JPH11248710A - Immunoreactive region of glycoprotein gpii of varicella herpes zoster virus (vzv) - Google Patents
Immunoreactive region of glycoprotein gpii of varicella herpes zoster virus (vzv)Info
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- JPH11248710A JPH11248710A JP10364933A JP36493398A JPH11248710A JP H11248710 A JPH11248710 A JP H11248710A JP 10364933 A JP10364933 A JP 10364933A JP 36493398 A JP36493398 A JP 36493398A JP H11248710 A JPH11248710 A JP H11248710A
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Abstract
Description
【0001】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、水痘帯状疱疹ウイ
ルスの糖タンパク質IIのアミノ酸位置450〜655を
包含する領域と相同性である免疫反応性ペプチドに関す
る。この関連において、好ましいペプチドは、上記領域
がアミノ酸505〜647、517〜597、535〜
584または545〜582に相当するペプチドによっ
て与えられる、これらの免疫反応性ペプチドは水痘帯状
疱疹感染の診断のための方法に使用することができる。The present invention relates to an immunoreactive peptide which is homologous to the region encompassing amino acid positions 450 to 655 of varicella-zoster virus glycoprotein II. In this context, preferred peptides are those wherein the region is amino acids 505-647, 517-597, 535-535.
These immunoreactive peptides, provided by peptides corresponding to 584 or 545 to 582, can be used in methods for the diagnosis of varicella-zoster infection.
【0002】[0002]
【従来技術】ウイルス分類国際委員会(ITCV)によ
れば、VZVはヘルペスウイルス科に属する。75%の
例で一次感染は生涯の年齢15歳までに起こり、通常は
不顕性の経過をたどる。これに反して、ウイルスとそれ
以前に接触したことがない成人の感染、および自然にま
たは治療的に免疫抑制を受けた人の場合の感染は、重篤
な症状を伴うことがある。胎児の感染も、このウイルス
は胎盤を通過することが可能で、この時点では母体の抗
体による保護が提供されないので、同様に重篤な症状を
招来する。一次感染ののち、ウイルスは生涯を通じて知
覚神経節に維持される。再活性化されると、VZVは知
覚神経節内の末梢神経に広がり、帯状疱疹を発症する。BACKGROUND OF THE INVENTION According to the International Commission on Virus Classification (ITCV), VZV belongs to the family Herpesviridae. In 75% of cases, primary infection occurs by age 15 years of life and usually follows a subclinical course. In contrast, infections in adults who have not previously been in contact with the virus, and in those who have been naturally or therapeutically immunosuppressed, can be severe. Fetal infection also results in severe symptoms, as the virus is capable of crossing the placenta and does not provide maternal antibody protection at this point. After primary infection, the virus is maintained in sensory ganglia throughout life. When reactivated, VZV spreads to peripheral nerves in sensory ganglia, causing shingles.
【0003】70のオープンリーディングフレーム(O
RF)は、最近知られた糖タンパク質gpI(ORF6
8)、gpII(ORF31)、gpIII(ORF37)、
gpIV(ORF67)、gpV(ORF14)、および
gpVI(ORF60)のオープンリーディングフレーム
を含めて、完全に決定され長さ124,884bpのVZ
Vゲノムヌクレオチド配列から推定できる(Dumas株;A.
J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986)。いずれの場合も、ヌクレオチド配列から推
定されるアミノ酸配列は、単純ヘルペスウイルス(HS
V)の糖タンパク質、gE、gB、gH、gI、gCお
よびgLと多かれ少なかれ顕著なホモロジーを示す。し
かしながら、配列ホモロジーから機能ホモロジーを誘導
することも可能であることを支持する根拠は全くない。
糖タンパク質gpI、gpII、gpIIIおよびgpVの
オープンリーディングフレームを確認するためには、分
子生物学的手法が用いられてきた。さらに完全に研究さ
れているHSVの糖タンパク質gBとは異なり、VZV
の相同性のタンパク質、すなわちgpIIに関しては、利
用できるデータはほとんどない。相当する研究はgpII
の生合成およびウイルス中和過程に対するgpIIの重要
性(P.M. Kellerら、Virologie 152: 181-191,1986;M.
Masserら、J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993)に限定
されている。[0003] 70 open reading frames (O
RF) is a recently known glycoprotein gpI (ORF6
8), gpII (ORF31), gpIII (ORF37),
A fully determined VZ of 124,884 bp in length, including the open reading frames of gpIV (ORF67), gpV (ORF14), and gpVI (ORF60).
V genome nucleotide sequence (Dumas strain;
J. Davison & JE Scott, J. Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986). In each case, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is the herpes simplex virus (HS)
V) shows more or less pronounced homology with the glycoproteins of gE, gB, gH, gI, gC and gL. However, there is no basis to support that functional homology can be derived from sequence homology.
Molecular biology techniques have been used to confirm the open reading frames of glycoproteins gpI, gpII, gpIII and gpV. Unlike the more fully studied HSV glycoprotein gB, VZV
Few data are available for a protein of homology to gpII. The corresponding study is gpII
Importance of gpII on the biosynthesis and virus neutralization processes of PM (PM Keller et al., Virologie 152: 181-191, 1986;
Masser et al., J. Gen. Virol. 74: 491-494, 1993).
【0004】Ellisら(E.P.0210931B1)はgpIIに帰属
されるORF31を確認している。さらに、Ellisらは
VZV感染MRC5細胞(ヒト線維芽細胞)からのgp
IIの精製、およびモルモットからのウイルス中和抗体の
調製のためのその使用を記載している。P.M. Keller
ら、Virologie 152: 181-191, 1986およびM.Masserら、
J.Gen. Virol. 74: 491-494, 1993は、ヒト血清のVZ
V特異的な抗体の力価を測定するため、VZV感染細胞
から親和性クロマトグラフィーによって精製したとくに
gpIIを使用している。カルボキシ末端領域を削除した
のちに、A.Bollen(E.P.0405867A1;US 371772)はVZ
Vワクチンを調製する目的で、SF9細胞内でバキュロ
ウイルス発現系を用いCHO細胞中での構成的発現によ
りその膜繋留部を欠くgpIIを発現させている。さら
に、E.H. Wasmuth & W.J. Miller(J.Med. Virol. 32:
189-193, 1990)は、VZV感染細胞から親和性精製さ
れた糖タンパク質(gpIIを含む)を糖タンパク質また
はドットELISAに用いてこれらの試験方法の感度お
よび決定された抗体力価がVZV感染に対する保護に相
関する事実を証明した。しかしながら、上述の報告のい
ずれにも診断に適した規模での試験をセットアップする
ために適当な量の糖タンパク質gpIIをどのようにして
調製するかの情報は全く示されていない。さらに、gp
IIもしくは、とくにgpIIタンパク質の免疫反応性エピ
トープの詳細な構造の研究はこれまで全く開示されてい
ない。[0004] Ellis et al. (EP0210931B1) have identified an ORF31 assigned to gpII. In addition, Ellis et al. Reported gp from VZV infected MRC5 cells (human fibroblasts).
The purification of II and its use for the preparation of virus neutralizing antibodies from guinea pigs is described. PM Keller
Virologie 152: 181-191, 1986 and M. Masser et al.
J. Gen. Virol. 74: 491-494, 1993 describes VZ of human serum.
To determine the titer of V-specific antibodies, gpII was used, especially purified by affinity chromatography from VZV infected cells. After deleting the carboxy terminal region, A. Bollen (EP0405867A1; US 371772)
For the purpose of preparing a V vaccine, gpII lacking its membrane anchor is expressed by constitutive expression in CHO cells using a baculovirus expression system in SF9 cells. Further, EH Wasmuth & WJ Miller (J. Med. Virol. 32:
189-193, 1990) use glycoproteins (including gpII) affinity purified from VZV-infected cells for glycoprotein or dot ELISA to determine the sensitivity of these test methods and the determined antibody titers against VZV infection. Demonstrated facts correlated with protection. However, none of the above reports provide any information on how to prepare an appropriate amount of glycoprotein gpII to set up a test on a diagnostically suitable scale. Furthermore, gp
No studies of the detailed structure of the immunoreactive epitope of II or especially of the gpII protein have been disclosed at all.
【0005】VZVに特異的な免疫に関する状態を検査
するための方法には、ラジオイムノアッセイ(RI
A)、固相酵素免疫測定法(ELISA)、蛍光抗体膜
抗原アッセイ(FAMA)および免疫蛍光試験(IF
T)から補体結合(CF)まできわめて広範囲の血清学
的方法がある。これらの方法は主として、VZV特異的
抗体を検出する。ヒト培養線維芽細胞上での綿密な培養
ののちに単離され、特殊な方法により診断的使用のため
に精製されたウイルス材料がしばしば抗原として使用さ
れる。[0005] Methods for examining the status of immunity specific to VZV include radioimmunoassay (RI).
A), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), fluorescent antibody membrane antigen assay (FAMA) and immunofluorescence test (IF
There is a very wide range of serological methods from T) to complement fixation (CF). These methods mainly detect VZV-specific antibodies. Viral material isolated after in-depth culture on cultured human fibroblasts and purified for diagnostic use by special methods is often used as the antigen.
【0006】しかしながら、感染線維芽細胞からのVZ
V抗原の単離はこの作業に従事する人の感染の危険を伴
う。さらに、とくにウイルスが感染細胞から放出され
ず、したがって特殊な精製方法が要求されるので、この
調製は、きわめて高価につき、時間がかかる。抗原を前
もって精製することなく免疫化学的試験に使用する場合
には、VZV感染細胞を超音波処理によって破壊し、抗
原はたとえば、マイクロタイトレーションプレートの被
覆用に希釈したのち直接使用される。この方法では、ウ
イルス特異的抗原に加え、マイクロタイトレーションプ
レートのウエルに結合するのは主として細胞特異的抗原
であることから、とくにある種の疾患たとえば自己免疫
疾患に関連する細胞特異的抗原が存在する場合には、こ
れらの細胞特異的抗原が偽陽性の結果を生じ、その結
果、誤診を招くことがある。精製したウイルス糖タンパ
ク質に基づく他の試験方法、たとえば糖タンパク質EL
ISAは、顕著により精密な多大の損失を生じる精製を
要求し、したがって、比較的大規模の免疫化学的診断試
験を確立することはほとんど不可能である。糖タンパク
質ELISAでは、α−ヘルペスウイルスの糖タンパク
質との間に存在する著しいホモロジーにより、HSV特
異的抗体との交叉反応性およびその結果としての偽陽性
結果もしばしば観察される。However, VZ from infected fibroblasts
Isolation of the V antigen is associated with a risk of infection in persons engaged in this task. Furthermore, this preparation is very expensive and time-consuming, especially since the virus is not released from the infected cells and thus requires special purification methods. If the antigen is used for immunochemical testing without prior purification, the VZV-infected cells are disrupted by sonication, and the antigen is used directly after dilution, for example, for coating microtitration plates. In this method, in addition to virus-specific antigens, cell-specific antigens, which are associated with certain diseases, for example, autoimmune diseases, are present, mainly because cell-specific antigens bind to the wells of the microtitration plate. In these cases, these cell-specific antigens can produce false positive results, resulting in misdiagnosis. Other Test Methods Based on Purified Viral Glycoproteins, eg, Glycoprotein EL
ISAs require purifications that result in significantly more precise and costly losses, and it is therefore almost impossible to establish relatively large-scale immunochemical diagnostic tests. Glycoprotein ELISAs also often show cross-reactivity with HSV-specific antibodies and consequent false-positive results due to the significant homology that exists between the α-herpesvirus glycoproteins.
【0007】[0007]
【発明が解決しようとする課題】上述の問題に対する解
決の可能性の一つには、異種システム内たとえば大腸菌
(E.coli)において大量に調製できる組換えタンパク質
の使用がある。このシステムを使用すれば人がVZVに
感染する可能性はない。さらに、このシステムは特異的
なウイルスタンパク質に向けられた識別診断の可能性を
提供する。とくにVZVタンパク質の反応性領域を、他
のヘルペスウイルスに対して特異的な抗体との交叉反応
性が実際上または完全に排除できる程度まで限定するこ
とが可能である。これらの条件に合致するタンパク質
は、宿主特異的タンパク質、たとえば大腸菌マルトース
結合タンパク質(MBP)、または融合パートナーとし
て発現産物の安定性に寄与する6ヒスチジン残基から構
成されるN−末端局在配列(Hisタグ)のいずれかととも
にハイブリッドタンパク質として発現させることもでき
る。これらのハイブリッドタンパク質はついで、単一工
程のアフィニティー精製法によって、ほぼ純粋な、した
がって夾雑物を含まない形態で、診断用に使用可能な表
面、たとえばELISAマイクロタイトレーションプレ
ートの被覆に直接使用することができる。上述の基準に
合致するタンパク質は、VZVシステムについてはこれ
まで記載されていない。One possible solution to the above-mentioned problems involves the use of recombinant proteins which can be prepared in large amounts in heterologous systems, for example in E. coli. With this system, there is no possibility that a person will be infected with VZV. In addition, this system offers the possibility of differential diagnostics directed to specific viral proteins. In particular, the reactive region of the VZV protein can be limited to such an extent that cross-reactivity with antibodies specific for other herpesviruses can be practically or completely eliminated. Proteins meeting these conditions may be host-specific proteins, such as E. coli maltose binding protein (MBP), or an N-terminal localization sequence composed of six histidine residues that contribute to the stability of the expressed product as a fusion partner ( His tag) can be expressed as a hybrid protein. These hybrid proteins can then be used in a single-step affinity purification process, in near pure and thus contaminant-free form, directly for coating diagnostically usable surfaces, for example ELISA microtitration plates. Can be. Proteins meeting the above criteria have not been described previously for the VZV system.
【0008】[0008]
【課題を解決するための手段】驚くべきことに、VZV
の糖タンパク質gpII上に、アミノ酸位置450〜65
5を包含する領域内に存在する診断的に利用可能なエピ
トープの位置を決定することが可能であった。したがっ
て、本発明は、VZVのgpIIのAA450〜655を
包含する領域と相同性であるか、またはgpIIのアミノ
酸450〜655を包含する領域を実質的に含有する免
疫反応性ペプチドに関する。これに関連して、好ましい
ペプチドは、上記領域がアミノ酸505〜647または
アミノ酸517〜597に相当するペプチドにより与え
られ、とくに好ましくはアミノ酸535〜584、きわ
めて好ましくはアミノ酸545〜582に相当するペプ
チドによって与えられる。これに関連して、VZV株の
変動により天然に変動したアミノ酸配列を示す免疫反応
性ペプチドも明らかに包含されるものである。SUMMARY OF THE INVENTION Surprisingly, VZV
Amino acid positions 450-65 on glycoprotein gpII
It was possible to determine the location of the diagnostically available epitope present in the region encompassing the 5's. Accordingly, the present invention relates to immunoreactive peptides that are homologous to the region encompassing AA 450-655 of gpII of VZV or that substantially comprise the region encompassing amino acids 450-655 of gpII. In this context, preferred peptides are given by peptides whose regions correspond to amino acids 505 to 647 or amino acids 517 to 597, particularly preferably those corresponding to amino acids 535 to 584, very preferably amino acids 545 to 582. Given. In this context, immunoreactive peptides exhibiting naturally varying amino acid sequences due to variations in the VZV strain are also explicitly included.
【0009】本発明はさらに、本発明による上述の免疫
反応性ペプチドをコードする核酸、すなわちDNAまた
はRNAに関する。すなわち、とくに表1に示した配列
を有する核酸である。しかしながら、これに加えて、上
述の核酸と緊縮条件下にハイブリダイズし、VZVに対
する抗体によって認識されるが他のヘルペスウイルスに
対する抗体には認識されないペプチドをコードする核酸
も同時に包含することを意図するものである。The present invention further relates to nucleic acids encoding the above-mentioned immunoreactive peptides according to the invention, ie DNA or RNA. That is, it is a nucleic acid having the sequence shown in Table 1. However, in addition to this, it is intended to include simultaneously nucleic acids encoding peptides that hybridize under stringent conditions to the nucleic acids described above and are recognized by antibodies to VZV but not to antibodies to other herpes viruses. Things.
【0010】本発明はまた、表1に示した配列を有する
核酸、または緊縮条件下にハイブリダイズする上述の核
酸の1種の発現によって調製できる免疫反応性ペプチド
であり、すべてVZVに対する抗体によって認識される
が他のヘルペスウイルスに対する抗体には認識されない
という事実によって特徴づけられる免疫反応性ペプチド
に関する。The invention also relates to an immunoreactive peptide which can be prepared by the expression of one of the nucleic acids having the sequences shown in Table 1 or of the above-mentioned nucleic acids which hybridize under stringent conditions, all of which are recognized by antibodies against VZV. Immunoreactive peptides characterized by the fact that they are not recognized by antibodies to other herpesviruses.
【0011】本発明はさらに、VZVに対する抗体の検
出を可能にする免疫化学的方法に関する。この方法にお
いては、上記免疫反応性ペプチドの1種または2種以上
を、VZV特異的抗体の存在を検討する患者からのサン
プルたとえば血液、血漿または血清サンプルと接触させ
る。ついで、サンプルからの抗体が使用した免疫反応性
ペプチドに結合するか、またはこれらのペプチドと他の
免疫学的関係、たとえば競合に加わるかを決定するため
に、当業者に周知の方法が使用される。[0011] The invention further relates to an immunochemical method which allows the detection of antibodies to VZV. In this method, one or more of the above immunoreactive peptides are contacted with a sample from a patient, eg, a blood, plasma or serum sample, for which the presence of VZV-specific antibodies is to be examined. Methods well known to those skilled in the art are then used to determine whether the antibodies from the sample bind to the used immunoreactive peptides or participate in other immunological relationships with these peptides, such as competition. You.
【0012】本発明はまた、核酸ハイブリダイゼーショ
ンによるVZVの検出のための本発明の上述の核酸の使
用に関する。本発明はさらに、本発明の免疫反応性ペプ
チドからなる、VZVに対する抗体を検出するための試
験キット、および本発明の核酸からなる、VZVを検出
するための試験キットに関する。The present invention also relates to the use of the above-mentioned nucleic acid of the present invention for detecting VZV by nucleic acid hybridization. The present invention further relates to a test kit for detecting an antibody against VZV, comprising the immunoreactive peptide of the present invention, and a test kit for detecting VZV, comprising the nucleic acid of the present invention.
【0013】[0013]
【発明の実施の形態】診断的に利用可能な免疫反応性領
域の位置を決定するためには断片化された形態での糖タ
ンパク質II(gpII)の細菌システムにおける発現が使
用された。gpII特異的免疫応答は、VZV感染後に最
初に出現することが知られている。gpIおよびgpII
Iに対する免疫応答の出現は、その後にのみ認められ
る。しかしながら、gpIIの細菌における発現またはそ
の免疫関連エピトープについての情報は、以前に存在し
なかった。Ellisら(E.P.021093B1)に記載されたよう
に、gpIIの全ORF31をゲノムVZV DNA(Ell
en株)から増幅し、挿入されたDNAフラグメントをM
BPハイブリッドタンパク質として発現させることがで
きる原核細胞発現ベクターpMAL−p2(NEB)に
クローン化した。しかしながら、完全なORF31は細
菌での発現には適さないことが見出された。この理由か
ら、ORF31の構成領域の発現は、pMALシステム
中において検討された。すべてのフラグメント(フラグ
メントサイズ400bp〜600bp)の場合に、相当する
発現産物が検出された。25VZV反応性ヒト血清から
なる血清プールを発現産物の反応性の検査に使用した。
1種のフラグメントのみに免疫反応性が見出された。こ
れはgpIIのAA450〜655に相同性の206AA
フラグメント(配列1)であった。免疫反応性エピトー
プをさらに限定するために、このフラグメントの構成領
域のpMALシステムにおける発現を行った。免疫スク
リーニングの補助によって、AA505〜647(pM
AL−427−gpII)、AA517〜597(pMA
L−240−gpII)またはAA535〜584(pM
AL−149−gpII)が免疫反応性であることが示さ
れた。AA535〜584の領域をgpIIの主要な免疫
反応性エピトープであると類別することが可能であっ
た。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Expression of glycoprotein II (gpII) in fragmented form in bacterial systems has been used to determine the location of diagnostically available immunoreactive regions. It is known that the gpII-specific immune response first appears after VZV infection. gpI and gpII
The appearance of an immune response to I is only seen thereafter. However, information on bacterial expression of gpII or its immune-related epitopes did not previously exist. As described in Ellis et al. (EP021093B1), the entire ORF31 of gpII was converted to genomic VZV DNA (Ell).
en strain) and the inserted DNA fragment
It was cloned into a prokaryotic expression vector pMAL-p2 (NEB) that could be expressed as a BP hybrid protein. However, it was found that the complete ORF31 was not suitable for bacterial expression. For this reason, the expression of ORF31 component regions was examined in the pMAL system. Corresponding expression products were detected for all fragments (fragment size 400 bp to 600 bp). A serum pool consisting of 25 VZV reactive human sera was used to test the reactivity of the expression product.
Only one fragment was found immunoreactive. This is 206 AA homologous to AA450-655 of gpII.
Fragment (sequence 1). To further define the immunoreactive epitope, expression of the components of this fragment in the pMAL system was performed. With the aid of immunoscreening, AA505-647 (pM
AL-427-gpII), AA517-597 (pMA
L-240-gpII) or AA 535-584 (pM
AL-149-gpII) was shown to be immunoreactive. It was possible to classify the region of AA535-584 as the major immunoreactive epitope of gpII.
【0014】配列1:gpII(Ellen株)のアミノ酸残基
450〜655。全部で206AA;理論分子量23.
5kDa。強調した領域が免疫反応性ドメインに相当す
る。下線を施したAAはDumas株と比較して置換された
AAである。アミノ酸番号は公表されたgpII配列(A.
J. Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986)のメチオニン(開始コドン)に始まる。 Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly Asp Val Ile Phe Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln 相当するヌクレオチド配列は表1に示す。Sequence 1: Amino acid residues 450 to 655 of gpII (Ellen strain). 206 AA in total; theoretical molecular weight 23.
5 kDa. The highlighted area corresponds to the immunoreactive domain. The underlined AA is the AA that has been substituted compared to the Dumas strain. The amino acid numbers are based on the published gpII sequence (A.
J. Davison & JE Scott, J. Gen. Virol. 67: 1759-18
16, 1986) at the start of the methionine (start codon). Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly Asp Val Ile Phe Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu The nucleotide sequence corresponding to Asp Tyr Ser Glu Ile Gln is shown in Table 1.
【0015】[0015]
【表1】 [Table 1]
【0016】[0016]
【表2】 [Table 2]
【0017】免疫学的試験法でこのドメインを評価する
ために、206AA長の領域をコードするgpII配列を
ベクターpQE(Qiagen)にサブクローニングした。こ
のベクター構築体はpQE−gpII*と命名した。この
ベクターは融合部分としてC末端に位置するヒスチジン
タグ(6×His)を有するので、試験すべきヒト血清
の免疫反応性はもっぱらgpII部分に帰すことが可能で
あり、VZV反応性血清の免疫試験における偽陽性の結
果を排除することができる。To evaluate this domain in an immunoassay, the gpII sequence encoding a 206 AA long region was subcloned into the vector pQE (Qiagen). This vector construct was named pQE-gpII *. Since this vector has a histidine tag (6 × His) located at the C-terminus as a fusion moiety, the immunoreactivity of the human serum to be tested can be attributed exclusively to the gpII moiety and the immunoassay of VZV-reactive sera. False positive results can be excluded.
【0018】ELISA評価においては、プラスミドp
QE−gpII*によってコードされる精製タンパク質は
IgG診断に対し、計算カットオフ305(陰性血清の
平均値+3×標準偏差)を用いた場合、感度71%(n
=49)、特異性100%(n=5)、また自由に選択
されたカットオフ160を使用した場合、感度82%、
特異性80%を与えた。In the ELISA evaluation, plasmid p
The purified protein encoded by QE-gpII * has a sensitivity of 71% (n) for IgG diagnosis using a calculated cutoff 305 (mean of negative serum + 3 × standard deviation).
= 49), 100% specificity (n = 5), and 82% sensitivity when using a freely chosen cutoff 160.
A specificity of 80% was given.
【0019】別のELISA評価においてはプラスミド
pQE−gpII*によってコードされる精製タンパク質
がIgM診断に対し、計算カットオフ102(陰性血清
の平均値+3×標準偏差)を用いた場合、感度23%
(n=13)、特異性100%(n=41)、また自由
に選択されたカットオフ70を用いた場合、感度61.
5%および特異性80%を与えた。感度および特異性
は、熟練者には周知の方法を用いて常に至適化すること
ができる。以下に本発明を実施例によって例示するが、
これらはいかなる意味においても本発明を限定するもの
と考えるべきではない。In another ELISA evaluation, the sensitivity of the purified protein encoded by the plasmid pQE-gpII * was 23% when the calculated cutoff 102 (mean of negative serum + 3 × standard deviation) was used for IgM diagnosis.
(N = 13), 100% specificity (n = 41), and with a freely selected cutoff 70, the sensitivity was 61.
5% and a specificity of 80% were given. Sensitivity and specificity can always be optimized using methods well known to the skilled person. Hereinafter, the present invention will be exemplified by examples,
They should not be considered as limiting the invention in any way.
【0020】[0020]
【実施例】実施例1:ウイルスVZV粒子の単離およびDNA抽出 VZV感染線維芽細胞からのウイルス粒子の放出には超
音波を使用した。ウイルスを直線スクロース勾配(20
〜70%w/v)により細胞構成成分から精製した。DN
アーゼIとインキュベートしたのち、ウイルスDNAを
プロテイナーゼKおよびドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)で処理することによりウイルス粒子から放出させ
た。フェノール/クロロホルムで抽出したのち、ウイル
スDNAをエタノールで沈殿させた。EXAMPLES Example 1 Isolation of Virus VZV Particles and DNA Extraction Ultrasound was used to release virus particles from VZV-infected fibroblasts. The virus was run on a linear sucrose gradient (20
(-70% w / v) from cell components. DN
After incubation withase I, the viral DNA was converted to proteinase K and sodium dodecyl sulfate (SD
The virus particles were released by treating with S). After extraction with phenol / chloroform, the viral DNA was precipitated with ethanol.
【0021】実施例2:ORF31のクローニングおよび免疫反応性フラグメン
トのサブクローニング ウイルスDNA(実施例1参照)を、ORF31の増幅用
の鋳型として用いた。これはgpIIをコードする。増幅
オリゴヌクレオチドとして以下のプライマーを使用し
た。 gpIIH 5′ GGAATTCCTTCTATGTTTGTTACGGCGGTTG 3′ gpIIR 5′ GCTCTAGAGCATTTACACCCCCGTTACATTCTCG 3′ これらのオリゴヌクレオチドは、公表された配列(A.J.
Davison & J.E. Scott, J.Gen. Virol. 67: 1759-1816,
1986)の相当するセグメントに相補性であるが、それ
らの5′末端に鋳型DNAにハイブリダイズしない制限
切断部位配列を含有する。増幅を行ったのち、サイズ2
630bpの増幅体を制限酵素EcoRIおよびXbaIにより
末端で切断し、予めEcoRIおよびXbaIにより線状化し
た発現ベクターpMAL−p2 中に結合した(pMA
L−p2−ORF31)。全ORF31をオーバーラッ
プ、二方向様式で配列決定した。それはヌクレオチド位
置1550にシトシンのチミジンによる塩基置換を有
し、これがアミノ酸レベルにおいてセリンのフェニルア
ラニンによる置換を生じた。Example 2 Cloning of ORF31 and Immunoreactive Fragments
Subcloning viral DNA (see Example 1) was used as a template for ORF31 amplification. It encodes gpII. The following primers were used as amplification oligonucleotides. gpIIH 5 ′ GGAATTCCTTCTATGTTTGTTACGGCGGTTG 3 ′ gpIIR 5 ′ GCTCTAGAGCATTTACACCCCCGTTACATTCTCG 3 ′ These oligonucleotides have the published sequence (AJ
Davison & JE Scott, J. Gen. Virol. 67: 1759-1816,
1986), but contains a restriction cleavage site sequence at their 5 'end that is complementary to the corresponding segment but does not hybridize to the template DNA. After amplification, size 2
The 630 bp amplicon was cleaved at the ends with restriction enzymes EcoRI and XbaI and ligated into the expression vector pMAL-p2 previously linearized with EcoRI and XbaI (pMA).
L-p2-ORF31). All ORF31s were sequenced in an overlapping, bi-directional fashion. It has a base substitution of cytosine by thymidine at nucleotide position 1550, which resulted in a substitution of serine by phenylalanine at the amino acid level.
【0022】免疫反応性領域をサブクローニングするた
めには、挿入領域を上述の制限酵素を使用してベクター
pMAL−p2−ORF31から切り出し、ゲル精製
し、ついでApoIで消化した。得られた610bp ApoI
フラグメントを同様にゲル精製し、ベクターpMAL−
c2のEcoRI切断部位にサブクローニングした。このベ
クターはpMAL−gpII*と命名された。免疫反応性
を確認したのち、コード領域をベクターpQE中にサブ
クローニングした。このためには、610bpフラグメン
トを制限酵素SmaIおよびHind IIIによってベクターp
MAL−gpII*から切り出し、ベクターpQE32のS
maI/Hind III制限切断部位にサブクローニングした。
このベクターはpQE−gpII*と命名された。For subcloning the immunoreactive region, the inserted region was excised from the vector pMAL-p2-ORF31 using the restriction enzymes described above, gel purified and then digested with ApoI. The resulting 610 bp ApoI
The fragment was similarly gel purified and the vector pMAL-
It was subcloned into the EcoRI cleavage site of c2. This vector was named pMAL-gpII *. After confirming immunoreactivity, the coding region was subcloned into the vector pQE. To this end, the 610 bp fragment was digested with the restriction enzymes SmaI and HindIII into the vector p.
Cleavage from MAL-gpII *, the vector pQE32 S
It was subcloned into the maI / HindIII restriction cleavage site.
This vector was named pQE-gpII *.
【0023】実施例3:免疫反応性エピトープのサブクローニング 鋳型DNAとしてベクターpMAL−gpII*およびオ
リゴヌクレオチド: 5′ CGGGATCCCGTGTTAAAGCTCGTATTCTCGGCGACG 3′ および 5′ CCCAAGCTTTAATCCTGTATCCCGCAGCTCGTCTCT 3′、 5′ CGGGATCCGTTTCTAATTGTCCAGAACTGGGATCAG 3′ および 5′ CCCAAGCTTATACGTAGTGATGCCCAAATAGAAAA 3′ または 5′ CGGGATCCTCTATGAGGGTATCTGGTAGTACTACGCGTT 3′ および 5′ CCCAAGCTTAGCCACGCATGGTTCTAACAGATC 3' を用いて増幅を行うことにより、427bpフラグメン
ト、240bpフラグメントまたは149bpフラグメント
を得ることができ、これらはそれぞれ酵素BamHIおよび
Hind IIIによる制限消化に付したのち、予めBamHIおよ
びHind IIIによって線状化したベクターpMAL−c2
にサブクローニングした。得られた構築体はそれぞれ、
pMAL−427−gpII、pMAL−240−gpI
I、およびpMAL−149−gpIIと命名された。Example 3: Subcloning of immunoreactive epitopes Vector pMAL-gpII * and oligonucleotides as template DNA: 5 'CGGGATCCCGTGTTAAAGCTCGTATTCTCGGCGACG 3' and 5 'CCCAAGCTTTAATCCTGTATCCCGCAGCTCGTCTCT 3', 5 'CGGGATCCGTTTCTAATTGTCCAGAACTGGGATCAGGATCAGTCGATCAGTCAGTCAGTCAGTCGATCGATCGATCAGTCAGTCAGTCAGTCGATCGATCGATCAGTCAGTCAGTCGATCGATCGATCAGGATCACTA By performing amplification using 'CGGGATCCTCTATGAGGGTATCTGGTAGTACTACGCGTT 3' and 5 'CCCAAGCTTAGCCACGCATGGTTCTAACAGATC 3', a 427 bp fragment, a 240 bp fragment or a 149 bp fragment can be obtained, which are the enzymes BamHI and BamHI, respectively.
After restriction digestion with HindIII, the vector pMAL-c2 previously linearized with BamHI and HindIII
Was subcloned. Each of the resulting constructs
pMAL-427-gpII, pMAL-240-gpI
I and pMAL-149-gpII.
【0024】実施例4:a)組換えタンパク質pQE−gpII*の調製 組換えタンパク質pQE−gpIIの発現および精製は、
製造業者の説明書に従い(Clontechより、Talon金属親
和性樹脂、PT1320−1)、変性条件下に金属親和
性クロマトグラフィーを用いて行った。Example 4: a) Preparation of the recombinant protein pQE-gpII * The expression and purification of the recombinant protein pQE-gpII
The analysis was performed using metal affinity chromatography under denaturing conditions according to the manufacturer's instructions (from Clontech, Talon metal affinity resin, PT1320-1).
【0025】b)固相I(本発明によるシステム)の調
製 B型マイクロタイトレーションプレート(Greinerか
ら)を、各ウエルあたり110μlの被覆溶液(50mM
炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.5中4μg/mlの組換えp
QE−gpII)と4℃で18時間インキュベートした。
マイクロタイトレーションプレートのウエルをついで、
各場合300μlの洗浄溶液(50mM Tris/EDT
A、pH7.0〜7.4+0.5%BSA)で3回洗浄し
た。 B) Preparation of solid phase I (system according to the invention)
The manufacturing B type microtitration plates (from Greiner), coated solution (50 mM of 110μl per each well
4 μg / ml recombinant p in sodium carbonate buffer, pH 9.5
QE-gpII) at 4 ° C. for 18 hours.
Then add the wells of the microtitration plate,
In each case 300 μl of washing solution (50 mM Tris / EDT)
A, pH 7.0-7.4 + 0.5% BSA).
【0026】c)VZV IgG抗体を検出するための
酵素イムノアッセイ 酵素イムノアッセイで抗−VZV IgGを検出するた
めには予めPODサンプル緩衝液(Behring Diagnostic
s GmbH, OWBE 945)中1:100に希釈した100μl
の血清を、各場合、実施例4bに記載のようにして調製
したマイクロタイトレーションプレートにピペットで添
加し、このプレートを37℃で1時間インキュベートし
た。 C) for detecting VZV IgG antibodies
Enzyme immunoassay To detect anti-VZV IgG by enzyme immunoassay, a POD sample buffer (Behring Diagnostic
s GmbH, OWBE 945) 100 μl diluted 1: 100
Was pipetted in each case into microtitration plates prepared as described in Example 4b and the plates were incubated at 37 ° C. for 1 hour.
【0027】プレートをPOD洗浄溶液(Behring Diag
nostics GmbH, OSEW 965)で3回洗浄後、微生物接合緩
衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935)中1:50
に希釈した抗−ヒトIgG/POD接合体(Behring Dia
gnostics GmbH, Ch. 243713)100μlをピペットで加
えた。1時間(37℃)のインキュベーション後に、さ
らに3回洗浄工程を行った。結合したVZV抗体分子の
数に直接相関関係を有する結合ペルオキシダーゼ活性を
H2O2/テトラメチルベンジジン(Behring Diagnostic
s GmbH, OUVG 945)の添加により測定した。室温に30
分間置いたのち、基質の変換を0.5M硫酸(Behring D
iagnostics GmbH, OSFA 965)を加えて停止させ、吸光
を450nmで測定した。The plate was washed with a POD washing solution (Behring Diag).
nostics GmbH, OSEW 965) three times and then 1:50 in microbial conjugation buffer (Behring Diagnostics GmbH, OUWW 935).
Anti-human IgG / POD conjugate (Behring Dia
gnostics GmbH, Ch. 243713) was added by pipette. After one hour (37 ° C.) incubation, three more washing steps were performed. Bound peroxidase activity, which has a direct correlation to the number of bound VZV antibody molecules, was measured by H 2 O 2 / tetramethylbenzidine (Behring Diagnostic).
s GmbH, OUVG 945). 30 to room temperature
After standing for 0.5 min, the conversion of the substrate was
iagnostics GmbH, OSFA 965) and the absorbance was measured at 450 nm.
【0028】抗−VZV抗体陽性ならびに抗−VZV抗
体陰性血清を、Enzygnost抗−VZV/IgG標準シス
テム(Behring Diagnostics GmbH, OWLT 155)および本
発明による酵素イムノアッセイの両者で検討した。検討
結果(吸光単位)は表2に示す。ELISAで評価した
場合には、精製pQE−gpII*タンパク質はIgG診
断に対し、計算カットオフ=331(陰性血清の平均値
+3×標準偏差)を使用すると、感度69%(n=5
2)、特異性94%(n=16)、また自由に選択され
たカットオフ=335を使用すると、感度69%(n=
52)、特異性100%(n=16)を与えた。Anti-VZV antibody positive and anti-VZV antibody negative sera were tested in both the Enzygnost anti-VZV / IgG standard system (Behring Diagnostics GmbH, OWLT 155) and the enzyme immunoassay according to the invention. The results of the study (absorbance units) are shown in Table 2. When assessed by ELISA, purified pQE-gpII * protein was 69% sensitive (n = 5) using a calculated cut-off = 331 (mean of negative serum + 3 × standard deviation) for IgG diagnosis.
2), with a specificity of 94% (n = 16) and a freely chosen cut-off = 335, a sensitivity of 69% (n = 16)
52), giving a specificity of 100% (n = 16).
【0029】実施例5:VZV IgM抗体を検出するための酵素イムノアッセ
イ 抗−VZV IgMを検出するための酵素イムノアッセ
イは以下のように実施した。すなわち、血清を予めPO
Dサンプル緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OWBE 9
45)中1:50に希釈し、ついでRF吸着剤(Behring
Diagnostics GmbH, OUCG 945)と1:2の比率で室温に
おいて15分間プレインキュベートした。上述のように
予め希釈した血清100μl を、実施例4bに記載のよ
うにして調製したマイクロタイトレーションプレートの
ウエル中で、37℃において1時間インキュベートし
た。Example 5: Enzyme immunoassay for detecting VZV IgM antibody
Enzyme immunoassay for the detection of Lee anti -VZV IgM was performed as follows. That is, the serum is
D sample buffer (Behring Diagnostics GmbH, OWBE 9
45), diluted 1:50 in RF adsorbent (Behring
Diagnostics GmbH, OUCG 945) at a ratio of 1: 2 at room temperature for 15 minutes. 100 μl of the serum previously diluted as described above was incubated for 1 hour at 37 ° C. in the wells of a microtitration plate prepared as described in Example 4b.
【0030】プレートをPOD洗浄溶液(Behring Diag
nostics GmbH, OSEW 965)によって3回洗浄したのち、
微生物接合緩衝液(Behring Diagnostics GmbH, OUWW 93
5)中1:25に希釈した抗−ヒトIgM/POD接合体
(Behring Diagnostics GmbHCh. 4241313)100μlを
ピペットで加えた。1時間(+37℃)インキュベーシ
ョンしたのち、さらに3回洗浄工程を実施した。結合し
たVZV抗体分子の数に直接相関関係を有する結合ペル
オキシダーゼ活性を、H2O2/テトラメチルベンジジン
(BehringDiagnostics GmbH, OUVG 945)の添加により
測定した。室温に30分間置いたのち基質の変換を0.
5M硫酸(Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965)を加
えて停止させ、吸光を450nmで測定した。The plate was washed with a POD washing solution (Behring Diag).
Nostics GmbH, OSEW 965)
Microbial conjugation buffer (Behring Diagnostics GmbH, OUWW 93
5) Anti-human IgM / POD conjugate diluted 1:25 in
100 μl (Behring Diagnostics GmbH Ch. 4241313) was added by pipette. After one hour of incubation (+ 37 ° C.), three additional washing steps were performed. Bound peroxidase activity, which directly correlates to the number of bound VZV antibody molecules, was measured by the addition of H 2 O 2 / tetramethylbenzidine (BehringDiagnostics GmbH, OUVG 945). After 30 minutes at room temperature, the conversion of the substrate was
The mixture was stopped by adding 5 M sulfuric acid (Behring Diagnostics GmbH, OSFA 965), and the absorbance was measured at 450 nm.
【0031】抗−VZV−陽性および抗−VZV−陰性
血清はEnzygnost抗−VZV/IgM標準システム(Beh
ring Diagnostics GmbH, OWLW 155)および本発明の酵
素イムノアッセイの両者で検討した。検討結果(吸光単
位)は表3に示す。ELISAで評価した場合には、精
製pQE−gpII*タンパク質はIgM診断に対し、計
算カットオフ102(陰性血清の平均値+3×標準偏
差)を用いると感度38%(n=13)、特異性100
%(n=41)、また自由に選択されたカットオフ96
を用いると、感度38%(n=13)、特異性100%
(n=41)を与えた。Anti-VZV-positive and anti-VZV-negative sera were obtained from the Enzygnost anti-VZV / IgM standard system (Beh
ring Diagnostics GmbH, OWLW 155) and the enzyme immunoassay of the present invention. The results of the study (absorbance units) are shown in Table 3. When assessed by ELISA, the purified pQE-gpII * protein was 38% sensitive (n = 13), specificity 100 using the calculated cutoff 102 (mean of negative serum + 3 x standard deviation) for IgM diagnosis.
% (N = 41) and a freely selected cut-off 96
Is used, sensitivity is 38% (n = 13), specificity is 100%
(N = 41).
【0032】[0032]
【表3】 [Table 3]
【0033】[0033]
【表4】 [Table 4]
【0034】[0034]
【表5】 [Table 5]
【0035】[0035]
【表6】 [Table 6]
【0036】[0036]
【配列表】配列番号:1 配列の長さ:206 配列の型:アミノ酸 鎖の数: トポロジー:直鎖状 配列の種類:タンパク質 ハイポセティカル:Yes 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val 1 5 10 15 Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn 20 25 30 Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala 35 40 45 Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly 50 55 60 Asp Val Ile Ser Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg 65 70 75 80 Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys 85 90 95 Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp 115 120 125 Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Phe Leu Phe Gly 130 135 140 His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala 145 150 155 160 Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln 195 200 205 配列番号:2 配列の長さ:618 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA(ゲノム) ハイポセティカル:Yes 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: GAATTTGCTA TGCTCCAGTT TACATATGAC CACATTCAAG AGCATGTTAA TGAAATGTTG 60 GCACGTATCT CCTCGTCGTG GTGCCAGCTA CAAAATCGCG AACGCGCCCT TTGGAGCGGA 120 CTATTTCCAA TTAACCCAAG TGCTTTAGCG AGCACCATTT TGGATCAACG TGTTAAAGCT 180 CGTATTCTCG GCGACGTTAT CTTCGTTTCT AATTGTCCAG AACTGGGATC AGATACACGC 240 ATTATACTTC AAAACTCTAT GAGGGTATCT GGTAGTACTA CGCGTTGTTA TAGCCGTCCT 300 TTAATTTCAA TAGTTAGTTT AAATGGGTCC GGGACGGTGG AGGGCCAGCT TGGAACAGAT 360 AACGAGTTAA TTATGTCCAG AGATCTGTTA GAACCATGCG TGGCTAATCA CAAGCGATAT 420 TTTCTATTTG GGCATCACTA CGTATATTAT GAGGATTATC GTTACGTCCG TGAAATCGCA 480 GTCCATGATG TGGGAATGAT TAGCACTTAC GTAGATTTAA ACTTAACACT TCTTAAAGAT 540 AGAGAGTTTA TGCCGCTGCA AGTATATACA AGAGACGAGC TGCGGGATAC AGGATTACTA 600 GACTACAGTG AAATTCAA 618 配列番号:3 配列の長さ:31 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: GGAATTCCTT CTATGTTTGT TACGGCGGTT G 31 配列番号:4 配列の長さ:34 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源:生物名:水痘帯状疱疹ウイルス ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: GCTCTAGAGC ATTTACACCC CCGTTACATT CTCG 34 配列番号:5 配列の長さ:36 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: CGGGATCCCG TGTTAAAGCT CGTATTCTCG GCGACG 36 配列番号:6 配列の長さ:36 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: CCCAAGCTTT AATCCTGTAT CCCGCAGCTC GTCTCT 36 配列番号:7 配列の長さ:36 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: CGGGATCCGT TTCTAATTGT CCAGAACTGG GATCAG 36 配列番号:8 配列の長さ:35 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: CCCAAGCTTA TACGTAGTGA TGCCCAAATA GAAAA 35 配列番号:9 配列の長さ:39 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: CGGGATCCTC TATGAGGGTA TCTGGTAGTA CTACGCGTT 39 配列番号:10 配列の長さ:33 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸(合成DNA) ハイポセティカル:No 起源: 生物名:水痘帯状疱疹ウイルス 株名:Ellen ゲノム内での位置 染色体上の位置:ORF31 配列: CCCAAGCTTA GCCACGCATG GTTCTAACAG ATC 33[Sequence List] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 206 Sequence type: Amino acid Number of chains: Topology: Linear Sequence type: Protein Hypothetical: Yes Origin: Organism name: Varicella zoster virus Strain name: Location in the Ellen genome Location on the chromosome: ORF31 Sequence: Glu Phe Ala Met Leu Gln Phe Thr Tyr Asp His Ile Gln Glu His Val 1 5 10 15 Asn Glu Met Leu Ala Arg Ile Ser Ser Ser Trp Cys Gln Leu Gln Asn 20 25 30 Arg Glu Arg Ala Leu Trp Ser Gly Leu Phe Pro Ile Asn Pro Ser Ala 35 40 45 Leu Ala Ser Thr Ile Leu Asp Gln Arg Val Lys Ala Arg Ile Leu Gly 50 55 60 Asp Val Ile Ser Val Ser Asn Cys Pro Glu Leu Gly Ser Asp Thr Arg 65 70 75 80 Ile Ile Leu Gln Asn Ser Met Arg Val Ser Gly Ser Thr Thr Arg Cys 85 90 95 Tyr Ser Arg Pro Leu Ile Ser Ile Val Ser Leu Asn Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Val Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Leu Ile Met Ser Arg Asp 115 120 125 Leu Leu Glu Pro Cys Val Ala Asn His Lys Arg Tyr Ph e Leu Phe Gly 130 135 140 His His Tyr Val Tyr Tyr Glu Asp Tyr Arg Tyr Val Arg Glu Ile Ala 145 150 155 160 Val His Asp Val Gly Met Ile Ser Thr Tyr Val Asp Leu Asn Leu Thr 165 170 175 Leu Leu Lys Asp Arg Glu Phe Met Pro Leu Gln Val Tyr Thr Arg Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Asp Thr Gly Leu Leu Asp Tyr Ser Glu Ile Gln 195 200 205 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 618 Sequence type: Number of nucleic acid strands : Single strand Topology: Linear Sequence type: DNA (genome) Hypothetical: Yes Origin: Organism name: Varicella-zoster virus Strain name: Ellen Position in genome Chromosome position: ORF31 Sequence: GAATTTGCTA TGCTCCAGTT TACATATGAC CACATTCAAG AGCATGTTAA TGAAATGTTG 60 GCACGTATCT CCTCGTCGTG GTGCCAGCTA CAAAATCGCG AACGCGCCCT TTGGAGCGGA 120 CTATTTCCAA TTAACCCAAG TGCTTTAGCG AGCACCATTT TGGATCAACG TGTTAAAGCT 180 CGTATTCTTCGCGATCATGATGCTATCTCTGCTCGATCTGATCTCGTCGATCTGATCTCGTCGATCTGATCTCGTCGATCTGATTCTGGCGTACT A CGCGTTGTTA TAGCCGTCCT 300 TTAATTTCAA TAGTTAGTTT AAATGGGTCC GGGACGGTGG AGGGCCAGCT TGGAACAGAT 360 AACGAGTTAA TTATGTCCAG AGATCTGTTA GAACCATGCG TGGCTAATCA CAAGCGATAT 420 TTTCTATTTG GGCATCACTA CGTATATTAT GAGGATTATC GTTACGTCCG TGAAATCGCA 480 GTCCATGATG TGGGAATGAT TAGCACTTAC GTAGATTTAA ACTTAACACT TCTTAAAGAT 540 AGAGAGTTTA TGCCGCTGCA AGTATATACA AGAGACGAGC TGCGGGATAC AGGATTACTA 600 GACTACAGTG AAATTCAA 618 SEQ ID NO: 3 Length of sequence : 31 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Hypothetical: No Origin: Organism name: Varicella-zoster virus Strain name: Ellen Within genome Position on chromosome Position on chromosome: ORF31 Sequence: GGAATTCCTT CTATGTTTGT TACGGCGGTT G31 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 34 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids (Synthetic DNA) Hypothetical: No Source: Organism name: Varicella-zoster virus position in genome Position on chromosome: ORF31 Sequence: GCTCTAGAGC ATTTACACCC CCGTTACATT CTCG 34 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 36 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology : Linear sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Hypothetical: No Origin: Organism name: Varicella-zoster virus Position in genome Chromosome position: ORF31 Sequence: CGGGATCCCG TGTTAAAGCT CGTATTCTCG GCGACG 36 SEQ ID NO: 6 Sequence length: 36 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid (synthetic DNA) Hypothetical: No Origin: Organism: Varicella-zoster virus strain Name: Ellen Location in genome Chromosome location: ORF31 Sequence: CCCAAGCTTT AATCCTGTAT CCCGCAGCTC GTCTCT 36 SEQ ID NO: 7 Sequence length: 36 Sequence type: Nuclear Number of chains: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acids (synthetic DNA) Hypothetical: No Origin: Organism name: Varicella-zoster virus Strain name: Ellen Position in genome Position on chromosome : ORF31 Sequence: CGGGATCCGT TTCTAATTGT CCAGAACTGG GATCAG 36 SEQ ID NO: 8 Sequence length: 35 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA) Hypothetical : No Origin: Organism name: Varicella-zoster virus Strain name: Position in Ellen genome Position on chromosome: ORF31 Sequence: CCCAAGCTTA TACGTAGTGA TGCCCAAATA GAAAA 35 SEQ ID NO: 9 Sequence length: 39 Sequence type: Nucleic acid Number: single-stranded Topology: linear Sequence type: other nucleic acids (synthetic DNA) Hypothetical: No Origin: Organism name: Varicella-zoster virus Strain name: E len Position in genome Chromosome position: ORF31 Sequence: CGGGATCCTC TATGAGGGTA TCTGGTAGTA CTACGCGTT 39 SEQ ID NO: 10 Sequence length: 33 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids (synthetic DNA) Hypothetical: No Origin: Organism: Varicella-zoster virus Strain: Ellen Position in genome Chromosome position: ORF31 Sequence: CCCAAGCTTA GCCACGCATG GTTCTAACAG ATC 33
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI G01N 33/53 C12N 15/00 ZNAA //(C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) (72)発明者 クラウス・ラートザク ドイツ連邦共和国35037マルブルク.ウー フアーシユトラーセ14 (72)発明者 ハンス−ペーター・ハウザー ドイツ連邦共和国35041エルンハウゼン. フオイアードルンヴエーク6 (72)発明者 ベルンハルト・ギーゼンドルフ ドイツ連邦共和国35041ミヒエルバハ.エ ーヴイゲスタール24Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 identification code FI G01N 33/53 C12N 15/00 ZNAA // (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) (72) Inventor Klaus Ratsak 35037 Malburg, Germany . Woer Fischstraße 14 (72) Inventor Hans-Peter Hauser 35041 Ernhausen, Germany. Huoi Dornweg 6 (72) Inventor Bernhard Giesendorf, Germany 35041 Michelbach. Evgestar 24
Claims (14)
包含する領域と相同性である免疫反応性ペプチド。1. An immunoreactive peptide which is homologous to the region encompassing AA450-655 of gpII of VZV.
655を包含する領域からなる免疫反応性ペプチド。2. AA450 of gpII of substantially VZV.
An immunoreactive peptide consisting of a region encompassing 655.
求項1または2のいずれかに記載の免疫反応性ペプチ
ド。3. The immunoreactive peptide according to claim 1, wherein the region corresponds to AA505 to 647.
求項3記載の免疫反応性ペプチド。4. The immunoreactive peptide according to claim 3, wherein the region corresponds to AA517-597.
求項4記載の免疫反応性ペプチド。5. The immunoreactive peptide according to claim 4, wherein the region corresponds to AA 535-584.
求項5記載の免疫反応性ペプチド。6. The immunoreactive peptide according to claim 5, wherein the region corresponds to AA 545 to 582.
核酸を発現させることによって調製できる免疫反応性ペ
プチド。7. An immunoreactive peptide which can be prepared by expressing the nucleic acid according to claim 9 or 10.
酸配列をコードする核酸。8. A nucleic acid encoding the amino acid sequence according to claim 1.
る核酸。9. A nucleic acid corresponding to the nucleotide sequence shown in Table 1.
核酸と緊縮条件下にハイブリダイズし、VZVに対する
抗体によって認識されるが、他のヘルペスウイルスに対
する抗体によっては認識されないペプチドをコードする
核酸。10. A nucleic acid encoding a peptide that hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid according to claim 8 or 9 and is recognized by an antibody against VZV but not recognized by an antibody against another herpes virus. .
出するために請求項1〜7のいずれかに記載の免疫反応
性ペプチドを使用する免疫化学的方法。11. An immunochemical method using the immunoreactive peptide according to any one of claims 1 to 7 for detecting an antibody against VZV in a sample.
VZVを検出するための請求項8〜10のいずれかに記
載の核酸の使用。12. Use of the nucleic acid according to any one of claims 8 to 10 for detecting VZV by nucleic acid hybridization.
反応性ペプチドからなるVZVに対する抗体を検出する
ための試験キット。A test kit for detecting an antibody against VZV, comprising the immunoreactive peptide according to any one of claims 1 to 7.
酸からなるVZVを検出するための試験キット。A test kit for detecting VZV comprising the nucleic acid according to any one of claims 8 to 10.
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