ES2245100T3 - Reactivo de inmunodiagnostico para la deteccion del virus maedi-visna y la infeccion por caev. - Google Patents
Reactivo de inmunodiagnostico para la deteccion del virus maedi-visna y la infeccion por caev.Info
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Abstract
Un péptido biotinilado que tiene la secuencia de aminoácidos siguiente: B-GGQELDCWHYQHYCVTSTKS (SEQ ID NO 85). La invención describe adicionalmente un péptido TM biotinilado como se describe arriba, más específicamente un péptido TM biotinilado como se representa por cualquiera de SEQ ID NO 13-85, en donde los dos residuos cisteína (C) presentes en la secuencia de aminoácidos están enlazados covalentemente para formar un puente cistina intramolecular. Este péptido ciclado químicamente mimetiza la estructura de bucle que se cree existe en la proteína TM nativa. La formación del enlace cistina puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica de la química de las proteínas. Existen varios compuestos o condiciones oxidantes que inducen específicamente la formación de puentes disulfuro, tales como por ejemplo oxidación al aire, I2, K3Fe(CN)6 . La presente invención proporciona también un péptido TM biotinilado como se ha descrito arriba, en el cual el resto biotina está complejado ya a una molécula de estreptavidina o avidina.
Description
Reactivo de inmunodiagnóstico para la detección
del virus Maedi-Visna y la infección por CAEV.
La presente invención se refiere al campo de la
infección por el virus Maedi-Visna (MVV) en los
mamíferos, más particularmente en las ovejas, y la detección de la
misma. La invención se refiere a péptidos específicos útiles en el
inmunodiagnóstico de la infección MVV, y a métodos y kits que
utilizan dichos péptidos. La invención se refiere también a
péptidos, métodos y kits, para la detección de la infección CAEV en
las cabras.
El virus Maedi-Visna (MVV) (o
lentivirus ovino) es un retrovirus exógeno no oncogénico de la
subfamilia Lentiviridae (Cutlip y Laird, 1976), afín al virus
de la inmunodeficiencia humana (HIV). MVV causa una enfermedad en
las ovejas que se caracteriza por un periodo asintomático
relativamente largo en el cual el virus persiste en presencia de una
respuesta humoral y celular fuerte. Después de un periodo de
incubación variable (2-10 años) el virus causa una
enfermedad crónica, progresiva y degenerativa e inflamatoria fatal
de los pulmones, articulaciones, glándulas mamarias y sistema
nervioso central de las ovejas (Bulgin, 1990). Las ovejas infectadas
son también inmunodeficientes y propensas a infecciones secundarias
(Myer et al. 1988).
La mayoría de las ovejas responden a la infección
MVV por producción de anticuerpos no protectores pero detectables en
suero contra las proteínas víricas, especialmente las proteínas
estructurales de la envoltura y la cápsida del virus. Se han
desarrollado varios ensayos serológicos de diagnóstico para detectar
estos anticuerpos, pero sólo dos métodos, el ensayo de
inmunodifusión en gel de agar (AGIDT) y el ELISA de virus entero
(WV), son prácticos y se utilizan habitualmente (Cutlip et
al. 1977; Houwers et al. 1982; Houwers y Schaake, 1987;
Hoff-Jorgensen, 1990; Simard y Briscoe, 1990). No se
dispone de estimaciones satisfactorias en cuanto a la sensibilidad y
especificidad de los ensayos AGIDT y WV-ELISA debido
en gran parte a la ausencia de un procedimiento de diagnóstico
adecuado de MVV que pueda considerarse como "patrón oro"
(Campbell et al. 1994). Además de la sensibilidad y
especificidad poco definidas, un problema fundamental tanto para el
ensayo AGIDT como para el WV-ELISA es la calidad
relativamente baja (es decir baja pureza y composición heterogénea)
y elevado coste de los antígenos de ensayo víricos empleados.
Antígenos víricos para ensayos convencionales se producen a partir
de los lisados de viriones enteros preparados por propagación lenta,
costosa y tediosa del MVV en sistemas de cultivo de células. El
rendimiento de proteínas específicas víricas es bajo, siendo al
mismo tiempo difícil la purificación y dando frecuentemente como
resultado co-purificación de proteínas celulares del
hospedador no definidas. Por esta razón, pueden producirse
reacciones positivas falsas (inespecíficas) debido a reacciones
cruzadas con proteínas celulares de mamífero, y reacciones negativas
falsas como consecuencia de la ausencia o cantidad insuficiente de
proteínas víricas inmunógenas específicas en la preparación del
antígeno de ensayo. Adicionalmente, los ensayos AGIDT y
WV-ELISA no son adecuados para ensayo automatizado
reproducible en gran escala, lo que impide una producción económica
y eficiente de grandes números de muestras, un requisito previo para
el control eficiente de los rebaños.
El virus de la
artritis-encefalitis caprina (CAEV) está relacionado
estrechamente desde los puntos de vista tanto genético como
antigénico con el MVV. La infección por CAEV en las cabras está muy
extendida, y puede causar pérdidas económicas importantes. Los
síntomas clínicos principales son artritis, mastitis crónica
subclínica, y neumonía intersticial. La encefalitis es una
característica rara de la infección por CAEV en las cabras jóvenes.
Análogamente a la infección MVV en las ovejas, el diagnóstico en
laboratorio de la infección CAEV está basado en la demostración de
anticuerpos antivíricos en ensayos de inmunodifusión en gel de agar
o ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA). Los antígenos
MVV se utilizan frecuentemente para el diagnóstico de la infección
por MVV en las ovejas y para el diagnóstico de la infección por CAEV
en las cabras (Coackley y Smith, 1984; Houwers y Schaake, 1987;
Zwahlen et al. 1983).
En fecha reciente, se han utilizado ampliamente
proteínas víricas recombinantes para detección de anticuerpos
antivíricos, especialmente en lentivirología humana y veterinaria.
Las técnicas de DNA recombinante pueden producir eficientemente
grandes cantidades de proteínas víricas muy purificadas. Entre los
antígenos recombinantes utilizados para detección del anticuerpo
anti-MVV se encuentran los derivados de proteínas
centrales (gag) (más particularmente p25), la glicoproteína
transmembranal (TM) y la glicoproteína de la envoltura externa
(Kwang y Cutlip, 1992 a,b; Kwang et al. 1995; Power et al.
1995; Keen et al. 1995, documento FR 2 586 427).
Recientemente (1997), Boshoff et al. consignaron el uso de
una proteína de fusión GST-TM-p25
para detección de anticuerpos contra MVV. Los resultados
presentados, si bien son alentadores, deben considerarse como
preliminares teniendo en cuenta el número limitado de ovejas
ensayadas. Además, los autores mencionan la posible reactividad de
la parte GST (no escindida) en la proteína de fusión con los sueros
de oveja, que causa posiblemente problemas de especificidad.
Kwang y Torres (1994) describen un inmunoensayo
basado en oligopéptidos para la detección de anticuerpos contra MVV
en las ovejas. De acuerdo con modelos de previsión por ordenador,
dichos autores identificaron tres sitios antigénicos en el segmento
N-terminal de la proteína TM de MVV (gp46), sobre la
base de lo cual se sintetizaron tres péptidos. Los péptidos
sintéticos exhibían una especificidad muy alta (con ausencia de
reacciones positivas falsas) cuando se ensayaron con una colección
de sueros de oveja seropositivos y seronegativos conocidos. Sin
embargo, la sensibilidad de la reacción era menor que la proteína TM
recombinante correspondiente, aun cuando se utilizó una combinación
de los tres péptidos. Los autores llegan a la conclusión de que las
proteínas recombinantes son los reactivos preferidos para el
desarrollo de inmunodiagnósticos de MVV.
De lo que antecede, se deduce que existe una
necesidad continuada de métodos de inmunodiagnóstico mejores para la
detección de MVV en las ovejas, que presenten características
mejores de especificidad, sensibilidad y reproducibilidad. Además,
existe necesidad de ensayos que sean más fáciles de realizar, y
factibles de automatización.
Es una finalidad de la presente invención
proporcionar péptidos adecuados para el inmunodiagnóstico de la
infección MVV, y la infección CAEV estrechamente afín.
Es también una finalidad de la presente invención
proporcionar una combinación de proteínas y péptidos recombinantes
para uso en el inmunodiagnóstico de la infección MVV, así como la
infección CAEV estrechamente afín.
La presente invención está orientada también a
nuevos métodos y kits para el inmunodiagnóstico de la infección MVV,
y la infección CAEV estrechamente afín.
Todas estas finalidades han sido satisfechas por
las realizaciones que se exponen a continuación.
La presente invención describe particularmente un
péptido que tiene la secuencia de aminoácidos siguiente (código de
aminoácidos de una sola letra):
La secuencia de aminoácidos representada por SEQ
ID NO 1 forma parte de la glicoproteína de la envoltura
transmembranal de MVV (gp46), que de aquí en adelante se denominará
antígeno TM. El péptido está localizado a partir del residuo del
aminoácido 85 al 102 en la secuencia completa de la proteína gp46
como se representa en la figura 1, y abarca la estructura conservada
del bucle Cys-Cys como se describe en lentivirus
afines. La secuencia de la proteína gp46 de MVV como se muestra en
la figura 1 se deriva de la secuencia publicada de la cepa MVV E1
(Sargan et al. 1991). Debe entenderse que la secuencia TM
puede variar ligeramente dependiendo de la cepa de virus de la que
se aísle. Pueden presentarse frecuentemente sustituciones
especialmente conservadoras de aminoácidos, como se ilustra a
continuación en la Tabla 1.
| Aminoácido | Situación conservadora por | |
| Ser (S) | Thr, Gly, Asn | |
| Arg (R) | His, Lys, Glu, Gln | |
| Leu (L) | Ile, Met, Phe, Val, Tyr | |
| Pro (P) | Ala, Thr, Gly | |
| Thr (T) | Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln | |
| Ala (A) | Pro, Gly, Thr | |
| Val (V) | Met, Ile, Tyr, Phe, Leu | |
| Gly (G) | Ala, Thr, Pro, Ser | |
| Ile (I) | Met, Leu, Phe, Val, Tyr | |
| Phe (F) | Met, Tyr, Ile, Leu, Trp, Val | |
| Tyr (Y) | Phe, Trp, Met, Ile, Val, Leu | |
| Cys (C) | Ser, Thr, Met | |
| His (H) | Gln, Arg, Lys, Glu, Thr | |
| Gln (Q) | Glu, His, Lys, Asn, Thr, Arg | |
| Asn (N) | Asp, Ser, Gln | |
| Lys (K) | Arg, Glu, Gln, His | |
| Asp (D) | Asn, Glu, Gln | |
| Glu (E) | Gln, Asp, Lys, Asn, His, Arg | |
| Met (M) | Ile, Leu, Phe, Val |
La Tabla 2 siguiente muestra algunas variaciones
en la secuencia de aminoácidos del péptido, que se ha demostrado
tiene lugar entre aislados naturales diferentes de cepas de MVV y
CAEV.
| Secuencia peptídica | SEQ ID NO | Cepa* |
| QELDCWHYQHYCVTSTKS | 1 | MVV "EV1" |
| QELDCWHYQHYCVTSTRS | 2 | MVV "1514" |
| QELDCWHYQHYCVTSTRS | 3 | MVV "KV1772" |
| HELDCWHYQHYCVTSTKS | 4 | MVV "KM1071" |
| HELDCWHYQHYCVTSTRS | 5 | MVV "icelandic 1514" |
| HELDCWHYQHYCVTSTRS | 6 | MVV "1514" (LV1-1KS2) |
| HELDCWHYQHYCVTSTRT | 7 | MVV "SA-OMVV" |
| QELDCWHYHQYCITSTKT | 8 | CAEV "Clemens" |
| QELDCWHYHQYCITSTKT | 9 | CAEV "Cork" |
| QELDCWHYHQYCVTSTRA | 10 | CAEV "63" |
| QELDCWHYHQYCITSTRT | 11 | CAEV "TO-87" |
| * origen de las secuencias (base de datos y número de acceso): | |
| MVV cepa EV1: | PIR JQ 1165 |
| MVV cepa 1514: | Swiss-Prot P03379 |
| MVV cepa KV1772: | Swiss-Prot P35954 |
| MVV cepa KM1071: | Genbank U51910 |
| MVV cepa "Icelandic 1514": | Genbank M60609 |
| MVV cepa 1514/clon LV1-1KS2: | Swiss-Prot P23423 |
| MVV cepa SA-OMVV: | Swiss-Prot P16899 |
| CAEV cepa "Clements": | Genbank M33677 |
| CAEV cepa Cork: | Swiss-Prot P31626 |
| CAEV cepa 63: | PIR VCLJC6 |
| CAEV cepa TO-87: | Genbank S80269 |
A partir de la alineación anterior es evidente
que especialmente las posiciones 1, 9, 10, 13, 17 y 18 del péptido
son propensas a sustituciones conservadoras. Una fórmula más general
para el péptido se representa por tanto a continuación:
X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}X_{18}
\hskip2cm(SEQ ID NO 12)
en
donde
- X_{1} representa Q o una sustitución
conservadora de Q, preferiblemente H,
- X_{9} representa Q o una sustitución
conservadora de Q, preferiblemente H,
- X_{10} representa H o una sustitución
conservadora de H, preferiblemente Q,
- X_{13} representa V o una sustitución
conservadora de V, preferiblemente I,
- X_{17} representa K o una sustitución
conservadora de K, preferiblemente R,
- X_{18} representa S o una sustitución
conservadora de S, preferiblemente T o A.
Debe indicarse que en la mayoría de los casos de
las secuencias de MVV, X_{9} es Q y X_{10} es H, mientras que en
la mayoría de las secuencias CAEV, ocurre lo contrario (X_{9} es H
y X_{10} es Q).
Varios estudios en lentivirus afines a MVV, tales
como HIV (Virus de la Inmunodeficiencia Humana), SIV (Virus de la
Inmunodeficiencia de los Simios) y CAEV han demostrado que la región
del bucle conservado Cys-Cys en la proteína TM
constituye una región inmunodominante (revisado por Pancino et
al. 1994). En particular, se ha descrito un péptido CAEV con una
secuencia homóloga a la secuencia representada por SEQ ID NO 1 como
reactivo con sueros de cabra infectada por CAEV (Bertoni et
al. 1994, documentos WO 96/00784, FR 2721618).
Como se indicará ulteriormente en la sección de
ejemplos, la presente invención demuestra que, de modo totalmente
inesperado, el péptido representado por SEQ ID NO 1 no es
inmunorreactivo cuando se fija como tal en la fase sólida de un
inmunoensayo. Únicamente cuando el péptido está biotinilado, y la
fijación a la fase sólida ocurre por la interacción del resto
biotina con estreptavidina o avidina, se encuentra que el péptido es
inmunorreactivo con sueros de ovejas infectadas con MVV.
La invención describe por tanto más
particularmente un péptido biotinilado representado por la fórmula
siguiente:
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
\hskip2cm(SEQ ID NO 13)
en
donde
- X_{1} representa Q o una sustitución
conservadora de Q, preferiblemente H,
- X_{9} representa Q o una sustitución
conservadora de Q, preferiblemente H,
- X_{10} representa H o una sustitución
conservadora de H, preferiblemente Q,
- X_{13} representa V o una sustitución
conservadora de V, preferiblemente I,
- X_{17} representa K o una sustitución
conservadora de K, preferiblemente R,
- X_{18} representa S o una sustitución
conservadora de S, preferiblemente T o A.
- B representa un resto biotinilo,
- L representa un enlace amida o una secuencia
enlazadora de aminoácidos que contiene de 1 a 5 residuos de
amino-ácido, y en la cual está presente
[B_{1}-L_{1}] o
[L_{2}-B_{2}], o ambos.
Las secuencias enlazadoras dan como resultado una
presentación más espacial del epítope peptídico en la fase sólida, y
por consiguiente un reconocimiento más eficiente del péptido por los
anticuerpos. Aminoácidos utilizados frecuentemente para la
construcción de secuencias enlazadoras son, entre otros, glicina,
alanina, beta-alanina, lisina,
epsilon-lisina, ácido aminocaprónico, ornitina, y
ácido aminobutírico. Debe entenderse que el resto biotinilo está
unido por su grupo carboxilo a un grupo amino de los aminoácidos de
la secuencia enlazadora o del péptido. Este grupo amino puede
encontrarse en posición alfa, o localizado en la cadena lateral del
aminoácido respectivo (v.g. epsilon-lisina). La
secuencia enlazadora ilustrada en la sección de ejemplos de la
presente invención está constituida por varios residuos glicina,
preferiblemente dos glicinas. Sin embargo, debe entenderse que
pueden ser igualmente eficientes otras secuencias enlazadoras
utilizadas corrientemente en la técnica de la química de los
péptidos.
La secuencia central que determina la
inmunorreactividad de los péptidos arriba descritos está abarcada
por los dos residuos cisteína. Los péptidos truncados siguientes
pueden considerarse como equivalentes de los péptidos:
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 14)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 15)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 16)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 17)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 18)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 19)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 20)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 21)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 22)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 23)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 24)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 25)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 26)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 27)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 28)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 29)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 30)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 31)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}TS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 32)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}T-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 33)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}T-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 34)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}T-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 35)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}T-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 36)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}T-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 37)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 38)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 39)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 40)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 41)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYX_{9}X_{10}YCX_{13}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 42)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYX_{9}X_{10}YC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 43)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYX_{9}X_{10}YC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 44)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYX_{9}X_{10}YC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 45)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYX_{9}X_{10}YC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 46)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYX_{9}X_{10}YC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 47)
en
donde
- X_{1} representa Q o una sustitución
conservadora de Q, preferiblemente H,
- X_{9} representa Q o una sustitución
conservadora de Q, preferiblemente H,
- X_{10} representa H o una sustitución
conservadora de H, preferiblemente Q,
- X_{13} representa V o una sustitución
conservadora de V, preferiblemente I,
- X_{17} representa K o una sustitución
conservadora de K, preferiblemente R,
- X_{18} representa S o una sustitución
conservadora de S, preferiblemente T o A.
- B representa un resto biotinilo,
- L representa un enlace amida o una secuencia
enlazadora de aminoácidos que contiene de 1 a 5 residuos de
amino-ácido, y en la cual está presente
[B_{1}-L_{1}] o
[L_{2}-B_{2}], o ambos.
Más adelante, en la sección de ejemplos se
muestra que los péptidos MVV de la presente invención pueden
utilizarse perfectamente para la detección de la infección CAEV en
las cabras, además de su utilidad demostrada como reactivos para la
detección de la infección MVV en las ovejas.
Los términos péptidos "derivados de MVV" y
derivados de "CAEV" implican que las secuencias de los péptidos
respectivos forman parte de una secuencia de proteína aislada de una
cepa de MVV, o respectivamente de CAEV. Como se ha expuesto
anteriormente, los péptidos derivados de MVV y derivados de CAEV
pueden presentar una reactividad cruzada extensa, cuando se trata de
la detección de la infección MVV en las ovejas, o respectivamente la
infección CAEV en las cabras.
Péptidos derivados de MVV específicos se
representan por la familia de secuencias siguiente:
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYQHYCVTSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 48)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYQHYCVTSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 49)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYQHYCVTSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 50)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYQHYCVTSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 51)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYQHYCVTSTX_{17}X_{18}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 52)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYQHYCVTSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 53)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYQHYCVTSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 54)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYQHYCVTSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 55)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYQHYCVTSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 56)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYQHYCVTSTX_{17}-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 57)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYQHYCVTST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 58)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYQHYCVTST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 59)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYQHYCVTST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 60)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYQHYCVTST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 61)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYQHYCVTST-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 62)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYQHYCVTS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 63)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYQHYCVTS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 64)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYQHYCVTS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 65)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYQHYCVTS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 66)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYQHYCVTS-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 67)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYQHYCVT-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 68)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYQHYCVT-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 69)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYQHYCVT-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 70)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYQHYCVT-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 71)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYQHYCVT-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 72)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYQHYCV-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 73)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYQHYCV-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 74)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYQHYCV-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 75)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYQHYCV-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 76)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYQHYCV-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 77)
[B_{1}-L_{1}]-X_{1}ELDCWHYQHYC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 78)
[B_{1}-L_{1}]-ELDCWHYQHYC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 79)
[B_{1}-L_{1}]-LDCWHYQHYC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 80)
[B_{1}-L_{1}]-DCWHYQHYC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 81)
[B_{1}-L_{1}]-CWHYQHYC-[L_{2}-B_{2}]
(SEQ ID NO 82)
en
donde
- X_{1} representa Q o una sustitución
conservadora de Q, preferiblemente H,
- X_{17} representa K o una sustitución
conservadora de K, preferiblemente R,
- X_{18} representa S o una sustitución
conservadora de S, preferiblemente T o A,
- B representa un resto biotinilo,
- L representa un enlace amida o una secuencia
enlazadora de aminoácidos que contiene de 1 a 5 residuos de
amino-ácido, y en la cual están presentes
[B_{1}-L_{1}] o
[L_{2}-B_{2}], o ambos.
El grupo de péptidos biotinilados de la invención
proceden todos ellos de la misma región inmunodominante en la
proteína TM (denominados en lo sucesivo "péptidos TM").
La invención describe, así pues, péptidos TM
biotinilados útiles en la detección de la infección MVV y CAEV, y
representados por la fórmula siguiente:
[B_{1}-L_{1}] -
(a) - CWHYX_{9}X_{10}YC - (b) -
[L_{2}-B_{2}]
\hskip2cm(SEQ ID NO 83)
en donde B representa un resto
biotinilo y L representa un enlace amida o una secuencia enlazadora
de aminoácidos que contiene de 1 a 5 residuos de amino-ácido,
estando presentes [B_{1}-L_{1}] o
[L_{2}-B_{2}] o ambos, y en donde (a) representa
desde nada al número máximo de aminoácidos contiguos localizados
desde la posición 1 a la posición 4 en la secuencia representada por
SEQ ID NO 12, y en donde (b) representa de nada hasta el número
máximo de aminoácidos contiguos localizados desde la posición 13 a
la posición 18 en la secuencia representada por SEQ ID NO
12.
El grupo de péptidos TM biotinilados derivados de
MVV útiles para la detección de la infección MVV y CAEV se
representa por la fórmula siguiente:
[B_{1}-L_{1}] -
(a) - CWHYQHYC - (b) - [L_{2}-B_{2}]
\hskip2cm(SEQ ID NO 84)
en donde B presenta un resto
biotinilo y L representa en enlace amida o una secuencia enlazadora
de aminoácidos que contiene de 1 a 5 residuos de aminoácido, estando
presentes [B_{1}-L_{1}] o
[L_{2}-B_{2}] o ambos al mismo tiempo, y en
donde (a) representa desde nada al número máximo de aminoácidos
contiguos localizados desde la posición 1 a la posición 4 en la
secuencia representada por SEQ ID NO 12, y en donde (b) representa
desde nada al número máximo de aminoácidos contiguos localizados
desde la posición 13 a la posición 18 en la secuencia representada
por SEQ ID NO
12.
El péptido TM de acuerdo con la invención se
representa por la secuencia siguiente:
B-GGQELDCWHYQHYCVTSTKS
\hskip2cm(SEQ ID NO 85)
Como se mostrará en la sección de ejemplos, el
péptido arriba descrito (SEQ ID NO 85) exhibe una inmunorreactividad
extremadamente satisfactoria con sueros de ovejas infectadas por
MVV, cuando se presenta sobre un soporte sólido por interacción con
estreptavidina o avidina. De hecho, la sensibilidad de detección de
los inmunoensayos basados en este péptido exclusivamente como agente
de detección es al menos 90%, en muchos casos 95%, aproximándose
incluso a veces a 100%.
El término "sensibilidad", tal como se
utiliza a lo largo de la presente invención, significa el porcentaje
de sueros de individuos infectados por MVV que exhiben una
inmunorreactividad positiva (= superior al nivel de ruido de fondo)
con el o los péptidos de la invención.
El término "especificidad", tal como se
utiliza a lo largo de la presente invención, significa (el número
total de sueros sanos (= procedentes de individuos no infectados con
MVV) menos el número de sueros sanos que exhiben una
inmunorreactividad positiva falsa con el o los péptidos de la
invención, dividido por el número total de sueros sanos) x 100%.
Los péptidos TM truncados biotinilados,
pertenecientes a la familia arriba descrita de secuencias de SEQ ID
NO 14 a 82 exhiben una inmunorreactividad similar con sueros de
ovejas infectadas con MVV a la del péptido TM preferido representado
por SEQ ID NO 85. La especificidad de los inmunoensayos basados en
dichos péptidos es aproximadamente la misma, y la sensibilidad puede
ser la misma o algo menor (desde 50% a 100%) en comparación con la
reactividad de los mismos sueros con el péptido representado por SEQ
ID NO 85.
La síntesis de oligopéptidos puede llevarse a
cabo de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica de la
química de los péptidos tal como se describe por ejemplo en
Bodanszky (1993). Como se describirá más adelante en la sección de
ejemplos, los péptidos de la presente invención han sido
sintetizados por síntesis de péptidos en fase sólida utilizando
química de Fmoc (Fmoc = 9-fluorometiloxicarbonilo).
Existen en la actualidad varios aparatos disponibles que permiten
una síntesis de péptidos rápida y totalmente automatizada, tales
como por ejemplo el sintetizador de péptidos Symphony/Multiplex, de
Rainin Instruments Co. Inc.
El proceso de biotinilación puede llevarse a cabo
de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica de la química de
los péptidos (véase, v.g., el documento WO 93/18054). La fijación
del resto biotinilo puede hacerse durante o después de la síntesis
de los péptidos. El resto biotinilo puede unirse en posición
N-terminal, C-terminal, o
internamente.
La invención describe adicionalmente un péptido
TM biotinilado como se describe arriba, más específicamente un
péptido TM biotinilado como se representa por cualquiera de SEQ ID
NO 13-85, en donde los dos residuos cisteína (C)
presentes en la secuencia de aminoácidos están enlazados
covalentemente para formar un puente cistina intramolecular. Este
péptido ciclado químicamente mimetiza la estructura de bucle que se
cree existe en la proteína TM nativa.
La formación del enlace cistina puede llevarse a
cabo de acuerdo con métodos conocidos en la técnica de la química de
las proteínas. Existen varios compuestos o condiciones oxidantes que
inducen específicamente la formación de puentes disulfuro, tales
como por ejemplo oxidación al aire, I_{2},
K_{3}Fe(CN)_{6} (McCurdy, 1989; Pohl et al.
1993).
La presente invención proporciona también un
péptido TM biotinilado como se ha descrito arriba, en el cual el
resto biotina está complejado ya a una molécula de estreptavidina o
avidina.
La presente invención proporciona adicionalmente
un péptido TM biotinilado como se ha descrito arriba, complejado con
una molécula de estreptavidina o avidina, en el cual el complejo
está ya inmovilizado sobre un soporte sólido.
La invención proporciona también una composición
peptídica que comprende un péptido biotinilado como se ha descrito
arriba, en combinación con cualquier otro péptido MVV o proteína
recombinante.
Una composición peptídica preferida de acuerdo
con la presente invención comprende un péptido TM biotinilado como
se ha descrito arriba y un polipéptido recombinante MVV gag
(p25), o un fragmento del mismo.
El uso de la proteína recombinante MVV gag
en el serodiagnóstico de la infección MVV en las ovejas y la
infección CAEV en las cabras ha sido ya descrito anteriormente
(véase, v.g. Zanoni et al. 1991). Sin embargo, la
sensibilidad y especificidad obtenidas con este antígeno
recombinante no eran satisfactorias. Además, la proteína
recombinante MVV gag como ha sido descrita por Zanoni et
al. (1991) contenía una parte GST
(Glutatión-S-transferasa) a la cual
pueden fijarse los sueros de oveja inespecíficamente.
La presente invención proporciona una composición
peptídica que comprende un péptido TM biotinilado como se ha
descrito arriba y una proteína recombinante MVV p25 como se
representa en la figura 2 (SEQ ID NO 88).
La secuencia de aminoácidos de la proteína
recombinante p25 como se muestra en la figura 2 contiene, además de
la secuencia de la proteína p25 propiamente dicha, un "marcador
His" constituido por 6 residuos histidina, que permite la
purificación de la proteína recombinante por IMAC (Cromatografía de
Afinidad de Ion Metálico Inmovilizado), y un sitio enteroquinasa que
permite la escisión del marcador His después de la purificación.
Debe entenderse que la proteína recombinante p25
como se representa en la figura 2 sirve únicamente como ejemplo, y
no excluye otras proteínas recombinantes p25 de MVV que tengan una
inmunorreactividad similar. La secuencia del gen codificante de la
proteína p25 de MVV ha sido descrita ampliamente en la técnica
anterior (v.g. para la cepa MVV E1 por Sargan et al. 1991).
Utilizando técnicas conocidas para clonación y expresión
recombinante, v.g. en un hospedador bacteriano tal como E.
coli, es prácticamente directo obtener la proteína p25 producida
recombinantemente, o un fragmento de la misma.
Como se muestra adicionalmente en la sección de
ejemplos, la combinación de un péptido TM biotinilado como se ha
descrito arriba con la proteína recombinante MVV p25 conduce a un
reactivo de inmunodiagnóstico que detecta las ovejas infectadas con
MVV con sensibilidad y especificidad que se aproximan ambas a 100%.
La misma composición peptídica puede utilizarse para el
serodiagnóstico de la infección CAEV en las cabras.
La secuencia de aminoácidos de los péptidos de la
invención puede insertarse también en o añadirse a una segunda
secuencia de aminoácidos, dando como resultado una proteína de
fusión. La segunda secuencia de aminoácidos puede originarse o bien
de una proteína sin relación alguna (= heteróloga), que funcionaría
meramente como una proteína "vehículo" del péptido de la
invención, o puede ser originaria de MVV. En el último caso, la
segunda secuencia de aminoácidos puede contener regiones inmunógenas
adicionales adecuadas para detección de la infección por MVV
(epítopes), conduciendo a una sensibilidad incrementada de la
proteína de fusión en comparación con el péptido solo. La segunda
secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión corresponde
preferiblemente a la secuencia MVV gag o una parte de la
misma. La presentación del epítope del péptido MVV TM por una
proteína de fusión, puede ser similar a la presentación del péptido
TM por interacción biotina/estreptavidina. Adicionalmente, la
secuencia heteróloga en la proteína de fusión puede producir
cualquier efecto secundario deseado en la proteína de fusión
resultante, v.g. puede optimizar la expresión, la purificación, la
inmovilización en una superficie, etc.
La construcción y expresión de proteínas de
fusión puede realizarse de acuerdo con métodos bien conocidos en la
técnica de la tecnología del DNA recombinante (tales como las
ilustradas por Maniatis et al. (1982)). Los fragmentos de DNA
que codifican las diferentes partes de la proteína de fusión están
enlazados entre sí, de tal modo que el marco de lectura no se
desplaza. La molécula de DNA híbrido se enlaza luego operativamente
a una casete de expresión que permite la expresión de la proteína de
fusión en una célula hospedadora. Células hospedadoras posibles para
la expresión de proteínas recombinantes MVV son bacterias (tales
como E. coli) o células eucariotas (levaduras o líneas de
células de mamífero).
El término "enlazado operativamente" hace
referencia a una yuxtaposición en la cual los componentes están
configurados de tal modo que realizan su función usual. Así, las
secuencias de control enlazadas operativamente a una secuencia
codificante son capaces de efectuar la expresión del gen
codificante.
El término "casete de expresión", abarca una
casete de elementos que permiten la transcripción y traducción
correctas de las secuencias codificadas por la maquinaria de la
célula hospedadora: es decir, una secuencia promotora, un sitio de
fijación de ribosoma, y posiblemente también secuencias reguladoras,
o señales de secreción.
Los péptidos o proteínas recombinantes TM de MVV
arriba descritos pueden inmovilizarse a un soporte sólido, por
enlace covalente o no covalente. Una vía de inmovilización preferida
para los péptidos TM biotinilados de la presente invención es el
recubrimiento por la vía de su resto biotina sobre una superficie
recubierta de estreptavidina o avidina. La complejación del péptido
biotinilado a estreptavidina (o avidina) puede ocurrir también antes
de la fijación, es decir en solución, seguido por el recubrimiento
del complejo sobre la fase sólida, como se describe más adelante en
la sección de ejemplos.
La invención proporciona también por tanto un
soporte sólido sobre el cual se ha inmovilizado el péptido TM
biotinilado o la composición peptídica arriba mencionada.
El soporte sólido sobre el cual se recubren los
péptidos o proteínas recombinantes de la invención puede
seleccionarse de los soportes utilizados comúnmente en la técnica
del inmunodiagnóstico. Dependiendo el tipo de ensayo, el soporte
sólido puede ser un vehículo de poliestireno (placa de
microtitulación (v.g. ELISA) o perlas (v.g. ensayo de microperlas)),
una membrana de nailon (LIA), perlas de látex (ensayos de
coagulación), etc.
De acuerdo con otra realización, la invención
proporciona un método para inmunodetección de la infección por MVV o
CAEV en mamíferos, comprendiendo dicho métodos los pasos de:
- poner en contacto una muestra biológica de
dicho mamífero con un péptido TM biotinilado o una composición
peptídica como se ha descrito arriba, en condiciones que permiten la
formación de un complejo inmunológico,
y
y
- detectar la presencia de un complejo
inmunológico formado entre el péptido TM biotinilado o la
composición peptídica y los anticuerpos anti-MVV o
anti-CAEV que pueden estar presentes en la
muestra.
Debe entenderse que la presencia de anticuerpos
anti-MVV o anti-CAEV en una muestra
biológica indica la existencia de una infección por MVV (o
respectivamente infección por CAEV) en un mamífero del que se tomó
la muestra.
El término "mamífero" puede hacer referencia
a un individuo humano, o cualquier animal mamífero. Preferiblemente,
el término mamífero se refiere a una oveja, el hospedador natural de
MVV, o cabra, el hospedador natural de CAEV. Aunque no se ha
demostrado todavía que MVV esté presente en humanos, no se excluye
que esto pueda suceder, como ha sido demostrado recientemente para
el Virus de la Artritis-Encefalitis Caprina (CAEV)
(véase el documento WO 97/33615).
El término "muestra biológica" hace
referencia a una muestra de sangre, suero, plasma, leche, orina,
fluido cerebroespinal o cualquier otro fluido corporal que pueda
contener anticuerpos contra MVV. Preferiblemente, la muestra
biológica es una muestra de suero.
De acuerdo con otra realización, la invención
proporciona un método para inmunodetección de la infección por MVV o
CAEV en mamíferos, comprendiendo dicho método los pasos de:
- poner en contacto una muestra biológica de
dicho mamífero con un péptido TM o una composición peptídica
biotinilado(a) o una proteína de fusión como se ha descrito
arriba, en condiciones que permiten la formación de un complejo
inmunológico, y
- detectar la presencia de un complejo
inmunológico formado entre el péptido TM o composición peptídica
biotinilado(a) o la proteína de fusión y los anticuerpos
anti-MVV o anti-CAEV que pueden
estar presentes en la mues-
tra.
tra.
La formación y detección de un complejo
inmunológico anticuerpo-antígeno, que indica la
presencia de anticuerpos anti-MVV o
anti-CAEV en la muestra, puede hacerse de acuerdo
con métodos bien conocidos en la técnica.
El diseño de inmunoensayos adecuados para
detección de anticuerpos en una muestra está sujeto a una gran
cantidad de variación, y se conocen en la técnica muchos formatos.
La mayoría de los ensayos implican el uso de anticuerpo y/o péptido
marcado. Los marcadores pueden ser, por ejemplo, enzimáticos (como
peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina), fluorescentes,
quimioluminiscentes, radiactivos o moléculas de colorantes. En un
ensayo de inmunosorbente unido a enzima (ELISA), el marcador es
enzimático, y la señal de detección es usualmente colorimétrica
(densidad óptica).
Tipos diferentes de ELISA pueden ser viables para
detección de anticuerpos en una muestra. En un ELISA indirecto, los
péptidos de la invención se recubren sobre una superficie sólida
(placas de microtitulación) en la cual aquéllos capturan los
anticuerpos posiblemente presentes en la muestra. Los anticuerpos
fijados a partir de la muestra son detectados subsiguientemente por
un segundo anticuerpo marcado (conjugado). La señal generada por el
último se cuantifica. En un ELISA de antígeno sándwich, los péptidos
de la invención se utilizan dos veces, primeramente como un agente
de captura (fijado en la superficie de, v.g., una placa de
microtitulación) y en segundo lugar como un agente de detección
(péptido marcado que reacciona con los anticuerpos fijados de la
muestra). Los anticuerpos procedentes de la muestra se encuentran
"emparedados" entre dos capas de péptido (esto se hace posible
por los dos sitios de fijación de antígeno que están presentes en
cada anticuerpo).
De acuerdo con una realización preferida, la
invención proporciona un método o ensayo de inmunodetección como se
ha descrito arriba, en el cual dicho método o ensayo es un
ELISA.
Adicionalmente, la invención proporciona un kit
de inmunodiagnóstico para la detección de la infección por MVV o
infección por CAEV en mamíferos, comprendiendo dicho kit un péptido
TM o composición peptídica biotinilado(a) como se ha descrito
arriba.
Adicionalmente, la invención proporciona un kit
de inmunodiagnóstico para la detección de la infección por MVV o
infección por CAEV en mamíferos, comprendiendo dicho kit un péptido
TM o composición peptídica biotinilado(a) o proteína de
fusión como se ha descrito arriba.
En una realización preferida, el kit de
inmunodiagnóstico comprende un soporte sólido sobre el cual se ha
inmovilizado fácilmente un péptido TM biotinilado de la invención,
preferiblemente por interacción biotina/estreptavidina.
Alternativamente, un kit de inmunodiagnóstico
preferido de la invención comprende como reactivo un péptido TM
biotinilado de la invención en el formato de un complejo
biotina/estreptavidina.
Los kits de inmunodiagnóstico de la invención
comprenden, además de los péptidos TM biotinilados, los tampones y
reactivos necesarios para realización del ensayo.
En una realización preferida, el kit de
inmunodiagnóstico de la invención comprende un péptido TM
biotinilado como se ha descrito arriba, en combinación con una
proteína p25 recombinante. Alternativamente, el kit de
inmunodiagnóstico de la presente invención comprende una proteína de
fusión como se ha descrito arriba.
Figura
1
Secuencia de aminoácidos que representa la
proteína TM del material aislado MVV EV1 (como ha sido descrito por
Sargan et al. 1991). La secuencia en negrita corresponde al
péptido TM1 de la invención.
Figura
2
Secuencia de aminoácidos de la proteína p25
recombinante descrita en la presente invención (SEQ ID NO 88).
Subrayado y en negrita: marcador His
Subrayado: Sitio de enteroquinasa (EK)
\newpage
Figura
3
Mapa físico del constructo de expresión
pIGRHISAMVVp25. Se indican los sitios de restricción relevantes.
Figura
4
Experimento de inducción para la producción de la
proteína HisMVVp25. Se tomaron muestras a intervalos de tiempo
diferentes (pistas 1, 2, y 3 respectivamente no inducidas y 1,5 h y
3 h después de la inducción) y se analizaron por
SDS-PAGE. Detección de proteínas por tinción con
Coomassie. Se muestra también la distribución entre fracción
insoluble (pista 4), cuerpos de inclusión (pista 5) y fracción
soluble (pista 6). La flecha indica la proteína de fusión MVV.
Figura
5
Parte A
Análisis de la proteína purificada procedente de
la fracción soluble (pistas 3 y 4) y de la fracción de cuerpos de
inclusión (pistas 1 y 2). Detección por tinción con Coomassie.
Parte B
Análisis por Transferencia Western utilizando un
suero de oveja infectada por MVV (izquierda) o un suero
anti-coli (derecha). Pistas 1 y 3, fracción soluble;
pistas 2 y 4, cuerpos de infusión.
Figura
6
ELISA indirecto utilizando péptido TM1
biotinilado de MVV (SEQ ID NO 85) como reactivo de detección. Los
valores de DO corresponden a los indicados en la Tabla 4. Las barras
negras representan valores DO con péptido TM1 recubierto sobre la
placa de microtitulación (recubierta directamente o por la vía de
estreptavidina). Las barras blancas representan valores de control
sin recubrimiento con el péptido TM1. La línea horizontal representa
el nivel de corte (c.o.).
Parte 6A
Recubrimiento directo del péptido TM1
biotinilado
Parte 6B
Recubrimiento del péptido TM1 complejado con
biotina/estreptavidina
Los sueros utilizados se clasifican de acuerdo
con su reactividad en AGIDT:
- gp135+:
- claramente positivo en AGIDT con el anticuerpo de referencia anti-gp135
- gp135+/-:
- débilmente positivo en AGIDT con el anticuerpo de referencia anti-gp135
- p25+:
- claramente positivo en AGIDT con el anticuerpo de referencia anti-p25
- dudoso:
- reactividad indeterminada en AGIDT
sueros negativos (marcados con *):
proceden de rebaños de Islandia que están certificados como exentos
de
MVV.
Figura
7
ELISA comparativo con los péptidos TM1, TM2 y TM3
(o respectivamente SEQ ID NO 85, 86, 87). Los péptidos biotinilados
se complejan con estreptavidina y se recubren subsiguientemente
sobre las placas de microtitulación. Se utilizan los mismos sueros y
las mismas condiciones de reacción que en la figura 6. El eje
vertical muestra los valores S/N (los valores >1 se consideran
positivos).
Figura
8
ELISA con utilización de p25 recombinante (SEQ ID
NO 88) como reactivo de detección. Se utilizan los mismos sueros y
condiciones de reacción que en la figura 6. Los valores S/N
superiores a 1 se consideran positivos.
\newpage
Figura
9
"Combi ELISA" que utiliza una combinación de
péptido TM1 biotinilado (SEQ ID NO 85) recubierto por interacción
con estreptavidina y proteína p25 recombinante (SEQ ID NO 88) como
reactivo de detección. Los mismos sueros y las mismas condiciones de
reacción que en la figura 6. El suero N1-17 no se
ensayó en esta serie.
La proteína p25 de MVV es codificada por el gen
precursor gag (antígenos asociados en grupo). Éste produce
una proteína no glicosilada de 55 kD que es escindida y procesada
enzimáticamente en p25 (la proteína central), p16 (proteína matriz)
y p14 (la nucleoproteína). Se ha encontrado que la proteína central
es la más inmunógena de todas las proteínas víricas gag. La
misma es también la proteína gag más conservada entre todos
los materiales aislados de MVV secuenciados actualmente.
El gen vírico que codifica la proteína p25 ha
sido clonado por PCR a partir de DNA provírico no integrado que se
extrajo de fibroblastos de ovejas infectadas, cultivados in
vitro, por el método Hirt modificado.
Se utilizó el conjunto iniciador siguiente para
amplificación del gen p25:
(a)
5'-TCCCGGGATCCATAGAAGGTAGAATTGTAAATCTGCAAGCAGG-3'
(sentido) (SEQ ID NO 89)
(b)
5'-ACACCCGGGATCCCTTCTGATCCTACATCTC-3'
(antisentido) (SEQ ID NO 90)
El fragmento PCR obtenido se clonó en el vector
pTZ (Pharmacia) y se secuenció. Se transfirió luego como un
fragmento Bam HI a pBluescript SK (Stratagene) y se
clonó subsiguientemente como un fragmento SmaI/XbaI en el vector de
expresión pIGRHISA.
El vector de expresión pIGRHISA utilizado en la
presente invención se representa en la figura 3. La transcripción
del gen heterólogo es controlada por el promotor dirigido hacia la
izquierda del bacteriófago lambda. Este promotor está controlado por
un represor sensible a la temperatura (Ci^{ts}) y proporcionado
por un plásmido compatible presente en la misma célula. Este sistema
está fuertemente controlado y permite que las células crezcan en
condiciones reprimidas (28ºC) en las cuales no se produce cantidad
alguna (o cantidades muy limitadas) de la proteína heteróloga. Por
inducción a temperatura más alta (37ºC o 42ºC) se produce la
proteína de interés durante un periodo de tiempo limitado que puede
optimizarse dependiendo de los requerimientos específicos para la
producción de cada proteína. Este sistema permite la producción de
proteínas que son tóxicas para el organismo hospedador y cuya
expresión constitutiva podría ser letal para el hospedador.
En el vector pIGRHISA, el codón de iniciación
está seguido por un codón para alanina seguido inmediatamente por 6
codones histidina y un sitio de escisión reconocido por
enteroquinasa. En este caso, la proteína producida lleva en su
extremo N-terminal la secuencia
M-A-H-H-H-H-H-H-V-D-D-D-K.
El sitio de escisión por enteroquinasa permite la separación de la
secuencia hexahistidina de la proteína purificada, en caso de que
esto resulte necesario.
El gen que codifica la proteína p25, obtenido por
PCR, se clonó en el vector pIGRHISA como un material digerido
SmaI/XbaI. El vector se abrió con NsiI, se hizo
romo con polimerasa Klenow y se cortó con XbaI. La fusión
SmaI/NsiI creada de este modo restablece el marco de
lectura entre la región His6 del vector y el gen MVV. Este plásmido
se designó pIGRHISAp25 (figura 3). La secuencia de la proteína p25
recombinante obtenida a partir de este constructo se representa en
la figura 2 (SEQ ID NO 88). Esta proteína recombinante se designará
proteína HisMVVp25.
Los experimentos de expresión se realizan en
cepas E. coli que llevan un plásmido compatible que codifica
un mutante sensible a la temperatura del gen represor CI. Para
inducir la expresión de los genes clonados bajo control del promotor
lambda, se inicia un cultivo por inoculación a partir de un cultivo
nocturno saturado a dilución 1/100. El cultivo se deja crecer luego
a 28ºC hasta un valor DO de aproximadamente 0,2 (a 600 nm) y la
temperatura se cambia a 42ºC. El cultivo se incuba ulteriormente
durante varias horas, dependiendo el periodo de inducción exacto de
la proteína individual. Para producción en gran escala de proteínas
recombinantes, se ha utilizado un fermentador de 15 litros. Las
condiciones de inducción eran esencialmente las mismas que se han
descrito arriba. Durante la fermentación, el pH, la presión de
oxígeno y la temperatura se monitorizaron y ajustaron. Se registra
también la curva de crecimiento. Al final de la fermentación, las
células se concentran por microfiltración y centrifugación, y el
sedimento de células se guarda a -70ºC hasta su procesamiento
ulterior.
Para evaluar el nivel de expresión de las
proteínas recombinantes, se realizaron inducciones en pequeña escala
y las células se cosecharon en momentos diferentes después de la
inducción. Las células se lisaron por ebullición en
SDS/mercaptoetanol, y el lisado se analizó por SDS/PAGE y se tiñó
con azul Coomassie. El nivel de expresión se analizó en tres cepas
diferentes de E. coli (SG4044, MC1061 y UT5600). El nivel de
expresión más alto se obtuvo en SG4044, y se utilizó esta cepa para
fermentación en gran escala. El análisis de una operación de
fermentación en función del tiempo se muestra en la figura 4.
Además, la figura 4 muestra también la distribución de la proteína
entre fracción soluble e insoluble (con inclusión de la fracción de
membrana y los cuerpos de inclusión) después de lisis de las células
en prensa francesa. La proteína recombinante p25 de MVV está
presente tanto en la fracción soluble como en la insoluble. Ambas
fracciones han sido purificadas y utilizadas en serología.
El sedimento de células obtenido después de la
fermentación se resuspendió en tampón de lisis (Tris 10 mM de pH
6,08, que contenía KCl 150 mM y EDTA 5 mM) (5 ml por gramo de
células húmedas) y se lisó pasándolo dos veces a través de la prensa
francesa. Antes de la lisis, la suspensión se complementó con PMSF
(1 mM) y ácido epsilon-aminocaproico (25 mM) para
inhibir las proteasas. La suspensión se clarificó por centrifugación
y, dado que la proteína p25 de MVV está presente en los cuerpos de
inclusión y en la fracción soluble, se utilizaron para procesamiento
ulterior tanto el sobrenadante clarificado como el sedimento.
La fracción de sedimento obtenida después de la
lisis en la prensa francesa se solubilizó en tampón que contenía
cloruro de guanidinio 6M (fosfato 50 mM, Triton
X-100 al 0,05%, pH 7,2). La solución clarificada
obtenida después de centrifugación a 30.000 g se aplicó luego a la
columna Ni-IDA preactivada (Pharmacia) equilibrada
con el mismo tampón que contenía cloruro de guanidinio 6M e imidazol
20 mM. En una columna IDA de 12 ml, se cargaron aproximadamente 4
litros equivalentes de caldo de fermentación. La columna se lavó
luego con el tampón de guanidinio que contenía
Triton-X-100 al 0,05% hasta que la
absorción a 280 nm alcanzó el nivel basal. La columna se lavó con el
tampón de carga que contenía imidazol 35 mM seguido por imidazol 50
mM. La proteína fijada se eluyó luego con imidazol 200 mM. Las
fracciones se analizaron por SDS-PAGE y
transferencia Western para evaluar la pureza y el rendimiento de la
purificación.
Para la purificación de la fracción soluble, el
sobrenadante obtenido después de clarificación del lisado de la
prensa francesa se complementó con cloruro de guanidinio sólido
hasta concentración final 6M. El procesamiento ulterior fue como se
ha descrito arriba.
Las fracciones de proteína eluidas de la columna
IMAC en imidazol 200 mM se agruparon y analizaron en SDS/PAGE
seguido por inmunotransferencia (figura 5). La pureza de la
preparación se evaluó sondando la transferencia con suero generado
para la proteína total de E. coli. A partir de este análisis
se estimó que la pureza de ambas preparaciones de proteína era mayor
que 95%. Esto se confirmó también por tinción con plata. El
rendimiento total de proteína purificada era aproximadamente 10 mg
de proteína HisMVVp25 por litro de caldo de fermentación.
La cantidad de proteína recombinante purificada
se estimó por el método micro BCA (Pierce) utilizando
sero-albúmina bovina como patrón.
Las fracciones que contenían la proteína
HisMVVp25 recombinante se agruparon y, antes de utilizarlas para
análisis serológico se dializaron las mismas contra un tampón que
contenía urea 6M (fosfato 50 mM de pH 7,2, NaCl 150 mM) para
eliminar el cloruro de guanidinio y el imidazol, que se ha
demostrado dan un ruido de fondo alto con sueros de oveja
(resultados no presentados).
Los péptidos se sintetizaron sobre resina
Tentagel S (Rapp Polymere GmbH, Alemania) utilizando un sintetizador
Rainin Symphony/Multiplex con química estándar Fmoc y activación
in situ con HOBt/TBTU (TBTU: tetrafluoroborato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio;
HOBt: N-hidroxibenzotriazol). Se realizaron
acoplamientos dobles estándar utilizando un exceso cuádruple de
aminoácidos en presencia de cantidades equimolares de HOBt y TBTU
durante 2 x 20 minutos. El grupo protector Fmoc se eliminó por
tratamiento moderado con base utilizando 2% piperidina/2% DBU
(1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno)
en DMF (dimetilformamida).
La biotinilación se realizó disolviendo biotina
en 30% dimetilsulfóxido/70% dimetilformamida con activación in situ.
Una vez completado el complejo péptido-resina, el
péptido se escinde de la resina por incubación durante 2,5 h con 90%
ácido trifluoroacético/5% tioanisol/3% etanoditiol/2% anisol. El
péptido se precipita de la mezcla de escisión utilizando
t-butilmetiléter. Después de la centrifugación, el
sedimento se lava tres veces con t-butilmetiléter y
se seca durante una noche a vacío. La pureza del péptido bruto se
comprueba en RP-HPLC.
Se sintetizaron los péptidos TM siguientes:
TM1: B-GGQELDCWHYQHYCVTSTKS (SEQ
ID NO 85)
TM2: B-GGRYRDNCTWQQWEEEIE (SEQ ID
NO 86)
TM3: B-GGQRDAQRIPDVWTALQG (SEQ ID
NO 87)
La oxidación (ciclación) del péptido TM1 se llevó
a cabo de acuerdo con el procedimiento siguiente: se disolvieron
48,4 mg de TM1 en 242 ml de ACN al 20% (acetonitrilo/0,1% TFA
(sonicación). Se tomaron muestras de 20 \mul como material de
partida de referencia en escala analítica. Se añadió
K_{3}[Fe(CN)_{6}] a una concentración final
de 0,24 mM. El pH se aumentó hasta pH 11 con NaOH 3M y la solución
se agitó durante 150 min a la temperatura ambiente y se protegió de
la luz. Finalmente, el pH se rebajó nuevamente a pH 1,5 utilizando
TFA. Se guardó a -20ºC.
Después de la oxidación del péptido TM1, el
péptido cíclico oxidado (TM1c) se separó de la fracción no oxidada
restante por cromatografía HPLC. Resumidamente, la muestra se cargó
en la columna HPLC (columna Nucleosil 10 \mu (C18) distribuida por
Alltech) en TFA al 0,1%. La elución se realizó con un incremento
gradual de ACN, utilizando una solución de ACN al 80% en TFA al
0,1%. El péptido TM1c se eluía a 28-30% ACN,
mientras que el péptido lineal TM1 se eluía como un pico separado a
31-32% ACN.
Los péptidos y proteínas MVV de la invención se
han ensayado contra una colección de sueros de ovejas infectadas con
MVV y no infectadas, a fin de evaluar su utilidad como reactivos de
inmunodiagnóstico. Las ovejas eran principalmente de la raza para
carne Rasa. Todos los animales tenían una edad de 6 meses o
mayor.
Los sueros procedentes de los animales infectados
se caracterizaron por el AGIDT clásico (Ensayo de
Inmuno-Difusión en Gel de Agar), utilizando un kit
comercial (Maeditec-1000, Central Veterinary
Laboratory, Reino Unido). En este kit, partículas víricas completas
de MVV sirven como antígeno y se proporciona un suero de referencia
contra gp135 y p25 como control de anticuerpos. La interpretación de
los resultados se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Los sueros se clasificaron como positivos para gp135
(gp135+), débilmente positivos para gp135 (gp135+/-), positivos para
p25, dudosos (indeterminados) y negativos. Se utilizaron sueros
procedentes de ovejas de Islandia exentas de MVV como controles
seronegativos certificados. Todos los sueros se guardaron a
-20ºC.
El antígeno p25 recombinante y los péptidos TM se
evaluaron en ELISA en cuanto a su sensibilidad y especificidad para
detectar sueros de ovejas infectadas con MVV.
Las condiciones de recubrimiento (pH del tampón
de recubrimiento, concentración óptima de antígeno ...) se
determinaron y optimizaron a fin de obtener la relación más
favorable de señal a ruido (S/N). Los antígenos se diluyen a partir
de una solución stock en el tampón de recubrimiento para obtener la
concentración de antígeno deseada. La tasa de dilución es al menos
1/100 para minimizar la posible interferencia por la urea
("ureum") presente en la solución stock de proteína. Los
péptidos biotinilados se recubrieron directamente (es decir, sin
complejación con estreptavidina), o después de formación de complejo
con estreptavidina. Debe entenderse que se puede considerar que el
recubrimiento directo de los péptidos biotinilados tiene un efecto
equivalente al recubrimiento de péptidos no biotinilados. La
formación de complejo con estreptavidina puede ocurrir en solución
(es decir, antes del recubrimiento) o sobre placas que se han
recubierto ("sensibilizado") previamente con estreptavidina (3
\mug/ml en tampón de carbonato). En los ejemplos que siguen, la
complejación de los péptidos TM con estreptavidina ocurre antes del
recubrimiento (= recubrimiento de complejo).
Las condiciones de recubrimiento utilizadas (a no
ser que se indique de otro modo) se muestran a continuación en la
Tabla 3:
| Antígeno | Condiciones de recubrimiento (todas a 100 \mul/pocillo durante 1 h a 37ºC) |
| p25 | 5 \mug/ml en tampón de carbonato de pH 9,6 |
| Péptidos TM | 1 \mug/ml de péptido TM en tampón de carbonato de pH 9,6 |
| Recubrimiento directo | |
| Péptidos TM | 1 \mug/ml complejo * [estrept/TM] en tampón de carbonato de pH 9,6 |
| Recubrimiento de complejo | |
| Complejo combi | 1 \mug/ml de p25 y 3 \mug/ml de complejo *[estrept/TM] en tampón de carbonato de |
| pH 9,6 |
| *: | complejo: | 9 \mul de estreptavidina (5 mg/ml) |
| 12 \mul de péptido TM (1 mg/ml) | ||
| 129 \mul de tampón de carbonato | ||
| se incuba la mezcla durante 1 h a 37ºC | ||
Después del recubrimiento, las placas se
saturaron con una solución de caseína (caseína al 0,1% en PBS) más
glicina 0,25M ("tampón de bloqueo"). Los pocillos se incubaron
con 250 \mul de tampón de bloqueo durante 1 h a 37ºC, después de
lo cual se lavaron tres veces con una solución de
PBS-Tween 20 ("tampón de lavado"). Las muestras
se suero, diluidas en relación 1/500 en "diluyente de muestra"
(tampón de bloqueo + 2,86 g/l de Triton X-705), se
incubaron a 100 \mul/pocillo durante 1 h a 37ºC. Después de lavado
concienzudo (5 x) con tampón de lavado, se realizó la detección de
los anticuerpos de oveja fijados con una inmunoglobulina
anti-oveja de conejo conjugada con peroxidasa
(Prosan), diluida a 1/10.000 en tampón de bloqueo, que se dejó en
los pocillos durante 1 h a 37ºC. Después de otra tanda de lavado
concienzuda (5 x), se añadieron a los pocillos 100 \mul de
cromógeno TMB (tetrametilbencidina) (dilución 1/100 en tampón
sustrato (Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O 0,06M; ácido cítrico 0,04M;
H_{2}O_{2} al 0,006%). Después de 15-30 min, se
paró el desarrollo del color por adición de 100 \mul de
H_{2}SO_{4} 1N, y se cuantificó por medida de los valores de la
densidad óptica (DO) a 450 nm - 595 nm. Los resultados del ensayo
ELISA pueden expresarse como valores DO, o como relación S/N
(señal/ruido), determinándose N en cada experimento separado con una
serie de 15 sueros de Islandia negativos certificados (N = 2x (valor
medio de los valores DO negativos + 3 SD)). Los resultados ELISA se
consideran positivos cuando la relación S/N es mayor que 1.
El péptido TM1 biotinilado (SEQ ID NO 85) se
recubrió bien directamente sobre las placas de microtitulación, o
después de formación de complejo con estreptavidina, como se ha
descrito arriba. Como se ilustra en la figura 6 y la Tabla 4, los
valores DO aumentaban drásticamente después de presentación del
péptido por la interacción biotina-estreptavidina.
Dado que el recubrimiento directo del péptido TM1 biotinilado puede
considerarse equivalente al recubrimiento directo del péptido TM1 no
biotinilado, puede decirse que la biotinilación del péptido TM1 y la
presentación subsiguiente del péptido sobre una fase sólida por
interacción con estreptavidina son indispensables a fin de obtener
una reactividad satisfactoria del péptido con los sueros de oveja.
Dicho de modo más directo, si el péptido representado por SEQ ID NO
1 se recubre como tal en la superficie de una fase sólida de
inmunoensayo, el mismo es completamente inútil (véase figura 6a).
Después de biotinilación del péptido (tal como en SEQ ID NO 85) y
presentación subsiguiente del péptido por interacción
biotina-estreptavidina, el mismo se vuelve altamente
reactivo con sueros de ovejas infectadas con MVV (véase figura 6b).
Aunque se sabe que la presentación del péptido por un complejo
estreptavidina/biotina puede tener un efecto positivo sobre la
serorreactividad y/o la eficiencia de fijación de algunos péptidos,
la diferencia en reactividad observada entre la figura 6a y la
figura 6b puede considerarse como sumamente sorprendente. Como se
muestra en la Tabla 4, el aumento observado en reactividad se
aproximaba en muchos casos o incluso excedía de un factor de
100.
| Recubrimiento directo | Recubrimiento con estreptavidina | |||||
| Suero | TM1 | Suero | TM1 | -TM1 | Factor de aumento | |
| N-1/4 | 0,0105 | N-1/4 | 0,843 | 0,042 | 76 | |
| N-1/8 | 0,0065 | N-1/8 | 0,026 | 0,022 | ||
| N-1/9 | 0,007 | N-1/9 | 0,402 | 0,028 | 53 | |
| N-1/10 | 0,053 | N-1/10 | 0,187 | 0,01 | 3 | |
| N-1/14 | 0,005 | N-1/14 | 0,352 | 0,017 | 67 | |
| N-1/19 | 0,0055 | N-1/19 | 0,516 | 94 | ||
| N-1/20 | 0,023 | N-1/20 | 0,172 | 0,037 | 6 | |
| N-1/24 | 0,018 | N-1/24 | 1,789 | 99 | ||
| N-3/2 | 0,016 | N-3/2 | 0,743 | 0,06 | 43 | |
| N-3/3 | 0,008 | N-3/3 | 0,836 | 0,012 | 103 | |
| N-3/4 | 0,01 | N-3/4 | 1,206 | 0,022 | 118 | |
| N-3/10 | 0,0325 | N-3/10 | 1,24 | 0,033 | 37 | |
| N-3/14 | 0,009 | N-3/14 | 0,205 | 0,012 | 21 | |
| N-3/15 | 0,0175 | N-3/15 | 1,612 | 0,031 | 90 | |
| N-3/19 | 0,0105 | N-3/19 | 0,654 | 0,024 | 60 | |
| N-3/23 | 0,0095 | N-3/23 | 1,297 | 0,02 | 134 | |
| N-3/25 | 0,0055 | N-3/25 | 0,314 | 0,013 | 55 | |
| N-26/9 | 0,006 | N-26/9 | 1,525 | 0,018 | 251 | |
| N-26/19 | 0,007 | N-26/19 | 0,315 | 0,016 | 43 | |
| N-1/3 | 0,013 | N-1/3 | 1,061 | 0,014 | 81 | |
| N-1/13 | 0,004 | N-1/13 | 0,366 | 0,042 | 81 | |
| N-3/8 | 0,018 | N-3/8 | 0,134 | 0,069 | 4 | |
| N-3/9 | 0,007 | N-3/9 | 1,042 | 0,027 | 145 | |
| N-3/21 | 0,013 | N-3/21 | 0,1 | 0,043 | 4 | |
| N-24/15 | 0,0075 | N-24/15 | 1,071 | 0,015 | 141 | |
| N-26/1 | 0,01 | N-26/1 | 0,153 | 0,016 | 14 | |
| N-27/16 | 0,0455 | N-27/16 | 0,068 | 0,075 | ||
| N-3/1 | 0,007 | N-3/1 | 0,036 | 0,024 | 2 |
TABLA 4
(continuación)
| Recubrimiento directo | Recubrimiento con estreptavidina | |||||
| Suero | TM1 | Suero | TM1 | -TM1 | Factor de aumento | |
| N-3/6 | 0,011 | N-3/6 | 0,857 | 0,055 | 73 | |
| N-3/18 | 0,006 | N-3/18 | 1,21 | 0,014 | 199 | |
| N-1/2 | 0,008 | N-1/2 | 1,292 | 0,044 | 156 | |
| N-1/15 | 0,02 | N-1/15 | 0,28 | 0,059 | 11 | |
| N-1/17 | 0,0065 | N-1/17 | 0,021 | 0,02 | ||
| N-24/1 | 0,005 | N-24/1 | 0,326 | 0,015 | 62 | |
| N-24/2 | 0,0055 | N-24/2 | 0,091 | 0,021 | 13 | |
| N-24/8 | 0,033 | N-24/8 | 0,591 | 0,111 | 15 | |
| N-24/19 | 0,0105 | N-24/19 | 0,12 | 0,026 | 9 | |
| N-26/17 | 0,007 | N-26/17 | 0,521 | 0,042 | 68 | |
| *3148 | 0,006 | *3148 | 0,027 | 0,013 | ||
| *3215 | 0,0045 | *3215 | 0,025 | 0,017 | ||
| *3265 | 0,0045 | *3265 | 0,018 | 0,019 | ||
| *3396 | 0,006 | *3396 | 0,016 | 0,017 | ||
| *3398 | 0,004 | *3398 | 0,028 | 0,021 | ||
| *3408 | 0,0045 | *3408 | 0,02 | 0,019 | ||
| *3508 | 0,017 | *3508 | 0,053 | 0,052 | ||
| *3518 | 0,004 | *3518 | 0,021 | 0,019 | ||
| *3600 | 0,004 | *3600 | 0,02 | 0,019 | ||
| *3628 | 0,004 | *3628 | 0,025 | 0,024 | ||
| c.o. | 0,018 | c.o. | 0,057 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los tres péptidos TM biotinilados TM1, TM2 y TM3
(SEQ ID NO 85, 86 y 87 respectivamente) se complejaron a
estreptavidina, y se recubrieron subsiguientemente sobre placas de
microtitulación para ensayos serológicos. Se utilizaron la misma
serie de sueros que se presentan en la figura 6. La figura 7 muestra
la reactividad claramente superior del péptido TM1 en comparación
con TM2 y TM3, que eran sólo marginalmente reactivos con sueros MVV
positivos en AGIDT. En el grupo total de sueros ensayados en la
figura 7, la sensibilidad global obtenida con TM1 como reactivo de
detección es 84%, mientras que un ELISA basado en TM2 o TM3 alcanza
solamente un nivel de sensibilidad de 19% y 42% respectivamente.
Se utilizó la misma serie de sueros para evaluar
la actividad serológica del antígeno p25 recombinante, en las
condiciones que se han descrito arriba. Los resultados se muestran
en la figura 8. Algunos sueros, que se pasaron por alto con el
péptido TM1, se detectan ahora con el antígeno p25 (tales como los
sueros No. N-1/8 y N-3/21). Por otra
parte, la sensibilidad global del antígeno p25 es menor (58%) que la
sensibilidad obtenida con el péptido TM1 solo (84%). Además, los
valores S/N obtenidos con el antígeno p25 eran usualmente menores
que los valores obtenidos utilizando el péptido TM1 como
antígeno.
En conclusión, la alta sensibilidad obtenida con
el péptido TM1, superior a la sensibilidad obtenida con el p25
recombinante puede considerarse como absolutamente excepcional, y
demuestra el carácter realmente inmunodominante del epítope
representado por TM1. Un número limitado de sueros parece no ser
reactivo con el péptido, pero reacciona con el p25 recombinante. Por
esta razón, se diseñó un ELISA combinado que utilizaba ambos
antígenos juntos en la fase sólida.
Una combinación del antígeno p25 con el péptido
TM1 biotinilado, complejado a estreptavidina, se ensayó de nuevo con
la misma serie de sueros que anteriormente. Las condiciones de
recubrimiento precisaron optimización en primer lugar. Cuando ambos
antígenos, p25 y el complejo [estrept/TM1] se aplicaron en las
concentraciones utilizadas para el recubrimiento separado, la señal
obtenida con varios sueros era considerablemente menor que cuando
los antígenos se utilizaron por separado. Este fue particularmente
el caso para sueros que daban señales altas con el péptido TM1 solo,
pero negativos con p25. Esta observación indicaba que el p25
recombinante estaba produciendo un efecto adverso sobre la reacción
de TM1. Por esta razón, se ensayaron relaciones diferentes de p25 y
péptido TM1 para recubrimiento y los resultados demostraron que la
disminución de la concentración de recubrimiento del p25 desde 5
\mug/ml a 1 \mug/ml mejoraba los resultados considerablemente
cuando ambos antígenos se recubrían juntos. Por esta razón, las
condiciones adoptadas finalmente para el recubrimiento combinado son
p25 a 1 \mug/ml y complejo [estrept/TM1] a 3 \mug/ml como se
muestra en la Tabla 3. La Tabla 5 muestra que, utilizando esta
combinación de antígenos, se obtenía una sensibilidad
excepcionalmente alta (>98%).
Varias muestras adicionales de suero de orígenes
diferentes (Escocia, España, Italia) han sido ensayadas en el
Combi-ELISA. La evaluación global se resume a
continuación en la Tabla 5.
| AGIDT+ | AGIDT- | AGIDT+/- | |
| ELISA+ | 620 | 46 | 90 |
| ELISA- | 10 | 1564 | 6 |
| Sensibilidad 98,4% | Especificidad 97,1% |
\vskip1.000000\baselineskip
La concordancia global entre AGIDT y ELISA es
satisfactoria en lo que concierne a la sensibilidad (98,4%). Esto
era de esperar, dado que se sabe que ELISA es más sensible que
AGIDT. Por el contrario, esta mayor sensibilidad tiene como
consecuencia que más muestras indeterminadas en AGIDT o negativas en
AGIDT se encuentran positivas en ELISA. La insensibilidad relativa
del ensayo AGIDT hace que el mismo sea inadecuado como patrón oro,
por lo cual el registro más bajo de especificidad (96,9%) del ELISA
frente a AGIDT tiene considerarse con precaución. Las muestras que
conducían a resultados discrepantes se analizaron ulteriormente
utilizando métodos serológicos alternativos (tales como LIA, o
transferencia Western utilizando lisado vírico como antígeno).
Teniendo en cuenta los resultados de la serología alternativa, las
cifras de la Tabla 5 se adaptan como se muestra en la Tabla 6
(eliminando las muestras indeterminadas). Esta Tabla ilustra que la
incorporación de los resultados de ensayos serológicos alternativos
tiene un efecto considerable sobre el registro de especificidad del
ensayo.
| Realmente + | Realmente - | |
| ELISA + | 655 | 11 |
| ELISA - | 4 | 1570 |
| Sensibilidad 99,4% | Especificidad 99,3% |
Se observó durante la evaluación serológica del
péptido TM1 que la reactividad de TM1 recién disuelto era subóptima,
y la reactividad aumentaba después del almacenamiento de la solución
(véase Tabla 7). Este fenómeno podía indicar que durante el
almacenamiento tenía lugar formación de puentes disulfuro.
Los sueros 6 a 118 proceden de Escocia (sueros
AGIDT+). Los otros sueros (N) proceden de Zaragoza (España).
| Suero No. | O-TM1 | N-TM1 |
| 6 | 12,44 | 7,24 |
| 11 | 12,11 | 6,5 |
| 25 | 8,48 | 5,41 |
| 45 | 3,98 | 2,18 |
| 65 | 7,24 | 3,51 |
| 71 | 11,84 | 6,33 |
| 75 | 11,92 | 6,33 |
| 78 | 20,26 | 15,44 |
| 101 | 12,37 | 6,64 |
| 103 | 11,61 | 7,33 |
| 115 | 5,74 | 3,79 |
| 118 | 13,42 | 8,09 |
| N-1/4 | 13,82 | 7,95 |
| N-1/5 | 19,48 | 11,9 |
| N-1/7 | 14,26 | 10,74 |
| N-1/8 | 2,03 | 1,5 |
La oxidación química del péptido TM1 para formar
puentes disulfuro intramoleculares se realizó como se ha descrito
arriba. Este tratamiento produjo un péptido (TM1c) de reactividad y
estabilidad iniciales satisfactorias en solución. Por esta razón se
utilizó como reactivo preferido para el desarrollo de ensayos
serológicos sobre TM1.
Como un sistema alternativo, los antígenos se
aplicaron también sobre tiras LIA (Inmuno-Ensayo en
Línea). En este sistema, los antígenos o complejos peptídicos
purificados se aplicaron en líneas paralelas sobre membranas de
nailon que se cortaron luego perpendicularmente a las líneas de
antígeno a fin de obtener pequeñas tiras (de 3-5 mm
de anchura). Los péptidos se aplicaron como complejos con
estreptavidina. Estas tiras se incubaron con suero diluido y se
revelaron ulteriormente de modo similar a una transferencia Western.
La reactividad del antígeno o péptido con el suero se revela como
una línea coloreada en las posiciones respectivas.
Los resultados obtenidos indicaron que LIA puede
ser útil para ensayo ulterior de sueros problemáticos (dudosos). De
hecho, en algunos casos, muestras negativas ELISA que son positivas
en AGIDT eran reactivas con la proteína p25 en LIA. Esto indica que
el ensayo LIA puede ser útil para propósitos de confirmación en
casos ambiguos.
Se ensayaron un número limitado de sueros de
cabra (212) utilizando el combi-ELISA en condiciones
idénticas a las descritas para los sueros de oveja. El anticuerpo de
detección (inmunoglobulina anti-oveja de conejo de
conjugada con peroxidasa (Prosan)) exhibe una reactividad cruzada
suficiente con anticuerpos de cabra, a fin de ser utilizado como
agente de detección en el combi-ELISA para la
detección de CAEV en cabras. La Tabla 8 siguiente muestra los
resultados obtenidos. Está claro que el Combi-ELISA,
como se ha descrito arriba basado en el péptido MVV TM1 (SEQ ID NO
85) y la proteína recombinante MVV p25, es perfectamente adecuado
también para la detección de anticuerpos anti-CAEV
en las cabras, además de su utilidad demostrada para detección de la
infección MVV en las ovejas.
| AGIDT+ | AGIDT- | |
| ELISA+ | 142 | 14 |
| ELISA- | 0 | 56 |
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Claims (10)
1. Un péptido biotinilado que tiene la secuencia
de aminoácidos siguiente:
B-GGQELDCWHYQHYCVTSTKS (SEQ ID NO
85)
2. Un péptido biotinilado de acuerdo con la
reivindicación 1, en el cual los dos residuos cisteína (C) presentes
en la secuencia de aminoácidos están enlazados covalentemente para
formar un puente cisteína intramolecular.
3. Un péptido biotinilado de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el cual el resto
biotinilado está complejado a una molécula de estreptavidina o
avidina.
4. Una composición peptídica que comprende un
péptido biotinilado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en combinación con cualquier otro péptido
MVV o proteína recombinante.
5. Una composición peptídica de acuerdo con la
reivindicación 4 que comprende un péptido biotinilado de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en combinación con un
polipéptido recombinante MVV gag (p25), o un fragmento del
mismo, más específicamente, en combinación con la proteína
recombinante MVV p25 como se representa por SEQ ID NO 88 (figura
2).
6. Uso de un péptido o composiciones peptídicas
biotinilados(as) de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 o las reivindicaciones 4 a 5 para la
inmunodetección de la infección por MVV o CAEV.
7. Uso de un péptido biotinilado o composiciones
peptídicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5
en un kit para la inmunodetección de la infección por MVV o
CAEV.
8. Un soporte sólido sobre el cual se ha
inmovilizado un péptido biotinilado de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, o una composición peptídica de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.
9. Un método para la inmunodetección de la
infección por MVV o infección por CAEV en mamíferos, que comprende
los pasos de:
- poner en contacto una muestra biológica de
dicho mamífero con un péptido biotinilado de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, o con una composición peptídica de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en condiciones
que permiten la formación de un complejo inmunológico, y
- detectar la presencia de un complejo
inmunológico formado entre dicho péptido biotinilado o dicha
composición peptídica y los anticuerpos anti-MVV o
anti-CAEV que pueden estar presentes en la
muestra.
10. Un kit de inmunodiagnóstico para la detección
de la infección por MVV o infección por CAEV en mamíferos,
comprendiendo dicho kit un péptido biotinilado de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una composición
peptídica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a
5.
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