JPH11248710A - 水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タンパク質ｇｐＩＩの免疫反応性領域 - Google Patents
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タンパク質ｇｐＩＩの免疫反応性領域Info
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- JPH11248710A JPH11248710A JP10364933A JP36493398A JPH11248710A JP H11248710 A JPH11248710 A JP H11248710A JP 10364933 A JP10364933 A JP 10364933A JP 36493398 A JP36493398 A JP 36493398A JP H11248710 A JPH11248710 A JP H11248710A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 水痘帯状疱疹ウイルスによる感染の診断方法
の確立。 【解決手段】 水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タ
ンパク質IIのアミノ酸位置４５０〜６５５を包含する領
域と相同性である免疫反応性のペプチド、好ましくはア
ミノ酸位置５０５〜６４７、５１７〜５９７、５３５〜
５８４または５４５〜５８２に相当するペプチドに関す
る。これらの免疫反応性ペプチドは水痘帯状疱疹ウイル
スによる感染の診断のための方法に使用することができ
る。
の確立。 【解決手段】 水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の糖タ
ンパク質IIのアミノ酸位置４５０〜６５５を包含する領
域と相同性である免疫反応性のペプチド、好ましくはア
ミノ酸位置５０５〜６４７、５１７〜５９７、５３５〜
５８４または５４５〜５８２に相当するペプチドに関す
る。これらの免疫反応性ペプチドは水痘帯状疱疹ウイル
スによる感染の診断のための方法に使用することができ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、水痘帯状疱疹ウイ
ルスの糖タンパク質IIのアミノ酸位置４５０〜６５５を
包含する領域と相同性である免疫反応性ペプチドに関す
る。この関連において、好ましいペプチドは、上記領域
がアミノ酸５０５〜６４７、５１７〜５９７、５３５〜
５８４または５４５〜５８２に相当するペプチドによっ
て与えられる、これらの免疫反応性ペプチドは水痘帯状
疱疹感染の診断のための方法に使用することができる。
ルスの糖タンパク質IIのアミノ酸位置４５０〜６５５を
包含する領域と相同性である免疫反応性ペプチドに関す
る。この関連において、好ましいペプチドは、上記領域
がアミノ酸５０５〜６４７、５１７〜５９７、５３５〜
５８４または５４５〜５８２に相当するペプチドによっ
て与えられる、これらの免疫反応性ペプチドは水痘帯状
疱疹感染の診断のための方法に使用することができる。
【０００２】
【従来技術】ウイルス分類国際委員会（ＩＴＣＶ）によ
れば、ＶＺＶはヘルペスウイルス科に属する。７５％の
例で一次感染は生涯の年齢１５歳までに起こり、通常は
不顕性の経過をたどる。これに反して、ウイルスとそれ
以前に接触したことがない成人の感染、および自然にま
たは治療的に免疫抑制を受けた人の場合の感染は、重篤
な症状を伴うことがある。胎児の感染も、このウイルス
は胎盤を通過することが可能で、この時点では母体の抗
体による保護が提供されないので、同様に重篤な症状を
招来する。一次感染ののち、ウイルスは生涯を通じて知
覚神経節に維持される。再活性化されると、ＶＺＶは知
覚神経節内の末梢神経に広がり、帯状疱疹を発症する。
れば、ＶＺＶはヘルペスウイルス科に属する。７５％の
例で一次感染は生涯の年齢１５歳までに起こり、通常は
不顕性の経過をたどる。これに反して、ウイルスとそれ
以前に接触したことがない成人の感染、および自然にま
たは治療的に免疫抑制を受けた人の場合の感染は、重篤
な症状を伴うことがある。胎児の感染も、このウイルス
は胎盤を通過することが可能で、この時点では母体の抗
体による保護が提供されないので、同様に重篤な症状を
招来する。一次感染ののち、ウイルスは生涯を通じて知
覚神経節に維持される。再活性化されると、ＶＺＶは知
覚神経節内の末梢神経に広がり、帯状疱疹を発症する。
【０００３】７０のオープンリーディングフレーム(Ｏ
ＲＦ)は、最近知られた糖タンパク質ｇｐＩ（ＯＲＦ６
８）、ｇｐII（ＯＲＦ３１）、ｇｐIII（ＯＲＦ３７)、
ｇｐIV（ＯＲＦ６７）、ｇｐV（ＯＲＦ１４）、および
ｇｐVI（ＯＲＦ６０）のオープンリーディングフレーム
を含めて、完全に決定され長さ１２４,８８４bpのＶＺ
Ｖゲノムヌクレオチド配列から推定できる(Dumas株；A.
J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986）。いずれの場合も、ヌクレオチド配列から推
定されるアミノ酸配列は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳ
Ｖ）の糖タンパク質、ｇＥ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＣお
よびｇＬと多かれ少なかれ顕著なホモロジーを示す。し
かしながら、配列ホモロジーから機能ホモロジーを誘導
することも可能であることを支持する根拠は全くない。
糖タンパク質ｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIIIおよびｇｐＶの
オープンリーディングフレームを確認するためには、分
子生物学的手法が用いられてきた。さらに完全に研究さ
れているＨＳＶの糖タンパク質ｇＢとは異なり、ＶＺＶ
の相同性のタンパク質、すなわちｇｐIIに関しては、利
用できるデータはほとんどない。相当する研究はｇｐII
の生合成およびウイルス中和過程に対するｇｐIIの重要
性（P.M. Kellerら、Virologie 152: 181-191,1986；M.
Masserら、J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993）に限定
されている。
ＲＦ)は、最近知られた糖タンパク質ｇｐＩ（ＯＲＦ６
８）、ｇｐII（ＯＲＦ３１）、ｇｐIII（ＯＲＦ３７)、
ｇｐIV（ＯＲＦ６７）、ｇｐV（ＯＲＦ１４）、および
ｇｐVI（ＯＲＦ６０）のオープンリーディングフレーム
を含めて、完全に決定され長さ１２４,８８４bpのＶＺ
Ｖゲノムヌクレオチド配列から推定できる(Dumas株；A.
J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986）。いずれの場合も、ヌクレオチド配列から推
定されるアミノ酸配列は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳ
Ｖ）の糖タンパク質、ｇＥ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＣお
よびｇＬと多かれ少なかれ顕著なホモロジーを示す。し
かしながら、配列ホモロジーから機能ホモロジーを誘導
することも可能であることを支持する根拠は全くない。
糖タンパク質ｇｐＩ、ｇｐII、ｇｐIIIおよびｇｐＶの
オープンリーディングフレームを確認するためには、分
子生物学的手法が用いられてきた。さらに完全に研究さ
れているＨＳＶの糖タンパク質ｇＢとは異なり、ＶＺＶ
の相同性のタンパク質、すなわちｇｐIIに関しては、利
用できるデータはほとんどない。相当する研究はｇｐII
の生合成およびウイルス中和過程に対するｇｐIIの重要
性（P.M. Kellerら、Virologie 152: 181-191,1986；M.
Masserら、J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993）に限定
されている。
【０００４】Ellisら（E.P.0210931B1）はｇｐIIに帰属
されるＯＲＦ３１を確認している。さらに、Ellisらは
ＶＺＶ感染ＭＲＣ５細胞（ヒト線維芽細胞）からのｇｐ
IIの精製、およびモルモットからのウイルス中和抗体の
調製のためのその使用を記載している。P.M. Keller
ら、Virologie 152: 181-191, 1986およびM.Masserら、
J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993は、ヒト血清のＶＺ
Ｖ特異的な抗体の力価を測定するため、ＶＺＶ感染細胞
から親和性クロマトグラフィーによって精製したとくに
ｇｐIIを使用している。カルボキシ末端領域を削除した
のちに、A.Bollen（E.P.0405867A1；US 371772）はＶＺ
Ｖワクチンを調製する目的で、ＳＦ９細胞内でバキュロ
ウイルス発現系を用いＣＨＯ細胞中での構成的発現によ
りその膜繋留部を欠くｇｐIIを発現させている。さら
に、E.H. Wasmuth & W.J. Miller（J.Med. Virol. 32:
189-193, 1990）は、ＶＺＶ感染細胞から親和性精製さ
れた糖タンパク質（ｇｐIIを含む）を糖タンパク質また
はドットＥＬＩＳＡに用いてこれらの試験方法の感度お
よび決定された抗体力価がＶＺＶ感染に対する保護に相
関する事実を証明した。しかしながら、上述の報告のい
ずれにも診断に適した規模での試験をセットアップする
ために適当な量の糖タンパク質ｇｐIIをどのようにして
調製するかの情報は全く示されていない。さらに、ｇｐ
IIもしくは、とくにｇｐIIタンパク質の免疫反応性エピ
トープの詳細な構造の研究はこれまで全く開示されてい
ない。
されるＯＲＦ３１を確認している。さらに、Ellisらは
ＶＺＶ感染ＭＲＣ５細胞（ヒト線維芽細胞）からのｇｐ
IIの精製、およびモルモットからのウイルス中和抗体の
調製のためのその使用を記載している。P.M. Keller
ら、Virologie 152: 181-191, 1986およびM.Masserら、
J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993は、ヒト血清のＶＺ
Ｖ特異的な抗体の力価を測定するため、ＶＺＶ感染細胞
から親和性クロマトグラフィーによって精製したとくに
ｇｐIIを使用している。カルボキシ末端領域を削除した
のちに、A.Bollen（E.P.0405867A1；US 371772）はＶＺ
Ｖワクチンを調製する目的で、ＳＦ９細胞内でバキュロ
ウイルス発現系を用いＣＨＯ細胞中での構成的発現によ
りその膜繋留部を欠くｇｐIIを発現させている。さら
に、E.H. Wasmuth & W.J. Miller（J.Med. Virol. 32:
189-193, 1990）は、ＶＺＶ感染細胞から親和性精製さ
れた糖タンパク質（ｇｐIIを含む）を糖タンパク質また
はドットＥＬＩＳＡに用いてこれらの試験方法の感度お
よび決定された抗体力価がＶＺＶ感染に対する保護に相
関する事実を証明した。しかしながら、上述の報告のい
ずれにも診断に適した規模での試験をセットアップする
ために適当な量の糖タンパク質ｇｐIIをどのようにして
調製するかの情報は全く示されていない。さらに、ｇｐ
IIもしくは、とくにｇｐIIタンパク質の免疫反応性エピ
トープの詳細な構造の研究はこれまで全く開示されてい
ない。
【０００５】ＶＺＶに特異的な免疫に関する状態を検査
するための方法には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体膜
抗原アッセイ（ＦＡＭＡ）および免疫蛍光試験（ＩＦ
Ｔ）から補体結合（ＣＦ）まできわめて広範囲の血清学
的方法がある。これらの方法は主として、ＶＺＶ特異的
抗体を検出する。ヒト培養線維芽細胞上での綿密な培養
ののちに単離され、特殊な方法により診断的使用のため
に精製されたウイルス材料がしばしば抗原として使用さ
れる。
するための方法には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体膜
抗原アッセイ（ＦＡＭＡ）および免疫蛍光試験（ＩＦ
Ｔ）から補体結合（ＣＦ）まできわめて広範囲の血清学
的方法がある。これらの方法は主として、ＶＺＶ特異的
抗体を検出する。ヒト培養線維芽細胞上での綿密な培養
ののちに単離され、特殊な方法により診断的使用のため
に精製されたウイルス材料がしばしば抗原として使用さ
れる。
【０００６】しかしながら、感染線維芽細胞からのＶＺ
Ｖ抗原の単離はこの作業に従事する人の感染の危険を伴
う。さらに、とくにウイルスが感染細胞から放出され
ず、したがって特殊な精製方法が要求されるので、この
調製は、きわめて高価につき、時間がかかる。抗原を前
もって精製することなく免疫化学的試験に使用する場合
には、ＶＺＶ感染細胞を超音波処理によって破壊し、抗
原はたとえば、マイクロタイトレーションプレートの被
覆用に希釈したのち直接使用される。この方法では、ウ
イルス特異的抗原に加え、マイクロタイトレーションプ
レートのウエルに結合するのは主として細胞特異的抗原
であることから、とくにある種の疾患たとえば自己免疫
疾患に関連する細胞特異的抗原が存在する場合には、こ
れらの細胞特異的抗原が偽陽性の結果を生じ、その結
果、誤診を招くことがある。精製したウイルス糖タンパ
ク質に基づく他の試験方法、たとえば糖タンパク質ＥＬ
ＩＳＡは、顕著により精密な多大の損失を生じる精製を
要求し、したがって、比較的大規模の免疫化学的診断試
験を確立することはほとんど不可能である。糖タンパク
質ＥＬＩＳＡでは、α−ヘルペスウイルスの糖タンパク
質との間に存在する著しいホモロジーにより、ＨＳＶ特
異的抗体との交叉反応性およびその結果としての偽陽性
結果もしばしば観察される。
Ｖ抗原の単離はこの作業に従事する人の感染の危険を伴
う。さらに、とくにウイルスが感染細胞から放出され
ず、したがって特殊な精製方法が要求されるので、この
調製は、きわめて高価につき、時間がかかる。抗原を前
もって精製することなく免疫化学的試験に使用する場合
には、ＶＺＶ感染細胞を超音波処理によって破壊し、抗
原はたとえば、マイクロタイトレーションプレートの被
覆用に希釈したのち直接使用される。この方法では、ウ
イルス特異的抗原に加え、マイクロタイトレーションプ
レートのウエルに結合するのは主として細胞特異的抗原
であることから、とくにある種の疾患たとえば自己免疫
疾患に関連する細胞特異的抗原が存在する場合には、こ
れらの細胞特異的抗原が偽陽性の結果を生じ、その結
果、誤診を招くことがある。精製したウイルス糖タンパ
ク質に基づく他の試験方法、たとえば糖タンパク質ＥＬ
ＩＳＡは、顕著により精密な多大の損失を生じる精製を
要求し、したがって、比較的大規模の免疫化学的診断試
験を確立することはほとんど不可能である。糖タンパク
質ＥＬＩＳＡでは、α−ヘルペスウイルスの糖タンパク
質との間に存在する著しいホモロジーにより、ＨＳＶ特
異的抗体との交叉反応性およびその結果としての偽陽性
結果もしばしば観察される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述の問題に対する解
決の可能性の一つには、異種システム内たとえば大腸菌
（E.coli）において大量に調製できる組換えタンパク質
の使用がある。このシステムを使用すれば人がＶＺＶに
感染する可能性はない。さらに、このシステムは特異的
なウイルスタンパク質に向けられた識別診断の可能性を
提供する。とくにＶＺＶタンパク質の反応性領域を、他
のヘルペスウイルスに対して特異的な抗体との交叉反応
性が実際上または完全に排除できる程度まで限定するこ
とが可能である。これらの条件に合致するタンパク質
は、宿主特異的タンパク質、たとえば大腸菌マルトース
結合タンパク質（ＭＢＰ）、または融合パートナーとし
て発現産物の安定性に寄与する６ヒスチジン残基から構
成されるＮ−末端局在配列(Hisタグ）のいずれかととも
にハイブリッドタンパク質として発現させることもでき
る。これらのハイブリッドタンパク質はついで、単一工
程のアフィニティー精製法によって、ほぼ純粋な、した
がって夾雑物を含まない形態で、診断用に使用可能な表
面、たとえばＥＬＩＳＡマイクロタイトレーションプレ
ートの被覆に直接使用することができる。上述の基準に
合致するタンパク質は、ＶＺＶシステムについてはこれ
まで記載されていない。
決の可能性の一つには、異種システム内たとえば大腸菌
（E.coli）において大量に調製できる組換えタンパク質
の使用がある。このシステムを使用すれば人がＶＺＶに
感染する可能性はない。さらに、このシステムは特異的
なウイルスタンパク質に向けられた識別診断の可能性を
提供する。とくにＶＺＶタンパク質の反応性領域を、他
のヘルペスウイルスに対して特異的な抗体との交叉反応
性が実際上または完全に排除できる程度まで限定するこ
とが可能である。これらの条件に合致するタンパク質
は、宿主特異的タンパク質、たとえば大腸菌マルトース
結合タンパク質（ＭＢＰ）、または融合パートナーとし
て発現産物の安定性に寄与する６ヒスチジン残基から構
成されるＮ−末端局在配列(Hisタグ）のいずれかととも
にハイブリッドタンパク質として発現させることもでき
る。これらのハイブリッドタンパク質はついで、単一工
程のアフィニティー精製法によって、ほぼ純粋な、した
がって夾雑物を含まない形態で、診断用に使用可能な表
面、たとえばＥＬＩＳＡマイクロタイトレーションプレ
ートの被覆に直接使用することができる。上述の基準に
合致するタンパク質は、ＶＺＶシステムについてはこれ
まで記載されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、ＶＺＶ
の糖タンパク質ｇｐII上に、アミノ酸位置４５０〜６５
５を包含する領域内に存在する診断的に利用可能なエピ
トープの位置を決定することが可能であった。したがっ
て、本発明は、ＶＺＶのｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５を
包含する領域と相同性であるか、またはｇｐIIのアミノ
酸４５０〜６５５を包含する領域を実質的に含有する免
疫反応性ペプチドに関する。これに関連して、好ましい
ペプチドは、上記領域がアミノ酸５０５〜６４７または
アミノ酸５１７〜５９７に相当するペプチドにより与え
られ、とくに好ましくはアミノ酸５３５〜５８４、きわ
めて好ましくはアミノ酸５４５〜５８２に相当するペプ
チドによって与えられる。これに関連して、ＶＺＶ株の
変動により天然に変動したアミノ酸配列を示す免疫反応
性ペプチドも明らかに包含されるものである。
の糖タンパク質ｇｐII上に、アミノ酸位置４５０〜６５
５を包含する領域内に存在する診断的に利用可能なエピ
トープの位置を決定することが可能であった。したがっ
て、本発明は、ＶＺＶのｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５を
包含する領域と相同性であるか、またはｇｐIIのアミノ
酸４５０〜６５５を包含する領域を実質的に含有する免
疫反応性ペプチドに関する。これに関連して、好ましい
ペプチドは、上記領域がアミノ酸５０５〜６４７または
アミノ酸５１７〜５９７に相当するペプチドにより与え
られ、とくに好ましくはアミノ酸５３５〜５８４、きわ
めて好ましくはアミノ酸５４５〜５８２に相当するペプ
チドによって与えられる。これに関連して、ＶＺＶ株の
変動により天然に変動したアミノ酸配列を示す免疫反応
性ペプチドも明らかに包含されるものである。
【０００９】本発明はさらに、本発明による上述の免疫
反応性ペプチドをコードする核酸、すなわちＤＮＡまた
はＲＮＡに関する。すなわち、とくに表１に示した配列
を有する核酸である。しかしながら、これに加えて、上
述の核酸と緊縮条件下にハイブリダイズし、ＶＺＶに対
する抗体によって認識されるが他のヘルペスウイルスに
対する抗体には認識されないペプチドをコードする核酸
も同時に包含することを意図するものである。
反応性ペプチドをコードする核酸、すなわちＤＮＡまた
はＲＮＡに関する。すなわち、とくに表１に示した配列
を有する核酸である。しかしながら、これに加えて、上
述の核酸と緊縮条件下にハイブリダイズし、ＶＺＶに対
する抗体によって認識されるが他のヘルペスウイルスに
対する抗体には認識されないペプチドをコードする核酸
も同時に包含することを意図するものである。
【００１０】本発明はまた、表１に示した配列を有する
核酸、または緊縮条件下にハイブリダイズする上述の核
酸の１種の発現によって調製できる免疫反応性ペプチド
であり、すべてＶＺＶに対する抗体によって認識される
が他のヘルペスウイルスに対する抗体には認識されない
という事実によって特徴づけられる免疫反応性ペプチド
に関する。
核酸、または緊縮条件下にハイブリダイズする上述の核
酸の１種の発現によって調製できる免疫反応性ペプチド
であり、すべてＶＺＶに対する抗体によって認識される
が他のヘルペスウイルスに対する抗体には認識されない
という事実によって特徴づけられる免疫反応性ペプチド
に関する。
【００１１】本発明はさらに、ＶＺＶに対する抗体の検
出を可能にする免疫化学的方法に関する。この方法にお
いては、上記免疫反応性ペプチドの１種または２種以上
を、ＶＺＶ特異的抗体の存在を検討する患者からのサン
プルたとえば血液、血漿または血清サンプルと接触させ
る。ついで、サンプルからの抗体が使用した免疫反応性
ペプチドに結合するか、またはこれらのペプチドと他の
免疫学的関係、たとえば競合に加わるかを決定するため
に、当業者に周知の方法が使用される。
出を可能にする免疫化学的方法に関する。この方法にお
いては、上記免疫反応性ペプチドの１種または２種以上
を、ＶＺＶ特異的抗体の存在を検討する患者からのサン
プルたとえば血液、血漿または血清サンプルと接触させ
る。ついで、サンプルからの抗体が使用した免疫反応性
ペプチドに結合するか、またはこれらのペプチドと他の
免疫学的関係、たとえば競合に加わるかを決定するため
に、当業者に周知の方法が使用される。
【００１２】本発明はまた、核酸ハイブリダイゼーショ
ンによるＶＺＶの検出のための本発明の上述の核酸の使
用に関する。本発明はさらに、本発明の免疫反応性ペプ
チドからなる、ＶＺＶに対する抗体を検出するための試
験キット、および本発明の核酸からなる、ＶＺＶを検出
するための試験キットに関する。
ンによるＶＺＶの検出のための本発明の上述の核酸の使
用に関する。本発明はさらに、本発明の免疫反応性ペプ
チドからなる、ＶＺＶに対する抗体を検出するための試
験キット、および本発明の核酸からなる、ＶＺＶを検出
するための試験キットに関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】診断的に利用可能な免疫反応性領
域の位置を決定するためには断片化された形態での糖タ
ンパク質II（ｇｐII）の細菌システムにおける発現が使
用された。ｇｐII特異的免疫応答は、ＶＺＶ感染後に最
初に出現することが知られている。ｇｐＩおよびｇｐII
Iに対する免疫応答の出現は、その後にのみ認められ
る。しかしながら、ｇｐIIの細菌における発現またはそ
の免疫関連エピトープについての情報は、以前に存在し
なかった。Ellisら（E.P.021093B1）に記載されたよう
に、ｇｐIIの全ＯＲＦ３１をゲノムＶＺＶ ＤＮＡ（Ell
en株）から増幅し、挿入されたＤＮＡフラグメントをＭ
ＢＰハイブリッドタンパク質として発現させることがで
きる原核細胞発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２（ＮＥＢ）に
クローン化した。しかしながら、完全なＯＲＦ３１は細
菌での発現には適さないことが見出された。この理由か
ら、ＯＲＦ３１の構成領域の発現は、ｐＭＡＬシステム
中において検討された。すべてのフラグメント（フラグ
メントサイズ４００bp〜６００bp）の場合に、相当する
発現産物が検出された。２５ＶＺＶ反応性ヒト血清から
なる血清プールを発現産物の反応性の検査に使用した。
１種のフラグメントのみに免疫反応性が見出された。こ
れはｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５に相同性の２０６ＡＡ
フラグメント（配列１）であった。免疫反応性エピトー
プをさらに限定するために、このフラグメントの構成領
域のｐＭＡＬシステムにおける発現を行った。免疫スク
リーニングの補助によって、ＡＡ５０５〜６４７（ｐＭ
ＡＬ−４２７−ｇｐII）、ＡＡ５１７〜５９７（ｐＭＡ
Ｌ−２４０−ｇｐII）またはＡＡ５３５〜５８４（ｐＭ
ＡＬ−１４９−ｇｐII）が免疫反応性であることが示さ
れた。ＡＡ５３５〜５８４の領域をｇｐIIの主要な免疫
反応性エピトープであると類別することが可能であっ
た。
域の位置を決定するためには断片化された形態での糖タ
ンパク質II（ｇｐII）の細菌システムにおける発現が使
用された。ｇｐII特異的免疫応答は、ＶＺＶ感染後に最
初に出現することが知られている。ｇｐＩおよびｇｐII
Iに対する免疫応答の出現は、その後にのみ認められ
る。しかしながら、ｇｐIIの細菌における発現またはそ
の免疫関連エピトープについての情報は、以前に存在し
なかった。Ellisら（E.P.021093B1）に記載されたよう
に、ｇｐIIの全ＯＲＦ３１をゲノムＶＺＶ ＤＮＡ（Ell
en株）から増幅し、挿入されたＤＮＡフラグメントをＭ
ＢＰハイブリッドタンパク質として発現させることがで
きる原核細胞発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２（ＮＥＢ）に
クローン化した。しかしながら、完全なＯＲＦ３１は細
菌での発現には適さないことが見出された。この理由か
ら、ＯＲＦ３１の構成領域の発現は、ｐＭＡＬシステム
中において検討された。すべてのフラグメント（フラグ
メントサイズ４００bp〜６００bp）の場合に、相当する
発現産物が検出された。２５ＶＺＶ反応性ヒト血清から
なる血清プールを発現産物の反応性の検査に使用した。
１種のフラグメントのみに免疫反応性が見出された。こ
れはｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５に相同性の２０６ＡＡ
フラグメント（配列１）であった。免疫反応性エピトー
プをさらに限定するために、このフラグメントの構成領
域のｐＭＡＬシステムにおける発現を行った。免疫スク
リーニングの補助によって、ＡＡ５０５〜６４７（ｐＭ
ＡＬ−４２７−ｇｐII）、ＡＡ５１７〜５９７（ｐＭＡ
Ｌ−２４０−ｇｐII）またはＡＡ５３５〜５８４（ｐＭ
ＡＬ−１４９−ｇｐII）が免疫反応性であることが示さ
れた。ＡＡ５３５〜５８４の領域をｇｐIIの主要な免疫
反応性エピトープであると類別することが可能であっ
た。
【００１４】配列１：ｇｐII(Ellen株）のアミノ酸残基
４５０〜６５５。全部で２０６ＡＡ；理論分子量２３.
５kDa。強調した領域が免疫反応性ドメインに相当す
る。下線を施したＡＡはDumas株と比較して置換された
ＡＡである。アミノ酸番号は公表されたｇｐII配列（A.
J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986）のメチオニン（開始コドン）に始まる。 Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly Asp Val Ile Phe Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln 相当するヌクレオチド配列は表１に示す。
４５０〜６５５。全部で２０６ＡＡ；理論分子量２３.
５kDa。強調した領域が免疫反応性ドメインに相当す
る。下線を施したＡＡはDumas株と比較して置換された
ＡＡである。アミノ酸番号は公表されたｇｐII配列（A.
J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986）のメチオニン（開始コドン）に始まる。 Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly Asp Val Ile Phe Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln 相当するヌクレオチド配列は表１に示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
【表２】
【００１７】免疫学的試験法でこのドメインを評価する
ために、２０６ＡＡ長の領域をコードするｇｐII配列を
ベクターｐＱＥ（Qiagen）にサブクローニングした。こ
のベクター構築体はｐＱＥ−ｇｐII*と命名した。この
ベクターは融合部分としてＣ末端に位置するヒスチジン
タグ（６×Ｈｉｓ）を有するので、試験すべきヒト血清
の免疫反応性はもっぱらｇｐII部分に帰すことが可能で
あり、ＶＺＶ反応性血清の免疫試験における偽陽性の結
果を排除することができる。
ために、２０６ＡＡ長の領域をコードするｇｐII配列を
ベクターｐＱＥ（Qiagen）にサブクローニングした。こ
のベクター構築体はｐＱＥ−ｇｐII*と命名した。この
ベクターは融合部分としてＣ末端に位置するヒスチジン
タグ（６×Ｈｉｓ）を有するので、試験すべきヒト血清
の免疫反応性はもっぱらｇｐII部分に帰すことが可能で
あり、ＶＺＶ反応性血清の免疫試験における偽陽性の結
果を排除することができる。
【００１８】ＥＬＩＳＡ評価においては、プラスミドｐ
ＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質は
ＩｇＧ診断に対し、計算カットオフ３０５（陰性血清の
平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度７１％（ｎ
＝４９）、特異性１００％（ｎ＝５）、また自由に選択
されたカットオフ１６０を使用した場合、感度８２％、
特異性８０％を与えた。
ＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質は
ＩｇＧ診断に対し、計算カットオフ３０５（陰性血清の
平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度７１％（ｎ
＝４９）、特異性１００％（ｎ＝５）、また自由に選択
されたカットオフ１６０を使用した場合、感度８２％、
特異性８０％を与えた。
【００１９】別のＥＬＩＳＡ評価においてはプラスミド
ｐＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質
がＩｇＭ診断に対し、計算カットオフ１０２（陰性血清
の平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度２３％
（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）、また自由
に選択されたカットオフ７０を用いた場合、感度６１.
５％および特異性８０％を与えた。感度および特異性
は、熟練者には周知の方法を用いて常に至適化すること
ができる。以下に本発明を実施例によって例示するが、
これらはいかなる意味においても本発明を限定するもの
と考えるべきではない。
ｐＱＥ−ｇｐII*によってコードされる精製タンパク質
がＩｇＭ診断に対し、計算カットオフ１０２（陰性血清
の平均値＋３×標準偏差）を用いた場合、感度２３％
（ｎ＝１３）、特異性１００％（ｎ＝４１）、また自由
に選択されたカットオフ７０を用いた場合、感度６１.
５％および特異性８０％を与えた。感度および特異性
は、熟練者には周知の方法を用いて常に至適化すること
ができる。以下に本発明を実施例によって例示するが、
これらはいかなる意味においても本発明を限定するもの
と考えるべきではない。
【００２０】
【実施例】実施例１：ウイルスＶＺＶ粒子の単離およびＤＮＡ抽出 ＶＺＶ感染線維芽細胞からのウイルス粒子の放出には超
音波を使用した。ウイルスを直線スクロース勾配（２０
〜７０％w/v）により細胞構成成分から精製した。ＤＮ
アーゼＩとインキュベートしたのち、ウイルスＤＮＡを
プロテイナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）で処理することによりウイルス粒子から放出させ
た。フェノール／クロロホルムで抽出したのち、ウイル
スＤＮＡをエタノールで沈殿させた。
音波を使用した。ウイルスを直線スクロース勾配（２０
〜７０％w/v）により細胞構成成分から精製した。ＤＮ
アーゼＩとインキュベートしたのち、ウイルスＤＮＡを
プロテイナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）で処理することによりウイルス粒子から放出させ
た。フェノール／クロロホルムで抽出したのち、ウイル
スＤＮＡをエタノールで沈殿させた。
【００２１】実施例２：ＯＲＦ３１のクローニングおよび免疫反応性フラグメン
トのサブクローニング ウイルスＤＮＡ(実施例１参照)を、ＯＲＦ３１の増幅用
の鋳型として用いた。これはｇｐIIをコードする。増幅
オリゴヌクレオチドとして以下のプライマーを使用し
た。 ｇｐIIＨ 5′ GGAATTCCTTCTATGTTTGTTACGGCGGTTG 3′ ｇｐIIＲ 5′ GCTCTAGAGCATTTACACCCCCGTTACATTCTCG 3′ これらのオリゴヌクレオチドは、公表された配列(A.J.
Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816,
1986）の相当するセグメントに相補性であるが、それ
らの５′末端に鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしない制限
切断部位配列を含有する。増幅を行ったのち、サイズ２
６３０bpの増幅体を制限酵素EcoRＩおよびXbaＩにより
末端で切断し、予めEcoRＩおよびXbaＩにより線状化し
た発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２ 中に結合した（ｐＭＡ
Ｌ−ｐ２−ＯＲＦ３１）。全ＯＲＦ３１をオーバーラッ
プ、二方向様式で配列決定した。それはヌクレオチド位
置１５５０にシトシンのチミジンによる塩基置換を有
し、これがアミノ酸レベルにおいてセリンのフェニルア
ラニンによる置換を生じた。
トのサブクローニング ウイルスＤＮＡ(実施例１参照)を、ＯＲＦ３１の増幅用
の鋳型として用いた。これはｇｐIIをコードする。増幅
オリゴヌクレオチドとして以下のプライマーを使用し
た。 ｇｐIIＨ 5′ GGAATTCCTTCTATGTTTGTTACGGCGGTTG 3′ ｇｐIIＲ 5′ GCTCTAGAGCATTTACACCCCCGTTACATTCTCG 3′ これらのオリゴヌクレオチドは、公表された配列(A.J.
Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816,
1986）の相当するセグメントに相補性であるが、それ
らの５′末端に鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしない制限
切断部位配列を含有する。増幅を行ったのち、サイズ２
６３０bpの増幅体を制限酵素EcoRＩおよびXbaＩにより
末端で切断し、予めEcoRＩおよびXbaＩにより線状化し
た発現ベクターｐＭＡＬ−ｐ２ 中に結合した（ｐＭＡ
Ｌ−ｐ２−ＯＲＦ３１）。全ＯＲＦ３１をオーバーラッ
プ、二方向様式で配列決定した。それはヌクレオチド位
置１５５０にシトシンのチミジンによる塩基置換を有
し、これがアミノ酸レベルにおいてセリンのフェニルア
ラニンによる置換を生じた。
【００２２】免疫反応性領域をサブクローニングするた
めには、挿入領域を上述の制限酵素を使用してベクター
ｐＭＡＬ−ｐ２−ＯＲＦ３１から切り出し、ゲル精製
し、ついでApoＩで消化した。得られた６１０bp ApoＩ
フラグメントを同様にゲル精製し、ベクターｐＭＡＬ−
ｃ２のEcoRＩ切断部位にサブクローニングした。このベ
クターはｐＭＡＬ−ｇｐII*と命名された。免疫反応性
を確認したのち、コード領域をベクターｐＱＥ中にサブ
クローニングした。このためには、６１０bpフラグメン
トを制限酵素SmaＩおよびHind IIIによってベクターｐ
ＭＡＬ−ｇｐII*から切り出し、ベクターｐＱＥ３２のS
maＩ／Hind III制限切断部位にサブクローニングした。
このベクターはｐＱＥ−ｇｐII*と命名された。
めには、挿入領域を上述の制限酵素を使用してベクター
ｐＭＡＬ−ｐ２−ＯＲＦ３１から切り出し、ゲル精製
し、ついでApoＩで消化した。得られた６１０bp ApoＩ
フラグメントを同様にゲル精製し、ベクターｐＭＡＬ−
ｃ２のEcoRＩ切断部位にサブクローニングした。このベ
クターはｐＭＡＬ−ｇｐII*と命名された。免疫反応性
を確認したのち、コード領域をベクターｐＱＥ中にサブ
クローニングした。このためには、６１０bpフラグメン
トを制限酵素SmaＩおよびHind IIIによってベクターｐ
ＭＡＬ−ｇｐII*から切り出し、ベクターｐＱＥ３２のS
maＩ／Hind III制限切断部位にサブクローニングした。
このベクターはｐＱＥ−ｇｐII*と命名された。
【００２３】実施例３：免疫反応性エピトープのサブクローニング 鋳型ＤＮＡとしてベクターｐＭＡＬ−ｇｐII*およびオ
リゴヌクレオチド： 5′ CGGGATCCCGTGTTAAAGCTCGTATTCTCGGCGACG 3′ および 5′ CCCAAGCTTTAATCCTGTATCCCGCAGCTCGTCTCT 3′、 5′ CGGGATCCGTTTCTAATTGTCCAGAACTGGGATCAG 3′ および 5′ CCCAAGCTTATACGTAGTGATGCCCAAATAGAAAA 3′ または 5′ CGGGATCCTCTATGAGGGTATCTGGTAGTACTACGCGTT 3′ および 5′ CCCAAGCTTAGCCACGCATGGTTCTAACAGATC 3' を用いて増幅を行うことにより、４２７bpフラグメン
ト、２４０bpフラグメントまたは１４９bpフラグメント
を得ることができ、これらはそれぞれ酵素BamHＩおよび
Hind IIIによる制限消化に付したのち、予めBamHＩおよ
びHind IIIによって線状化したベクターｐＭＡＬ−ｃ２
にサブクローニングした。得られた構築体はそれぞれ、
ｐＭＡＬ−４２７−ｇｐII、ｐＭＡＬ−２４０−ｇｐI
I、およびｐＭＡＬ−１４９−ｇｐIIと命名された。
リゴヌクレオチド： 5′ CGGGATCCCGTGTTAAAGCTCGTATTCTCGGCGACG 3′ および 5′ CCCAAGCTTTAATCCTGTATCCCGCAGCTCGTCTCT 3′、 5′ CGGGATCCGTTTCTAATTGTCCAGAACTGGGATCAG 3′ および 5′ CCCAAGCTTATACGTAGTGATGCCCAAATAGAAAA 3′ または 5′ CGGGATCCTCTATGAGGGTATCTGGTAGTACTACGCGTT 3′ および 5′ CCCAAGCTTAGCCACGCATGGTTCTAACAGATC 3' を用いて増幅を行うことにより、４２７bpフラグメン
ト、２４０bpフラグメントまたは１４９bpフラグメント
を得ることができ、これらはそれぞれ酵素BamHＩおよび
Hind IIIによる制限消化に付したのち、予めBamHＩおよ
びHind IIIによって線状化したベクターｐＭＡＬ−ｃ２
にサブクローニングした。得られた構築体はそれぞれ、
ｐＭＡＬ−４２７−ｇｐII、ｐＭＡＬ−２４０−ｇｐI
I、およびｐＭＡＬ−１４９−ｇｐIIと命名された。
【００２４】実施例４：ａ）組換えタンパク質ｐＱＥ−ｇｐII*の調製 組換えタンパク質ｐＱＥ−ｇｐIIの発現および精製は、
製造業者の説明書に従い（Clontechより、Talon金属親
和性樹脂、ＰＴ１３２０−１）、変性条件下に金属親和
性クロマトグラフィーを用いて行った。
製造業者の説明書に従い（Clontechより、Talon金属親
和性樹脂、ＰＴ１３２０−１）、変性条件下に金属親和
性クロマトグラフィーを用いて行った。
【００２５】ｂ）固相Ｉ（本発明によるシステム）の調
製 Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Greinerか
ら）を、各ウエルあたり１１０μlの被覆溶液（５０mM
炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５中４μg／mlの組換えｐ
ＱＥ−ｇｐII）と４℃で１８時間インキュベートした。
マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで、
各場合３００μlの洗浄溶液（５０mM Ｔｒｉｓ／ＥＤＴ
Ａ、pH７.０〜７.４＋０.５％ＢＳＡ）で３回洗浄し
た。
製 Ｂ型マイクロタイトレーションプレート（Greinerか
ら）を、各ウエルあたり１１０μlの被覆溶液（５０mM
炭酸ナトリウム緩衝液、pH９.５中４μg／mlの組換えｐ
ＱＥ−ｇｐII）と４℃で１８時間インキュベートした。
マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで、
各場合３００μlの洗浄溶液（５０mM Ｔｒｉｓ／ＥＤＴ
Ａ、pH７.０〜７.４＋０.５％ＢＳＡ）で３回洗浄し
た。
【００２６】ｃ）ＶＺＶ ＩｇＧ抗体を検出するための
酵素イムノアッセイ 酵素イムノアッセイで抗−ＶＺＶ ＩｇＧを検出するた
めには予めＰＯＤサンプル緩衝液（Behring Diagnostic
s GmbH, OWBE 945）中１：１００に希釈した１００μl
の血清を、各場合、実施例４ｂに記載のようにして調製
したマイクロタイトレーションプレートにピペットで添
加し、このプレートを３７℃で１時間インキュベートし
た。
酵素イムノアッセイ 酵素イムノアッセイで抗−ＶＺＶ ＩｇＧを検出するた
めには予めＰＯＤサンプル緩衝液（Behring Diagnostic
s GmbH, OWBE 945）中１：１００に希釈した１００μl
の血清を、各場合、実施例４ｂに記載のようにして調製
したマイクロタイトレーションプレートにピペットで添
加し、このプレートを３７℃で１時間インキュベートし
た。
【００２７】プレートをＰＯＤ洗浄溶液（Behring Diag
nostics GmbH, OSEW 965）で３回洗浄後、微生物接合緩
衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935)中１：５０
に希釈した抗−ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ接合体(Behring Dia
gnostics GmbH, Ch. 243713)１００μlをピペットで加
えた。１時間（３７℃）のインキュベーション後に、さ
らに３回洗浄工程を行った。結合したＶＺＶ抗体分子の
数に直接相関関係を有する結合ペルオキシダーゼ活性を
Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（Behring Diagnostic
s GmbH, OUVG 945）の添加により測定した。室温に３０
分間置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸（Behring D
iagnostics GmbH, OSFA 965）を加えて停止させ、吸光
を４５０nmで測定した。
nostics GmbH, OSEW 965）で３回洗浄後、微生物接合緩
衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935)中１：５０
に希釈した抗−ヒトＩｇＧ／ＰＯＤ接合体(Behring Dia
gnostics GmbH, Ch. 243713)１００μlをピペットで加
えた。１時間（３７℃）のインキュベーション後に、さ
らに３回洗浄工程を行った。結合したＶＺＶ抗体分子の
数に直接相関関係を有する結合ペルオキシダーゼ活性を
Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン（Behring Diagnostic
s GmbH, OUVG 945）の添加により測定した。室温に３０
分間置いたのち、基質の変換を０.５Ｍ硫酸（Behring D
iagnostics GmbH, OSFA 965）を加えて停止させ、吸光
を４５０nmで測定した。
【００２８】抗−ＶＺＶ抗体陽性ならびに抗−ＶＺＶ抗
体陰性血清を、Enzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＧ標準シス
テム（Behring Diagnostics GmbH, OWLT 155）および本
発明による酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討
結果（吸光単位）は表２に示す。ＥＬＩＳＡで評価した
場合には、精製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＧ診
断に対し、計算カットオフ＝３３１（陰性血清の平均値
＋３×標準偏差）を使用すると、感度６９％（ｎ＝５
２）、特異性９４％（ｎ＝１６）、また自由に選択され
たカットオフ＝３３５を使用すると、感度６９％（ｎ＝
５２）、特異性１００％（ｎ＝１６）を与えた。
体陰性血清を、Enzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＧ標準シス
テム（Behring Diagnostics GmbH, OWLT 155）および本
発明による酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討
結果（吸光単位）は表２に示す。ＥＬＩＳＡで評価した
場合には、精製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＧ診
断に対し、計算カットオフ＝３３１（陰性血清の平均値
＋３×標準偏差）を使用すると、感度６９％（ｎ＝５
２）、特異性９４％（ｎ＝１６）、また自由に選択され
たカットオフ＝３３５を使用すると、感度６９％（ｎ＝
５２）、特異性１００％（ｎ＝１６）を与えた。
【００２９】実施例５：ＶＺＶ ＩｇＭ抗体を検出するための酵素イムノアッセ
イ 抗−ＶＺＶ ＩｇＭを検出するための酵素イムノアッセ
イは以下のように実施した。すなわち、血清を予めＰＯ
Ｄサンプル緩衝液（Behring Diagnostics GmbH, OWBE 9
45）中１：５０に希釈し、ついでＲＦ吸着剤（Behring
Diagnostics GmbH, OUCG 945）と１：２の比率で室温に
おいて１５分間プレインキュベートした。上述のように
予め希釈した血清１００μl を、実施例４ｂに記載のよ
うにして調製したマイクロタイトレーションプレートの
ウエル中で、３７℃において１時間インキュベートし
た。
イ 抗−ＶＺＶ ＩｇＭを検出するための酵素イムノアッセ
イは以下のように実施した。すなわち、血清を予めＰＯ
Ｄサンプル緩衝液（Behring Diagnostics GmbH, OWBE 9
45）中１：５０に希釈し、ついでＲＦ吸着剤（Behring
Diagnostics GmbH, OUCG 945）と１：２の比率で室温に
おいて１５分間プレインキュベートした。上述のように
予め希釈した血清１００μl を、実施例４ｂに記載のよ
うにして調製したマイクロタイトレーションプレートの
ウエル中で、３７℃において１時間インキュベートし
た。
【００３０】プレートをＰＯＤ洗浄溶液（Behring Diag
nostics GmbH, OSEW 965）によって３回洗浄したのち、
微生物接合緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 93
5)中１：２５に希釈した抗−ヒトＩｇＭ／ＰＯＤ接合体
(Behring Diagnostics GmbHCh. 4241313）１００μlを
ピペットで加えた。１時間（＋３７℃）インキュベーシ
ョンしたのち、さらに３回洗浄工程を実施した。結合し
たＶＺＶ抗体分子の数に直接相関関係を有する結合ペル
オキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン
（BehringDiagnostics GmbH, OUVG 945）の添加により
測定した。室温に３０分間置いたのち基質の変換を０.
５Ｍ硫酸（Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965）を加
えて停止させ、吸光を４５０nmで測定した。
nostics GmbH, OSEW 965）によって３回洗浄したのち、
微生物接合緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 93
5)中１：２５に希釈した抗−ヒトＩｇＭ／ＰＯＤ接合体
(Behring Diagnostics GmbHCh. 4241313）１００μlを
ピペットで加えた。１時間（＋３７℃）インキュベーシ
ョンしたのち、さらに３回洗浄工程を実施した。結合し
たＶＺＶ抗体分子の数に直接相関関係を有する結合ペル
オキシダーゼ活性を、Ｈ2Ｏ2／テトラメチルベンジジン
（BehringDiagnostics GmbH, OUVG 945）の添加により
測定した。室温に３０分間置いたのち基質の変換を０.
５Ｍ硫酸（Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965）を加
えて停止させ、吸光を４５０nmで測定した。
【００３１】抗−ＶＺＶ−陽性および抗−ＶＺＶ−陰性
血清はEnzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＭ標準システム（Beh
ring Diagnostics GmbH, OWLW 155）および本発明の酵
素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光単
位）は表３に示す。ＥＬＩＳＡで評価した場合には、精
製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＭ診断に対し、計
算カットオフ１０２（陰性血清の平均値＋３×標準偏
差）を用いると感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００
％（ｎ＝４１）、また自由に選択されたカットオフ９６
を用いると、感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００％
（ｎ＝４１）を与えた。
血清はEnzygnost抗−ＶＺＶ／ＩｇＭ標準システム（Beh
ring Diagnostics GmbH, OWLW 155）および本発明の酵
素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果（吸光単
位）は表３に示す。ＥＬＩＳＡで評価した場合には、精
製ｐＱＥ−ｇｐII*タンパク質はＩｇＭ診断に対し、計
算カットオフ１０２（陰性血清の平均値＋３×標準偏
差）を用いると感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００
％（ｎ＝４１）、また自由に選択されたカットオフ９６
を用いると、感度３８％（ｎ＝１３）、特異性１００％
（ｎ＝４１）を与えた。
【００３２】
【表３】
【００３３】
【表４】
【００３４】
【表５】
【００３５】
【表６】
【００３６】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２０６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 ハイポセティカル：Ｙｅｓ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val 1 5 10 15 Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn 20 25 30 Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala 35 40 45 Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly 50 55 60 Asp Val Ile Ser Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg 65 70 75 80 Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys 85 90 95 Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp 115 120 125 Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly 130 135 140 His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala 145 150 155 160 Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln 195 200 205 配列番号：２ 配列の長さ：６１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） ハイポセティカル：Ｙｅｓ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： GAATTTGCTA TGCTCCAGTT TACATATGAC CACATTCAAG AGCATGTTAA TGAAATGTTG 60 GCACGTATCT CCTCGTCGTG GTGCCAGCTA CAAAATCGCG AACGCGCCCT TTGGAGCGGA 120 CTATTTCCAA TTAACCCAAG TGCTTTAGCG AGCACCATTT TGGATCAACG TGTTAAAGCT 180 CGTATTCTCG GCGACGTTAT CTTCGTTTCT AATTGTCCAG AACTGGGATC AGATACACGC 240 ATTATACTTC AAAACTCTAT GAGGGTATCT GGTAGTACTA CGCGTTGTTA TAGCCGTCCT 300 TTAATTTCAA TAGTTAGTTT AAATGGGTCC GGGACGGTGG AGGGCCAGCT TGGAACAGAT 360 AACGAGTTAA TTATGTCCAG AGATCTGTTA GAACCATGCG TGGCTAATCA CAAGCGATAT 420 TTTCTATTTG GGCATCACTA CGTATATTAT GAGGATTATC GTTACGTCCG TGAAATCGCA 480 GTCCATGATG TGGGAATGAT TAGCACTTAC GTAGATTTAA ACTTAACACT TCTTAAAGAT 540 AGAGAGTTTA TGCCGCTGCA AGTATATACA AGAGACGAGC TGCGGGATAC AGGATTACTA 600 GACTACAGTG AAATTCAA 618 配列番号：３ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： GGAATTCCTT CTATGTTTGT TACGGCGGTT G 31 配列番号：４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源：生物名：水痘帯状疱疹ウイルス ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： GCTCTAGAGC ATTTACACCC CCGTTACATT CTCG 34 配列番号：５ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： CGGGATCCCG TGTTAAAGCT CGTATTCTCG GCGACG 36 配列番号：６ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： CCCAAGCTTT AATCCTGTAT CCCGCAGCTC GTCTCT 36 配列番号：７ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： CGGGATCCGT TTCTAATTGT CCAGAACTGG GATCAG 36 配列番号：８ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： CCCAAGCTTA TACGTAGTGA TGCCCAAATA GAAAA 35 配列番号：９ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： CGGGATCCTC TATGAGGGTA TCTGGTAGTA CTACGCGTT 39 配列番号：１０ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） ハイポセティカル：Ｎｏ 起源： 生物名：水痘帯状疱疹ウイルス 株名：Ｅｌｌｅｎ ゲノム内での位置 染色体上の位置：ＯＲＦ３１ 配列： CCCAAGCTTA GCCACGCATG GTTCTAACAG ATC 33
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 クラウス・ラートザク ドイツ連邦共和国35037マルブルク．ウー フアーシユトラーセ14 (72)発明者 ハンス−ペーター・ハウザー ドイツ連邦共和国35041エルンハウゼン. フオイアードルンヴエーク６ (72)発明者 ベルンハルト・ギーゼンドルフ ドイツ連邦共和国35041ミヒエルバハ．エ ーヴイゲスタール24
Claims (14)
- 【請求項１】 ＶＺＶのｇｐIIのＡＡ４５０〜６５５を
包含する領域と相同性である免疫反応性ペプチド。 - 【請求項２】 実質的にＶＺＶのｇｐIIのＡＡ４５０〜
６５５を包含する領域からなる免疫反応性ペプチド。 - 【請求項３】 領域はＡＡ５０５〜６４７に相当する請
求項１または２のいずれかに記載の免疫反応性ペプチ
ド。 - 【請求項４】 領域はＡＡ５１７〜５９７に相当する請
求項３記載の免疫反応性ペプチド。 - 【請求項５】 領域はＡＡ５３５〜５８４に相当する請
求項４記載の免疫反応性ペプチド。 - 【請求項６】 領域はＡＡ５４５〜５８２に相当する請
求項５記載の免疫反応性ペプチド。 - 【請求項７】 請求項９または１０のいずれかに記載の
核酸を発現させることによって調製できる免疫反応性ペ
プチド。 - 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載のアミノ
酸配列をコードする核酸。 - 【請求項９】 表１に示したヌクレオチド配列に相当す
る核酸。 - 【請求項１０】 請求項８または９のいずれかに記載の
核酸と緊縮条件下にハイブリダイズし、ＶＺＶに対する
抗体によって認識されるが、他のヘルペスウイルスに対
する抗体によっては認識されないペプチドをコードする
核酸。 - 【請求項１１】 サンプル中のＶＺＶに対する抗体を検
出するために請求項１〜７のいずれかに記載の免疫反応
性ペプチドを使用する免疫化学的方法。 - 【請求項１２】 核酸ハイブリダイゼーションによって
ＶＺＶを検出するための請求項８〜１０のいずれかに記
載の核酸の使用。 - 【請求項１３】 請求項１〜７のいずれかに記載の免疫
反応性ペプチドからなるＶＺＶに対する抗体を検出する
ための試験キット。 - 【請求項１４】 請求項８〜１０のいずれかに記載の核
酸からなるＶＺＶを検出するための試験キット。
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