KR100224331B1 - 조환수두 대상포진바이러스 및 그 제작방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 게놈의 유전자군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 삽입함으로서 제조되는 조환수두대상포진 바이러스, 기술한 조환바이러스의 게놈 DNA, 유효성분으로서 기술한 조환 바이러스를 함유하는 생백신, 기술한 조환바이러스에서 유래한 항원, 기술한 항원을 함유하는 진단제를 제공한다.
본 발명의 조환수두 대상포진 바이러스는, 닭의 수두 및 B형 간염에 동일하게 우수한 면역효과를 보유하는 다가 백신으로 이용될 수 있고, 그것의 발현산물과 게놈 DNA는 다가 진단제로서 이용할 수 있다.

Description

조환두수 바이러스 및 그 제작방법
제 1 도는, 본 발명의 조환 VZV구조의 설명도이다.
A공정은 VZV DNA 및 키메라 플라스미드(chimeric plasmid) DNA(pHH)의 코트란스펙션(cotransfection)과정이고, B는 IFA 테스트에 의한 조환선별(recombination screening)과정이다.
제 2 도는 VZV tK 유전자와 HBVpreS2-HBs 유전자의 DNA 염기배열과, 이들 유전자의 조환형 배열에 대한 설명도이다.
표시 : Sta*-preS2 유전자의 개시코돈(starting codon), Sta**-HBs 유전자의 개시코돈, Sta***-VZVtk 유전자의 개시코돈, Ter-HBs 유전자의 종료코돈(termination codon), X*-VZV tk 유전자에 대한 염기, X1-T4DNA 폴리머라아제를 보유하는 플레쉬(flesh)단에 대한 염기, X-HBs 유전자에 대한 염기.
제 3 도는, 본 발명의 조환 VZV에 감염된 세포에서 분비된 HBs의 정제를 나타낸다.
감염된 세포에서 분비된 HBs는 농축되고 CsCl평형원심분리법의 영향을 받는다.
화분(fraction)의 밀도(●)는 부피와 무게측정에 의해 감시되고, HBs 항원역가(○)는 RPHA 테스트로 분석된다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 조환두수 대상포진 바이러스와 그 제작법에 관한 것이며, 이렇게 얻어진 조환수두 대상포진 바이러스와 그 항원 및 게놈 DNA는 백신, 면역학적 진단제, 유전자진단제, 유전자공학시약 등으로 이용할 수 있다.
바이러스유전자에 외래유전자 또는 이종유전자를 삽입함에 의해 조환 바이러스를 작성하는 기술, 즉 바이러스 게놈을 클론과 또는 발현벡터로서 사용하는 기술은 1979년경으로, 예컨대, 바이러스벡터로서 SV40을 이용한 집토끼 β-글로빈의 생산[Nature(London), 277, 108-114, 1979, 동상, 278, 35-40, 1979] 등에 의해 추정된다.
1980년, 세계보건기구(WHO)총회가 백신의 성과에 의거하여 천연두의 근절을 선언하고, 종두의 폐지를 권고하였다.
그 아래, 종두의 유효성분인 독약화 바이러스로서의 수두바이러스의 유효이용이 세계적으로 주목되고 재평가 되어지고있다.
그런 상황하에서, 언급한 바이러스 게놈을 외래 유전자의 클론화 및 발현벡터로서 이용하는 것을 목적으로 작출한 조환수두 바이러스가 보고되었다[Proceedings of National Academy of Science(USA), 79, 4927-4931, 1982 ; 동상, 79, 7415-7419, 1984].
이 WHO의 제창은 하기를 시사한다 ; 종래 사용한 플라스미드벡터, 페이스(phase)벡터, 코스미드(cosmid)벡터 등의 숙주(주로 박테리아나 효모)는 좁으므로, 그러한 결점을 해소하기 위한 목적으로 고등동물세포를 숙주로 하는 광숙주역의 수두바이러스벡터와 같은 바이러스벡터를 개발한다 ; 2종이상의 이종항원이나 이종바이러스로 이루어진 종래의 혼합백신에 대신하는 것으로서, 수두바이러스게놈에 2종이상의 외래유전자를 삽입하여 제작한 조환수두 바이러스를 유효성분으로 사용하는 다가백신을 개발한다.
상술한 WHO선언이나 제창을 기점으로 하여, 각종 바이러스벡터에 대한 기초연구 및 개발이 각 방면에서 적극적으로 전개되고, 그 결과, 벌써 방대한 데이터가 축적되고 있다.
즉, 이와 같은 바이러스 벡터로서, 예컨대 수두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 레트로바이러스, 액포바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 마렉빙바이러스, 수두 바이러스, 파르보 바이러스, 꽃양배추 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 토마토 골든 모자이크 바이러스 등의 바이러스게놈이 벌써 알려져 있다[바이러스, 36, 1-41, 1986 ; 동상, 37, 1-40, 1987 ; Current Communication in Molecular Biology : 바이러스벡터, PP.10198, Y. Olusman 및 S. H. Hughes(ed.), Cold Spring Hartor Laboratory(USA) 1988년 발행 ; 유럽공개공보 제334,530호].
상기 바이러스 벡터 중에서, 본 발명에 관련된 수두 대상포진 바이러스(이하 VZV라 약기한다)에 대해, 이하에서 설명한다.
VZV는 일반적으로 세포 내 유래성 바이러스이고, 그 감염성이 생세포내에만 유지되므로, 바이러스의 분리, 시험관 내에서의 배양 및 대량생산이 어렵다.
따라서, VZV 백신 및 진단제의 개발뿐 아니라 닭의 수두의 병원체로서의 VZV의 기초 및 임상연구는 주저되는 경향에 있다.
그 때문에 VZV의 연구는, 본 발명자들이 1975년에 세포유리(cell-free)의, 수두생 백신용의 독약화 VZV강주를 확립하기까지, 좀처럼 진전되지 않았다(Biken Journal, 23, 53-55, 1975 ; 특공소 51-19018 ; 특공소 53-41292 ; 특공소 56-42144).
상기의 독약화 VZV강주를 사용하는 생백신의 개발이 계기가 되고, 세계각지에서 VZV의 기초와 임상 및 응용연구가 적극적으로 전개되고 있다.
현재에는, 이 독약화 VZV강주를 유효성분으로서 사용하는 수두생백신이 세계각국에서 광범위하에 실용으로 제공되고 있다[Requirements for Varic-ella Vaccine(Live) Adopted 1984 ; WHO Technical Report Series, No. 725, pp. 102-124, 1985].
VZV의 기초, 임상, 진단, 면역학 등에 의한 방대한 데이터도 벌써 축적되고 있다[Virology, vol.2,pp. 2011-2054, B.N.Fields, etal.(ed.), Raven Press(USA), pud. 1990]
특히, VZV게놈의 구조분석에 관해서는, 1980년대에 들어, 유전자의 클론화와 그 발현, 단일클론성 항체 등의 기술개발과 보급에 따라, VZV게놈 DNA의 제한 지도작성과 전염기 배열 결정 둥에 의해, 장족의 진보를 이루고 있다(Journal of General Virology, 67, 1759-1816, 1986 ; 동상, 67, 1817-1829, 1986 ; 바이러스, 37, 71-80, 1987).
상기의 문헌에 의하여 VZV에 관한 바이러스학상의 지견은 다음과 같다.
VZV는, 엔벨로프(envelope)를 보유하고, 분류학적으로는 단순 헤르페스 바이러스군, 즉 헤르페스 바이러스과 알파헤르페스 바이러스아과에 속하는 직경이 약 180-200nm의 DNA형 바이러스이다.
이 게놈은, 약 120kb(Kilobase)의 2개쇄를 보유하는 선형DNA로 이루어지고, 핵단백질체(uncleocapsid)내부의 직경 약 75nm의 도넛 형태의 코어(core)에 내재하고 있다.
이 게놈 DNA는, 독특한 배열(U)의 긴 단편(UL)과 짧은 단편 (US), UL에 인접하는 terminal repeat(TR)배열 TRL과 US에 인접하는 배열TRS, 및 이들의 각 TR에 상보적으로 염기배열의 방향이 역방향인 2개의 inverted repeat 9(IR), 즉 TRL에 상보적인 IRL, 및 TRS에 상보적인 IRS로 되어 있다.
이들 6단편은, 5'에서 3'말단의 방향으로 TRS, UL, IRL, TRS, US, TRS순으로 늘어서 있다.
현재, 합계 71개의 ORF(open reading frames)가 5'말단에서 순서적으로 1부터 7까지 번호를 붙어놓고, 이들 유전자중 기능이 확인 또는 추정되어 있는 것은 다음의 21ORF이다[괄호안에 숫자는 ORF번호를 각각 의미한다] : (4) 초기단백질, (8) 데옥시 우리진 트리포스페타아제, (10) 트랜스-유도단백질, (13) 티미딘 합성효소, (14) 당단백질(이하 gp로 약기한다 V, (18) 폴리뉴클레오티드 환원 효소 대 서브유닛, (28) DNA 합성효소, (29) DNA 결합단백질, (31) gpⅡ, (36) 티미딘 키나아제(이하 tk로 약기한다). (37) gpⅢ, (40) 캡시드 단백질, (48) 액소뉴클레아제, (62, 71) 초기단백질, (63, 70) 초기단백질, (66) 단백질 키나아제, (67) gpⅣ, 그리고 (68) gpⅠ.
VZV를 바이러스 벡터로서 사용하여 작출한 조환VZV에 대하여는 다음과 같다 : VZV의 gpⅠ 유전자촉진제의 하류영역에 외래유전자를 삽입하여 얻은 조환 VZV이고, 외래유전자가 에프슈타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)의 gp350유전자(특개소 63-12277 또는 유럽공개공보 제251534호 ; 특개소 63-141589 ; Journal of Virology, 61, 1796-1867, 1987), 왜래유전자가 항간염바이러스(이하 HSV로 약기한다)의 preS2 및 표면항원(이하 HBs라 약기한다)유전자(특개소 63-12277 또는 유럽공개공보 제 251534호)인 것; VZV의 gp Ⅰ 유전자촉진제의 하류에 에프슈타인-바 바이러스의 gp300과 gp220의 각 유전자를 연결한 유전자 단편을 다시 VZV tk 유전자내에삽입하여, 에프슈타인-바이러스 유전자를 tk와의 융합단백질로서 발현시켜서 제작한 조환VZV[Proceedings of National Academy of Science USA, 84, 3896-3990, 1987 ; UCLA Symposia on Molecular Biology ; New Series, vol. 84 : Technical Adrances of Vaccine Development, pp. 235-241, by R. W. Ellis, at al., Alan R. Liss, Inc.(USA)pud. 1988 등].
그러나, 이들 조환 VZV는 모두 면역원성이 낮고, 안전성과 유효성이 확인되어 있지 않다.
이들 VZV를 항원으로서 사용하여 백신이나 진단제를 시장에 내놓는 시도는 현재 알려져 있지 않다.
따라서, 조환VZV는 아직 실용적 적용에 이르지 못했다고 판단된다.
그 이유로서는 다음과 같다 : (1) 게놈의 길이가 통상, 약 10kb인 소형바이러스에 대해, 전술한 VZV는 대형이고, 그 감염성 게놈은 약 120kb로 극히 길고, 그 DNA장쇄는 절단되기 쉬워 불안정하다 ; (2) VZV는 본래, 열에 극히 불안정한 세포의존성 바이러스이고, 그 감염성유지에는 -60℃ 이하에서의 보존을 필요로 하는 등, 그 취급, 배양, 대량생산 등이 용이하지 않다 ; (3) 바이러스배양에 있어서 1세포당 감염성 바이러스 입자 생산수에 관해, 다른 바이러스가 통상, 약 10-100입자인 것에 대하여, VZV 경우는 약 0.1개로 생산수율이 극히 저조하다는 것 등이다.
이들 이유로 인해, VZV배양에 의한 게놈의 양산뿐 아니라, 시험연구단계에서의 사용에 견디는 VZV게놈 DNA의 조제와 클론화는 매우 곤란하고, 또한 산업이용상, 질과 양 공히 적격한 조환 VZV를 선별 채취하는 확률이 극히 저조하다.
환언하면, 조환 VZV주의 확립에는 이들 매우 곤란한 조건을 극복할 필요가 있다.
본 발명의 목적은, 삽입되는 외래 유전자의 고발현기능을 보유하고, 그러한 발현능이 잇따른 세대(generation)를 통해 유전학적으로 안정하고, 생백신의 성분으로서 적격한 안전성과 유효성을 보유하고 새로운 조환 VZV를 제공하는 것이다.
더욱 구체적으로 본 발명은, 실용적 이용의 관점에서, 특히 다른 숙주벡터개와의 배양과 대량생산이 곤란한 HBV유전자를 운반하는 조환VZV를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, VZV의 유전자 촉진제의 하류영역에, HBV게놈의 유전자군에서 선택된 1종이상의 유전자를 삽입한 조환 VZV와, 그 제작법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기의 조환 VZV의 게놈 DNA, 이 조환 VZV를 함유하는 생백신, 이 조환 VZV에서 유래한 항원, 및 이 항원을 함유하는 진단제도 제공한다.
본 발명의 구성과 바람직한 실시예는 다음과 같다.
[바이러스 백터로서의 VZV주]
본 발명에서는, 안전성, 유효성 및 균질성을 병유하는 조환생백신의 작출을 주목적으로 하여 VZV게놈을 벡터로서 사용한다.
본 발명에 의하면, 예컨대 강(ATCC VR-795), Webster(ATCC VR-916), Ellen(ATCC VR-586), YS, YG, SCOLL, Kawaguchi and Dumas 등의 기존의 공지VZV주(Journal of General Virology, 67, 1816-1829, 1986; 바이러스. 37, 71-80, 1897) 및 장래 분리되는 VZV주 등을 임의로 사용할 수 있다.
이들 VZV주중, 시험연구나 제조상에서의 취급에 있어서 안전성의 확보, 및 안전성과 유효성을 겸비함 생백신 및 진단제 제공 등의 산업상 이용을 고려하면, 독약화 VZV주의 사용이 바람직하다.
특히, 상기의 주목적의 관점에서, 독약화 VZV강주는, 그 안전성과 유효성이 세계적으로 확정, 공인되어, 현재 세계수준으로 사용되고 있는 유일한 DNA형의 독약화 바이러스이므로, 본 발명에 최적하다.
[VZV의 배양과 그 세포선택]
인간, 원숭이, 모르토트 등에서 유래한 VZV 감수성이 공지인 세포를 사용할 수 이다.
이들 세포중, 미입인자 및 발암성인자의 혼입확률, 백신용 바이러스주 배양의 세포로서의 적격성, 생산 바이러스양 등을 고려하면, 생백신 제조용으로서 공인된 2배체 세포, 예컨대 HEL299(ATCC NO. CCL 137), MRC-5(ATCC NO. CCL 171), WI-38(ATCC NO, CCL 75) 4 등의 사용이 바람직하다.
이들 세포의 중식과 유지량 배지, 및 바이러스 배양배지로서, 시판 합성배지, 예컨대 199배지[Difco사(미국)제, MEM배지 Gibco사(미국)제]등을 사용할 수 있다.
이러한 배지는 사용직전에, 약 7%(w/v)의 NaHCO3수용액 적하혼합하여 pH약 6.8-8.0으로 조정한 후, 다시 치사성 소혈청[예컨대, Flow사(미국)제]를 최종농도가 약 2-15%(w/v)가 되도록 추가하여 첨가 혼합함에 의해, 배양에 제공한다.
VZV의 배양은, 미리 조제한 배양세포에 그 조 바이러스(seed virus)를 접종한 후, 유지배지를 사용하여 행한다.
배양온도는 25-50℃, 바람직하게는 33-38℃가 추천된다.
[HBV유전자를 삽입하는 VZV유전자의 선택]
본 발명에 의하면, 이론적으로는, 전술한 71개의 모든 VZV유전자를 각각, HBV유전자를 삽입하는 부위로서 사용할 수 있다.
이러한 사용상의 유의점으로서, 각 유전자의 촉진제가 기능할 수 있도록, 촉진제의 하류를 차지하는 ORF 영역에 HBV 유전자를 삽입하는 것, 및 번역이 윤활하게 진행하도록 VZV유전자와 외래유전자 상호코돈을 파괴함이 없이 삽입하는 것 등을 들 수 있다.
일반적으로, 외래유전자가 삽입된 바이러스 유전자는 파괴되어 본래 기능을 발휘하지 못하므로, HBV 유전자를 연결하는 유전자 촉진제로서, 바이러스의 감염성 및 증식성에 영향을 미치지 않고, 또한 다량발현을 보유하고, 촉진제강도가 강한 유전자, 예컨대 tk유전자나 gp유전자 등의 채용이 바람직하다.
특히, 독약화 VZV 강주를 사용하는 경우에는, gpV유전자(14th ORF)의 결손이나 발현기능의 저하(Journal of Virology, 64, 4540-4548, 1990)가 알려져 있으므로, 이 유전자 영역의 사용은 추천될 수 없다.
그러나, VZV야생형의 gpV유전자의 사용은 가능하고, 그 유전자촉진제의 하류에 HBV유전자를 삽입하는 것에 의해, 그 gpV를 코드화하는 유전자영역의 파괴 또는 발현량 저하를 일으킬 수 있다.
이것에 의해 얻어진 조환 VZV는, 독약화 VZV강주와 유사한 독약화 주로서, 매우 높은 유용성이 기대된다.
[VZV게놈 내에 삽입되는 HBV유전자의 선택]
본 발명에 의하면, 이론적으로는, VZV의 증식성과 감염성에 지장을 주지 않는 범위 내에서, HBV게놈의 유전자군에서 선택되는 1종이상의 유전자를 외래유전자로서 사용할 수 있다.
단, 조환VZV의 생백신으로서의 사용을 고려하여, 독성물질, 위해 작용물질, 독소 등을 코드화하는 유전자 영역의 외래유전자중에 연좌하지 않도록, 세심한 주위를 할 필요가 있다.
예컨대, HBV의 preS1영역과 중합인체혈청알부민 수요체인 preS2 부영역은 공히 간세포에의 친화성이 알려져 있으므로, 이러한 영역을 코드화하는 유전자의 근방을 외래유전자로서 사용하는 경우에는, 그 당영역을 제한효소를 제기할 필요가 있다.
HBV유전자를 삽입하는 조환 VZV는, HBV와 VZV에 대한 양자의 항원성 및 면역원성을 병유하여, 더욱이 독약화주이다.
따라서, B형 간염과 닭의 수두에 대하여 동시면역이 가능한 2가 생백신의 유효성분으로서, 또한 HBV와 VZV양항원으로 이루어진 진단용의 2가 항원으로서 실용에 제공할 수 있다.
여기에서 특별한 것은, 종래기술에서는 불활성화 백신으로만 제공되어 얻을 수 없는 항원, 예컨대 HBV항원을, 본 발명에 의하면, 생백신으로서 실용에 제공하여 얻는 것이다.
[조환 VZV의 제조]
이 과정은 다음의 순서로 이루어진다 : 외래유전자를 삽입하도록 하는 VZV유전자의 클론화 ; 외래유전자의 클론화 ; 클론화한 VZV유전자에 외래유전자를 삽입한 키메라 플라스미드의 제조 ; 이 키메라 플라스미드와 VZV게놈사이의 코트란스펙션에 의해, 조환 VZV의 작출.
이하 이 순서로 설명한다.
(1) VZV유전자의 클론화 : 후술의 실시예 1에 기재한 요령으로 VZV게놈 DNA를 그 감염세포에서 추출, 정제한 후, 이 DNA를 제한효소로 소화하고, 통상적인 아카로즈겔 전기영동으로 분화하여 조제한 이들 DNA 단편을, 시판 또는 공지한 숙주 벡터계(P. H. Powels, Cloning Vector-A Laboratory Manual, 2 rols., Elsevier, 1985 ; ATCC Recombinant DNA Materials, American Type Culture Collection, 1989)로 사용하여 클론화한다.
예컨대, VZVtk유전자는, VZV게놈을 제한효소 Sac Ⅰ로 소화하여 조제한 H단편(Intervirology, 29, 301-310, 1988)을 대장균 플라스미드 벡터 pVC12[Methods in Enzymology, vol.101, pp. 20-78, Academic Press(미국), 1983]의 Sac Ⅰ부위에 삽입한 후, 이것을 대장균 JM109주(ATCC NO. 53323)에 이입하여 형질전환시키므로서, 클론화할 수 있다.
이 공정의 간략화로는, 이미 클론화된 VZV유전자(예컨대, Journal of General Virology, 67, 1817-1829, 1986)를 이용할 수 있다.
(2) HBV유전자의 클론화 : 적출한 HBV감염조직세포나 배양한 HBV감염세포의 계면활성제 또는 초음파에 의한 용액, 바이러스 배양상청이나 감염개체의 혈액 등을 출발재료로서 사용할 수 있다.
재료의 정재수단으로서 공지의 상법을 조합시켜서 사용할 수 있다.
예컨대, 유안(황산암모니아)염석법, 저속원심법, 또는 밀도구배초원심법 등을 조합시켜 사용하므로서, 출발재료에서 먼저 바이러스입자의 정제를 구획 분할하여 조제한다.
이 정제하여 구획분할 한 곳에서 게놈DNA의 추출과 정제는, 그 불가역적변성을 피하므로, pH3-10에서의 실시가 바람직하고, 공지의 상법에 의해 실시할 수 있다.
예컨대, 100℃의 NaCl용액을 사용하는 열식염법, SDC(디옥시콜산나트륨)이나 SDS(디옥실유산나트륨) 등을 사용하는 세제법, 2상분배의 원리에 의거하는 페놀 추출법, 염산 구아니딘의 농축액을 사용하는 염산구아니딘(quanidine chloride)법, NaOH용액이나 Na2CO3-NaHCO3완충액 등을 사용하는 약 pH10에서의 알칼리법, 냉에탄올을 사용하는 알코올침전법 등을 적절히 조합시켜 채용하므로서 게놈 DNA를 조제할 수 있다.
이 DNA는 상기의 (1)과 동일한 요령으로 클론화한다.
이 공정을 간략화하기 위해, 이미 클론화된 HBV유전자를 사용할 수 있다.
예컨대, pH1B11[특개소 63-22098(Biken No. 1081)]에 클론화된 HBVpreS1-preS2-HBs 항원유전자 등을 이용할 수 있다.
(3) VZV-HBV 유전자의 키메라 플라스미드의 제조 : 상술한(1)의 요령으로 제조한 플라스미드 벡터내의 VZV 유전자의 하류영역을 제한 효소로 소화하고, 상기(2)에서 클론화한 HBV유전자에서 유도된 DNA단편을, 기술한 플라스미드 벡터의 제한 부위에 삽입하고, 이 플라스미드를 숙주세포에 삽입하여 형질전환시킨다.
이렇게 해서, VZV유전자와 HBV유전자가 연계된 키메라 플라스미드를 구성한다.
(4) 조환 VZV의 작출 : 상기 (1)에서의 VZV게놈과 (3)에서 조제한 키메라 플라스미드를 동시에 숙주세포로 삽입하고, 이들 사이에서 조환을 일으켜서 조환 VZV를 작출한다.
숙주세포로의 DNA화분과 키메라 플라스미드 DNA의 도입에는, 공지의 상법, 예컨대 DEAE 텍스트란법, 전기천공법, 또는 인산칼슘법 등을 적용할 수 있다.
인산칼슘법(Virology, 52, 465-467, 1973)의 경우, 인산이온과 칼슘이온의 공존하에서 형성되는 양 DNA의 공침전물을 조제한 후, 이것을 세포배양에 접촉하여, 코트란스펙선 시킨다.
VZV친주를 사전에 접종하여 약 2-3시간 배양한 감염세포에, 키메라 플라스미드 DNA의 인산칼륨공침전물을 적하하여 접촉시켜, 그 DNA를 VZV감염세포에 도입할 수 도 있다.
이어서, 이들 세포를 배양하고, 그 배양계에서 VZV게놈 DNA와 키메라 플라스미드 DNA사이에서 조환을 일으켜, 조환 VZV를 작출할 수 있다.
(5) 조환 VZV와 그 배양 : 본 발명에서 유효한 각종 조환 VZV클론은 모두 독약화 VZV주이고, 생백신의 유효성분으로서 사용할 수 있다.
예컨대, VZV와 HBV 양 유전자사이의 조환 VZV클론은, 후술의 실시예 6에서 나타나듯이 rHv 강주시리즈로 총칭되고, 명명된 다음의 20주로 이루어진다 : rVH1강주, rVH2, rVH3, rVH4, rVH5, rVH6, rVH7, rVH8, rVH9, rVH10, rVH11, rVH12, rVH13, rVH14, rVH15, rVH16, rVH17, rVH18, rVH19, 및 rVH20의 각 강주.
본 발명의 조환 VZV는, 후술의 실시예 1에서의 기재와 같은 요령으로, 배양세포에 조환 VZV종바이러스를 접종하여 배양할 수 있다.
그 배양성청 및 감염세포 내에서는, 감염성의 조환 VZV입자이외에, 조환 VZV게놈의 발현산물인 각종 항원이 생산된다.
예컨대, 상기의 rVH7강주를 배양하면, 조환 VZV입자 이외에, 그 배양상청에는 분자량이 30k, 35k 등의 HBs 폴리펩티드가, 또한 감염세포내에는 26k, 30k 등의 HBs 폴리펩티드가 각각 생산된다.
조한 VZV의 배양물 중에 생산되고, 이들 항원, 바이러스 입자와 그 DNA는 모두, 백신, 면역학적 진단제, 유전자 진단제, 또는 유전자공학 시약으로서 이용할 수 있다.
[조환 VZV게놈 DNA의 제한 효소 분석]
공지의 상법, 예컨대 Southern blot법(Journal of Molecular Biology, 98, 503, 1975)에 의해 분석할 수 있다.
더 구체적으로, VZV게놈을 제한효소로 소화하여 조제한 DNA단편을 아가로즈겔전기영동으로 분화하고, 이들 화분(畵分)을 니트로 셀룰로오즈 세포막에 옮긴다.
그때, RI(방사선 동위원소)로 표지의 프로브(probe)와의 사이에 혼성화(hybridization)를 행하고, 이렇게 처리된 화분의 반응상을 방사선 자동사진법에 의해 분석한다.
[조환 VZV항원의 측정, 검출 및 동정]
조환 VZV배양에 의해 생산되는 바이러스 입자 및 각종 항원의 측정, 검출 및 동정은, 면역학 및 혈청진단에서 상용되고 있는 공지의 방법, 예컨대 항체로 코우트(coat)한 적혈구를 사용하는 RPHA(역 수신 적혈구응집반응)법, 효소로 표지한 항체를 사용하는 ELISA(효소결합항체 면역측정법)또는 EIA(효소 면역 측정법), RI로 표지한 항제를 사용하는 RIA(방사면역분석시험), FITC(fluorescein isothiocyanate)로 표지한 항체로 감염세포를 염색하여 형광현미경 하에서 항원의 존재를 판정하는 면역형광법, 또는 RI표지한 배지성분을 첨가 혼합한 배지 중에서 조환 VZV를 배향하여 조제한 RI표지항원과 미리 조제한 항체와의 사이의 면역침강반응을 SDS-PACE(SDS-폴리아크릴아미드 전기영동)에 걸어 분자량이 크기에 따라 분화한 후, 그 전기영동상을 자동방사선 사진법으로 분석하는 면역침강법 등의 채용이 가능하다.
이 공정을 간략화하기 위해, 시판되고 있는 각종 측정 카드(kit)를 사용할 수 있다.
항원 밀도는 공지의 상법, 예컨대 밀도구배평형원심법에 의해 측정할 수 있다.
항원입자의 형태는 전자현미경으로 관찰할 수 있다.
[조환 VZV의 감염가의 측정]
공지의 상법, 예컨대 감염세포의 라운딩(rounding)을 지표로 하는 CPE(세포변성효과)를 광학현미경 하에서 판정하는 CPE법 ; 뉴우트럴 레드와 아가로즈를 함유하는 고형배양배지를 중층한 감염세포의 배양에 의해 형성되는 각 플라크(plaque)를 1단위로 하는 PFUs(플라크 형성단위)를 육안으로 계산하는 플라크검정법 ; 포르말린으로 고정한 감염세포를 메틸렌 블루용액으로 염색하여 PFUs를 육안으로 계산하는 플라크 검정법 ; 감염세포가 형성하는 포커스(focus)의 수, FFUd(포커스 형성단위)를 광학 현미경하에서 계수하는 포커스법 ; 등을 채용할 수 있다.
[조환 VZV의 클론화]
공지의 상법, 예컨대 감염세포의 클론화에는 포커스법, 조환 VZV의 클론화에는 플라크 감정법이 채용될 수 있다.
포커스 및 플라크의 채취에는, 유리제, 플라스틱제, 금속제 등의 원통세관 내지 실린더를 사용할 수 있다.
클론화한 감염세포 및 조환 VZV는, 클론때마다 신선한 세포배양에 접종하여, 바이러스를 배양한다.
[조환 VZV면역원성의 판정]
조환 VZV를 함유한 용액을 원숭이, 집토끼, 실험용 집토끼, 쥐 등의 실험 소동물의 피하에 접종한 후, 이들 면역동물을 사육관리한다.
사육기간동안, 바이러스접종 후, 또는 월 단위로 일정기간마다, 예컨대 실험용 집토끼의 경우에는, 그 대퇴부정맥에서 약 3㎖의 부분체혈을 행하고, 그 혈중항체가를 측정한다.
항체가의 측정에는 면역학 및 혈청진단에서 상용되고 있는 공지의 방법, 예컨대 면역에 사용한 항원으로 코우트한 적혈구를 사용하는 PHA(수선적혈구 응집반응)법, 공지의 일정량의 감염바이러스와 그 항혈청과의 사이에서 항원/항체반응시킨 후, 그 감염 바이러스량을 50% 중화감소시키는 항혈청의 최고희석배수를, CPE법이나 플라크 검정법에 의해 측정하는 중화시험법 등을 채용할 수 있다.
[조환 VZV를 유효성분으로서 함유하는 생백신의 제조]
인체 2배체세포배양을 사용하여 조환 VZV를 배양한 후, 그 배양물을, 예컨대 의해 정제하고, 조환 VZV화분을 채취한다.
이것에 아미노산 및 당류 등의 용액을 첨가 혼합하고, 생백신 1도즈(dose)당 바이러스 함량이 100PFU 이상이 되도록 희석조정하여, 생백신을 제조한다.
생백신의 일부샘물은 Japanese Ministry of Health and Welfare의 제 195호 규정의 생물학적 조제기준(1989년), 예컨대 건조 독약화 생수두백신, 조환첨가 B형 간염 백신(효모유래) 등에 준거하여, 안전성, 유효성 및 균질성에 관한 각종 시험검정을 행하고, 그 백신으로서의 적격성을 확인, 확정한 후, 사용한다.
건조백신은, 약 3-30㎖용의 Bayard병 또는 앰플(ampoul)중에서 동결건조되고, 기밀밀폐상태로 제공되어 5℃ 이하에서 저장한다. 이러한 백신의 사용은, 첨부사용서의 기재에 따라서, 사용직전에 멸균증류수에 건조내용물을 완전히 재용해한 후, 예컨대 1도즈, 0.5℃를 피하에 접종한다.
[조환 VZV항원을 유효성분으로서 함유하는 진단제의 제조]
인체 2배체세포배양을 사용하여 조환VZV를 배양한 후, 그 배양물을 예컨대, 원심법에 의해 정제하고, 조환VZV를 배양한 후, 그 배양물을 예컨대, 원심법에 의해 정제하고, 조환 VZV항원화분을 채취한다.
이 항원을, 예컨대 포르말린의 첨가, 또는 56℃에서의 가열 등에 의해 불활성화한 후, 항원단백질량이 1-10㎍/㎖가 되도록, 예컨대 PBs로 희석조정하여, 진단제를 조제한다.
이러한 항원은, 2-50㎖용의 Bayard병이나 앰플 중에서 밀폐되고 액상 또는 건조상태로 제공된다.
이 항원은, 첨부사용서의 기재에 따라, 각종 혈청진단, 예컨대 ELISA, PHA 등의 항원으로서, 또 항체의 제작에 사용할 수 있다.
건조제품의 경우에는, 증류수로 건조내용물을 완전히 재용해하여 사용한다.
[발명의 효과]
(1) 다가 생백신의 제공 : 본 발명에 의해 제공되는 조환 VZV주는 VZV유전자와 1종 이상의 HBV유전자를 동시에 발현하는 독약화 바이러스이고, 더욱이, 그 각 발현산물은 현행의 백신항원과 동시의 면역원성을 보유하고 있고, 또한 그 발현능은 바이러스계 하에서 유전학적으로 안전 또한 양호하고, 이 조환VZV는 생백신으로서 안전성과 유효성을 겸비하고 있다.
따라서 종래의 혼합 또는 불활성화 백신에 대신하여 다가 생백신 또는 다기능 생백신의 유효성분으로서 실용에 제공할 수 있다.
(2) 불활성화 백신항원의 생백신으로의 변환 : 종래, 유입인자혼입의 위험성, 배양, 정제 등에 관한 기술적 제약 때문에, 체액성 면역만을 유도하고, 그 면역 지속성의 불량이 공지임에도 불구하고, 불활성화 백신으로만 실용화 될 수 없는 항원을, 체액성과 세포성의 양 면역을 유도하고, 그 증강된 면역 효과가 양호하게 영속되는 생백신으로 변환하여 제공하는 것을 가능하게 한다.
(3) 혼합백신의 제조비용의 저감 : 종래의 혼합백신은, 각 백신성분을 개별로 조제한 후, 이들을 혼합하여 제조된 것이다.
본 발명에 의하면, 2종 이상의 상호 이종항원을, 조환 VZV를 1회 배양하는 것에 의해, 동시에 제조할 수 있으므로, 백신의 제조비용이 극도로 저감된다.
(4) 본 발명에 의해, 배양이나 양산이 곤란한 HBV항원의 대량생산이 가능하게 된다.
(5) 생물학적 재해의 확률이 높은 병원체항원을 안전하게 제조할 수 있다.
(6) 본 발명에 의한 조환 VZV항원은, 상기한 2종이상의 항원을 보유하므로, 이들의 2종 이상 병원체를 동시에 판정할 수 있는 다가 진단제로서도 유용하다.
그 조환 VZV게놈, DNA는, 2종이상의 이종유전자 DNA로 되는 키메라 프로브(chimeric probs)로서 유전자진단에 이용할 수 있다.
(7) WHO의 EPI(면역확대 계획)기여 : 이상에 더하며, WHO가 제창한 혼합 또는 다가 백신사용에 의해 접종과 피접종양자 간에서의 생력화에 의거하여 예방접종의 보급 고려하면, 본 발명이 백신제조, 방역과 위생행정, 임상검사, 개인의 에방접종 등에 있어서 경제성과 생력화의 확보에 기여함과 아울러, 나아가서, 예방접종의 보급과 촉진의 포석이 되는 면역효과 개선과 증강의 측면에서 인류에 상당한 유익을 가져다 주었다.
본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하려고 한다.
그러나 본 발명이 이들 실시예에 제한되는것은 아니다.
다음의 실시예에서 사용되는 인산염완충식염수(PBS)의 제조는 다음과 같다 : NaCl을 8.0g, KCl을 0.2g, Na2HP04·12H2O를 2.0g, KH2PO를 0.2g, CaCl2를 0.1g, 및 MgCl2·6H2O를 0.1g, 증류수에 용해하여 1,000㎖로 하고, PBS(-)도 별도로 조제하였고, 2가 이온, CaCl2및 MgCl2·6H2O를 함유하지 않는다.
[실시예 1]
수두바이러스의 배양 : 인체 2배체 섬유아세포, MRC-5를 37℃에서 VZV의 숙주 배양으로서 배양하였다.
기초배지로서 MEM배지[Gibco사(미국)제]를 사용하였다.
그 기초배지는 사용직전에 7%(W/V)NaHCO3수용액을 첨가혼합하고, 증식배지는 pH7.4, 유지배지는 pH7.8로 각각 조정하였다.
이어서, 시판 태아혈청을, 그 최종농도가 중식배지에서는 10%(V/V), 및 유지배지에서는 3%(V/V)가 되도록 추가혼합하여 사용하였다.
이렇게 배양된 MRC-5세포에 VZV강주(ATCC VR-795)종바이러스를 MOI(감염다중도) 0.01에서 접종한 후, 37℃에서 3일간 배양하였다.
배지에는 유지배지를 사용하였다.
VZV배양하는 동안, VZV의 증식에 따라 감염세포영역이 점차로 넓어진다.
VZV감염세포는, 검경 하에서 라운딩을 나타내고, 이른바 CPE(세포변성효과)로서 검출할 수 있다.
따라서, 이러한 CPE에 의거하여 감염세포에 확대를 검경 하에서 관찰함으로써, VZV증식의 정도를 판정할 수 있다.
CPE가 세포증식모노사이트(monocyte)전역에서 인지되는 시점에서, VZV배양을 종료하였다.
마찬가지로, 생수두백신주인 강주(WHO Technical Report Series, No. 725, pp. 102-124, 1985)종 바이러스를 배양하였다.
배양용기로서, 배양면적 210㎠의 병 5개를 사용하였다.
이 강수두백신주는 다음의 실시예 모두에 적용된다.
[실시예 2]
VZV게놈 DNA의 추출과 조제 : 실시예 1에서 얻은 강수두백신주의 감염세포를 채취하였다.
더 구체적으로, 바이러스배양종료 후, 배양액을 버리고, 0.1%(W/V) EDTA2Na의 PBS(-) 용액을 16㎖, 각 병에 첨가하여 감염세포를 병의 네벽면에서 박리시킨 후, 이동을 푸울(pool)하였다.
이어서, 3,000rpm, 10분간, 실온에서 원심하고, 감염세포의 펠레트(pellet)를 채취하였다.
이것에, 0.5%(V/V)NP40[BDH Chemicals사(영국)제] 및 10mM EDTA-2Na를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH : 8.0)를 3㎖ 첨가하여 세포를 부유시키고, 실온에서 30분간 정차하여 세포를 용해시켰다.
이어서, 세포파편을 제거하기 위해, 3000g, 20분간, 4℃에서 원심하고, 그 상청을 채취하였다.
이 조작을 3회 반복하여 행하였다.
그리고, 채취한 각 상청을 푸울하였다.
이어서, 이 상청을, SW27로서(rotor)[Beckman Instruments사(미국)제]에서 27000rpm, 1시간, 4℃로 원심하고, 펠레트를 채취하였다.
이 펠레트를, 2㎖의 TE액[10mM Tris-HCl(pH : 8.0), 1mM EDTA-2Na]에 부유시켰다.
이어서, 이것에 VZV입자가용화액[10mM TrisOHCl(pH:8.0), 1%(W/V)SDS, 10mM EDTA-2Na, 200㎍/㎖ RNase A] 2㎖를 첨가혼합하여, 37℃에서 하룻밤 반응시켰다.
반응종료 후, 등량의 수포화페놀-클로로포름-이소아밀알코올(1 : 1: 1)혼합액에서 2회, DNA의 추출을 행하고, 수층을 채취하였다.
이어서, 이 수층에 2배량이 냉에탄을 첨가혼합한 후, -20℃에서 하룻밤 정치하여 DNA를 침전시켰다.
이 DNA는, 원심에 의해 회수한 후, 상기의 TE액 2㎖에 재부유하고, VZV게놈 DNA로서, 이후의 사용에 제공하였다.
DNA농도는, 흡광도 OD260에 의해 결정하였다.
[실시예 3]
HBV의 preS2 및 HBs의 유전자 DNA단편의 조제 : HBV의 아형 adr주의 preS1-preS2-HBs유전자가 pBR322 Bam HI부위에 클론화시킨 플라스미드 pM1B11(특개소 63-22098)을 제한효소 Hpa Ⅱ로 소화하였다.
이어서, 이것을 0.5%(W/V) 아가로즈겔전기영동에 걸어서, Hpa Ⅱ 단편을 회수한 후, T4 DNA 폴리머라아제에 의해 양 말단을 평활말단으로 하였다.
[실시예 4]
VZVtk 유전자의 클론화 : 실시예 2에서 얻은 VZV게놈 DNA를, 제한효소 Sac Ⅰ로 소화하고, 이것을 0.5(W/V) 아가로즈겔전기영동에 걸어서 H단편(Intervirology, 29, 301-310, 1988)을 회수하였다.
이 DNA단편을, Sac Ⅰ에서 개열한 플라스미드 pVC12[Methods In Enzymobgy, vol. 101, pp. 20-78, Academic Press(미국), 1983]에 삽입한 후, 대장균 JM109주(ATCC NO. 53323)에 이입하여, 플라스미드 pVC12-tk를 제작하였다.
더구나, pVC12-tk를 제한효소 Eco RI와 Fok Ⅰ으로 소화한 후, 1.0%(W/V) 아가로즈겔전기영동에 의해 회수한 Eco RI와 Fik Ⅰ 단편을 재차, pVC12에 클론화하여, 플라스미드 pEF6을 얻었다(제 1 도).
[실시예 5]
조환 VZV제작용의 키메라 플라스미드의 제조 : 실시예 3에서 조제한 HBV게놈 DNA의 Hpa Ⅱ 단편을, 실시예 4에서 얻은 pEF6 tk 유전자의 Hinc Ⅱ부위에 삽입한후, 이것을 대장균 JM109주에 이입하여 키메라 플라스미드 pHH를 얻었다(제 1 도).
HBV유전자의 삽입연계부위의 염기배열을, 7-DEAZA배열 커트(sequencing kit)(manufactwred by Takara Shuzo Co., Nucleic Acid Research, 14, 1319, 1988)를 사용하여 결정하였다.
이 결과를 제 2 도에 나타내었다.
이 키메라 PHH는 HBV의 preS2-HBs 유전자의 1,080염기단편이 VZV유전자의 Sac Ⅰ-Fok Ⅰ4.8kb 단편의 사이에서 삽입연계되어 있고, VZV tk유전자의 진성촉진제와 증폭제의 기능하에서, VZV tk유전자의 진성개시코돈 ATG(메티오닌)과 HBV preS2와 TCC(세린)가 연계한 상태로 전사 및 번역되고, VZV tk유전자의 발현에 대신하여, HBV preS2의 25개 아미노산과 전 HBs펩티드 양 유전자를 발현한다(제 1 도 및 제 2 도).
[실시예 6]
조환 VZV의 제작 : 실시예 2에서 조제한 VZV게놈 DNA(25㎍/㎖) 및 실시예 5에서 조제한 키메라 플라스미드 pHH(20㎍/㎖)를, 인산칼슘법(Virology, 52, 465-467, 1973)에 의해, 직경 60㎜의 플라스틱제 페트리접시에서 배양한 MRC-5세포로 트란스 팩트(transfect)시켰다(제 1 도).
이어서, 코트란스펙션물을 배양하고, VZV게놈의 도입에 의해 형성되는 각 VZV포커스에서, 감염세포를 실린더에 의해 제거하였다.
이러한 감염세포를 포커스마다 각각, 25㎤ 플라스틱제 플라스크에 배양한 MRC-5세포로 접종하여 증식시켰다.
동시에, 감염세포의 일부를 포커스별로 각각, 커버슬립상에 배양한 MRC-5 세포로 접종하여 증식시킨 후, 이동을 항 HBs 단일 클론성항체[BML사(일본)제]를 사용하는 면역형광법으로 검경하였다.
더 구체적으로, 각 커버슬립상의 세포를, PBS로 세정한 후, 냉메탄올과 냉아세톤의 동량혼합액에서, -20℃로 5분간 고정하고, 탄수시켰다.
이어서, 마우스의 상기 단일클론성 항체, 및 FITC로 표지된 항마우스 igG항체로 이들 세포를 염색하였다.
이러한 염색된 각 표본을, 형광현미경에서 형광도를 지표로서 HBs 항원성 존재와 그 세기를 검경하였다.
그 결과, 합계 35개의 클론(C1-C35)중, 5개가 조환 VZV후보클론으로서 선정되었다.
조환율은 14.5%이었다.
이 검정결과에 의하여, 상술한 플라스크 내에서 증식시킨 감염세포 중, 조환 VZV 후보클론의 감염세포에서, 세포유리한 VZV를 조제하였다.
조제한 조환 VZV는, 실제적 사용까지 -70℃에서 보존하였다(Journal of General Virology, 61, 255-269, 1982).
이어서, 직경 60㎜의 플라스틱제 페트리접시에 배양한 MRC-5세포를 사용하여, 상기의 조환 VZV후보중 형광도가 최고인 1클론(C17)에 관해 플라크검정법을 행하였다.
플라크검정법에서는, 기초배지로서 199배지[Difco사(미국)제]를 실시예 1의 기재와 동일하게 하여 조제한 유지배지에, 아가로즈를 최종농도가 0.8%(W/V)가 되도록 첨가혼합하여 고형배지를 조제하였다.
이 배지는 감염세포 모노사이트에 중층하여 사용하였다.
감염배양세포의 염색은, 상기의 고형배지에 뉴우트럴 레드를 최종농도 0.01%(W/V)가 되도록 첨가혼합하여 조제한 배지를 다시 중층하여 행하였다.
바이러스접종은, 페트리접지당 1-2개의 플라크가 형성되도록 VZV농도를 조정하여 행하였다.
배양은 5%(W/V)탄산가스 보온기내에서 행하고, 다른 조건은 실시예 1과 동일하게 하였다.
발현한 플라크를 각각, 개별로 실린더에서 들어올림에 의해, VZV를 클론화하였다.
얻어진 조환 VZV중의 1클론(C17-5)을, 미감염세포 5-10개에 대하여 클론감염세포 1개의 비율로 접종하고, 세포에서 세포로 10세대를 계속하였다.
계속 이어진 제 10대의 각 감염세포배양에서 각각, 세포유리의 조환VZV를 조제하였다.
이들 조환 VZV에 관하여, 면역형광법으로 검정하여 엄선한 결과, HBs항원을 생산하는 세포유리의 조환VZV(제 1 도)를 20클론 분리하였다.
이들 클론을 rVH강주시리즈로 하고, 이 시리즈(series)를 구성하는 20주에 대하여, rVH강주, rVH2강주, rVH3강주의 요령으로 이하순차, rVH4강주에서 rVH20강주까지 명명하였다.
이들 20강주에서는 모드, 동정도의 HBs 항원의 생산이 확인되었으므로, 이러한 조환 VZV에 의해 HBs항원의 생산은 모두, 바이러스세대의 계속 하에서 유전학적으로안전 및 양호하다라고 판단된다.
이하의 실시예에서는, rVH강주시리즈중의 조환VZV주의 대표예로서, rVH7강주를 사용한다.
rVH7강주의 친주는, 실시예 1 및 2에 기재한 바와 같이, 독약화 VZV의 강수두생백신이다.
[실시예 7]
조환 VZV게놈 DNA의 제한효소분석 : Southern blot법(Journal of Molecular Biology, 98, 503, 91975)에 의해 행하여졌다.
친주(親株)인 강수두생백신주와 조환VZV주의 각 게놈 DNA를 실시예 2의 기재와 동일하게 하여 추출 조제한 후, 각 DNA를 제한효소 Sac Ⅰ(Set Ⅰ)로 소화하여 얻어지는 DNA단편을, 0.8%(W/V)아가로즈겔 전기영동으로 분화하고, 영동이 끝난 겔을 에티디움브로마이드(etidium bromide)로 염색하였다.
이어서, 이 겔에 니트로셀룰로오즈 세포막을 포개고, 각 DNA화분을 이 세포막에 옮기고, RI표지 프로브에 의해 혼성화(hybridization)를 행한 후, 방사선자동스냅사진법에 걸었다.
프로브로서, [α-32p]dCTP로 표지한 pM1B11 및 pHH의 각 DNA를 사용하였다.
그 결과, 친주에서는, 본래의 Sac Ⅰ-H 단편이, 조환 VZV주에서는 Sac Ⅰ-H' 단편이 각각 검출되었다.
그 때문에, Sac Ⅰ-H 단편은 VZV tk유전자를 함유하고, 조환 VZV주의 HBs와 tk양 유전자영역에는 Sac Ⅰ 부위가 없는 것을 고려하면, 친주의 Sac Ⅰ-H단편이, 조환주에서 Sac Ⅰ-H 단편에 시프트(shift)한다고 생각된다.
친주의 Sac Ⅰ-H 단편은 pHH 프로브와만 반응하는데 대해, 조환주의 Sac Ⅰ-H' 단편은 pM1B11 및 pHH양 프로브와 각각 혼성화하므로, 조환 VZV게놈의 tk 유전자에는 HBs 유전자가 삽입되어 있다고 판정된다.
[실시예 8]
조환 VZV주의 감염세포에서 생산되는 HBs항원의 검출과 동정 : 실시예 6에서 얻은 rVH7강주를, 배양면적 150㎤의 플라스틱제 플라스크 5개를 사용하여, 실시예 1에서와 같은 방식으로 배양하였다.
그 배양상청을 푸울하고, 3000rpm에서 20분간, 4℃로 원심하였다.
감염세포를, 배양 플라스크양벽면에서 고무세정기(rubger scrubger)로 박리한 후, PBS에 부유시켰다.
(1) HBs항원의 생산량측정 : 상기의 원심상청 35㎖를, 다시 27000rpm에 3시간, 4℃에서 원심하고, 펠레트를 채취하여, 이것을 0.2㎖ PBS에 현탁하고, 조환주의 배양상청화분으로 하였다.
한편, 상기의 감염세포 약 106개를 1㎖으 PBS에 부유시키고, 초음파(20KHz, 150mA, 4초)로 세포를 파괴한 후, 3000rpm에서 20분간, 4℃에서 원심하여, 그 상청을 채취하고, 조환주감염세포화분으로 하였다.
양 화분에 대하여 항 HBS혈청으로 코우트한 세포를 사용하는 RPHA(역수신 적혈구 응집반응)시험에 의해, HBs항원기를 측정하였다.
이 시험에는 시판기험 키트[Midori Juji Co.(일본)제]를 사용하였다.
비교대조로서, 상기와 동일하게 약 106개의 세포에서 조제한 미감염세포화분 및 친주세포화분, 및 효모로 생산한 HBs항원(특개소 63-22098)을 각각 사용하였다.
이들 샘플은, 2단계 희석하여 측정하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1에서 조환 VZV주의 배양에 의한 HBs의 생산량은, 감염세포화분에서는 10㎍/㎖, 배양상청화분에서는 4㎍/㎖(농축전의 근본배양상청으로는 23㎍/㎖)로 산출추정된다.
[표 1]
(2) HBs항원의 면역형광법에 의한 검출 : 실시예 6에서 기재한 HBs항원의 단일 클론성 항체를 사용하는 면역형광법에 의해, 상기의 조환 VZV감염세포에서의 HBs 항원생산의 유무를 검정하였다.
감염세포질 내에서의 HBs항원의 생산이 확인되었다.
(3) 배양상청의 HBs항원의 전자현미경에 의한 확인 : 상기의 배양상청을 500rpm에서 20분간 원심한 후, 그 상청에 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 6000을 최종농도 10%(W/V)가 되도록 첨가혼합하고, 침전물을 형성시켰다.
이어서, 저속원심에 의해 회수한 침전물 펠레트를 TEN액[20mM Tris-HCl(pH; 7.4), 1mM EDTA-2Na, 150mM NaCl]에 부유시킨 후, 그 부유액을, SW27로우터를 사용하는 CsCl 밀도구배 평형원심에 2회 걸었다.
원심컬럼으로서, 밀도 1.15, 1.25 및 1.4g/㎤로 이루어진 불연속구배를 사용하고, 이 칼럼에 침전물 부유액을 중층한 후, 23000rpm, 2시간, 4℃에서 원심하였다.
원심종류 후, 칼럼을 분화하고, HBs항원화분을, 상술한 RPHA시험에 의해 결정하였다.
이렇게 얻어진 HBs 항원화분은, TEN액과 혼합하고, CsCl에 의해 밀도를 1.2g/㎤으로 조정한 후, 다시 SW41로 33000rpm 40시간, 4℃에서 원심하였다.
원심종료 후, 칼럼을 분화하였다.
HBs항원화분을 채취하여 희석하고, 이것을 10%(W/V)지당 쿠션상에 중층한 후, SW41 로우터에 의해 4000rpm에서, 3시간, 4℃에서 원심하였다.
그 펠레트를, PBs화분에는, 다수의 직경 20-30nm 입자가 검출되었다.
이 결과에서, 입자상의 HBs 항원이, 감염세포로부터 분리되고 있다고 판단된다.
(4) 배양상청이 HBs항원이 밀도측정 : 상기의 전자현미경에 의한 관찰로서 사용한 정제 HBs화분 일부를, SW41로부터의 사용으로, 33000rpm, 4℃에서 40시간, 밀도 1.2g/㎤의 CsCl밀도 구배평형원심에 의해 분화하였다.
각 화분의 체적과 중량을 측정하여 밀도를 산출함과 아울러, 그 HBs항원가를 피크(peak)를 나타내는 정제 HBs화분의 밀도는 1.20g/㎤이었다(제 3 도).
[실시예 9]
조환 VZV주의 VZV 및 HBs양 항원의 동정 : 실시예 1과 동일한 방식으로 직경 100㎜의 페트리접시 3개에 MRC-5세포를 배양하였다.
그 1개에는 rVH4강주를, 다른 1개에는 그 친주를 각각 접종하였다.
나머지 1개의 세포배양은, 바이러스를 접종하지 않고, 대조항원의 조제에 사용하였다.
이들 세포를, 메티오닌을 함유하지 않은 MEM배지에 50μCI/㎖의 [35S]메티오닌과 시스테인 첨가하여 조제한 기초배지를 사용하여, 실시예 1과 동일한 방식으로 4시간, 배양을 행하였다.
이어서, 세포를 박리하고, RIPA완충액 20mM Tris-HCl(pH : 8.0), 1%(W/V)Tritom X-100, 0.1% (W/V)SDB, 150mM NaCl, 및 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride에서 페세포용해한 후, 35000rpm에서 20분간 원심하고, 그 상청을 채취하였다.
얻어진 6종의 상청 각각은, 항 VZV모르모트 혈청(Virology, 156, 4230426, 1987)과 혼합하고, 면역침강반응시켰다.
이들 반응계에서 형성된 면역복합체는, 단백질 세파로스 CL-48[Pharmacia LKB(스웨덴)제]의 칼럼 크로마토그래피에 의해, 각각 분리하였다.
HBs항원(특개소 63-22098)을 사용하여 제작한 항HBs 집토끼혈청과 상기한 6종의 상청사이에도 상기와 동일하게 각 면역복합체를 형성시키고, 이들을 분리하였다.
이어서, 이들 면역복합체를 각각, SDS-PAGE 전기영동한 후, 방사선자동사진법을 행하였다.
그 결과, VZV 폴리펩티드는, 친주 및 조환주의 양 감염세포에 있어서 동일하게 검출되었다.
그러나, 분자량이 26K 및 30K의 양 HBs항원은, 친주의 감염세ㅐ포 내에만 VZV 폴리펩티드가 검출되었다.
이들 26K 및 30K 양 항원과는 대조적으로, 조환주의 배양상청에서는, 실시예 7에 기재한 조환주의 감염세포가 분지하는 HBs항원이, 30K 및 35K 양 폴리펩티드로서 동정되었다.
이것에서, 감염세포 내에서 합성된 26K 및 30K의 HBs 항원은, 그 배양상청에 분비되는 동안에, 수식과 프로세싱을 받아 30K와 35K의 HBs항원이 된다고 판정된다.
[실시예 10]
조환VZV를 유효성분으로 하는 생백신의 제조 : 배양면적 210㎤의 병 20개의 MRC-5세포배양에, 실시예 6에서 얻은 rVH7강주 종 바이러스를 접종한 후, 실시예 1과 동일한 방식으로 하여 배양하였다.
배양종료 후, 배양액을 버리고, 각 병 내의 감염세포를 200㎖의 PBS(-)에서 2회 세정하였다.
이어서, 20㎖의 0.03%(W/V) EDTA-3Na을 병 내의 감염세포에 중층하고, 세포를 병내벽면에서 박리시켜 부유시켰다.
병내의 감염세포 부유액을 푸울하고, 2000rpm에서, 10분간 4℃에서 원심하여, 감염세포의 펠레트를 채취하였다.
이들을 100㎖의 PBS(-)에 재부유한 후, 동결융해를 1회 행하였다.
이어서, 빙수욕 중에서 초음파처리(20KHz, 150mA, 0.3초/㎖)한 후, 300rpm에서, 20분간 4℃에서 원심하였다.
이 원액에서 감정용으로서 30㎖를 샘플링하고, 나머지 원액 70㎖에, PBS(-)에 용해한 사카로즈(succharose) 및 젤라틴 가수분해물을 백신안정화재로서 최종농도가 5%(W/V) 및 2.5%(W/V)가 되도록 첨가혼합하고, 140㎖의 생백신최종벌크(bulk)를 조제하였다.
이 최종벌크에서 검정용으로 30㎖를 샘플링한 후, 나머지 벌크를 3㎖용의 Bayard병에 0.5㎖씩 분주하고, 동결건조한 후, 질소가스를 충전하여 고무마개로 봉하여 병 내부를 기밀 밀폐하였다.
이 생백신 소분품은, 4C에서 보존하고, 사용직전에 주사용 증류수 0.5㎖를 첨가하여 건조내용물을 완전히 용해하여 사용한다.
한편, 샘플링한 백신원액과 최종벌크, 및 소분품 20개에 관하여, 검정시험을 행하였다.
이러한 검정시험은, 안전성, 유효성 및 균질성을 확인하고, 생백신으로서의 적격성을 확정하기 위해 Welfare Notification No. 195에 규정한 생물학적 제제기감(1989년) 건조독약화 생 수두백신에 준거하고, 또한 동일한 규정의 기준 조환침강형 간염백신(효모출래)도 고려하여 실시하였다.
이러한 검정시험의 결과, 상기의 소분품은, 그 바이러스함량이 2×104PFU(프라크형성단위)/0.5㎖이고, 또한 상기기준에 규정한 각종 시험에 합격하였기 때문에, 적격성을 구비한 생백신으로서 이후의 사용에 제공하였다.
[실시예 11]
진단제용의 조환 항원의 제조 : 배양면적 210㎠의 병 20개의 MRC-5 세포배양에, 실시예 6에서 얻은 rVH7 강주 종 바이러스를 접종하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 배양하였다.
1일간 배양한 후, 각 병의 배양액을 버리고, 병내의 감염세포를 200㎖의 PBS(-)에서 2회 세정하였다.
이어서, 페놀레드를 상기한 199배지[Difco4(미국)제]를 이들 병에 주입하고, 다시 3일간, 37℃에서 배양을 지속하였다.
배양종료후, 병에서 배양액을 채취하고, 푸울하였다.
이것을 3000rpm에서 20분간 원심하고, 그 상청을 Minitan Vltra-Filter MW 10000[Millpore(미국)제]으로 체적을 1/20으로 농축하였다.
이어서, 이 농축액을 560℃에서 30분간 가열하고, 바이러스를 불활성화하였다.
얻어진 불활성화 농축액중의 조환 VZV항원 단백질의 함량이 5㎍/㎖가 되도록 PBS로 희석조정하고, 이것을 3㎖용의 앰플에 2㎖씩 분주한 후, 용봉하고, 수두 및 B형 간염의 진단제로서 사용하여 제공하였다.
[실시예 12]
조환VZV를 유효성분으로 하는 조환생백신의 면역원성의 판정 : 실시예 10에서 제조한 조환수두생백신주의 면역원성을, 모르모트를 사용하여 측정하였다.
비교대조로서, 친주성백신인 시판건조독약화 생수두백신(Prepared by the Osaka University Microorganism Research Laboratory, 조환침강형 간염백신 특개소63-22098에서 제조, 및 Merck사(미국)제의 양 백신], MRC-5 미감염세포에서 실시예 10과 동일한 공정을 거쳐서 조제한 제조항원의 합계 5종을 사용하였다.
이들 각 백신을 3주령의 평균체중 250g의 모르모트 3마리에 각각 피하접종하였다.
접종량이 조환주 및 친주 양 백신에서는, 3000PFU 또는 2000PFU/unit가 되도록 PBS(-)로 희석조정하여 행하였다.
B형 간염백신은, HBs항원량 10㎍/animal을 접종하였다.
백신접종 후,4, 6 및 8주째에, 각 피접종동물이 대퇴부정맥에서 부분출혈하고, 그 혈중 항체가를 측정하였다.
항체가의 측정에는, VZV에서는 중화시스템법(Journal of General Virology, 61, 255-269, 1982)를, HBs에서는 HBs항원을 코드화한 세포를 사용하는 PHA(수신적혈구 집반응)시험키트(manufactured by the Chemical and Serum Therapy Research Laboratory)를 각각 채용하였다.
그 결과를 표 2 및 표 3에 나타내었다.
친주 및 조환주의 양 백신은 같이 VZV항체를 동일수준으로 유도하였다.
그러나, HBs항체는 조환주 백신접종만으로 검출되었다(표 2).
더욱이, 조환주 백신의 HBs에 대한 면역원성은, 시판 B형 간염백신과 같았다(표 3).
이들 결과에서, 조환주 백신이 보유한, VZV 및 HBs양 항원에 대한 면역원성을 같이 양호하도록 판정된다.
[표 2] VZV친주 및 조환주 각 백신으로 면역한 모르모트의 VZV와 HBs 양항원에 대한 항체반응
[표 3] 조환VZV주 백신 및 기성조환 HBs 백신을 접종한 모르모트의 HBs에 대한 면역응답의 비교

Claims (11)

  1. 강수두단백주의 게놈 DNA 및 B형 간염표면항원 유전자의 Hpa Ⅱ 단편을 함유하는 조환수두 바이러스에 있어서, Hpa Ⅱ 단편 게놈 DNA는 티미딘 키나아제(tk) 유전자 HincII 단편에 삽입되어 있고, 이것에 따라서, Hpa Ⅱ 단편의 5' 말단이 티미딘 키나아제 유전자의 개시코돈과 해독구조(frame) 일치하여 연계된, B형 간염표면항원 유전자 프로모터의 단독지배 하에 발현되는 조환수두 바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, rVH 강주 시리즈를 구성하는 조환수두 바이러스군에서 선택되는 1클론 이상의 조환수두 바이러스.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항 기재의 조환수두 바이러스의 유래항원에 있어, 수두바이러스 항원과, 분자량이 26, 30 내지 35(kd)가 있는 B형 간염표면항원.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항 기재의 조환수두 바이러스의 게놈 DNA.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항 기재의 조환수두 바이러스의 면역도즈를 함유하는 생백신.
  6. 제 3 항의 수두 바이러스항원 및/또는 B형 간염표면 항원을, 항원-항체반응량을 함유하는 진단제.
  7. 강수두단백주의 게놈 DNA 및 B형 간염표면항원 유전자의 Hpa Ⅱ 단편을 삽입연계한 조환수두바이러스를 작성하는 방법에 있어서, Hpa Ⅱ 단편의 5' 말단이 티미딘 키나아제 유전자의 개시코돈과 해독구조(frame)일치됨에 의하여 Hpa Ⅱ 단편 게놈 DNA는 티미딘 키나아제(tk) 유전자의 HincII 단편에 삽입하는 것을 특징으로 하는 조환수두 바이러스의 제작방법.
  8. 제 2 항에 있어서, 조환수두 바이러스의 클론이 rVH 17-5(ECACC No. V92041523)에 있는 조환수두 바이러스.
  9. 제 8 항 기재의 조환수두 바이러스의 유래항원에 있어, 수두바이러스 항원과, 분자량이 26, 30 내지 35(kd)가 있는 B형 간염표면항원.
  10. 제 8 항 기재의 조환수두 바이러스의 게놈 DNA.
  11. 제 8 항 기재의 조환수두 바이러스의 면역도즈를 함유하는 생백신.
KR1019920007062A 1991-04-26 1992-04-25 조환수두 대상포진바이러스 및 그 제작방법 KR100224331B1 (ko)

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