次いで除去し、そしてウエルを0.1
M NaCl／0.05％Tween 20（350 μl ／回）で５回洗浄した。１％正常ヤギ血清を
含むクエン酸緩衝液 pH 7.0 中に希釈したヤギ抗ヒトIg−西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ接合体 100μl を37℃で30分間各ウエルに添加した後、上記と同様に５回
洗浄した。室温で30分間100 μl ／ウエルの基質溶液（クエン酸／リン酸緩衝液
, pH 6.0中の80μg/mlテトラメチルベンジジン, 0.0015％過酸化水素）を添加す
ることにより、ELISA アッセイを開始した。ウエルあたり100 μl の1 N H₂SO₄ を添加することにより反応を停止させ、そして自動ELISA リーダーにより450 nm
と630 nmの光学濃度の比を測定した。陽性結果に関するカットオフ値は、少なく
とも３つの既知の陰性試料から得られた平均吸光度を0.200 上回る吸光単位に設
定した。

【００７４】第１Ａ表の結果は、本発明のポリペプチドとＨＩＶ−１陽性および陰性試料と
の反応性を示す。ここでＨＩＶ−１陽性試料はGS91-(034, 037, 042, 046, 049,
052, 056, 067), 11230, 11424, 11527, 11532 および11535 であり、そして陰
性試料はPS1059〜PS1062, PS1068, PS1071およびD21 〜D25 である。

【００７５】

【表１】

【００７６】^* 試料は異なるポリペプチド間で吸光度を比較できるようにするために、1/20の
代わりに1/40希釈した。GS-91-(034, 037, 042, 046, 049, 052, 056, 067), 11
230, 11424, 11527, 11532および11535 は既知のＨＩＶ−１陽性試料であり；試
料PS1059〜PS1062, PS1068, PS1071およびD21 〜D25 は既知のＨＩＶ−１陰性試
料である。^** 強調した値は、0.200 ＋陰性平均値により設定されたカットオフ値に基づいて
陽性である値を示す。カットオフ値＝0.238 （BRU124EXを除く）。BRU124EXのカ
ットオフ値＝0.254 。^*** BRU124EXの反応性についての試験は、別の日に異なる試料を使って別個に行
った。 n.d.＝実施せず（または試験せず）。

【００７７】第１Ｂ表の結果は、本発明のポリペプチドとＨＩＶ−２陽性および陰性試料と
の反応性を示す。ここでＨＩＶ−２陽性試料は 92099, 92100, P-83, P-84 およ
びP-86であり、そして陰性試料はNBD1, NBD2, NBD3およびNBD4である。

【００７８】

【表２】

【００７９】強調した値は0.200 ＋陰性平均値により設定されたカットオフ値に基づいて陽性
である値である。カットオフ値＝0.256 。既知の陽性試料は92099, 92100, P-83, P-84およびP-86であり、既知の陰性試料
はNBD1, NBD2, NBD3およびNBD4である。

【００８０】 pol ポリペプチドを含めることによるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２抗体検出の
特異性の改善は、第１Ｃ表に示す実験結果により証明される。この実験では、米
国特許第5,439,792 号明細書（その開示は参考として本明細書中に組み込まれる
）に開示されたように、pol ポリペプチドを個別にまたはエンベロープ特異的ポ
リペプチドと一緒にマイクロウエルプレート上にコーティングした。個別のpol ポリペプチドによるプレートコーティングの場合、前記ポリペプチドを1.0 μg/
mlの濃度でコーティングした。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ポリペプチドとの混
合物のプレートコーティングの場合、前記ポリペプチドをコーティング緩衝液中
に次の濃度で一緒に混合した：ＨＩＶ−１エンベロープポリペプチド（MNGCと命
名）を1.23μg/ml、ＨＩＶ−２エンベロープポリペプチド（41-2-3GCと命名）を
0.64μg/ml、BRU124F3X を0.25μg/ml、およびROD124C5X を0.125 μg/ml。ポリ
ペプチドコーティング手順は前の「免疫反応性」の項目に記載したのと同じであ
った。試験した試料は既知のＨＩＶ−１試料（ウエスタンブロット全バンド陽性
試料）（即ち、SAL040, SAL041, SAL059, SAL063, SAL064）、既知のＨＩＶ−２
試料（ウエスタンブロット全バンド陽性試料）（即ち、52, GB92000128, GB9200
0152, GB92000154, GB92000158）、ＨＩＶ−１不確定試料（即ち、B3113, B5813
, B5885, B7045, C000127, C000214, C000455 ）およびＨＩＶ−２不確定試料（
即ち、B3123, B5605, B5810, B5826, B5832, B5875, B6312 ）である。Genetic
Systems （商標）HIV-1/HIV-2 Peptide EIA Kit (Sanofi Diagnostics Pasteur,
Inc., Redmond, Washingtonより入手可能）において使われる対照試料、即ちＨ
ＩＶ−１陽性対照（PC-1）、ＨＩＶ−２陽性対照（PC-2）および陰性対照（NC）
も含めた。既知の陽性試料と不確定試料の両方を市販のウイルス溶解物試験であ
る Genetic Systems（商標）HIV-1/HIV-2 EIA (Sanofi Diagnostics Pasteur, I
nc., Redmond, Washington）においても試験した。

【００８１】

【表３】

【００８２】

【表４】

【００８３】^* 4 ペプチド＝MNGC (1.23μg/ml); 41-2-3GC (0.64 μg/ml); BRU124F3X (0.25
μg/ml); ROD124C5X (0.125 μg/ml) HIV-1pol(BRU124F3X) のみとHIV-2pol(124C5X)のみ＝各々1.0 μg/ml HIV-1 & HIV-2 WB Pos. ＝全バンドウエスタンブロット陽性試料 HIV-1 & HIV-2 不確定＝ウエスタンブロット不確定試料^** Pos/Neg欄中、P ＝陽性；N ＝陰性；FP＝偽陽性^*** Genetic Systems （商標）HIV-1/2 EIA (FDA承認)

【００８４】第１Ｃ表は、単独のpol ポリペプチドをコーティングしたプレートまたは４つ
のポリペプチド全部をコーティングしたプレートを使った時、既知のＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２陽性試料の全てが陽性結果を示したことを証明する。ＨＩＶ−
１およびＨＩＶ−２不確定試料はいずれも、単独のpol ポリペプチドをコーティ
ングしたプレートまたは４つのポリペプチド全部をコーティングしたプレートを
使った時、陰性結果を示した。ウイルス溶解物を使用するＨＩＶ−１／ＨＩＶ−
２ＥＩＡを使って試験すると、不確定試料は高度に陽性の結果を示した。これ
らの結果は、本発明のpol ポリペプチドを含めたポリペプチドＥＩＡがＨＩＶ陽
性試料を検出するのに高感度であり且つ特異的であることを非常に明確に証明す
る。

【００８５】実施例３ −pol23 とpol7のクローニング pol23 およびpol7組換え体の両者をまずpGEX系 (Pharmacia)中でクローニング
した。次いでクローニングした挿入断片を、遺伝子発現の分析を単純化するため
に「精製ハンドル」を提供する別の発現ベクターに移した。

【００８６】組換え体：pGEX/pol23 ＨＩＶ−１ LAI株ウイルス溶解物より単離したＨＩＶ−１ウイルスＤＮＡを鋳
型として使ってそして次のプライマー対： 5' AGCACCATGGGGATCCCAGGGATTAGATATCAGTACAATG 3'および 5' AGTCAGAATTCATTGGCCTTGCCCCTGCTT 3' を使ってＰＣＲ生成物を作製した。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼの誤りによる突
然変異の可能性を最少にするためにUlTma ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）
を使った。ＰＣＲ生成物を制限酵素 BamHIとEcoRI で消化し、そしてBamHI とEc
oRI で消化したpGEX 5X-1 (Pharmacia) 中に挿入した。連結混合物を用いてＥ．
コリ DH11Sを形質転換せしめ、そしてアンピシリン耐性コロニーを選択した（Ma
niatis, 前掲を参照のこと）。

【００８７】挿入断片含有コロニーをまずコロニー−ＰＣＲにより同定した。この後、増殖
、プラスミド単離¹⁾および制限分析を行って、候補のクローンが推定通りの制限
部位を含むことを証明した（Maniatis, 前掲を参照のこと）。得られたクローン
のプラスミド地図を図１に与える。¹⁾ Ｌブロス＋100 mg/ml アンピシリン中で37℃で一晩増殖させた組換え細菌培養
物から、QIAwell 8 Plus Plasmid Kit (QIAGEN) を使ってプラスミドＤＮＡを調
製した。

【００８８】組換え体：pGEX/pol7.0 上述したのと同様に、ＨＩＶ−１ウイルスＤＮＡ鋳型と次のプライマー対： 5' AGCACCATGGGGATCCCCTACAGTGCAGGGGAAAGAATA 3' および 5' GACTAGTCGACTCAATCATCACCTGCCATCTG 3' を使ってＰＣＲ生成物を作製した。ＰＣＲ反応は、ポリメラーゼの誤りによる突
然変異の可能性を最少にするためにUlTma ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）
を使った。ＰＣＲ生成物を制限酵素 BamHIとSalIで消化し、そしてBamHI とSalI
で消化したpGEX 5X-1 中に挿入した。連結混合物を用いてＥ．コリ DH11Sを形質
転換せしめ、そしてアンピシリン耐性コロニーを選択した。

【００８９】挿入断片含有コロニーをまずコロニー−ＰＣＲにより同定した。この後、増殖
、プラスミド単離および制限分析を行って、候補のクローンが推定通りの制限部
位を含むことを証明した。得られたクローンのプラスミド地図を図２に与える。

【００９０】発現ベクター pQE42およびpThioHisA 中へのpGEX/pol23およびpGEX/pol7.0 のサブクローニング BamHI とSalI酵素での消化により、pGEX/pol23およびpGEX/pol7.0 から挿入断
片ＤＮＡを調製した。市販の発現ベクター pThioHisA (Invitrogen) とpQE42 (Q
IAGEN)を各々 BglII²⁾およびSalI酵素で消化した。別々の連結反応として、各挿
入断片を各ベクターに連結せしめた（Maniatis, 前掲）。再びＥ．コリ宿主株DH
11S 中でアンピシリン耐性形質転換体を選択した。クローンの素性をコロニー−
ＰＣＲと精製プラスミドＤＮＡの制限分析により確認した。得られた組換え体を
pQE/pol23, pQE/pol7.0, pThioHis/pol23 および pThioHis/pol7.0と命名した（
得られたクローンのプラスミド地図をそれぞれ図３〜６に与える）。²⁾ BamHI とBglII 酵素は連結によって接合できる粘着末端を生じることに注目。

【００９１】実施例４ −実施例３クローンのタンパク質発現 tac プロモーターを使う３つのプラスミド発現系 pGEX, pThioHisAおよびpQE4
2 は全て、グルコースにより負に調節され（シャットオフ）そしてラクトース類
似体IPTGにより正に調節される（ターンオン）。

【００９２】 600 nmの光学濃度が２〜６に達するまで、各組換え体pQE/pol23, pQE/pol7.0, pThioHis/pol23 および pThioHis/pol7.0 の25 ml 培養物を完全Ｔブロス＋100
mg/ml アンピシリン, 1.0 ％グルコース中で37℃で（振盪しながら）増殖させた
。次いで細胞をペレットにし、組換え融合タンパク質の発現を誘導するために１
mM IPTG を含む新鮮なグルコース不含有培地中に再懸濁した。更に２時間インキ
ュベーション後、誘導した培養物を2000 rpmで10分間の遠心により収得した。得
られた上清培地を捨て、細胞ペレットを−70℃で凍結させた。

【００９３】凍結したペレットを解凍しそして20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.8と500 mM N
aCl から成る水性媒質 2.0 ml 中に再懸濁した。ドライアイス／エタノール浴中
での凍結と湯浴中での解凍の２サイクルおよび10回の連続した短い音波処理によ
り細胞を溶解させた。得られた溶解物を、ペレットになるまでエッペンドルフ遠
心管中で最高速度で遠心した。溶解物の上清とペレットを次の精製に使った。

【００９４】pQE/pol23, pQE/pol7.0 ：Ni-NTA精製これらの組換え体については、20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.8と８Ｍ尿素を
含む水性緩衝液中に溶解物ペレットを溶かした。この懸濁液を同緩衝液で予め平
衡化しておいた Ni-NTA アガロース(QIAGEN)に結合させた。同緩衝液を使って未
結合材料を洗い落とした。次いで結合したタンパク質を、20 mM リン酸ナトリウ
ム, 6.4 Ｍ尿素および100 mM EDTA を含む水性緩衝液を用いて溶出させた。得ら
れた精製融合タンパク質をSDS-PAGEにより分析した。

【００９５】溶解物上清も下記に示す方法を使って精製した。しかしながら、組換えタンパ
ク質は溶解物ペレット中により高レベルで観察された。

【００９６】pThioHis/pol23, pThioHis/pol7.0 ：Ni-NTA精製これらの組換え体については、溶解物上清を20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.8
と500 mM NaCl を含む水性緩衝液中で予め平衡化しておいた Ni-NTA に結合させ
た。同緩衝液を使って未結合材料を洗い落とし、次に水性洗浄緩衝液（20 mM リ
ン酸ナトリウム, pH 6.0, 500 mM NaCl ）を使って再洗浄した。

【００９７】洗浄緩衝液中の増加する濃度のイミダゾール（50 mM, 200 mM, 350 mM, 500 m
M ）を使って、連続する４段階において結合したタンパク質を溶出させた。SDS-
PAGE分析は、350 mMイミダゾールがこれらの組換え体に最適な溶出条件であるこ
とを示した。

【００９８】SDS-PAGEおよびウエスタンブロット分析標準実験プロトコルを使って、得られた部分精製融合タンパク質の試料をSDS-
PAGEにより分離した。Novex ４〜20％ポリアクリルアミド勾配ゲルを使った。どの場合でも、第２表に示すように、組換え融合タンパク質は推定サイズの近
くに移動することが観察された。

【００９９】

【表５】

【０１００】分離したタンパク質をウエスタンブロット分析用にニトロセルロース支持体へ
と移行させた。電気泳動したタンパク質をニトロセルロース膜へと移行させるの
には半乾式電気泳動移行法（Harlow & Lane, Antibodies, a laboratory manual
, 488-489 頁）を使った。

【０１０１】移行後、膜をBlotto (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5.0 ％脱脂粉乳, 0.
1 ％Tween-20）を使って４℃で一晩かまたは室温で１時間のいずれかでブロック
した。ブロック剤を除去した後、Blotto中に希釈した第一抗体³⁾と共に膜をイン
キュベートした。次いで第一抗体溶液を捨て、Blottoを使ってブロットを５分間
ずつ４回洗浄した。第二抗体−酵素接合体⁴⁾を添加し、室温で30分間インキュベ
ートした。30分後、第二抗体を捨て、そしてブロットを前と同様に４回洗浄した
。この後、水ですすぎ、そして発色基質溶液⁵⁾を添加した。

【０１０２】バンドが出現した後で水洗することにより色の発色を停止させた。pQE/pol23
とpThioHis/pol23の両タンパク質バンドがウエスタンブロット上で一方のマウス
モノクローナル抗体を使った時に反応し、pQE/pol7.0とpThioHis/pol7.0 の両タ
ンパク質バンドは他方のマウス抗体と反応した。ヒトＨＩＶ−１陽性血清を使っ
た場合には４つのバンド全部が検出された。

【０１０３】³⁾ ＨＩＶ polに対する２つのマウスモノクローナル抗体を１：4000希釈倍率で使
用した。ＨＩＶに対して陽性のヒト血清を１：500 希釈倍率で使用した。⁴⁾ 第二抗体接合体は、第一抗体がマウスモノクローナル抗体である場合にはBlot
to中の西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウス抗体（１：2000）であり、
第一抗体がヒト血清である場合にはBlotto中のアルカリホスファターゼ接合ヤギ
抗ヒト抗体（１：2000）であった。⁵⁾ 西洋ワサビペルオキシダーゼ第二抗体接合体と共に使用した基質はテトラメチ
ルベンジジン（ＴＭＢ）(Vector Labs) であり、アルカリホスファターゼ第二抗
体接合体と共に使用した基質は BCIP/NBT 一成分基質（Kirkegaard & Perry Lab
oratories, Inc. ）であった。

【０１０４】実施例５ −酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）試験ＥＩＡプレートを部分精製済組換え融合タンパク質でコーティングした。各試
料は15 mM 炭酸／35 mM 重炭酸コーティング緩衝液 pH 9.6 中の１：500 の希釈
倍率で室温で一晩コーティングした。コーティングしたプレートを「オン／オフ
」ブロックし（2.5 ％脱脂粉乳）、４％ショ糖溶液を使って「オン／オフ」コー
ティングし、そして一晩風乾した。調製したら、プレートをシールパウチ中で乾
燥保存することができる。

【０１０５】各組換え融合タンパク質を16個のＨＩＶ−１陽性試料、８個の正常提供者試料
および４個のＥ．コリ反応性試料について試験した。Ｅ．コリ反応性試料は、Ｅ
．コリ溶解物からのタンパク質に対して高い反応性を有することが以前に証明さ
れている試料である。本発明者らが観察したＨＩＶ−１陽性試料との反応性が、
組換えポリペプチドに特異的であり且つ混入したＥ．コリタンパク質に対して向
けられたものでないことを保証するためにそれらを含めた。

【０１０６】簡単に言えば、試料を試料希釈剤〔１Ｌあたり44.1 gのクエン酸ナトリウム二
水和物, 1.2 mlのTween 20, 50 ng の脱脂粉乳, 0.05 ml のAntiform A, 50 ml
のヤギ血清, 58.6 gの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸, 92.9 gのトリ
エタノールアミン塩酸塩, 1 mlのProclin 300 を含有する〕中に１：101 希釈し
、生じた混合物の200 μl を予め調製しておいたプレートの各ウエルに添加した
。プレートにカバーをし、37±１℃で60分間インキュベートした。各ウエルから
液体を吸引し、プレートを洗浄溶液（0.1 M NaCl／0.05％Tween 20）で最低５回
洗浄した。

【０１０７】 100 mlの接合体溶液（１％正常ヤギ血清を含むクエン酸緩衝液 pH 7.0 中に希
釈したヤギ抗ヒトIg−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体）を各ウエルに添加し
た。次いでプレートにカバーをし、37±１℃で60分間インキュベートした。イン
キュベーション後、各ウエルから液体を吸引し、そしてプレートを洗浄溶液で最
低５回洗浄した。

【０１０８】色原体溶液（クエン酸／リン酸緩衝液 pH 6.0 中、80μg/mlのテトラメチルベ
ンジジン, 0.0015％過酸化水素）100 μl を各ウエルに添加した。次いでプレー
トにカバーをし、遮光下で室温で30分間インキュベートした。カバーを取り、10
0 μl の停止試薬（1N H₂SO₄）を添加した後、プレートの450 nmの吸光度と、比
較参照として615 nm〜630 nmの吸光度を読み取った。450 nm対630 nmの光学濃度
の比を計算した。陽性結果のカットオフ値は、少なくとも３つの既知の陰性試料
から得られた平均吸光度を0.200 上回る吸光単位に設定した。これらの実験の結
果を第３表に与える。

【０１０９】

【表６】

【０１１０】上記結果から、本発明のポリペプチドの１つまたは組合せを使うことにより、
ＨＩＶに対する抗体の存在についての高感度で且つ高精度の試験が提供されるこ
とは明らかである。本発明のポリペプチドをそれ自体でまたはスクリーニングア
ッセイや確認試験と組み合わせて使用でき、一方で完全溶解物または完全抗原を
独立した手順として使用することができる。本発明のポリペプチドは、スクリー
ニングアッセイや確認試験においてＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のエンベロープ
領域またはgag 領域から誘導されたポリペプチドまたはタンパク質と組み合わせ
て使用することもできる。更に、該ポリペプチドの特異性のために、該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列もＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおいて
同様な特異性を示すだろうと期待できる。

【０１１１】本発明を十分記載してきたが、特許請求の範囲および精神より逸脱することな
くそれに多くの変更や改良を行えることは当業者に明白であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpGEX/pol23のプラスミド
地図を示す。

【図２】図２は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpGEX/pol7 のプラスミド
地図を示す。

【図３】図３は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpQE/pol23 のプラスミド
地図を示す。

【図４】図４は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpQE/pol7のプラスミド地
図を示す。

【図５】図５は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpThioHis/pol23のプラス
ミド地図を示す。

【図６】図６は、本発明の組換え構成物の１つ、より詳しくはpThioHis/pol7 のプラス
ミド地図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＨＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ０７Ｋ 16/10 // Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者チョン−ダグスー，ピーターアメリカ合衆国，ワシントン 98040，マーサーアイランド，エイティフォースアベニュサウスイースト 6001 (72)発明者モンジ，ノブオアメリカ合衆国，ワシントン 98115，シアトル，ノースイーストナインティエイスストリート 3545 (72)発明者コール，キャロル−アンアメリカ合衆国，ワシントン 98112，シアトル，エイティーンスアベニュイースト 1116 (72)発明者ゴショーン，アリスカンプアメリカ合衆国，ワシントン 98177，シアトル，セブンティーンスアベニュノースウエスト 20309 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA35 CA03 4B063 QA01 QA14 QA18 QQ03 QQ79 4H045 AA10 AA11 BA10 BA13 BA14 BA15 BA16 BA17 CA05 DA76 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】体液中のＨＩＶに対する抗体の存在を検出する方法であって
、 (a) 免疫特異的結合を可能にする条件下で、体液と下記のアミノ酸配列を含ん
で成る少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質を含有する組成物とを接
触させて反応混合物を形成せしめ、ここで下記ポリペプチド配列のうちの少なく
とも１つの配列の中に含まれる少なくとも６個のアミノ酸を有するオリゴペプチ
ドがそのような配列中にエピトープを含有し【化１】【化２】【化３】【化４】【化５】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないかまたは結合を促進するために付加された
１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨである）；そして (b) 前記ポリペプチドと前記体液中の抗体成分との間に免疫特異的結合が起こ
ったかどうかを検出し、ここで免疫複合体が形成されそして免疫複合体の検出が
前記体液中のＨＩＶに対する抗体の存在を示すことを含んで成る方法。
【請求項２】前記ポリペプチドが担体巨大分子に接合されている、請求項
１に記載の方法。
【請求項３】前記ポリペプチドが固定化されている、請求項１に記載の方
法。
【請求項４】前記免疫特異的結合が免疫沈澱により検出される、請求項１
に記載の方法。
【請求項５】前記組成物が、ＨＩＶ−１のポリメラーゼタンパク質から選
ばれた少なくとも１つのポリペプチドとＨＩＶ−２のポリメラーゼタンパク質か
ら選ばれた少なくとも１つのポリペプチドとを含んで成る、請求項１に記載の方
法。
【請求項６】変更後のポリペプチドが未変更のポリペプチドの免疫反応性
の実質的に全部を保持するように、前記ポリペプチドがアミノ酸残基の置換、付
加または削除により変更されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記免疫反応性が放射性免疫沈澱法、免疫蛍光法およびエン
ザイムリンクドイムノソルベントアッセイ法から成る群より選ばれた方法により
測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記ポリペプチドまたはタンパク質と前記体液中の抗体成分
との免疫特異的結合が、 (i) 前記免疫反応混合物中に形成された免疫複合体から未結合成分を除去し
； (ii) 前記免疫反応混合物に標識抗体を添加し、ここで前記標識抗体が免疫複
合体の一成分に免疫特異的に結合することができそして前記標識が検出可能なシ
グナルを提供し；そして (iii) 前記標識抗体が前記免疫複合体に結合するかどうかを測定することにより検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記標識が酵素基質の添加により検出される酵素を含んで成
る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記標識が放射性標識を含んで成る、請求項８に記載の方
法。
【請求項１１】前記標識が蛍光標識を含んで成る、請求項８に記載の方法
。
【請求項１２】体液中のＨＩＶ−１に対する抗体の存在を検出する方法で
あって、 (a) 免疫特異的結合を可能にする条件下で、体液と下記のアミノ酸配列を含ん
で成る少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質を含有する組成物とを接
触させて反応混合物を形成せしめ、ここで下記ポリペプチド配列の１つの配列中
に含まれる少なくとも６個のアミノ酸を有するオリゴペプチドがそのような配列
中にエピトープを含有し【化６】【化７】【化８】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）；そして (b) 前記ポリペプチドと前記体液中の抗体成分との間に免疫特異的結合が起こ
ったかどうかを検出し、ここで免疫複合体の検出が体液中のＨＩＶ抗体の存在を
示すことを含んで成る方法。
【請求項１３】体液中のＨＩＶ−２に対する抗体の存在を検出する方法で
あって、 (a) 免疫特異的結合を可能にする条件下で、体液と下記のアミノ酸配列を含ん
で成る少なくとも１つのポリペプチドまたはタンパク質を含有する組成物とを接
触させて反応混合物を形成せしめ、ここで下記ポリペプチド配列のうちの少なく
とも１つの配列の中に含まれる少なくとも６個のアミノ酸を有するオリゴペプチ
ドがそのような配列中にエピトープを含有し【化９】【化１０】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるか、または結合を促進する
ために付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ ₂ である）；そして (b) 前記ポリペプチドと前記体液中の抗体成分との間に免疫特異的結合が起こ
ったかどうかを検出し、ここで免疫複合体の検出が体液中のＨＩＶ抗体の存在を
示すことを含んで成る方法。
【請求項１４】ＨＩＶ抗体に対して免疫反応性であるポリペプチド組成物
であって、下記アミノ酸配列：【化１１】【化１２】【化１３】【化１４】【化１５】（上記配列中、Ｗは前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基のＨであるか、また
は前記ポリペプチドのアミノ末端ＮＨ₂ 基に結合した１もしくは複数の追加のア
ミノ酸であり、前記追加のアミノ酸は担体タンパク質または支持体への前記ポリ
ペプチドの結合を促進するために選択され；Ｘは存在しないか、Cys-Gly-Gly ま
たはLys-Lys であり；Ｙは存在しないか、Cys であるかまたは結合を促進するた
めに付加された１もしくは複数のアミノ酸であり；そしてＺはＯＨまたはＮＨ₂ であり；ただしＨＩＶ抗体に対する免疫反応性が維持される限りにおいて上記配
列中にアミノ酸が挿入、削除または置換されてもよい）のうちの少なくとも１つを含んで成るポリペプチド組成物。
【請求項１５】前記ポリペプチドが式（Ｉ）BRU124E を有する、請求項１
４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１６】前記ポリペプチドが式（II）BRU24EX を有する、請求項１
４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１７】前記ポリペプチドが式（III)BRU124F1X を有する、請求項
１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１８】前記ポリペプチドが式（IV）BRU124F3X を有する、請求項
１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１９】前記ポリペプチドが式（Ｖ）ROD124E1を有する、請求項１
４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２０】前記ポリペプチドが式（VI）ROD124EXを有する、請求項１
４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２１】前記ポリペプチドが式（VII) ROD124C2Xを有する、請求項
１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２２】前記ポリペプチドが式（VIII）ROD124C1X を有する、請求
項１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２３】前記ポリペプチドが式（IX）ROD123C3X を有する、請求項
１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２４】前記ポリペプチドが式（Ｘ）POL2A1を有する、請求項１４
に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２５】前記ポリペプチドが式（XI）ROD124C5X を有する、請求項
１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２６】前記ポリペプチドが式（XII) pol23-aa を有する、請求項
１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２７】前記ポリペプチドが式（XIII）pol7-aa を有する、請求項
１４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２８】ＨＩＶ−１と免疫反応性であるポリペプチド組成物であっ
て、下記ポリヌクレオチド配列：【化１６】によりコードされるポリペプチドを含んで成るポリペプチド組成物。
【請求項２９】ＨＩＶ−１と免疫反応性であるポリペプチド組成物であっ
て、下記ポリヌクレオチド配列：【化１７】によりコードされるポリペプチドを含んで成るポリペプチド組成物。
【請求項３０】体液中のＨＩＶに対する抗体の存在を検出するための試験
キットであって、抗原と前記体液中の前記抗原に対する抗体の存在を検出するの
に適当である補助試薬とを含んで成る試験キット。
【請求項３１】前記抗原が請求項２８のポリペプチドである、請求項３０
に記載の試験キット。
【請求項３２】前記抗原が請求項２９のポリペプチドである、請求項３０
に記載の試験キット。
【請求項３３】下記ポリヌクレオチド配列：【化１８】を含んで成り、前記ポリヌクレオチド配列がＨＩＶ−１と免疫反応性であるポリ
ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド組成物。
【請求項３４】下記ポリヌクレオチド配列：【化１９】を含んで成り、前記ポリヌクレオチド配列がＨＩＶ−１と免疫反応性であるポリ
ペプチドをコードする、ポリヌクレオチド組成物。