JP3217019B2 - Hcmvの糖タンパク質、およびhcmvワクチンおよびその産生法 - Google Patents
Hcmvの糖タンパク質、およびhcmvワクチンおよびその産生法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトサイトメガロ
ウィルス(HCMV)に関し、そしてそのウィルスの糖タン
パク質の産生、それらのワクチンの可能性及びHCMV特異
性抗体の産生に関する。 【0002】 【従来の技術】HCMVは、かなり重要なヒト病原菌であ
り、そしてそれに対する有効なワクチンが必要である。
従来の実験的なワクチンは、弱められた非病原性形ウィ
ルスに基づかれて来たが、しかし、所望としない副作用
が存在する。本発明は、組換えDNA技法を用いての、
HCMVに対するワクチンの製造への他のアプローチを提供
する。 【0003】他のヘルペスウィルスのように、HCMVは、
多重糖タンパク質を特定する(1,2)。これらの特徴
化は、ポリクローナル血清及びモノクローナル抗体を用
いての、CMVにより感染された細胞及び精製されたビリ
オンの研究を含む(2〜10)。1つの糖タンパク質が、
一部精製され、そしてモルモットに中和反応を誘発する
ことが示されて来た。 【0004】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、HCMVに
より特定化された糖タンパク質の合計数は、不明確であ
り、そして個々の糖タンパク質のワクチン可能性は知ら
れていない。HCMVにより感染された細胞からの個々の糖
タンパク質の精製は、期待の持てるものではない。なぜ
ならば、そのウィルスはゆっくりと増殖し、そして感染
の間、宿主タンパク質の合成を止めないからである。 【0005】 【課題を解決するための手段】本発明は、本明細書でg
B及びgHとして言及されている2種の糖タンパク質を
コードするHCMVのDNAの同定及び発現に基づかれる。
gBタンパク質は、F/D境界からの1378〜4095塩基の
間に存在する、HCMVゲノムのHindIII Fフラグメント中
のDNAによってコードされている。gHタンパク質
は、L/D境界からの228〜2456塩基の間に存在する、H
indIII Lフラグメント中のDNAによってコードされ
る。 【0006】本発明の1つの観点によれば、ヒトにHCMV
中和性抗体を高めることができる1又はそれよりも多く
の抗原決定基を組込むポリペプチドを、組換えDNAベ
クターからの適切な宿主生物中に発現することを含んで
成る方法が提供され、ここで前記決定基(又は決定基
類)は、F/D境界からの1378〜4095塩基の間に存在す
る、HCMVゲノムのHindIII Fフラグメント中のDNAに
よってコードされたタンパク質の部分に対応し、そして
/又はL/D境界からの228〜2456塩基の間に存在す
る、HCMVゲノムのHindIII Lフラグメント中のDNAに
よってコードされたタンパク質の部分に対応する。 【0007】本発明の第2の観点は、そのようなポリペ
プチドをコードするDNAを合む組換えウィルスベクタ
ーを提供することであり、前記ベクターは、ヒトを感染
することができ、そして免疫原形にそのポリペプチドを
発現する。 【0008】本発明の第3の観点は、そのようなポリペ
プチドを合成することを含んで成る方法を提供する。 【0009】本発明の第4の観点は、そのようなポリペ
プチド又は上記のような組換えウィルスベクターにより
宿主動物(ヒトを除く)を免疫化し、そして前記ポリペ
プチドに対して特異的な抗血清をその宿主動物から抽出
することを含んで成るHCMV単一特異性抗血清の調製方法
を提供する。HCMV−特異性モノクローナル抗体は、その
ような免疫化された動物からの細胞から調製され得る。 【0010】本発明の第5の観点は、抗体とHCMVポリペ
プチドとを接触し、そしてそのポリペプチドから結合し
た抗体を分離することを含んで成る、HCMV−特異性抗体
を精製する方法を提供する。 【0011】本発明の第6の観点は、サンプルとHCMVポ
リペプチドとを接触せしめ、そしてそのポリペプチドに
結合する抗体を検出することを含んで成る、臨床サンプ
ル中のHCMV特異性抗体を検出するための方法を提供す
る。 【0012】本発明の第7の観点は、そのような検出方
法を行なうためのキットを提供することであり、そして
該キットは、臨床サンプルとの接触のために適切な形の
前記ポリペプチド及び前記ポリペプチドに結合するHCMV
特異性抗体を検出するための手段を含んで成る。 【0013】 【発明の実施の形態】免疫応答を導びく、HCMVの表面糖
タンパク質を同定し、そして哺乳類ベクター中にその対
応する配列の遺伝物質を導入することによって、HCMVに
対するワクチンの基礎を形成することができる、免疫学
的に活性的なタンパク質を産生することができる。 【0014】組換えウィルスワクチンに関しては、その
同定されたHCMVゲノムフラグメントが単離され、そして
従来の遺伝子工学技法により適切な哺乳類ウィルスベク
ター中に導入され、そして哺乳類宿主中にそのプラスミ
ドをトランスフェクトすることができる。 【0015】適切なベクターは、哺乳類細胞及びウィル
ス、たとえばポックスウィルス(特に好ましくはワクシ
ニアウィルス)及びウシ乳頭腫ウィルスを含む。 【0016】外来性DNAの発現は、組換えウィルスベ
クターにより細胞又は動物を感染することによって得ら
れる。たとえば、組換えウィルス、たとえばワクシニア
ウィルスは、生ワクチンとして使用され得る。さらに、
組換えベクターにより感染された細胞を用いて、ワクチ
ンとして使用するために外来性DNAの生成物を調製す
ることができる。 【0017】1つの好ましい技法において、HCMVゲノム
の糖タンパク質−コードフラグメントが、プラスミドpG
S62中に導入され、そして次に、ワクシニアウィルスに
より感染された哺乳類細胞中にそのプラスミドをトラン
フェクトすることによって、ワクシニアウィルス中にト
ランスファーされる。 【0018】HCMVのDNAが、それによって産生される
タンパク質の機能に有意に影響を及ぼさないで、種々の
方法により変性され得ることは明らかであろう。たとえ
ば、タンパク質のトランスメンブラン形は、膜アンカー
配列を含むC−末端をコードするDNAを除去すること
によって分泌形に転換され得る。そのような変性は、本
発明の請求の範囲内に存在する。 【0019】 【実施例】 (推定上の糖タンパク質遺伝子の同定)HCMVゲノム内に
可能な糖タンパク質遺伝子を同定するために、HCMV株、
AD169のゲノムの個々のクローン化された制限フラグメ
ントが、参考文献(11)に記載のM13/ジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法又は参考文献(12)のBankier及びB
arrellによって記載された策略及び方法を用いて、配列
決定された。次にその得られた配列を、可能性あるタン
パク質コード配列及びRNAポリマラーゼII転写シグナ
ルについて分析した。次に可能性あるタンパク質コード
配列の推定される翻訳生成物を、糖タンパク質の特徴、
すなわちN−末端の疎水性シグナルペプチド、C−末端
に近い疎水性トランスメンブラン配列及び外部ドメイン
における可能性あるN−グリコシル化部位の存在につい
て試験した。 【0020】これらの基準を用いて、HCMVゲノムのHind
III Fフラグメントの16255〜18972塩基間に及びHCMVゲ
ノムのHindIII Lフラグメントの228〜2456塩基間にそ
れぞれ存在する2種の推定上の糖タンパク質遺伝子を同
定した。HCMVゲノムのHindIIIフラグメント地図は、図
1に示されている。図1において、垂直な点線は、それ
ぞれ長い及び短いユニーク領域を示す。大文字は、Hind
IIIによる切断によって産生されたフラグメントを言及
する−参考文献(13)を参照のこと。糖タンパク質遺伝
子B及びHの位置及び配向は、それぞれHindIII制限フ
ラグメントF及びLに示されている。糖タンパク質Bの
コード領域は、DNA配列の相補的鎖上のHindIII F/
D境界からの塩基1378〜4095間に存在し;そして糖タン
パク質Hのコード領域は、DNA配列の相補的鎖上のHi
ndIII L/D境界からの塩基228〜2456間に存在する。 【0021】(HCMVの糖タンパク質B)指摘された読み
取り枠における糖タンパク質B遺伝子の第一次翻訳生成
物は、16個の可能性あるN−結合性グリコシル化部位を
含む、906個のアミノ酸ポリペプチドである。シグナル
配列として機能する、N−末端に近い疎水性配列及びア
ンカー配列として機能する、そのC−末端での疎水性ア
ミノ酸の延長が存在する。この遺伝子の推定される翻訳
生成物を、他のヒトヘルペスウィルスの糖タンパク質遺
伝子と比較した。この調査は、単純ヘルペスウィルス
(HSV)及び工プスタイン−バーウィルス(EBV)の糖タ
ンパク質B(gB)と相同であることを表わし(参考文献
14);水痘・帯状へルペスウィルス(VZV)はまた、相
同な糖タンパク質遺伝子を有する。この理由のために、
この読み枠によってコードされたタンパク質は、HCMVの
gBとして実質的に言及される。 【0022】その推定される翻訳生成物HCMV gBとHSV1
及びEBVのそれらとの比較は、図2から図5に示されて
いる。推定されるHCMV糖タンパク質配列は、EBV及びHSV
1に見られるそれらのものと整合されている。それらの
配列は、1文字のアミノ酸コードで示され、そして相同
アミノ酸の最適な整合をできるだけ生成するために、整
合され、そして点線により対合された。ほとんど相同し
ない領域、たとえば末端では、その整合は任意である。
糖タンパク質の特徴を有する、N−末端で及びC−未端
の近くでの疎水性アミノ酸の領域は実線で囲まれ、そし
て可能性あるN−結合性グリコシル化配列(N*T又は
N*S;*はいづれかのアミノ酸である)が下線を引か
れている。 【0023】図2から図5はHSV-1,EBV及びHCMVのgB
タンパク質の良好な整合を示し、そしてそれらのタンパ
ク質は、最少の保存性を示すN−及びC−末端を伴っ
て、それらの長さの大部分で相同であることを示す。す
べての3種のタンパク質において、121位で、等しくマ
ッチされたアミノ酸が存在することが見うけられる。EB
VのgBの部分として取る場合、これは、そのタンパク質
の14%以上が好ましくは保存されることを意味する。さ
らに、推定上のシグナル配列とアンカー配列との間に存
在するすべての10個のシステイン残基は、好ましくは整
合され、そしてそれらのタンパク質の細胞外部分が類似
する全部の構造体を有することができることを示唆す
る。これらの3種のウィルスタンパク質の間の相同性の
程度は、推定上のHCMV糖タンパク質が糖タンパク質Bの
相同体であるという確信のある証拠を提供する。その糖
タンパク質の特性のもう1つの証拠は、図2から図5に
示されているその特徴的な疎水性領域及び可能性あるN
−グリコシル化部位によって提供される。 【0024】HCMVのgBの性質を調べるために、そしてこ
のタンパク質に対する抗血清を高めるために、HCMVゲノ
ムのHindIII Fフラグメントから遺伝子を切り出し、そ
して組換えワクシニアウィルス中に発現せしめた。この
ベクター系は、真核性ウィルス糖タンパク質遺伝子の発
現のために適切である。なぜならばそのタンパク質は、
正しくプロセスされ、そしてその感染された細胞膜中に
挿入されるからである。さらに、感染性組換えウィルス
は、ワクチン接種された動物中において外来性タンパク
質に対する単一特異性抗血清を高めるために使用され得
る。 【0025】図6から図8に示されたコード配列は、下
記のようにしてワクシニアウィルス中に導入された。図
2から図8に示された配列は、コードセンス配列におい
て通常使用される5'から3'形で示される。これは、図
1に示されるHCMVゲノムの原型の方向に対して反対の方
向である。HCMVのgBのアミノ酸配列が、一文字のアミノ
酸コードを用いて、DNA配列の上に示されている。 【0026】(HCMVのgBを発現する組換えワクシニアウ
ィルスの構成) 1.策略 ワクシニアウィルス中における外来性遺伝子の発現は、
ワクシニアのプロモーターの使用に依存する(参考文献
15を参照のこと)。これは、ワクシニアのプロモーター
のユニークな性質及びRNAボリマラーゼIIによって転
写されるプロモーターを認識しないワクシニアDNAポ
リマラーゼの存在のためである。ワクシニアウィルス中
における外来性遺伝子の発現を促進するように計画され
ているいくつかのプラスミドが、構成されている(参考
文献16〜18を参照のこと)。それらは、ワクシニアプロ
モーター及びチミジンキナーゼ(TK)遺伝子内でトラン
スローケートされた下流の制限エンドヌクレアーゼ部位
を含む。次に、外来性タンパク質のコード配列は、ワク
シニアプロモーターの下流に位置を定められ、そしてイ
ン ビボで相同組換え法によりワクシニアゲノム中に挿
入され得る(参考文献17を参照のこと)。ワクシニアプ
ロモーターのコード配列と外来性タンパク質のコード配
列との間の連結部が、その外来性遺伝子の翻訳開始コド
ンを使用するために製造されるならば、確実な外来性タ
ンパク質が、製造される。 【0027】HCMVのgB遺伝子のヌクレオチド配列及び隣
接するDNAの検査は、制限エンドヌクレアーゼXmaIII
部位の存在を示し、そのgBコード配列の上流に148個
のヌクレオチド及びその下流に251個のヌクレオチドを
有した。さらに、上流のXmaIII部位とgB読み取り枠を
開始するATGコドンとの間に可能性ある翻訳開始コドン
は存在しなかった。従って、この策略は、3.1Kbのフラ
グメントとしてHCMV HindIII FフラグメントからgB
遺伝子を切り出し、そしてこのフラグメントをプラスミ
ド挿入ベクターpGS62(pGS20の誘導体−参考文献17を参
照のこと−ここでワクシニアプロモーターの上流のEcoR
I部位が欠失されている)のSmaI部位にクローン化する
ことであった。この方法において、gB遺伝子は、ワク
シニアウィルスの複製サイクルを通して発現されるワク
シニアプロモーターの制御下にあるであろう。所望のフ
ラグメントの直接的な単離は、HCMV HindIII Fフラグ
メントの大きなサイズ及び他のXmaIII部位の存在のため
に困難であった。 【0028】2.実験 さらに詳しくは、図6から図8のコード配列が、図9に
例示されている次の一連の操作によってワクシニアウィ
ルス中に導入された。 【0029】a)切断されたpAT153(参考文献19を参照
のこと)中にクローン化されたHindIII Fフラグメント
を、BamHIにより消化し、そして電気泳動によりその生
成物を分離した後、8.5Kbのフラグメントを単離し、そ
して自己連結せしめ、プラスミドpSB1(またpSCB1と
して知られている)を得た。pSB1は、pAT153の3.5Kb H
indIII/BamHIフラグメント中にクローン化された5Kb Hi
ndIII/BamHIフラグメントを含む。 【0030】b)pSB1をBamHI及びHindIIIにより消化
し、そして5.0KbのHCMVフラグメントを単離し、そしてX
maIIIにより消化した。その得られた3.1KbのXmaIIIフラ
グメントを単離し、5'突出部をE.コリのDNAポリ
マラーゼIクレノウフラグメントにより修復し、そして
その修復されたフラグメントをプラスミドpGS62のSmaI
部位に連結した。pGS62は、ワクシニアのプロモーター
要素によって妨げられるワクシニアウィルスのチミジン
キナーゼ(TK)遺伝子を合む。SmaI部位での外来性遺伝
子の挿入は、プラスミドをもたらし、ここでその外来性
HCMV gB遺伝子は、ワクシニアプロモーター(P)の制御
下にあり、そしてチミジンキナーゼのコード配列を端に
有する。 【0031】その得られたプラスミドpSB2内のgB遺伝子
の方向は、便利なマーカーとして3'XmaIII部位からのユ
ニークEcoRI部位存在の911ヌクレオチドを用いて決定さ
れた。 【0032】組換えプラスミドは、サイズの増大により
同定され、そして3.1K挿入体の方向は、EcoRIによる消
化によって決定された。ワクシニアのプロモーターに関
して、正しい方向にXmaIIIフラグメントを含むプラスミ
ドを同定し、そしてpSB2(またpSCB2として知られてい
る)と命名した。 【0033】参考文献17に記載の方法を用いて、CV-1細
胞を、ワクシニアウィルスにより感染せしめ、そしてpS
B2によりトランスフェクトした。その組換えウィルス
は、ワクシニアTK遺伝子の挿入不括性化のためにTK
-であり、そしてこの表現型は、容易に単離するための
手段を提供した。TK-ウィルスは、5-ブロモデオキシ
ウリジンの存在下で143−TK-細胞上にプレートす
ることによって、その得られた子孫から選択され、そし
てそのようなウィルスクローンは、pSB1とのハイブリダ
イゼーションによりHCMV特異性DNA挿入体の存在につ
いてスクリーンされた。ウィルスの増殖及び精製の後、
組換えウィルスのゲノムを、制限エンドヌクレアーゼに
よる消化及びサザン法によって分析した。その結果は、
HCMV gB遺伝子がHindIII Jフラグメント内のワクシニ
アTK遺伝子中に挿入されたことを確証し、そして他の
ゲノムの再配列が生じなかったことを示した。その組換
えウィルスをHCMV gB-VACと命名した。 【0034】(組換えワクシニアウィルスによるHCMV g
Bの発現)HCMV gBの発現を試験するために、精製された
HCMVに対して生ぜしめられた多価のウサギ血清を用い
て、HCMV gB-VAC又はWTワクシニアにより感染された
細胞からの、35Sによりラベルされたポリペプチドを免
疫沈殿せしめた。 【0035】CV-1細胞を、WTワクシニア又は組換えHC
MV gB-VACのいづれかにより、細胞当り30のプラーク形
成単位(pfu)で感染せしめた。感染後3時間で、それ
らの細胞を、メチオニンを含まない培地により洗浄し、
そして次に30分間、メチオニンを含まない培地中でイン
キュベートした。その細胞を、10μMのラベルされてい
ないメチオニンを含む培地中、100μCi/mlの35S−メチ
オニンによりラベル化した。PBSにより洗浄した後、そ
の細胞を、氷上で10分間、RIPA緩衝液(0.05MのTris ・
Hcl pH7.2、0.15MのNaCl、1%デオキシコール酸ナトリ
ウム、0.1%SDS、1%Tritonx-100、5μg/mlの2mMの
DNAse、2mMのPMSF)により分解した。その分解物を
4℃で60分間、31,000rpm(Beckman SW50.1ローター)
で遠心分離し、そしてその得られた上清液のアリコート
を、HCMVにより高度免疫化されたウサギからの血清又は
非免疫性ウサギ血清と共にインキュベートした(20分
間、室温で)。免疫複合体をプロテインAセファロース
により沈殿せしめ(2時間、室温で)、溶離し、煮沸
し、そして10%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動せ
しめた。そのゲルをメタノール/酢酸中に固定し、そし
てフルオログラフィーエンハンサー(Amplify,Amersha
m)と共に含浸せしめ、そしてオートラジオグラフを調
製した。HSV-1により感染された細胞からのタンパク質
の分子量マーカーを、主要キャプシッド抗原(157K
D)、糖タンパク質B(128KD)及びVP16(66KD)に対す
るモノクローナル抗体により沈殿せしめた。 【0036】免疫血清を用いて、約145KDのポリペプチ
ドを、HCMV gB-VACにより感染された細胞(WTワクシ
ニアにより感染された細胞ではない)から免疫沈殿せし
めた。他のポリペプチドを、プレ免疫ウサギ血清とのそ
れらの反応性によって示されているように、非特異的に
沈殿せしめた。 【0037】次に、HCMVに対して生ぜしめられ、そして
イン ビトロで中和化活性を有することを示されたネズ
ミモノクローナル抗体を、HCMV gB-VACにより感染され
た細胞中にHCMV gB生成物を認識するためのそれらの能
力について試験した。CV-1細胞の単層上での、HCMV gB-
VACによって形成されたプラークを、メタノールにより
固定し、そして次に、モノクローナル抗体及び続いて、
125Iによりラベルされたスタフィロコーカス(Staphyl
ococcus)のプロテインA(Amersham)又はペルオキシ
ダーゼ接合性ウサギ抗−マウス免疫グロブリン(DaKo)
のいづれかと共にインキュベートした。モノクローナル
抗体によって認識された抗原を含むウィルスプラーク
を、プロテインA結合抗体の場合、オートラジオグラフ
上での黒い点として又はペルオキシダーゼ接合性抗グロ
ブリンと反応した単層へのH2O2及びアミノーエチルカル
バゾールの添加に従っての“赤いプラーク”として可視
化した。試験された10種のモノクローナル抗体のうち4
種は、HCMV gB-VAC(WTワクシニアではない)により
形成されたプラークを認識することを示した。HCMV gB-
VACを示すモノクローナル抗体を結した、そのウィルス
によって形成されたプラークのすべては、純粋なもので
あり、WTワクシニアにより汚染されていないことが注
目すべきである。類似する結論が、ブロモデオキシウリ
ジンの存在及び不在下でTK- 143細胞上でウィルスに
よりプラークし、そしてサザン法によるゲノムDNAの
分析によって得られた。 【0038】WTワクシニア、組換えHCMV gB-VAC又は
感染されていないCV-1細胞からの細胞分解物を、調製
し、そして上記のようにしてモノクローナル抗体37,39
又は59により免疫沈殿化せしめた。 【0039】プロテインAを結合することができた3種
のモノクローナル抗体がまた、35S−メチオニンにより
ラベルされた感染性細胞抽出物も免疫沈殿化せしめた。
モノクローナル抗体37及び39が、HCMV gB-VAC(但しW
Tワクシニア又は感染されていない細胞ではない)によ
り感染された細胞からのタンパク質を免疫沈殿せしめた
ことは、免疫染色データと一致した。モノクローナル抗
体59は、HCMV感染性を中和することができるけれども、
この抗体はHCMV gBを認識しなかった。この抗体の目標
タンパク質は知られていない。145KDのタンパク質の他
に、約55KDのより低分子量のタンパク質がまた、両モノ
クローナル抗体により検出された。これは、両モノクロ
ーナル抗体により認識されたエピトープが55KD及び145K
Dの両タンパク質上に存在し、又はこれらのタンパク質
が物理的に関連し、そして結果的に同時沈殿することを
示唆する。 【0040】HCMVにより感染された細胞中に合成された
gBとHCMV gB-VACにより感染された細胞からのgBとを
直接的に比較するために、MRC-5細胞を、5pfu/細胞で
HCMV株、AD169により感染せしめ、又は偽感染せしめ
た。72〜98時間後、感染からの細胞を、35S−メチオニ
ン(28μCi/ml)によりラベルし、そして分解物を調製
し、そして、上記のようにしてモノクローナル抗体39又
は47のいづれかにより免疫沈殿せしめた。WTワクシニ
ア、組換えgB-VACにより感染された又は感染されていな
いCV-1細胞を、上記のようにして放射性ラベルし、分解
し、そしてモノクローナル抗体39により免疫沈殿せしめ
た。 【0041】両システムにおいて合成された145KD種は
明確に同時移動し、そして成熟した55KD種もまた、類似
するサイズのワクシニアバンドの非特異的な沈殿がこれ
をより不明確にしたけれども、明確に同時移動したりこ
れらの2種の種類の他に、さらに66KDバンドがまた、HC
MVにより感染された細胞分解物にも見られた。これは、
gBには無関係であると思われる。なぜならば、プロテ
インAを結合しなかったもう1つのモノクローナル抗体
(47)が、非特異的にこのバンドをもたらしたからであ
る。そのサイズは、それがたくさんの66KDのHCMVマトリ
ックスタンパク質であることを示唆した。 【0042】(ヒト免疫血清はHCMV gBを認識する)HCM
V gBに対して向けられた抗体が、ヒトにおける一次HCMV
感染の間、産生されるかどうかを調べるために、一次HC
MV感染の前及び後で、心臓の移植を受けた患者から採取
された血清が、組換ワクシニアウィルスによって含成さ
れたHCMV gBを認識する能カについて試験された。 【0043】H3-VAC又はHCMV gB-VACのいづれかにより
感染されたCV-1細胞を、上記のようにして調製された、
35S−メチオニン細胞分解物によりラベルした。次に、
分解物を、ウサギプレ−免疫、続いてウサギ抗−HCMV又
はHCMVによる感染の前に採取されたヒト血清、続いてHC
MVによる感染の後の血清のいづれかにより連続的に処理
した。免疫複合体がプロテインAセファロースにより沈
殿せしめられ、そして上記のようにしてポリアクリルア
ミドゲル上で分離された。 【0044】HCMVに対してひき起こされたウサギ血清
を、陽性の対照として使用した。ヒト血清はまた、時前
の天然痘ワタチンのために、ワクシニアウィルスに対す
る抗体を含む傾向があるので、免疫沈殿法が、HCMVによ
る感染の前及び続いて後で採取された血清を用いて同じ
細胞分解物に対して連続的に行なわれた。これらのデー
タは、145KDのポリペプチドが、HCMV感染の後で(但し
その前ではない)採取されたヒト血清によって、gB-VAC
により感染された細胞分解物から免疫沈殿せしめられた
ことを示す。145KDのタンパク質はまた、ウサギ抗−HCM
V血清によっても沈殿せしめられた。さらに対照とし
て、同じヒト血清が、もう1つの組換えワクシニアウィ
ルスH3-VACによって発現されたインフルエンザウィルス
A/NT/60/68からのインフルエンザウィルス赤血球凝集
素(HA)を認識する能力について試験された。そのイ
ンフルエンザHAは、HCMV感染の前に採取されたヒト血
清によって免疫沈殿せしめられ、そしてHCMV感染の後に
採取された血清によってはそれほどでもなかった。これ
らのデータは、心臓移植を受けた患者がH3サブタイプ
のインフルエンザAウィルス感染を前に経験したことを
示す。さらに、HCMV gBは、HCMV感染の後採取された血
清によって単に沈殿せしめられるけれども、HCMV感染の
前に採取された血清によるインフルエンザHAの沈殿
は、HCMVタンパク質の沈殿の特異性を確証する。HCMVに
対する抗体の成長が、組織拒絶を妨げるために心臓移植
の間の免疫抑制にもかかわらず、生じたこともまた有意
である。ヒト免疫血清はまた、イン ビトロでHCMV感染
性を中和することもできる。免疫抑制の間、HCMV感染を
経験した、心臓移植を受けた患者から採取されたいくか
つの他の血清がまた、HCMV gBの類似する沈殿をもたら
した。 【0045】(HCMV gBは感染された細胞表面上で発現
される)組換えワクシニアウィルスにより感染された細
胞中において合成されたHCMV gBが細胞表面に輸送され
るかどうかを試験するために、免疫蛍光研究が行なわれ
た。 【0046】CV-1細胞を、ガラス性カバースリップ上で
増殖せしめ、そして10pfu/細胞でWTワクシニアウィ
ルス又はHCMV-gB-VACのいづれかにより感染せしめた。
感染後48時間の細胞を、2%パラホルムアルデヒドの等
張溶液により固定した。4%ウシ血清アルブミン(BS
A)を合むPBS中でのインキュベーションの後、単層を、
4℃で一晩、腹水を含む、モノクローナル抗体37の1/40
0希釈溶液と反応せしめた。広範な洗浄の後、結合した
抗体を、4%BSA及び2%正常ウサギ血清を含むPBSによ
り1/20に希釈された、フルオレセイン接合性ウサギ抗−
マウス免疫グロブリン(DaKo)により検出した。螢光
を、x400でu.v.照射により観察した。 【0047】HCMV gB-VACにより感染された細胞は、陽
性の表面螢光を示したが、しかしWTにより感染された
細胞は、目だった反応性は示さなかった。感染された細
胞膜上の染色のパターンは、通常、粒状の外観を示し、
細胞膜におけるHCMV gBの集まり又は凝集を示唆した。 【0048】(HCMV gB-VACによるウサギのワクチン
化)組換えワクシニアウィルスによって発現されたHCMV
gBに対して生ぜしめられた抗−血清がHCMV感染性を中
和することがてきるかどうかを決定するために、2匹の
ウサギに、表1に示されるようにして組換え生ウィルス
によりワクチン接種した。 【0049】 【表1】 【0050】2匹のウサギを、それぞれの横腹上の1つ
の部位中に、精製された感染性HCMVgB-VAC 108pfuによ
り皮下免疫接種した。46日後、両動物を、同じ用量の組
換え生ワクチンにより再ワクチン接種した。第3のウサ
ギは、インフルエンザウィルスの核タンパク質遺伝子を
発現するTK- 組換えワクシニアウィルスを受け、そし
てまた再ワクチン接種された。表1に示された日に、ウ
サギから得られた血清サンプルを、イン ビトロでHCMV
感染性を中和するそれらの能力について試験した。血清
サンプルを、補体を不活性化するために56℃で30分間、
インキュベートし、そして次に、血清希釈溶液(1:10
又は1:50)の1体積とHCMV株AD169(750pfu)の等体
積とを混合し、そして37℃で30分間インキュベートし
た。新しいウサギ血清を補体源として添加し、5%の最
終濃度にし、そしてその混合物を30℃でさらに30分間イ
ンキュベートし、その後、残留ウィルスをMRC-5細胞に
対して検定した。プラークが10日後、計数され、そして
その結果は、プラーク数の%減少として表1に示されて
いる。ウサギ1及び2からの血情は、外因性補体の存在
下でHCMVの感染性を中和する抗体を含んだ。異なったT
K- 組換えワクシニアウィルスと共にインキュベートさ
れた第3ウサギは、そのような抗体を持たなかった。 【0051】従ってHCMV gB-VACによりワクチン接種さ
れた2匹の動物は、イン ビトロでHCMVを中和する抗体
を増殖せしめるが、但しインフルエンザウィルスの該タ
ンパク質を発現するもう1つのTK- 組換えワクシニア
ウィルスにより免疫化された第3ウサギはそうでなかっ
た。これらのウサギ血清によるHCMV感染性の中和は、補
体に依存した。なぜならば熱により不括性化にされた血
清は、外因性補体の添加なしに、HCMVプラーク数を減じ
なかった。2回目のワクチン接種の前及び後での抗体の
レベルを試験するもう1つの実験は、両動物が再ワクチ
ン接種の後、抗体カ価を高めたことを示した。ウサギ1
は、116日目までその抗体レベルを維持し、そしてこの
時点で、1:50の希釈度でHCMVプラーク形成を70%減じ
た。ウサギ2における抗体レベルは、時間と共に減少し
たが、しかし116日目、1:50の希釈度でHCMVプラーク
形成を24%、なお減じた。 【0052】(結論)推定上のコード配列は、ワクシニ
アに発現された真のHCMVタンパク質をコードする。ワク
シニアに発現したタンパク質は、HCMVにより感染された
細胞に見られるタンパク質と電気泳動により同一である
ことがわかった。そのタンパク質は次の特性を有する。
それは、抗体を中和するための目的である(なぜなら
ば、それは、中和性抗体によって認識されるからであ
る)。それは、HCMV gB-VACにより感染された細胞の表
面上こ存在し、そしてそれはHCMV粒子中に存在する。 【0053】一次生成物は、145,000の見掛分子量を有
し、そして55,000の分子量の生成物に加工される。それ
は、組換えウィルスにより感染された細胞中における発
現を通してウサギ免疫系に放される場合、HCMV感染を中
和する抗体の産生を誘発することができる。 【0054】上記例は、HCMV株AD169を使用したけれど
も、他の菌株も、機能的に同価値があり、そしてまた使
用され得る。 【0055】(HCMVの糖タンパク質H)図10から図1
2に示されているような遺伝子の推定上のアミノ酸配列
とEBV及びHSV-1遺伝子のアミノ酸配列との比較は、これ
らのウィルスの糖タンパク質Hが相同であることを示し
た。従って、このHCMV遺伝子は、HCMV gHとして言及さ
れる。 【0056】(HCMV gHを発現する組換えワクシニアウ
ィルスの構成)HCMV gH遺伝子を、次のようにしてプラ
スミドベクターpGS62中にクローン化した。11400個の塩
基対のHindIII Lフラグメントを、HindIIIによる消化
によってプラスミドpAT153/HindIII Lから切り出し、
そしてE.コリのDNAポリマラーゼクレノウフラグメ
ントによる処理によってそれらの末端を平滑末端化し
た。次に、そのDNAを、図10から図12に示される
ようにCMV gH遺伝子の翻訳開示部位の上流に96個のヌク
レオチドを切断するSmaIにより消化した。HCMV gHコー
ド配列を含む2.5KbのDNAフラグメントを単離し、そ
してユニークSmaI部位でブラスミドpGS62中に連結し
た。得られたプラスミドpSB3は、ワクシニアプロモータ
ーの下流に正しく位置を定められたHCMV gH遺伝子を含
むことが示された。前記方法は、HCMV gB遺伝子のため
に使用される方法に本質的に類似した。 【0057】HCMV gH遺伝子をまた、その同じワクシニ
アプロモーターの下流のユニークSmaI部位でプラスミド
pSC11(参考文献16)中に挿入した。このプラスミドはp
SB4と呼ばれた。プラスミドSC11は、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の発現を導びく第2のワクシニアプロモータ
ーを含む。従って、同時にHCMV gH遺伝子を得る組換え
ウィルスはまた、β−ガラクトシダーゼ遺伝子もまた獲
得する。これは、X−ガルの存在下でそれらの青色によ
り、これらの組換えウィルスによって形成されたプラー
クの急速な同定を可能にする。 【0058】プラスミドpSB3及びpSB4を用いて、HCMV g
H遺伝子を含むTK- 組換えワクシニアウィルスを構成
した。それらのウィルスは、それぞれHCMV gH-VAC(GS6
2)及びHCMV gH-VAC(SC11)と呼ばれた。これらのウィ
ルスは、プラーク精製され、そして次に、より多くのス
トックが確立される方法(参考文献17)を用いて、増殖
され、そして精製された。それらのウィルスのゲノムD
NAの分析は、推定されるように、HCMV gH遺伝子がワ
クシニアHindIII Jフラグメントを有するTK遺伝子中
に挿入されたことを示した。 【0059】(HCMV gH遺伝子の発現)HCMV gH遺伝子の
生成物を、次のようにして、HCMV gH-VACにより感染さ
れた細胞によって同定した: (1)CV-1細胞の単層を、WTワクシニア(WT)又は
組換えワクシニアウィルスCMV gH-VAC(GS62)もしくは
CMV gH-VAC(SC11)のいづれかにより感染せしめた。感
染された細胞を、感染後3〜6時間で35S−メチオニン
により放射性ラベルし、そして分解物を、感染後6時間
でその感染された細胞から調製した。これらの分解物
を、非特異的なウサギ血清、精製されたHCMVビリオンに
対して発現されたウサギ血清又は抗−HCMVモノクローナ
ル抗体16(HCMV16)のいづれかにより免疫沈殿せしめ
た。約86KDのポリペブチドを、ウサギ抗−HCMV血清を用
いて、gH-VAC(SC11)及びgH-VAC(GS62)により感染さ
れた細胞から免疫沈殿せしめた。このペプチドは、WT
ワクシニアにより感染された細胞からは沈殿せしめられ
なかった。HSV糖タンパク質Dからの合成ペプチドに対
して発現されたウサギ血清は、このバンドを沈殿せしめ
なかった。しかしながら、類似するサイズのポリペプチ
ドは、ウサギ抗−HCMV血清を用いて、HCMVにより感染さ
れたMRC-5細胞から沈殿せしめられた。 【0060】(2)抗−HCMVモノクローナル16はまた、
gH-VAC(但しWTではない)により感染された細胞から
86KDのバンドを免疫沈殿せしめた。HCMV gBを認識する
モノクローナルHCMV37は、対照として、86KDのタンパク
質を沈殿せしめなかった。 【0061】(3)HCMV gH-VACにより感染された細胞
中に合成されたHCMV gHの細胞位置が免疫螢光法によっ
て調べられた。これは、gHポリペプチドが核膜に輸送
され、そしてまた、拡散的に細胞質中において検出可能
であったことを示した。もし細胞が初めに透過されなけ
れば、HCMV gH-VACにより感染された細胞上に螢光は存
在しなかった。 【0062】(モノクローナルHCMV16は、HCMV感染牲を
中和する)HCMV gHが、ウィルス感染性の抗体仲介性中
和のための目的物であるかどうかを調べるために、HCMV
をモノクローナルHCMV16と共にインキュベートし、そし
て残る感染性をMRC-5細胞に対して検定した。1:4000
の希釈度でさえ、モノクローナルHCMV16は、イン ビト
ロでHCMV感染性を50%以上減じた。この中和は、外困性
補体に依存しなかった。明らかに、HCMV gH遺伝子の生
成物は、ウィルスの中和化のための目標物であり、そし
て従って、今後のHCMVワクチンに可能性を有する。 【0063】(結論)HCMVのHindIII Lフラグメント内
にマッピングされたHCMV糖タンパク質遺伝子のDNA配
列が決定され、そして組換えワクシニアウィルスに発現
された。その遺伝子生成物は、組換えワクシニアにより
感染された細胞における核膜に輸送される、86KDのポリ
ペプチドとして同定された。HCMVにより感染された細胞
において、それはまた、細胞表面膜にも存在するこのタ
ンパク質を認識するモノクローナル抗体は、イン ビト
ロでHCMVの感染性を効果的に中和する。これは、HCMVワ
クチンにおいて、この86KDの糖タンパク質の可能性ある
役割を示す。 【0064】前記説明は、組換えワクシニアウィルスに
より感染された細胞中におけるHCMVタンパク質の産生及
び感染防御抗体の出現を宿主に引き起こすワクチンとし
て作用するための前記ウィルスの可能性に対して、例に
よりとりくんで来たが、本発明は、当業者の能力内で容
易に、種々の異なった技法により修飾することができる
ことは明らかであろう。これらは、次のとおりに例示さ
れる。 【0065】(i)図6から図8及び図10から図12
に与えられたDNA及びアミノ酸配列に基づいて、HCMV
gB及びgHタンパク質をコードするDNAを、当業界
において良く知られた方法によって得ることができる。
たとえば、所望のアミノ酸配列をコードするDNAを合
成することができる。他方、そのDNAは、制限、続い
てラベルされたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブ
リダイゼーションにより対象の配列を同定することで、
ウィルスゲノムから得られる。また、cDNAは、ウィ
ルスmRNAからの逆転写、続いてオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーションプローブによりスクリーニング
することによって得られる。 【0066】(ii)HCMVタンパク質は、組換えDNAベ
クターにより形質転換された微生物又は細胞培養物に発
現される。適切なベクター及び発現システムは、広く知
られていて、そしてたとえば細菌、たとえばE.コリ
(E.coli)、酵母、たとえばサッカロマイセス セレビ
シアエ(Saccharomyces cerevisiae)及び哺乳類細胞培
養物、たとえばCOS又はCHO細胞にタンパク質を発現する
ために使用される。微生物発現(たとえば細菌及び酵
母)の場合、HCMVのタンパク質DNAは、発現ベクター
中への挿入の前、5'フランキング領域を除去するため
に、通常操作され、そのコード領域は、HCMVタンパク質
遺伝子のATG又はそのコード配列と読み枠を合わせて人
工的に導入されるATGのいづれかである出発コドンから
翻訳される。コード配列の5'領域、たとえば疎水性シ
グナル領域を除去することが所望される場合、後者が、
特に使用されるであろう。その疎水性3'アンカー領域
もまた、所望により除去され得る。なぜならば、それは
臨界の抗原決定基を含まない傾向にあるからである。そ
の組換えベクターは、複数のHCMVタンパク質コード配
列、たとえばタンデム反復でのgB又はgHのコード配
列又はタンデムでのgB及びgHの両者のコード配列を
含むことができる。発現ベクターのサイズを滅じるため
には、それぞれの糖タンパク質のコード配列の一部のみ
を、それが所望の抗原決定基を正しくコードする限り、
導入することができる。 【0067】(iii)HCMVタンパク質、又は所望とする
抗原決定基を含むその一部がまた、タンパク質合成の既
知方法を用いて、化学的手段によって合成され得る。 【0068】(iv)しかしながら、生成されたHCMVタン
パク質は、適切な動物をHCMVタンパク質により免疫化
し、そのタンパク質に対する抗体の産生を可能にし、そ
して次にその動物から抗血清を抽出することによって、
単一特異性血清として、HCMV−特異性抗体を産生するた
めに使用され得る。 【0069】(v)HCMVタンパク質は、そのタンパク質
による動物、通常マウスの免疫化、続いて分離され、そ
してクローン化され得る抗体産生ハイブリドーマを形成
するために、腫瘍細胞とその動物からの脾臓細胞との融
合の標準技法によって、HCMV−特異性モノクローナル抗
体を産生するために特に使用され得る。これらのクロー
ンから、モノクローナル抗体が収穫され得る。通常、抗
体のパネルが産生される。なせならば、それぞれのHCMV
タンパク質は、複数の抗体の産生を予期されるであろう
からである。 【0070】(vi)HCMVタンパク質はまた、適切な支持
体、たとえばアフィニティカラム上に固定されたタンパ
ク質と抗体とを接触し、そして次にたとえば溶離するこ
とによってそのタンパク質から結合した抗体を分離する
ことによって、HCMV−特異性抗体を精製するためにも使
用され得る。 【0071】(vii)HCMVタンパク質はまた、HCMV抗体
のための検定においても使用され得る。種々の従来の検
定方法が、たとえばELlSA, RIA又は免疫螢光法に基づい
て使用され得る。典型的には、HCMVタンパク質は、支持
体上に固定され、次にヒトからの臨床的サンプルと接触
され得る。洗浄した後、その支持体は、固定されたHCMV
タンパク質によって見出されたいづれかのHCMV抗体に結
合する、ラベルされた抗−ヒトIgGと接触せしめられ
る。 【0072】(viii)HCMVタンパク質はまた、ワクチン
配合において通常使用される種類の適切なアジュバント
又は賦形剤と共にそれを混合することによって、ワクチ
ンとしても使用され得る。このワクチンの形は、たとえ
ば免疫抑制された個人においては、組換えワクチンより
もより適切であろう。 【0073】(参考文献) 1. Stinski,M. (1976) J. Virol. 19, 594-609. 2. Pereira,L., Hoffman,M., Tatsuno,M and Dondero,
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ウィルス(HCMV)に関し、そしてそのウィルスの糖タン
パク質の産生、それらのワクチンの可能性及びHCMV特異
性抗体の産生に関する。 【0002】 【従来の技術】HCMVは、かなり重要なヒト病原菌であ
り、そしてそれに対する有効なワクチンが必要である。
従来の実験的なワクチンは、弱められた非病原性形ウィ
ルスに基づかれて来たが、しかし、所望としない副作用
が存在する。本発明は、組換えDNA技法を用いての、
HCMVに対するワクチンの製造への他のアプローチを提供
する。 【0003】他のヘルペスウィルスのように、HCMVは、
多重糖タンパク質を特定する(1,2)。これらの特徴
化は、ポリクローナル血清及びモノクローナル抗体を用
いての、CMVにより感染された細胞及び精製されたビリ
オンの研究を含む(2〜10)。1つの糖タンパク質が、
一部精製され、そしてモルモットに中和反応を誘発する
ことが示されて来た。 【0004】 【発明が解決しようとする課題】しかしながら、HCMVに
より特定化された糖タンパク質の合計数は、不明確であ
り、そして個々の糖タンパク質のワクチン可能性は知ら
れていない。HCMVにより感染された細胞からの個々の糖
タンパク質の精製は、期待の持てるものではない。なぜ
ならば、そのウィルスはゆっくりと増殖し、そして感染
の間、宿主タンパク質の合成を止めないからである。 【0005】 【課題を解決するための手段】本発明は、本明細書でg
B及びgHとして言及されている2種の糖タンパク質を
コードするHCMVのDNAの同定及び発現に基づかれる。
gBタンパク質は、F/D境界からの1378〜4095塩基の
間に存在する、HCMVゲノムのHindIII Fフラグメント中
のDNAによってコードされている。gHタンパク質
は、L/D境界からの228〜2456塩基の間に存在する、H
indIII Lフラグメント中のDNAによってコードされ
る。 【0006】本発明の1つの観点によれば、ヒトにHCMV
中和性抗体を高めることができる1又はそれよりも多く
の抗原決定基を組込むポリペプチドを、組換えDNAベ
クターからの適切な宿主生物中に発現することを含んで
成る方法が提供され、ここで前記決定基(又は決定基
類)は、F/D境界からの1378〜4095塩基の間に存在す
る、HCMVゲノムのHindIII Fフラグメント中のDNAに
よってコードされたタンパク質の部分に対応し、そして
/又はL/D境界からの228〜2456塩基の間に存在す
る、HCMVゲノムのHindIII Lフラグメント中のDNAに
よってコードされたタンパク質の部分に対応する。 【0007】本発明の第2の観点は、そのようなポリペ
プチドをコードするDNAを合む組換えウィルスベクタ
ーを提供することであり、前記ベクターは、ヒトを感染
することができ、そして免疫原形にそのポリペプチドを
発現する。 【0008】本発明の第3の観点は、そのようなポリペ
プチドを合成することを含んで成る方法を提供する。 【0009】本発明の第4の観点は、そのようなポリペ
プチド又は上記のような組換えウィルスベクターにより
宿主動物(ヒトを除く)を免疫化し、そして前記ポリペ
プチドに対して特異的な抗血清をその宿主動物から抽出
することを含んで成るHCMV単一特異性抗血清の調製方法
を提供する。HCMV−特異性モノクローナル抗体は、その
ような免疫化された動物からの細胞から調製され得る。 【0010】本発明の第5の観点は、抗体とHCMVポリペ
プチドとを接触し、そしてそのポリペプチドから結合し
た抗体を分離することを含んで成る、HCMV−特異性抗体
を精製する方法を提供する。 【0011】本発明の第6の観点は、サンプルとHCMVポ
リペプチドとを接触せしめ、そしてそのポリペプチドに
結合する抗体を検出することを含んで成る、臨床サンプ
ル中のHCMV特異性抗体を検出するための方法を提供す
る。 【0012】本発明の第7の観点は、そのような検出方
法を行なうためのキットを提供することであり、そして
該キットは、臨床サンプルとの接触のために適切な形の
前記ポリペプチド及び前記ポリペプチドに結合するHCMV
特異性抗体を検出するための手段を含んで成る。 【0013】 【発明の実施の形態】免疫応答を導びく、HCMVの表面糖
タンパク質を同定し、そして哺乳類ベクター中にその対
応する配列の遺伝物質を導入することによって、HCMVに
対するワクチンの基礎を形成することができる、免疫学
的に活性的なタンパク質を産生することができる。 【0014】組換えウィルスワクチンに関しては、その
同定されたHCMVゲノムフラグメントが単離され、そして
従来の遺伝子工学技法により適切な哺乳類ウィルスベク
ター中に導入され、そして哺乳類宿主中にそのプラスミ
ドをトランスフェクトすることができる。 【0015】適切なベクターは、哺乳類細胞及びウィル
ス、たとえばポックスウィルス(特に好ましくはワクシ
ニアウィルス)及びウシ乳頭腫ウィルスを含む。 【0016】外来性DNAの発現は、組換えウィルスベ
クターにより細胞又は動物を感染することによって得ら
れる。たとえば、組換えウィルス、たとえばワクシニア
ウィルスは、生ワクチンとして使用され得る。さらに、
組換えベクターにより感染された細胞を用いて、ワクチ
ンとして使用するために外来性DNAの生成物を調製す
ることができる。 【0017】1つの好ましい技法において、HCMVゲノム
の糖タンパク質−コードフラグメントが、プラスミドpG
S62中に導入され、そして次に、ワクシニアウィルスに
より感染された哺乳類細胞中にそのプラスミドをトラン
フェクトすることによって、ワクシニアウィルス中にト
ランスファーされる。 【0018】HCMVのDNAが、それによって産生される
タンパク質の機能に有意に影響を及ぼさないで、種々の
方法により変性され得ることは明らかであろう。たとえ
ば、タンパク質のトランスメンブラン形は、膜アンカー
配列を含むC−末端をコードするDNAを除去すること
によって分泌形に転換され得る。そのような変性は、本
発明の請求の範囲内に存在する。 【0019】 【実施例】 (推定上の糖タンパク質遺伝子の同定)HCMVゲノム内に
可能な糖タンパク質遺伝子を同定するために、HCMV株、
AD169のゲノムの個々のクローン化された制限フラグメ
ントが、参考文献(11)に記載のM13/ジデオキシヌ
クレオチド鎖終結法又は参考文献(12)のBankier及びB
arrellによって記載された策略及び方法を用いて、配列
決定された。次にその得られた配列を、可能性あるタン
パク質コード配列及びRNAポリマラーゼII転写シグナ
ルについて分析した。次に可能性あるタンパク質コード
配列の推定される翻訳生成物を、糖タンパク質の特徴、
すなわちN−末端の疎水性シグナルペプチド、C−末端
に近い疎水性トランスメンブラン配列及び外部ドメイン
における可能性あるN−グリコシル化部位の存在につい
て試験した。 【0020】これらの基準を用いて、HCMVゲノムのHind
III Fフラグメントの16255〜18972塩基間に及びHCMVゲ
ノムのHindIII Lフラグメントの228〜2456塩基間にそ
れぞれ存在する2種の推定上の糖タンパク質遺伝子を同
定した。HCMVゲノムのHindIIIフラグメント地図は、図
1に示されている。図1において、垂直な点線は、それ
ぞれ長い及び短いユニーク領域を示す。大文字は、Hind
IIIによる切断によって産生されたフラグメントを言及
する−参考文献(13)を参照のこと。糖タンパク質遺伝
子B及びHの位置及び配向は、それぞれHindIII制限フ
ラグメントF及びLに示されている。糖タンパク質Bの
コード領域は、DNA配列の相補的鎖上のHindIII F/
D境界からの塩基1378〜4095間に存在し;そして糖タン
パク質Hのコード領域は、DNA配列の相補的鎖上のHi
ndIII L/D境界からの塩基228〜2456間に存在する。 【0021】(HCMVの糖タンパク質B)指摘された読み
取り枠における糖タンパク質B遺伝子の第一次翻訳生成
物は、16個の可能性あるN−結合性グリコシル化部位を
含む、906個のアミノ酸ポリペプチドである。シグナル
配列として機能する、N−末端に近い疎水性配列及びア
ンカー配列として機能する、そのC−末端での疎水性ア
ミノ酸の延長が存在する。この遺伝子の推定される翻訳
生成物を、他のヒトヘルペスウィルスの糖タンパク質遺
伝子と比較した。この調査は、単純ヘルペスウィルス
(HSV)及び工プスタイン−バーウィルス(EBV)の糖タ
ンパク質B(gB)と相同であることを表わし(参考文献
14);水痘・帯状へルペスウィルス(VZV)はまた、相
同な糖タンパク質遺伝子を有する。この理由のために、
この読み枠によってコードされたタンパク質は、HCMVの
gBとして実質的に言及される。 【0022】その推定される翻訳生成物HCMV gBとHSV1
及びEBVのそれらとの比較は、図2から図5に示されて
いる。推定されるHCMV糖タンパク質配列は、EBV及びHSV
1に見られるそれらのものと整合されている。それらの
配列は、1文字のアミノ酸コードで示され、そして相同
アミノ酸の最適な整合をできるだけ生成するために、整
合され、そして点線により対合された。ほとんど相同し
ない領域、たとえば末端では、その整合は任意である。
糖タンパク質の特徴を有する、N−末端で及びC−未端
の近くでの疎水性アミノ酸の領域は実線で囲まれ、そし
て可能性あるN−結合性グリコシル化配列(N*T又は
N*S;*はいづれかのアミノ酸である)が下線を引か
れている。 【0023】図2から図5はHSV-1,EBV及びHCMVのgB
タンパク質の良好な整合を示し、そしてそれらのタンパ
ク質は、最少の保存性を示すN−及びC−末端を伴っ
て、それらの長さの大部分で相同であることを示す。す
べての3種のタンパク質において、121位で、等しくマ
ッチされたアミノ酸が存在することが見うけられる。EB
VのgBの部分として取る場合、これは、そのタンパク質
の14%以上が好ましくは保存されることを意味する。さ
らに、推定上のシグナル配列とアンカー配列との間に存
在するすべての10個のシステイン残基は、好ましくは整
合され、そしてそれらのタンパク質の細胞外部分が類似
する全部の構造体を有することができることを示唆す
る。これらの3種のウィルスタンパク質の間の相同性の
程度は、推定上のHCMV糖タンパク質が糖タンパク質Bの
相同体であるという確信のある証拠を提供する。その糖
タンパク質の特性のもう1つの証拠は、図2から図5に
示されているその特徴的な疎水性領域及び可能性あるN
−グリコシル化部位によって提供される。 【0024】HCMVのgBの性質を調べるために、そしてこ
のタンパク質に対する抗血清を高めるために、HCMVゲノ
ムのHindIII Fフラグメントから遺伝子を切り出し、そ
して組換えワクシニアウィルス中に発現せしめた。この
ベクター系は、真核性ウィルス糖タンパク質遺伝子の発
現のために適切である。なぜならばそのタンパク質は、
正しくプロセスされ、そしてその感染された細胞膜中に
挿入されるからである。さらに、感染性組換えウィルス
は、ワクチン接種された動物中において外来性タンパク
質に対する単一特異性抗血清を高めるために使用され得
る。 【0025】図6から図8に示されたコード配列は、下
記のようにしてワクシニアウィルス中に導入された。図
2から図8に示された配列は、コードセンス配列におい
て通常使用される5'から3'形で示される。これは、図
1に示されるHCMVゲノムの原型の方向に対して反対の方
向である。HCMVのgBのアミノ酸配列が、一文字のアミノ
酸コードを用いて、DNA配列の上に示されている。 【0026】(HCMVのgBを発現する組換えワクシニアウ
ィルスの構成) 1.策略 ワクシニアウィルス中における外来性遺伝子の発現は、
ワクシニアのプロモーターの使用に依存する(参考文献
15を参照のこと)。これは、ワクシニアのプロモーター
のユニークな性質及びRNAボリマラーゼIIによって転
写されるプロモーターを認識しないワクシニアDNAポ
リマラーゼの存在のためである。ワクシニアウィルス中
における外来性遺伝子の発現を促進するように計画され
ているいくつかのプラスミドが、構成されている(参考
文献16〜18を参照のこと)。それらは、ワクシニアプロ
モーター及びチミジンキナーゼ(TK)遺伝子内でトラン
スローケートされた下流の制限エンドヌクレアーゼ部位
を含む。次に、外来性タンパク質のコード配列は、ワク
シニアプロモーターの下流に位置を定められ、そしてイ
ン ビボで相同組換え法によりワクシニアゲノム中に挿
入され得る(参考文献17を参照のこと)。ワクシニアプ
ロモーターのコード配列と外来性タンパク質のコード配
列との間の連結部が、その外来性遺伝子の翻訳開始コド
ンを使用するために製造されるならば、確実な外来性タ
ンパク質が、製造される。 【0027】HCMVのgB遺伝子のヌクレオチド配列及び隣
接するDNAの検査は、制限エンドヌクレアーゼXmaIII
部位の存在を示し、そのgBコード配列の上流に148個
のヌクレオチド及びその下流に251個のヌクレオチドを
有した。さらに、上流のXmaIII部位とgB読み取り枠を
開始するATGコドンとの間に可能性ある翻訳開始コドン
は存在しなかった。従って、この策略は、3.1Kbのフラ
グメントとしてHCMV HindIII FフラグメントからgB
遺伝子を切り出し、そしてこのフラグメントをプラスミ
ド挿入ベクターpGS62(pGS20の誘導体−参考文献17を参
照のこと−ここでワクシニアプロモーターの上流のEcoR
I部位が欠失されている)のSmaI部位にクローン化する
ことであった。この方法において、gB遺伝子は、ワク
シニアウィルスの複製サイクルを通して発現されるワク
シニアプロモーターの制御下にあるであろう。所望のフ
ラグメントの直接的な単離は、HCMV HindIII Fフラグ
メントの大きなサイズ及び他のXmaIII部位の存在のため
に困難であった。 【0028】2.実験 さらに詳しくは、図6から図8のコード配列が、図9に
例示されている次の一連の操作によってワクシニアウィ
ルス中に導入された。 【0029】a)切断されたpAT153(参考文献19を参照
のこと)中にクローン化されたHindIII Fフラグメント
を、BamHIにより消化し、そして電気泳動によりその生
成物を分離した後、8.5Kbのフラグメントを単離し、そ
して自己連結せしめ、プラスミドpSB1(またpSCB1と
して知られている)を得た。pSB1は、pAT153の3.5Kb H
indIII/BamHIフラグメント中にクローン化された5Kb Hi
ndIII/BamHIフラグメントを含む。 【0030】b)pSB1をBamHI及びHindIIIにより消化
し、そして5.0KbのHCMVフラグメントを単離し、そしてX
maIIIにより消化した。その得られた3.1KbのXmaIIIフラ
グメントを単離し、5'突出部をE.コリのDNAポリ
マラーゼIクレノウフラグメントにより修復し、そして
その修復されたフラグメントをプラスミドpGS62のSmaI
部位に連結した。pGS62は、ワクシニアのプロモーター
要素によって妨げられるワクシニアウィルスのチミジン
キナーゼ(TK)遺伝子を合む。SmaI部位での外来性遺伝
子の挿入は、プラスミドをもたらし、ここでその外来性
HCMV gB遺伝子は、ワクシニアプロモーター(P)の制御
下にあり、そしてチミジンキナーゼのコード配列を端に
有する。 【0031】その得られたプラスミドpSB2内のgB遺伝子
の方向は、便利なマーカーとして3'XmaIII部位からのユ
ニークEcoRI部位存在の911ヌクレオチドを用いて決定さ
れた。 【0032】組換えプラスミドは、サイズの増大により
同定され、そして3.1K挿入体の方向は、EcoRIによる消
化によって決定された。ワクシニアのプロモーターに関
して、正しい方向にXmaIIIフラグメントを含むプラスミ
ドを同定し、そしてpSB2(またpSCB2として知られてい
る)と命名した。 【0033】参考文献17に記載の方法を用いて、CV-1細
胞を、ワクシニアウィルスにより感染せしめ、そしてpS
B2によりトランスフェクトした。その組換えウィルス
は、ワクシニアTK遺伝子の挿入不括性化のためにTK
-であり、そしてこの表現型は、容易に単離するための
手段を提供した。TK-ウィルスは、5-ブロモデオキシ
ウリジンの存在下で143−TK-細胞上にプレートす
ることによって、その得られた子孫から選択され、そし
てそのようなウィルスクローンは、pSB1とのハイブリダ
イゼーションによりHCMV特異性DNA挿入体の存在につ
いてスクリーンされた。ウィルスの増殖及び精製の後、
組換えウィルスのゲノムを、制限エンドヌクレアーゼに
よる消化及びサザン法によって分析した。その結果は、
HCMV gB遺伝子がHindIII Jフラグメント内のワクシニ
アTK遺伝子中に挿入されたことを確証し、そして他の
ゲノムの再配列が生じなかったことを示した。その組換
えウィルスをHCMV gB-VACと命名した。 【0034】(組換えワクシニアウィルスによるHCMV g
Bの発現)HCMV gBの発現を試験するために、精製された
HCMVに対して生ぜしめられた多価のウサギ血清を用い
て、HCMV gB-VAC又はWTワクシニアにより感染された
細胞からの、35Sによりラベルされたポリペプチドを免
疫沈殿せしめた。 【0035】CV-1細胞を、WTワクシニア又は組換えHC
MV gB-VACのいづれかにより、細胞当り30のプラーク形
成単位(pfu)で感染せしめた。感染後3時間で、それ
らの細胞を、メチオニンを含まない培地により洗浄し、
そして次に30分間、メチオニンを含まない培地中でイン
キュベートした。その細胞を、10μMのラベルされてい
ないメチオニンを含む培地中、100μCi/mlの35S−メチ
オニンによりラベル化した。PBSにより洗浄した後、そ
の細胞を、氷上で10分間、RIPA緩衝液(0.05MのTris ・
Hcl pH7.2、0.15MのNaCl、1%デオキシコール酸ナトリ
ウム、0.1%SDS、1%Tritonx-100、5μg/mlの2mMの
DNAse、2mMのPMSF)により分解した。その分解物を
4℃で60分間、31,000rpm(Beckman SW50.1ローター)
で遠心分離し、そしてその得られた上清液のアリコート
を、HCMVにより高度免疫化されたウサギからの血清又は
非免疫性ウサギ血清と共にインキュベートした(20分
間、室温で)。免疫複合体をプロテインAセファロース
により沈殿せしめ(2時間、室温で)、溶離し、煮沸
し、そして10%ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動せ
しめた。そのゲルをメタノール/酢酸中に固定し、そし
てフルオログラフィーエンハンサー(Amplify,Amersha
m)と共に含浸せしめ、そしてオートラジオグラフを調
製した。HSV-1により感染された細胞からのタンパク質
の分子量マーカーを、主要キャプシッド抗原(157K
D)、糖タンパク質B(128KD)及びVP16(66KD)に対す
るモノクローナル抗体により沈殿せしめた。 【0036】免疫血清を用いて、約145KDのポリペプチ
ドを、HCMV gB-VACにより感染された細胞(WTワクシ
ニアにより感染された細胞ではない)から免疫沈殿せし
めた。他のポリペプチドを、プレ免疫ウサギ血清とのそ
れらの反応性によって示されているように、非特異的に
沈殿せしめた。 【0037】次に、HCMVに対して生ぜしめられ、そして
イン ビトロで中和化活性を有することを示されたネズ
ミモノクローナル抗体を、HCMV gB-VACにより感染され
た細胞中にHCMV gB生成物を認識するためのそれらの能
力について試験した。CV-1細胞の単層上での、HCMV gB-
VACによって形成されたプラークを、メタノールにより
固定し、そして次に、モノクローナル抗体及び続いて、
125Iによりラベルされたスタフィロコーカス(Staphyl
ococcus)のプロテインA(Amersham)又はペルオキシ
ダーゼ接合性ウサギ抗−マウス免疫グロブリン(DaKo)
のいづれかと共にインキュベートした。モノクローナル
抗体によって認識された抗原を含むウィルスプラーク
を、プロテインA結合抗体の場合、オートラジオグラフ
上での黒い点として又はペルオキシダーゼ接合性抗グロ
ブリンと反応した単層へのH2O2及びアミノーエチルカル
バゾールの添加に従っての“赤いプラーク”として可視
化した。試験された10種のモノクローナル抗体のうち4
種は、HCMV gB-VAC(WTワクシニアではない)により
形成されたプラークを認識することを示した。HCMV gB-
VACを示すモノクローナル抗体を結した、そのウィルス
によって形成されたプラークのすべては、純粋なもので
あり、WTワクシニアにより汚染されていないことが注
目すべきである。類似する結論が、ブロモデオキシウリ
ジンの存在及び不在下でTK- 143細胞上でウィルスに
よりプラークし、そしてサザン法によるゲノムDNAの
分析によって得られた。 【0038】WTワクシニア、組換えHCMV gB-VAC又は
感染されていないCV-1細胞からの細胞分解物を、調製
し、そして上記のようにしてモノクローナル抗体37,39
又は59により免疫沈殿化せしめた。 【0039】プロテインAを結合することができた3種
のモノクローナル抗体がまた、35S−メチオニンにより
ラベルされた感染性細胞抽出物も免疫沈殿化せしめた。
モノクローナル抗体37及び39が、HCMV gB-VAC(但しW
Tワクシニア又は感染されていない細胞ではない)によ
り感染された細胞からのタンパク質を免疫沈殿せしめた
ことは、免疫染色データと一致した。モノクローナル抗
体59は、HCMV感染性を中和することができるけれども、
この抗体はHCMV gBを認識しなかった。この抗体の目標
タンパク質は知られていない。145KDのタンパク質の他
に、約55KDのより低分子量のタンパク質がまた、両モノ
クローナル抗体により検出された。これは、両モノクロ
ーナル抗体により認識されたエピトープが55KD及び145K
Dの両タンパク質上に存在し、又はこれらのタンパク質
が物理的に関連し、そして結果的に同時沈殿することを
示唆する。 【0040】HCMVにより感染された細胞中に合成された
gBとHCMV gB-VACにより感染された細胞からのgBとを
直接的に比較するために、MRC-5細胞を、5pfu/細胞で
HCMV株、AD169により感染せしめ、又は偽感染せしめ
た。72〜98時間後、感染からの細胞を、35S−メチオニ
ン(28μCi/ml)によりラベルし、そして分解物を調製
し、そして、上記のようにしてモノクローナル抗体39又
は47のいづれかにより免疫沈殿せしめた。WTワクシニ
ア、組換えgB-VACにより感染された又は感染されていな
いCV-1細胞を、上記のようにして放射性ラベルし、分解
し、そしてモノクローナル抗体39により免疫沈殿せしめ
た。 【0041】両システムにおいて合成された145KD種は
明確に同時移動し、そして成熟した55KD種もまた、類似
するサイズのワクシニアバンドの非特異的な沈殿がこれ
をより不明確にしたけれども、明確に同時移動したりこ
れらの2種の種類の他に、さらに66KDバンドがまた、HC
MVにより感染された細胞分解物にも見られた。これは、
gBには無関係であると思われる。なぜならば、プロテ
インAを結合しなかったもう1つのモノクローナル抗体
(47)が、非特異的にこのバンドをもたらしたからであ
る。そのサイズは、それがたくさんの66KDのHCMVマトリ
ックスタンパク質であることを示唆した。 【0042】(ヒト免疫血清はHCMV gBを認識する)HCM
V gBに対して向けられた抗体が、ヒトにおける一次HCMV
感染の間、産生されるかどうかを調べるために、一次HC
MV感染の前及び後で、心臓の移植を受けた患者から採取
された血清が、組換ワクシニアウィルスによって含成さ
れたHCMV gBを認識する能カについて試験された。 【0043】H3-VAC又はHCMV gB-VACのいづれかにより
感染されたCV-1細胞を、上記のようにして調製された、
35S−メチオニン細胞分解物によりラベルした。次に、
分解物を、ウサギプレ−免疫、続いてウサギ抗−HCMV又
はHCMVによる感染の前に採取されたヒト血清、続いてHC
MVによる感染の後の血清のいづれかにより連続的に処理
した。免疫複合体がプロテインAセファロースにより沈
殿せしめられ、そして上記のようにしてポリアクリルア
ミドゲル上で分離された。 【0044】HCMVに対してひき起こされたウサギ血清
を、陽性の対照として使用した。ヒト血清はまた、時前
の天然痘ワタチンのために、ワクシニアウィルスに対す
る抗体を含む傾向があるので、免疫沈殿法が、HCMVによ
る感染の前及び続いて後で採取された血清を用いて同じ
細胞分解物に対して連続的に行なわれた。これらのデー
タは、145KDのポリペプチドが、HCMV感染の後で(但し
その前ではない)採取されたヒト血清によって、gB-VAC
により感染された細胞分解物から免疫沈殿せしめられた
ことを示す。145KDのタンパク質はまた、ウサギ抗−HCM
V血清によっても沈殿せしめられた。さらに対照とし
て、同じヒト血清が、もう1つの組換えワクシニアウィ
ルスH3-VACによって発現されたインフルエンザウィルス
A/NT/60/68からのインフルエンザウィルス赤血球凝集
素(HA)を認識する能力について試験された。そのイ
ンフルエンザHAは、HCMV感染の前に採取されたヒト血
清によって免疫沈殿せしめられ、そしてHCMV感染の後に
採取された血清によってはそれほどでもなかった。これ
らのデータは、心臓移植を受けた患者がH3サブタイプ
のインフルエンザAウィルス感染を前に経験したことを
示す。さらに、HCMV gBは、HCMV感染の後採取された血
清によって単に沈殿せしめられるけれども、HCMV感染の
前に採取された血清によるインフルエンザHAの沈殿
は、HCMVタンパク質の沈殿の特異性を確証する。HCMVに
対する抗体の成長が、組織拒絶を妨げるために心臓移植
の間の免疫抑制にもかかわらず、生じたこともまた有意
である。ヒト免疫血清はまた、イン ビトロでHCMV感染
性を中和することもできる。免疫抑制の間、HCMV感染を
経験した、心臓移植を受けた患者から採取されたいくか
つの他の血清がまた、HCMV gBの類似する沈殿をもたら
した。 【0045】(HCMV gBは感染された細胞表面上で発現
される)組換えワクシニアウィルスにより感染された細
胞中において合成されたHCMV gBが細胞表面に輸送され
るかどうかを試験するために、免疫蛍光研究が行なわれ
た。 【0046】CV-1細胞を、ガラス性カバースリップ上で
増殖せしめ、そして10pfu/細胞でWTワクシニアウィ
ルス又はHCMV-gB-VACのいづれかにより感染せしめた。
感染後48時間の細胞を、2%パラホルムアルデヒドの等
張溶液により固定した。4%ウシ血清アルブミン(BS
A)を合むPBS中でのインキュベーションの後、単層を、
4℃で一晩、腹水を含む、モノクローナル抗体37の1/40
0希釈溶液と反応せしめた。広範な洗浄の後、結合した
抗体を、4%BSA及び2%正常ウサギ血清を含むPBSによ
り1/20に希釈された、フルオレセイン接合性ウサギ抗−
マウス免疫グロブリン(DaKo)により検出した。螢光
を、x400でu.v.照射により観察した。 【0047】HCMV gB-VACにより感染された細胞は、陽
性の表面螢光を示したが、しかしWTにより感染された
細胞は、目だった反応性は示さなかった。感染された細
胞膜上の染色のパターンは、通常、粒状の外観を示し、
細胞膜におけるHCMV gBの集まり又は凝集を示唆した。 【0048】(HCMV gB-VACによるウサギのワクチン
化)組換えワクシニアウィルスによって発現されたHCMV
gBに対して生ぜしめられた抗−血清がHCMV感染性を中
和することがてきるかどうかを決定するために、2匹の
ウサギに、表1に示されるようにして組換え生ウィルス
によりワクチン接種した。 【0049】 【表1】 【0050】2匹のウサギを、それぞれの横腹上の1つ
の部位中に、精製された感染性HCMVgB-VAC 108pfuによ
り皮下免疫接種した。46日後、両動物を、同じ用量の組
換え生ワクチンにより再ワクチン接種した。第3のウサ
ギは、インフルエンザウィルスの核タンパク質遺伝子を
発現するTK- 組換えワクシニアウィルスを受け、そし
てまた再ワクチン接種された。表1に示された日に、ウ
サギから得られた血清サンプルを、イン ビトロでHCMV
感染性を中和するそれらの能力について試験した。血清
サンプルを、補体を不活性化するために56℃で30分間、
インキュベートし、そして次に、血清希釈溶液(1:10
又は1:50)の1体積とHCMV株AD169(750pfu)の等体
積とを混合し、そして37℃で30分間インキュベートし
た。新しいウサギ血清を補体源として添加し、5%の最
終濃度にし、そしてその混合物を30℃でさらに30分間イ
ンキュベートし、その後、残留ウィルスをMRC-5細胞に
対して検定した。プラークが10日後、計数され、そして
その結果は、プラーク数の%減少として表1に示されて
いる。ウサギ1及び2からの血情は、外因性補体の存在
下でHCMVの感染性を中和する抗体を含んだ。異なったT
K- 組換えワクシニアウィルスと共にインキュベートさ
れた第3ウサギは、そのような抗体を持たなかった。 【0051】従ってHCMV gB-VACによりワクチン接種さ
れた2匹の動物は、イン ビトロでHCMVを中和する抗体
を増殖せしめるが、但しインフルエンザウィルスの該タ
ンパク質を発現するもう1つのTK- 組換えワクシニア
ウィルスにより免疫化された第3ウサギはそうでなかっ
た。これらのウサギ血清によるHCMV感染性の中和は、補
体に依存した。なぜならば熱により不括性化にされた血
清は、外因性補体の添加なしに、HCMVプラーク数を減じ
なかった。2回目のワクチン接種の前及び後での抗体の
レベルを試験するもう1つの実験は、両動物が再ワクチ
ン接種の後、抗体カ価を高めたことを示した。ウサギ1
は、116日目までその抗体レベルを維持し、そしてこの
時点で、1:50の希釈度でHCMVプラーク形成を70%減じ
た。ウサギ2における抗体レベルは、時間と共に減少し
たが、しかし116日目、1:50の希釈度でHCMVプラーク
形成を24%、なお減じた。 【0052】(結論)推定上のコード配列は、ワクシニ
アに発現された真のHCMVタンパク質をコードする。ワク
シニアに発現したタンパク質は、HCMVにより感染された
細胞に見られるタンパク質と電気泳動により同一である
ことがわかった。そのタンパク質は次の特性を有する。
それは、抗体を中和するための目的である(なぜなら
ば、それは、中和性抗体によって認識されるからであ
る)。それは、HCMV gB-VACにより感染された細胞の表
面上こ存在し、そしてそれはHCMV粒子中に存在する。 【0053】一次生成物は、145,000の見掛分子量を有
し、そして55,000の分子量の生成物に加工される。それ
は、組換えウィルスにより感染された細胞中における発
現を通してウサギ免疫系に放される場合、HCMV感染を中
和する抗体の産生を誘発することができる。 【0054】上記例は、HCMV株AD169を使用したけれど
も、他の菌株も、機能的に同価値があり、そしてまた使
用され得る。 【0055】(HCMVの糖タンパク質H)図10から図1
2に示されているような遺伝子の推定上のアミノ酸配列
とEBV及びHSV-1遺伝子のアミノ酸配列との比較は、これ
らのウィルスの糖タンパク質Hが相同であることを示し
た。従って、このHCMV遺伝子は、HCMV gHとして言及さ
れる。 【0056】(HCMV gHを発現する組換えワクシニアウ
ィルスの構成)HCMV gH遺伝子を、次のようにしてプラ
スミドベクターpGS62中にクローン化した。11400個の塩
基対のHindIII Lフラグメントを、HindIIIによる消化
によってプラスミドpAT153/HindIII Lから切り出し、
そしてE.コリのDNAポリマラーゼクレノウフラグメ
ントによる処理によってそれらの末端を平滑末端化し
た。次に、そのDNAを、図10から図12に示される
ようにCMV gH遺伝子の翻訳開示部位の上流に96個のヌク
レオチドを切断するSmaIにより消化した。HCMV gHコー
ド配列を含む2.5KbのDNAフラグメントを単離し、そ
してユニークSmaI部位でブラスミドpGS62中に連結し
た。得られたプラスミドpSB3は、ワクシニアプロモータ
ーの下流に正しく位置を定められたHCMV gH遺伝子を含
むことが示された。前記方法は、HCMV gB遺伝子のため
に使用される方法に本質的に類似した。 【0057】HCMV gH遺伝子をまた、その同じワクシニ
アプロモーターの下流のユニークSmaI部位でプラスミド
pSC11(参考文献16)中に挿入した。このプラスミドはp
SB4と呼ばれた。プラスミドSC11は、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の発現を導びく第2のワクシニアプロモータ
ーを含む。従って、同時にHCMV gH遺伝子を得る組換え
ウィルスはまた、β−ガラクトシダーゼ遺伝子もまた獲
得する。これは、X−ガルの存在下でそれらの青色によ
り、これらの組換えウィルスによって形成されたプラー
クの急速な同定を可能にする。 【0058】プラスミドpSB3及びpSB4を用いて、HCMV g
H遺伝子を含むTK- 組換えワクシニアウィルスを構成
した。それらのウィルスは、それぞれHCMV gH-VAC(GS6
2)及びHCMV gH-VAC(SC11)と呼ばれた。これらのウィ
ルスは、プラーク精製され、そして次に、より多くのス
トックが確立される方法(参考文献17)を用いて、増殖
され、そして精製された。それらのウィルスのゲノムD
NAの分析は、推定されるように、HCMV gH遺伝子がワ
クシニアHindIII Jフラグメントを有するTK遺伝子中
に挿入されたことを示した。 【0059】(HCMV gH遺伝子の発現)HCMV gH遺伝子の
生成物を、次のようにして、HCMV gH-VACにより感染さ
れた細胞によって同定した: (1)CV-1細胞の単層を、WTワクシニア(WT)又は
組換えワクシニアウィルスCMV gH-VAC(GS62)もしくは
CMV gH-VAC(SC11)のいづれかにより感染せしめた。感
染された細胞を、感染後3〜6時間で35S−メチオニン
により放射性ラベルし、そして分解物を、感染後6時間
でその感染された細胞から調製した。これらの分解物
を、非特異的なウサギ血清、精製されたHCMVビリオンに
対して発現されたウサギ血清又は抗−HCMVモノクローナ
ル抗体16(HCMV16)のいづれかにより免疫沈殿せしめ
た。約86KDのポリペブチドを、ウサギ抗−HCMV血清を用
いて、gH-VAC(SC11)及びgH-VAC(GS62)により感染さ
れた細胞から免疫沈殿せしめた。このペプチドは、WT
ワクシニアにより感染された細胞からは沈殿せしめられ
なかった。HSV糖タンパク質Dからの合成ペプチドに対
して発現されたウサギ血清は、このバンドを沈殿せしめ
なかった。しかしながら、類似するサイズのポリペプチ
ドは、ウサギ抗−HCMV血清を用いて、HCMVにより感染さ
れたMRC-5細胞から沈殿せしめられた。 【0060】(2)抗−HCMVモノクローナル16はまた、
gH-VAC(但しWTではない)により感染された細胞から
86KDのバンドを免疫沈殿せしめた。HCMV gBを認識する
モノクローナルHCMV37は、対照として、86KDのタンパク
質を沈殿せしめなかった。 【0061】(3)HCMV gH-VACにより感染された細胞
中に合成されたHCMV gHの細胞位置が免疫螢光法によっ
て調べられた。これは、gHポリペプチドが核膜に輸送
され、そしてまた、拡散的に細胞質中において検出可能
であったことを示した。もし細胞が初めに透過されなけ
れば、HCMV gH-VACにより感染された細胞上に螢光は存
在しなかった。 【0062】(モノクローナルHCMV16は、HCMV感染牲を
中和する)HCMV gHが、ウィルス感染性の抗体仲介性中
和のための目的物であるかどうかを調べるために、HCMV
をモノクローナルHCMV16と共にインキュベートし、そし
て残る感染性をMRC-5細胞に対して検定した。1:4000
の希釈度でさえ、モノクローナルHCMV16は、イン ビト
ロでHCMV感染性を50%以上減じた。この中和は、外困性
補体に依存しなかった。明らかに、HCMV gH遺伝子の生
成物は、ウィルスの中和化のための目標物であり、そし
て従って、今後のHCMVワクチンに可能性を有する。 【0063】(結論)HCMVのHindIII Lフラグメント内
にマッピングされたHCMV糖タンパク質遺伝子のDNA配
列が決定され、そして組換えワクシニアウィルスに発現
された。その遺伝子生成物は、組換えワクシニアにより
感染された細胞における核膜に輸送される、86KDのポリ
ペプチドとして同定された。HCMVにより感染された細胞
において、それはまた、細胞表面膜にも存在するこのタ
ンパク質を認識するモノクローナル抗体は、イン ビト
ロでHCMVの感染性を効果的に中和する。これは、HCMVワ
クチンにおいて、この86KDの糖タンパク質の可能性ある
役割を示す。 【0064】前記説明は、組換えワクシニアウィルスに
より感染された細胞中におけるHCMVタンパク質の産生及
び感染防御抗体の出現を宿主に引き起こすワクチンとし
て作用するための前記ウィルスの可能性に対して、例に
よりとりくんで来たが、本発明は、当業者の能力内で容
易に、種々の異なった技法により修飾することができる
ことは明らかであろう。これらは、次のとおりに例示さ
れる。 【0065】(i)図6から図8及び図10から図12
に与えられたDNA及びアミノ酸配列に基づいて、HCMV
gB及びgHタンパク質をコードするDNAを、当業界
において良く知られた方法によって得ることができる。
たとえば、所望のアミノ酸配列をコードするDNAを合
成することができる。他方、そのDNAは、制限、続い
てラベルされたオリゴヌクレオチドプローブとのハイブ
リダイゼーションにより対象の配列を同定することで、
ウィルスゲノムから得られる。また、cDNAは、ウィ
ルスmRNAからの逆転写、続いてオリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーションプローブによりスクリーニング
することによって得られる。 【0066】(ii)HCMVタンパク質は、組換えDNAベ
クターにより形質転換された微生物又は細胞培養物に発
現される。適切なベクター及び発現システムは、広く知
られていて、そしてたとえば細菌、たとえばE.コリ
(E.coli)、酵母、たとえばサッカロマイセス セレビ
シアエ(Saccharomyces cerevisiae)及び哺乳類細胞培
養物、たとえばCOS又はCHO細胞にタンパク質を発現する
ために使用される。微生物発現(たとえば細菌及び酵
母)の場合、HCMVのタンパク質DNAは、発現ベクター
中への挿入の前、5'フランキング領域を除去するため
に、通常操作され、そのコード領域は、HCMVタンパク質
遺伝子のATG又はそのコード配列と読み枠を合わせて人
工的に導入されるATGのいづれかである出発コドンから
翻訳される。コード配列の5'領域、たとえば疎水性シ
グナル領域を除去することが所望される場合、後者が、
特に使用されるであろう。その疎水性3'アンカー領域
もまた、所望により除去され得る。なぜならば、それは
臨界の抗原決定基を含まない傾向にあるからである。そ
の組換えベクターは、複数のHCMVタンパク質コード配
列、たとえばタンデム反復でのgB又はgHのコード配
列又はタンデムでのgB及びgHの両者のコード配列を
含むことができる。発現ベクターのサイズを滅じるため
には、それぞれの糖タンパク質のコード配列の一部のみ
を、それが所望の抗原決定基を正しくコードする限り、
導入することができる。 【0067】(iii)HCMVタンパク質、又は所望とする
抗原決定基を含むその一部がまた、タンパク質合成の既
知方法を用いて、化学的手段によって合成され得る。 【0068】(iv)しかしながら、生成されたHCMVタン
パク質は、適切な動物をHCMVタンパク質により免疫化
し、そのタンパク質に対する抗体の産生を可能にし、そ
して次にその動物から抗血清を抽出することによって、
単一特異性血清として、HCMV−特異性抗体を産生するた
めに使用され得る。 【0069】(v)HCMVタンパク質は、そのタンパク質
による動物、通常マウスの免疫化、続いて分離され、そ
してクローン化され得る抗体産生ハイブリドーマを形成
するために、腫瘍細胞とその動物からの脾臓細胞との融
合の標準技法によって、HCMV−特異性モノクローナル抗
体を産生するために特に使用され得る。これらのクロー
ンから、モノクローナル抗体が収穫され得る。通常、抗
体のパネルが産生される。なせならば、それぞれのHCMV
タンパク質は、複数の抗体の産生を予期されるであろう
からである。 【0070】(vi)HCMVタンパク質はまた、適切な支持
体、たとえばアフィニティカラム上に固定されたタンパ
ク質と抗体とを接触し、そして次にたとえば溶離するこ
とによってそのタンパク質から結合した抗体を分離する
ことによって、HCMV−特異性抗体を精製するためにも使
用され得る。 【0071】(vii)HCMVタンパク質はまた、HCMV抗体
のための検定においても使用され得る。種々の従来の検
定方法が、たとえばELlSA, RIA又は免疫螢光法に基づい
て使用され得る。典型的には、HCMVタンパク質は、支持
体上に固定され、次にヒトからの臨床的サンプルと接触
され得る。洗浄した後、その支持体は、固定されたHCMV
タンパク質によって見出されたいづれかのHCMV抗体に結
合する、ラベルされた抗−ヒトIgGと接触せしめられ
る。 【0072】(viii)HCMVタンパク質はまた、ワクチン
配合において通常使用される種類の適切なアジュバント
又は賦形剤と共にそれを混合することによって、ワクチ
ンとしても使用され得る。このワクチンの形は、たとえ
ば免疫抑制された個人においては、組換えワクチンより
もより適切であろう。 【0073】(参考文献) 1. Stinski,M. (1976) J. Virol. 19, 594-609. 2. Pereira,L., Hoffman,M., Tatsuno,M and Dondero,
D. (1984) Virology,139, 73-86. 3. Pereira,L., Hoffman,M. and Cremer,N. (1982) In
fect. Immun., 36, 933-942. 4. Pereira,L., Hoffman,M., Gallo,G. and Cremer,N.
(1982) Infect. Immun., 36, 924-932. 5. Britt,W.J. (1984) Virology, 135, 369-378. 6. Nowak,B., Sullivan,C., Sarnow,P., Thomas,R., B
ricout,F., Nicolas,J.C., Fleckenstein,B. and Levin
e,A.J. (1984) Virology, 132, 325-338. 7. Law,K.M., Wilton-Smith,P. and Farrar,G.H. (198
5) J. Med. Virol. 17,255-266. 8. Rasmussen.L., Mullenax,J., Nelson,R. and Merig
an,T.C. (1985) J. Virol. 55, 274-280. 9. Rasmussen,L., Mullenax,J., Nelson,M. and Merig
an,T.C. (1985) Virology, 145, 186-190. 10. Britt,W.J. and Auger,D. (1986) J. Virol., 58,
185-191. 11. Sanger,F., Coulson,A.R., Barrell,B.G., Smith.
A.J.H. and Roe,B.A. (1980) J. Mol. Biol., 143, 161
-178. 12. Bankier,A.T. and Barrell,B.G. (1983). Shotgun
DNA sequencing in Techniques in the Life Scienc
es. Volume B508, pp. 1-34. Elsevier Scientific Pub
lishers Ireland Ltd. 13. Oram,J.D., Downing,R.G., Akrigg,A., Dollery,A.
A., Duggleby,C.J., Wilkinson,G.W.G. and Greenaway,
P.J. (1982) J. Gen. Virol., 59, 111-129. 14. Pellet,P.E., Biggin,M.D., Barrell,B.G. and Roi
zman,B. (1985)J. Virol. 56, 807-813. 15. Smith,G.L. and Moss,B. BioTechniques 2, 120-12
6, (1984). 16. Chakrabarti,S., Breckling,K. and Moss,B. (198
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irol, 47, 857-864. 18. Boyle,D.B., Couper,B.E.H. and Both,G.W. (1985)
Gene, 35, 169-177. 19. Twigg,A.J. and Sherratt,D. (1980) Nature, 283,
216.
【図面の簡単な説明】
【図1】 制限酵素HindIIIのための適切な切断を示す
原型方向におけるHCMVゲノム株AD169の地図であり、HCM
V gB及びHCMV gHをコードする遺伝子の位置及び方向も
示している。 【図2】 図1に同定されたHCMV gB遺伝子(CMVとして
命名されている)の推定上の翻訳生成物と単純ヘルペス
ウィルスのタイプ1の糖タンパク質B(HSVとして命名
されている)及び可能性あるエプスタイン−バーウィル
スの糖タンパク質(EBVとして命名されている)の推定
上の翻訳生成物との比較である。可能性あるグリコシル
化部位は下線を引かれ、そして推定上の疎水性シグナル
領域及びアンカー領域は実線で囲まれている。 【図3】 図2の続きである。 【図4】 図3の続きである。 【図5】 図4の続きである。 【図6】 HCMV gBの推定上のアミノ酸配列を示す、HCM
V gBをコードする遺伝子を含む、HCMVゲノムのHindIII
FフラグメントのXmaIII制限酵素フラグメントのDNA
配列である。明確には、これは、HCMVゲノムの原型方向
に存在する方向に対して反対の方向に示される。 【図7】 図6の続きである。 【図8】 図7の続きである。 【図9】 プラスミドpGS62中への図6から図8の配列
の導入を例示するものであり、これからそれは、ワクシ
ニアウィルス中にトランスファーされ得る。濃い線は、
HCMVのDNAを示し;そして薄い線はプラスミドDNA
を示す。開放のボックスは、ワクシニアHindIII Jフラ
グメントから取られたワクシニアDNAを示し、そして
TK遺伝子のコード配列を含み、この中にワクシニアプ
ロモーターPがトランスロケーションされている。 【図10】 HCMV gHのためのコード配列を拡張するSma
I−HindIII LフラグメントのDNA配列を示す。図6
から図8に関するように、これは、HCMVゲノムの原型方
向に存在する方向に対して反対の方向に示されている。
HCMV gHの推定上のアミノ酸配列が、一文字のアミノ酸
コードでDNA配列の上に示されている。クローニング
に使用されるSmaI(CCCGGG)及びHindIII(AAGCTT)の
ための制限酵素認識配列が下線を引かれ、そしてその可
能性あるグリコシル化部位も下線を引かれている。Hind
III部位は、ゲノム中のHindIIIフラグメントL及びDの
間の境界を示す。推定上の疎水性シグナル領域及びアン
カー領域は、実線で囲まれている。 【図11】 図10の続きである。 【図12】 図11の続きである。
原型方向におけるHCMVゲノム株AD169の地図であり、HCM
V gB及びHCMV gHをコードする遺伝子の位置及び方向も
示している。 【図2】 図1に同定されたHCMV gB遺伝子(CMVとして
命名されている)の推定上の翻訳生成物と単純ヘルペス
ウィルスのタイプ1の糖タンパク質B(HSVとして命名
されている)及び可能性あるエプスタイン−バーウィル
スの糖タンパク質(EBVとして命名されている)の推定
上の翻訳生成物との比較である。可能性あるグリコシル
化部位は下線を引かれ、そして推定上の疎水性シグナル
領域及びアンカー領域は実線で囲まれている。 【図3】 図2の続きである。 【図4】 図3の続きである。 【図5】 図4の続きである。 【図6】 HCMV gBの推定上のアミノ酸配列を示す、HCM
V gBをコードする遺伝子を含む、HCMVゲノムのHindIII
FフラグメントのXmaIII制限酵素フラグメントのDNA
配列である。明確には、これは、HCMVゲノムの原型方向
に存在する方向に対して反対の方向に示される。 【図7】 図6の続きである。 【図8】 図7の続きである。 【図9】 プラスミドpGS62中への図6から図8の配列
の導入を例示するものであり、これからそれは、ワクシ
ニアウィルス中にトランスファーされ得る。濃い線は、
HCMVのDNAを示し;そして薄い線はプラスミドDNA
を示す。開放のボックスは、ワクシニアHindIII Jフラ
グメントから取られたワクシニアDNAを示し、そして
TK遺伝子のコード配列を含み、この中にワクシニアプ
ロモーターPがトランスロケーションされている。 【図10】 HCMV gHのためのコード配列を拡張するSma
I−HindIII LフラグメントのDNA配列を示す。図6
から図8に関するように、これは、HCMVゲノムの原型方
向に存在する方向に対して反対の方向に示されている。
HCMV gHの推定上のアミノ酸配列が、一文字のアミノ酸
コードでDNA配列の上に示されている。クローニング
に使用されるSmaI(CCCGGG)及びHindIII(AAGCTT)の
ための制限酵素認識配列が下線を引かれ、そしてその可
能性あるグリコシル化部位も下線を引かれている。Hind
III部位は、ゲノム中のHindIIIフラグメントL及びDの
間の境界を示す。推定上の疎水性シグナル領域及びアン
カー領域は、実線で囲まれている。 【図11】 図10の続きである。 【図12】 図11の続きである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
G01N 33/53 G01N 33/53 V
33/531 33/531 A
33/566 33/566
33/569 33/569 J
33/577 33/577 B
// C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA
(73)特許権者 596054478
Temple Court,11 Que
en Victoria Stree
t,London,EC4N 4TP,
United Kingdom
(72)発明者 マーティン パトリック クレイニッジ
イギリス国,シービー2 2アールビ
ー,ケンブリッジ バブラハム ロード
15
(72)発明者 バークレー ジョージ バーレル
イギリス国,ケンブリッジ,スタンスゲ
イト アベニュ 16
(56)参考文献 特開 昭61−22100(JP,A)
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C07K 14/045
C12N 15/00 - 15/90
BIOSIS(DIALOG)
GenBank/EMBL/DDBJ
WPI(DIALOG)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 1.免疫学的にヒトサイトメガロウイルス(HCMV)
中和抗体と反応する抗原決定基を含有する、HCMV糖
タンパク質B(gB)または糖タンパク質H(gH)ポ
リペプチドのC末端切形断片であって、該HCMV g
BまたはgHポリペプチドは以下のアミノ酸配列(i)
または(ii)からなり、そして該HCMV gBまたは
gHポリペプチドはHCMV中和抗体を誘発し得る: (i)HCMV gBポリペプチド 【化1】【化2】【化3】 もしくは HCMV gHポリペプチド 【化4】【化5】【化6】 ;または (ii)該アミノ酸配列(i)において1またはそれ以上
のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有する
アミノ酸配列。 2.請求項1に記載の切形断片であって、C末端膜アン
カー配列の全てまたは一部を欠損している、切形断片。 3.以下の工程を包含する、生物学的被検物においてH
CMV抗原に対する抗体を検出するための免疫学的アッ
セイ法であって: (a)抗体−抗原複合体を生成する条件下で、プローブ
ポリペプチドとともに生物学的サンプルをインキュベー
トする工程;および (b)該プローブポリペプチドを含有する抗体−抗原複
合体を検出する工程を包含し、ここで、該プローブポリ
ペプチドは、免疫学的にHCMV中和抗体と反応する抗
原決定基を含有する、HCMV gBまたはgHポリペ
プチドのC末端切形断片からなり、該HCMV gBま
たはgHポリペプチドは、以下のアミノ酸配列(i)ま
たは(ii)からなり、そして該HCMV gBまたはg
HポリペプチドはHCMV中和抗体を誘発し得る: (i)HCMV gBポリペプチド 【化7】【化8】【化9】 もしくは HCMV gHポリペプチド 【化10】【化11】【化12】 ;または (ii)該アミノ酸配列(i)において1またはそれ以上
のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有する
アミノ酸配列。 4.前記切形断片がC末端膜アンカー配列の全てまたは
一部を欠損している、請求項3に記載の免疫学的アッセ
イ法。 5. ヒトサイトメガロウイルス感染に対するワクチン
であって、該ワクチンは、薬学的に受容され得る賦形剤
中に、免疫学的にHCMV中和抗体と反応する抗原決定
基を含有する、HCMV gBまたはgHポリペプチド
のC末端切形断片を含み、該切形断片は、罹病性の個体
に投与されるとヒトサイトメガロウイルスに対するウイ
ルス中和活性が引き出されるに有効な量で存在し、該H
CMV gBまたはgHポリペプチドは以下のアミノ酸
配列(i)または(ii)からなり、そして該HCMV
gBまたはgHポリペプチドはHCMV中和抗体を誘発
し得る: (i)HCMV gBポリペプチド 【化13】【化14】【化15】 もしくは HCMV gHポリペプチド 【化16】【化17】【化18】 ;または (ii)該アミノ酸配列(i)において1またはそれ以上
のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有する
アミノ酸配列。6.前記切形断片がC末端膜アンカー配列の全てまたは
一部を欠損している、請求項5に記載のワクチン。 7. ワクチン組成物を作製する方法であって、免疫学
的にHCMV中和抗体と反応する抗原決定基を含有す
る、HCMV gBまたはgHポリペプチドのC末端切
形断片を薬学的に受容され得る賦形剤と混合する工程を
包含する、方法、ここで、該HCMV gBまたはgH
ポリペプチドは以下のアミノ酸配列(i)または(ii)
からなり、そして該HCMV gBまたはgHポリペプ
チドはHCMV中和抗体を誘発し得る: (i)HCMV gBポリペプチド 【化19】【化20】【化21】 もしくは HCMV gHポリペプチド 【化22】【化23】【化24】 ;または (ii)該アミノ酸配列(i)において1またはそれ以上
のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失を有する
アミノ酸配列。8.前記切形断片がC末端膜アンカー配列の全てまたは
一部を欠損している、請求項7に記載の方法。
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GB8629988 | 1986-12-16 | ||
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