JP2999966B2 - ＨＳＶｇＢをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
ＨＳＶｇＢをコードするポリヌクレオチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】ヘルペスウイルスには、１型
（HSV-1）および２型（HSV-2）と名付けられた２つの密
接に関連する変異体を含む単純ヘルペスウイルスが包含
される。これらの型のウイルスは、強い交差反応を示す
が、中和滴定により区別することができる。HSV-1およ
びHSV-2は様々なヒトの疾患（例えば、皮膚感染、陰部
ヘルペス、ウイルス性脳炎など）の原因となっている。 【０００２】単純ヘルペスウイルスは２本鎖DNAウイル
スであって、膜内に被包された二十面体の核キャプシド
内に約150〜160kbpのゲノムを有する。この膜には、数
多くのウイルス特異的な糖タンパクが含まれ、それらの
うち最も多いのは、gB、gC、gD、およびgEである。ここ
で、gBおよびgDは、１型と２型との間で交差反応を示
す。 【０００３】HSV-1およびHSV-2の両方に対するヒトヘの
安全で効果的なワクチンを提供すること、および感染が
生じた場合は、その疾患の治療法を提供することは、医
学的にも科学的にも非常に興味ある問題である。 【０００４】ある有望な試みは、単離された糖タンパク
を予防に用いることであった。この糖タンパクは、マウ
スに注射し、次いで生きたウイルスを感染させた場合
に、防御性を与えることが示されていた。しかし、単純
ヘルペス糖タンパクの利用は、これまで、主にウイルス
の培養と膜タンパクの単離とに依存してきた。糖タンパ
クの商業的生産においては、危険な病原体の取り扱い、
培養細胞中におけるウイルスの維持、ウイルスゲノムま
たはその一部を含まない糖タンパクの単離などに関する
問題が、糖タンパクをワクチンとして用いることを妨げ
てきた。従って、ウイルスを培養し、そして膜タンパク
を分離すること以外の方法により生産された糖タンパク
を用いたワクチンを提供することが望ましい。 【０００５】ヘルペスの感染を治療的に処置するための
方法、すなわち個体がウイルスに感染した後で、その疾
患を軽減したり、その疾患の再発を防止する処置法を開
発することもまた非常に興味が持たれる。ウイルスの感
染は、通常、抗生物質による治療に対しては抵抗性を示
すので、著しい副作用を持たない他の方法に非常に興味
が持たれている。再発性ヘルペス疾患の治療には、いく
つかの薬剤（特に、アシクロビール(Acyclovir)）が有
効であったが、再発を防止するために長期間にわたって
連続投与を行う必要性があるので望ましくなく、治療の
過程で薬剤抵抗性の変異体が生じる。 【０００６】 【従来の技術】EberleおよびMou（J. of Infectious Di
seases (1983) 148：436-444）は、ヒト血清中における
HSV-1に特有のポリペプチド抗原に対する抗体の相対的
な力価を報告している。Marsdenら（J. of Virology (1
978) 28：624-642）は、HSV-1とHSV-2との間におけるタ
イプ内の組み換えにより、117キロダルトン(kd)の糖タ
ンパクに対応する遺伝子がHSVの遺伝子地図上の0.35〜
0.40地図単位内に位置することを報告している。Ruyech
anら（同上 (1979) 29：677-679）は、糖タンパクＢ遺
伝子の位置が、0.30〜0.42地図単位の間にあることを報
告している。SkareおよびSummers Virology (1977) 7
6：581〜595）は、HSV-1 DNA上のEcoRＩ、XbaＩ、HindI
IIのエンドヌクレアーゼ切断部位を報告している。Roiz
man（Ann. Rev. Genetics (1979) 13：25〜57）は、HSV
ゲノムの構成を報告している。DeLuccaら（Virology (1
982) 122：411）は、0.345〜0.368地図単位の間のgB１
構造遺伝子内に変異があると考えられるいくつかの表現
型変異体の位置を決定している。 【０００７】HSV-1またはHSV-2に感染したニワトリ胚細
胞から抽出されたサブユニットワクチンが、米国特許第
4,317,811号および第4,374,127号に述べられている。ま
た、Hilfenhausら（Develop. Biol. Standard (1982) 5
2：321-331）により、特定のHSV-1種（BW3）からのサブ
ユニットワクチンの調製が述べられているのを参照され
たい。Roizmanら（同上 (1982) 52：287-304）は、免疫
感作したマウスにおいて効力を有することが示されてい
る非感染性のHSV-1×HSV-2組換え体および欠失変異体の
調製について述べている。Watsonら（Science (1982) 2
18：381-384）は、カエル卵母細胞の核への注入による
クローン化断片の発現だけでなく、HSV-1 gD遺伝子のク
ローニングおよびエセリヒア・コリー（E.coli）内にお
ける該遺伝子の低レベル発現について述べている。彼ら
はまた、gD遺伝子の塩基配列も示している。Weisら（Na
ture (1983) 302：72-74）は、エセリヒア・コリー内に
おけるgDの高レベル発現について報告している。このポ
リペプチドは、ウサギにおいて中和抗体を誘導する。Be
rmanら（Science (1983) 222：524-527）は、哺乳動物
培養細胞中における糖タンパクＤの発現について報告し
ている。Laskyら（Biotechnology (1984年6月) 527-53
2）は、この糖タンパクＤをマウスの免疫化に用いるこ
とを報告している。Cohenら（J. Virol (1984) 49：102
-108）は、成熟タンパクの８〜23残基内に含まれる、gD
の特定の抗原決定基の位置および化学合成について報告
している。 【０００８】HSVを感染させた細胞からの膜タンパク調
製物を、ヒトの感染後ワクチンとして、「治療」に用い
ることについては、Dundarov,S.ら（Dov. Biol. Standa
rd (1987) 57：351-357）およびSkinner, G.R.B.ら（同
上 (1982) 52：333-34）により報告されている。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】単純ヘルペスウイルス
１型および２型に対する治療に用いるワクチンおよび組
成物、ならびにそれらの生産方法が提供される。これら
の治療法は、組換えDNA技術により生産されるウイルス
特異的ポリペプチドの組み合わせを用いている。特に、
HSV gBおよびgDは、改変された哺乳動物宿主で生産さ
れ、そして組み合わせて用いられた。これらのポリペプ
チドは、ヒトを含む動物における単純ヘルペスウイルス
感染の治療に用いられうる。 【００１０】従って、本発明のある局面は単純ヘルペス
ウイルス（HSV）感染の治療的処置に用いられるワクチ
ンである。該ワクチンは、 ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＢ
（gB）ポリペプチド；および； ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ
（gD）ポリペプチドを含有する。 【００１１】ここで、該ポリペプチドは哺乳動物細胞中
において組換えDNA構築物を発現させて調製されたもの
であり、該ポリペプチドは、このワクチンが、HSVに一
次感染した後の個体に投与される場合には、HSVに感染
した該個体においてHSVにより誘導される疾患の再発を
防止するのに効果的な量で存在する。 【００１２】本発明の他の局面は、単純ヘルペスウイル
ス（HSV）感染の治療に用いられるワクチンである。該
ワクチンは、 ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＢ
（gB）ポリペプチド；または ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ
（gD）ポリペプチドを含有する。 【００１３】ここで、該ポリペプチドは、哺乳動物細胞
中において組換えDNA構築物を発現させて得られたもの
であり、該ポリペプチドは、このワクチンが、HSVに一
次感染した後の個体に投与される場合には、HSVに感染
した該個体においてHSVにより誘導される疾患の再発を
防止するのに効果的な量で存在する。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本願発明によれば、単純
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１型（ｇＢ
１）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオチド酸配
列を有する単離したヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドが提供される。 【００１５】本願発明によれば、単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２型（ｇＢ２）をコードす
る、図４〜７に記載のヌクレオチド酸配列を有する単離
したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供
される。 【００１６】本願発明によれば、図４〜７に記載のアミ
ノ酸配列、またはこのアミノ酸配列の免疫学的等価物を
有する単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ
（ｇＢ）およびその前駆体、あるいはそれらの類似体を
コードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
が提供される。 【００１７】好ましい実施態様においては、前記免疫学
的等価物のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と５％よ
り少ない数で異なる。 【００１８】好ましい実施態様においては、前記ヌクレ
オチド配列は、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 396
50より入手可能）中のヌクレオチド配列、または、それ
らとコドンの縮重のみで異なるヌクレオチド配列から選
択される。 【００１９】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも１５個のアミノ
酸をコードする。 【００２０】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも３０個のアミノ
酸をコードする。 【００２１】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド酸配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２２】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２
型（ｇＢ２）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２３】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物が提供される： (a) 図４〜７に記載のアミノ酸配列、またはこのアミノ
酸配列の免疫学的等価物を有する単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）およびその前駆体、
あるいはそれらの類似体をコードするヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチド (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２４】好ましい実施態様においては、前記免疫学
的等価物のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と５％よ
り少ない数で異なる。 【００２５】好ましい実施態様においては、前記ヌクレ
オチド配列は、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 396
50より入手可能）中のヌクレオチド配列、または、それ
らとコドンの縮重のみで異なる。 【００２６】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも１５個のアミノ
酸をコードする。 【００２７】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも３０個のアミノ
酸をコードする。 【００２８】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主
細胞が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド酸配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２９】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主
細胞が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２
型（ｇＢ２）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００３０】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主
細胞が提供される： (a) 図４〜７に記載のアミノ酸配列、またはこのアミノ
酸配列の免疫学的等価物を有する単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）およびその前駆体、
あるいはそれらの類似体をコードするヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチド (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００３１】好ましい実施態様においては、前記免疫学
的等価物のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と５％よ
り少ない数で異なる。 【００３２】好ましい実施態様においては、前記ヌクレ
オチド配列は、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 396
50より入手可能）中のヌクレオチド配列、または、それ
らとコドンの縮重のみで異なる。 【００３３】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも１５個のアミノ
酸をコードする。 【００３４】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも３０個のアミノ
酸をコードする。 【００３５】本願発明によれば、単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２型（ｇＢ２）、単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ１型（ｇＤ１）、
および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ
２型（ｇＤ２）からなる群より選択される少なくとも１
つ、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパ
ク質Ｂ１型（ｇＢ１）のポリペプチド、その免疫学的に
等価な断片、またはそれらの混合物をコードする、融合
タンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供され
る。 【００３６】 【発明の実施の形態】ワクチン 本発明のワクチンは、１型および２型の両方の組換えHS
V糖タンパクＢおよびＤを用いている。成熟（全長）gB
およびgDタンパクは、これら成熟タンパクと免疫学的に
等価な（すなわち、感染に対して防御性を与える）断
片、前駆体、および類似体と同様に用いられる。請求の
範囲で用いているように、「糖タンパクＢポリペプチ
ド」および「糖タンパクＤポリペプチド」という用語
は、このような断片、前駆体、および類似体を含むこと
が意図される。組換えgBおよびgDポリペプチドは、真核
細胞、好ましくは酵母または哺乳動物細胞、最も好まし
くは哺乳動物細胞において生産される。断片の長さは、
少なくとも約15アミノ酸、好ましくは少なくとも約30ア
ミノ酸である。ワクチンは、１型ポリペプチドの混合
物、２型ポリペプチドの混合物、または１型および２型
ポリペプチド両方の混合物、あるいは個々のポリペプチ
ドのいずれをも含有し得る。 【００３７】gBおよびgDポリペプチド混合物は、単独で
も用いられるが、通常は、生理学的および薬理学的に受
容される媒体、一般的には水、生理食塩水、リン酸緩衝
液、糖などと共に用いられる。さらに、該ポリペプチド
混合物は、生理学的に受容されるアジュバント（例え
ば、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド誘導体な
ど）と共に用いられ得る。実施例6.3で示されるよう
に、様々なアジュバントが有効である。アジュバントの
選択は、少なくとも部分的には、アジュバントを含んだ
ワクチンの安定性、投与経路、ワクチン接種される個体
種に対するアジュバントの効能、そしてヒトの場合に
は、このアジュバントが食品医薬品局（FDA）によって
ヒトヘの使用が認可されているかいないかといったこと
に依存する。ワクチンは、リポソームにより運搬される
か、および／またはインターロイキン１および２のよう
な免疫調節剤と共に運搬される。ワクチンは都合のよい
非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、
筋肉内、または腹腔内）により投与されうる。同一また
は異なった経路で投与されるワクチンを分割して投与す
ることは有利である。ワクチンは、単純へルペスウイル
スに一次感染した後に投与される。 【００３８】感染後投与の効能は、実施例6.1に示され
ている。ウイルス感染後の宿主における免疫応答の増大
に及ぼすワクチンの効果は、実施例6.2に示されてい
る。単純ヘルペスウイルスのウイルス表面糖タンパク
は、抗体が介在するウイルスの中和化と、抗体依存性細
胞障害（ADCC）とによって認識される抗原であることが
示されている。Norrild B.ら、Infect. Immun. (1980)
28：38-44。頻繁にHSV感染を再発する患者は、しばしば
中和抗体およびADCCの両方を高いレベルで有する。Core
y, L.およびSpear, P.G., Eng. N., J. Med. 314：686-
691, 1986。このような患者にとって、HSV特異的抗体の
有力な誘導物質が、ウイルス糖タンパクであることが示
された。Eberle, R., Mou, S.W., およびZaia, J.A.,
J. Gen Virol. 65：1839-1843、1984。従って、２つの
ウイルス糖タンパクだけから構成され、他のウイルス抗
原を含まない組換えサブユニットワクチンを、再発性陰
部ヘルペスの治療へ臨床的に利用することは期待されな
かった。 【００３９】糖タンパクＢおよびＤは改変することなく
用いられる。しかし、より小さな関連ポリペプチド（例
えば、断片など）を用いる場合、および分子量が約5,00
0ダルトンより小さい（例えば、1,500〜5,000ダルト
ン）場合には、所望の免疫応答を誘導するために改変が
必要とされる。より小さなハプテンは、適切な免疫原キ
ャリアー（例えば、破傷風トキソイドなど）に結合させ
なければならない。 【００４０】gBまたはgDポリペプチドをコードする短い
DNA断片を、他の病原性生物やウイルスからのタンパク
を発現する遺伝子に連結することもできる。このように
して、得られた融合タンパクは１種類より多くの病気に
対して免疫性を与え得る。 【００４１】１回の投与量あたりに用いられる組換えgB
およびgDポリペプチドの総量は、通常、宿主の体重１kg
あたり、約0.1μg〜２mg、より一般的には約0.5μg〜１
mg、そして特に約0.5μg〜10μgである。ワクチン中のg
Dに対するgBの割合は、通常、約0.1：１〜10：1、より
一般的には約0.5：１〜10：１、そして好ましくは約0.
5：１〜５：１である。１回の投与は、日単位から週単
位の間隔で繰り返して行われ、通常は２週間から４週間
の間隔で、通常は約２回から10回を越えずに行われる。
しかし、実施例6.4に示されるように、ウイルスに一次
感染した後の投与時間が、疾患の再発率に影響を及ぼ
す。従って、治療される種および／または個体に依存し
て、最も効果的な投与時間を決定する必要がある。最も
効果的な時間は、例えば疾患の状態をモニターする疾患
症候学または抗体価を用いる基本的な検査により決定し
得る。さらに、疾患の急性期、すなわち個体がHSVによ
り誘導される病変を体に示す場合に、ワクチン投与が疾
患の再発を著しく低減させることは、実施例6.4のデー
タに示されている。 【００４２】組換え糖タンパクＢ 組換えgBポリペプチドの調製は、1985年10月24日に公開
された国際公開No.WO85/04587の国際出願No.PCT/US85/0
0587に詳述されている。組換えgBポリペプチドを生産す
るのに用いる材料および方法については、以下で簡単に
記述する。 【００４３】実施例における図４〜図７は、gB１パット
ン株のヌクレオチド配列と、そのヌクレオチド配列によ
りコードされるアミノ酸配列とを表す。図４〜図７に
は、gB１とgB２との間の実質的な相同性も示されてい
る。ヌクレオチド配列には多くの変化があり得る。独立
した機能を有する種々の断片が用いられ得る。これら断
片は成熟gB以外のタンパクに結合し得る。さらに、種々
のコドンは、同じアミノ酸をコードするように改変され
得るが、宿主の性質に従ってより効果的な発現を示す。
例えば、これらコドンは、１種またはそれ以上のタンパ
ク、あるいはタンパク群における特定コドンの出現頻度
に従って改変され得る。これらタンパクは、例えば解糖
系タンパクであって、特定の宿主（例えば、酵母）の全
タンパクにおいて高い比率を占める。ある場合には、１
個またはそれ以上のコドンは、あるアミノ酸を別のアミ
ノ酸で置き換えることにより、異なるアミノ酸をコード
するように改変し得る。この場合、変化の影響はタンパ
クの免疫原性や興味ある他の生物学的因子に有害ではな
い。ある場合には、Ｎ末端またはＣ末端にアミノ酸を付
加することが望ましい。このようなアミノ酸の付加は好
ましい結果をもたらす。このことは、成熟gB１またはそ
の前駆体をコードする配列の5'末端または3'末端にコド
ンを付加することにより、容易に達成し得る。さらにgB
２のアミノ酸配列はgB１のアミノ酸配列と20％だけ数が
異なっているが、HSV-1またはHSV-2の他の株は、それぞ
れgB１パットン株またはgB２ 333株と同一または類似の
gB糖タンパクを持っている。これらgB糖タンパクは、通
常は５％より少ない数だけ、より一般的には２％より少
ない数だけ、そして多くの場合は、0.5％より少ない数
だけのアミノ酸が、gB１パットン株またはgB２ 333株の
アミノ酸配列と異なっている。 【００４４】gB１の配列、特にgB１パットン株は、タン
パクのＮ末端から始まる４つのドメインに分けられる：
１番目のアミノ酸から約30番目のアミノ酸にまで広がる
第１の疎水性領域、第１の疎水性領域から約726番目の
アミノ酸にまで広がり、極性が変化し得る領域；極性が
変化し得る該領域から約795番目のアミノ酸にまで広が
る第２の疎水性領域；そして904番目のアミノ酸のＣ末
端にまで広がり、極性が変化し得る第２の領域である。 【００４５】gBは膜の糖タンパクであるから、他の糖タ
ンパクから類推すると、第１の疎水性領域は分泌および
／または膜の配置を支配するシグナルリーダー配列であ
ると考えられる。従って、極性が変化し得る第１の配列
は、膜の外側にあり、gBが別のタンパクに対する受容体
として、あるいはワクチン中の免疫原として作用する程
度まで、認識配列として役立つ。第２の疎水性配列は、
トランスメンブレン・インテクグレイター配列(transme
mbrane integrator sequence)（しばしば、「アンカー
(anchor)」と呼ばれる）としての役目を果たし得る。極
性が変化し得る第２のアミノ酸配列は、細胞質内に存在
すると考えられ、受容体がトランスメンブレン・インテ
クグレイター配列の外部にあるという程度まで、１つま
たはそれ以上の細胞質プロセスを変更する役目を果たし
得る。 【００４６】gBの前駆体またはその機能的な断片をコー
ドしているポリヌクレオチド配列は、適当な発現ベクタ
ーに該ポリヌクレオチド配列を挿入し、得られた発現構
築産物を適合する宿主に導入することにより、クローン
化され、そして発現され得る。コードしている断片は、
約0.1地図単位未満、通常は約0.05地図単位未満であ
る；ここで、1.0地図単位とはHSVゲノム全体の大きさで
ある。発現ベクターは、染色体外に存在するか、あるい
は宿主細胞のゲノム内に組み込まれた、低レベルまたは
高レベルのマルチコピーベクターであり得る。そして、
発現ベクターは、興味のあるポリペプチドを分泌または
排泄させるか、あるいは興味のあるポリペプチドを細胞
質内または膜内に保持させる。非常に数多くの発現ベク
ターが文献に発表されており、一般に、真核宿主で用い
るのに有用である。真核宿主には、酵母（例えば、サッ
カロマイセス・セルビシア(S. cerevisiae)）および広
範囲の永久増殖性哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、
サル細胞、ハムスター細胞（例えば、3T3、ベロ(Ver
o)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、または初
代細胞系）が含まれる。分泌が必要とされる場合には、
宿主に依存して、天然または非天然のいずれかの分泌リ
ーダー配列を用いることができる。分泌リーダー配列を
切断するプロセッシングシグナルは、天然のシグナル、
または非天然の分泌リーダー配列に関連するシグナル、
あるいはこの両方がタンデムになったものであり得る。 【００４７】gB１パットンをコードするポリヌクレオチ
ド配列を得るために、EcoRＩ制限酵素断片Ｆ上に、gB１
コード配列の位置を地図に示した。Ｆ断片の３つの副断
片が、単離され、pBR322中にサブクローン化された（図
２）。次いで、これらサブクローンのDNA断片は、HSV-1
が感染した細胞から単離したポリA+ mRNAのノーザンブ
ロットに対するプローブとして用いられた。gBに対して
予測された大きさのmRNAにハイブリダイズした断片は、
gBコード領域内に存在すると推定された。gBの転写方向
もまた、DNAプローブのどの鎖がmRNAとハイブリダイズ
したかを決定することにより明らかにされた。gB配列の
同一性を確認するために、DNA断片をハイブリッド−セ
レクトHSV-1 mRNAに対して用いた。このmRNAは、次いで
インビトロで翻訳され、得られたタンパクはgB特異的抗
体を用いてgBに関して分析された。 【００４８】gB１をコードする断片は、今日では、制限
酵素地図作成や塩基配列の決定を含む様々な方法で取り
扱われ、制限酵素切断部位や発現のためのオープンリー
ディングフレーム領域が確証される。次いで、DNA配列
は、完全なgB前駆体またはその断片をコードしている配
列を与えることに限定される。次いで、これら配列は、
適当な位置にある転写シグナルおよび適当な翻訳シグナ
ルを有する適当な発現ベクターに挿入される。これは、
突出部分を充填し、そしてアダプターなどを用いて平滑
末端結合を行うことにより達成し得る。 【００４９】増幅能力を有する遺伝子に対して遺伝子を
タンデムに導入することは特に興味深いことである。有
用な遺伝子には、メトトレキセートを用いることにより
増幅し得るジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）遺伝子
（ここで、dhfr遺伝子および隣接領域は反復してい
る）；および重金属（例えば、銅）などで増幅し得るメ
タロチオネインが含まれる。発現構築産物は、形質転
換、トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱など
を含むいかなる有用な手段によっても、適当な宿主に導
入することができる。次いで、宿主細胞は、特定の遺伝
子を増幅することを選択するレベルに、適当な生物毒に
よりストレスがかけられる。次いで、これら細胞は培養
され、所望のポリペプチドを有効に生産するまで増殖さ
れる。 【００５０】上述の手順に従って、HSV-2 333株由来のg
B２をコードしているポリヌクレオチド配列は、前駆体
および成熟体の両方が単離され、クローン化され、そし
て構築物を与えるために操作される。その結果、１種ま
たはそれ以上の宿主で発現し得る。gB１パットンをコー
ドする断片の有用性を考慮すると、これら断片は、特異
的HSV-2制限断片クローンヘのDNA部分をコードするgB２
の位置付け、または感染した宿主細胞由来のgB２ mRNA
の単離のいずれのプローブとしても用いられる。便宜的
には、gB１遺伝子の異なる領域をコードする複数のプロ
ーブが用いられる。このプローブにハイブリダイズする
のにおおよそ適当な大きさを有する陽性DNA断片または
豊富なmRNAのいずれもが選択される。次いで、mRNAは逆
転写されてcDNAを与えるか、および／またはHSV-2ゲノ
ムの断片とのハイブリダイゼーションに用いて、gB２を
コードしているその機能を確認することができる。必要
に応じて、gB２構造遺伝子の一部を含む１個より多くの
クローン化された断片は、適当に、全コード領域および
隣接領域を与えるために操作され、そして結合され得
る。次いで、このコード領域は発現ベクター中に導入さ
れる。 【００５１】組換え糖タンパクＤ 組換えgD１の調製は、1985年10月24日に公開された国際
公開No.WO85/04587の国際出願No.PCT/US85/00587に詳述
されている。組換えgDポリペプチドを生産するのに用い
られる材料および方法については、以下で簡単に述べ
る。組換えgD２の調製に関する詳しい記述は以下の実施
例に与えられている。 【００５２】天然に存在する糖タンパクＤと免疫学的に
交差反応を行うポリペプチドは、例えば酵母や哺乳類細
胞（例えば、CHO細胞）の真核宿主において、組換えDNA
の方法論により生産される。真核生物での生産は、真核
宿主に関連して、例えば翻訳後修飾および／または分泌
などの利点を与える。gDポリペプチドは、少なくとも約
９個のアミノ酸をコードする比較的短い合成DNA断片か
ら生産され、gDに特異的な免疫応答を誘導するのに有効
なハプテンを与える。 【００５３】gD DNA断片は、天然起源または合成起源の
ものであり得る。HSV-1の天然のgD遺伝子は、ウイルス
ゲノム上において、短い内部繰り返し（IRs）配列と、
その3'末端にある短い終結繰り返し（TRs）配列との間
に位置する。成熟タンパクをコードしているということ
は、約1.6kbpの断片がゲノムの2.9kbp SacＩ制限酵素断
片上に位置しているのを見い出せることである。成熟タ
ンパクの全コード領域は、2.9kbp SacＩ断片のうちのHi
ndIII−NruＩ断片中に位置している。天然に存在するgD
遺伝子は、修飾を受ける場合もあれば、受けない場合も
ある。遺伝子の領域は、望み通りに欠失させるか、およ
び／または他のDNA断片と結合させ得る。gD DNA断片
は、gB DNAの発現について上述したものと同様の材料お
よび手順を用いて、発現ベクターに挿入され、そして発
現され得る。天然に存在するgD遺伝子の特定断片の調
製、クローニング、および発現については、以下の実施
例において詳述する。 【００５４】以下の実施例は、例示を目的として与えら
れたものであり、限定するものではない。以下の実施例
において、第１節では組換えタンパクを生産するのに用
いられる一般的な手順について、第２節では組換えgB１
の調製について；第３節では組換えgB２の調製につい
て；第４節では組換えgD１の調製について；第５節では
組換えgD２の調製について；第６節ではgBおよびgDのポ
リペプチド混合物を用いたワクチンの研究について述べ
る。 【００５５】 【実施例】 １．材料および方法 HSV-1パットン株およびHSV-2 333株の生きた保存株は、
Dr.Richard Hyman（Hershey Medical Center, Hershey,
Pennsylvania）より入手した。これらのウイルスは、D
r.Evelyn Linnette（Viro Labs, Emeryville, Californ
ia）またはAmerican Type Tissue Culture Laboratory
より入手したベロ細胞中で増殖させ得る。この増殖は標
準的な手順に従って行われる。プラスミドpACYC184（Ch
angおよびCohen, J. Bacteriology (1978) 134：1141）
のEcoRＩ部位にクローン化されたHSV-1パットンEcoRＩ
DNA断片（Kudlerら、Virology (1983) 124：86-99）の
ライブラリーは、Dr.Hymanより得るか、あるいは簡便法
で独自に調製し得る。２つのHSV-2 333クローン、すな
わちpBR322（Sutcliffe, Nucleic Acids Research(197
8) 5：2731）のHindIII部位に挿入されたHindIII断片Ｈ
およびＬもまた、Dr.Hymanより得ることができる。 【００５６】dhfr欠損CHO細胞系は、Dr.Y.W.Kan (Unive
rsity of California, San Francisco）より得た。この
細胞系はもともと、UrlaubおよびChasin（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1980) 77：4216-4220）により記述さ
れている。非選択条件下で、これらの細胞は、10％牛胎
児血清、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイ
シン、そして150μg/ml L-プロリンを追加したハムのF-
12培地（Gibcoより入手、cat. no.176）で増殖させた。
選択培地は、10％の透析された牛胎児血清と、ペニシリ
ン、ストレプトマイシン、および150μg/ml L-プロリン
とを追加したDEMであった。メトトレキセート（MTX）選
択のために、濃縮MTX保存培地は、Lederleより得たMTX
から調製し、使用直前に上記のDME選択培地に加えた。 【００５７】1.1 クローニング すべてのDNA操作は、標準的な手順に従って行われた。M
aniatisら、MolecularCloning, CSH（1982）を参照され
たい。制限酵素、T4 DNAリガーゼ、エセリヒア・コリー
DNAポリメラーゼＩクレノー断片、そして他の生物学的
試薬は、Bethesda Research Laboratories、あるいは他
の表示した市販品供給業者から購入し、製造業者の指示
書に従って使用した。２本鎖DNAは１％アガロースゲル
上で分離し、電気溶出により単離した。 【００５８】1.2 RNAの単離，ノーザンブロット解析，
およびハイブリッド選択翻訳法 全RNAは、細胞あたり10個のウイルスという多重度でHSV
-1またはHSV-2に感染して６時間後のベロ細胞より調製
した。細胞単分子層を洗浄し、抽出緩衝液でインキュベ
ートし、そしてPachlら（Cell (1983) 33：335-344）に
よって述べられているように処理した。ポリA+ RNAは、
500mM NaCl, 10mM Tris HCl（pH7.5）、１mM EDTA、0.1
％ SDS中に入ったオリゴdTセルロース（Collaborative
Researchより得た）の３mlカラムに、２mgの全RNAを通
し、次いで100mM NaCl, 10mM TrisHCl (pH7.5)、１mM E
DTA、0.1％ SDSでカラムを洗浄し、そして10mM Tris HC
l(pH7.5)、１mM EDTA、0.1％ SDSでポリA+分画を溶出さ
せることにより調製した。 【００５９】ノーザンブロット解析を行うために、ポリ
A+ RNAを、グリオキサール（McMasterら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1977) 74：4835-4838）で変性させ、
１％アガロースゲルの電気泳動により分別し、ニトロセ
ルロースペーパー（Thomas,同上 (1980) 77：5201-520
5）に移し、そして32Ｐ標識プローブでハイブリダイズ
させた。 【００６０】ハイブリッド選択翻訳法に用いられる方法
の詳細は、以前に記述されている（Pachlら、Cell (198
3) 33：335-344）。DNAフィルターは、gBをコードする
3.5kbのXho-Kpn断片３μg、またはHSV-1 gDをコードす
る3.0kbのSstＩ−SstＩ断片２μgのいずれかを用いて調
製した。このフィルターを、HSV-1が感染した細胞由来
のポリA+ RNA 40μgと共にインキュベートした、結合RN
Aを溶出し、網状赤血球無細胞系（Pachlら、J. Virol.
(1983) 45：133-139）で翻訳させた。翻訳産物は、12.5
％ SDSポリアクリルアミドゲル（Laemmli, Nature (197
0) 227：689）で解析した。 【００６１】1.3 DNAトランスフェクション COS ７細胞（Gluzman, Cell (1981) 23：175-182）また
はdhfr欠損CHO細胞（UrlaubおよびChasin (1980) 前
出）の形質転換は、キャリアーDNAを省略したこと以外
は、van der EbおよびGraham（Methods in Enz. (1980)
65：826-839）の手順を、ParkerおよびStark（J. of V
irol. (1979) 31：306-369）により改変された手順を用
いて行った。プラスミドDNAのリン酸カルシウム沈澱
は、250mM CaCl2中のプラスミドDNAに、これと等容量の
２倍に濃縮したHEPES-緩衝化生理食塩水（２×HBS）を
１滴ずつ加えて混合することにより調製した（１×HBS
は、0.14MNaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、2.8mM グル
コース、10mM HEPES（pH7.0）である）。室温で約20分
間インキュベートした後、１mlのリン酸カルシウム-DNA
懸濁液（15μgのDNAを含む）を、10cmの平板上で集密度
が50％に達するまで増殖した細胞の培地へ加えた。６〜
８時間後、DNAを含んだ培地を取り除き、細胞を15％グ
リセロール−１×HBSと共に４分間インキュベートし
た。次いで、これら細胞を２日間非選択培地（F12）で
増殖させ、その後これら細胞を選択培地中に分割、すな
わち植え継いだ。10日後には、dhfr陽性の細胞コロニー
が現れ、14日後に、パスツールピペットで平板からコロ
ニーの細胞を移すことにより、これらコロニーを分離し
た。分離した細胞を増殖のためにマルチウェルの平板に
移した。 【００６２】1.4 細胞のインビボ標識および免疫沈澱 35 Ｓ−メチオニンで標識するために、細胞を3.5cmの平
板で集密的に増殖させ、PBS（0.14M NaCl 2.7mM KCl、1
5.3mM Na2HPO4）で１回洗浄し、次いでメチオニンを除
いた0.5mlの標識培地DEM（Gibcoから得たダルベッコの
修正イーグル培地、cat. no.188G）に、１％の透析され
た牛胎児血清と、400μCi/mlの35Ｓ−メチオニン（＞10
00μCi/mmol）を加えたものを、各平板に添加した。こ
れら細胞を37℃にて適当な時間インキュベートした。標
識期間の終わりには、培地を取り除き、単分子層をPBS
で１回洗浄した。「冷」メチオニンチェイス（“cold”
methionine chase）として、2.5mMのメチオニンを含むD
MEで標識培地を置き換えた。免疫沈澱を行うために、細
胞を、0.1mlの細胞溶液緩衝液（20mM Tris-HCl（pH
8）、100mM NaCl、１mM EDTA、0.5％ノニデットP40、0.
5％デオキシコール酸ナトリウム、牛血清アルブミン、
0.1％ SDS、1.0mMフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド、10mMベンズアミジン、１％アプロテニン、Sigma Ch
emical Companyより得た）中で溶解させた。細胞溶解物
を、チューブにかき集め、手早くボルテックスミキサー
にかけ、次いで４℃にて５〜10分間放置した。細胞破片
物は、遠心分離により取り除き、透明になった溶解物は
−70℃で貯蔵した。 【００６３】免疫沈澱を行うために、細胞溶解物0.1ml
は、普通血清と４℃で30分間インキュベートすることに
より予め清澄させ、次いでプロテインＡセファロース
（PAS）の20％溶液（溶解緩衝液中）50μlを加え、４℃
で30分間、静かに振盪しながらインキュベートし続け
た。PASは、14,000×gで１分間遠心分離することにより
取り除き、５μlのHSV-1ポリクローナル抗体（DAKOより
得た）またはgB特異的モノクローナル抗体F3AB（Univer
sity of South AlabamaのDr.John Oakesより得た）を加
えた。F3AB抗体を用いる場合は、溶解緩衝液から0.1％
SDSを省いた。４℃で30分間の後、75μlのPASを加え、
上述のようにインキュベートした。PAS-免疫複合体を遠
心分離により集め、BSAとプロテアーゼ阻害剤とを欠く
溶解緩衝液で３回洗浄し、0.12M Tris HCl（pH7.0）で
１回洗浄した。免疫沈澱したタンパクをSDSサンプル緩
衝液中で煮沸することによりPASから解離させ、次いで1
2％ポリアクリルアミドゲルで解析した。細胞培地から
標識タンパクを免疫沈澱させるために、培地をまず遠心
分離により清澄にし、次いで１/10容量の10倍溶解緩衝
液を加えると、タンパクが上述のように沈澱した。 【００６４】1.5 免疫螢光 COS細胞またはCHOクローンにおけるgBまたはgDの発現を
分析するために、スライドのウェル内で増殖した細胞を
PBSで３回洗浄し、100％メタノールを用いて−20℃にて
10分間固定し、続いてさらにPBSで３回洗浄し、５％ヤ
ギ血清（GS）を足したPBSで１回洗浄した。次いで、固
定された細胞を、１次抗体（PBS-５％GSで１/100に希釈
したHSV-1またはHSV-2ポリクローナル抗体）とともに37
℃にて30分間インキュベートした。次に、この細胞をPB
S-５％GSで３回洗浄し、２次抗体（PBS-５％GSで１/10
に希釈したFITC−結合ヤギ抗−ウサギIgG（カペル）と
ともに37℃にて30分間インキュベートした。PBS-５％GS
で４回洗浄した後、スライドを50％グリセロール−100m
M トリス（pH8.0）を用いてカバー片でマウントし、螢
光光学系を装備したライツ光学顕微鏡で観察した。生細
胞の免疫螢光は、細胞をPBS-５％GSでの最初の洗浄に引
き続き直ちに１次抗体とともにインキュベートしたこと
を除いては、上述のようにして行った。カバー片でマウ
ントする前に、生細胞を５％ホルムアルデヒドを含有す
るPBSで固定した。螢光染色した細胞は、コダックのエ
クタクロムフィルム（Kodac Ektachrome film；ASA40
0）を用いて写真を撮った。 【００６５】1.6 ELISA分析 CHO細胞を培養した培地中のgBタンパク濃度を、標準物
質として精製した組換えgB調製物を用いた間接酵素結合
免疫吸着分析法（ELISA）により測定した。PBSで１：10
00に希釈されたF3AB抗体50μlを、室温で１時間インキ
ュベートすることにより、96−ウェルの塩化ポリビニル
プレート（Dynatech Laboratories, Inc.）のウェルに
吸着させた。過剰な抗体をPBS-５％GSで３回洗浄するこ
とにより除去した。50μlの培地試料またはPBS-1％GSで
希釈したgBタンパク標準物質をウェルに添加し、室温に
て１時間インキュベートした。次いで、このプレートを
PBS＋１％GSで３回洗浄し、その後同じ緩衝液で１：100
0に希釈した50μlのウサギ抗HSV-1ポリクローナル抗体
（DAKOより入手）とともに３回目のインキュベーション
を１時間行った。過剰な２次抗体は、PBS＋１％GSで３
回洗浄することにより除去した。最後に、PBS-１％GSで
１：500に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤ
ギ抗ウサギ抗体（Boehringer Mannheim）の50μlを各ウ
ェルに添加し、１時間インキュベートした、次いで、ウ
ェルをPBS＋１％GSで１回洗浄し、続いてPBSで８回洗浄
した後、１mg/mlの濃度の2,2'−アジド−ジ〔3−エチル
ベンズ−チオアゾリンスルホネート〕（Boehringer Man
nheim）を0.1Mクエン酸（pH4.0）、0.003％ H2O2中に含
有する液50μlで呈色させた。この呈色反応を、５分後
に50μlの10％ SDSを添加することによって停止させ、
吸光度をマイクロタィタープレートリーダーで414nmに
て読み取った。 【００６６】gDタンパクの濃度は、標準物質として精製
した組換えgDおよびF3ABの代わりにgD−特異的モノクロ
ーナル抗体8D2（Rectorら、Infect. and Immun. (1982)
38：168-174）を使用したことを除いては、同様の方法
で測定した。 【００６７】２．糖タンパク 2.1 gB１遺伝子の分離，クローニングおよび特徴付け 糖タンパクgB１に対応する遺伝子を単離するために、HS
V-1パットン株（Patton；SkareおよびSummers, Virolog
y (1977) 76：581-595）のEcoRＩＦ制限断片の地図の座
標0.345-0.40に及ぶDNA断片を、プラスミドpBR322にサ
ブクローン化した。これらの断片は、プラスミドpACY18
4のEcoRＩ領域の適当な制限酵素消化物から調製され、T
AE緩衝液（0.04M トリス−酢酸、0.002M EDTA）を用い
た１％アガロースゲルでの電気泳動により分離され、電
気溶出された。単離された断片を、前もって適当な制限
酵素で切断し、アルカリホスファターゼで処理してある
pBR322に結合した。HSV-1の全ゲノムの制限酵素切断地
図を図１に示し、サブクローン化された領域のより詳細
な地図を図２に示す。図１を参照すると、従来の地図が
最初の２行で示されている（Roizman, 1979）。点線は
Ｌ−Ｓ連結部を示す。プロトタイプのアイソマーの配列
のEcoRＩ制限酵素切断地図を、ハッチングを施した枠で
囲むことにより示されるEcoRＩ断片Ｆとともに第３行に
示す（SkareおよびSummers, 1977；Roizman, 1979）。H
SV-2のHindIII制限酵素切断地図を、ハッチングを施し
た枠で囲んだHindIII断片Ｈとともに第４行に示す（Roi
zman,1979）。１地図単位は、HSV-1のDNAの98.9メガダ
ルトンまたは148.9kbpに相当し、HSV-2のDNAの105.6メ
ガダルトンまたは160.5kbpに相当する。 【００６８】図２を参照すると、詳細な地図ライン
（Ｉ）に示された制限酵素切断部位は次の通りである：
E, EcoRＩ; B, BamHＩ; S, SalＩ; P, PstＩ; X, XhoＩ
（DeLuccaらより, 1983）; N, NdeＩ; Xn, XmnＩ; V, E
coRV。0.355のDeLuccaらによってマッピングされたBstE
II部位は、この株では欠失しており、0.357に新しいPst
Ｉ部位が存在する。ラインIIは、gB１コード領域を含む
３つのプラスミドのサブクローンを示す。これらは、0.
345のBamHＩ部位から0.360のSalＩ部位までの範囲のpHS
106；0.36のSalＩ部位から0.388のSalＩ部位までの範囲
のpHS107；および0.345から0.40地図単位までの範囲のB
amHＩ断片である。ラインIIIはgB１のmRNAをマッピング
するために用いられる３つのプローブを示し；ラインIV
はハイブリッド選択のために用いられる断片を示し；そ
して、ラインＶはgB２遺伝子の位置を決定するために用
いられるこれらのプローブを示す（以下を参照）。これ
らの断片を作製するために用いた追加の制限酵素切断部
位は、Nc, NcoＩ; K, KpnＩ;およびA, AluＩである。 【００６９】EcoRＩ断片におけるgB１コード領域の位置
を決定するために、HSV-1が感染したベロ細胞から単離
したポリA+ mRNAのノザンブロッティングを、pHS106お
よびpHS107から単離された詳細な地図に示されたDNA断
片をプローブとして行った。pHS106から単離された0.5k
b PstＩ−SalＩ断片をHSV-1についてのプローブとして
用いたとき、検出された主な種類は３kbのmRNAであっ
た。PstＩ−SalＩ断片の約１kb上流に位置する0.49kb N
coＩ断片をプローブとして同様のブロッティングを行う
と、gB１のmRNAと推定される３kbのmRNAとのハイブリダ
イズも検出された。このことは、gB１をコードする配列
がPstＩ−SalＩ断片の少なくとも１kb上流まで延長され
ていることを示唆する。３kbのmRNAは、PstＩ−SalＩ断
片から下流の最初のXhoＩ部位よりは延長されていな
い。なぜならば、0.5kb XhoＩ−XhoＩ断片がこのmRNAと
ハイブリダイズしないからである。gB１転写単位の転写
の方向は右から左（3'←5'）であり、このことはPstＩ
−SalＩおよびNcoＩ−NcoＩ断片の5'−3'の方向の鎖の
みが３kb gB１ mRNAにハイブリダイズすることにより証
明される。 【００７０】ハイブリッド選択翻訳は、HSV-1ポリA+ mR
NAを3.2kb KpnＩ−XhoＩ断片（gB１コード領域として示
される領域を含む）とハイブリダイズさせることにより
行った。結合したmRNAを溶出し、インビトロで翻訳させ
たとき、HSV-1感染ベロ細胞由来のgB１と同様の大きさ
の100kdタンパクが検出された。この100kdタンパクの同
定の確認は、gB１−特異的モノクローナル抗体と免疫沈
降することより行われた。KpnＩ−XhoＩ断片を用いたハ
イブリッド選択により、その他のいくつかのタンパクも
検出されたが、おそらくこれはDNAのG＋C含有量が高い
ためにおこったmRNAの非特異的なハイブリダイズの結果
である。HSV-1糖タンパクgDをコードする3.0kbのSstＩ
−SstＩDNA断片を用いて同じRNAを選択すると、同様の
タンパクのパターンが観察されたが、100kdのgBタンパ
クは検出されなかった。この結果は、gBがKpnＩ−XhoＩ
断片に特異的であることを示唆する。 【００７１】図３は、0.345地図単位のBamHＩ制限酵素
切断部位から0.373地図単位のXhoＩ部位までの、3.95kb
DNA断片の制限酵素切断地図を示す。gB１オープンリー
ディングフレームは枠で囲んで示されており、転写の方
向は図示されているように右から左へである。実際のコ
ード領域は、地図単位0.348から0.367までである。BamH
Ｉ部位から3,640番目の唯一ではないAluＩ部位までのDN
A配列を示し、AluＩ部位は（Ａ）で示す。図示されてい
る制限酵素切断部位は、B, BamHＩ; B1, BalＩ; Bs, Bs
tEII; K, KpnＩ; Nc, NcoＩ; P, PstＩ; Pv, PvuII; S,
SalＩ; Sc, SacＩ; X, XhoＩ; Xm, Xma３を含む。右側
に示すAluＩ部位から末端のXhoＩ部位までの制限酵素切
断部位は示されていない。生産されたgB１タンパクのグ
リコシル化の可能性がある部位および疎水性アンカーお
よびシグナル領域（枠で囲い塗りつぶした部分）が示さ
れている。 【００７２】BamHＩ部位からヌクレオチド残基の3,640
番目の唯一ではないAluＩ部位までのDNA配列を、Sanger
のM13ジデオキシヌクレオチド合成法を用いて決定し
た。コード領域の両DNA鎖を配列決定した。完全なDNA配
列が、並べた制限酵素切断断片から集められ、このよう
にして該配列は診断片全部を通して読み取られる。図４
〜図７は、gB１のDNA配列を示し（第３行）；gB１に対
する予想アミノ酸配列は、DNA配列の下に示す（第４
行）。 【００７３】図４〜図７に示したgB１に対応するアミノ
酸配列およびDNA配列は、国際特許公開第WO85/04587号
（1985年10月24日公開）の表１に初めて示された配列と
は異なる、ということは注意すべきである。この表１の
中のDNA配列には誤りがあり、配列の607番目の位置にヌ
クレオチド（G）が付け加えられている。図４〜図７で
はこのヌクレオチドは削除されており、この図は正しい
DNA配列を示す。上記表１中のアミノ酸配列は、その中
に示されている誤ったDNA配列から推定されたものであ
り；上記付け加えられたヌクレオチドによりリーディン
グフレームが変わっているため、該表１に示された配列
は正しくない。図４〜図７は正しいDNA配列に基づいた
アミノ酸配列を示し；図４〜図７のアミノ酸配列は、gB
１のＮ−末端領域のアミノ酸配列決定により確認されて
いる。この推定アミノ酸配列における変化は、疎水性お
よび親水性の領域の推定された位置、およびgB１分子内
のグリコシル化部位に関する訂正も結果する。正しい配
列に基づいた推定アミノ酸配列を、該配列の下に示す。 【００７４】22bpのオリゴヌクレオチド（残基473-49
4）を用いたプライマー延長は、gB１のmRNAの5'末端が
残基188に位置することを示した。CATおよびTATA転写調
節シグナルは、残基55-62および125-131であると推定さ
れる。残基438-440のATGから開始し、TGA停止コドンで
終結する、2712個のヌクレオチドのオープンリーディン
グフレームが存在する。２つの推定されるポリアデニル
化シグナルが、残基3166-3173および3409-3416の3'側の
非コード領域に位置している。 【００７５】記述されたアミノ酸配列は膜タンパクの特
徴を示す。カルボキシ末端近くのアミノ酸残726から795
番目までの範囲の非常に疎水性の領域が存在し、69個の
アミノ酸は膜に結合し得る。Ｎ−末端における最初の30
個のアミノ酸は主に疎水性である。この疎水性アミノ酸
ドメインは、荷電したアミノ酸または親水性のアミノ酸
が高度に集中した領域の前にある。Ｎ−末端の親水性の
配列は分泌リーダーまたはシグナル配列として働き、該
配列の次に分泌リーダーの切断および除去のためのプロ
セッシングシグナルがある。Ｃ−末端近くの疎水性の領
域は、タンパクを細胞膜に結合するためのトランスメン
ブレン・インテグレーション配列として作用できる。 【００７６】配列のデータは親水性の外部ドメイン内の
asn-X-thr/ser配列（図３も参照のこと）により定義さ
れるような９個の可能性のあるＮ−結合型グリコシル化
部位が存在することも示唆する。もしも最初の30個のア
ミノ酸がプロセッシングにより除去され、可能性のある
各Ｎ−結合型グリコシル化部位が部位あたり平均２kdの
炭水化物を付加するのに利用されるならば、成熟タンパ
クの分子量は約123kdとなる。 【００７７】2.2 哺乳動物細胞におけるgB１の発現 哺乳動物細胞でgB１を発現させるために、dhfrを欠くCH
O細胞にプラスミドpHS112およびpHS114を導入して形質
転換させた。この形質転換は、材料および方法に記述し
たようなカルシウム沈澱法を用いて行った。プラスミド
pHS112およびpHS114で形質転換したE.coli HB101株は、
ATCCに寄託されており、それぞれ受託番号39650および3
9651で受託されている。これらの株の構築は、国際特許
公開第WO85/04587号（前出）に記載されている。形質転
換された細胞は、チミジン、プリンおよびグリシンを欠
いた選択培地を用いて選択した。細胞は、パスツールピ
ペットで取り出すことにより単離し、複数のウェルを持
つプレートで増殖させた。多数のクローンが単離され、
該クローンはHSV-1ポリクローナル抗体またはgBに特異
的なモノクローナル抗体を用いた免疫螢光および放射性
免疫沈降によりgBを生産することが示された。３個の細
胞クローンpHS112-1、pHS112-9およびpHS112-23が単離
され、該クローンは細胞内にある形の完全なgBタンパク
を合成した。これら細胞で生産されたgBは、グリコシル
化されていると考えられる。なぜならば、１時間パルス
標識し、続いて５時間チェイスした後に、チェイスを行
わなかった細胞に比べてより大きな分子量の形が検出さ
れ得、約10％のgBが培地中に分泌されたからである。不
完全なgBを発現する５個の細胞クローン（pHS114-5、pH
S114-6、pHS114-7、pHS114-11およびpHS114-12）も分析
され、やはり培地中にいくらかのgBを分泌することが示
された。これらの細胞系の１つであるpHS114-7は、MTX
でさらに増幅するために選択された。クローンは最初は
0.01、0.05、0.10および0.3μM MTXで選択された。免疫
螢光分析で検出すると高レベルのgBを合成する３個のク
ローンが、0.3μM MTXで選択されたものから単離され
た。放射性免疫沈降により、これらのクローンpHS114-
0.3μM-6、23および25は、35Ｓ−メチオニンで１時間標
識している間に、増幅しなかったクローンpHS114-7より
も２〜３倍多くのgBを合成する。パルスチェイス実験
は、１時間のパルスの間にこれらのクローンで合成され
るgBの少なくとも８％が、５時間で細胞外に分泌される
ことを示す。 【００７８】発現は、発現ベクターpHS137を用いても行
われた。このベクターの地図を図９に示す。プラスミド
pHS137は、シグナル配列の切断後の長さが690個のアミ
ノ酸である不完全なgB１タンパクをコードする。 【００７９】pHS137は、pHS108（2.1章で記述した）をX
hoＩおよびBamHＩで分解し、続いて、得られた3.5kd断
片を単離することにより構築した。この断片の末端はク
レノーで平滑末端とした。この平滑末端とされたXhoＩ
−BamHＩ断片をPVUIIで部分分解し、ゲルで2098bpのバ
ンドとして移動したDNAを該部分分解物から単離した。
単離されたXhoＩ−PVUIIバンドを、前もってSmaＩで分
解されているpSV7dに連結し、得られたDNAをE.coliを形
質転換するのに用いた。得られた細菌クローンを、gB１
インサートが適当な方向で挿入されているプラスミドに
ついてスクリーニングした。 【００８０】発現を得るために、pHS137をプラスミドpA
Ddhfrとともにdhfr欠損CHO細胞に導入して形質転換させ
た。得られたクローンはgB１を生産し、分泌した。この
ようなクローンの１つであるpHS137-7-B-50は、10mlの
完全培地を入れたT75培養フラスコ中で、24時間に1-3×
107細胞あたり6.91＋/−1.53μg/ml gB１タンパクを生
産した。 【００８１】３．糖タンパクＢ２ gB２遺伝子の単離、特徴付け、およびクローニングは、
国際特許公開第WO85/04857号（前出）に記載されてい
る。 【００８２】3.1 哺乳動物細胞でのgB２の発現 HSV-2糖タンパクgBの発現は、pHS210単独で形質転換す
るか、またはpHS210とともに同時形質転換することによ
り、COS細胞（一時的な発現）で行われる。この２番目
のプラスミドはdhfrを含む。 【００８３】プラスミドpHS210は以下のようにして構築
した；全gB２遺伝子を3.8kb NruＩ−BamHＩ断片としてp
BR322にサブクローン化し、pHS208を作製した。図１０
を参照のこと。遺伝子の5'末端のPstＩ部位（NruＩ部位
の100bp右(下流)）を、M13でのインビトロでの変異によ
りHindIII部位に変えた。次いで、1.9kbのHindIIIからP
vuIIまでの断片を、pSV1/dhfrをHindIIIおよびBglIIで
分解することにより得られるpSV1に挿入した。図１０を
参照のこと；pSV1/dhfrは、PCT国際特許公開第WO85/045
87号に記載されている。このクローニング工程のため
に、pHS208をPvuIIで切断し、末端を平滑末端に修復し
た。次いで、この分子をHindIIIで切断し、1.9kb HindI
II−(PvuII) 断片をゲル電気泳動により単離した。同様
にpSV1/dhfrをBglIIで切断し、平滑末端に修復し、Hind
IIIで切断し、ゲル電気泳動により4.85kb HindIII−(Bg
lII)ベクター断片を単離した。これら２つの断片（1.9k
bおよび4.85kb）を、発現ベクターであるpHS210（図１
０）を作製するために連結した。 【００８４】プラスミドpHS210は、直接にCOS細胞を形
質転換するのに用いた。発現は、１次抗体スクリーニン
グ用として、gB特異的モノクローナル抗体であるF3ABお
よび市販のポリクローナル抗体であるHSV-2抗体（DAK
O）も用いた、免疫螢光分析により検出された。gB２の
培地への分泌は、gB２−特異的ELISA分析により検出さ
れた。この目的のために、プレートをモノクローナル抗
体でコートした。細胞培養培地試料をコートしたプレー
トに添加し、次いで結合したgB２を、ウサギ抗HSV-2ポ
リクローナル抗体（DAKO）に続いて西洋ワサビ結合ヤギ
抗ウサギIgGを用いて検出した。 【００８５】CHO細胞形質転換のためのプラスミドpHS21
0は、同時形質転換プロトコルでは、選択マーカとしてd
hfrを含む第２のプラスミドとともに用いられた（図１
０）。選択培地で続いて形質転換および増殖させること
により、約100個のdhfr+クローンが単離され、ELISA分
析（ELISAプレートはF3AB特異的モノクローナル抗体で
コートされている）を用いてgB２の合成および分泌につ
いてスクリーニングされた。gB分泌のレベルが最も高い
クローンpHS210 #3-1は、さらにgB２ポリペプチドの特
徴について選択された。gB２タンパクは、〔35Ｓ〕−メ
チオニンで標識し、続いて放射性免疫沈降を行うことに
より検出された。１時間パルス後、79kdおよび84kdのポ
リペプチドに相当する２つの拡散したバンドが細胞内で
検出された。これらのタンパクは、637残基の不完全な
遺伝子産物について推測された大きさよりも68,991ダル
トン大きく、該タンパクは部分的にグリコシル化された
前駆体に相当すると推測された。５時間チェイスした
後、細胞内にgB２は検出されなかった。そして、89kdの
ポリペプチドが培地中に検出された。クローンpHS210 #
3-1の培地中に分泌された成熟型の大きさの完全なグリ
コシル化されたgB２は、pHS4-6により分泌された100kd
のgB１よりもいくぶん小さかった。これは、gB１プラス
ミドに含まれる94アミノ酸に対応するコード配列が、pH
S210から除去されたためである。 【００８６】４．糖タンパクD１ 4.1 gD１の哺乳類発現ベクターの構築 pBR322のEcoRＩ部位にクローン化したパットン株のHSV-
1のEcoRＩ断片のライブラリーは、Dr.Richard Hyman, H
ershey Medical Center, Hershey, PAにより作製され
た。gD１遺伝子は、このライブラリーのクローンＨのEc
oRＩ断片内の2.9kb SacＩ断片中に完全に含まれてい
る。15kb EcoRＩ挿入物を含むクローンＨはDr.Hymanか
ら得た。この2.9kb断片をゲル電気泳動で精製し、次にH
indIIIとＮｃｏＩとで完全分解した。７４ｂｐの5'非翻
訳配列とアミノ末端20アミノ酸をコードする60bpとから
なるgD遺伝子の5'末端を134bpの断片としてゲルから単
離した。gD遺伝子の3'末端は、pHYS119（国際公開No.WO
85/04587（前出）を参照されたい）を、NcoＩとSalＩと
で分解し、873bp断片を単離することにより得られた。
これらの２断片（5'末端および3'末端）をあらかじめHi
ndIIIおよびSalＩで分解したプラスミドpUC12と連結し
た。pUC12ベクターは、PharmasiaおよびP-L Biochemica
lsから市販されており、得られたプラスミドはpHS131と
名付けた。プラスミドpHS131をHindIIIで分解し、5'側
の４塩基対の突出部をクレノーポリメラーゼで充填し、
次にSalＩで分解した。gD遺伝子を含む1007bp断片をゲ
ル単離し、そしてあらかじめSmaＩおよびSalＩで切断し
たプラスミドpSV7dに連結した。このプラスミドpSV7dに
ついては以下に述べる。得られた発現ベクターはpHS132
と名付ける。その誘導は図１１に概略を示す。 【００８７】このプラスミドは、完全なタンパクの合計
399個のアミノ酸のうちの25個のアミノ酸のシグナル配
列を含むgD１タンパクの315個のアミノ酸をコードす
る。このタンパクはカルボキシル末端で切断されてお
り、疎水性の膜アンカードメインと細胞質ドメインとを
含む84アミノ酸を欠いており、得られたタンパクは培地
に分泌される。 【００８８】プラスミドpSV7dを以下のように構築し
た：SV40の複製起点と初期プロモーターを含む400bpのB
amHＩ／HindIII断片を、SVgtＩ（Mulligan, R.ら、J. M
ol. Cell Biol. (1981) 1：854-864）から切り出し、そ
して精製した。SV40のポリＡ付加部位を含む240bpのSV4
0 BclＩ／BamHI断片を、pSV2／dhfr（Subramaniら、J.M
ol. Cell Biol. (1981) 1：854-864）から切り出し、そ
して精製した。これらの断片を下のリンカー： 【００８９】 【化９】 【００９０】により融合させた。このリンカーは３つの
全ての読み取り枠での停止コドンと共に５つの制限部位
を含む。得られた670bp断片（SV40の複製起点、SV40の
初期プロモーター、停止コドンを有するポリリンカー、
およびSV40のポリアデニル化部位を含む）を約1.5kbが
欠失したpBR322誘導体（LuskyおよびBotchan, Cell (19
84) 36：391）であるpMLのBamHＩ部位にクローン化し、
pSV6を得た。pSV6のpML配列内のEcoRＩおよびEcoRV部位
を、EcoRＩおよびEcoRVで分解することにより除去した
後、各末端の約200bpを除去するために、Bal31ヌクレア
ーゼで処理し、最後に再連結してpSV7aを得た。Bal31切
除により、EcoRV部位から約200bp離れたSV40領域に隣接
する１つのBamHＩ制限部位を除去した。SV40領域に隣接
する第２のBamHＩ部位を除去するために、pSV7aをNruＩ
で分解した。この酵素はpML配列を複製起点の上流で切
断する。これを平滑末端連結により再環化させ、pSV7b
を得た。 【００９１】pSV7cおよびpSV7dは連続したポリリンカー
置換物を意味する。まず、pSV7bをStuＩおよびXbaＩで
分解した。次に、以下のリンカーをベクターに連結さ
せ、pSV7cを得た： 【００９２】 【化１０】 【００９３】その後、pSV7cをBglIIおよびXbaＩで分解
し、以下のリンカーと連結させ、pSV7dを得た： 【００９４】 【化１１】 【００９５】4.2 gD１の哺乳類細胞での発現 プラスミドpHS132のgD１発現は多くの実験で示されてい
る。第１に、前述の方法を用い、かつ検出に市販の対HS
V-1ウサギ血清（DAKO）を用いて感染させた後、特異的
免疫螢光が、COS７細胞で観察された。第２に、gD１を
分泌する安定なCHO細胞系が確立された。発現レベルはE
LISAで分析され、パルス標識し、チェイスした細胞溶解
物と培地との放射免疫沈降により確認された。第３に、
gD１がCHO細胞系D64のローラーボトル培養の培地から、
硫安沈澱、免疫アフィニティークロマトグラフィー、お
よび限外濾過という一連の工程により精製された。アフ
ィニティークロマトグラフィーには、Rectorら (1982)
（前出）に記載のgDモノクローナル抗体8D2を臭化シア
ン活性化セファロース4Bに結合させたものを用いた。 【００９６】５．糖タンパクD2 5.1 gD2の哺乳類発現ベクターの構築 HSV-2の333株のHindIII断片は、文献（Kudlerら、Virol
ogy (1983) 124：86-99）に示されているように、Dr.Ri
chard HymanによりpBR322にクローン化された。糖タン
パクgD２の遺伝子は、Ruyechanら、J. Virol. (1970) 2
9：677-697により、0.90〜0.945地図単位間のウイルス
の短い特異領域に地図化されている。HindIIIＬ断片の
占める領域は、Roizman, B., Ann. Rev. Genet (1979)
13：25-27のゲノム地図に示されている。gD２遺伝子のD
NA配列が、Watson, Gene (1983) 26：307-312により報
告されている。 【００９７】pBR322にクローン化されたHindIII Ｌ断片
を、Dr.Richard Hymanから入手し、図１２のＡに示す制
限地図を決定した。gD２の遺伝子はgD１をコードする2.
9kbSacＩ断片をプローブとしてHindIII Ｌ断片の制限酵
素分解物をサザンブロットすることにより、2.4kb Xho
Ｉ断片上に存在することが見いだされた。XhoＩ断片の
地図とgD２遺伝子の位置とを図１２のＢに示す。この2.
4kb XhoＩ断片をXhoＩ部位を含むpBR322誘導体ベクター
にクローン化し、プラスミドpHS204を得た。３つの異な
るgD２発現ベクター、プラスミドpHS211、pHS212、およ
びpHS213を次のように構築し、模式図を図１３に示し
た。プラスミドpHS211はシグナル配列を含むgD２の初め
の305個のアミノ酸をコードする。その構築には、pHS20
4をSmaＩおよびBamHＩで切断し、２つの制限断片をゲル
から単離した：5'非翻訳配列の82bpを含む該遺伝子の5'
末端を含む250bp SmaＩ断片、および該遺伝子の内部を
含む3'隣接の746bpのSmaＩ−BamHＩ断片。哺乳類細胞発
現ベクターpSV7d（第4.2節に記載）をEcoRＩで切断し、
5'の４bpの突出部分をクレノーポリメラーゼで平滑末端
にし、次いでBamHＩで切断した。pHS204の２断片を分解
されたpSV7dに連結し、そして細菌の形質転換体からSma
Ｉ断片が正しい方向に入っているものを選択し、ベクタ
ーpHS211を得た。 【００９８】gD２の352個のアミノ酸およびpHS211に存
在する遺伝子を越える付加的な47個の残基をコードする
プラスミドpHS212を、pHS204のHaeIIでの分解、そして
クレノーポリメラーゼでの末端平滑化、およびBamHＩで
の分解により構築した。（HaeII）（括弧は末端が充填
されていることを表わす）からBamHＩまでの141bpの断
片をゲル単離した。プラスミドpHS211をE.coli GM272株
に導入し、プラスミドDNAを調製し、それを次にBclＩで
分解後、クレノーポリメラーゼで平滑化し、そしてBamH
Ｉで分解した。大きいベクター断片（約3.4kb）をゲル
単離し、141bp(HaeII)−BamHＩ断片に連結し、プラスミ
ドpHS212を得た。gD２配列とプラスミドベクター配列
の、該遺伝子の3'末端側での融合により、gD２遺伝子の
3'末端側にナンセンスDNAの27コドンが付加される。こ
れらのナンセンス配列を除去するために、プラスミドpH
S213を、pHS211のSalＩでの部分分解、１ヶ所切断され
たプラスミドのゲル単離、次いでクレノーポリメラーゼ
での平滑化およびBamHＩでの分解、により構築した。pH
S204の（HaeII）からBamHＩの141bp断片を、線状化した
pHS211に連結し、プラスミドpHS213を得た。 【００９９】5.2 哺乳類細胞におけるgD２の発現 哺乳類細胞におけるgD２の発現は、pHS211、pHS212およ
びpHS213でCOS７細胞にトランスフェクトすることによ
り、一過性の発現についてまず分析した。gD２の発現
は、免疫螢光、およびCOS７が培養された培地の捕捉ELI
SA分析、の両方法により、免疫螢光に対してはウサギ抗
HSV-2抗体を用いて、そしてELISAにおける捕捉抗体につ
いては、gD型の共通抗体である8D2（Rectorら（1982）
前出）を用いて検出した。 【０１００】次に、Ad dhfrを有するプラスミドpHS211
またはpHS213でトランスフェクトし、dhfr獲得について
選択し、gD２の発現についてERISA分析でスクリーニン
グすることにより、永久CHO細胞系を確立した。 【０１０１】Ad-dhfrの記述：dhfr遺伝子を持つプラス
ミドを、アデノウイルス−２由来の主要好気プロモータ
ー（Ad-MLP、地図単位16〜17.3）を5'末端でマウスdhfr
cDNAに融合させることにより構築した。SV40小ｔ抗原
に対するイントロンとSV40初期領域ポリアデニル化部位
とをコードするDNAを、SouthernおよびBerg, J. Mol. A
ppl. Genet. (1982) 1：327-341に記載されているpSV2-
neoより得て、dhfr cDNAの3'末端に融合させた。これら
３つの断片をpBR322にサブクローン化し、プラスミドAd
-dhfrを得た。このプラスミドは、KauhmanおよびSharp,
Molec. and Cell Biol.,(1982)2：1304-1319に記載さ
れているdhfrプラスミドと機能的には同様である。 【０１０２】６．gB−gDワクチンを用いた治療的処置 6.1 一次感染後に投与した組換えHSV糖タンパクワクチ
ンがモルモットの再発性ヘルペス疾患に及ぼす効果 雌のハートレイモルモットの膣内に、第１日目に５×10
5pfu HSV-2 MS株を接種した。これら動物を、アシクロ
ビール（５mg／ml）を飲料水に加えることにより、第１
〜10日目において処置した。アシクロビールは、一次感
染の症状を軽減し、従って２次的な細菌感染の発生、お
よび生殖器の傷の発生を減少させる。一次感染中におけ
るアシクロビールの使用は、モルモットに対する処置を
停止した後の疾患の経過には影響がないことが示されて
いる（Bernsteinら、Virology, (1986) 67：1601）。一
次感染から回復した後、これら動物を、HSV-2全糖タン
パク調製物（gP2）で免疫化し、組換えgB１およびgD１
の混合物（HSV-1 gB＋gD）で免疫化するか、あるいは処
置しなかった。処置グループを下に示している。 【０１０３】グループ 処置 投与量 アジュバント 経路 Ｎ Ｉ なし なし なし なし 11 II HSV-1 gB＋gD 25μg＋25μg フロインド 足蹠 11 III gP2 50μg フロインド 足蹠 11 IV 対照アジュバントのみ なし フロインド 足蹠 9 後方の足蹠にワクチンを注射することにより、第21日目
と、さらに第42日目に動物を免疫化した。組換えタンパ
クgB１およびgD１の両方を、前述のように哺乳類細胞に
おいて生産した。結果は表１および図１４に報告する。 【０１０４】これらの結果は、再発性ヘルペス疾患のパ
ターンがＩ群およびIV群について同じであったことを示
しており、それ故にこれらの群を分析用にプールした
（対照，ｎ＝20）。 【０１０５】表１および図１４に示されている結果は、
組換え糖タンパクによるワクチン接種が疾患の再発頻度
に対して顕著な影響を及ぼすことを示している。加え
て、gB＋gDの組み合わせは天然の糖タンパクの混合物よ
り優れている。 【０１０６】特定の時間内に起こる病害日数により測定
した疾患の再発率は、再発エピソードの頻度と持続期間
との両方を考慮する評価である。図１５のＡは、ヘルペ
ス疾患が認められた週あたりの平均日数として表されて
いる再発性ヘルペス疾患の感染率を示している。免疫化
したグループは、gBgDおよびgD-2でワクチン投与された
動物の両方を含む。図１５のＡに示されているように、
疾患の再発率（週あたりの病害日数）は、評価期間が最
初の感染から遠ざかるにつれて、全てのグループで低下
したが、低下率はワクチン投与した動物では大きかっ
た。対照動物と免疫化した動物との間における再発性ヘ
ルペス疾患の感染率の差を図１５のＢに示す。図１５の
Ｂから明らかなように、糖タンパクによる免疫化が疾患
の再発率に及ぼす効果は、図１４より推論されるよう
に、２回目の投与後よりもむしろ１回目の免疫化投与に
続いて確立されているようであった。 【０１０７】 【表１】 【０１０８】6.2 一次感染後に投与した組換えHSV糖タ
ンパクワクチンが宿主の免疫応答に及ぼす効果 感染後の糖タンパク投与が宿主の免疫応答に及ぼす効果
は、感染した動物によって生産される抗HSV抗体を、感
染前と、HSV糖タンパクワクチンで免疫化した後とに測
定することにより、決定された。 【０１０９】6.1節で述べたように、これら動物にHSV-2
ms株で接種し、アシクロビールで処置し、そしてHSV糖
タンパクワクチンで処置した。これら動物から血清を第
41日目と第95日目に集めた。血清中の抗HSV抗体は、本
質的にはPachl,C.ら、J ofVirology (1987) 61：315-32
5に記載されているように、1.6節に述べた方法である、
ELISAにより測定した。捕捉抗原には、HSV-1糖タンパク
混合物（gP-1）、HSV-1糖タンパクＤ（gD-1）、あるい
はHSV-2糖タンパクＤ（gD-2）が含まれていた。 【０１１０】HSV糖タンパクワクチン投与が抗HSV抗体の
力価に及ぼす効果は、データが幾何平均で表されている
表２に示されている。抗体は、HSV接種前に集めた血清
中には検出されなかった。表２に見られるように、未処
置の対照動物では、抗HSV抗体の力価は第95日目よりも
第41日目の方が大きかった。それとは対照的に、糖タン
パクで処置した動物は、一般的に第95日目までずっと高
い力価を示していた。またHSV糖タンパクでワクチン接
種すると、未処置の対照に比べて抗HSV抗体の力価が顕
著に増加した（P<.05）。さらに、gP-2混合物での処置
は、抗体の力価が1.4〜７倍上昇したが、組換えHSV-1 g
BgDワクチンでの処置は、対照値に比べて力価が９〜31
倍上昇した。このように、HSV糖タンパクを動物に投与
すること、特に組換えHSV糖タンパクgBgDを投与するこ
とは、宿主の免疫応答を増加させ、そして6.1節に示し
たように、再発性HSV疾患の頻度および症状を軽減す
る。 【０１１１】 【表２】 【０１１２】6.3 gD１を含むHSV糖タンパクワクチンに
より誘導された免疫応答におけるアジュバントの影響 いくつかのアジュバントを、HSV糖タンパクワクチンに
よる免疫治療処置におけるその影響を調べるために試験
した。試験を行なったアジュバントは、完全フロインド
アジュバント（CFA）、水酸化アルミニウム、およびN−
アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル
−L−アラニン−2−(1'−2'−ジパルミトイル−sn−グ
リセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミ
ン（MTP−PEと呼ばれる）であった。 【０１１３】アジュバントの影響は、gD１を含むワクチ
ン（これはまた、種々のアジュバントを含む）を投与し
た後の抗gD１抗体量を測定することにより調べられた。
gD１のみを含むワクチンは、gBgDを含むワクチンのモデ
ルとして働く。なぜなら、アジュバントの影響は、ワク
チン中のHSV糖タンパクの型に特異的であるようには考
えられないためである。 【０１１４】以下の研究において、gD１をpHS132から合
成し、4.2節に記載されているように、単離した。雌の
モルモットに、35μgのgD１と種々のアジュバント組成
物とから成る混合物を３週間間隔で３回にわたり足蹠か
ら投与し免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、そし
て３回目の免疫化の１，５，９および13週間後に、動物
から採血し、そして抗gD力価を、1.6節に述べたようにE
LISAにより決定した。 【０１１５】次に示す結果により、試験したアジュバン
トのうちで最も有望なのはMTP-PEであることが示唆され
る。なぜなら、MTP-PEは実験動物中で高い抗gD１力価を
恒常的に生産するためである。力価についてはCFAほど
は長期間保持されなかったが、これらのレベルはCFAに
ついて見られたものと同等であった。 【０１１６】6.3.1 CFAと水酸化アルミニウムとの比較 動物を、gD１とCFAまたは水酸化アルミニウムのいずれ
かとを含むワクチンで免疫化した。抗gD力価におけるア
ジュバントの影響を表３に示す。表３ではデータを幾何
平均で表している。表５に見られるように、最も効果的
なアジュバントはCFAであった。最も長く持続し最も高
い抗体力価は、CFAワクチンで免疫化した群に見られ
た。他のアジュバントの影響を、CFAで得られた力価に
比較した割合（パーセント）として示す。10％水酸化ア
ルミニウム懸濁液をアジュバントとして用いることによ
り、最も低い抗gD１力価が得られた。 【０１１７】 【表３】 【０１１８】6.3.2 CFA，nor−MDP，およびMTP-PEの比
較 動物を、gD１と、CFA、nor−MDP、およびMTP-PEのうち
のいずれかとを含むワクチンで免疫化した。MTP-PEをリ
ポソームにカプセル化し、そしてこの後者のアジュバン
トを、外因性のgD１とともに、そして、リポソームに取
込まれたgD１とともに、投与した。リポソームは、合成
ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびMT
P-PE（またはMTP-PEおよびgD１）を、懸濁媒体（滅菌し
たCa++およびMg++塩を含まない等張ダルベッコ緩衝液、
pH7.2）中に175：75：1の割合加え、ボルテックスによ
り撹拌することにより調製された。表４に見られるよう
に、CFAを含むワクチンでの免疫化により最も高い抗gD
１平均力価を得た。nor-MDPで得られた力価は、CFAで免
疫化した群で得られた平均力価の44から74％の範囲であ
った。MTP-PEおよび外因性gD１で得られた平均力価は、
nor−MDPで得られたものよりもいくらか低く、CFAで得
られたものの32から72％の範囲であった。MTP-PEおよび
リポソームでカプセル化されたgD１で得られた力価が非
常に低いのは、カプセル化された形のgD１のレベルが非
常に低いためであり得る。カプセル化されたgD１の投与
量は外因性のgD１の投与量の約７％のみであった。この
低い投与量は、リポソーム中へのgD１の取込みが、非常
に低い効率であることに起因するものであった。この非
常に低い取込みは、抗原のサイズにより引き起こされ得
る。リポソームの他の処方によれば、抗原をさらによい
効率で取込むことができた。 【０１１９】 【表４】【０１２０】6.3.3 MTP-PEを含む異なる処方物の比較 動物を、高油性デリバリー系（スクアレン／アルラセ
ル）中のMTP-PEで処方されたワクチン、および低油性デ
リバリー系中のMTP-PEで処方されたワクチンを含むgD１
で免疫化した。油性度の低いMTP-PE処方物は、４％のス
クアレンおよび0.008％のTween80を含んでいた。これら
のアジュバント処方物で得たgD１抗体力価を表５に示
す。 【０１２１】表５に見られるように、MTP-PE処方物は、
オイル−界面活性剤の割合の低い処方物中の唯一の成分
として用いたときでさえも、アジュバントとして効果的
であった。［それは、RIBI中のCWS成分の効果的な代替
物でもあったし、さらにRIBIと比較してもその効果は時
間とともに増大した。３回目の採血時に、MTP-RIBIで得
られた力価はRIBIで得られたものの２倍であった。］１
回目の採血後、MTP-PE低油性処方物は、高油性デリバリ
ーシステム（スクアレン／アルラセル）よりも高い力価
を示した。 【０１２２】 【表５】 【０１２３】6.4 治療的研究：モルモットの再発性ヘ
ルペス病予防に効果的なワクチンにおけるアジュバント
の影響，投与部位，および投与時期 gBgDワクチンは、SDS-PAGEにより判断するとおよそ70−
80％の単一性にまで精製した組換えgB１およびgD１のそ
れぞれ25μgを含む。組換えgB１タンパクは、pHS113-9-
10-21およびpHS137-7-B-50セルラインから調製したgB１
の50：50の混合物であった。これらのセルラインは、ベ
クターpHS113およびpHS137をそれぞれ保有するCHOセル
ラインである。pHS113およびpHS137の調製については、
2.2節に記載されている。gBタンパクは、Pachlら、J of
Virology, 61：315-325（1987）に記載されているよう
に精製され、このことについては2.2節に記載されてい
る。アフィニティークロマトグラフィーによる精製中に
おいて、C4D2の代わりに8D2を用いたこと以外は、4.2節
に記載されているように、gD１を調製した。 【０１２４】この実施例においては、２つのアジュバン
ト、nor-MDPおよびCFAの効果を比較している。アジュバ
ントnor-MAPを、50％スクアレン／アルラセルおよび抗
原で乳化し、50μg／投与で用いた。 【０１２５】本研究はまた、２つの投与経路についても
比較を行なっている。つまり、足蹠内投与と、筋肉内ま
たは皮下投与との比較を行なっている。最後に、モルモ
ットでの再発性ヘルペス病の予防における投与の種々の
時間を比較している。実験計画を表６に示す。 【０１２６】 【表６】【０１２７】体重350〜400gの雌のハートレイモルモッ
トに、第１日目に5.7／log10pfuのHSV-2 MS株を膣内に
植菌した。膣内植菌24時間後に収集した膣からの清拭試
料からHSVを回収することにより、動物が感染している
ことを確めた。一次感染の医療経過を、Stanberryら、J
Infec Dis (1987) 155：914で述べられているように、
生殖器の皮膚の病変により、追跡し、定量化した。一次
感染より回復後、動物を表10に示してあるような処理群
に無作為化した。急性の疾病が消散後、11日目から100
日目までの間、疾病の再発の徴候について、動物を毎日
調べた。疾病日は、再発した疾病が観察された日として
定義し、重症の再発は１個を越える数の水泡が認められ
た日であり、そしてエピソードは、病変のない日に続い
て新しく疾病が発生することを示す。 【０１２８】第22日から第76日の間の動物の分析より得
た結果を表７に示す。表９のデータにより、IM注射にお
いて、nor-MDPが効果的なアジュバントであることが示
唆される。これは、疾病全日数がより低いこと、重症の
再発がより低率であること、および、ヘルペス性のエピ
ソードの全数が減少することに反映される。さらに、no
r-MDPを含むワクチンおよび投与されたIMは、CFAを含み
そして足蹠中に投与されたワクチンと同程度に効果的で
あると考えられる。 【０１２９】 【表７】 【０１３０】種々のアジュバントを含むワクチンの注射
により生じる局所的な反応もまた、監視した。その結果
を表８に示す。注射部位での局所的な紅斑および硬変の
発生率は、nor-MDPを含むワクチンについて同様であっ
た。さらに、局所的な反応生成性も基づき、nor-MDPは
ワクチンにおける使用が可能であると考えられる。 【０１３１】 【表８】 【０１３２】表７の結果によっても、免疫治療の開始と
急性の疾病の始まりとの間の間隔が減少するにつれて、
処置の相対的な効力が増強することが示される。最初の
感染後、８、15または21日後にCFAを含むgBgDワクチン
の接種を受けた動物のうち、膣内植菌後最も短時間のう
ちワクチンを受けた動物が、未処置のコントロールに比
較すると、疾病の期間が最も短く、重い再発の割合が最
も低く、そして、全エピソードが最も少なかった。感染
15日後に、ワクチンを接種した動物について得た値は、
８日後にワクチン接種した群について得たものよりも高
く、そして21日後に接種した群は15日後に接種した群よ
りも高かった。この効果は図１６にも示されている。図
１６は、HSV-2植菌８、15または21日後に、最初にワク
チン接種した動物について、膣内に植菌した後の日々に
おける再発数のグラフを示す。 【０１３３】図１６のデータは、再発した疾病の割合の
減少（％）を計算するために用いられた（疾病の再発率
の有意性についての説明は6.1節を参照されたい）、こ
のデータは表９に示されている。表９では、最も早い期
間（つまり14〜50日）において８日目に最初のワクチン
を接種することにより、再発した疾病の割合（パーセン
ト）が最も大きく減少するのが観察され得る。しかし、
HSVを膣内に植菌した15日後に最初のワクチン接種を行
なうことにより、51〜92日目から、最も効果的な保護が
得られた。HSV-2に初めに接触させてから21日後に最初
のワクチン接種を行なったときに最も弱い保護効果がか
得られた。 【０１３４】モルモットにおいては、病気の急性な時期
が、ウイルスの感染後14〜21日の期間に起こるというこ
とを銘記すべきである。この急性な時期において、HSV
により誘導された疾病が、動物の身体に見い出される。
従って、図16のデータにより、51〜92日目における最も
効果的な保護が、感染の急性な時期の期間でのワクチン
の投与により得られたことが示される。 【０１３５】 【表９】 【０１３６】本発明によれば、単純ヘルペスウイルスの
感染後に投与することにより、単純ヘルペスウイルス１
型および２型の治療処置に効果のあるワクチンが提供さ
れる。 【０１３７】上記発明は、その内容を明快に理解するた
めに、例示し、実施例を挙げることによりいくぶん詳細
に述べてきたが、添付の請求の範囲内において、ある変
更および修飾がなされ得ることは明らかである。 【０１３８】 【発明の効果】本願発明により、単離した糖タンパク質
をコードするポリヌクレオチドを利用して再発性単純ヘ
ルペスウイルス誘導疾病を阻止するのに有効なワクチン
を製造することが可能になった。
（HSV-1）および２型（HSV-2）と名付けられた２つの密
接に関連する変異体を含む単純ヘルペスウイルスが包含
される。これらの型のウイルスは、強い交差反応を示す
が、中和滴定により区別することができる。HSV-1およ
びHSV-2は様々なヒトの疾患（例えば、皮膚感染、陰部
ヘルペス、ウイルス性脳炎など）の原因となっている。 【０００２】単純ヘルペスウイルスは２本鎖DNAウイル
スであって、膜内に被包された二十面体の核キャプシド
内に約150〜160kbpのゲノムを有する。この膜には、数
多くのウイルス特異的な糖タンパクが含まれ、それらの
うち最も多いのは、gB、gC、gD、およびgEである。ここ
で、gBおよびgDは、１型と２型との間で交差反応を示
す。 【０００３】HSV-1およびHSV-2の両方に対するヒトヘの
安全で効果的なワクチンを提供すること、および感染が
生じた場合は、その疾患の治療法を提供することは、医
学的にも科学的にも非常に興味ある問題である。 【０００４】ある有望な試みは、単離された糖タンパク
を予防に用いることであった。この糖タンパクは、マウ
スに注射し、次いで生きたウイルスを感染させた場合
に、防御性を与えることが示されていた。しかし、単純
ヘルペス糖タンパクの利用は、これまで、主にウイルス
の培養と膜タンパクの単離とに依存してきた。糖タンパ
クの商業的生産においては、危険な病原体の取り扱い、
培養細胞中におけるウイルスの維持、ウイルスゲノムま
たはその一部を含まない糖タンパクの単離などに関する
問題が、糖タンパクをワクチンとして用いることを妨げ
てきた。従って、ウイルスを培養し、そして膜タンパク
を分離すること以外の方法により生産された糖タンパク
を用いたワクチンを提供することが望ましい。 【０００５】ヘルペスの感染を治療的に処置するための
方法、すなわち個体がウイルスに感染した後で、その疾
患を軽減したり、その疾患の再発を防止する処置法を開
発することもまた非常に興味が持たれる。ウイルスの感
染は、通常、抗生物質による治療に対しては抵抗性を示
すので、著しい副作用を持たない他の方法に非常に興味
が持たれている。再発性ヘルペス疾患の治療には、いく
つかの薬剤（特に、アシクロビール(Acyclovir)）が有
効であったが、再発を防止するために長期間にわたって
連続投与を行う必要性があるので望ましくなく、治療の
過程で薬剤抵抗性の変異体が生じる。 【０００６】 【従来の技術】EberleおよびMou（J. of Infectious Di
seases (1983) 148：436-444）は、ヒト血清中における
HSV-1に特有のポリペプチド抗原に対する抗体の相対的
な力価を報告している。Marsdenら（J. of Virology (1
978) 28：624-642）は、HSV-1とHSV-2との間におけるタ
イプ内の組み換えにより、117キロダルトン(kd)の糖タ
ンパクに対応する遺伝子がHSVの遺伝子地図上の0.35〜
0.40地図単位内に位置することを報告している。Ruyech
anら（同上 (1979) 29：677-679）は、糖タンパクＢ遺
伝子の位置が、0.30〜0.42地図単位の間にあることを報
告している。SkareおよびSummers Virology (1977) 7
6：581〜595）は、HSV-1 DNA上のEcoRＩ、XbaＩ、HindI
IIのエンドヌクレアーゼ切断部位を報告している。Roiz
man（Ann. Rev. Genetics (1979) 13：25〜57）は、HSV
ゲノムの構成を報告している。DeLuccaら（Virology (1
982) 122：411）は、0.345〜0.368地図単位の間のgB１
構造遺伝子内に変異があると考えられるいくつかの表現
型変異体の位置を決定している。 【０００７】HSV-1またはHSV-2に感染したニワトリ胚細
胞から抽出されたサブユニットワクチンが、米国特許第
4,317,811号および第4,374,127号に述べられている。ま
た、Hilfenhausら（Develop. Biol. Standard (1982) 5
2：321-331）により、特定のHSV-1種（BW3）からのサブ
ユニットワクチンの調製が述べられているのを参照され
たい。Roizmanら（同上 (1982) 52：287-304）は、免疫
感作したマウスにおいて効力を有することが示されてい
る非感染性のHSV-1×HSV-2組換え体および欠失変異体の
調製について述べている。Watsonら（Science (1982) 2
18：381-384）は、カエル卵母細胞の核への注入による
クローン化断片の発現だけでなく、HSV-1 gD遺伝子のク
ローニングおよびエセリヒア・コリー（E.coli）内にお
ける該遺伝子の低レベル発現について述べている。彼ら
はまた、gD遺伝子の塩基配列も示している。Weisら（Na
ture (1983) 302：72-74）は、エセリヒア・コリー内に
おけるgDの高レベル発現について報告している。このポ
リペプチドは、ウサギにおいて中和抗体を誘導する。Be
rmanら（Science (1983) 222：524-527）は、哺乳動物
培養細胞中における糖タンパクＤの発現について報告し
ている。Laskyら（Biotechnology (1984年6月) 527-53
2）は、この糖タンパクＤをマウスの免疫化に用いるこ
とを報告している。Cohenら（J. Virol (1984) 49：102
-108）は、成熟タンパクの８〜23残基内に含まれる、gD
の特定の抗原決定基の位置および化学合成について報告
している。 【０００８】HSVを感染させた細胞からの膜タンパク調
製物を、ヒトの感染後ワクチンとして、「治療」に用い
ることについては、Dundarov,S.ら（Dov. Biol. Standa
rd (1987) 57：351-357）およびSkinner, G.R.B.ら（同
上 (1982) 52：333-34）により報告されている。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】単純ヘルペスウイルス
１型および２型に対する治療に用いるワクチンおよび組
成物、ならびにそれらの生産方法が提供される。これら
の治療法は、組換えDNA技術により生産されるウイルス
特異的ポリペプチドの組み合わせを用いている。特に、
HSV gBおよびgDは、改変された哺乳動物宿主で生産さ
れ、そして組み合わせて用いられた。これらのポリペプ
チドは、ヒトを含む動物における単純ヘルペスウイルス
感染の治療に用いられうる。 【００１０】従って、本発明のある局面は単純ヘルペス
ウイルス（HSV）感染の治療的処置に用いられるワクチ
ンである。該ワクチンは、 ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＢ
（gB）ポリペプチド；および； ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ
（gD）ポリペプチドを含有する。 【００１１】ここで、該ポリペプチドは哺乳動物細胞中
において組換えDNA構築物を発現させて調製されたもの
であり、該ポリペプチドは、このワクチンが、HSVに一
次感染した後の個体に投与される場合には、HSVに感染
した該個体においてHSVにより誘導される疾患の再発を
防止するのに効果的な量で存在する。 【００１２】本発明の他の局面は、単純ヘルペスウイル
ス（HSV）感染の治療に用いられるワクチンである。該
ワクチンは、 ａ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＢ
（gB）ポリペプチド；または ｂ．免疫的に活性な単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ
（gD）ポリペプチドを含有する。 【００１３】ここで、該ポリペプチドは、哺乳動物細胞
中において組換えDNA構築物を発現させて得られたもの
であり、該ポリペプチドは、このワクチンが、HSVに一
次感染した後の個体に投与される場合には、HSVに感染
した該個体においてHSVにより誘導される疾患の再発を
防止するのに効果的な量で存在する。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本願発明によれば、単純
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１型（ｇＢ
１）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオチド酸配
列を有する単離したヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドが提供される。 【００１５】本願発明によれば、単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２型（ｇＢ２）をコードす
る、図４〜７に記載のヌクレオチド酸配列を有する単離
したヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが提供
される。 【００１６】本願発明によれば、図４〜７に記載のアミ
ノ酸配列、またはこのアミノ酸配列の免疫学的等価物を
有する単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ
（ｇＢ）およびその前駆体、あるいはそれらの類似体を
コードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
が提供される。 【００１７】好ましい実施態様においては、前記免疫学
的等価物のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と５％よ
り少ない数で異なる。 【００１８】好ましい実施態様においては、前記ヌクレ
オチド配列は、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 396
50より入手可能）中のヌクレオチド配列、または、それ
らとコドンの縮重のみで異なるヌクレオチド配列から選
択される。 【００１９】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも１５個のアミノ
酸をコードする。 【００２０】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも３０個のアミノ
酸をコードする。 【００２１】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド酸配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２２】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２
型（ｇＢ２）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２３】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物が提供される： (a) 図４〜７に記載のアミノ酸配列、またはこのアミノ
酸配列の免疫学的等価物を有する単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）およびその前駆体、
あるいはそれらの類似体をコードするヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチド (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２４】好ましい実施態様においては、前記免疫学
的等価物のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と５％よ
り少ない数で異なる。 【００２５】好ましい実施態様においては、前記ヌクレ
オチド配列は、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 396
50より入手可能）中のヌクレオチド配列、または、それ
らとコドンの縮重のみで異なる。 【００２６】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも１５個のアミノ
酸をコードする。 【００２７】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも３０個のアミノ
酸をコードする。 【００２８】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主
細胞が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド酸配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００２９】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主
細胞が提供される： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２
型（ｇＢ２）をコードする、図４〜７に記載のヌクレオ
チド配列を有する単離したヌクレオチド配列： (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００３０】本願発明によれば、以下のヌクレオチド配
列を含有するＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主
細胞が提供される： (a) 図４〜７に記載のアミノ酸配列、またはこのアミノ
酸配列の免疫学的等価物を有する単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）およびその前駆体、
あるいはそれらの類似体をコードするヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチド (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 【００３１】好ましい実施態様においては、前記免疫学
的等価物のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と５％よ
り少ない数で異なる。 【００３２】好ましい実施態様においては、前記ヌクレ
オチド配列は、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 396
50より入手可能）中のヌクレオチド配列、または、それ
らとコドンの縮重のみで異なる。 【００３３】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも１５個のアミノ
酸をコードする。 【００３４】好ましい実施態様においては、前記ポリヌ
クレオチドのフラグメントは少なくとも３０個のアミノ
酸をコードする。 【００３５】本願発明によれば、単純ヘルペスウイルス
（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２型（ｇＢ２）、単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ１型（ｇＤ１）、
および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ
２型（ｇＤ２）からなる群より選択される少なくとも１
つ、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパ
ク質Ｂ１型（ｇＢ１）のポリペプチド、その免疫学的に
等価な断片、またはそれらの混合物をコードする、融合
タンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供され
る。 【００３６】 【発明の実施の形態】ワクチン 本発明のワクチンは、１型および２型の両方の組換えHS
V糖タンパクＢおよびＤを用いている。成熟（全長）gB
およびgDタンパクは、これら成熟タンパクと免疫学的に
等価な（すなわち、感染に対して防御性を与える）断
片、前駆体、および類似体と同様に用いられる。請求の
範囲で用いているように、「糖タンパクＢポリペプチ
ド」および「糖タンパクＤポリペプチド」という用語
は、このような断片、前駆体、および類似体を含むこと
が意図される。組換えgBおよびgDポリペプチドは、真核
細胞、好ましくは酵母または哺乳動物細胞、最も好まし
くは哺乳動物細胞において生産される。断片の長さは、
少なくとも約15アミノ酸、好ましくは少なくとも約30ア
ミノ酸である。ワクチンは、１型ポリペプチドの混合
物、２型ポリペプチドの混合物、または１型および２型
ポリペプチド両方の混合物、あるいは個々のポリペプチ
ドのいずれをも含有し得る。 【００３７】gBおよびgDポリペプチド混合物は、単独で
も用いられるが、通常は、生理学的および薬理学的に受
容される媒体、一般的には水、生理食塩水、リン酸緩衝
液、糖などと共に用いられる。さらに、該ポリペプチド
混合物は、生理学的に受容されるアジュバント（例え
ば、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド誘導体な
ど）と共に用いられ得る。実施例6.3で示されるよう
に、様々なアジュバントが有効である。アジュバントの
選択は、少なくとも部分的には、アジュバントを含んだ
ワクチンの安定性、投与経路、ワクチン接種される個体
種に対するアジュバントの効能、そしてヒトの場合に
は、このアジュバントが食品医薬品局（FDA）によって
ヒトヘの使用が認可されているかいないかといったこと
に依存する。ワクチンは、リポソームにより運搬される
か、および／またはインターロイキン１および２のよう
な免疫調節剤と共に運搬される。ワクチンは都合のよい
非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、皮下、真皮内、
筋肉内、または腹腔内）により投与されうる。同一また
は異なった経路で投与されるワクチンを分割して投与す
ることは有利である。ワクチンは、単純へルペスウイル
スに一次感染した後に投与される。 【００３８】感染後投与の効能は、実施例6.1に示され
ている。ウイルス感染後の宿主における免疫応答の増大
に及ぼすワクチンの効果は、実施例6.2に示されてい
る。単純ヘルペスウイルスのウイルス表面糖タンパク
は、抗体が介在するウイルスの中和化と、抗体依存性細
胞障害（ADCC）とによって認識される抗原であることが
示されている。Norrild B.ら、Infect. Immun. (1980)
28：38-44。頻繁にHSV感染を再発する患者は、しばしば
中和抗体およびADCCの両方を高いレベルで有する。Core
y, L.およびSpear, P.G., Eng. N., J. Med. 314：686-
691, 1986。このような患者にとって、HSV特異的抗体の
有力な誘導物質が、ウイルス糖タンパクであることが示
された。Eberle, R., Mou, S.W., およびZaia, J.A.,
J. Gen Virol. 65：1839-1843、1984。従って、２つの
ウイルス糖タンパクだけから構成され、他のウイルス抗
原を含まない組換えサブユニットワクチンを、再発性陰
部ヘルペスの治療へ臨床的に利用することは期待されな
かった。 【００３９】糖タンパクＢおよびＤは改変することなく
用いられる。しかし、より小さな関連ポリペプチド（例
えば、断片など）を用いる場合、および分子量が約5,00
0ダルトンより小さい（例えば、1,500〜5,000ダルト
ン）場合には、所望の免疫応答を誘導するために改変が
必要とされる。より小さなハプテンは、適切な免疫原キ
ャリアー（例えば、破傷風トキソイドなど）に結合させ
なければならない。 【００４０】gBまたはgDポリペプチドをコードする短い
DNA断片を、他の病原性生物やウイルスからのタンパク
を発現する遺伝子に連結することもできる。このように
して、得られた融合タンパクは１種類より多くの病気に
対して免疫性を与え得る。 【００４１】１回の投与量あたりに用いられる組換えgB
およびgDポリペプチドの総量は、通常、宿主の体重１kg
あたり、約0.1μg〜２mg、より一般的には約0.5μg〜１
mg、そして特に約0.5μg〜10μgである。ワクチン中のg
Dに対するgBの割合は、通常、約0.1：１〜10：1、より
一般的には約0.5：１〜10：１、そして好ましくは約0.
5：１〜５：１である。１回の投与は、日単位から週単
位の間隔で繰り返して行われ、通常は２週間から４週間
の間隔で、通常は約２回から10回を越えずに行われる。
しかし、実施例6.4に示されるように、ウイルスに一次
感染した後の投与時間が、疾患の再発率に影響を及ぼ
す。従って、治療される種および／または個体に依存し
て、最も効果的な投与時間を決定する必要がある。最も
効果的な時間は、例えば疾患の状態をモニターする疾患
症候学または抗体価を用いる基本的な検査により決定し
得る。さらに、疾患の急性期、すなわち個体がHSVによ
り誘導される病変を体に示す場合に、ワクチン投与が疾
患の再発を著しく低減させることは、実施例6.4のデー
タに示されている。 【００４２】組換え糖タンパクＢ 組換えgBポリペプチドの調製は、1985年10月24日に公開
された国際公開No.WO85/04587の国際出願No.PCT/US85/0
0587に詳述されている。組換えgBポリペプチドを生産す
るのに用いる材料および方法については、以下で簡単に
記述する。 【００４３】実施例における図４〜図７は、gB１パット
ン株のヌクレオチド配列と、そのヌクレオチド配列によ
りコードされるアミノ酸配列とを表す。図４〜図７に
は、gB１とgB２との間の実質的な相同性も示されてい
る。ヌクレオチド配列には多くの変化があり得る。独立
した機能を有する種々の断片が用いられ得る。これら断
片は成熟gB以外のタンパクに結合し得る。さらに、種々
のコドンは、同じアミノ酸をコードするように改変され
得るが、宿主の性質に従ってより効果的な発現を示す。
例えば、これらコドンは、１種またはそれ以上のタンパ
ク、あるいはタンパク群における特定コドンの出現頻度
に従って改変され得る。これらタンパクは、例えば解糖
系タンパクであって、特定の宿主（例えば、酵母）の全
タンパクにおいて高い比率を占める。ある場合には、１
個またはそれ以上のコドンは、あるアミノ酸を別のアミ
ノ酸で置き換えることにより、異なるアミノ酸をコード
するように改変し得る。この場合、変化の影響はタンパ
クの免疫原性や興味ある他の生物学的因子に有害ではな
い。ある場合には、Ｎ末端またはＣ末端にアミノ酸を付
加することが望ましい。このようなアミノ酸の付加は好
ましい結果をもたらす。このことは、成熟gB１またはそ
の前駆体をコードする配列の5'末端または3'末端にコド
ンを付加することにより、容易に達成し得る。さらにgB
２のアミノ酸配列はgB１のアミノ酸配列と20％だけ数が
異なっているが、HSV-1またはHSV-2の他の株は、それぞ
れgB１パットン株またはgB２ 333株と同一または類似の
gB糖タンパクを持っている。これらgB糖タンパクは、通
常は５％より少ない数だけ、より一般的には２％より少
ない数だけ、そして多くの場合は、0.5％より少ない数
だけのアミノ酸が、gB１パットン株またはgB２ 333株の
アミノ酸配列と異なっている。 【００４４】gB１の配列、特にgB１パットン株は、タン
パクのＮ末端から始まる４つのドメインに分けられる：
１番目のアミノ酸から約30番目のアミノ酸にまで広がる
第１の疎水性領域、第１の疎水性領域から約726番目の
アミノ酸にまで広がり、極性が変化し得る領域；極性が
変化し得る該領域から約795番目のアミノ酸にまで広が
る第２の疎水性領域；そして904番目のアミノ酸のＣ末
端にまで広がり、極性が変化し得る第２の領域である。 【００４５】gBは膜の糖タンパクであるから、他の糖タ
ンパクから類推すると、第１の疎水性領域は分泌および
／または膜の配置を支配するシグナルリーダー配列であ
ると考えられる。従って、極性が変化し得る第１の配列
は、膜の外側にあり、gBが別のタンパクに対する受容体
として、あるいはワクチン中の免疫原として作用する程
度まで、認識配列として役立つ。第２の疎水性配列は、
トランスメンブレン・インテクグレイター配列(transme
mbrane integrator sequence)（しばしば、「アンカー
(anchor)」と呼ばれる）としての役目を果たし得る。極
性が変化し得る第２のアミノ酸配列は、細胞質内に存在
すると考えられ、受容体がトランスメンブレン・インテ
クグレイター配列の外部にあるという程度まで、１つま
たはそれ以上の細胞質プロセスを変更する役目を果たし
得る。 【００４６】gBの前駆体またはその機能的な断片をコー
ドしているポリヌクレオチド配列は、適当な発現ベクタ
ーに該ポリヌクレオチド配列を挿入し、得られた発現構
築産物を適合する宿主に導入することにより、クローン
化され、そして発現され得る。コードしている断片は、
約0.1地図単位未満、通常は約0.05地図単位未満であ
る；ここで、1.0地図単位とはHSVゲノム全体の大きさで
ある。発現ベクターは、染色体外に存在するか、あるい
は宿主細胞のゲノム内に組み込まれた、低レベルまたは
高レベルのマルチコピーベクターであり得る。そして、
発現ベクターは、興味のあるポリペプチドを分泌または
排泄させるか、あるいは興味のあるポリペプチドを細胞
質内または膜内に保持させる。非常に数多くの発現ベク
ターが文献に発表されており、一般に、真核宿主で用い
るのに有用である。真核宿主には、酵母（例えば、サッ
カロマイセス・セルビシア(S. cerevisiae)）および広
範囲の永久増殖性哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、
サル細胞、ハムスター細胞（例えば、3T3、ベロ(Ver
o)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、または初
代細胞系）が含まれる。分泌が必要とされる場合には、
宿主に依存して、天然または非天然のいずれかの分泌リ
ーダー配列を用いることができる。分泌リーダー配列を
切断するプロセッシングシグナルは、天然のシグナル、
または非天然の分泌リーダー配列に関連するシグナル、
あるいはこの両方がタンデムになったものであり得る。 【００４７】gB１パットンをコードするポリヌクレオチ
ド配列を得るために、EcoRＩ制限酵素断片Ｆ上に、gB１
コード配列の位置を地図に示した。Ｆ断片の３つの副断
片が、単離され、pBR322中にサブクローン化された（図
２）。次いで、これらサブクローンのDNA断片は、HSV-1
が感染した細胞から単離したポリA+ mRNAのノーザンブ
ロットに対するプローブとして用いられた。gBに対して
予測された大きさのmRNAにハイブリダイズした断片は、
gBコード領域内に存在すると推定された。gBの転写方向
もまた、DNAプローブのどの鎖がmRNAとハイブリダイズ
したかを決定することにより明らかにされた。gB配列の
同一性を確認するために、DNA断片をハイブリッド−セ
レクトHSV-1 mRNAに対して用いた。このmRNAは、次いで
インビトロで翻訳され、得られたタンパクはgB特異的抗
体を用いてgBに関して分析された。 【００４８】gB１をコードする断片は、今日では、制限
酵素地図作成や塩基配列の決定を含む様々な方法で取り
扱われ、制限酵素切断部位や発現のためのオープンリー
ディングフレーム領域が確証される。次いで、DNA配列
は、完全なgB前駆体またはその断片をコードしている配
列を与えることに限定される。次いで、これら配列は、
適当な位置にある転写シグナルおよび適当な翻訳シグナ
ルを有する適当な発現ベクターに挿入される。これは、
突出部分を充填し、そしてアダプターなどを用いて平滑
末端結合を行うことにより達成し得る。 【００４９】増幅能力を有する遺伝子に対して遺伝子を
タンデムに導入することは特に興味深いことである。有
用な遺伝子には、メトトレキセートを用いることにより
増幅し得るジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）遺伝子
（ここで、dhfr遺伝子および隣接領域は反復してい
る）；および重金属（例えば、銅）などで増幅し得るメ
タロチオネインが含まれる。発現構築産物は、形質転
換、トランスフェクション、リン酸カルシウム沈澱など
を含むいかなる有用な手段によっても、適当な宿主に導
入することができる。次いで、宿主細胞は、特定の遺伝
子を増幅することを選択するレベルに、適当な生物毒に
よりストレスがかけられる。次いで、これら細胞は培養
され、所望のポリペプチドを有効に生産するまで増殖さ
れる。 【００５０】上述の手順に従って、HSV-2 333株由来のg
B２をコードしているポリヌクレオチド配列は、前駆体
および成熟体の両方が単離され、クローン化され、そし
て構築物を与えるために操作される。その結果、１種ま
たはそれ以上の宿主で発現し得る。gB１パットンをコー
ドする断片の有用性を考慮すると、これら断片は、特異
的HSV-2制限断片クローンヘのDNA部分をコードするgB２
の位置付け、または感染した宿主細胞由来のgB２ mRNA
の単離のいずれのプローブとしても用いられる。便宜的
には、gB１遺伝子の異なる領域をコードする複数のプロ
ーブが用いられる。このプローブにハイブリダイズする
のにおおよそ適当な大きさを有する陽性DNA断片または
豊富なmRNAのいずれもが選択される。次いで、mRNAは逆
転写されてcDNAを与えるか、および／またはHSV-2ゲノ
ムの断片とのハイブリダイゼーションに用いて、gB２を
コードしているその機能を確認することができる。必要
に応じて、gB２構造遺伝子の一部を含む１個より多くの
クローン化された断片は、適当に、全コード領域および
隣接領域を与えるために操作され、そして結合され得
る。次いで、このコード領域は発現ベクター中に導入さ
れる。 【００５１】組換え糖タンパクＤ 組換えgD１の調製は、1985年10月24日に公開された国際
公開No.WO85/04587の国際出願No.PCT/US85/00587に詳述
されている。組換えgDポリペプチドを生産するのに用い
られる材料および方法については、以下で簡単に述べ
る。組換えgD２の調製に関する詳しい記述は以下の実施
例に与えられている。 【００５２】天然に存在する糖タンパクＤと免疫学的に
交差反応を行うポリペプチドは、例えば酵母や哺乳類細
胞（例えば、CHO細胞）の真核宿主において、組換えDNA
の方法論により生産される。真核生物での生産は、真核
宿主に関連して、例えば翻訳後修飾および／または分泌
などの利点を与える。gDポリペプチドは、少なくとも約
９個のアミノ酸をコードする比較的短い合成DNA断片か
ら生産され、gDに特異的な免疫応答を誘導するのに有効
なハプテンを与える。 【００５３】gD DNA断片は、天然起源または合成起源の
ものであり得る。HSV-1の天然のgD遺伝子は、ウイルス
ゲノム上において、短い内部繰り返し（IRs）配列と、
その3'末端にある短い終結繰り返し（TRs）配列との間
に位置する。成熟タンパクをコードしているということ
は、約1.6kbpの断片がゲノムの2.9kbp SacＩ制限酵素断
片上に位置しているのを見い出せることである。成熟タ
ンパクの全コード領域は、2.9kbp SacＩ断片のうちのHi
ndIII−NruＩ断片中に位置している。天然に存在するgD
遺伝子は、修飾を受ける場合もあれば、受けない場合も
ある。遺伝子の領域は、望み通りに欠失させるか、およ
び／または他のDNA断片と結合させ得る。gD DNA断片
は、gB DNAの発現について上述したものと同様の材料お
よび手順を用いて、発現ベクターに挿入され、そして発
現され得る。天然に存在するgD遺伝子の特定断片の調
製、クローニング、および発現については、以下の実施
例において詳述する。 【００５４】以下の実施例は、例示を目的として与えら
れたものであり、限定するものではない。以下の実施例
において、第１節では組換えタンパクを生産するのに用
いられる一般的な手順について、第２節では組換えgB１
の調製について；第３節では組換えgB２の調製につい
て；第４節では組換えgD１の調製について；第５節では
組換えgD２の調製について；第６節ではgBおよびgDのポ
リペプチド混合物を用いたワクチンの研究について述べ
る。 【００５５】 【実施例】 １．材料および方法 HSV-1パットン株およびHSV-2 333株の生きた保存株は、
Dr.Richard Hyman（Hershey Medical Center, Hershey,
Pennsylvania）より入手した。これらのウイルスは、D
r.Evelyn Linnette（Viro Labs, Emeryville, Californ
ia）またはAmerican Type Tissue Culture Laboratory
より入手したベロ細胞中で増殖させ得る。この増殖は標
準的な手順に従って行われる。プラスミドpACYC184（Ch
angおよびCohen, J. Bacteriology (1978) 134：1141）
のEcoRＩ部位にクローン化されたHSV-1パットンEcoRＩ
DNA断片（Kudlerら、Virology (1983) 124：86-99）の
ライブラリーは、Dr.Hymanより得るか、あるいは簡便法
で独自に調製し得る。２つのHSV-2 333クローン、すな
わちpBR322（Sutcliffe, Nucleic Acids Research(197
8) 5：2731）のHindIII部位に挿入されたHindIII断片Ｈ
およびＬもまた、Dr.Hymanより得ることができる。 【００５６】dhfr欠損CHO細胞系は、Dr.Y.W.Kan (Unive
rsity of California, San Francisco）より得た。この
細胞系はもともと、UrlaubおよびChasin（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1980) 77：4216-4220）により記述さ
れている。非選択条件下で、これらの細胞は、10％牛胎
児血清、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイ
シン、そして150μg/ml L-プロリンを追加したハムのF-
12培地（Gibcoより入手、cat. no.176）で増殖させた。
選択培地は、10％の透析された牛胎児血清と、ペニシリ
ン、ストレプトマイシン、および150μg/ml L-プロリン
とを追加したDEMであった。メトトレキセート（MTX）選
択のために、濃縮MTX保存培地は、Lederleより得たMTX
から調製し、使用直前に上記のDME選択培地に加えた。 【００５７】1.1 クローニング すべてのDNA操作は、標準的な手順に従って行われた。M
aniatisら、MolecularCloning, CSH（1982）を参照され
たい。制限酵素、T4 DNAリガーゼ、エセリヒア・コリー
DNAポリメラーゼＩクレノー断片、そして他の生物学的
試薬は、Bethesda Research Laboratories、あるいは他
の表示した市販品供給業者から購入し、製造業者の指示
書に従って使用した。２本鎖DNAは１％アガロースゲル
上で分離し、電気溶出により単離した。 【００５８】1.2 RNAの単離，ノーザンブロット解析，
およびハイブリッド選択翻訳法 全RNAは、細胞あたり10個のウイルスという多重度でHSV
-1またはHSV-2に感染して６時間後のベロ細胞より調製
した。細胞単分子層を洗浄し、抽出緩衝液でインキュベ
ートし、そしてPachlら（Cell (1983) 33：335-344）に
よって述べられているように処理した。ポリA+ RNAは、
500mM NaCl, 10mM Tris HCl（pH7.5）、１mM EDTA、0.1
％ SDS中に入ったオリゴdTセルロース（Collaborative
Researchより得た）の３mlカラムに、２mgの全RNAを通
し、次いで100mM NaCl, 10mM TrisHCl (pH7.5)、１mM E
DTA、0.1％ SDSでカラムを洗浄し、そして10mM Tris HC
l(pH7.5)、１mM EDTA、0.1％ SDSでポリA+分画を溶出さ
せることにより調製した。 【００５９】ノーザンブロット解析を行うために、ポリ
A+ RNAを、グリオキサール（McMasterら、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1977) 74：4835-4838）で変性させ、
１％アガロースゲルの電気泳動により分別し、ニトロセ
ルロースペーパー（Thomas,同上 (1980) 77：5201-520
5）に移し、そして32Ｐ標識プローブでハイブリダイズ
させた。 【００６０】ハイブリッド選択翻訳法に用いられる方法
の詳細は、以前に記述されている（Pachlら、Cell (198
3) 33：335-344）。DNAフィルターは、gBをコードする
3.5kbのXho-Kpn断片３μg、またはHSV-1 gDをコードす
る3.0kbのSstＩ−SstＩ断片２μgのいずれかを用いて調
製した。このフィルターを、HSV-1が感染した細胞由来
のポリA+ RNA 40μgと共にインキュベートした、結合RN
Aを溶出し、網状赤血球無細胞系（Pachlら、J. Virol.
(1983) 45：133-139）で翻訳させた。翻訳産物は、12.5
％ SDSポリアクリルアミドゲル（Laemmli, Nature (197
0) 227：689）で解析した。 【００６１】1.3 DNAトランスフェクション COS ７細胞（Gluzman, Cell (1981) 23：175-182）また
はdhfr欠損CHO細胞（UrlaubおよびChasin (1980) 前
出）の形質転換は、キャリアーDNAを省略したこと以外
は、van der EbおよびGraham（Methods in Enz. (1980)
65：826-839）の手順を、ParkerおよびStark（J. of V
irol. (1979) 31：306-369）により改変された手順を用
いて行った。プラスミドDNAのリン酸カルシウム沈澱
は、250mM CaCl2中のプラスミドDNAに、これと等容量の
２倍に濃縮したHEPES-緩衝化生理食塩水（２×HBS）を
１滴ずつ加えて混合することにより調製した（１×HBS
は、0.14MNaCl、5mM KCl、0.7mM Na2HPO4、2.8mM グル
コース、10mM HEPES（pH7.0）である）。室温で約20分
間インキュベートした後、１mlのリン酸カルシウム-DNA
懸濁液（15μgのDNAを含む）を、10cmの平板上で集密度
が50％に達するまで増殖した細胞の培地へ加えた。６〜
８時間後、DNAを含んだ培地を取り除き、細胞を15％グ
リセロール−１×HBSと共に４分間インキュベートし
た。次いで、これら細胞を２日間非選択培地（F12）で
増殖させ、その後これら細胞を選択培地中に分割、すな
わち植え継いだ。10日後には、dhfr陽性の細胞コロニー
が現れ、14日後に、パスツールピペットで平板からコロ
ニーの細胞を移すことにより、これらコロニーを分離し
た。分離した細胞を増殖のためにマルチウェルの平板に
移した。 【００６２】1.4 細胞のインビボ標識および免疫沈澱 35 Ｓ−メチオニンで標識するために、細胞を3.5cmの平
板で集密的に増殖させ、PBS（0.14M NaCl 2.7mM KCl、1
5.3mM Na2HPO4）で１回洗浄し、次いでメチオニンを除
いた0.5mlの標識培地DEM（Gibcoから得たダルベッコの
修正イーグル培地、cat. no.188G）に、１％の透析され
た牛胎児血清と、400μCi/mlの35Ｓ−メチオニン（＞10
00μCi/mmol）を加えたものを、各平板に添加した。こ
れら細胞を37℃にて適当な時間インキュベートした。標
識期間の終わりには、培地を取り除き、単分子層をPBS
で１回洗浄した。「冷」メチオニンチェイス（“cold”
methionine chase）として、2.5mMのメチオニンを含むD
MEで標識培地を置き換えた。免疫沈澱を行うために、細
胞を、0.1mlの細胞溶液緩衝液（20mM Tris-HCl（pH
8）、100mM NaCl、１mM EDTA、0.5％ノニデットP40、0.
5％デオキシコール酸ナトリウム、牛血清アルブミン、
0.1％ SDS、1.0mMフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド、10mMベンズアミジン、１％アプロテニン、Sigma Ch
emical Companyより得た）中で溶解させた。細胞溶解物
を、チューブにかき集め、手早くボルテックスミキサー
にかけ、次いで４℃にて５〜10分間放置した。細胞破片
物は、遠心分離により取り除き、透明になった溶解物は
−70℃で貯蔵した。 【００６３】免疫沈澱を行うために、細胞溶解物0.1ml
は、普通血清と４℃で30分間インキュベートすることに
より予め清澄させ、次いでプロテインＡセファロース
（PAS）の20％溶液（溶解緩衝液中）50μlを加え、４℃
で30分間、静かに振盪しながらインキュベートし続け
た。PASは、14,000×gで１分間遠心分離することにより
取り除き、５μlのHSV-1ポリクローナル抗体（DAKOより
得た）またはgB特異的モノクローナル抗体F3AB（Univer
sity of South AlabamaのDr.John Oakesより得た）を加
えた。F3AB抗体を用いる場合は、溶解緩衝液から0.1％
SDSを省いた。４℃で30分間の後、75μlのPASを加え、
上述のようにインキュベートした。PAS-免疫複合体を遠
心分離により集め、BSAとプロテアーゼ阻害剤とを欠く
溶解緩衝液で３回洗浄し、0.12M Tris HCl（pH7.0）で
１回洗浄した。免疫沈澱したタンパクをSDSサンプル緩
衝液中で煮沸することによりPASから解離させ、次いで1
2％ポリアクリルアミドゲルで解析した。細胞培地から
標識タンパクを免疫沈澱させるために、培地をまず遠心
分離により清澄にし、次いで１/10容量の10倍溶解緩衝
液を加えると、タンパクが上述のように沈澱した。 【００６４】1.5 免疫螢光 COS細胞またはCHOクローンにおけるgBまたはgDの発現を
分析するために、スライドのウェル内で増殖した細胞を
PBSで３回洗浄し、100％メタノールを用いて−20℃にて
10分間固定し、続いてさらにPBSで３回洗浄し、５％ヤ
ギ血清（GS）を足したPBSで１回洗浄した。次いで、固
定された細胞を、１次抗体（PBS-５％GSで１/100に希釈
したHSV-1またはHSV-2ポリクローナル抗体）とともに37
℃にて30分間インキュベートした。次に、この細胞をPB
S-５％GSで３回洗浄し、２次抗体（PBS-５％GSで１/10
に希釈したFITC−結合ヤギ抗−ウサギIgG（カペル）と
ともに37℃にて30分間インキュベートした。PBS-５％GS
で４回洗浄した後、スライドを50％グリセロール−100m
M トリス（pH8.0）を用いてカバー片でマウントし、螢
光光学系を装備したライツ光学顕微鏡で観察した。生細
胞の免疫螢光は、細胞をPBS-５％GSでの最初の洗浄に引
き続き直ちに１次抗体とともにインキュベートしたこと
を除いては、上述のようにして行った。カバー片でマウ
ントする前に、生細胞を５％ホルムアルデヒドを含有す
るPBSで固定した。螢光染色した細胞は、コダックのエ
クタクロムフィルム（Kodac Ektachrome film；ASA40
0）を用いて写真を撮った。 【００６５】1.6 ELISA分析 CHO細胞を培養した培地中のgBタンパク濃度を、標準物
質として精製した組換えgB調製物を用いた間接酵素結合
免疫吸着分析法（ELISA）により測定した。PBSで１：10
00に希釈されたF3AB抗体50μlを、室温で１時間インキ
ュベートすることにより、96−ウェルの塩化ポリビニル
プレート（Dynatech Laboratories, Inc.）のウェルに
吸着させた。過剰な抗体をPBS-５％GSで３回洗浄するこ
とにより除去した。50μlの培地試料またはPBS-1％GSで
希釈したgBタンパク標準物質をウェルに添加し、室温に
て１時間インキュベートした。次いで、このプレートを
PBS＋１％GSで３回洗浄し、その後同じ緩衝液で１：100
0に希釈した50μlのウサギ抗HSV-1ポリクローナル抗体
（DAKOより入手）とともに３回目のインキュベーション
を１時間行った。過剰な２次抗体は、PBS＋１％GSで３
回洗浄することにより除去した。最後に、PBS-１％GSで
１：500に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤ
ギ抗ウサギ抗体（Boehringer Mannheim）の50μlを各ウ
ェルに添加し、１時間インキュベートした、次いで、ウ
ェルをPBS＋１％GSで１回洗浄し、続いてPBSで８回洗浄
した後、１mg/mlの濃度の2,2'−アジド−ジ〔3−エチル
ベンズ−チオアゾリンスルホネート〕（Boehringer Man
nheim）を0.1Mクエン酸（pH4.0）、0.003％ H2O2中に含
有する液50μlで呈色させた。この呈色反応を、５分後
に50μlの10％ SDSを添加することによって停止させ、
吸光度をマイクロタィタープレートリーダーで414nmに
て読み取った。 【００６６】gDタンパクの濃度は、標準物質として精製
した組換えgDおよびF3ABの代わりにgD−特異的モノクロ
ーナル抗体8D2（Rectorら、Infect. and Immun. (1982)
38：168-174）を使用したことを除いては、同様の方法
で測定した。 【００６７】２．糖タンパク 2.1 gB１遺伝子の分離，クローニングおよび特徴付け 糖タンパクgB１に対応する遺伝子を単離するために、HS
V-1パットン株（Patton；SkareおよびSummers, Virolog
y (1977) 76：581-595）のEcoRＩＦ制限断片の地図の座
標0.345-0.40に及ぶDNA断片を、プラスミドpBR322にサ
ブクローン化した。これらの断片は、プラスミドpACY18
4のEcoRＩ領域の適当な制限酵素消化物から調製され、T
AE緩衝液（0.04M トリス−酢酸、0.002M EDTA）を用い
た１％アガロースゲルでの電気泳動により分離され、電
気溶出された。単離された断片を、前もって適当な制限
酵素で切断し、アルカリホスファターゼで処理してある
pBR322に結合した。HSV-1の全ゲノムの制限酵素切断地
図を図１に示し、サブクローン化された領域のより詳細
な地図を図２に示す。図１を参照すると、従来の地図が
最初の２行で示されている（Roizman, 1979）。点線は
Ｌ−Ｓ連結部を示す。プロトタイプのアイソマーの配列
のEcoRＩ制限酵素切断地図を、ハッチングを施した枠で
囲むことにより示されるEcoRＩ断片Ｆとともに第３行に
示す（SkareおよびSummers, 1977；Roizman, 1979）。H
SV-2のHindIII制限酵素切断地図を、ハッチングを施し
た枠で囲んだHindIII断片Ｈとともに第４行に示す（Roi
zman,1979）。１地図単位は、HSV-1のDNAの98.9メガダ
ルトンまたは148.9kbpに相当し、HSV-2のDNAの105.6メ
ガダルトンまたは160.5kbpに相当する。 【００６８】図２を参照すると、詳細な地図ライン
（Ｉ）に示された制限酵素切断部位は次の通りである：
E, EcoRＩ; B, BamHＩ; S, SalＩ; P, PstＩ; X, XhoＩ
（DeLuccaらより, 1983）; N, NdeＩ; Xn, XmnＩ; V, E
coRV。0.355のDeLuccaらによってマッピングされたBstE
II部位は、この株では欠失しており、0.357に新しいPst
Ｉ部位が存在する。ラインIIは、gB１コード領域を含む
３つのプラスミドのサブクローンを示す。これらは、0.
345のBamHＩ部位から0.360のSalＩ部位までの範囲のpHS
106；0.36のSalＩ部位から0.388のSalＩ部位までの範囲
のpHS107；および0.345から0.40地図単位までの範囲のB
amHＩ断片である。ラインIIIはgB１のmRNAをマッピング
するために用いられる３つのプローブを示し；ラインIV
はハイブリッド選択のために用いられる断片を示し；そ
して、ラインＶはgB２遺伝子の位置を決定するために用
いられるこれらのプローブを示す（以下を参照）。これ
らの断片を作製するために用いた追加の制限酵素切断部
位は、Nc, NcoＩ; K, KpnＩ;およびA, AluＩである。 【００６９】EcoRＩ断片におけるgB１コード領域の位置
を決定するために、HSV-1が感染したベロ細胞から単離
したポリA+ mRNAのノザンブロッティングを、pHS106お
よびpHS107から単離された詳細な地図に示されたDNA断
片をプローブとして行った。pHS106から単離された0.5k
b PstＩ−SalＩ断片をHSV-1についてのプローブとして
用いたとき、検出された主な種類は３kbのmRNAであっ
た。PstＩ−SalＩ断片の約１kb上流に位置する0.49kb N
coＩ断片をプローブとして同様のブロッティングを行う
と、gB１のmRNAと推定される３kbのmRNAとのハイブリダ
イズも検出された。このことは、gB１をコードする配列
がPstＩ−SalＩ断片の少なくとも１kb上流まで延長され
ていることを示唆する。３kbのmRNAは、PstＩ−SalＩ断
片から下流の最初のXhoＩ部位よりは延長されていな
い。なぜならば、0.5kb XhoＩ−XhoＩ断片がこのmRNAと
ハイブリダイズしないからである。gB１転写単位の転写
の方向は右から左（3'←5'）であり、このことはPstＩ
−SalＩおよびNcoＩ−NcoＩ断片の5'−3'の方向の鎖の
みが３kb gB１ mRNAにハイブリダイズすることにより証
明される。 【００７０】ハイブリッド選択翻訳は、HSV-1ポリA+ mR
NAを3.2kb KpnＩ−XhoＩ断片（gB１コード領域として示
される領域を含む）とハイブリダイズさせることにより
行った。結合したmRNAを溶出し、インビトロで翻訳させ
たとき、HSV-1感染ベロ細胞由来のgB１と同様の大きさ
の100kdタンパクが検出された。この100kdタンパクの同
定の確認は、gB１−特異的モノクローナル抗体と免疫沈
降することより行われた。KpnＩ−XhoＩ断片を用いたハ
イブリッド選択により、その他のいくつかのタンパクも
検出されたが、おそらくこれはDNAのG＋C含有量が高い
ためにおこったmRNAの非特異的なハイブリダイズの結果
である。HSV-1糖タンパクgDをコードする3.0kbのSstＩ
−SstＩDNA断片を用いて同じRNAを選択すると、同様の
タンパクのパターンが観察されたが、100kdのgBタンパ
クは検出されなかった。この結果は、gBがKpnＩ−XhoＩ
断片に特異的であることを示唆する。 【００７１】図３は、0.345地図単位のBamHＩ制限酵素
切断部位から0.373地図単位のXhoＩ部位までの、3.95kb
DNA断片の制限酵素切断地図を示す。gB１オープンリー
ディングフレームは枠で囲んで示されており、転写の方
向は図示されているように右から左へである。実際のコ
ード領域は、地図単位0.348から0.367までである。BamH
Ｉ部位から3,640番目の唯一ではないAluＩ部位までのDN
A配列を示し、AluＩ部位は（Ａ）で示す。図示されてい
る制限酵素切断部位は、B, BamHＩ; B1, BalＩ; Bs, Bs
tEII; K, KpnＩ; Nc, NcoＩ; P, PstＩ; Pv, PvuII; S,
SalＩ; Sc, SacＩ; X, XhoＩ; Xm, Xma３を含む。右側
に示すAluＩ部位から末端のXhoＩ部位までの制限酵素切
断部位は示されていない。生産されたgB１タンパクのグ
リコシル化の可能性がある部位および疎水性アンカーお
よびシグナル領域（枠で囲い塗りつぶした部分）が示さ
れている。 【００７２】BamHＩ部位からヌクレオチド残基の3,640
番目の唯一ではないAluＩ部位までのDNA配列を、Sanger
のM13ジデオキシヌクレオチド合成法を用いて決定し
た。コード領域の両DNA鎖を配列決定した。完全なDNA配
列が、並べた制限酵素切断断片から集められ、このよう
にして該配列は診断片全部を通して読み取られる。図４
〜図７は、gB１のDNA配列を示し（第３行）；gB１に対
する予想アミノ酸配列は、DNA配列の下に示す（第４
行）。 【００７３】図４〜図７に示したgB１に対応するアミノ
酸配列およびDNA配列は、国際特許公開第WO85/04587号
（1985年10月24日公開）の表１に初めて示された配列と
は異なる、ということは注意すべきである。この表１の
中のDNA配列には誤りがあり、配列の607番目の位置にヌ
クレオチド（G）が付け加えられている。図４〜図７で
はこのヌクレオチドは削除されており、この図は正しい
DNA配列を示す。上記表１中のアミノ酸配列は、その中
に示されている誤ったDNA配列から推定されたものであ
り；上記付け加えられたヌクレオチドによりリーディン
グフレームが変わっているため、該表１に示された配列
は正しくない。図４〜図７は正しいDNA配列に基づいた
アミノ酸配列を示し；図４〜図７のアミノ酸配列は、gB
１のＮ−末端領域のアミノ酸配列決定により確認されて
いる。この推定アミノ酸配列における変化は、疎水性お
よび親水性の領域の推定された位置、およびgB１分子内
のグリコシル化部位に関する訂正も結果する。正しい配
列に基づいた推定アミノ酸配列を、該配列の下に示す。 【００７４】22bpのオリゴヌクレオチド（残基473-49
4）を用いたプライマー延長は、gB１のmRNAの5'末端が
残基188に位置することを示した。CATおよびTATA転写調
節シグナルは、残基55-62および125-131であると推定さ
れる。残基438-440のATGから開始し、TGA停止コドンで
終結する、2712個のヌクレオチドのオープンリーディン
グフレームが存在する。２つの推定されるポリアデニル
化シグナルが、残基3166-3173および3409-3416の3'側の
非コード領域に位置している。 【００７５】記述されたアミノ酸配列は膜タンパクの特
徴を示す。カルボキシ末端近くのアミノ酸残726から795
番目までの範囲の非常に疎水性の領域が存在し、69個の
アミノ酸は膜に結合し得る。Ｎ−末端における最初の30
個のアミノ酸は主に疎水性である。この疎水性アミノ酸
ドメインは、荷電したアミノ酸または親水性のアミノ酸
が高度に集中した領域の前にある。Ｎ−末端の親水性の
配列は分泌リーダーまたはシグナル配列として働き、該
配列の次に分泌リーダーの切断および除去のためのプロ
セッシングシグナルがある。Ｃ−末端近くの疎水性の領
域は、タンパクを細胞膜に結合するためのトランスメン
ブレン・インテグレーション配列として作用できる。 【００７６】配列のデータは親水性の外部ドメイン内の
asn-X-thr/ser配列（図３も参照のこと）により定義さ
れるような９個の可能性のあるＮ−結合型グリコシル化
部位が存在することも示唆する。もしも最初の30個のア
ミノ酸がプロセッシングにより除去され、可能性のある
各Ｎ−結合型グリコシル化部位が部位あたり平均２kdの
炭水化物を付加するのに利用されるならば、成熟タンパ
クの分子量は約123kdとなる。 【００７７】2.2 哺乳動物細胞におけるgB１の発現 哺乳動物細胞でgB１を発現させるために、dhfrを欠くCH
O細胞にプラスミドpHS112およびpHS114を導入して形質
転換させた。この形質転換は、材料および方法に記述し
たようなカルシウム沈澱法を用いて行った。プラスミド
pHS112およびpHS114で形質転換したE.coli HB101株は、
ATCCに寄託されており、それぞれ受託番号39650および3
9651で受託されている。これらの株の構築は、国際特許
公開第WO85/04587号（前出）に記載されている。形質転
換された細胞は、チミジン、プリンおよびグリシンを欠
いた選択培地を用いて選択した。細胞は、パスツールピ
ペットで取り出すことにより単離し、複数のウェルを持
つプレートで増殖させた。多数のクローンが単離され、
該クローンはHSV-1ポリクローナル抗体またはgBに特異
的なモノクローナル抗体を用いた免疫螢光および放射性
免疫沈降によりgBを生産することが示された。３個の細
胞クローンpHS112-1、pHS112-9およびpHS112-23が単離
され、該クローンは細胞内にある形の完全なgBタンパク
を合成した。これら細胞で生産されたgBは、グリコシル
化されていると考えられる。なぜならば、１時間パルス
標識し、続いて５時間チェイスした後に、チェイスを行
わなかった細胞に比べてより大きな分子量の形が検出さ
れ得、約10％のgBが培地中に分泌されたからである。不
完全なgBを発現する５個の細胞クローン（pHS114-5、pH
S114-6、pHS114-7、pHS114-11およびpHS114-12）も分析
され、やはり培地中にいくらかのgBを分泌することが示
された。これらの細胞系の１つであるpHS114-7は、MTX
でさらに増幅するために選択された。クローンは最初は
0.01、0.05、0.10および0.3μM MTXで選択された。免疫
螢光分析で検出すると高レベルのgBを合成する３個のク
ローンが、0.3μM MTXで選択されたものから単離され
た。放射性免疫沈降により、これらのクローンpHS114-
0.3μM-6、23および25は、35Ｓ−メチオニンで１時間標
識している間に、増幅しなかったクローンpHS114-7より
も２〜３倍多くのgBを合成する。パルスチェイス実験
は、１時間のパルスの間にこれらのクローンで合成され
るgBの少なくとも８％が、５時間で細胞外に分泌される
ことを示す。 【００７８】発現は、発現ベクターpHS137を用いても行
われた。このベクターの地図を図９に示す。プラスミド
pHS137は、シグナル配列の切断後の長さが690個のアミ
ノ酸である不完全なgB１タンパクをコードする。 【００７９】pHS137は、pHS108（2.1章で記述した）をX
hoＩおよびBamHＩで分解し、続いて、得られた3.5kd断
片を単離することにより構築した。この断片の末端はク
レノーで平滑末端とした。この平滑末端とされたXhoＩ
−BamHＩ断片をPVUIIで部分分解し、ゲルで2098bpのバ
ンドとして移動したDNAを該部分分解物から単離した。
単離されたXhoＩ−PVUIIバンドを、前もってSmaＩで分
解されているpSV7dに連結し、得られたDNAをE.coliを形
質転換するのに用いた。得られた細菌クローンを、gB１
インサートが適当な方向で挿入されているプラスミドに
ついてスクリーニングした。 【００８０】発現を得るために、pHS137をプラスミドpA
Ddhfrとともにdhfr欠損CHO細胞に導入して形質転換させ
た。得られたクローンはgB１を生産し、分泌した。この
ようなクローンの１つであるpHS137-7-B-50は、10mlの
完全培地を入れたT75培養フラスコ中で、24時間に1-3×
107細胞あたり6.91＋/−1.53μg/ml gB１タンパクを生
産した。 【００８１】３．糖タンパクＢ２ gB２遺伝子の単離、特徴付け、およびクローニングは、
国際特許公開第WO85/04857号（前出）に記載されてい
る。 【００８２】3.1 哺乳動物細胞でのgB２の発現 HSV-2糖タンパクgBの発現は、pHS210単独で形質転換す
るか、またはpHS210とともに同時形質転換することによ
り、COS細胞（一時的な発現）で行われる。この２番目
のプラスミドはdhfrを含む。 【００８３】プラスミドpHS210は以下のようにして構築
した；全gB２遺伝子を3.8kb NruＩ−BamHＩ断片としてp
BR322にサブクローン化し、pHS208を作製した。図１０
を参照のこと。遺伝子の5'末端のPstＩ部位（NruＩ部位
の100bp右(下流)）を、M13でのインビトロでの変異によ
りHindIII部位に変えた。次いで、1.9kbのHindIIIからP
vuIIまでの断片を、pSV1/dhfrをHindIIIおよびBglIIで
分解することにより得られるpSV1に挿入した。図１０を
参照のこと；pSV1/dhfrは、PCT国際特許公開第WO85/045
87号に記載されている。このクローニング工程のため
に、pHS208をPvuIIで切断し、末端を平滑末端に修復し
た。次いで、この分子をHindIIIで切断し、1.9kb HindI
II−(PvuII) 断片をゲル電気泳動により単離した。同様
にpSV1/dhfrをBglIIで切断し、平滑末端に修復し、Hind
IIIで切断し、ゲル電気泳動により4.85kb HindIII−(Bg
lII)ベクター断片を単離した。これら２つの断片（1.9k
bおよび4.85kb）を、発現ベクターであるpHS210（図１
０）を作製するために連結した。 【００８４】プラスミドpHS210は、直接にCOS細胞を形
質転換するのに用いた。発現は、１次抗体スクリーニン
グ用として、gB特異的モノクローナル抗体であるF3ABお
よび市販のポリクローナル抗体であるHSV-2抗体（DAK
O）も用いた、免疫螢光分析により検出された。gB２の
培地への分泌は、gB２−特異的ELISA分析により検出さ
れた。この目的のために、プレートをモノクローナル抗
体でコートした。細胞培養培地試料をコートしたプレー
トに添加し、次いで結合したgB２を、ウサギ抗HSV-2ポ
リクローナル抗体（DAKO）に続いて西洋ワサビ結合ヤギ
抗ウサギIgGを用いて検出した。 【００８５】CHO細胞形質転換のためのプラスミドpHS21
0は、同時形質転換プロトコルでは、選択マーカとしてd
hfrを含む第２のプラスミドとともに用いられた（図１
０）。選択培地で続いて形質転換および増殖させること
により、約100個のdhfr+クローンが単離され、ELISA分
析（ELISAプレートはF3AB特異的モノクローナル抗体で
コートされている）を用いてgB２の合成および分泌につ
いてスクリーニングされた。gB分泌のレベルが最も高い
クローンpHS210 #3-1は、さらにgB２ポリペプチドの特
徴について選択された。gB２タンパクは、〔35Ｓ〕−メ
チオニンで標識し、続いて放射性免疫沈降を行うことに
より検出された。１時間パルス後、79kdおよび84kdのポ
リペプチドに相当する２つの拡散したバンドが細胞内で
検出された。これらのタンパクは、637残基の不完全な
遺伝子産物について推測された大きさよりも68,991ダル
トン大きく、該タンパクは部分的にグリコシル化された
前駆体に相当すると推測された。５時間チェイスした
後、細胞内にgB２は検出されなかった。そして、89kdの
ポリペプチドが培地中に検出された。クローンpHS210 #
3-1の培地中に分泌された成熟型の大きさの完全なグリ
コシル化されたgB２は、pHS4-6により分泌された100kd
のgB１よりもいくぶん小さかった。これは、gB１プラス
ミドに含まれる94アミノ酸に対応するコード配列が、pH
S210から除去されたためである。 【００８６】４．糖タンパクD１ 4.1 gD１の哺乳類発現ベクターの構築 pBR322のEcoRＩ部位にクローン化したパットン株のHSV-
1のEcoRＩ断片のライブラリーは、Dr.Richard Hyman, H
ershey Medical Center, Hershey, PAにより作製され
た。gD１遺伝子は、このライブラリーのクローンＨのEc
oRＩ断片内の2.9kb SacＩ断片中に完全に含まれてい
る。15kb EcoRＩ挿入物を含むクローンＨはDr.Hymanか
ら得た。この2.9kb断片をゲル電気泳動で精製し、次にH
indIIIとＮｃｏＩとで完全分解した。７４ｂｐの5'非翻
訳配列とアミノ末端20アミノ酸をコードする60bpとから
なるgD遺伝子の5'末端を134bpの断片としてゲルから単
離した。gD遺伝子の3'末端は、pHYS119（国際公開No.WO
85/04587（前出）を参照されたい）を、NcoＩとSalＩと
で分解し、873bp断片を単離することにより得られた。
これらの２断片（5'末端および3'末端）をあらかじめHi
ndIIIおよびSalＩで分解したプラスミドpUC12と連結し
た。pUC12ベクターは、PharmasiaおよびP-L Biochemica
lsから市販されており、得られたプラスミドはpHS131と
名付けた。プラスミドpHS131をHindIIIで分解し、5'側
の４塩基対の突出部をクレノーポリメラーゼで充填し、
次にSalＩで分解した。gD遺伝子を含む1007bp断片をゲ
ル単離し、そしてあらかじめSmaＩおよびSalＩで切断し
たプラスミドpSV7dに連結した。このプラスミドpSV7dに
ついては以下に述べる。得られた発現ベクターはpHS132
と名付ける。その誘導は図１１に概略を示す。 【００８７】このプラスミドは、完全なタンパクの合計
399個のアミノ酸のうちの25個のアミノ酸のシグナル配
列を含むgD１タンパクの315個のアミノ酸をコードす
る。このタンパクはカルボキシル末端で切断されてお
り、疎水性の膜アンカードメインと細胞質ドメインとを
含む84アミノ酸を欠いており、得られたタンパクは培地
に分泌される。 【００８８】プラスミドpSV7dを以下のように構築し
た：SV40の複製起点と初期プロモーターを含む400bpのB
amHＩ／HindIII断片を、SVgtＩ（Mulligan, R.ら、J. M
ol. Cell Biol. (1981) 1：854-864）から切り出し、そ
して精製した。SV40のポリＡ付加部位を含む240bpのSV4
0 BclＩ／BamHI断片を、pSV2／dhfr（Subramaniら、J.M
ol. Cell Biol. (1981) 1：854-864）から切り出し、そ
して精製した。これらの断片を下のリンカー： 【００８９】 【化９】 【００９０】により融合させた。このリンカーは３つの
全ての読み取り枠での停止コドンと共に５つの制限部位
を含む。得られた670bp断片（SV40の複製起点、SV40の
初期プロモーター、停止コドンを有するポリリンカー、
およびSV40のポリアデニル化部位を含む）を約1.5kbが
欠失したpBR322誘導体（LuskyおよびBotchan, Cell (19
84) 36：391）であるpMLのBamHＩ部位にクローン化し、
pSV6を得た。pSV6のpML配列内のEcoRＩおよびEcoRV部位
を、EcoRＩおよびEcoRVで分解することにより除去した
後、各末端の約200bpを除去するために、Bal31ヌクレア
ーゼで処理し、最後に再連結してpSV7aを得た。Bal31切
除により、EcoRV部位から約200bp離れたSV40領域に隣接
する１つのBamHＩ制限部位を除去した。SV40領域に隣接
する第２のBamHＩ部位を除去するために、pSV7aをNruＩ
で分解した。この酵素はpML配列を複製起点の上流で切
断する。これを平滑末端連結により再環化させ、pSV7b
を得た。 【００９１】pSV7cおよびpSV7dは連続したポリリンカー
置換物を意味する。まず、pSV7bをStuＩおよびXbaＩで
分解した。次に、以下のリンカーをベクターに連結さ
せ、pSV7cを得た： 【００９２】 【化１０】 【００９３】その後、pSV7cをBglIIおよびXbaＩで分解
し、以下のリンカーと連結させ、pSV7dを得た： 【００９４】 【化１１】 【００９５】4.2 gD１の哺乳類細胞での発現 プラスミドpHS132のgD１発現は多くの実験で示されてい
る。第１に、前述の方法を用い、かつ検出に市販の対HS
V-1ウサギ血清（DAKO）を用いて感染させた後、特異的
免疫螢光が、COS７細胞で観察された。第２に、gD１を
分泌する安定なCHO細胞系が確立された。発現レベルはE
LISAで分析され、パルス標識し、チェイスした細胞溶解
物と培地との放射免疫沈降により確認された。第３に、
gD１がCHO細胞系D64のローラーボトル培養の培地から、
硫安沈澱、免疫アフィニティークロマトグラフィー、お
よび限外濾過という一連の工程により精製された。アフ
ィニティークロマトグラフィーには、Rectorら (1982)
（前出）に記載のgDモノクローナル抗体8D2を臭化シア
ン活性化セファロース4Bに結合させたものを用いた。 【００９６】５．糖タンパクD2 5.1 gD2の哺乳類発現ベクターの構築 HSV-2の333株のHindIII断片は、文献（Kudlerら、Virol
ogy (1983) 124：86-99）に示されているように、Dr.Ri
chard HymanによりpBR322にクローン化された。糖タン
パクgD２の遺伝子は、Ruyechanら、J. Virol. (1970) 2
9：677-697により、0.90〜0.945地図単位間のウイルス
の短い特異領域に地図化されている。HindIIIＬ断片の
占める領域は、Roizman, B., Ann. Rev. Genet (1979)
13：25-27のゲノム地図に示されている。gD２遺伝子のD
NA配列が、Watson, Gene (1983) 26：307-312により報
告されている。 【００９７】pBR322にクローン化されたHindIII Ｌ断片
を、Dr.Richard Hymanから入手し、図１２のＡに示す制
限地図を決定した。gD２の遺伝子はgD１をコードする2.
9kbSacＩ断片をプローブとしてHindIII Ｌ断片の制限酵
素分解物をサザンブロットすることにより、2.4kb Xho
Ｉ断片上に存在することが見いだされた。XhoＩ断片の
地図とgD２遺伝子の位置とを図１２のＢに示す。この2.
4kb XhoＩ断片をXhoＩ部位を含むpBR322誘導体ベクター
にクローン化し、プラスミドpHS204を得た。３つの異な
るgD２発現ベクター、プラスミドpHS211、pHS212、およ
びpHS213を次のように構築し、模式図を図１３に示し
た。プラスミドpHS211はシグナル配列を含むgD２の初め
の305個のアミノ酸をコードする。その構築には、pHS20
4をSmaＩおよびBamHＩで切断し、２つの制限断片をゲル
から単離した：5'非翻訳配列の82bpを含む該遺伝子の5'
末端を含む250bp SmaＩ断片、および該遺伝子の内部を
含む3'隣接の746bpのSmaＩ−BamHＩ断片。哺乳類細胞発
現ベクターpSV7d（第4.2節に記載）をEcoRＩで切断し、
5'の４bpの突出部分をクレノーポリメラーゼで平滑末端
にし、次いでBamHＩで切断した。pHS204の２断片を分解
されたpSV7dに連結し、そして細菌の形質転換体からSma
Ｉ断片が正しい方向に入っているものを選択し、ベクタ
ーpHS211を得た。 【００９８】gD２の352個のアミノ酸およびpHS211に存
在する遺伝子を越える付加的な47個の残基をコードする
プラスミドpHS212を、pHS204のHaeIIでの分解、そして
クレノーポリメラーゼでの末端平滑化、およびBamHＩで
の分解により構築した。（HaeII）（括弧は末端が充填
されていることを表わす）からBamHＩまでの141bpの断
片をゲル単離した。プラスミドpHS211をE.coli GM272株
に導入し、プラスミドDNAを調製し、それを次にBclＩで
分解後、クレノーポリメラーゼで平滑化し、そしてBamH
Ｉで分解した。大きいベクター断片（約3.4kb）をゲル
単離し、141bp(HaeII)−BamHＩ断片に連結し、プラスミ
ドpHS212を得た。gD２配列とプラスミドベクター配列
の、該遺伝子の3'末端側での融合により、gD２遺伝子の
3'末端側にナンセンスDNAの27コドンが付加される。こ
れらのナンセンス配列を除去するために、プラスミドpH
S213を、pHS211のSalＩでの部分分解、１ヶ所切断され
たプラスミドのゲル単離、次いでクレノーポリメラーゼ
での平滑化およびBamHＩでの分解、により構築した。pH
S204の（HaeII）からBamHＩの141bp断片を、線状化した
pHS211に連結し、プラスミドpHS213を得た。 【００９９】5.2 哺乳類細胞におけるgD２の発現 哺乳類細胞におけるgD２の発現は、pHS211、pHS212およ
びpHS213でCOS７細胞にトランスフェクトすることによ
り、一過性の発現についてまず分析した。gD２の発現
は、免疫螢光、およびCOS７が培養された培地の捕捉ELI
SA分析、の両方法により、免疫螢光に対してはウサギ抗
HSV-2抗体を用いて、そしてELISAにおける捕捉抗体につ
いては、gD型の共通抗体である8D2（Rectorら（1982）
前出）を用いて検出した。 【０１００】次に、Ad dhfrを有するプラスミドpHS211
またはpHS213でトランスフェクトし、dhfr獲得について
選択し、gD２の発現についてERISA分析でスクリーニン
グすることにより、永久CHO細胞系を確立した。 【０１０１】Ad-dhfrの記述：dhfr遺伝子を持つプラス
ミドを、アデノウイルス−２由来の主要好気プロモータ
ー（Ad-MLP、地図単位16〜17.3）を5'末端でマウスdhfr
cDNAに融合させることにより構築した。SV40小ｔ抗原
に対するイントロンとSV40初期領域ポリアデニル化部位
とをコードするDNAを、SouthernおよびBerg, J. Mol. A
ppl. Genet. (1982) 1：327-341に記載されているpSV2-
neoより得て、dhfr cDNAの3'末端に融合させた。これら
３つの断片をpBR322にサブクローン化し、プラスミドAd
-dhfrを得た。このプラスミドは、KauhmanおよびSharp,
Molec. and Cell Biol.,(1982)2：1304-1319に記載さ
れているdhfrプラスミドと機能的には同様である。 【０１０２】６．gB−gDワクチンを用いた治療的処置 6.1 一次感染後に投与した組換えHSV糖タンパクワクチ
ンがモルモットの再発性ヘルペス疾患に及ぼす効果 雌のハートレイモルモットの膣内に、第１日目に５×10
5pfu HSV-2 MS株を接種した。これら動物を、アシクロ
ビール（５mg／ml）を飲料水に加えることにより、第１
〜10日目において処置した。アシクロビールは、一次感
染の症状を軽減し、従って２次的な細菌感染の発生、お
よび生殖器の傷の発生を減少させる。一次感染中におけ
るアシクロビールの使用は、モルモットに対する処置を
停止した後の疾患の経過には影響がないことが示されて
いる（Bernsteinら、Virology, (1986) 67：1601）。一
次感染から回復した後、これら動物を、HSV-2全糖タン
パク調製物（gP2）で免疫化し、組換えgB１およびgD１
の混合物（HSV-1 gB＋gD）で免疫化するか、あるいは処
置しなかった。処置グループを下に示している。 【０１０３】グループ 処置 投与量 アジュバント 経路 Ｎ Ｉ なし なし なし なし 11 II HSV-1 gB＋gD 25μg＋25μg フロインド 足蹠 11 III gP2 50μg フロインド 足蹠 11 IV 対照アジュバントのみ なし フロインド 足蹠 9 後方の足蹠にワクチンを注射することにより、第21日目
と、さらに第42日目に動物を免疫化した。組換えタンパ
クgB１およびgD１の両方を、前述のように哺乳類細胞に
おいて生産した。結果は表１および図１４に報告する。 【０１０４】これらの結果は、再発性ヘルペス疾患のパ
ターンがＩ群およびIV群について同じであったことを示
しており、それ故にこれらの群を分析用にプールした
（対照，ｎ＝20）。 【０１０５】表１および図１４に示されている結果は、
組換え糖タンパクによるワクチン接種が疾患の再発頻度
に対して顕著な影響を及ぼすことを示している。加え
て、gB＋gDの組み合わせは天然の糖タンパクの混合物よ
り優れている。 【０１０６】特定の時間内に起こる病害日数により測定
した疾患の再発率は、再発エピソードの頻度と持続期間
との両方を考慮する評価である。図１５のＡは、ヘルペ
ス疾患が認められた週あたりの平均日数として表されて
いる再発性ヘルペス疾患の感染率を示している。免疫化
したグループは、gBgDおよびgD-2でワクチン投与された
動物の両方を含む。図１５のＡに示されているように、
疾患の再発率（週あたりの病害日数）は、評価期間が最
初の感染から遠ざかるにつれて、全てのグループで低下
したが、低下率はワクチン投与した動物では大きかっ
た。対照動物と免疫化した動物との間における再発性ヘ
ルペス疾患の感染率の差を図１５のＢに示す。図１５の
Ｂから明らかなように、糖タンパクによる免疫化が疾患
の再発率に及ぼす効果は、図１４より推論されるよう
に、２回目の投与後よりもむしろ１回目の免疫化投与に
続いて確立されているようであった。 【０１０７】 【表１】 【０１０８】6.2 一次感染後に投与した組換えHSV糖タ
ンパクワクチンが宿主の免疫応答に及ぼす効果 感染後の糖タンパク投与が宿主の免疫応答に及ぼす効果
は、感染した動物によって生産される抗HSV抗体を、感
染前と、HSV糖タンパクワクチンで免疫化した後とに測
定することにより、決定された。 【０１０９】6.1節で述べたように、これら動物にHSV-2
ms株で接種し、アシクロビールで処置し、そしてHSV糖
タンパクワクチンで処置した。これら動物から血清を第
41日目と第95日目に集めた。血清中の抗HSV抗体は、本
質的にはPachl,C.ら、J ofVirology (1987) 61：315-32
5に記載されているように、1.6節に述べた方法である、
ELISAにより測定した。捕捉抗原には、HSV-1糖タンパク
混合物（gP-1）、HSV-1糖タンパクＤ（gD-1）、あるい
はHSV-2糖タンパクＤ（gD-2）が含まれていた。 【０１１０】HSV糖タンパクワクチン投与が抗HSV抗体の
力価に及ぼす効果は、データが幾何平均で表されている
表２に示されている。抗体は、HSV接種前に集めた血清
中には検出されなかった。表２に見られるように、未処
置の対照動物では、抗HSV抗体の力価は第95日目よりも
第41日目の方が大きかった。それとは対照的に、糖タン
パクで処置した動物は、一般的に第95日目までずっと高
い力価を示していた。またHSV糖タンパクでワクチン接
種すると、未処置の対照に比べて抗HSV抗体の力価が顕
著に増加した（P<.05）。さらに、gP-2混合物での処置
は、抗体の力価が1.4〜７倍上昇したが、組換えHSV-1 g
BgDワクチンでの処置は、対照値に比べて力価が９〜31
倍上昇した。このように、HSV糖タンパクを動物に投与
すること、特に組換えHSV糖タンパクgBgDを投与するこ
とは、宿主の免疫応答を増加させ、そして6.1節に示し
たように、再発性HSV疾患の頻度および症状を軽減す
る。 【０１１１】 【表２】 【０１１２】6.3 gD１を含むHSV糖タンパクワクチンに
より誘導された免疫応答におけるアジュバントの影響 いくつかのアジュバントを、HSV糖タンパクワクチンに
よる免疫治療処置におけるその影響を調べるために試験
した。試験を行なったアジュバントは、完全フロインド
アジュバント（CFA）、水酸化アルミニウム、およびN−
アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル
−L−アラニン−2−(1'−2'−ジパルミトイル−sn−グ
リセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミ
ン（MTP−PEと呼ばれる）であった。 【０１１３】アジュバントの影響は、gD１を含むワクチ
ン（これはまた、種々のアジュバントを含む）を投与し
た後の抗gD１抗体量を測定することにより調べられた。
gD１のみを含むワクチンは、gBgDを含むワクチンのモデ
ルとして働く。なぜなら、アジュバントの影響は、ワク
チン中のHSV糖タンパクの型に特異的であるようには考
えられないためである。 【０１１４】以下の研究において、gD１をpHS132から合
成し、4.2節に記載されているように、単離した。雌の
モルモットに、35μgのgD１と種々のアジュバント組成
物とから成る混合物を３週間間隔で３回にわたり足蹠か
ら投与し免疫化した。２回目の免疫化の１週間後、そし
て３回目の免疫化の１，５，９および13週間後に、動物
から採血し、そして抗gD力価を、1.6節に述べたようにE
LISAにより決定した。 【０１１５】次に示す結果により、試験したアジュバン
トのうちで最も有望なのはMTP-PEであることが示唆され
る。なぜなら、MTP-PEは実験動物中で高い抗gD１力価を
恒常的に生産するためである。力価についてはCFAほど
は長期間保持されなかったが、これらのレベルはCFAに
ついて見られたものと同等であった。 【０１１６】6.3.1 CFAと水酸化アルミニウムとの比較 動物を、gD１とCFAまたは水酸化アルミニウムのいずれ
かとを含むワクチンで免疫化した。抗gD力価におけるア
ジュバントの影響を表３に示す。表３ではデータを幾何
平均で表している。表５に見られるように、最も効果的
なアジュバントはCFAであった。最も長く持続し最も高
い抗体力価は、CFAワクチンで免疫化した群に見られ
た。他のアジュバントの影響を、CFAで得られた力価に
比較した割合（パーセント）として示す。10％水酸化ア
ルミニウム懸濁液をアジュバントとして用いることによ
り、最も低い抗gD１力価が得られた。 【０１１７】 【表３】 【０１１８】6.3.2 CFA，nor−MDP，およびMTP-PEの比
較 動物を、gD１と、CFA、nor−MDP、およびMTP-PEのうち
のいずれかとを含むワクチンで免疫化した。MTP-PEをリ
ポソームにカプセル化し、そしてこの後者のアジュバン
トを、外因性のgD１とともに、そして、リポソームに取
込まれたgD１とともに、投与した。リポソームは、合成
ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびMT
P-PE（またはMTP-PEおよびgD１）を、懸濁媒体（滅菌し
たCa++およびMg++塩を含まない等張ダルベッコ緩衝液、
pH7.2）中に175：75：1の割合加え、ボルテックスによ
り撹拌することにより調製された。表４に見られるよう
に、CFAを含むワクチンでの免疫化により最も高い抗gD
１平均力価を得た。nor-MDPで得られた力価は、CFAで免
疫化した群で得られた平均力価の44から74％の範囲であ
った。MTP-PEおよび外因性gD１で得られた平均力価は、
nor−MDPで得られたものよりもいくらか低く、CFAで得
られたものの32から72％の範囲であった。MTP-PEおよび
リポソームでカプセル化されたgD１で得られた力価が非
常に低いのは、カプセル化された形のgD１のレベルが非
常に低いためであり得る。カプセル化されたgD１の投与
量は外因性のgD１の投与量の約７％のみであった。この
低い投与量は、リポソーム中へのgD１の取込みが、非常
に低い効率であることに起因するものであった。この非
常に低い取込みは、抗原のサイズにより引き起こされ得
る。リポソームの他の処方によれば、抗原をさらによい
効率で取込むことができた。 【０１１９】 【表４】【０１２０】6.3.3 MTP-PEを含む異なる処方物の比較 動物を、高油性デリバリー系（スクアレン／アルラセ
ル）中のMTP-PEで処方されたワクチン、および低油性デ
リバリー系中のMTP-PEで処方されたワクチンを含むgD１
で免疫化した。油性度の低いMTP-PE処方物は、４％のス
クアレンおよび0.008％のTween80を含んでいた。これら
のアジュバント処方物で得たgD１抗体力価を表５に示
す。 【０１２１】表５に見られるように、MTP-PE処方物は、
オイル−界面活性剤の割合の低い処方物中の唯一の成分
として用いたときでさえも、アジュバントとして効果的
であった。［それは、RIBI中のCWS成分の効果的な代替
物でもあったし、さらにRIBIと比較してもその効果は時
間とともに増大した。３回目の採血時に、MTP-RIBIで得
られた力価はRIBIで得られたものの２倍であった。］１
回目の採血後、MTP-PE低油性処方物は、高油性デリバリ
ーシステム（スクアレン／アルラセル）よりも高い力価
を示した。 【０１２２】 【表５】 【０１２３】6.4 治療的研究：モルモットの再発性ヘ
ルペス病予防に効果的なワクチンにおけるアジュバント
の影響，投与部位，および投与時期 gBgDワクチンは、SDS-PAGEにより判断するとおよそ70−
80％の単一性にまで精製した組換えgB１およびgD１のそ
れぞれ25μgを含む。組換えgB１タンパクは、pHS113-9-
10-21およびpHS137-7-B-50セルラインから調製したgB１
の50：50の混合物であった。これらのセルラインは、ベ
クターpHS113およびpHS137をそれぞれ保有するCHOセル
ラインである。pHS113およびpHS137の調製については、
2.2節に記載されている。gBタンパクは、Pachlら、J of
Virology, 61：315-325（1987）に記載されているよう
に精製され、このことについては2.2節に記載されてい
る。アフィニティークロマトグラフィーによる精製中に
おいて、C4D2の代わりに8D2を用いたこと以外は、4.2節
に記載されているように、gD１を調製した。 【０１２４】この実施例においては、２つのアジュバン
ト、nor-MDPおよびCFAの効果を比較している。アジュバ
ントnor-MAPを、50％スクアレン／アルラセルおよび抗
原で乳化し、50μg／投与で用いた。 【０１２５】本研究はまた、２つの投与経路についても
比較を行なっている。つまり、足蹠内投与と、筋肉内ま
たは皮下投与との比較を行なっている。最後に、モルモ
ットでの再発性ヘルペス病の予防における投与の種々の
時間を比較している。実験計画を表６に示す。 【０１２６】 【表６】【０１２７】体重350〜400gの雌のハートレイモルモッ
トに、第１日目に5.7／log10pfuのHSV-2 MS株を膣内に
植菌した。膣内植菌24時間後に収集した膣からの清拭試
料からHSVを回収することにより、動物が感染している
ことを確めた。一次感染の医療経過を、Stanberryら、J
Infec Dis (1987) 155：914で述べられているように、
生殖器の皮膚の病変により、追跡し、定量化した。一次
感染より回復後、動物を表10に示してあるような処理群
に無作為化した。急性の疾病が消散後、11日目から100
日目までの間、疾病の再発の徴候について、動物を毎日
調べた。疾病日は、再発した疾病が観察された日として
定義し、重症の再発は１個を越える数の水泡が認められ
た日であり、そしてエピソードは、病変のない日に続い
て新しく疾病が発生することを示す。 【０１２８】第22日から第76日の間の動物の分析より得
た結果を表７に示す。表９のデータにより、IM注射にお
いて、nor-MDPが効果的なアジュバントであることが示
唆される。これは、疾病全日数がより低いこと、重症の
再発がより低率であること、および、ヘルペス性のエピ
ソードの全数が減少することに反映される。さらに、no
r-MDPを含むワクチンおよび投与されたIMは、CFAを含み
そして足蹠中に投与されたワクチンと同程度に効果的で
あると考えられる。 【０１２９】 【表７】 【０１３０】種々のアジュバントを含むワクチンの注射
により生じる局所的な反応もまた、監視した。その結果
を表８に示す。注射部位での局所的な紅斑および硬変の
発生率は、nor-MDPを含むワクチンについて同様であっ
た。さらに、局所的な反応生成性も基づき、nor-MDPは
ワクチンにおける使用が可能であると考えられる。 【０１３１】 【表８】 【０１３２】表７の結果によっても、免疫治療の開始と
急性の疾病の始まりとの間の間隔が減少するにつれて、
処置の相対的な効力が増強することが示される。最初の
感染後、８、15または21日後にCFAを含むgBgDワクチン
の接種を受けた動物のうち、膣内植菌後最も短時間のう
ちワクチンを受けた動物が、未処置のコントロールに比
較すると、疾病の期間が最も短く、重い再発の割合が最
も低く、そして、全エピソードが最も少なかった。感染
15日後に、ワクチンを接種した動物について得た値は、
８日後にワクチン接種した群について得たものよりも高
く、そして21日後に接種した群は15日後に接種した群よ
りも高かった。この効果は図１６にも示されている。図
１６は、HSV-2植菌８、15または21日後に、最初にワク
チン接種した動物について、膣内に植菌した後の日々に
おける再発数のグラフを示す。 【０１３３】図１６のデータは、再発した疾病の割合の
減少（％）を計算するために用いられた（疾病の再発率
の有意性についての説明は6.1節を参照されたい）、こ
のデータは表９に示されている。表９では、最も早い期
間（つまり14〜50日）において８日目に最初のワクチン
を接種することにより、再発した疾病の割合（パーセン
ト）が最も大きく減少するのが観察され得る。しかし、
HSVを膣内に植菌した15日後に最初のワクチン接種を行
なうことにより、51〜92日目から、最も効果的な保護が
得られた。HSV-2に初めに接触させてから21日後に最初
のワクチン接種を行なったときに最も弱い保護効果がか
得られた。 【０１３４】モルモットにおいては、病気の急性な時期
が、ウイルスの感染後14〜21日の期間に起こるというこ
とを銘記すべきである。この急性な時期において、HSV
により誘導された疾病が、動物の身体に見い出される。
従って、図16のデータにより、51〜92日目における最も
効果的な保護が、感染の急性な時期の期間でのワクチン
の投与により得られたことが示される。 【０１３５】 【表９】 【０１３６】本発明によれば、単純ヘルペスウイルスの
感染後に投与することにより、単純ヘルペスウイルス１
型および２型の治療処置に効果のあるワクチンが提供さ
れる。 【０１３７】上記発明は、その内容を明快に理解するた
めに、例示し、実施例を挙げることによりいくぶん詳細
に述べてきたが、添付の請求の範囲内において、ある変
更および修飾がなされ得ることは明らかである。 【０１３８】 【発明の効果】本願発明により、単離した糖タンパク質
をコードするポリヌクレオチドを利用して再発性単純ヘ
ルペスウイルス誘導疾病を阻止するのに有効なワクチン
を製造することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】HSV-1およびHSV-2の物理的地図、プロトタイプ
のアイソマーの配置に対するEcoRＩ切断地図、およびHS
V-2のHindIII制限酵素切断地図を表す。 【図２】HSV-1地図におけるgB１コード領域の制限酵素
切断地図を表す。 【図３】gB１コード領域の制限酵素切断地図である。 【図４】gB１およびgB２のDNAアミノ酸配列を表す。 【図５】図４の続きである。 【図６】図５の続きである。 【図７】図６の続きである。 【図８】HSV-2の物理的地図であり、gB２コード領域が
示されている。 【図９】プラスミドpHS137のいくつかの重要な特徴を示
す地図である。 【図１０】gB２の制限酵素切断地図である。 【図１１】gD１の哺乳動物発現ベクターであるpHS132の
構築に関するフローチャートである。 【図１２】HSV-2の物理的地図であり、gD２コード領域
が示されている。 【図１３】gD２に対する哺乳動物ベクターの構築に関す
るフローチャートである。 【図１４】一次感染した後に行われる組換えgB−gDを用
いたワクチン接種が再発性ヘルペス疾患に及ぼす効果を
表す。 【図１５】Ａは、ヘルペスウイルス糖タンパクによる免
疫化が再発性ヘルペスの感染率に及ぼす効果を表す。Ｂ
は、対照のモルモットと感作したモルモットとの間にお
ける週単位の再発率の差を表す。 【図１６】gBgDワクチンの投与時間がヘルペス疾患の再
発に及ぼす効果を表すグラフである。
のアイソマーの配置に対するEcoRＩ切断地図、およびHS
V-2のHindIII制限酵素切断地図を表す。 【図２】HSV-1地図におけるgB１コード領域の制限酵素
切断地図を表す。 【図３】gB１コード領域の制限酵素切断地図である。 【図４】gB１およびgB２のDNAアミノ酸配列を表す。 【図５】図４の続きである。 【図６】図５の続きである。 【図７】図６の続きである。 【図８】HSV-2の物理的地図であり、gB２コード領域が
示されている。 【図９】プラスミドpHS137のいくつかの重要な特徴を示
す地図である。 【図１０】gB２の制限酵素切断地図である。 【図１１】gD１の哺乳動物発現ベクターであるpHS132の
構築に関するフローチャートである。 【図１２】HSV-2の物理的地図であり、gD２コード領域
が示されている。 【図１３】gD２に対する哺乳動物ベクターの構築に関す
るフローチャートである。 【図１４】一次感染した後に行われる組換えgB−gDを用
いたワクチン接種が再発性ヘルペス疾患に及ぼす効果を
表す。 【図１５】Ａは、ヘルペスウイルス糖タンパクによる免
疫化が再発性ヘルペスの感染率に及ぼす効果を表す。Ｂ
は、対照のモルモットと感作したモルモットとの間にお
ける週単位の再発率の差を表す。 【図１６】gBgDワクチンの投与時間がヘルペス疾患の再
発に及ぼす効果を表すグラフである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 パブロ，ディー．ティー．バレンズエラ
アメリカ合衆国 カリフォルニア
94117 サンフランシスコ，アッパー
テラス 455
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12N 5/00 - 5/28
C12P 1/00 - 41/00
A61K 39/00 - 39/44
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ
ＥＮＥＴＹＸ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、以下に記載の単離したヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチド： 【化１】【化２】２．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２
型（ｇＢ２）をコードする、以下に記載の単離したヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチド： 【化３】【化４】３．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ
（ｇＢ）およびその前駆体、あるいはそれらの類似体、
あるいは細胞質ドメインおよび／またはトランスメンブ
レンアンカー領域の全てまたは一部の欠失を含む組換え
ＨＳＶｇＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を有するポリヌクレオチドであって： 該ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列は、以下に
記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含
有する； ここで、該アミノ酸配列は、 【化５】【化６】または、 【化７】【化８】である。 ４．前記ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列が、
プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 39650より入手可
能）中のヌクレオチド配列、または、それらとコドンの
縮重のみで異なるヌクレオチド配列から選択される、請
求項１〜３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 ５．以下のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ構築物： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、以下に記載の単離したヌク
レオチド配列： 【化９】【化１０】および (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 ６．以下のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ構築物： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ２
型（ｇＢ２）をコードする、以下に記載の単離したヌク
レオチド配列： 【化１１】【化１２】および (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 ７．以下のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ構築物： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ
（ｇＢ）およびその前駆体、あるいはそれらの類似体、
あるいは細胞質ドメインおよび／またはトランスメンブ
レンアンカー領域の全てまたは一部の欠失を含む組換え
ＨＳＶｇＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
であって： 該ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列は、以下に
記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含
有する； ここで、該アミノ酸配列は、 【化１３】【化１４】または、 【化１５】【化１６】である、および (b)宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 ８．前記ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列が、
プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 39650より入手可
能）中のヌクレオチド配列、または、それらとコドンの
縮重のみで異なるヌクレオチド配列から選択される、請
求項５〜７のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。 ９．以下のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ構築物に
より形質転換された、宿主細胞： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、以下に記載の単離したヌク
レオチド配列： 【化１７】【化１８】および (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 １０．以下のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ構築物
により形質転換された、宿主細胞： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質２型
（ｇＢ２）をコードする、以下に記載の単離したヌクレ
オチド配列： 【化１９】【化２０】および (b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 １１．以下のヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ構築物
により形質転換された、宿主細胞： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ
（ｇＢ）およびその前駆体、あるいはそれらの類似体、
あるいは細胞質ドメインおよび／またはトランスメンブ
レンアンカー領域の全てまたは一部の欠失を含む組換え
ＨＳＶｇＢポリペプ チドをコードするヌクレオチド配列
であって： 該ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列は、以下に
記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含
有する； ここで、該アミノ酸配列は、 【化２１】【化２２】または、 【化２３】【化２４】である、および (b)宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列。 １２．前記ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列
が、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 39650より入手
可能）中のヌクレオチド配列、または、それらとコドン
の縮重のみで異なるヌクレオチド配列から選択される、
請求項９〜１１のいずれかに記載の形質転換された宿主
細胞。１３．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質の
製造方法 であって、以下のヌクレオチド配列を含有する
ＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主細胞： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ１
型（ｇＢ１）をコードする、以下に記載の単離したヌク
レオチド配列： 【化２５】【化２６】および(b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列を培養する工程を包含す
る、方法。 １４．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質の
製造方法であって、以下のヌクレオチド配列を含有する
ＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主細胞： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質２型
（ｇＢ２）をコードする 、以下に記載の単離したヌクレ
オチド配列： 【化２７】【化２８】および(b) 宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列を培養する工程を包含す
る、方法。 １５．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質の
製造方法であって、以下のヌクレオチド配列を含有する
ＤＮＡ構築物により形質転換された、宿主細胞： (a) 単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ
（ｇＢ）およびその前駆体 、あるいはそれらの類似体、
あるいは細胞質ドメインおよび／またはトランスメンブ
レンアンカー領域の全てまたは一部の欠失を含む組換え
ＨＳＶｇＢポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
であって： 該ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列は、以下に
記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含
有する； ここで、該アミノ酸配列は、 【化２９】【化３０】 または、 【化３１】【化３２】 である、および (b)宿主細胞中での発現を推進するための、該ヌクレオ
チド配列と結合可能な制御配列を培養する工程を包含す
る、方法。 １６．前記ＨＳＶｇＢをコードするヌクレオチド配列
が、プラスミドｐＨＳ１１２（ATCC No. 39650より入手
可能）中のヌクレオチド配列、または、それらとコドン
の縮重のみで異なるヌクレオチド配列から選択される、
請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。 １７．単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｂ
２型（ｇＢ２）または細胞質ドメインおよび／もしくは
トランスメンブレンアンカー領域の全てもしくは一部の
欠失を含む組換えＨＳＶｇＢ２ポリペプチド、単純ヘル
ペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパク質Ｄ１型（ｇＤ
１）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖タンパ
ク質Ｄ２型（ｇＤ２）からなる群より選択される少なく
とも１つ、ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）糖
タンパク質Ｂ１型（ｇＢ１）または細胞質ドメインおよ
び／もしくはトランスメンブレンアンカー領域の全ても
しくは一部の欠失を含む組換えＨＳＶｇＢ１ポリペプチ
ドの融合タンパク質、またはそれらの混合物をコードす
るヌクレオチド配列。
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