JPH07199A - 水痘帯状疱疹ウイルス検出用プライマーセット及びそれを用いる同ウイルスの検出方法 - Google Patents
水痘帯状疱疹ウイルス検出用プライマーセット及びそれを用いる同ウイルスの検出方法Info
- Publication number
- JPH07199A JPH07199A JP17081793A JP17081793A JPH07199A JP H07199 A JPH07199 A JP H07199A JP 17081793 A JP17081793 A JP 17081793A JP 17081793 A JP17081793 A JP 17081793A JP H07199 A JPH07199 A JP H07199A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- primer set
- vzv
- pcr
- virus
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒト水痘帯状疱疹ウイルス感染の早期診断を
可能にする、同ウイルス検出のための、高感度でウイル
ス株の種類に依存せず、しかも近縁ウイルスとは交差反
応性のないPCR用プライマーセットを提供する。 【構成】 ヒト水痘帯状疱疹ウイルスのゲノムDNAの
うち、グリコプロテインIIをコードする領域の一部を増
幅せしめることのできるPCR用プライマーセット。ま
た、それを用いた同ウイルスの検出方法。
可能にする、同ウイルス検出のための、高感度でウイル
ス株の種類に依存せず、しかも近縁ウイルスとは交差反
応性のないPCR用プライマーセットを提供する。 【構成】 ヒト水痘帯状疱疹ウイルスのゲノムDNAの
うち、グリコプロテインIIをコードする領域の一部を増
幅せしめることのできるPCR用プライマーセット。ま
た、それを用いた同ウイルスの検出方法。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス
(Varicella-Zoster Virus)を早期かつ高感度に検出す
るための特異的なPCR用プライマーセット、及びそれ
を用いる同ウイルスの迅速、簡便な検出方法に関する。
(Varicella-Zoster Virus)を早期かつ高感度に検出す
るための特異的なPCR用プライマーセット、及びそれ
を用いる同ウイルスの迅速、簡便な検出方法に関する。
【0002】
【従来の技術】水痘帯状疱疹ウイルス(以下「VZV」
という)は、αヘルペスウイルス群に属し、約125k
bpの塩基配列からなる線状2本鎖DNAを有するウイ
ルスである。VZVゲノムの全塩基配列については、Da
vison and Scott (J.General Virology 67,198
6,1759―1816)により決定されており、同配
列上にVZVに必須なタンパクであるMajor Capsid Pro
tein(MCP)、グリコプロテインI(gpI)、グリ
コプロテインII(gpII)、グリコプロテインIII(g
pIII )等がコードされていることもわかっている。
という)は、αヘルペスウイルス群に属し、約125k
bpの塩基配列からなる線状2本鎖DNAを有するウイ
ルスである。VZVゲノムの全塩基配列については、Da
vison and Scott (J.General Virology 67,198
6,1759―1816)により決定されており、同配
列上にVZVに必須なタンパクであるMajor Capsid Pro
tein(MCP)、グリコプロテインI(gpI)、グリ
コプロテインII(gpII)、グリコプロテインIII(g
pIII )等がコードされていることもわかっている。
【0003】VZVはヒトを宿主とし、初感染である水
痘の後、脊髄神経節に潜伏し、再活性化して帯状疱疹を
引き起こすことが知られている。VZVの感染経路は、
水痘患者の鼻咽頭粘膜及び皮膚水痘内、または帯状疱疹
患者の皮膚水痘内に存在するウイルスが直接接触する
か、もしくは水痘内溶液の呼吸器への散布による。通
常、予後は良好で、1〜2週間で全治する。しかし、免
疫抑制状態(免疫抑制剤使用、悪性腫瘍、免疫不全等の
基礎疾患)のヒトがVZVに初感染、あるいは再活性化
した場合、重症化し、時に致命的になることがあるた
め、早期治療を行うための迅速診断法の確立が望まれて
いる。
痘の後、脊髄神経節に潜伏し、再活性化して帯状疱疹を
引き起こすことが知られている。VZVの感染経路は、
水痘患者の鼻咽頭粘膜及び皮膚水痘内、または帯状疱疹
患者の皮膚水痘内に存在するウイルスが直接接触する
か、もしくは水痘内溶液の呼吸器への散布による。通
常、予後は良好で、1〜2週間で全治する。しかし、免
疫抑制状態(免疫抑制剤使用、悪性腫瘍、免疫不全等の
基礎疾患)のヒトがVZVに初感染、あるいは再活性化
した場合、重症化し、時に致命的になることがあるた
め、早期治療を行うための迅速診断法の確立が望まれて
いる。
【0004】一方、現在のVZV診断法としては血清学
的診断法(補体結合反応、中和試験、FAMA法、EL
ISA等)が中心である。しかし、血清学的診断法で
は、VZVの近縁ウイルス(Herpes Simplex Virus:H
SV等)との交差反応が観察され、特異性に問題がある
(水痘帯状疱疹、高橋理明、新村真人編、メディカルト
リビューン1987,39〜54)。他に、ウイルス分
離法もVZVの確定法として用いられるが、その判定に
は熟練を要し、2〜3週間掛かるため、迅速性に欠ける
上、分離率も低い。
的診断法(補体結合反応、中和試験、FAMA法、EL
ISA等)が中心である。しかし、血清学的診断法で
は、VZVの近縁ウイルス(Herpes Simplex Virus:H
SV等)との交差反応が観察され、特異性に問題がある
(水痘帯状疱疹、高橋理明、新村真人編、メディカルト
リビューン1987,39〜54)。他に、ウイルス分
離法もVZVの確定法として用いられるが、その判定に
は熟練を要し、2〜3週間掛かるため、迅速性に欠ける
上、分離率も低い。
【0005】近年、VZVの迅速診断法として、ポリメ
ラーゼ チェーン リアクション法(以下「PCR法」
という)(Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al., S
cience, 1985;230:1350〜1354)の応
用が注目されている。PCR法は、in vitroで
極微量の核酸を試料として、特定の領域のDNA塩基配
列を選択的に増幅する技術である。その基本は、DNA
塩基配列の特定の領域の両端で対合する1対の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマー(以下「プライマーセット」
という)を用い、変性→再アニーリング→伸長反応の各
ステップを、耐熱性DNAポリメラーゼ等を用いて繰り
返すことにある。したがって、プライマー結合領域とし
て、種特異的な塩基配列を選択することにより、高い特
異性をもった検出が可能であり、更に指数関数的な増幅
が行えるので、他の診断法に比べ、微量のサンプルから
の高感度な検出を行うことができる点で優れている。ま
た数時間の反応で結果が得られることから、迅速診断の
手段として適しており、VZVの診断法としても試みら
れている。
ラーゼ チェーン リアクション法(以下「PCR法」
という)(Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al., S
cience, 1985;230:1350〜1354)の応
用が注目されている。PCR法は、in vitroで
極微量の核酸を試料として、特定の領域のDNA塩基配
列を選択的に増幅する技術である。その基本は、DNA
塩基配列の特定の領域の両端で対合する1対の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマー(以下「プライマーセット」
という)を用い、変性→再アニーリング→伸長反応の各
ステップを、耐熱性DNAポリメラーゼ等を用いて繰り
返すことにある。したがって、プライマー結合領域とし
て、種特異的な塩基配列を選択することにより、高い特
異性をもった検出が可能であり、更に指数関数的な増幅
が行えるので、他の診断法に比べ、微量のサンプルから
の高感度な検出を行うことができる点で優れている。ま
た数時間の反応で結果が得られることから、迅速診断の
手段として適しており、VZVの診断法としても試みら
れている。
【0006】PCR法を用いたVZVの診断法の研究
は、そのいずれも、迅速性、高感度、特異性を目指して
なされている。それらの結果は、たしかに血清学的診断
法およびウイルス分離法に比べて、VZVの臨床症状と
より相関のあるデータを示している。しかし、PCR法
を用いても現時点でVZVの診断に必要な感度を得るに
は、Nested double PCR法を行った後、増幅産物をラ
ジオアイソトープ(32P)を用いたdot―blot法
で解析しなければならなかった。従って、操作が煩雑で
時間が掛かり、ラジオアイソトープ使用可能な限られた
施設でしか行えない点が非常に不便であるため、PCR
法の特徴が生かされていなかった(Kido S, Ozaki T e
t. al., J. Clinical Microbiol. 1991;29:7
6〜79,Dlugosch D, Eis-Hublinger A.M. et. al.,
J. Med. Virol., 1991;35(2):136〜14
1,Koropchak C.M. et. al., J. Infect. Dis.,199
1;163:1016〜1022,Lowry P.W. et. a
l., J. Infect. Dis.,1993;167:78〜8
3)。
は、そのいずれも、迅速性、高感度、特異性を目指して
なされている。それらの結果は、たしかに血清学的診断
法およびウイルス分離法に比べて、VZVの臨床症状と
より相関のあるデータを示している。しかし、PCR法
を用いても現時点でVZVの診断に必要な感度を得るに
は、Nested double PCR法を行った後、増幅産物をラ
ジオアイソトープ(32P)を用いたdot―blot法
で解析しなければならなかった。従って、操作が煩雑で
時間が掛かり、ラジオアイソトープ使用可能な限られた
施設でしか行えない点が非常に不便であるため、PCR
法の特徴が生かされていなかった(Kido S, Ozaki T e
t. al., J. Clinical Microbiol. 1991;29:7
6〜79,Dlugosch D, Eis-Hublinger A.M. et. al.,
J. Med. Virol., 1991;35(2):136〜14
1,Koropchak C.M. et. al., J. Infect. Dis.,199
1;163:1016〜1022,Lowry P.W. et. a
l., J. Infect. Dis.,1993;167:78〜8
3)。
【0007】そこでラジオアイソトープを用いずに、高
感度で簡便、かつ短時間にVZVを検出できる系が望ま
れていた。
感度で簡便、かつ短時間にVZVを検出できる系が望ま
れていた。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、VZVをP
CR法により高感度に検出することができ、かつ、HS
V等の近縁ウイルスと交差しないPCR用プライマーセ
ット及びそれを用いたVZVの検出方法を提供すること
を目的とする。
CR法により高感度に検出することができ、かつ、HS
V等の近縁ウイルスと交差しないPCR用プライマーセ
ット及びそれを用いたVZVの検出方法を提供すること
を目的とする。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明はVZVをPCR
法により高感度に検出でき、かつ近縁ウイルスと交差し
ないPCR用プライマーセットを提供することからな
る。
法により高感度に検出でき、かつ近縁ウイルスと交差し
ないPCR用プライマーセットを提供することからな
る。
【0010】ところで、特定の塩基配列の有無をPCR
法により検出するにあたっては、その塩基配列のいかな
る部分に対応するプライマーセットを選択するかが重要
である。プライマーセットの結合位置によってPCR法
による増幅効率が変化することが知られているからであ
る。そして、この予測は一般に困難である。
法により検出するにあたっては、その塩基配列のいかな
る部分に対応するプライマーセットを選択するかが重要
である。プライマーセットの結合位置によってPCR法
による増幅効率が変化することが知られているからであ
る。そして、この予測は一般に困難である。
【0011】そこで、発明者らは次のような観点からV
ZVのグリコプロテインIIをコードする領域の一部を増
幅し得るプライマーセットを選択した。すなわち、VZ
Vの全塩基配列中から(1)プライマー末端がグアニン
もしくはシトシンである8塩基以上30塩基以下、特に
好ましくは20塩基ないし25塩基からなるプライマー
セット、(2)プライマー中のグアニン、シトシン含量
が50%程度でプライマーの全範囲を通じてその偏りが
なく、特にアデニンまたはチミンが7残基以上並ぶこと
がなく、グアニンまたはシトシンが6残基以上ならぶこ
とがないプライマーセット、(3)そのプライマーセッ
トを用いたPCR法による増幅産物が100bpないし
500bpであるようなプライマーセット、(4)近縁
ウイルスの塩基配列との相同性がない部分に結合するプ
ライマーセットの4条件を満たすPCR用プライマーセ
ットを選択した。
ZVのグリコプロテインIIをコードする領域の一部を増
幅し得るプライマーセットを選択した。すなわち、VZ
Vの全塩基配列中から(1)プライマー末端がグアニン
もしくはシトシンである8塩基以上30塩基以下、特に
好ましくは20塩基ないし25塩基からなるプライマー
セット、(2)プライマー中のグアニン、シトシン含量
が50%程度でプライマーの全範囲を通じてその偏りが
なく、特にアデニンまたはチミンが7残基以上並ぶこと
がなく、グアニンまたはシトシンが6残基以上ならぶこ
とがないプライマーセット、(3)そのプライマーセッ
トを用いたPCR法による増幅産物が100bpないし
500bpであるようなプライマーセット、(4)近縁
ウイルスの塩基配列との相同性がない部分に結合するプ
ライマーセットの4条件を満たすPCR用プライマーセ
ットを選択した。
【0012】その1例としては、gpII―1(5′―C
GTGAAATCGCAGTCCATGATGTGG―
3′)とgpII―a(5′―CGTGGTAAATCC
GTGTACGGTGGAA―3′)が挙げられる。こ
れらのプライマーは、ホスホアミダイト法等で合成する
ことができる。合成にあっては、DNA/RNA合成機
を利用すれば便利である。
GTGAAATCGCAGTCCATGATGTGG―
3′)とgpII―a(5′―CGTGGTAAATCC
GTGTACGGTGGAA―3′)が挙げられる。こ
れらのプライマーは、ホスホアミダイト法等で合成する
ことができる。合成にあっては、DNA/RNA合成機
を利用すれば便利である。
【0013】分析対象としては、VZVのDNAを含む
可能性のあるサンプル、即ち、皮膚水疱あるいは血液中
のリンパ球に代表される感染細胞が挙げられる。これら
のサンプルより、核酸成分を抽出して、PCR用テンプ
レート試料として使用する。核酸成分の抽出法として
は、次の方法がある。
可能性のあるサンプル、即ち、皮膚水疱あるいは血液中
のリンパ球に代表される感染細胞が挙げられる。これら
のサンプルより、核酸成分を抽出して、PCR用テンプ
レート試料として使用する。核酸成分の抽出法として
は、次の方法がある。
【0014】lysis buffer(K buff
er:50mM KCl、10mMTris―HCl、
3mM MgCl2 、0.45%Tween20、0.
45%NP40、1mg/ml Proteinase
K)に106 細胞/100μlで懸濁し、65℃で1
晩インキュベートした。その後、98℃で10分間イン
キュベートすることで、Proteinase Kの失
活およびDNAの変性を行った。その溶液をフェノール
処理3回、クロロホルム処理2回を行った後、エタノー
ル沈殿法によりDNAを回収した。これ以外にも、核酸
成分の抽出法としては、上記lysis buffer
でインキュベートするだけの簡便法も使用できる。この
ようにして得られたVZVのDNAテンプレート試料及
びPCR用プライマーセットを使ってPCR法を行っ
た。最近では、PCR法用のキットや専用のシステムが
市販されているので、これを利用することができる。
er:50mM KCl、10mMTris―HCl、
3mM MgCl2 、0.45%Tween20、0.
45%NP40、1mg/ml Proteinase
K)に106 細胞/100μlで懸濁し、65℃で1
晩インキュベートした。その後、98℃で10分間イン
キュベートすることで、Proteinase Kの失
活およびDNAの変性を行った。その溶液をフェノール
処理3回、クロロホルム処理2回を行った後、エタノー
ル沈殿法によりDNAを回収した。これ以外にも、核酸
成分の抽出法としては、上記lysis buffer
でインキュベートするだけの簡便法も使用できる。この
ようにして得られたVZVのDNAテンプレート試料及
びPCR用プライマーセットを使ってPCR法を行っ
た。最近では、PCR法用のキットや専用のシステムが
市販されているので、これを利用することができる。
【0015】この結果、驚いたことにPCR法にて増幅
された増幅産物は、1.5%アガロースゲル電気泳動に
かけた後、エチジウムブロマイド染色法にて解析するこ
とが可能なほど大量に得られていることが明らかにな
り、本発明の完成に至った。
された増幅産物は、1.5%アガロースゲル電気泳動に
かけた後、エチジウムブロマイド染色法にて解析するこ
とが可能なほど大量に得られていることが明らかにな
り、本発明の完成に至った。
【0016】即ち、前述のプライマーの長さ、末端の塩
基、グアニン、シトシンの分布、増幅産物の大きさ、他
の類縁ウイルスとの非相同性に関する選定基準はこの分
野において一般的に用いられているものである。してみ
れば、この顕著な結果は増幅される領域の塩基配列特有
の性質によると考えるほかはない。このことは、VZV
の他の領域を増幅せしめる方法においては、用いるプラ
イマーについて前述の配慮をし、その上さらにNest
ed double PCR法を用いても、なお十分な
PCR産物が得られていないことからも明らかである。
また、実施例において示すごとく、本発明の発明者らに
よっても、VZVのグリコプロテインIIの一部を増幅さ
せた場合だけ増幅産物が十分に得られ、グリコプロテイ
ンI等他の領域を増幅させる場合には十分な増幅が行わ
れないことが確認されている。
基、グアニン、シトシンの分布、増幅産物の大きさ、他
の類縁ウイルスとの非相同性に関する選定基準はこの分
野において一般的に用いられているものである。してみ
れば、この顕著な結果は増幅される領域の塩基配列特有
の性質によると考えるほかはない。このことは、VZV
の他の領域を増幅せしめる方法においては、用いるプラ
イマーについて前述の配慮をし、その上さらにNest
ed double PCR法を用いても、なお十分な
PCR産物が得られていないことからも明らかである。
また、実施例において示すごとく、本発明の発明者らに
よっても、VZVのグリコプロテインIIの一部を増幅さ
せた場合だけ増幅産物が十分に得られ、グリコプロテイ
ンI等他の領域を増幅させる場合には十分な増幅が行わ
れないことが確認されている。
【0017】以上のことから本発明は次のように把握さ
れる。すなわち、VZVのゲノムDNAのうち、グリコ
プロテインIIをコードする領域(前記文献:Davison an
d Scott, J. General Virology, 67,1986,17
59〜1816において57008番目の塩基から59
611番目の塩基まで)の一部をPCR法により増幅す
る過程を含むことを特徴とするVZVの検出方法、及び
当該領域を増幅することのできるPCR用プライマーセ
ットである。
れる。すなわち、VZVのゲノムDNAのうち、グリコ
プロテインIIをコードする領域(前記文献:Davison an
d Scott, J. General Virology, 67,1986,17
59〜1816において57008番目の塩基から59
611番目の塩基まで)の一部をPCR法により増幅す
る過程を含むことを特徴とするVZVの検出方法、及び
当該領域を増幅することのできるPCR用プライマーセ
ットである。
【0018】また、この場合において増幅されるグリコ
プロテインIIをコードする領域の一部が、VZVゲノム
の58823番目の塩基から59161番目の塩基まで
の領域の全部またはその一部であるVZVの検出方法、
及び当該領域を増幅することのできるPCR用プライマ
ーセットである。
プロテインIIをコードする領域の一部が、VZVゲノム
の58823番目の塩基から59161番目の塩基まで
の領域の全部またはその一部であるVZVの検出方法、
及び当該領域を増幅することのできるPCR用プライマ
ーセットである。
【0019】ここで、プライマーを選定するに際し、次
のような配慮をするのが一般的である。 (1)プライマー末端がグアニンもしくはシトシンであ
る8塩基以上30塩基以下、特に好ましくは20塩基な
いし25塩基からなるプライマーセットであること。 (2)プライマー中のグアニン、シトシン含量が50%
程度で、プライマーの全範囲を通じてその偏りがなく、
特にアデニンまたはチミンが7残基以上並ぶことがな
く、グアニンまたはシトシンが6残基以上ならぶことが
ないプライマーセットであること。 (3)そのプライマーセットを用いたPCR法による増
幅産物が100bpないし500bpであるようなプラ
イマーセットであること。 (4)近縁ウイルスの塩基配列との相同性がない部分に
結合するプライマーセットであること。
のような配慮をするのが一般的である。 (1)プライマー末端がグアニンもしくはシトシンであ
る8塩基以上30塩基以下、特に好ましくは20塩基な
いし25塩基からなるプライマーセットであること。 (2)プライマー中のグアニン、シトシン含量が50%
程度で、プライマーの全範囲を通じてその偏りがなく、
特にアデニンまたはチミンが7残基以上並ぶことがな
く、グアニンまたはシトシンが6残基以上ならぶことが
ないプライマーセットであること。 (3)そのプライマーセットを用いたPCR法による増
幅産物が100bpないし500bpであるようなプラ
イマーセットであること。 (4)近縁ウイルスの塩基配列との相同性がない部分に
結合するプライマーセットであること。
【0020】特に好ましくはプライマーセットのうち一
方は、5′―CGTGAAATCGCAGTCCATG
ATGTGG―3′であり、また、もう一方が、5′―
CGTGGTAAATCCGTGTACGGTGGAA
―3′であるプライマーセット及び、これらのプライマ
ーセットを用いるVZVの検出方法である。
方は、5′―CGTGAAATCGCAGTCCATG
ATGTGG―3′であり、また、もう一方が、5′―
CGTGGTAAATCCGTGTACGGTGGAA
―3′であるプライマーセット及び、これらのプライマ
ーセットを用いるVZVの検出方法である。
【0021】もっとも、エチジウムブロマイド染色によ
らずに、ラジオアイソトープや蛍光プローブを使ったd
ot―blot法等でも解析は可能である。この場合に
おいても増幅産物の量が多いことは解析を容易にする点
で有利である。
らずに、ラジオアイソトープや蛍光プローブを使ったd
ot―blot法等でも解析は可能である。この場合に
おいても増幅産物の量が多いことは解析を容易にする点
で有利である。
【0022】本発明のPCR用プライマーセットを用い
たPCR法によれば、HSV等の近縁ヘルペスウイルス
と交差せず、かつ株間の相違なくVZVを検出できる。
更にラジオアイソトープを使わずに、アガロースゲル電
気泳動によるエチジウムブロマイド染色のみで、高感度
(2コピーまで)にVZVを検出できる特徴を有する。
従って、簡便にかつ短時間にVZVの高感度検出が可能
であり、VZVが重症化する前に早期診断をすることが
可能となった。
たPCR法によれば、HSV等の近縁ヘルペスウイルス
と交差せず、かつ株間の相違なくVZVを検出できる。
更にラジオアイソトープを使わずに、アガロースゲル電
気泳動によるエチジウムブロマイド染色のみで、高感度
(2コピーまで)にVZVを検出できる特徴を有する。
従って、簡便にかつ短時間にVZVの高感度検出が可能
であり、VZVが重症化する前に早期診断をすることが
可能となった。
【0023】また、本発明に係るプライマーセットを含
有してなる、VZV DNAを検出するためのキットを
作製することができる。
有してなる、VZV DNAを検出するためのキットを
作製することができる。
【0024】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【0025】
【実施例1】 PCR用プライマーセットの設定 VZVの全遺伝子配列のうちMajor Capsid Protein(M
CP)、グリコプロテインI、II、III 、(gpI、I
I、III )をコードする領域より、下記の条件(1)か
ら(3)を満たす部分をPCR用プライマーセットとし
て選び出した。
CP)、グリコプロテインI、II、III 、(gpI、I
I、III )をコードする領域より、下記の条件(1)か
ら(3)を満たす部分をPCR用プライマーセットとし
て選び出した。
【0026】(1)プライマー末端がグアニンもしくは
シトシンである25塩基からなる領域 (2)プライマー中のグアニン、シトシン含量が50%
程度で偏りなく分布している。特にアデニン、チミンが
7塩基以上並ぶことがなく、グアニン、シトシンが6塩
基以上並ぶことがないもの。 (3)プライマーセットを用いたPCR法により増幅さ
れる産物が100pb〜500bpである。 以上の条件に合うプライマーセットの具体例を下記配列
表に示す。
シトシンである25塩基からなる領域 (2)プライマー中のグアニン、シトシン含量が50%
程度で偏りなく分布している。特にアデニン、チミンが
7塩基以上並ぶことがなく、グアニン、シトシンが6塩
基以上並ぶことがないもの。 (3)プライマーセットを用いたPCR法により増幅さ
れる産物が100pb〜500bpである。 以上の条件に合うプライマーセットの具体例を下記配列
表に示す。
【0027】
【0028】配列番号:1 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 CGTGAAATCGCAGTCCATGATGTGG
【0029】配列番号:2 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 CGTGGTAAATCCGTGTACGGTGGAA
【0030】配列番号:3 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 GTAAAACTGAACGCGGTTACAAGCG
【0031】配列番号:4 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 GCGCATATATCGACCGTAGCATGCT
【0032】配列番号:5 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 CGTGCTTCTGAATCGTACTTTGTCG
【0033】配列番号:6 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 CGACGCAACGATTCGGTAACGTTAT
【0034】配列番号:7 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 CAAAGACTCATTGAGGTGTCAGTGG
【0035】配列番号:8 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:その他 合成DNA 配列 CTGTCCGAAGTACTTTCAAGACACC
【0036】即ち、配列番号1で示されるプライマー
(gpII―1)と、配列番号2で示されるプライマー
(gpII―a)とからなるプライマーセット(gpI
I)、配列番号3で示されるプライマー(gpIII ―
2)と配列番号4で示されるプライマー(gpIII ―
a)とからなるプライマーセット(gpIII )、配列番
号5で示されるプライマー(MCP―1)と、配列番号
6で示されるプライマー(MCP―2)とからなるプラ
イマーセット(MCP)、及び配列番号7で示されるプ
ライマー(gpI―1)と、配列番号8で示されるプラ
イマー(gpI―a)とからなるプライマーセット(g
pI)の4組である。gpII、gpIII 、MCP、gp
Iはそれぞれ339bp、145bp、245bp、3
69bpの領域を増幅し得るプライマーセットである。
(gpII―1)と、配列番号2で示されるプライマー
(gpII―a)とからなるプライマーセット(gpI
I)、配列番号3で示されるプライマー(gpIII ―
2)と配列番号4で示されるプライマー(gpIII ―
a)とからなるプライマーセット(gpIII )、配列番
号5で示されるプライマー(MCP―1)と、配列番号
6で示されるプライマー(MCP―2)とからなるプラ
イマーセット(MCP)、及び配列番号7で示されるプ
ライマー(gpI―1)と、配列番号8で示されるプラ
イマー(gpI―a)とからなるプライマーセット(g
pI)の4組である。gpII、gpIII 、MCP、gp
Iはそれぞれ339bp、145bp、245bp、3
69bpの領域を増幅し得るプライマーセットである。
【0037】合成に先立ち、以上のプライマーについ
て、Gene BANKに登録されている2860種
(4746881 塩基)のDNAに対して、コンピュ
ーターによるホモロジー検索を行い、相同性がほとんど
ないことを確認した。プライマーの合成はDNA/RN
A合成機(Applied Biosystems Inc., model392)を
用いてホスホアミダイト法で行った。
て、Gene BANKに登録されている2860種
(4746881 塩基)のDNAに対して、コンピュ
ーターによるホモロジー検索を行い、相同性がほとんど
ないことを確認した。プライマーの合成はDNA/RN
A合成機(Applied Biosystems Inc., model392)を
用いてホスホアミダイト法で行った。
【0038】
【実施例2】 各種プライマーセットによるVZVの検出 VZV(河口株)感染HEL(ヒト胎児肺)細胞をlysi
s buffer (K buffer:50mM KCl、10mM T
ris―HCl(pH8.3)、3mM MgCl2 、
0.45%Tween20、0.45%NP40、1m
g/ml Proteinase K)に106 細胞/
100μlで懸濁し、65℃で1晩インキュベートし
た。その後、98℃で10分間インキュベートすること
で、Proteinase Kの失活およびDNAの変
性を行った。その溶液をフェノール処理3回、クロロホ
ルム処理2回を行った後、エタノール沈殿法によりDN
Aを回収した。
s buffer (K buffer:50mM KCl、10mM T
ris―HCl(pH8.3)、3mM MgCl2 、
0.45%Tween20、0.45%NP40、1m
g/ml Proteinase K)に106 細胞/
100μlで懸濁し、65℃で1晩インキュベートし
た。その後、98℃で10分間インキュベートすること
で、Proteinase Kの失活およびDNAの変
性を行った。その溶液をフェノール処理3回、クロロホ
ルム処理2回を行った後、エタノール沈殿法によりDN
Aを回収した。
【0039】ここで用いたHEL細胞は、富山医科薬科
大学医学部ウイルス学教室 白木公康氏より分与された
ものである。もっとも、これ以外にも、ヒト二倍体肺細
胞として同一の、MRC―5(ATCC登録番号CCL
171)、WI―38(ATCC登録番号CCL75)
等を用いることができる。
大学医学部ウイルス学教室 白木公康氏より分与された
ものである。もっとも、これ以外にも、ヒト二倍体肺細
胞として同一の、MRC―5(ATCC登録番号CCL
171)、WI―38(ATCC登録番号CCL75)
等を用いることができる。
【0040】次に45μlの反応液(終濃度50mM
KCl、10mM Tris―HCl(pH8.3)、
1.75mM MgCl2 、0.01%ゼラチン、dN
TP各200μM、1.25unit Taqポリメラ
ーゼ、PCR用上流、下流プライマー各20pmol)
に、5μlのテンプレート(上記のDNAを10倍段階
希釈したもの)を加えてPCR法を行った。PCR法は
92℃で1分間→60℃で2分間→72℃で3分間を1
サイクルとし、各サイクル毎に最終ステップを0.06
分間延長しながら30サイクル行った(CETUS96
00を使用)。
KCl、10mM Tris―HCl(pH8.3)、
1.75mM MgCl2 、0.01%ゼラチン、dN
TP各200μM、1.25unit Taqポリメラ
ーゼ、PCR用上流、下流プライマー各20pmol)
に、5μlのテンプレート(上記のDNAを10倍段階
希釈したもの)を加えてPCR法を行った。PCR法は
92℃で1分間→60℃で2分間→72℃で3分間を1
サイクルとし、各サイクル毎に最終ステップを0.06
分間延長しながら30サイクル行った(CETUS96
00を使用)。
【0041】この1回目のPCR(以下「first
PCR」という)の産物の1/10をテンプレートとし
て、再度同様の方法を用いて2回目のPCR(以下「r
epeated PCR」という)を行った。firs
t PCR、repeated PCRによる増幅産物
は、1.5%アガロースゲル(SeaKEM GTG、
TBE buffer:45mM Tris―bora
te/1mM EDTA)の電気泳動にかけた後、エチ
ジウムブロマイド染色を行って、UV照射下で解析し
た。分子量マーカーとしてφX174/HaeIII di
gest(Marker4、ニッポンジーン(株))を
用い、増幅産物の大きさを確認した。
PCR」という)の産物の1/10をテンプレートとし
て、再度同様の方法を用いて2回目のPCR(以下「r
epeated PCR」という)を行った。firs
t PCR、repeated PCRによる増幅産物
は、1.5%アガロースゲル(SeaKEM GTG、
TBE buffer:45mM Tris―bora
te/1mM EDTA)の電気泳動にかけた後、エチ
ジウムブロマイド染色を行って、UV照射下で解析し
た。分子量マーカーとしてφX174/HaeIII di
gest(Marker4、ニッポンジーン(株))を
用い、増幅産物の大きさを確認した。
【0042】図1から図4は、それぞれプライマーセッ
トgpII、gpIII 、MCP及びgpIを用いたfir
st PCR(それぞれの図中(a))及びrepea
ted PCR(それぞれの図中(b))の増幅産物
を、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示
す。図中レーン1〜5は、VZV感染HEL細胞より抽
出したDNAをそれぞれ×1、×101 、×102 、×
103 、×104 希釈してPCR用テンプレートとした
場合を示す。レーン6はテンプレート無し(蒸留水を使
用)の場合を示す。レーンMは分子量マーカー(Mar
ker4)である。右側の矢印は、予想される増幅産物
の分子量を示す。
トgpII、gpIII 、MCP及びgpIを用いたfir
st PCR(それぞれの図中(a))及びrepea
ted PCR(それぞれの図中(b))の増幅産物
を、1.5%アガロースゲル電気泳動にかけた結果を示
す。図中レーン1〜5は、VZV感染HEL細胞より抽
出したDNAをそれぞれ×1、×101 、×102 、×
103 、×104 希釈してPCR用テンプレートとした
場合を示す。レーン6はテンプレート無し(蒸留水を使
用)の場合を示す。レーンMは分子量マーカー(Mar
ker4)である。右側の矢印は、予想される増幅産物
の分子量を示す。
【0043】first PCRでは、使用した4種類
のプライマーセットのいずれを用いても、検出限界(×
102 希釈)に差はなかった。しかし、repeate
dPCRでは、プライマーセットgpIIで行った増幅結
果のみ、検出感度が103倍上昇しており、他の3種の
プライマーセットでは、感度上昇が見られなかった。こ
の結果より、プライマーセットgpIIを、VZV高感度
検出用プライマーセットと決め、以下の研究を行った。
のプライマーセットのいずれを用いても、検出限界(×
102 希釈)に差はなかった。しかし、repeate
dPCRでは、プライマーセットgpIIで行った増幅結
果のみ、検出感度が103倍上昇しており、他の3種の
プライマーセットでは、感度上昇が見られなかった。こ
の結果より、プライマーセットgpIIを、VZV高感度
検出用プライマーセットと決め、以下の研究を行った。
【0044】
【実施例3】 VZV高感度検出用プライマーセット(gpII)を使っ
たrepeatedPCRによるVZVの検出感度 (a)感度検定用gpII部分領域DNAの調製 PCR用プライマーセットgpIIにより増幅されるVZ
Vの遺伝子領域(VZVのゲノムDNAの58823番
目の塩基から59161番目の塩基まで)を含むgpII
の部分領域(同58636番目の塩基から59379番
目の塩基まで)を、VZV感染HEL細胞から抽出した
DNAをテンプレートとして、PCR法により増幅し
た。このとき上流プライマーにEcoRIサイト、下流
プライマーにはPstIサイトをあらかじめ作ってお
き、これらの制限酵素サイトを用いて、pUC118ベ
クターに組み込んだ。このプラスミドを大腸菌(JM1
09株)にトランスフォームし、得られたトランスフォ
ーマントを300mlのスケールで培養した。この培養
液中の大腸菌よりアルカリ法(QIAGEN,BIAG
EN社)を使ってプラスミドDNAを調製した。以後、
このプラスミドDNAを感度検定用gpII部分領域DN
Aとして使用した。ここで、感度検定用gpII部分領域
DNAのDNA濃度は、260nmでの吸光度により算
出した。また、ウイルスのコピー数への換算は、この感
度検定用のgpII部分領域DNAを有するプラスミドが
3873bpであることと、DNAの平均ヌクレオチド
分子量が330であることを使って行い、感度検定用g
pII部分領域DNAの4.25agが1コピーと決め
た。なお、このプラスミドDNA上の塩基配列がVZV
遺伝子の塩基配列と一致していることは、DNAシーク
エンサーを使って確認した。
たrepeatedPCRによるVZVの検出感度 (a)感度検定用gpII部分領域DNAの調製 PCR用プライマーセットgpIIにより増幅されるVZ
Vの遺伝子領域(VZVのゲノムDNAの58823番
目の塩基から59161番目の塩基まで)を含むgpII
の部分領域(同58636番目の塩基から59379番
目の塩基まで)を、VZV感染HEL細胞から抽出した
DNAをテンプレートとして、PCR法により増幅し
た。このとき上流プライマーにEcoRIサイト、下流
プライマーにはPstIサイトをあらかじめ作ってお
き、これらの制限酵素サイトを用いて、pUC118ベ
クターに組み込んだ。このプラスミドを大腸菌(JM1
09株)にトランスフォームし、得られたトランスフォ
ーマントを300mlのスケールで培養した。この培養
液中の大腸菌よりアルカリ法(QIAGEN,BIAG
EN社)を使ってプラスミドDNAを調製した。以後、
このプラスミドDNAを感度検定用gpII部分領域DN
Aとして使用した。ここで、感度検定用gpII部分領域
DNAのDNA濃度は、260nmでの吸光度により算
出した。また、ウイルスのコピー数への換算は、この感
度検定用のgpII部分領域DNAを有するプラスミドが
3873bpであることと、DNAの平均ヌクレオチド
分子量が330であることを使って行い、感度検定用g
pII部分領域DNAの4.25agが1コピーと決め
た。なお、このプラスミドDNA上の塩基配列がVZV
遺伝子の塩基配列と一致していることは、DNAシーク
エンサーを使って確認した。
【0045】(b)検出感度の検定 上記(a)で調製した感度検定用gpII部分領域DNA
を1.9×10-1コピー〜1.9×104 コピーの濃度
に希釈し、PCRプライマーセットgpIIを使用して、
実施例2で示したrepeated PCRを行った。
その増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動にかけ
た後、エチジウムブロマイド染色した結果を図5に示し
た。図中、レーン1は1.9×104 コピー、レーン2
は1.9×103 コピー、レーン3は1.9×102 コ
ピー、レーン4は1.9×101コピー、レーン5は
1.9×100 コピー、レーン6は1.9×10-1コピ
ーのDNAテンプレート濃度でPCRを行った場合を示
す。レーン7はテンプレートDNAなし(蒸留水を使
用)の場合を示す。レーンMは、分子量マーカー(Ma
rker 4)である。また、本プライマーセットを使
った場合の予想される増幅産物の分子量(339bp)
を矢印で示す。
を1.9×10-1コピー〜1.9×104 コピーの濃度
に希釈し、PCRプライマーセットgpIIを使用して、
実施例2で示したrepeated PCRを行った。
その増幅産物を1.5%アガロースゲル電気泳動にかけ
た後、エチジウムブロマイド染色した結果を図5に示し
た。図中、レーン1は1.9×104 コピー、レーン2
は1.9×103 コピー、レーン3は1.9×102 コ
ピー、レーン4は1.9×101コピー、レーン5は
1.9×100 コピー、レーン6は1.9×10-1コピ
ーのDNAテンプレート濃度でPCRを行った場合を示
す。レーン7はテンプレートDNAなし(蒸留水を使
用)の場合を示す。レーンMは、分子量マーカー(Ma
rker 4)である。また、本プライマーセットを使
った場合の予想される増幅産物の分子量(339bp)
を矢印で示す。
【0046】図5より、プライマーセットgpIIによる
repeated PCRによるVZVの検出限界は
1.9コピーであることがわかる。この感度があれば、
VZV感染症の発症前の患者より採取した血液(リンパ
球)からでもVZVを検出することが可能である。な
お、gpII―1と、3′末端側の4塩基を欠いたgpII
―aとからなるプライマーセットによる増幅において
も、gpII―aを用いた場合と同様の結果が得られた。
repeated PCRによるVZVの検出限界は
1.9コピーであることがわかる。この感度があれば、
VZV感染症の発症前の患者より採取した血液(リンパ
球)からでもVZVを検出することが可能である。な
お、gpII―1と、3′末端側の4塩基を欠いたgpII
―aとからなるプライマーセットによる増幅において
も、gpII―aを用いた場合と同様の結果が得られた。
【0047】
【実施例4】 VZVの他株との交差反応性 実施例2で使用した河口株とは疫学的に異なるVZVの
Oka株(ワクチン株)、Batson株についてもプ
ライマーセットgpIIによるPCR法で検出可能である
ことを確認した。ここでVZV河口株及びOka株は大
阪大学微生物病研究所麻疹部門 山西弘一氏より分与さ
れたものであり、同所に分与を申込むことができる。ま
たBatson株は福島医科大学細菌学教室 茂田士郎
氏より分与されたものである。方法は、実施例2と同様
に行い、河口株感染HEL細胞の代わりに、Oka株感
染HEL細胞、及びBatson株感染HEL細胞より
テンプレートDNAを調製し、repeated PC
Rを行った。
Oka株(ワクチン株)、Batson株についてもプ
ライマーセットgpIIによるPCR法で検出可能である
ことを確認した。ここでVZV河口株及びOka株は大
阪大学微生物病研究所麻疹部門 山西弘一氏より分与さ
れたものであり、同所に分与を申込むことができる。ま
たBatson株は福島医科大学細菌学教室 茂田士郎
氏より分与されたものである。方法は、実施例2と同様
に行い、河口株感染HEL細胞の代わりに、Oka株感
染HEL細胞、及びBatson株感染HEL細胞より
テンプレートDNAを調製し、repeated PC
Rを行った。
【0048】repeated PCRによる増幅産物
の1.5%アガロースゲル電気泳動像を図6に示した。
図中、レーン1はVZV Oka株感染HEL細胞から
抽出したDNAを、レーン2はVZV Batson株
感染HEL細胞から抽出したDNAを、レーン3はVZ
V河口株感染HEL細胞から抽出したDNAをそれぞれ
テンプレートDNAとして使ってPCR法を行った場合
を示す。レーンMは、分子量マーカー(Marker
4)である。また、本プライマーセットを使った場合の
予想される増幅産物の分子量(339bp)を矢印で示
す。
の1.5%アガロースゲル電気泳動像を図6に示した。
図中、レーン1はVZV Oka株感染HEL細胞から
抽出したDNAを、レーン2はVZV Batson株
感染HEL細胞から抽出したDNAを、レーン3はVZ
V河口株感染HEL細胞から抽出したDNAをそれぞれ
テンプレートDNAとして使ってPCR法を行った場合
を示す。レーンMは、分子量マーカー(Marker
4)である。また、本プライマーセットを使った場合の
予想される増幅産物の分子量(339bp)を矢印で示
す。
【0049】河口株と同様に、Oka株、Batson
株とも予想される増幅産物(339bp)が確認でき
た。以上より、PCR用プライマーセットgpIIを用い
たrepeated PCRにより、株間の相違なく、
VZVを検出することが可能であった。
株とも予想される増幅産物(339bp)が確認でき
た。以上より、PCR用プライマーセットgpIIを用い
たrepeated PCRにより、株間の相違なく、
VZVを検出することが可能であった。
【0050】
【実施例5】 VZVの近縁ヘルペスウイルス(HSV1、HSV2、
CMV)との交差反応性 VZVの近縁ヘルペスウイルス(HSV1、HSV2、
CMV)に対して、PCR用プライマーセットgpIIを
用いたrepeated PCRで核酸の増幅が行われ
ないことを確認した。方法は、実施例2と同様に、VZ
V(河口株)感染HEL細胞、HSV―1、HSV―
2、またはCMV感染HEL細胞よりテンプレートDN
Aを調製し、プライマーセットgpIIを用いたrepe
atedPCRを行った。
CMV)との交差反応性 VZVの近縁ヘルペスウイルス(HSV1、HSV2、
CMV)に対して、PCR用プライマーセットgpIIを
用いたrepeated PCRで核酸の増幅が行われ
ないことを確認した。方法は、実施例2と同様に、VZ
V(河口株)感染HEL細胞、HSV―1、HSV―
2、またはCMV感染HEL細胞よりテンプレートDN
Aを調製し、プライマーセットgpIIを用いたrepe
atedPCRを行った。
【0051】repeated PCRによる増幅産物
の1.5%アガロースゲル電気泳動像を図7に示した。
図中、レーン1はHSV1感染HEL細胞から抽出した
DNAを、レーン2はHSV2感染HEL細胞から抽出
したDNAを、レーン3はCMV感染HEL細胞から抽
出したDNAを、レーン4はVZV(河口株)感染HE
L細胞から抽出したDNAを、それぞれテンプレートD
NAとして用いてPCR法を行った場合を示す。レーン
Mは、分子量マーカー(Marker 4)である。ま
た、VZVの場合に予想される増幅産物の分子量(33
9bp)を矢印で示す。
の1.5%アガロースゲル電気泳動像を図7に示した。
図中、レーン1はHSV1感染HEL細胞から抽出した
DNAを、レーン2はHSV2感染HEL細胞から抽出
したDNAを、レーン3はCMV感染HEL細胞から抽
出したDNAを、レーン4はVZV(河口株)感染HE
L細胞から抽出したDNAを、それぞれテンプレートD
NAとして用いてPCR法を行った場合を示す。レーン
Mは、分子量マーカー(Marker 4)である。ま
た、VZVの場合に予想される増幅産物の分子量(33
9bp)を矢印で示す。
【0052】repeated PCRによる増幅産物
のバンドは、テンプレートとしてVZVを用いたときに
は339bpに検出できるが、HSV―1、HSV―
2、及びCMVの場合は検出されなかった。このことよ
りプライマーセットgpIIを用いたrepeated
PCRは、VZVと近縁のウイルスであるHSV―1、
HSV―2、およびCMVと交差することなく、VZV
を特異的に検出することができた。
のバンドは、テンプレートとしてVZVを用いたときに
は339bpに検出できるが、HSV―1、HSV―
2、及びCMVの場合は検出されなかった。このことよ
りプライマーセットgpIIを用いたrepeated
PCRは、VZVと近縁のウイルスであるHSV―1、
HSV―2、およびCMVと交差することなく、VZV
を特異的に検出することができた。
【0053】
【発明の効果】本発明のプライマーセットを用いた水痘
帯状疱疹ウイルスの検出方法によれば、同ウイルスを、
その株の種類によらずに、また他の近縁ヘルペスウイル
スに交差反応をすることなく、迅速かつ高感度に検出す
ることができる。かくして、同ウイルス感染症の早期治
療を可能にする迅速診断法が確立された。
帯状疱疹ウイルスの検出方法によれば、同ウイルスを、
その株の種類によらずに、また他の近縁ヘルペスウイル
スに交差反応をすることなく、迅速かつ高感度に検出す
ることができる。かくして、同ウイルス感染症の早期治
療を可能にする迅速診断法が確立された。
【図1】図1は、本発明のプライマーセットgpIIを用
いてのVZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真で
ある。
いてのVZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真で
ある。
【図2】図2は、プライマーセットgpIII を用いての
VZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真である。
VZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真である。
【図3】図3は、プライマーセットMCPを用いてのV
ZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真である。
ZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真である。
【図4】図4は、プライマーセットgpIを用いてのV
ZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真である。
ZV検出結果を示す電気泳動の図面代用写真である。
【図5】図5は、本発明のプライマーセットgpIIを用
いた場合の、VZV検出感度の評価結果を示す電気泳動
の図面代用写真である。
いた場合の、VZV検出感度の評価結果を示す電気泳動
の図面代用写真である。
【図6】図6は、本発明のプライマーセットgpIIを用
いた場合の、各種VZV株との交差反応性を示す電気泳
動の図面代用写真である。
いた場合の、各種VZV株との交差反応性を示す電気泳
動の図面代用写真である。
【図7】図7は、本発明のプライマーセットgpIIを用
いた場合の、VZVの近縁ヘルペスウイルスとの交差反
応性を示す電気泳動の図面代用写真である。
いた場合の、VZVの近縁ヘルペスウイルスとの交差反
応性を示す電気泳動の図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 友森 チエリ 東京都日野市旭が丘4丁目3番2号 帝人 株式会社東京研究センター内
Claims (6)
- 【請求項1】 水痘帯状疱疹ウイルスのゲノムDNAの
うち、グリコプロテインIIをコードする領域の一部をP
CR法により増幅することのできるPCR用プライマー
セット。 - 【請求項2】 増幅されるグリコプロテインIIをコード
する領域の一部が、水痘帯状疱疹ウイルスのゲノムDN
Aの58823番目の塩基から、59161番目の塩基
までの領域の全部またはその一部である請求項1に記載
のプライマーセット。 - 【請求項3】 プライマーセットのうち一方は、5′―
CGTGAAATCGCAGTCCATGATGTGG
―3′であり、また、もう一方が、5′―CGTGGT
AAATCCGTGTACGGTGGAA―3′である
請求項2に記載のプライマーセット。 - 【請求項4】 水痘帯状疱疹ウイルスのゲノムDNAの
うち、グリコプロテインIIをコードする領域の一部をP
CR法により増幅する過程を含むことを特徴とする水痘
帯状疱疹ウイルスの検出方法。 - 【請求項5】 増幅されるグリコプロテインIIをコード
する領域の一部が、水痘帯状疱疹ウイルスのゲノムDN
Aの58823番目の塩基から、59161番目の塩基
までの領域の全部またはその一部である請求項4に記載
の水痘帯状疱疹ウイルスの検出方法。 - 【請求項6】 プライマーセットのうち一方は、5′―
CGTGAAATCGCAGTCCATGATGTGG
―3′であり、また、もう一方が、5′―CGTGGT
AAATCCGTGTACGGTGGAA―3′である
プライマーセットを用いる請求項5に記載の水痘帯状疱
疹ウイルスの検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17081793A JPH07199A (ja) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | 水痘帯状疱疹ウイルス検出用プライマーセット及びそれを用いる同ウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP17081793A JPH07199A (ja) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | 水痘帯状疱疹ウイルス検出用プライマーセット及びそれを用いる同ウイルスの検出方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07199A true JPH07199A (ja) | 1995-01-06 |
Family
ID=15911887
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP17081793A Pending JPH07199A (ja) | 1993-06-18 | 1993-06-18 | 水痘帯状疱疹ウイルス検出用プライマーセット及びそれを用いる同ウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07199A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0927760A3 (de) * | 1997-12-23 | 2000-10-11 | Dade Behring Marburg GmbH | Immunreaktive Bereiche des Glycoproteins gpII des Varicella Zoster-Virus (VZV) |
US6849407B2 (en) | 2000-08-31 | 2005-02-01 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of varicella-zoster virus |
-
1993
- 1993-06-18 JP JP17081793A patent/JPH07199A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0927760A3 (de) * | 1997-12-23 | 2000-10-11 | Dade Behring Marburg GmbH | Immunreaktive Bereiche des Glycoproteins gpII des Varicella Zoster-Virus (VZV) |
US6849407B2 (en) | 2000-08-31 | 2005-02-01 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of varicella-zoster virus |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Henry et al. | Structure of the genome of equine herpesvirus type 1 | |
Tenorio et al. | Detection and typing of human herpesviruses by multiplex polymerase chain reaction | |
Lungu et al. | Reactivated and latent varicella-zoster virus in human dorsal root ganglia. | |
Nugent et al. | Analysis of equid herpesvirus 1 strain variation reveals a point mutation of the DNA polymerase strongly associated with neuropathogenic versus nonneuropathogenic disease outbreaks | |
Compton | Degenerate primers for DNA amplification | |
Traktman et al. | Transcriptional mapping of the DNA polymerase gene of vaccinia virus | |
Cohrs et al. | Analysis of individual human trigeminal ganglia for latent herpes simplex virus type 1 and varicella-zoster virus nucleic acids using real-time PCR | |
Davison et al. | Nucleotide sequences of the joint between the L and S segments of herpes simplex virus types 1 and 2 | |
Szpara et al. | Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations | |
Völter et al. | Screening human tumor samples with a broad-spectrum polymerase chain reaction method for the detection of polyomaviruses | |
Clarke et al. | Configuration of latent varicella-zoster virus DNA | |
Grose et al. | Complete DNA sequence analyses of the first two varicella-zoster virus glycoprotein E (D150N) mutant viruses found in North America: evolution of genotypes with an accelerated cell spread phenotype | |
Takada et al. | Identification of varicella-zoster virus strains by PCR analysis of three repeat elements and a PstI-site-less region | |
Deback et al. | Utilization of microsatellite polymorphism for differentiating herpes simplex virus type 1 strains | |
Heller et al. | Repeat arrays in cellular DNA related to the Epstein-Barr virus IR3 repeat | |
Sakaoka et al. | Demonstration of either endogenous recurrence or exogenous reinfection by resiriction endonuclease cleavage analysis of herpes simplex virus from patients with recrudescent genital herpes | |
Suzutani et al. | Rapid phenotypic characterization method for herpes simplex virus and varicella-zoster virus thymidine kinases to screen for acyclovir-resistant viral infection | |
Obara et al. | Distribution of herpes simplex virus types 1 and 2 genomes in human spinal ganglia studied by PCR and in situ hybridization | |
Balliet et al. | Construction and characterization of a herpes simplex virus type I recombinant expressing green fluorescent protein: acute phase replication and reactivation in mice | |
Barrett-Muir et al. | Investigation of varicella-zoster virus variation by heteroduplex mobility assay | |
Widen et al. | Development of a PCR system for porcine cytomegalovirus detection and determination of the putative partial sequence of its DNA polymerase gene | |
Holden et al. | The IR3 gene of equine herpesvirus type 1: a unique gene regulated by sequences within the intron of the immediate-early gene | |
US6242567B1 (en) | Method for detection and prevention of human cytomegalovirus infection | |
JPH07199A (ja) | 水痘帯状疱疹ウイルス検出用プライマーセット及びそれを用いる同ウイルスの検出方法 | |
JP2006223180A (ja) | マルチプレックスpcrを用いたヘルペスウイルス遺伝子検出法 |