JP4163799B2 - 水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タンパク質ｇｐＩＩの免疫反応性領域 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質IIのアミノ酸位置４５０〜６５５を包含する領域と相同性である免疫反応性ペプチドに関する。この関連において、好ましいペプチドは、上記領域がアミノ酸５０５〜６４７、５１７〜５９７、５３５〜５８４または５４５〜５８２に相当するペプチドによって与えられる、これらの免疫反応性ペプチドは水痘帯状疱疹感染の診断のための方法に使用することができる。
【０００２】
【従来技術】
ウイルス分類国際委員会（ＩＴＣＶ）によれば、ＶＺＶはヘルペスウイルス科に属する。７５％の例で一次感染は生涯の年齢１５歳までに起こり、通常は不顕性の経過をたどる。これに反して、ウイルスとそれ以前に接触したことがない成人の感染、および自然にまたは治療的に免疫抑制を受けた人の場合の感染は、重篤な症状を伴うことがある。胎児の感染も、このウイルスは胎盤を通過することが可能で、この時点では母体の抗体による保護が提供されないので、同様に重篤な症状を招来する。一次感染ののち、ウイルスは生涯を通じて知覚神経節に維持される。再活性化されると、ＶＺＶは知覚神経節内の末梢神経に広がり、帯状疱疹を発症する。
【０００３】
７０のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)は、最近知られた糖タンパク質ｇｐＩ（ＯＲＦ６８）、ｇｐII（ＯＲＦ３１）、ｇｐIII（ＯＲＦ３７)、ｇｐIV（ＯＲＦ６７）、ｇｐV（ＯＲＦ１４）、およびｇｐVI（ＯＲＦ６０）のオープンリーディングフレームを含めて、完全に決定され長さ１２４,８８４bpのＶＺＶゲノムヌクレオチド配列から推定できる(Dumas株；A.J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816, 1986）。いずれの場合も、ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質、ｇＥ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＣおよびｇＬと多かれ少なかれ顕著なホモロジーを示す。しかしながら、配列ホモロジーから機能ホモロジーを誘導することも可能であることを支持する根拠は全くない。糖タンパク質ｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIIIおよびｇｐＶのオープンリーディングフレームを確認するためには、分子生物学的手法が用いられてきた。さらに完全に研究されているＨＳＶの糖タンパク質ｇＢとは異なり、ＶＺＶの相同性のタンパク質、すなわちｇｐIIに関しては、利用できるデータはほとんどない。相当する研究はｇｐIIの生合成およびウイルス中和過程に対するｇｐIIの重要性（P.M. Kellerら、Virologie 152: 181-191, 1986；M.Masserら、J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993）に限定されている。
【０００４】
Ellisら（E.P.0210931B1）はｇｐIIに帰属されるＯＲＦ３１を確認している。さらに、EllisらはＶＺＶ感染ＭＲＣ５細胞（ヒト線維芽細胞）からのｇｐIIの精製、およびモルモットからのウイルス中和抗体の調製のためのその使用を記載している。P.M. Kellerら、Virologie 152: 181-191, 1986およびM.Masserら、J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993は、ヒト血清のＶＺＶ特異的な抗体の力価を測定するため、ＶＺＶ感染細胞から親和性クロマトグラフィーによって精製したとくにｇｐIIを使用している。カルボキシ末端領域を削除したのちに、A.Bollen（E.P.0405867A1；US 371772）はＶＺＶワクチンを調製する目的で、ＳＦ９細胞内でバキュロウイルス発現系を用いＣＨＯ細胞中での構成的発現によりその膜繋留部を欠くｇｐIIを発現させている。さらに、E.H. Wasmuth & W.J. Miller（J.Med. Virol. 32: 189-193, 1990）は、ＶＺＶ感染細胞から親和性精製された糖タンパク質（ｇｐIIを含む）を糖タンパク質またはドットＥＬＩＳＡに用いてこれらの試験方法の感度および決定された抗体力価がＶＺＶ感染に対する保護に相関する事実を証明した。しかしながら、上述の報告のいずれにも診断に適した規模での試験をセットアップするために適当な量の糖タンパク質ｇｐIIをどのようにして調製するかの情報は全く示されていない。さらに、ｇｐIIもしくは、とくにｇｐIIタンパク質の免疫反応性エピトープの詳細な構造の研究はこれまで全く開示されていない。
【０００５】
ＶＺＶに特異的な免疫に関する状態を検査するための方法には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体膜抗原アッセイ（ＦＡＭＡ）および免疫蛍光試験（ＩＦＴ）から補体結合（ＣＦ）まできわめて広範囲の血清学的方法がある。これらの方法は主として、ＶＺＶ特異的抗体を検出する。ヒト培養線維芽細胞上での綿密な培養ののちに単離され、特殊な方法により診断的使用のために精製されたウイルス材料がしばしば抗原として使用される。
【０００６】
しかしながら、感染線維芽細胞からのＶＺＶ抗原の単離はこの作業に従事する人の感染の危険を伴う。さらに、とくにウイルスが感染細胞から放出されず、したがって特殊な精製方法が要求されるので、この調製は、きわめて高価につき、時間がかかる。抗原を前もって精製することなく免疫化学的試験に使用する場合には、ＶＺＶ感染細胞を超音波処理によって破壊し、抗原はたとえば、マイクロタイトレーションプレートの被覆用に希釈したのち直接使用される。この方法では、ウイルス特異的抗原に加え、マイクロタイトレーションプレートのウエルに結合するのは主として細胞特異的抗原であることから、とくにある種の疾患たとえば自己免疫疾患に関連する細胞特異的抗原が存在する場合には、これらの細胞特異的抗原が偽陽性の結果を生じ、その結果、誤診を招くことがある。精製したウイルス糖タンパク質に基づく他の試験方法、たとえば糖タンパク質ＥＬＩＳＡは、顕著により精密な多大の損失を生じる精製を要求し、したがって、比較的大規模の免疫化学的診断試験を確立することはほとんど不可能である。糖タンパク質ＥＬＩＳＡでは、α−ヘルペスウイルスの糖タンパク質との間に存在する著しいホモロジーにより、ＨＳＶ特異的抗体との交叉反応性およびその結果としての偽陽性結果もしばしば観察される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述の問題に対する解決の可能性の一つには、異種システム内たとえば大腸菌（E.coli）において大量に調製できる組換えタンパク質の使用がある。このシステムを使用すれば人がＶＺＶに感染する可能性はない。さらに、このシステムは特異的なウイルスタンパク質に向けられた識別診断の可能性を提供する。とくにＶＺＶタンパク質の反応性領域を、他のヘルペスウイルスに対して特異的な抗体との交叉反応性が実際上または完全に排除できる程度まで限定することが可能である。これらの条件に合致するタンパク質は、宿主特異的タンパク質、たとえば大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、または融合パートナーとして発現産物の安定性に寄与する６ヒスチジン残基から構成されるＮ−末端局在配列(Hisタグ）のいずれかとともにハイブリッドタンパク質として発現させることもできる。これらのハイブリッドタンパク質はついで、単一工程のアフィニティー精製法によって、ほぼ純粋な、したがって夾雑物を含まない形態で、診断用に使用可能な表面、たとえばＥＬＩＳＡマイクロタイトレーションプレートの被覆に直接使用することができる。上述の基準に合致するタンパク質は、ＶＺＶシステムについてはこれまで記載されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、ＶＺＶの糖タンパク質ｇｐII上に、アミノ酸位置４５０〜６５５を包含する領域内に存在する診断的に利用可能なエピトープの位置を決定することが可能であった。
したがって、本発明は、ＶＺＶのｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５を包含する領域と相同性であるか、またはｇｐIIのアミノ酸４５０〜６５５を包含する領域を実質的に含有する免疫反応性ペプチドに関する。これに関連して、好ましいペプチドは、上記領域がアミノ酸５０５〜６４７またはアミノ酸５１７〜５９７に相当するペプチドにより与えられ、とくに好ましくはアミノ酸５３５〜５８４、きわめて好ましくはアミノ酸５４５〜５８２に相当するペプチドによって与えられる。
これに関連して、ＶＺＶ株の変動により天然に変動したアミノ酸配列を示す免疫反応性ペプチドも明らかに包含されるものである。
【０００９】
本発明はさらに、本発明による上述の免疫反応性ペプチドをコードする核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡに関する。すなわち、とくに表１に示した配列を有する核酸である。しかしながら、これに加えて、上述の核酸と緊縮条件下にハイブリダイズし、ＶＺＶに対する抗体によって認識されるが他のヘルペスウイルスに対する抗体には認識されないペプチドをコードする核酸も同時に包含することを意図するものである。
【００１０】
本発明はまた、表１に示した配列を有する核酸、または緊縮条件下にハイブリダイズする上述の核酸の１種の発現によって調製できる免疫反応性ペプチドであり、すべてＶＺＶに対する抗体によって認識されるが他のヘルペスウイルスに対する抗体には認識されないという事実によって特徴づけられる免疫反応性ペプチドに関する。
【００１１】
本発明はさらに、ＶＺＶに対する抗体の検出を可能にする免疫化学的方法に関する。この方法においては、上記免疫反応性ペプチドの１種または２種以上を、ＶＺＶ特異的抗体の存在を検討する患者からのサンプルたとえば血液、血漿または血清サンプルと接触させる。ついで、サンプルからの抗体が使用した免疫反応性ペプチドに結合するか、またはこれらのペプチドと他の免疫学的関係、たとえば競合に加わるかを決定するために、当業者に周知の方法が使用される。
【００１２】
本発明はまた、核酸ハイブリダイゼーションによるＶＺＶの検出のための本発明の上述の核酸の使用に関する。
本発明はさらに、本発明の免疫反応性ペプチドからなる、ＶＺＶに対する抗体を検出するための試験キット、および本発明の核酸からなる、ＶＺＶを検出するための試験キットに関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
診断的に利用可能な免疫反応性領域の位置を決定するためには断片化された形態での糖タンパク質II（ｇｐII）の細菌システムにおける発現が使用された。ｇｐII特異的免疫応答は、ＶＺＶ感染後に最初に出現することが知られている。ｇｐＩおよびｇｐIIIに対する免疫応答の出現は、その後にのみ認められる。しかしながら、ｇｐIIの細菌における発現またはその免疫関連エピトープについての情報は、以前に存在しなかった。Ellisら（E.P.021093B1）に記載されたように、ｇｐIIの全ＯＲＦ３１をゲノムＶＺＶ ＤＮＡ（Ellen株）から増幅し、挿入されたＤＮＡフラグメントをＭＢＰハイブリッドタンパク質として発現させることができる原核細胞発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２（ＮＥＢ）にクローン化した。しかしながら、完全なＯＲＦ３１は細菌での発現には適さないことが見出された。この理由から、ＯＲＦ３１の構成領域の発現は、ｐＭＡＬシステム中において検討された。すべてのフラグメント（フラグメントサイズ４００bp〜６００bp）の場合に、相当する発現産物が検出された。２５ＶＺＶ反応性ヒト血清からなる血清プールを発現産物の反応性の検査に使用した。１種のフラグメントのみに免疫反応性が見出された。これはｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５に相同性の２０６ＡＡフラグメント（配列１）であった。免疫反応性エピトープをさらに限定するために、このフラグメントの構成領域のｐＭＡＬシステムにおける発現を行った。免疫スクリーニングの補助によって、ＡＡ５０５〜６４７（ｐＭＡＬ−４２７−ｇｐII）、ＡＡ５１７〜５９７（ｐＭＡＬ−２４０−ｇｐII）またはＡＡ５３５〜５８４（ｐＭＡＬ−１４９−ｇｐII）が免疫反応性であることが示された。ＡＡ５３５〜５８４の領域をｇｐIIの主要な免疫反応性エピトープであると類別することが可能であった。
【００１４】
配列１：ｇｐII(Ellen株）のアミノ酸残基４５０〜６５５。全部で２０６ＡＡ；理論分子量２３.５kDa。強調した領域が免疫反応性ドメインに相当する。下線を施したＡＡはDumas株と比較して置換されたＡＡである。アミノ酸番号は公表されたｇｐII配列（A.J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816, 1986）のメチオニン（開始コドン）に始まる。
Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val
Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn
Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala
Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly
Asp Val Ile Phe Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg
Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys
Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr
Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp
Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly
His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala
Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr
Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp
Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln
相当するヌクレオチド配列は表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】
免疫学的試験法でこのドメインを評価するために、２０６ＡＡ長の領域をコードするｇｐII配列をベクターｐＱＥ（Qiagen）にサブクローニングした。このベクター構築体はｐＱＥ−ｇｐII*と命名した。このベクターは融合部分としてＣ末端に位置するヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）を有するので、試験すべきヒト血清の免疫反応性はもっぱらｇｐII部分に帰すことが可能であり、ＶＺＶ反応性血清の免疫試験における偽陽性の結果を排除することができる。
【００１８】
ＥＬＩＳＡ評価においては、プラスミドｐＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質はＩｇＧ診断に対し、計算カットオフ３０５（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度７１％（ｎ＝４９）、特異性１００％（ｎ＝５）、また自由に選択されたカットオフ１６０を使用した場合、感度８２％、特異性８０％を与えた。
【００１９】
別のＥＬＩＳＡ評価においてはプラスミドｐＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質がＩｇＭ診断に対し、計算カットオフ１０２（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度２３％（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）、また自由に選択されたカットオフ７０を用いた場合、感度６１.５％および特異性８０％を与えた。感度および特異性は、熟練者には周知の方法を用いて常に至適化することができる。
以下に本発明を実施例によって例示するが、これらはいかなる意味においても本発明を限定するものと考えるべきではない。
【００２０】
【実施例】
実施例１：
ウイルスＶＺＶ粒子の単離およびＤＮＡ抽出
ＶＺＶ感染線維芽細胞からのウイルス粒子の放出には超音波を使用した。ウイルスを直線スクロース勾配（２０〜７０％w/v）により細胞構成成分から精製した。ＤＮアーゼＩとインキュベートしたのち、ウイルスＤＮＡをプロテイナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理することによりウイルス粒子から放出させた。フェノール／クロロホルムで抽出したのち、ウイルスＤＮＡをエタノールで沈殿させた。
【００２１】
実施例２：
ＯＲＦ３１のクローニングおよび免疫反応性フラグメントのサブクローニング
ウイルスＤＮＡ(実施例１参照)を、ＯＲＦ３１の増幅用の鋳型として用いた。これはｇｐIIをコードする。増幅オリゴヌクレオチドとして以下のプライマーを使用した。
ｇｐIIＨ 5′ GGAATTCCTTCTATGTTTGTTACGGCGGTTG 3′
ｇｐIIＲ 5′ GCTCTAGAGCATTTACACCCCCGTTACATTCTCG 3′
これらのオリゴヌクレオチドは、公表された配列(A.J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816, 1986）の相当するセグメントに相補性であるが、それらの５′末端に鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしない制限切断部位配列を含有する。増幅を行ったのち、サイズ２６３０bpの増幅体を制限酵素EcoRＩおよびXbaＩにより末端で切断し、予めEcoRＩおよびXbaＩにより線状化した発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２ 中に結合した（ｐＭＡＬ−ｐ２−ＯＲＦ３１）。全ＯＲＦ３１をオーバーラップ、二方向様式で配列決定した。それはヌクレオチド位置１５５０にシトシンのチミジンによる塩基置換を有し、これがアミノ酸レベルにおいてセリンのフェニルアラニンによる置換を生じた。
【００２２】
免疫反応性領域をサブクローニングするためには、挿入領域を上述の制限酵素を使用してベクターｐＭＡＬ−ｐ２−ＯＲＦ３１から切り出し、ゲル精製し、ついでApoＩで消化した。得られた６１０bp ApoＩフラグメントを同様にゲル精製し、ベクターｐＭＡＬ−ｃ２のEcoRＩ切断部位にサブクローニングした。このベクターはｐＭＡＬ−ｇｐII*と命名された。免疫反応性を確認したのち、コード領域をベクターｐＱＥ中にサブクローニングした。このためには、６１０bpフラグメントを制限酵素SmaＩおよびHind IIIによってベクターｐＭＡＬ−ｇｐII*から切り出し、ベクターｐＱＥ３２のSmaＩ／Hind III制限切断部位にサブクローニングした。このベクターはｐＱＥ−ｇｐII*と命名された。
【００２３】
実施例３：
免疫反応性エピトープのサブクローニング
鋳型ＤＮＡとしてベクターｐＭＡＬ−ｇｐII*およびオリゴヌクレオチド：
5′ CGGGATCCCGTGTTAAAGCTCGTATTCTCGGCGACG 3′ および
5′ CCCAAGCTTTAATCCTGTATCCCGCAGCTCGTCTCT 3′、
5′ CGGGATCCGTTTCTAATTGTCCAGAACTGGGATCAG 3′ および
5′ CCCAAGCTTATACGTAGTGATGCCCAAATAGAAAA 3′ または
5′ CGGGATCCTCTATGAGGGTATCTGGTAGTACTACGCGTT 3′ および
5′ CCCAAGCTTAGCCACGCATGGTTCTAACAGATC 3'
を用いて増幅を行うことにより、４２７bpフラグメント、２４０bpフラグメントまたは１４９bpフラグメントを得ることができ、これらはそれぞれ酵素BamHＩおよびHind IIIによる制限消化に付したのち、予めBamHＩおよびHind IIIによって線状化したベクターｐＭＡＬ−ｃ２にサブクローニングした。得られた構築体はそれぞれ、ｐＭＡＬ−４２７−ｇｐII、ｐＭＡＬ−２４０−ｇｐII、およびｐＭＡＬ−１４９−ｇｐIIと命名された。
【００２４】
実施例４：
ａ）組換えタンパク質ｐＱＥ−ｇｐ II* の調製
組換えタンパク質ｐＱＥ−ｇｐIIの発現および精製は、製造業者の説明書に従い（Clontechより、Talon金属親和性樹脂、ＰＴ１３２０−１）、変性条件下に金属親和性クロマトグラフィーを用いて行った。
【００２５】
ｂ）固相Ｉ（本発明によるシステム）の調製
Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Greinerから）を、各ウエルあたり１１０μlの被覆溶液（５０mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５中４μg／mlの組換えｐＱＥ−ｇｐII）と４℃で１８時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで、各場合３００μlの洗浄溶液（５０mM Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ、pH７.０〜７.４＋０.５％ＢＳＡ）で３回洗浄した。
【００２６】
ｃ）ＶＺＶ ＩｇＧ抗体を検出するための酵素イムノアッセイ
酵素イムノアッセイで抗−ＶＺＶ ＩｇＧを検出するためには予めＰＯＤサンプル緩衝液（Behring Diagnostics GmbH, OWBE 945）中１：１００に希釈した１００μlの血清を、各場合、実施例４ｂに記載のようにして調製したマイクロタイトレーションプレートにピペットで添加し、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【００２７】
プレートをＰＯＤ洗浄溶液（Behring Diagnostics GmbH, OSEW 965）で３回洗浄後、微生物接合緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935)中１：５０に希釈した抗−ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ接合体(Behring Diagnostics GmbH, Ch. 243713)１００μlをピペットで加えた。１時間（３７℃）のインキュベーション後に、さらに３回洗浄工程を行った。結合したＶＺＶ抗体分子の数に直接相関関係を有する結合ペルオキシダーゼ活性をＨ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（Behring Diagnostics GmbH, OUVG 945）の添加により測定した。室温に３０分間置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸（Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965）を加えて停止させ、吸光を４５０nmで測定した。
【００２８】
抗−ＶＺＶ抗体陽性ならびに抗−ＶＺＶ抗体陰性血清を、Enzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＧ標準システム（Behring Diagnostics GmbH, OWLT 155）および本発明による酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光単位）は表２に示す。ＥＬＩＳＡで評価した場合には、精製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＧ診断に対し、計算カットオフ＝３３１（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を使用すると、感度６９％（ｎ＝５２）、特異性９４％（ｎ＝１６）、また自由に選択されたカットオフ＝３３５を使用すると、感度６９％（ｎ＝５２）、特異性１００％（ｎ＝１６）を与えた。
【００２９】
実施例５：
ＶＺＶ ＩｇＭ抗体を検出するための酵素イムノアッセイ
抗−ＶＺＶ ＩｇＭを検出するための酵素イムノアッセイは以下のように実施した。すなわち、血清を予めＰＯＤサンプル緩衝液（Behring Diagnostics GmbH, OWBE 945）中１：５０に希釈し、ついでＲＦ吸着剤（Behring Diagnostics GmbH, OUCG 945）と１：２の比率で室温において１５分間プレインキュベートした。上述のように予め希釈した血清１００μl を、実施例４ｂに記載のようにして調製したマイクロタイトレーションプレートのウエル中で、３７℃において１時間インキュベートした。
【００３０】
プレートをＰＯＤ洗浄溶液（Behring Diagnostics GmbH, OSEW 965）によって３回洗浄したのち、微生物接合緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935)中１：２５に希釈した抗−ヒトＩｇＭ／ＰＯＤ接合体(Behring Diagnostics GmbH Ch. 4241313）１００μlをピペットで加えた。１時間（＋３７℃）インキュベーションしたのち、さらに３回洗浄工程を実施した。結合したＶＺＶ抗体分子の数に直接相関関係を有する結合ペルオキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（BehringDiagnostics GmbH, OUVG 945）の添加により測定した。室温に３０分間置いたのち基質の変換を０.５Ｍ硫酸（Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965）を加えて停止させ、吸光を４５０nmで測定した。
【００３１】
抗−ＶＺＶ−陽性および抗−ＶＺＶ−陰性血清はEnzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＭ標準システム（Behring Diagnostics GmbH, OWLW 155）および本発明の酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光単位）は表３に示す。ＥＬＩＳＡで評価した場合には、精製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＭ診断に対し、計算カットオフ１０２（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を用いると感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）、また自由に選択されたカットオフ９６を用いると、感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）を与えた。
【００３２】
【表３】
【００３３】
【表４】
【００３４】
【表５】
【００３５】
【表６】
【００３６】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルスの糖タンパク質IIのアミノ酸位置４５０〜６５５を包含する領域と相同性である免疫反応性ペプチドに関する。この関連において、好ましいペプチドは、上記領域がアミノ酸５０５〜６４７、５１７〜５９７、５３５〜５８４または５４５〜５８２に相当するペプチドによって与えられる、これらの免疫反応性ペプチドは水痘帯状疱疹感染の診断のための方法に使用することができる。
【０００２】
【従来技術】
ウイルス分類国際委員会（ＩＴＣＶ）によれば、ＶＺＶはヘルペスウイルス科に属する。７５％の例で一次感染は生涯の年齢１５歳までに起こり、通常は不顕性の経過をたどる。これに反して、ウイルスとそれ以前に接触したことがない成人の感染、および自然にまたは治療的に免疫抑制を受けた人の場合の感染は、重篤な症状を伴うことがある。胎児の感染も、このウイルスは胎盤を通過することが可能で、この時点では母体の抗体による保護が提供されないので、同様に重篤な症状を招来する。一次感染ののち、ウイルスは生涯を通じて知覚神経節に維持される。再活性化されると、ＶＺＶは知覚神経節内の末梢神経に広がり、帯状疱疹を発症する。
【０００３】
７０のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)は、最近知られた糖タンパク質ｇｐＩ（ＯＲＦ６８）、ｇｐII（ＯＲＦ３１）、ｇｐIII（ＯＲＦ３７)、ｇｐIV（ＯＲＦ６７）、ｇｐV（ＯＲＦ１４）、およびｇｐVI（ＯＲＦ６０）のオープンリーディングフレームを含めて、完全に決定され長さ１２４,８８４bpのＶＺＶゲノムヌクレオチド配列から推定できる(Dumas株；A.J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816, 1986）。いずれの場合も、ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質、ｇＥ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＣおよびｇＬと多かれ少なかれ顕著なホモロジーを示す。しかしながら、配列ホモロジーから機能ホモロジーを誘導することも可能であることを支持する根拠は全くない。糖タンパク質ｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIIIおよびｇｐＶのオープンリーディングフレームを確認するためには、分子生物学的手法が用いられてきた。さらに完全に研究されているＨＳＶの糖タンパク質ｇＢとは異なり、ＶＺＶの相同性のタンパク質、すなわちｇｐIIに関しては、利用できるデータはほとんどない。相当する研究はｇｐIIの生合成およびウイルス中和過程に対するｇｐIIの重要性（P.M. Kellerら、Virologie 152: 181-191, 1986；M.Masserら、J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993）に限定されている。
【０００４】
Ellisら（E.P.0210931B1）はｇｐIIに帰属されるＯＲＦ３１を確認している。さらに、EllisらはＶＺＶ感染ＭＲＣ５細胞（ヒト線維芽細胞）からのｇｐIIの精製、およびモルモットからのウイルス中和抗体の調製のためのその使用を記載している。P.M. Kellerら、Virologie 152: 181-191, 1986およびM.Masserら、J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993は、ヒト血清のＶＺＶ特異的な抗体の力価を測定するため、ＶＺＶ感染細胞から親和性クロマトグラフィーによって精製したとくにｇｐIIを使用している。カルボキシ末端領域を削除したのちに、A.Bollen（E.P.0405867A1；US 371772）はＶＺＶワクチンを調製する目的で、ＳＦ９細胞内でバキュロウイルス発現系を用いＣＨＯ細胞中での構成的発現によりその膜繋留部を欠くｇｐIIを発現させている。さらに、E.H. Wasmuth & W.J. Miller（J.Med. Virol. 32: 189-193, 1990）は、ＶＺＶ感染細胞から親和性精製された糖タンパク質（ｇｐIIを含む）を糖タンパク質またはドットＥＬＩＳＡに用いてこれらの試験方法の感度および決定された抗体力価がＶＺＶ感染に対する保護に相関する事実を証明した。しかしながら、上述の報告のいずれにも診断に適した規模での試験をセットアップするために適当な量の糖タンパク質ｇｐIIをどのようにして調製するかの情報は全く示されていない。さらに、ｇｐIIもしくは、とくにｇｐIIタンパク質の免疫反応性エピトープの詳細な構造の研究はこれまで全く開示されていない。
【０００５】
ＶＺＶに特異的な免疫に関する状態を検査するための方法には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体膜抗原アッセイ（ＦＡＭＡ）および免疫蛍光試験（ＩＦＴ）から補体結合（ＣＦ）まできわめて広範囲の血清学的方法がある。これらの方法は主として、ＶＺＶ特異的抗体を検出する。ヒト培養線維芽細胞上での綿密な培養ののちに単離され、特殊な方法により診断的使用のために精製されたウイルス材料がしばしば抗原として使用される。
【０００６】
しかしながら、感染線維芽細胞からのＶＺＶ抗原の単離はこの作業に従事する人の感染の危険を伴う。さらに、とくにウイルスが感染細胞から放出されず、したがって特殊な精製方法が要求されるので、この調製は、きわめて高価につき、時間がかかる。抗原を前もって精製することなく免疫化学的試験に使用する場合には、ＶＺＶ感染細胞を超音波処理によって破壊し、抗原はたとえば、マイクロタイトレーションプレートの被覆用に希釈したのち直接使用される。この方法では、ウイルス特異的抗原に加え、マイクロタイトレーションプレートのウエルに結合するのは主として細胞特異的抗原であることから、とくにある種の疾患たとえば自己免疫疾患に関連する細胞特異的抗原が存在する場合には、これらの細胞特異的抗原が偽陽性の結果を生じ、その結果、誤診を招くことがある。精製したウイルス糖タンパク質に基づく他の試験方法、たとえば糖タンパク質ＥＬＩＳＡは、顕著により精密な多大の損失を生じる精製を要求し、したがって、比較的大規模の免疫化学的診断試験を確立することはほとんど不可能である。糖タンパク質ＥＬＩＳＡでは、α−ヘルペスウイルスの糖タンパク質との間に存在する著しいホモロジーにより、ＨＳＶ特異的抗体との交叉反応性およびその結果としての偽陽性結果もしばしば観察される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上述の問題に対する解決の可能性の一つには、異種システム内たとえば大腸菌（E.coli）において大量に調製できる組換えタンパク質の使用がある。このシステムを使用すれば人がＶＺＶに感染する可能性はない。さらに、このシステムは特異的なウイルスタンパク質に向けられた識別診断の可能性を提供する。とくにＶＺＶタンパク質の反応性領域を、他のヘルペスウイルスに対して特異的な抗体との交叉反応性が実際上または完全に排除できる程度まで限定することが可能である。これらの条件に合致するタンパク質は、宿主特異的タンパク質、たとえば大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、または融合パートナーとして発現産物の安定性に寄与する６ヒスチジン残基から構成されるＮ−末端局在配列(Hisタグ）のいずれかとともにハイブリッドタンパク質として発現させることもできる。これらのハイブリッドタンパク質はついで、単一工程のアフィニティー精製法によって、ほぼ純粋な、したがって夾雑物を含まない形態で、診断用に使用可能な表面、たとえばＥＬＩＳＡマイクロタイトレーションプレートの被覆に直接使用することができる。上述の基準に合致するタンパク質は、ＶＺＶシステムについてはこれまで記載されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
驚くべきことに、ＶＺＶの糖タンパク質ｇｐII上に、アミノ酸位置４５０〜６５５を包含する領域内に存在する診断的に利用可能なエピトープの位置を決定することが可能であった。
したがって、本発明は、ＶＺＶのｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５を包含する領域と相同性であるか、またはｇｐIIのアミノ酸４５０〜６５５を包含する領域を実質的に含有する免疫反応性ペプチドに関する。これに関連して、好ましいペプチドは、上記領域がアミノ酸５０５〜６４７またはアミノ酸５１７〜５９７に相当するペプチドにより与えられ、とくに好ましくはアミノ酸５３５〜５８４、きわめて好ましくはアミノ酸５４５〜５８２に相当するペプチドによって与えられる。
これに関連して、ＶＺＶ株の変動により天然に変動したアミノ酸配列を示す免疫反応性ペプチドも明らかに包含されるものである。
【０００９】
本発明はさらに、本発明による上述の免疫反応性ペプチドをコードする核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡに関する。すなわち、とくに表１に示した配列を有する核酸である。しかしながら、これに加えて、上述の核酸と緊縮条件下にハイブリダイズし、ＶＺＶに対する抗体によって認識されるが他のヘルペスウイルスに対する抗体には認識されないペプチドをコードする核酸も同時に包含することを意図するものである。
【００１０】
本発明はまた、表１に示した配列を有する核酸、または緊縮条件下にハイブリダイズする上述の核酸の１種の発現によって調製できる免疫反応性ペプチドであり、すべてＶＺＶに対する抗体によって認識されるが他のヘルペスウイルスに対する抗体には認識されないという事実によって特徴づけられる免疫反応性ペプチドに関する。
【００１１】
本発明はさらに、ＶＺＶに対する抗体の検出を可能にする免疫化学的方法に関する。この方法においては、上記免疫反応性ペプチドの１種または２種以上を、ＶＺＶ特異的抗体の存在を検討する患者からのサンプルたとえば血液、血漿または血清サンプルと接触させる。ついで、サンプルからの抗体が使用した免疫反応性ペプチドに結合するか、またはこれらのペプチドと他の免疫学的関係、たとえば競合に加わるかを決定するために、当業者に周知の方法が使用される。
【００１２】
本発明はまた、核酸ハイブリダイゼーションによるＶＺＶの検出のための本発明の上述の核酸の使用に関する。
本発明はさらに、本発明の免疫反応性ペプチドからなる、ＶＺＶに対する抗体を検出するための試験キット、および本発明の核酸からなる、ＶＺＶを検出するための試験キットに関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
診断的に利用可能な免疫反応性領域の位置を決定するためには断片化された形態での糖タンパク質II（ｇｐII）の細菌システムにおける発現が使用された。ｇｐII特異的免疫応答は、ＶＺＶ感染後に最初に出現することが知られている。ｇｐＩおよびｇｐIIIに対する免疫応答の出現は、その後にのみ認められる。しかしながら、ｇｐIIの細菌における発現またはその免疫関連エピトープについての情報は、以前に存在しなかった。Ellisら（E.P.021093B1）に記載されたように、ｇｐIIの全ＯＲＦ３１をゲノムＶＺＶ ＤＮＡ（Ellen株）から増幅し、挿入されたＤＮＡフラグメントをＭＢＰハイブリッドタンパク質として発現させることができる原核細胞発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２（ＮＥＢ）にクローン化した。しかしながら、完全なＯＲＦ３１は細菌での発現には適さないことが見出された。この理由から、ＯＲＦ３１の構成領域の発現は、ｐＭＡＬシステム中において検討された。すべてのフラグメント（フラグメントサイズ４００bp〜６００bp）の場合に、相当する発現産物が検出された。２５ＶＺＶ反応性ヒト血清からなる血清プールを発現産物の反応性の検査に使用した。１種のフラグメントのみに免疫反応性が見出された。これはｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５に相同性の２０６ＡＡフラグメント（配列１）であった。免疫反応性エピトープをさらに限定するために、このフラグメントの構成領域のｐＭＡＬシステムにおける発現を行った。免疫スクリーニングの補助によって、ＡＡ５０５〜６４７（ｐＭＡＬ−４２７−ｇｐII）、ＡＡ５１７〜５９７（ｐＭＡＬ−２４０−ｇｐII）またはＡＡ５３５〜５８４（ｐＭＡＬ−１４９−ｇｐII）が免疫反応性であることが示された。ＡＡ５３５〜５８４の領域をｇｐIIの主要な免疫反応性エピトープであると類別することが可能であった。
【００１４】
配列１：ｇｐII(Ellen株）のアミノ酸残基４５０〜６５５。全部で２０６ＡＡ；理論分子量２３.５kDa。強調した領域が免疫反応性ドメインに相当する。下線を施したＡＡはDumas株と比較して置換されたＡＡである。アミノ酸番号は公表されたｇｐII配列（A.J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816, 1986）のメチオニン（開始コドン）に始まる。
Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val
Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn
Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala
Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly
Asp Val Ile Phe Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg
Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys
Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr
Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp
Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly
His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala
Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr
Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp
Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln
相当するヌクレオチド配列は表１に示す。
【００１５】
【表１】
【表２】
免疫学的試験法でこのドメインを評価するために、２０６ＡＡ長の領域をコードするｇｐII配列をベクターｐＱＥ（Qiagen）にサブクローニングした。このベクター構築体はｐＱＥ−ｇｐII*と命名した。このベクターは融合部分としてＣ末端に位置するヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）を有するので、試験すべきヒト血清の免疫反応性はもっぱらｇｐII部分に帰すことが可能であり、ＶＺＶ反応性血清の免疫試験における偽陽性の結果を排除することができる。
【００１８】
ＥＬＩＳＡ評価においては、プラスミドｐＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質はＩｇＧ診断に対し、計算カットオフ３０５（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度７１％（ｎ＝４９）、特異性１００％（ｎ＝５）、また自由に選択されたカットオフ１６０を使用した場合、感度８２％、特異性８０％を与えた。
【００１９】
別のＥＬＩＳＡ評価においてはプラスミドｐＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質がＩｇＭ診断に対し、計算カットオフ１０２（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度２３％（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）、また自由に選択されたカットオフ７０を用いた場合、感度６１.５％および特異性８０％を与えた。感度および特異性は、熟練者には周知の方法を用いて常に至適化することができる。
以下に本発明を実施例によって例示するが、これらはいかなる意味においても本発明を限定するものと考えるべきではない。
【００２０】
【実施例】
実施例１：
ウイルスＶＺＶ粒子の単離およびＤＮＡ抽出
ＶＺＶ感染線維芽細胞からのウイルス粒子の放出には超音波を使用した。ウイルスを直線スクロース勾配（２０〜７０％w/v）により細胞構成成分から精製した。ＤＮアーゼＩとインキュベートしたのち、ウイルスＤＮＡをプロテイナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で処理することによりウイルス粒子から放出させた。フェノール／クロロホルムで抽出したのち、ウイルスＤＮＡをエタノールで沈殿させた。
【００２１】
実施例２：
ＯＲＦ３１のクローニングおよび免疫反応性フラグメントのサブクローニング
ウイルスＤＮＡ(実施例１参照)を、ＯＲＦ３１の増幅用の鋳型として用いた。これはｇｐIIをコードする。増幅オリゴヌクレオチドとして以下のプライマーを使用した。
ｇｐIIＨ 5′ GGAATTCCTTCTATGTTTGTTACGGCGGTTG 3′
ｇｐIIＲ 5′ GCTCTAGAGCATTTACACCCCCGTTACATTCTCG 3′
これらのオリゴヌクレオチドは、公表された配列(A.J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816, 1986）の相当するセグメントに相補性であるが、それらの５′末端に鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしない制限切断部位配列を含有する。増幅を行ったのち、サイズ２６３０bpの増幅体を制限酵素EcoRＩおよびXbaＩにより末端で切断し、予めEcoRＩおよびXbaＩにより線状化した発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２ 中に結合した（ｐＭＡＬ−ｐ２−ＯＲＦ３１）。全ＯＲＦ３１をオーバーラップ、二方向様式で配列決定した。それはヌクレオチド位置１５５０にシトシンのチミジンによる塩基置換を有し、これがアミノ酸レベルにおいてセリンのフェニルアラニンによる置換を生じた。
【００２２】
免疫反応性領域をサブクローニングするためには、挿入領域を上述の制限酵素を使用してベクターｐＭＡＬ−ｐ２−ＯＲＦ３１から切り出し、ゲル精製し、ついでApoＩで消化した。得られた６１０bp ApoＩフラグメントを同様にゲル精製し、ベクターｐＭＡＬ−ｃ２のEcoRＩ切断部位にサブクローニングした。このベクターはｐＭＡＬ−ｇｐII*と命名された。免疫反応性を確認したのち、コード領域をベクターｐＱＥ中にサブクローニングした。このためには、６１０bpフラグメントを制限酵素SmaＩおよびHind IIIによってベクターｐＭＡＬ−ｇｐII*から切り出し、ベクターｐＱＥ３２のSmaＩ／Hind III制限切断部位にサブクローニングした。このベクターはｐＱＥ−ｇｐII*と命名された。
【００２３】
実施例３：
免疫反応性エピトープのサブクローニング
鋳型ＤＮＡとしてベクターｐＭＡＬ−ｇｐII*およびオリゴヌクレオチド：
5′ CGGGATCCCGTGTTAAAGCTCGTATTCTCGGCGACG 3′ および
5′ CCCAAGCTTTAATCCTGTATCCCGCAGCTCGTCTCT 3′、
5′ CGGGATCCGTTTCTAATTGTCCAGAACTGGGATCAG 3′ および
5′ CCCAAGCTTATACGTAGTGATGCCCAAATAGAAAA 3′ または
5′ CGGGATCCTCTATGAGGGTATCTGGTAGTACTACGCGTT 3′ および
5′ CCCAAGCTTAGCCACGCATGGTTCTAACAGATC 3'
を用いて増幅を行うことにより、４２７bpフラグメント、２４０bpフラグメントまたは１４９bpフラグメントを得ることができ、これらはそれぞれ酵素BamHＩおよびHind IIIによる制限消化に付したのち、予めBamHＩおよびHind IIIによって線状化したベクターｐＭＡＬ−ｃ２にサブクローニングした。得られた構築体はそれぞれ、ｐＭＡＬ−４２７−ｇｐII、ｐＭＡＬ−２４０−ｇｐII、およびｐＭＡＬ−１４９−ｇｐIIと命名された。
【００２４】
実施例４：
ａ）組換えタンパク質ｐＱＥ−ｇｐ II* の調製
組換えタンパク質ｐＱＥ−ｇｐIIの発現および精製は、製造業者の説明書に従い（Clontechより、Talon金属親和性樹脂、ＰＴ１３２０−１）、変性条件下に金属親和性クロマトグラフィーを用いて行った。
【００２５】
ｂ）固相Ｉ（本発明によるシステム）の調製
Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Greinerから）を、各ウエルあたり１１０μlの被覆溶液（５０mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５中４μg／mlの組換えｐＱＥ−ｇｐII）と４℃で１８時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで、各場合３００μlの洗浄溶液（５０mM Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ、pH７.０〜７.４＋０.５％ＢＳＡ）で３回洗浄した。
【００２６】
ｃ）ＶＺＶ ＩｇＧ抗体を検出するための酵素イムノアッセイ
酵素イムノアッセイで抗−ＶＺＶ ＩｇＧを検出するためには予めＰＯＤサンプル緩衝液（Behring Diagnostics GmbH, OWBE 945）中１：１００に希釈した１００μlの血清を、各場合、実施例４ｂに記載のようにして調製したマイクロタイトレーションプレートにピペットで添加し、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。
【００２７】
プレートをＰＯＤ洗浄溶液（Behring Diagnostics GmbH, OSEW 965）で３回洗浄後、微生物接合緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935)中１：５０に希釈した抗−ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ接合体(Behring Diagnostics GmbH, Ch. 243713)１００μlをピペットで加えた。１時間（３７℃）のインキュベーション後に、さらに３回洗浄工程を行った。結合したＶＺＶ抗体分子の数に直接相関関係を有する結合ペルオキシダーゼ活性をＨ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（Behring Diagnostics GmbH, OUVG 945）の添加により測定した。室温に３０分間置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸（Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965）を加えて停止させ、吸光を４５０nmで測定した。
【００２８】
抗−ＶＺＶ抗体陽性ならびに抗−ＶＺＶ抗体陰性血清を、Enzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＧ標準システム（Behring Diagnostics GmbH, OWLT 155）および本発明による酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光単位）は表２に示す。ＥＬＩＳＡで評価した場合には、精製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＧ診断に対し、計算カットオフ＝３３１（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を使用すると、感度６９％（ｎ＝５２）、特異性９４％（ｎ＝１６）、また自由に選択されたカットオフ＝３３５を使用すると、感度６９％（ｎ＝５２）、特異性１００％（ｎ＝１６）を与えた。
【００２９】
実施例５：
ＶＺＶ ＩｇＭ抗体を検出するための酵素イムノアッセイ
抗−ＶＺＶ ＩｇＭを検出するための酵素イムノアッセイは以下のように実施した。すなわち、血清を予めＰＯＤサンプル緩衝液（Behring Diagnostics GmbH, OWBE 945）中１：５０に希釈し、ついでＲＦ吸着剤（Behring Diagnostics GmbH, OUCG 945）と１：２の比率で室温において１５分間プレインキュベートした。上述のように予め希釈した血清１００μl を、実施例４ｂに記載のようにして調製したマイクロタイトレーションプレートのウエル中で、３７℃において１時間インキュベートした。
【００３０】
プレートをＰＯＤ洗浄溶液（Behring Diagnostics GmbH, OSEW 965）によって３回洗浄したのち、微生物接合緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935)中１：２５に希釈した抗−ヒトＩｇＭ／ＰＯＤ接合体(Behring Diagnostics GmbH Ch. 4241313）１００μlをピペットで加えた。１時間（＋３７℃）インキュベーションしたのち、さらに３回洗浄工程を実施した。結合したＶＺＶ抗体分子の数に直接相関関係を有する結合ペルオキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（BehringDiagnostics GmbH, OUVG 945）の添加により測定した。室温に３０分間置いたのち基質の変換を０.５Ｍ硫酸（Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965）を加えて停止させ、吸光を４５０nmで測定した。
【００３１】
抗−ＶＺＶ−陽性および抗−ＶＺＶ−陰性血清はEnzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＭ標準システム（Behring Diagnostics GmbH, OWLW 155）および本発明の酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光単位）は表３に示す。ＥＬＩＳＡで評価した場合には、精製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＭ診断に対し、計算カットオフ１０２（陰性血清の平均値＋３×標準偏差）を用いると感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）、また自由に選択されたカットオフ９６を用いると、感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）を与えた。
【００３２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【配列表】
Claims (8)
- ＶＺＶのｇｐIIの領域ＡＡ４５０〜６５５から成る免疫反応性ペプチド。
- ＶＺＶのｇｐ II の領域ＡＡ５０５〜６４７から成る免疫反応性ペプチド。
- ＶＺＶのｇｐ II の領域ＡＡ５１７〜５９７から成る免疫反応性ペプチド。
- ＶＺＶのｇｐ II の領域ＡＡ５３５〜５８４から成る免疫反応性ペプチド。
- 請求項１〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする核酸。
- 表１に示したヌクレオチド配列に相当する核酸。
- サンプル中のＶＺＶに対する抗体を検出するために請求項１〜４のいずれかに記載の免疫反応性ペプチドを使用する免疫化学的方法。
- 請求項１〜４のいずれかに記載の免疫反応性ペプチドからなるＶＺＶに対する抗体を検出するための試験キット。
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