ES2341061T3

ES2341061T3 - Regiones inmunorreactivas de la glicoproteina gpii del virus de la varicela zoster (vzv).

Info

Publication number: ES2341061T3
Application number: ES98122351T
Authority: ES
Inventors: Markus Dr. Eickmann; Dorothee Glicklhorn; Klaus Prof. Dr. Radsak; Hans-Peter Dr. Hauser; Bernhard Dr. Giesendorf
Original assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH; Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1997-12-23
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2010-06-14
Anticipated expiration: 2018-11-25
Also published as: DE19757767A1; CA2255101A1; DE59814427D1; ATE453715T1; US6414116B1; EP0927760A2; CA2255101C; JPH11248710A; EP0927760A3; US20020150889A1; EP0927760B1; JP4163799B2; US6960442B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE PEPTIDOS INMUNORREACTIVOS, LOS CUALES SON HOMOLOGOAS CON LA ZONA DE LAS POSICIONES 450 A 655 DE LOS AMINOACIDOS DE LA GLICOPROTEINA II DEL VIRUS ZOSTER DE LA VARICELA. PREFERIBLEMENTE SON LOS PEPTIDOS, A LOS CUALES CORRESPONDEN LAS ZONAS DE LOS AMINOACIDOS 505 A 647, 517 A 597, 535 A 584 O 545 A 582. LOS PEPTIDOS INMUNORREACTIVOS SON UTILIZABLES EN EL PROCEDIMIENTO PARA LA DIAGNOSIS DE UNA INFECCION POR EL VIRUS ZOSTER DE LA VARICELA.

Description

Regiones inmunorreactivas de la glicoproteína gpII del virus de la Varicela-Zoster (VZV).

La presente invención se refiere a procedimientos inmunoquímicos para detectar anticuerpos contra el virus de la Varicela-Zoster (VZV) mediante el empleo de péptidos inmunorreactivos, que corresponden a la región de las posiciones de los aminoácidos 450 hasta 655 de la glicoproteína II del virus de la Varicela-Zoster. En este caso son preferentes aquellos procedimientos en los cuales la región indicada corresponda a los aminoácidos 505 hasta 647, 517 hasta 597 o 535 hasta 584. La presente invención se refiere así mismo a instrumental de ensayo que contiene péptidos inmunorreactivos, que corresponden a las regiones que han sido citadas precedentemente.

El VZV se asigna a la familia de los virus del Herpes de conformidad con la clasificación del Comité Internacional para la Virustaxonomía (ITCV). La infección primaria se produce en el 75% de los casos hasta la edad de 15 años y transcurre en la mayoría de los casos de manera inaparente. Por el contrario, en el caso de los adultos, que no hayan tenido todavía ningún contacto con el virus, y en el caso de personas, que presentan una inmunosupresión natural o terapéutica, la infección transcurre con una sintomatología severa. La infección del neonato conduce, de la misma manera, a una sintomatología severa puesto que el virus tiene acceso a través de la placenta y en este instante no existe ningún tipo de protección por medio de anticuerpos maternales. En conexión con la infección primaria el virus persiste durante toda la vida en los ganglios sensoriales. Tras la reactivación se expande el VZV a través de los nervios periféricos en los ganglios sensoriales y conduce como consecuencia al Herpes-Zoster.

A partir de la secuencia de nucleótidos completamente determinada del genoma VZV con una longitud de 124.884 bp (cepa Dumas; (A. J. Davison & J. E. Scott. (1986), J. Gen. Virol. 67, 1759-1816)) pueden deducirse 70 marcos de lectura abiertos, entre los cuales se encuentran también los marcos de lectura abiertos de las glicoproteínas conocidas actualmente gpI (ORF 68), gpII (ORF 31), gpIII (ORF 37), gpIV (ORF 67), gpV(ORF 14) y gpVI (ORF 60). La secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de nucleótidos muestra homologías marcadas respectivamente de forma variable para las glicoproteínas gE, gB, gH, gI, gC y gL del virus del Herpes Simplex (HSV). Sin embargo, no existe ningún punto de referencia relativo a que pueda derivarse de la homología de la secuencia también una homología de la función. Los marcos de lectura abiertos de las glicoproteínas gpI, gpII, gpIII y gpV han podido ser confirmados por medio de la biología molecular. En contra de lo que ocurre en el caso de la glicoproteína gB del HSV, que ha sido investigada detalladamente, existen menos datos sobre la proteína homóloga de VZV, gpII. Las investigaciones correspondientes se limitan a la biosíntesis de la gpII y al significado de la gpII para el proceso de la neutralización de los virus (P. M. Keller et al. (1986), Virologie 152, 181-191; M. Massaer et al. (1993), J. Gen. Virol. 74, 491-494).

Los autores Ellis et al. (E.P. 0210931B1) han confirmado el ORF 31 de la gpII. Por otra parte, los autores Ellis et al., han descrito la purificación de la gpII a partir de células MRC-5 infectadas con VZV (fibroblastos humanos) y su empleo para la obtención de anticuerpos neutralizantes de los virus a partir de conejillos de Indias. Las publicaciones de los autores P. M. Keller et al. (1986), Virologie 152, 181-191 y M. Massaer et al. (1993), J. Gen. Virol. 74, 491-494 emplean, entre otras cosas, la gpII, que ha sido purificada por medio de una cromatografía de afinidad a partir de células infectadas con VZV, para llevar a cabo la determinación del título de anticuerpo específico para el VZV de sueros humanos. La publicación del autor A. Bollen (E.P 0405867 A1; US 371772) expresa, tras la deleción de la región carboxiterminal, gpII sin anclaje con la membrana, con ayuda del sistema de expresión del baculovirus en células SF9 y por medio de la expresión constituyente en células CHO para la obtención de una vacuna contra el VZV. Por otra parte, la publicación de los autores E. H. Wasmuth & W. J: Miller ((1990), J. Med. Virol. 32, 189-193) muestra, mediante el empleo de glicoproteínas (incluso la gpII) en el ensayo de glicoproteína-ELISA o en el ensayo Dot-ELISA, purificadas por afinidad, procedentes de células infectadas con VZV, la sensibilidad de estos métodos de ensayo y la relación entre el título de anticuerpo determinado y la protección contra una infección producida por el VZV. Sin embargo, ninguna de las publicaciones que han sido citadas precedentemente permite obtener una conclusión sobre la obtención de cantidades suficientes de la glicoproteína gpII para el establecimiento de un ensayo a escala relevante desde el punto de vista del diagnóstico.

Se ha presentado una investigación de regiones cuestionablemente inmunorreactivas de la glicoproteína gpII en la publicación de los autores Kjartansdottir et al. (1996), Arch. Virol., tomo 141, Nr. 12, 2465-2469. Como resultado de esta investigación no pudo especificarse por parte de los autores de la publicación ninguna otra región inmunorreactiva, con excepción de una sola región (AS 417-447).

Los métodos serológicos para la verificación de la situación de inmunidad específica para el VZV son muy numerosos y van desde el ensayo inmunorradiológico Radio- immuno- assay (RIA), pasando por el ensayo inmunoabsorbente ligado a un enzima Enzyme- linked- immunosorbentassay (ELISA), por un ensayo de fluorescencia de anticuerpos a antígenos de membrana Fluoreszent- antibody- membran- antigen- assay (FAMA), por el ensayo de inmunofluorescencia Immun-Fluoreszenz- Test (IFT) hasta la fijación del complemento Komplement- Fixation (CF). En este caso, se detectan preponderantemente anticuerpos específicos del VZV. Como antígeno se utiliza, con frecuencia, material vírico, que ha sido obtenido sobre cultivos de fibroblastos humanos, siguiéndose un cultivo engorroso, y que ha sido preparado siguiéndose métodos especiales para el empleo en diagnóstico.

Sin embargo, la obtención de los antígenos para el VZV a partir de fibroblastos infectados va acompañada de un peligro de infección para el personal dedicado a esta finalidad. Por otra parte, la obtención requiere una gran inversión de costes y de tiempo entre otras cosas debido a que el virus no es liberado por las células infectadas y que, como consecuencia, se requieren procedimientos de purificación especiales. Para el empleo del antígeno sin purificación previa para un ensayo inmunoquímico se someten a una digestión las células infectadas con el VZV mediante tratamiento con ultrasonidos y el antígeno se emplea directamente tras la dilución para el recubrimiento de, por ejemplo, placas de microtitulación. Puesto que en el caso de este método se enlazan sobre las cavidades de las placas de microtitulación, además de los antígenos específicos de virus, preponderantemente también antígenos específicos de la célula, los antígenos específicos de la célula, especialmente cuando estén presentes determinadas enfermedades, por ejemplo enfermedades autoinmunes, pueden conducir a resultados positivos faltos y, como consecuencia, a un diagnóstico erróneo. Otros procedimientos de ensayo, que están basados en la glicoproteína vírica purificada, tal como por ejemplo un ensayo de glicoproteína-ELISA, requieren procedimientos de purificación extraordinariamente engorrosos y sometidos a grandes pérdidas de tal manera, que el establecimiento de ensayos de diagnóstico inmunoquímicos a gran escala apenas puede ser realizado hasta el presente. Como consecuencia de la homología marcada entre las glicoproteínas de los virus del Herpes \alpha se observan frecuentemente también para el ensayo de glicoproteína-ELISA reactividades cruzadas con anticuerpos específicos del HSV y condicionado a esto, resultados positivos falsos.

Una posible solución del problema, que ha sido indicado precedentemente, reside en el empleo de proteínas recombinantes, que pueden ser preparadas en grandes cantidades en sistemas heterólogos, por ejemplo en Escherischia coli (E. coli). En este sistema queda excluida una posible infección del personal por VZV. Por otra parte está dada la posibilidad de un diagnóstico diferencial dirigido a una proteína vírica específica. De manera especial, la región reactiva de la proteína VZV puede ser limitada de tal manera que casi pueden excluirse o pueden excluirse por completo las reactividades cruzadas con anticuerpos específicos de otros virus del Herpes. Las proteínas que cumplen esta condición previa pueden ser expresadas también en forma de proteínas híbridas, contribuyendo a la estabilización del producto de la expresión bien una proteína propia del huésped, por ejemplo la proteína de enlace con la maltosa (MBP) de E. coli o una secuencia ubicada en la posición N-terminal constituida por 6 restos de histidina (His-tag) como participante en la fusión. Estas proteínas híbridas pueden ser empleadas a continuación directamente, a través de purificaciones de afinidad de una sola etapa en forma aproximadamente pura y, por consiguiente, exenta de contaminación, para el recubrimiento de superficies empleadas para el diagnóstico, por ejemplo placas de microtitulación para el ensayo ELISA. Las proteínas, que cumplen los criterios que han sido citados precedentemente, no han sido descritas hasta el presente para el sistema VZV.

De manera sorprendente pudieron ser localizados sobre la glicoproteína gpII del VZV epitopos que pueden ser empleados para diagnóstico, que se encuentran en la región de las posiciones de los aminoácidos 450 hasta 655.

Los objetos de la presente invención están definidos en las reivindicaciones. Entre otras cosas, el objeto de la presente invención consiste, por consiguiente, en un procedimiento inmunoquímico, que posibilita la detección de anticuerpos contra el VZV. En este procedimiento se pone en contacto un péptido inmunorreactivo, elegido entre las regiones aminoácido 450 hasta 655, aminoácido 505 hasta 647, aminoácido 517 hasta 597 y aminoácido 535 hasta 584, con una muestra, por ejemplo con una muestra de sangre, de plasma o de suero de un paciente, que tiene que ser explorado con respecto a la presencia de anticuerpos específicos del VZV. A continuación se determina con ayuda de los métodos, que son conocidos por el técnico en la materia, si los anticuerpos procedentes de la muestra se enlazan con los péptidos inmunorreactivos empleados o si se presentan con éstos en otra interacción inmunológica, por ejemplo una competición.

Descripción detallada de la invención

Para llevar a cabo la localización de las regiones inmunorreactivas que pueden ser empleadas para el diagnóstico, se empleó la expresión de la glicoproteína II (gpII) en forma fragmentada en el sistema bacteriano. Se sabe que se presenta en primer lugar la respuesta inmune específica de la gpII tras la infección con VZV. Sólo a continuación se lleva a cabo la respuesta inmune contra la gpI y contra la gpIII. Desde luego existían hasta el presente conocimientos relativos a la expresión bacteriana pero no sobre los epitopos inmunorrelevantes de la gpII. Se amplificó todo el ORF31 de la gpII, descrito por los autores Ellis et al. (E.P. 0210931B1) a partir de VZV-ADN genómico (cepa Ellen) y se clonó en el vector de expresión procariota pMAL-p2 (NEB), que permite la expresión del fragmento de ADN insertado como proteína híbrida MBP. Sin embargo, el ORF31 completo no es adecuado para la expresión bacteriana. Por este motivo se investigó la expresión de las regiones parciales del ORF31 con el sistema pMAL. En todos los fragmentos pudieron ser detectados los productos correspondientes de la expresión (tamaño del fragmento comprendido entre 400 y 600 bp). La reactividad de los productos de la expresión se verificó con ayuda de un grupo de sueros constituido por 25 sueros humanos reactivos al VZV. Únicamente uno de los fragmentos se reveló como inmunorreactivo. En este caso se trata de un fragmento de un tamaño de 206 aminoácidos (Seq. 1), que es homólogo con el aminoácido 450-655 de la gpII. Para limitar todavía más el epitopo inmunorreactivo se utilizaron regiones parciales de este fragmento para la expresión en el sistema pMAL. Por medio de la inmunoselección pudo demostrarse que son inmunorreactivos los fragmentos que codifican el aminoácido 505-647 (pMAL-427-gpII), el aminoácido 517- 597 (pMAL-240-gpII) o el aminoácido 535-584 (pMAL-149-gpII). La región de aminoácido 535-584 pudo ser clasificada como epitopo principal inmunorreactivo de la gpII.

Secuencia 1: resto de aminoácido 450-655 de la gpII (cepa Ellen). En total 206 AS; peso molecular teórico 23,5 kDa. La región en negrita corresponde a los dominios inmunorreactivos. El aminoácido subrayado es el aminoácido substituido en comparación con la cepa Dumas. La numeración de los aminoácidos comienza en la metionina (codón de iniciación) de la secuencia publicada de la gpII (A. J. Davison & J. E. Scott. (1986), J. Gen. Virol. 67, 1759-1816).

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

La correspondiente secuencia de nucleótidos está representada en la tabla 1.

2

3

Para la evaluación de estos dominios en los procedimientos de ensayo inmunológicos se subclonó en el vector pQE (Qiagen) la secuencia de la gpII, que codifica la región con una longitud de 206 AS. El constructo del vector se denominó como pQE-gpII*. Este vector dispone de una cola de histidina situada en la posición C-terminal (6 x His) como parte de la fusión de tal manera que la inmunorreactividad de los sueros humanos ensayados se debe únicamente a la parte gpII y pueden ser excluidos resultados positivos falsos en el inmunoensayo de los sueros reactivos al VZV.

Con ocasión de una evaluación en el ensayo ELISA pudo determinarse una sensibilidad del 71% (n = 49) y una especificidad del 100% (n = 5) por medio de la proteína purificada, que es codificada por el plásmido pQE-gpII*, con el redondeo a la baja calculado de 305 (valor medio de los sueros negativos + 3 veces la desviación patrón) y, de manera respectiva, pudo determinarse con el redondeo a la baja libremente elegido de 160, una sensibilidad del 82% y una especificidad del 80% para el diagnóstico IgG.

Con ocasión de una evaluación alternativa en el ensayo ELISA pudo determinarse una sensibilidad del 23% (n = 13) y una especificidad del 100% (n = 41) por medio de una proteína purificada, que es codificada por el plásmido pQE-gpII*, con un redondeo a la baja calculado de 102 (valor medio de los sueros negativos + 3 veces la desviación patrón) y, de manera respectiva, pudo determinarse con un redondeo a la baja libremente elegido de 70, una sensibilidad del 61,5% y una especificidad del 80% para el diagnóstico IgM. La sensibilidad y la especificidad pueden optimizarse en cualquier momento de conformidad con los procedimientos conocidos por el técnico en la materia.

La presente invención se ilustra a continuación además por medio de ejemplos que, sin embargo, no deben ser considerados en modo alguno como limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Obtención de viriones VZV virales y extracción del ADN

Se liberan viriones por medio de tratamiento por ultrasonidos a partir de fibroblastos infectados con el VZV. Los virus fueron purificados a través de un gradiente de sucrosa lineal (20-70% (p/v)) de los componentes celulares. Después de una incubación DNasa I se liberó de los viriones el ADN viral mediante tratamiento con proteinasa K y con dodecilsulfato de sodio (SDS). Tras una extracción con fenol/cloroformo se llevó a cabo la precipitación del ADN viral por medio de etanol.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Clonación del ORF31 y subclonación del fragmento inmunorreactivo

El ADN viral (véase el ejemplo 1) sirvió como matriz para la amplificación del ORF31, que codifica la gpII. Como oligonucleótidos de amplificación sirvieron los cebadores siguientes:

: gpIIH 5' GGAATTCCTTCTATGTTTGTTACGGCGGTTG 3';

: gpIIR 5' GCTCTAGAGCATTTACACCCCCGTTACATTCTCG 3'.

\vskip1.000000\baselineskip

Estos oligonucleótidos son complementarios de la correspondiente sección de secuencias de la secuencia publicada (A. J. Davison & J. E. Scott. (1986), J. Gen. Virol. 67, 1759-1816), que contienen, sin embargo, en su extremo 5' una secuencia de puntos de corte por restricción, que no hibridiza con la matrices de ADN. Una vez verificada la amplificación se cortó en el extremo el producto de la amplificación con un tamaño de 2630 bp con los enzimas de restricción EcoRI y XbaI y se enlazó con el vector de expresión pMAL-p2 previamente linealizado con EcoRI y con XbaI (pMAL-p2-ORF31). Se secuenció, en su totalidad, el ORF31 de una manera con solapamiento bidireccional. Éste presentó una substitución de bases en la posición del nucleótido 1550 de citosina por timidina, que condujo a una substitución de serina por fenilalanina en el plano de los aminoácidos.

Para la subclonación de la región inmunorreactiva se retiró por restricción la región insertada con los enzimas de restricción que han sido citados precedentemente a partir del vector pMAL-p2-ORF31, se purificó en gel y a continuación se sometió a una digestión con ApoI. El fragmento ApoI resultante, con un tamaño de 610 bp, se sometió igualmente a una purificación con gel y se subclonó en el punto de restricción EcoRI del vector pMAL-c2. El vector se denominó como pMAL-gpII*. Una vez confirmada la inmunorreactividad se subclonó la región codificante en el vector pQE. Con esta finalidad se retiró por restricción el fragmento con un tamaño de 610 bp por medio de los enzimas de restricción XmnI y HindIII a partir del vector pMAL-gpII* y se subclonó en los puntos de corte por restricción SmaI/HindIII del vector pQE32. El vector se denominó como pQE-gpII*.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Subclonación del epitopo inmunorreactivo

Mediante la amplificación con el vector pMAL-gpII* como matrices de ADN y con los oligonucleótidos:

: 5'CGGGATCCCGTGTTAAAGCTCGTATTCTCGGCGACG3' y

: 5'CCCAAGCTTTAATCCTGTATCCCGCAGCTCGTCTCT3',

: 5 'CGGGATCCGTTTCTAATTGTCCAGAACTGGGATCAG3' y

: 5'CCCAAGCTTATACGTAGTGATGCCCAAATAGAAAA3' o

: 5'CGGGATCCTCTATGAGGGTATCTGGTAGTACTACGCGTT3' y

: 5'CCCAAGCTTAGCCACGCATGGTTCTAACAGATC3'

\vskip1.000000\baselineskip

pudo obtenerse un fragmento con un tamaño de 427 bp, un fragmento con un tamaño de 240 bp o un fragmento con un tamaño de 149 bp, que se subclonaron respectivamente después de una digestión de restricción con los enzimas BamHI y HindIII en el vector pMAL-c2 linealizado con BamHI y con HindIII. Los constructos resultantes se denominaron como pMAL-427-gpII, pMAL-240-gpII o pMAL-149-gpII.

Ejemplo 4 a) Obtención de la proteína recombinante pQE gpII*

Se llevó a cabo la expresión y la purificación de la proteína recombinante pQE gpII mediante cromatografía de afinidad de metal Metal Affinity Chromatography bajo condiciones desnaturalizantes según las indicaciones del fabricante (firma Clontech, Talon Metal Affinity Resin, PT1320-1).

b) Obtención de la fase fija I (sistema de conformidad con la invención)

Se incubaron placas de microtitulación del tipo B (firma Greiner) con 110 \mul por cada pocillo de solución de recubrimiento (4 \mug/ml de pQE gpII recombinante en 50 mM de tampón de carbonato de sodio, pH 9,5) durante 18 horas a 4ºC. Los pocillos de las placas de microtitulación se lavaron a continuación tres veces con 300 \mul cada vez de solución de lavado (50 Mm Tris/EDTA pH 7,0-7,4 + 0,5% BSA).

c) Inmunoensayo enzimático para la detección de los anticuerpos VZV-IgG

Para llevar a cabo la detección de anti VZV IgG en el inmunoensayo enzimático se dispusieron por pipetado, respectivamente, 100 \mul de los sueros previamente diluidos a 1:100 en tampón para muestras POD (Behring Diagnostics GmbH, OWBE 945) en las placas de microtitulación preparadas de conformidad con el ejemplo 4b y se incubaron durante 1 hora a 37ºC.

Al cabo de 3 lavados con solución de lavado POD (Behring Diagnostics GmbH, OSEW 965) se depositaron por pipetado 100 \mul del conjugado IgG/POD anti-humano (Behring Diagnostics GmbH Ch. 243713), diluido a 1:50 en tampón conjugado Microbiol (Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935). La incubación durante 1 hora (37ºC) se concluyó con otras tres etapas de lavado. La actividad peroxidasa enlazada, que está relacionada directamente con el número de los anticuerpos VZV enlazados, se determinó mediante la adición de H_{2}O_{2}/tetrametilbencidina (Behring Diagnostics GmbH OUVG 945). La conversión del substrato se detuvo al cabo de 30 minutos a la temperatura ambiente por medio de adición de ácido sulfúrico 0,5 M (Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965) y se midió la extinción a 450 nm.

Los sueros positivos de anticuerpos anti-VZV, así como los sueros negativos de anticuerpos anti-VZV se ensayaron tanto en el sistema de referencia Enzygnost Anti VZV/IgG (Behring Diagnostics GmbH, OWLT 155), así como también en el inmunoensayo enzimático de conformidad con la invención. Los resultados (unidades de extinción) del ensayo se encuentran en la tabla 2. En el caso de una evaluación en el ensayo ELISA pudo determinarse una sensibilidad del 69% (n = 52) y una especificidad del 100% (n = 16) por medio de la proteína purificada pQE-gpII* con el redondeo a la baja calculado de 331 (valor medio de los sueros negativos + 3 veces la desviación patrón) y, de manera respectiva, con un redondeo a la baja elegido libremente de 335 pudo determinarse una sensibilidad del 69% (n = 52) y una especificidad del 100% (n = 16) para el diagnóstico IgG.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Inmunoensayo enzimático para la detección de los anticuerpos VZV-IgM

El inmunoensayo enzimático para la detección de los anti-VZV IgM se llevó a cabo de la manera siguiente:

En primer lugar se diluyeron los sueros a 1:50 en tampón para muestras POD (Behring Diagnostics GmbH, OWBE 945) y a continuación se incubaron durante 15 minutos a la temperatura ambiente 1:2 con el adsorbente RF (Behring Diagnostics GmbH, OUCG 945). En los pocillos de las placas de microtitulación, preparadas de conformidad con el ejemplo 4b, se incubaron durante 1 hora a 37ºC respectivamente 100 \mul de los sueros diluidos previamente, que han sido descritos precedentemente.

Al cabo de tres lavados con solución de lavado POD (Behring Diagnostics GmbH, OSEW 965) se introdujeron por pipetado 100 \mul del conjugado IgM/POD anti-humano (Behring Diagnostics GmbH Ch. 4241313), diluido a 1:25 en tampón para conjugados Microbiol (Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935). La incubación durante 1 hora (+37ºC) se concluyó con otras tres fases de lavado. La actividad peroxidasa enlazada, que estaba relacionada directamente con el número de los anticuerpos VZV enlazados, se determinó mediante la adición de H_{2}O_{2}/tetrametilbencidina (Behring Diagnostics GmbH OUVG 945). La conversión del substrato se detuvo al cabo de 30 minutos a la temperatura ambiente mediante la adición de ácido sulfúrico 0,5 M (Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965) y se midió la extinción a 450 nm.

Los sueros anti-VZV positivos así como los sueros anti-VZV negativos se ensayaron tanto en el sistema de referencia Enzygnost Anti VZV/IgM (Behring Diagnostics GmbH, OWLW 155), así como también en el inmunoensayo enzimático de conformidad con la invención. Los resultados (unidades de extinción) del ensayo se encuentran en la tabla 3. En el caso de una evaluación en el ensayo ELISA pudo determinarse por medio de una proteína purificada pQE-gpII* con un redondeo a la baja calculado de 102 (valor medio de los sueros negativos + 3 veces la desviación patrón) una sensibilidad del 38% (n = 13) y una especificidad del 100% (n = 41) y, de manera respectiva, con un redondeo a la baja elegido libremente de 96 pudo determinarse una sensibilidad del 38% (n = 13) y una especificidad del 100% (n = 41) para el diagnóstico IgM.

TABLA 2

4

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

9

10

11

(1) DATOS GENERALES:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Dade Behring Marburg GmbH

\vskip0.500000\baselineskip

(B): DOMICILIO: Emil-von-Behring-Str. 76

\vskip0.500000\baselineskip

(C): LOCALIDAD: Marburg

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 35001

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 06421/39-2332

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: 06421/39-3631

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Regiones inmunorreactivas de la glicoproteína gpII del virus de Varicela-Zoster (VZV)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE LAS SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): VERSIÓN QUE PUEDE SER LEÍDA MEDIANTE ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SOPORTE DE DATOS: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPA)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD: NÚMERO DE LA SOLICITUD: DE 197 57 767.9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 206 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 618 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: SÍ

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCCTT CTATGTTTGT TACGGCGGTT G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCTAGAGC ATTTACACCC CCGTTACATT CTCG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCCG TGTTAAAGCT CGTATTCTCG GCGACG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF3-1

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTT AATCCTGTAT CCCGCAGCTC GTCTCT

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCGT TTCTAATTGT CCAGAACTGG GATCAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTA TACGTAGTGA TGCCCAAATA GAAAA

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCTC TATGAGGGTA TCTGGTAGTA CTACGCGTT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) DATOS RELATIVOS A LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): FORMA DE LA HEBRA: hebra individual

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE LA MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): PROCEDENCIA ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: virus de Varicela Zoster

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CEPA: Ellen

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): POSICIÓN EN EL GENOMA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): POSICIÓN EN EL MAPA: ORF31

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAAGCTTA GCCACGCATG GTTCTAACAG ATC

\hfill

33

Claims

1. Procedimiento inmunoquímico para la detección de anticuerpos contra el virus de Varicela-Zoster (VZV) en una muestra por medio de un péptido inmunorreactivo, que corresponde a la región de aminoácidos desde 450 hasta 655 de la gpII del VZV.

2. Procedimiento inmunoquímico según la reivindicación 1, en el que el péptido inmunorreactivo corresponde a la región de aminoácidos desde 505 hasta 647 de la gpII del VZV.

3. Procedimiento inmunoquímico según la reivindicación 2, en el que el péptido inmunorreactivo corresponde a la región de aminoácidos desde 517 hasta 597 de la gpII del VZV.

4. Procedimiento inmunoquímico según la reivindicación 3, en el que el péptido inmunorreactivo corresponde a la región de aminoácidos desde 535 hasta 584 de la gpII del VZV.

5. Péptido inmunorreactivo, que corresponde a la región de aminoácidos desde 535 hasta 584 de la gpII del VZV.

6. Instrumentación de ensayo para llevar a cabo la detección de anticuerpos contra el VZV, que contiene un péptido inmunorreactivo, que corresponde a una región de la gpII del VZV, elegida entre las regiones siguientes: aminoácido 450 hasta 655, aminoácido 505 hasta 647, aminoácido 517 hasta 597 y aminoácido 535 hasta 584.