WO2019044927A1 - 改変型ＨＳＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＨＳＶワクチン - Google Patents

改変型ＨＳＶ ｇＢタンパク質及びこれを含むＨＳＶワクチン Download PDF

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泰亮 森
知裕 西村
清水　裕之
みゆき 松本
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Definitions

  • the present invention relates to modified HSV gB proteins and HSV vaccines comprising the same.
  • the herpes simplex virus (Herpes simplex virus; HSV) is a neurotropic pathogen, and after primary infection in mucosal epithelia, it translocates to the sensory nerve and becomes a latent infection in the trigeminal ganglia or sacral ganglia.
  • the latent HSV sometimes reactivates and causes various pathological conditions (Non-patent Document 1).
  • HSV-1 and HSV-2 Two serotypes (HSV-1 and HSV-2) are known for HSV, HSV-1 mainly causes labial and corneal herpes, and HSV-2 mainly causes genital herpes.
  • HSV-1 often causes genital herpes and HSV-2 causes cold sores due to diversification of sexual behavior.
  • the percentage of antibody-positive (pre-infected) patients in Japan is 60 to 80% for HSV-1 and 10% for HSV-2, and even if it is limited to HSV-2, the potential demand for vaccine is estimated to be 10 million.
  • Non-Patent Document 3 the percentage of antibody-positive persons (pre-infected persons) in the United States is 57% for HSV-1 and 20% for HSV-2 (of which approximately 10% is manifest genital herpes)
  • Non-Patent Document 3 the percentage of antibody-positive persons (pre-infected persons) in the United States is 57% for HSV-1 and 20% for HSV-2 (of which approximately 10% is manifest genital herpes
  • Infection with HSV cells is known to involve five envelope glycoproteins (glycoproteins) at two stages: adsorption and invasion.
  • the five envelope glycoproteins are called envelope glycoprotein B (gB), envelope glycoprotein C (gC), envelope glycoprotein D (gD), envelope glycoprotein H (gH), and envelope glycoprotein L (gL), respectively.
  • gB envelope glycoprotein B
  • gC envelope glycoprotein C
  • gD envelope glycoprotein D
  • gH envelope glycoprotein H
  • gL envelope glycoprotein L
  • Non-patent Documents 5 and 6 Non-patent Documents 5 and 6
  • This process is not essential for HSV entry into cells, but is thought to be involved in more efficient entry.
  • gB and gD bind to their respective host cell receptors and are initiated by fusion of the viral envelope and the host cell membrane.
  • gB receptors and gD receptors are known.
  • NM-IIA Non-patent Documents 7 and 8
  • MAG Non-patent Document 9
  • Nectin 1 Non-patent Document 10
  • HVEM Non-patent Document 11
  • 3-O-sulfated heparan sulfate Non-patent document 12
  • gH / gL heterodimers are known to interact with gB and gD and play an important role in membrane fusion (Non-patent Document 13).
  • Non-patent Document 14 the structure of gB is similar to that of VSV (Vesicular stomatitis virus), which is known as a membrane fusion protein, and this confirms that gB is a membrane fusion protein of HSV.
  • VSV Vesicular stomatitis virus
  • GB is also highly conserved in other herpesviruses, and its function is considered to be common to herpesviruses.
  • Non-patent Document 15 HSV is classified into Class II pathogens, which are thought to be because HSV has an immune evasion mechanism and cleverly bypasses the host's immune response.
  • PILR alpha is a herpes simplex virus-1 entry coreceptor that associates with glycoprotein B.
  • antiviral agents such as acyclovir are used for the treatment of HSV.
  • these antiviral agents can not completely remove the virus, and the virus reactivates when taking the drug. Therefore, it is desirable to develop a preventive vaccine that protects HSV infection itself or a therapeutic vaccine that alleviates or alleviates recurrent symptoms, but there is currently no effective vaccine and its unmet needs are high.
  • the present invention can induce an antibody having a high content ratio of neutralizing antibody exhibiting high neutralizing activity against HSV gB as compared to wild type HSV gB upon induction of immunity, and can be used for prevention and / or treatment of HSV infection It is an object of the present invention to provide a modified HSV gB protein and a vaccine comprising the same.
  • the present inventors conducted comprehensive B cell epitope analysis on gB proteins known as one of the major protective antigens of HSV, and used beneficial epitopes (neutralizing epitopes) and beneficial or harmful in expressing protective activity. It tried to classify into various epitopes (non-neutralizing epitopes). Then, a modified HSV gB protein in which its neutralizing antibody induction ability and infection protective ability are enhanced by de-epitoping useless or harmful epitopes and immunologically highlighting useful epitopes, and the modified HSV gB We came to complete a vaccine containing protein.
  • the present invention relates to the following inventions.
  • a modified protein modified HSV gB protein of envelope glycoprotein B (gB) of herpes simplex virus (HSV), which induces non-neutralizing antibody present in domain IV and domain I of wild type HSV gB
  • Modified HSV gB protein wherein at least one of the epitopes (non-neutralizing epitopes) is modified so as not to function as an epitope.
  • the non-neutralizing epitope is an arginine residue (R 567) or an arginine residue (R 602 (R602) in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 on the surface of the crystal structure of wild type HSV gB ectodomain.
  • the modified HSV gB protein of (1) which is an epitope.
  • the modification includes glycosylation at the position of at least one amino acid residue selected from the group consisting of amino acid residues corresponding to D199, R567, R602, and S631 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the modification includes glycosylation at the position of at least two amino acid residues selected from the group consisting of the amino acid residues corresponding to D199, R567, R602, and S631 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • HSV herpes simplex virus
  • the modification includes glycosylation at the position of at least one amino acid residue selected from the group consisting of the amino acid residues corresponding to D199, R567, R602, and S631 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (17) a modified HSV gB protein comprising a modification to (19) The modified HSV gB protein according to (17) or (18), wherein the modification comprises modification for introducing a sugar chain at the position of the amino acid residue corresponding to D199 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the serum contains a relatively large amount of neutralizing antibody having high neutralizing activity, as compared to when it is induced by wild type HSV gB. obtain. That is, the modified HSV gB protein of the present invention and a vaccine containing the same can induce immunorefocussing and provide a strong protective effect against HSV. Therefore, high preventive and therapeutic effects can be expected against HSV infection.
  • FIG. 7 is a correlation diagram obtained by classifying anti-gB antibodies obtained by the competition ELISA of Example 2.
  • FIG. 7 is a MOE of the result of identification of an epitope of gB antibody by alanine scanning in Example 3.
  • FIG. 10 is a diagram showing a design strategy for the modified gB protein of Example 5.
  • FIG. 10 shows a simplified view of the crystal structure for the design strategy of the modified gB protein of Example 5.
  • FIG. 16 shows the results of mouse immunogenicity studies of bcev 19 of Example 5.
  • FIG. 6 shows the results of mouse immunogenicity studies of bcev 50 of Example 5.
  • FIG. 16 shows the results of analysis of immunorefocussing of bcev 19 of Example 5.
  • FIG. 16 is a diagram showing the analysis results of immunorefocussing of bcev 50 of Example 5.
  • FIG. 16 shows the results of characterization of bcev19, bcev19 ', bcev50 and bcev50' by gel permeation chromatography of Example 5.
  • FIG. 16 shows the comparison results of bcev 19 and bcev 19 ′ in the mouse immunogenicity test of Example 5.
  • FIG. 16 shows the comparison results of bcev 50 and bcev 50 'in the mouse immunogenicity test of Example 5.
  • FIG. 6 shows the comparison result of multiple alignment of the amino acid sequence of HSV-1 derived gB (SEQ ID NO: 2) and the amino acid sequence of HSV-2 derived gB (SEQ ID NO: 3); Denotes amino acid residues 383 to 388 (I383-R388) of domain II of HSB-1 derived gB and amino acids residue 386 to 391 (I386-R391) of domain II of HSB-2 derived gB .
  • the modified HSV gB protein of the present invention is a modified protein of envelope glycoprotein B (gB) of herpes simplex virus (HSV) and induces non-neutralizing antibodies present in domain IV and domain I of wild type gB Among the epitopes (non-neutralizing epitopes), at least one is a modified HSV gB protein that has been modified so as not to function as an epitope.
  • gB envelope glycoprotein B
  • HSV herpes simplex virus
  • the present invention is based on the hypothesis proposed by the present inventors that the “decoy region” is present in the HSV gB antigen.
  • the “decoy region” is derived from the English language “Decoy” and is considered to be one of the immune escape mechanisms by which the pathogen escapes from the host's immune response.
  • the “decoy region” is an antigen region that induces an antibody with no or low neutralizing antibody activity, and this deceptive inprinting (also referred to as “immune bias”) prevents generation of a neutralizing antibody, or It is believed that the pathogen is a mechanism to escape the host's immune response so that production is low.
  • the “wild-type HSV gB” is a HSV-1 derived envelope glycoprotein B (gB) having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or an HSV-2 derived gB having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 As a result of referring to the full length and comparing them in multiple alignment, their sequence identity is about 87% (FIG. 17).
  • the three-dimensional structure of gB has also been analyzed, and is known to consist of an intracellular domain, a transmembrane domain and an ectodomain.
  • the crystal structure of gB from HSV-1 is described, for example, in Science 313: 217-220 (2006) and J. Am. Virol. 84: 12924-12933 (2010).
  • Wild-type HSV gB ectodomain refers to the soluble, antigenic, extracellular region of wild-type HSV gB.
  • An example of the wild type HSV gB ectodomain is the wild type gB ectodomain 1-705 from HSV-2 strain 333 consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • domain IV and domain I located at the upper and lower portions are more prominent than domain II located at the middle, resulting in high antigen presentation.
  • the ratio of antibodies to domain IV and domain I is high and the ratio of antibodies to domain II is low, as examined by the present inventors.
  • wild-type HSV gB domain II has only an epitope that induces neutralizing antibodies (referred to herein as "neutralizing epitope”). It is found that both the neutralizing epitope and the epitope inducing non-neutralizing antibody (referred to as “non-neutralizing epitope” in the present specification) are present in domain IV and domain I of wild type HSV gB.
  • non-neutralizing antibodies bind to antigens (ie, viruses) but can not suppress the activity of viruses, it is important to be able to induce the production of neutralizing rather than non-neutralizing antibodies, particularly in the production of vaccines. It is done.
  • the modified HSV gB protein of the present invention "reveals” domain II with neutralizing epitopes by de-epitoping "outstanding" domain IV and domain I, which is not very useful for the production of neutralizing antibodies. By inducing “it is possible to induce an antibody with high neutralizing activity.
  • modified HSV gB protein (also referred to as “HSV gB modified protein” or “variant”) means that at least one amino acid residue or continuous amino acid residue region relative to wild type HSV gB is It refers to a protein which has been substituted, deleted or added, and also includes a protein which is not present in the wild type, such as a glycosylated protein by substitution or deletion of amino acid residues.
  • the modified HSV gB protein of the present invention has higher neutralizing antibody induction activity than the wild-type protein.
  • Neutralizing antibody inducing activity refers to the ability to induce neutralizing antibodies of an antigen protein, and is a neutralizing antibody titer in immune serum obtained by inoculating the subject animal with the antigen protein. It can be evaluated.
  • Negtralizing antibody refers to an antibody capable of losing the infectivity of viral particles, for example, at the concentration of antibody required to reduce the number of plaques of the test virus by 50% (NT50) Evaluate the strength of the neutralizing activity.
  • “De-epitope” refers to modification of a site that has contributed to antibody production as an epitope in wild-type HSV gB so as not to function as an epitope.
  • a method of de-epitopeization a method of replacing an amino acid residue at the site of the epitope with another amino acid residue, a method of deleting (deleting) an amino acid residue at the site of the epitope, and a site of the epitope Examples include a method of introducing a sugar chain by substitution or deletion of a certain amino acid residue.
  • a method of de-epitope formation a method of introducing a sugar chain, particularly a method of introducing an N-type sugar chain (N-glycosidic linked sugar chain) is preferable.
  • non-neutralizing antibody-inducing epitope present in domain IV and domain I of wild-type gB is described in SEQ ID NO: 1 on the surface of the crystal structure of wild-type HSV gB ectodomain Amino acid residue corresponding to the 567th arginine residue (R567), the 602nd arginine residue (R602), the 631st serine residue (S631), or the 199th aspartic acid residue (D199) in the amino acid sequence of
  • An epitope comprising at least one amino acid residue which exists in a region of 1.5 nm or less from the group, more preferably in a region of 1 nm or less from the amino acid residue is mentioned.
  • distance from amino acid residue refers to a linear distance from the above amino acid residue regardless of the shape of the surface of the crystal structure of the ectodomain of wild type HSV gB. Because deneutralizing epitopes induce the production of useless or harmful antibodies and are not useful for the production of neutralizing antigens, these de-epitopes reduce the production of useless or harmful antibodies and also beneficial epitopes. By making them stand out, the production of neutralizing antibodies can be increased.
  • the crystal method is not particularly limited, the method described in J. Virol. 84: 12924-12933 (2010). For example, crystals of gB can be grown using 15% PEG 4000-0.3 M NaCl-0.1 M sodium citrate pH 5.5.
  • an arginine residue at position 567 (R567), an arginine residue at position 602 (R602), a serine residue at position 631 (S631), or a 199th position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • An epitope including an amino acid residue corresponding to an aspartic acid residue (D199) is mentioned. Since it has been demonstrated by the present inventors that these epitopes are non-neutralizing epitopes, de-epitopeation of these epitopes can reduce the production of useless or harmful antibodies in protective expression. In addition, de-epitopeization of these epitopes can increase the production rate of neutralizing antibodies by highlighting useful epitopes.
  • Modifications for de-epitope include modifications made by glycosylation by substitution of amino acid residues, deletion of amino acid residues, and / or substitution or deletion of amino acid residues.
  • the above modification is carried out as follows: a 199th aspartic acid residue (D199), a 567th arginine residue (R567), a 602nd arginine residue (R602), and a 631th serine residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a modification for introducing a sugar at a position of at least one, preferably at least two amino acid residues selected from the group consisting of amino acid residues corresponding to the group (S631).
  • it is performed by amino acid residue substitution of R567N, P568S, G569S, S631N, H632T, and Q633T in the amino acid sequence. It is further preferable to include a modification for introducing a sugar chain into each position of the amino acid residue corresponding to D199, R567 and S631 in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the modification preferably further includes a modification for introducing a sugar chain at the position of the amino acid residue corresponding to R602 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the sugar chain introduction comprises the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 Preferably, it is carried out by amino acid residue substitution of R602N, D603A, A604T in
  • the modification preferably further includes a modification for introducing a sugar chain at the position of an amino acid residue corresponding to D199 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the sugar chain introduction comprises the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1
  • it is carried out by amino acid residue substitution of D199N, D200A, and H201T in
  • the method for introducing a sugar chain is not particularly limited as long as it is a common method, but for example, when introducing an N-type sugar chain, cDNA of a wild type gB protein (GenBank: M15118.1, SEQ ID NO: 4) is used as a template
  • the primers are designed so that three consecutive amino acid sequences of the target site for introducing an N-type sugar chain are N-X-S / T (X is any amino acid other than proline), and the mutation is Introduce.
  • Mutations for glycan introduction include, for example, the following mutations in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1: (D199N, D200A, H201T), (R567N, P568S, G569S), (S631N, H632A, Q633T) And (S631N, H632T, Q633T).
  • the gB variant can be obtained by cloning and expressing the nucleic acid sequence of the modified gB protein of interest, and further, the nucleic acid sequence to which a tag such as 6xHis has been linked, if necessary. Then, an N-type sugar chain is added to asparagine at the target site of the gB variant by a conventional method.
  • Modification of the non-neutralizing epitope may further comprise substitution of the charged amino acid residue that is the epitope with an uncharacteristic amino acid residue, such as an alanine residue.
  • This method is different from the introduction of N-type sugar chains, and has the advantage of being able to de-epitopicize at pinpoint.
  • the modified HSV gB protein is glycosylated at each of the amino acid residues corresponding to D199, R567 and S631 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and further, at position 613 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Preferred is the gB protein in which the amino acid residue corresponding to arginine (R613) is substituted with alanine.
  • an amino acid residue corresponding to each of D199, R567, R602, and S631 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is glycosylated, and further described in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid residue corresponding to arginine (R 613) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 is more preferably a gB protein in which alanine is substituted.
  • the modified HSV gB protein of the present invention can be produced by genetic engineering techniques.
  • the production method is not particularly limited.
  • a cDNA of a wild-type gB protein is used as a template, a primer for introducing a target mutation is designed, and a nucleic acid into which a mutation has been introduced by PCR is obtained. It can be obtained by ligating in some cases, optionally ligating tags, and introducing it into an appropriate expression vector and expressing it. Further, in the case of a modified form by sugar chain introduction, it can be obtained as described above.
  • the modified HSV gB protein produced may be optionally purified.
  • the purification method is not particularly limited, purification by affinity chromatography column etc. may be mentioned.
  • HSV infections include infections due to HSV-1 and HSV-2, and include, for example, herpes labialis, corneal herpes, genital herpes, generalized neonatal herpes, and stomatitis due to HSV, skin disease, encephalitis, meninges And inflammation and myelitis.
  • the HSV vaccine of the invention comprises the modified HSV gB protein of the invention.
  • the dosage form of the HSV vaccine of the present embodiment may be, for example, liquid, powder (lyophilized powder, dry powder), capsule, tablet, frozen state.
  • the HSV vaccine of the present embodiment may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier carriers commonly used for vaccine production can be used without limitation, and specifically, saline, buffered saline, dextrose, water, glycerol, isotonic aqueous buffer and combinations thereof may be mentioned.
  • Be The vaccine may further contain an emulsifying agent, a preservative (eg thimerosal), an isotonicity agent, a pH adjusting agent, etc., as appropriate.
  • Adjuvants include, for example, aluminum adjuvants or oil-in-water emulsion adjuvants including squalene (AS03, MF59 etc.), CpG and Toll-like acceptance such as 3-O-deacylated-4'-monophosphoryl lipid A (MPL)
  • MPL 3-O-deacylated-4'-monophosphoryl lipid A
  • body ligands saponin adjuvants
  • polymer adjuvants such as poly ⁇ -glutamic acid
  • polysaccharides such as chitosan and inulin.
  • the HSV vaccine of this embodiment can be obtained by mixing the modified HSV gB protein of the present invention and, if necessary, a carrier, an adjuvant and the like.
  • the adjuvant may be mixed at the time of use.
  • the administration route of the HSV vaccine of this embodiment is, for example, transdermal administration, sublingual administration, eye drop administration, intradermal administration, intramuscular administration, oral administration, enteral administration, nasal administration, intravenous administration, subcutaneous administration, Intraperitoneal administration may be by oral administration via the mouth.
  • the administration method of the HSV vaccine of this embodiment is, for example, a method of administering by a syringe, a transdermal patch, a microneedle, an implantable sustained-release device, a syringe with a microneedle, a needleless device, a spray It is also good.
  • Example 1 Isolation of Anti-gB Antibody
  • the cDNA (SEQ ID NO: 4) of gB ectodomain 1-705aa (gB1-705) from strain 333 of HSV-2 was cloned into pCAGGS1-dhfr-neo.
  • Strep Tag II was designed to be added to the C-terminus of gB.
  • FreeStyle293 or Expi293 expression system (Life Technology) was used.
  • the expression plasmid was transfected into cells, and the culture supernatant was recovered in 4 to 6 days.
  • the culture supernatant containing gB was concentrated with UF membrane to remove biotin contained in the medium.
  • the concentrated culture supernatant was purified using a StrepTactin column to obtain purified gB2.
  • a gene encoding an amino acid from 370 to 457 aa of gB was amplified by PCR and cloned into pET43.1b (+) to construct a gB370-457 expression plasmid.
  • the Nus-Tag gene and His-Tag gene are added to this plasmid to facilitate purification.
  • the plasmid was transformed into Rosetta2 (Novagen). After culturing in LB medium at 37 ° C. to the mid-log phase, expression was induced with 1 mM IPTG and cultured at 25 ° C. overnight. BugBuster mix was used to extract soluble proteins.
  • the obtained protein was purified using Ni NTA Agarose (QIAGEN).
  • Example 2 Classification of Anti-gB Antibody ⁇ Preparation of Antibody Fragment scFv-hFc>
  • the variable region of the isolated scFv gene was linked to a human Fc gene, cloned into a pCAG vector, and a scFv-hFc expression plasmid was constructed.
  • FreeStyle293 or Expi293 expression system was used for expression.
  • the expression plasmid was transfected into cells, and the culture supernatant was recovered in 4 to 6 days.
  • the culture supernatant was subjected to purification of scFv-hFc using Ab Rapid PuRe 10 (Protenova).
  • the binding activity of the obtained scFv-phage and scFv-hFc was evaluated by ELISA.
  • Recombinant gB was immobilized by diluting gB1-705 to 1 ⁇ g / mL in PBS, 50 ⁇ L in MaxiSorp plate (Nunc), and incubating at 4 ° C. overnight or at room temperature for 1 to 2 hours. After immobilization, the plate was washed with PBS, and 100 ⁇ L of the obtained scFv-phage and IgG were added to the plate wells and incubated at 37 ° C.
  • the cells were washed with PBST, and 100 ⁇ L of detection antibodies anti-M13 / HRP (GE Healthcare) or anti-hFc / HRP (Cosmo Bio) were added to the wells of the plate and incubated at 37 ° C. After 1 hour, the cells were washed with PBST and developed by adding 100 ⁇ L of TMB to the wells of the plate. After 30 minutes, the reaction was quenched with 1 N sulfuric acid, and absorbance (OD 450 nm / 650 nm) was measured with a microplate reader (Molecular Device) (data not shown).
  • denatured or native gB1-705 500 ng was loaded onto an 8-16% SDS-PAGE and electrophoresed.
  • the denatured gB1-705 was obtained by adding 2% 2-mercaptoethanol to gB1-705 and boiling at 96 ° C. for 5 minutes.
  • Non-denatured gB1-705 was loaded directly without these operations. Trypsin or chymotrypsin digested gB fragments were obtained as follows.
  • each scFv-hFc was reacted with 1 ⁇ g / mL 2% skimmed milk-PBS-T for 30 minutes at room temperature.
  • anti-hFc / HRP in 2% skimmed milk-PBS-T was reacted and developed with Immobilon Western Detection Regent (Millipore). Silver staining was performed for detection of bands in SDS-PAGE.
  • GB was fragmented respectively by treatment with trypsin or chymotrypsin.
  • the reactivity of these gB and antibody E7 scFv-hFc was detected by Western blotting.
  • E7 scFv-hFc non-reduced and unboiled gB1-705 (lane 1), boiled gB1-705 (lane 2), reduced-boiled gB1-705 (lane 3) and protease-treated gB fragment (lane) Reactivity was shown in 5, 6, 7) (FIG. 1). Similar reaction patterns were observed with antibodies E17 and E31 (Table 1). These suggest that the antibodies E7, E17 and E31 scFv-hFc are continuous epitopes.
  • the antibodies A17, D1, D2, D3, D37, D48 and E15 scFv-hFc consist of non-reduced and unboiled gB1-705, boiled gB1-705, reduced-boiled gB1-705 and protease-treated gB fragments Although the reactivity was shown, the reactivity with those gB fragments showed a pattern different from E7, E17 and E31 (Table 1). The reaction pattern between D1 and D2 and the reaction pattern between D3 and D37 are the same, suggesting that they recognize the same or nearby epitopes, respectively.
  • the patterns of reactivity of gB fragments could be classified into six groups. E41, F13, F18, F19, F22, F30 and F78 scFv-hFc showed reactivity only to non-reduced non-boiled gB1-705 (Table 1). These antibody clones are trimer specific and are suggested to be discontinuous epitopes. F7, F11, F12, F33, F52, F67, F68, F69, F76, F80, F87, G39, G64, H76, H34, H57, H61, H65, G10, G25 and G65 are not reduced. Reactivity was shown not only to unboiled gB1-705 but also to boiled gB1-705 (Table 1).
  • gB1-705 was diluted to 1 ⁇ g / mL with PBS, 50 ⁇ L was added to a maxi sorp plate, and gB1-705 was immobilized by incubating overnight at 4 ° C. After immobilization, the plate was washed with PBS, and 50 ⁇ L of the obtained scFv-hFc was added to the plate wells and incubated at 25 ° C. After 1 hour, 50 ⁇ l of scFv-phage was added to the plate wells and incubated at 25 ° C.
  • the cells were washed with PBST, and 100 ⁇ L of detection antibody anti-M13 / HRP was added to the wells of the plate and incubated at 25 ° C. After 1 hour, the cells were washed with PBST and developed by adding 100 ⁇ L of TMB to the wells of the plate. After 30 minutes, the reaction was quenched with 1 N sulfuric acid, and the absorbance (OD 450 nm / 650 nm) was measured with a microplate reader.
  • the group containing antibodies E41, F18, F19, F13, F78, F22 and F30 is a group showing reactivity only to non-reduced non-boiled gB1-705, but unlike the other groups, the competitive ELISA It was confirmed that the antibody E41, F18, F19, F13 and F78 and the groups F22 and F30 were classified. On the other hand, other groups were not further subdivided from the above mentioned groups. Thus, anti-gB clones were classified into 10 groups in total. In addition, it was suggested that D48 had reactivity with gB370-457, and that an epitope was present in 370 aa to 457 aa of gB.
  • Example 3 Identification of Epitope of gB Antibody by Alanine Scanning
  • a gene in which each of the charged amino acid residues (187 points) in 1-705 aa which is an ectodomain of gB is modified to alanine is constructed by PCR, pCAGGS1-dhfr-neo Cloned into For expression, FreeStyle293 or Expi293 expression system was used.
  • the expression amount of the obtained gB alanine substitution product and the binding activity of the alanine substitution product and the antibody fragment were evaluated by ELISA.
  • the culture supernatant containing the gB alanine substitution was placed in a MaxiSorp plate, and the gB alanine substitution was immobilized by incubating for 1 hour at room temperature. After immobilization, the plate was washed with PBST, and 100 ⁇ L of detection antibody StrepTactin / HRP (IBA) was added to the plate wells and incubated at room temperature. After 1 hour, the cells were washed with PBST and developed by adding 100 ⁇ L of TMB to the wells of the plate. After 30 minutes, the reaction was stopped with 1N sulfuric acid, and the absorbance (OD 450 nm / 650 nm) was measured with a microplate reader to determine the expression level.
  • IBA detection antibody StrepTactin / HRP
  • the culture supernatant containing the gB alanine substitute was put in a Streptactin-immobilized MaxiSorp plate, and the gB alanine substitute was immobilized by incubating at room temperature for 1 hour. After immobilization, the plate was washed with PBST, and 100 ⁇ L of antibody fragment was added to the plate wells and incubated at room temperature. After 1 hour, the cells were washed with PBST, and 100 ⁇ L of detection antibody anti-human Fc / HRP (Cosmo Bio) was added to the wells of the plate and incubated at room temperature.
  • Epitope candidates were selected based on whether the reactivity per expression level was changed as compared to wild type gB1-705 not substituted with alanine. Furthermore, in the case of an antibody that requires close examination, epitope candidates were narrowed down by ELISA using a purified product of gB alanine substitution product.
  • E82 and E88 compete with E8 and E35 in a competitive ELISA, the epitopes of E82 and E88 are expected to be near R532, R613, H632.
  • the antibody which could not identify the epitope is considered to be highly likely to be an epitope for amino acid residues other than charged amino acids in the sense that the present analysis is limited to charged amino acid residues.
  • Vero cells CCL. 81
  • Vero cells CCL. 81
  • Human herpesvirus 2 (HSV-2) MS strain [VR-540] was used for neutralization test and infection defense ability analysis.
  • HSV-1 purchased and used KOS strain (VR-1493) from ATCC. Vero cells are cultured to full sheet in MEM medium containing 10% FBS, and HSV-2 MS strain and HSV-1 KOS strain are m.c. o.
  • intracellular freeze-thaw was performed to release intracellular virus into the medium by freezing / thawing three times. After centrifugation, the supernatant was collected and made into HSV-2 virus bank and HSV-1 virus bank.
  • Virus neutralization test The neutralizing activity of the obtained anti-gB clone was evaluated by a virus neutralization test.
  • the neutralization test was performed using two methods of plaque number reduction activity (plaque reduction activity) measurement and cell to cell infection spread suppression activity measurement. Two target viruses were used: HSV-2 MS strain and HSV-1 KOS strain.
  • plaque reduction activity measurement a test antibody was prepared to a predetermined concentration, mixed with approximately 100 PFU of HSV-2 MS strain or HSV-1 KOS strain, and then reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • the reaction solution is seeded on a full sheet of Vero cells in a 48-well plate, adsorbed for 1 hour at 30 ° C., cultured for 24 hours in a 1% methylcellulose-containing medium, and 50% methanol / ethanol / ethanol mixed 1: 1 Inactivation and fixation were carried out with 50% ethanol ( ⁇ 20 ° C.) at ⁇ 20 ° C. for 30 minutes.
  • anti-HSV gB monoclonal antibody is reacted at 37 ° C for 1 hour, immunostained with anti-mouse IgG-HRP (Dako P0447) and TMBH (MOS TMBH-1000), and the image of each well is taken in with ELISPOT analyzer, analysis software The number of plaques was counted by.
  • Cell-to-cell infection expansion inhibitory activity measurement is performed by inoculating approximately 100 PFU of HSV-2 MS strain or HSV-1 KOS strain into a 48-well plate in full sheet Vero cells, and adsorbing at 30 ° C for 1 hour, and then predetermined concentration 1% methylcellulose medium (containing 5 ⁇ g / mL, 25 ⁇ g / mL and 125 ⁇ g / mL of antibody concentration) containing the test antibody of interest, and cultured HSV-2 MS strain for about 40 hours, HSV-1 KOS strain for about 48 hours After that, inactivation and fixation were carried out with 50% methanol / 50% ethanol ( ⁇ 20 ° C.) at ⁇ 20 ° C. for 30 minutes.
  • predetermined concentration 1% methylcellulose medium containing 5 ⁇ g / mL, 25 ⁇ g / mL and 125 ⁇ g / mL of antibody concentration
  • an anti-HSV gB monoclonal antibody is reacted at 37 ° C. for 1 hour, immunostained with anti-mouse IgG-HRP (Dako P0447) and TMBH, the image of each well is taken in by ELISPOT analyzer, and the average plaque size by analysis software was analyzed.
  • the results are shown in Table 3.
  • the obtained 44 clones are roughly divided into two, a neutralizing antibody and a non-neutralizing antibody, and among the neutralizing antibodies, only one of them is a clone that neutralizes both HSV-1 and HSV-2 Neutralizing type-specific clones, clones with strong plaque number reduction activity but no (weak) clones with cell to cell infection spread inhibitory activity, and clones with strong plaque number reduction activity and cell to cell infection spread inhibitory activity exist It was In addition, it was confirmed that this neutralization pattern was linked to the result of the previous grouping (Table 3, FIG. 2).
  • Plaque number reduction activity was analyzed at 5 ⁇ g / mL, 25 ⁇ g / mL and 125 ⁇ g / mL, and those with neutralization potential up to 5 ⁇ g / mL were found to be “++”, those with neutralization potential up to 25 ⁇ g / mL “+”, And those having neutralization ability at 125 ⁇ g / mL or less were considered “ ⁇ ”.
  • Cell-to-cell infection spread control is analyzed at 5 ⁇ g / mL, 10 ⁇ g / mL and 20 ⁇ g / mL, and those with neutralization potential up to 5 ⁇ g / mL are treated as “++”, neutralization potential up to 10 ⁇ g / mL Those that were found to be "+” and those that were found to have a neutralizing ability to 20 ⁇ g / mL or less were considered to be " ⁇ ". All measurements were performed in duplicate.
  • Example 5 Design and Evaluation of Vaccine Antigens ⁇ Strategy for Modified gB Antigen Design>
  • neutralizing epitopes and non-neutralizing epitopes are present in domain IV and domain I on gB2 antigen, and a neutralizing epitope is present in domain II It turned out to do.
  • the gB antigen was designed.
  • the base wild type gB is ectodomain gB1-705, and Streptag II is added to the C-terminal side for StrepTactin purification (FIG. 4 (A)).
  • the first is modification of gB by N-type glycosylation.
  • the N-type sugar chain is different from the O-type sugar chain, and is imparted to the sequence of the consensus sequence NXT or NXS (X is any amino acid except proline).
  • NXT or NXS X is any amino acid except proline.
  • X is any amino acid except proline.
  • domain IV of HSV2-gB is considered to be an important region for binding to the receptor, it is located farthest from the viral membrane surface and exposed to the surface so that the antibody is easily bound. In fact, as described above, it has been suggested that human serum contains a large amount of antibody that recognizes domain IV.
  • domain I is located at the root of gB and is a region important for fusion with host cells, but when expressing only ectodomain, the region originally in contact with the viral membrane surface is Exposed to the surface.
  • vaccine antigen design using only gB ectodomain is assumed in vaccine production. Therefore, the region in contact with the viral membrane may be newly exposed, and it was decided to introduce an N-type sugar chain into one nonneutralizing epitope region (Fig. 4 (B) and Fig. 5). .
  • the sugar chain originally added to wild-type gB is considered to be located at N115, N371, N649 with reference to HSV-1 gB (PDB No. 3 NWF) (FIG. 4 (B)).
  • D199, R567, R602, and S631 were newly selected as the position of glycan introduction.
  • gB1-705 The cDNA (SEQ ID NO: 4) of the gB ectodomain (1-705 aa) derived from wild type HSV-2 strain 333 was cloned into pCAGGS1-dhfr-neo. Strep Tag II was designed to be added to the C-terminus of gB. Using this sequence as a template, a variant was designed in which the following mutations were introduced.
  • Variant bcev1-3 D199N, D200A, H201T
  • Variant bceg13 R567N, P568S, G569S
  • Variant bcev11 D199N, D200A, H201T
  • Variant bcev12 D199N, D200A, H201T
  • Variants bcev13 D199N, D200A, H201T, R567N, P568S, G569S, R613A, S631N, H632A, Q633T
  • Variants bcev19 D199N, D200A, H201T
  • Q633T Variants bcev 19 ': R567N, P568S, G569S, R613A, S631N, H632T, Q63
  • FreeStyle293 or Expi293 expression system was used for expression.
  • the expression plasmid was transfected into cells, and the culture supernatant was recovered in 4 to 6 days.
  • the culture supernatant containing gB was concentrated with UF membrane in order to suppress the influence of biotin contained in the medium.
  • the concentrated culture supernatant was purified using a StrepTactin column to obtain purified gB.
  • the properties of the obtained purified gB1-705 were confirmed to be multimeric by SDS-PAGE and gel filtration chromatography.
  • the column was Superdex 200 Increase 5/150 GL (GE Healthcare), and each modified gB purified product at a concentration of 100 ⁇ g / mL was applied.
  • the flow rate was 0.4 mL / min and the running buffer used D-PBS to detect A280.
  • Bcev1-3 modified with D199N, D200A, and H201T has domain I added with a mutation that introduces a sugar chain, and its expression level is improved about twice as compared to wild-type gB1-705. ing. Originally, this region is considered to be stabilized in contact with the viral membrane surface. As wild-type gB1-705 is secretory and expressed, this region which is not originally in contact with the solvent is exposed and thus destabilized, and a sugar chain is added thereto to stabilize bcev1-3, resulting in expression It is estimated that the amount has increased.
  • Bceg13 is gB added with modifications of R567N, P568S, G569S of domain IV.
  • the expression level is 0.3 times that of wild-type gB1-705. Since the same trimer structure as wild type is maintained, it is not a critical mutation to maintain the structure, but the speed of structural change and folding of single chain is slower compared to wild type. It may be.
  • Bcev11 is a variant in which R613A located in domain IV is introduced in addition to the mutations of D199N, D200A and H201T of bcev1-3.
  • the expression level of bcev11 was equivalent to that of wild type gB1-705.
  • the R613A mutation may be a mutation that reduces the expression level or makes it equivalent to the wild type.
  • Bcev12 is gB which added modification of R567N, P568S, G569S to bcev11. Based on the result of bceg13, the expression level should be decreased by adding the mutation of R567N, P568S and G569S, but the expression level was unexpectedly improved twice as compared with the wild type. This is an expression level equivalent to bcev1-3 only with modifications of D199N, D200A, and H201T. The R613A mutation also contributes to the decrease in expression level, but adding R567N, P568S, and G569S may also bring the structure and folding speed of Domain IV closer to bcev1-3.
  • Bcev19 is a gB variant in which mutations of S631N, H632T and Q633T have been introduced into bcev12.
  • the expression level of bcev19 was 0.6 times that of the wild type, and not only trimers but also trace amounts of multimers were contained.
  • Another mutation to S631, H632, or Q633, or glycosylation at a nearby location other than 631-633 aa was also examined, but no significant improvement effect on properties was observed (data not shown).
  • Bcev50 is a gB variant in which mutations of R602N, D603A, A604T have been introduced into domain IV of bcev19.
  • the expression level was lower than that of bcev19, and was 0.3 times that of wild type.
  • the properties also included trimers as in bcev19, but also contained multimers.
  • ⁇ A binding activity test of modified gB1-705> In order to confirm that the purpose is to reduce or eliminate the reactivity with the non-neutralizing antibody, the reaction of the prepared variants bcev1-3, bceg13, bcev12, bcev19 and bcev50 with the 44 clones of the anti-gB2 monoclonal antibody Sex was assessed by ELISA. Wild type gB1-705 was used as a control. gB1-705 was diluted to 1 ⁇ g / mL with PBS, 50 ⁇ L was added to a maxi sorp plate, and gB1-705 was immobilized by overnight incubation at 4 ° C.
  • the plate was washed with PBS, and 100 ⁇ L of the obtained antibody was added to the plate wells and incubated at 37 ° C. After 1 hour, the cells were washed with PBST, and 100 ⁇ L of detection antibody anti-human IgG Fc / HRP (ROCKLAND) was added to the wells of the plate and incubated at 37 ° C. After 1 hour, the cells were washed with PBST and developed by adding 100 ⁇ L of TMB to the wells of the plate. After 30 minutes, the reaction was quenched with 1N sulfuric acid, and absorbance (OD 450 nm / 650 nm) was measured with a microplate reader.
  • ROCKLAND detection antibody anti-human IgG Fc / HRP
  • bcev1-3 loses reactivity with F13, F19 and F78, which have D200 and H201 as epitopes, by introducing mutations of D199N, D200A and H201T, and bceg13 introduces mutations of R567N, P568S and G569S As a result, the reactivity with F76 and G25 in which R567 is an epitope was lost.
  • Bcev19 in which mutations of S631N, H632A and Q633T were introduced into bcev12 maintained the reaction with 22 types of neutralizing antibodies, while the reaction with non-neutralizing antibodies was reduced.
  • the bcev 50 in which mutations of R602N, D603A, and A604T were introduced into bcev19, had lost reactivity with all 21 non-neutralizing antibodies. On the other hand, although reactivity was maintained with 14 types among 23 types of neutralizing antibodies, reaction with 9 types was falling.
  • bcev 19 and bcev 50 are less likely to be non-neutralizing antibodies as compared to the wild type antigen gB 1-705, and can be expected as novel vaccine antigens capable of inducing an ideal immune response.
  • the wild-type gB antigen gB1-705 (gB WT) was used as a positive control and the saline as a negative control, and an immunogenicity test of the modified gB antigen was performed.
  • a predetermined amount of antigen is dissolved in saline for injection (saline), and BALB / c mice (5 weeks old) at a volume of 200 ⁇ L / animal / mouse together with MPLA (10 ⁇ g / animal) and CpG (1 ⁇ g / animal) , Females) was immunized subcutaneously at the back of a total of 3 times at 2-week intervals. Two weeks after the final immunization (third time), blood was collected for each individual to prepare serum. The prepared sera were serially diluted to evaluate the binding antibody titer against wild type gB antigen (anti-gB ELISA) and the neutralizing antibody titer against HSV-2 (50% reduction in plaque number activity).
  • Bcev 19 as a result of evaluating the binding antibody induction activity (anti-gB ELISA) against wild type gB antigen and the neutralizing antibody induction activity against HSV-2 (plaque number reduction rate) using serum collected 2 weeks after final immunization Both bcev 50 were confirmed to induce higher neutralizing antibody activity with less binding antibody activity than wild-type gB antigen (gB1-705) at any dose.
  • the present results show that the remaining neutralizing epitope (beneficial) is obtained by de-epitoping the non-neutralizing epitope (harmful and useless epitope) on the wild-type gB antigen by means of N-type glycosylation and alanine substitution. It is considered that the result is that the immune response to the epitope) can be induced more efficiently and effectively. In other words, it was considered that the biased immune response (immune bias) against the wild type gB antigen could be corrected into an ideal form (immune correction) by the present inventors' immuno refocusing strategy. I can say that.
  • ⁇ Mouse infection protection test of bcev 19 and bcev 50> The murine genital herpes infection model was used to separately evaluate the protective ability of prophylactic administration of the modified gB antigens bcev 19 and bcev 50.
  • Wild type gB1-705 (gBWT) was used as a positive control for all experiments. All antigens were immunized subcutaneously three times at two week intervals with 0.03 ⁇ g / mouse, 0.1 ⁇ g / mouse, 0.3 ⁇ g / mouse, 1 ⁇ g / mouse.
  • Depo-Provera was subcutaneously inoculated at 2 mg / animal 6 days before virus inoculation. Under anesthesia, 5 ⁇ 10 5 PFU / 20 ⁇ L / animal HSV-2 MS strain was intravaginally inoculated and 21 days follow-up was performed. The ability to protect against infection was evaluated using survival days (survival rate) and symptom scores as indices. The symptom score was classified according to the degree of vaginal lesion symptom and general symptom, and the score of 3 grade and 2 grade was set, respectively. What added the score of the vaginal lesion and the general symptom shown below was made into the symptom score.
  • bcev 19 The results of bcev 19 are shown in Table 6 (days alive), FIG. 8 (survival rate) and FIG. 9 (symptom score). At all doses (0.03 to 1 ⁇ g / animal) set for both gB WT and bcev 19, a significant effect of prolonging survival was shown compared to the negative control group (saline administration group).
  • the median survival days (MST) showed no clear dose dependence, and the MST ratio for the saline administration group was less than 2 at any dose, whereas the MST for the bcev 19 administration group was almost dose dependent.
  • the MST ratio was also> 2.8 at three doses of 0.1 ⁇ g / animal or more, and a clear improvement in survival rate was observed (Table 6, Figure 8).
  • bcev 50 results are shown in Table 7 (survival days), FIG. 10 (survival rate) and FIG. 11 (symptom score). Similar to bcev19, bcev 50 also showed clear superiority in terms of survival days, survival rate, and symptom score as compared to gB WT.
  • the analysis result of bcev 19 is shown in FIG. 12, and the analysis result of bcev 50 is shown in FIG.
  • both the bcev19 immune serum and the bcev 50 immune serum had increased binding antibody activity to gB1-457 and gB111-457.
  • the present results were obtained by de-epitopicizing the non-neutralizing epitope mainly present on domain IV, which is considered to be the decoy region on wild-type gB antigen, by N-type glycosylation and alanine substitution. It is considered that this is the result of being able to efficiently and effectively induce an immune response to the neutralizing epitope (beneficial epitope) which is frequently retained on and.
  • the biased immune response (immune bias) to the decoy region on the wild-type gB antigen could be corrected (immune correction) to an ideal form by the immunorefocusing strategy.
  • bcev19 introduces modifications of D199N, D200A, H201T in domain I, and modifications of R613A, R567N, P568S, G569S, S631N, H632T, Q633T in domain IV.
  • bcev 50 introduces modifications of D199N, D200A, H201T in domain I, and modifications of R613A, R567N, P568S, G569S, S631N, H632T, Q633T, R602N, D603A, A604T in domain IV.
  • D199N, D200A, and H201T in bcev19 and bcev50 are mutations that contribute to the improvement of the expression level. Similar results were obtained for bceg1-3 in which D199N, D200A and H201T were introduced into gB1-705, and this is supported (Table 4).
  • bcev 19 and bcev 19 'and bcev 50 and bcev 50' were compared in the mouse immunogenicity test, respectively.
  • the amount of antigen was subcutaneously immunized three times at 2-week intervals at 0.3 ⁇ g / animal and 1 ⁇ g / animal, respectively.
  • the N-type sugar chain (D199N, D200A, H201T) of domain I not only enhances the neutralizing antibody inducibility but also improves the protein expression level and improves the properties It turned out that it is a mutation that also contributes to
  • the modified HSV gB protein of the present invention can be used to make a vaccine effective for the prevention and treatment of HSV infection.

Abstract

単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の改変タンパク質であって、野生型ＨＳＶ　ｇＢのドメインＩＶ及びドメインＩに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ（非中和エピトープ）のうち、少なくとも１つのエピトープが不活性化（脱エピトープ化）された、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。

Description

改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質及びこれを含むＨＳＶワクチン
　本発明は、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質及びこれを含むＨＳＶワクチンに関する。
　単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ；ＨＳＶ）は、向神経性の病原体であり、粘膜上皮に初感染後は知覚神経に移行し、三叉神経節又は仙骨神経節にて終生潜伏感染する。潜伏しているＨＳＶはときに再活性化し、様々な病態を引き起こす（非特許文献１）。
　ＨＳＶには２つの血清型（ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２）が知られており、ＨＳＶ－１は主に口唇・角膜ヘルペス、ＨＳＶ－２は主に性器ヘルペスの原因となる。しかし近年、性行動の多様化等から、しばしばＨＳＶ－１が性器ヘルペス、ＨＳＶ－２が口唇ヘルペスの原因となることもある。日本における抗体陽性者（既感染者）比率は、ＨＳＶ－１で６０～８０％、ＨＳＶ－２は１０％であり、ＨＳＶ－２に限ったとしてもワクチンの潜在需要は１０００万人と推測される（非特許文献２）。また、米国における抗体陽性者（既感染者）比率は、ＨＳＶ－１が５７％、ＨＳＶ－２が２０％（そのうち約１０％が顕在性の性器ヘルペス）となっている（非特許文献３）。
　ＨＳＶの細胞への感染成立には、吸着と侵入の２段階で５つのエンベロープ糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が関与していることが知られている。この５つのエンベロープ糖タンパク質はそれぞれ、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、エンベロープ糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）、エンベロープ糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、エンベロープ糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）、エンベロープ糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）と呼ばれている（非特許文献４）。
　まず、吸着過程は、ｇＢ及びｇＣが細胞表面のヘパラン硫酸に結合することがきっかけとなる（非特許文献５、６）。この過程はＨＳＶが細胞に侵入する際必須ではないが、より効率的な侵入に関与していると考えられている。次に、侵入過程では、ｇＢ及びｇＤがそれぞれの宿主細胞受容体と結合し、ウイルスエンベロープと宿主細胞膜が融合することによって開始される。
　宿主細胞受容体としてｇＢ受容体とｇＤ受容体が知られている。ｇＢ受容体として、ＮＭ－ＩＩＡ（非特許文献７、８）及びＭＡＧ（非特許文献９）が同定されている。ｇＤ受容体として、ネクチン１（非特許文献１０）、ＨＶＥＭ（非特許文献１１）、及び３－Ｏ－硫酸化ヘパラン硫酸（非特許文献１２）が同定されている。また、ｇＨ／ｇＬのヘテロダイマーは、ｇＢ及びｇＤと相互作用し膜融合において重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１３）。
　２００６年にＨＳＶ－１　ｇＢの構造が解かれた結果、ｇＢは５つのドメインをもった３量体を形成していることが明らかになった（非特許文献１４）。また、ｇＢの構造は膜融合タンパク質として知られているＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ　ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　ｖｉｒｕｓ）のｇＧと似た構造をとっており、このことはｇＢがＨＳＶの膜融合タンパク質であることを裏付けている。また、ｇＢは他のヘルペスウイルスにおいても高度に保存されており、その機能はヘルペスウイルスに共通するものであると考えられている。
　感染症を引き起こす病原体は、従来型ワクチンで十分な効果を得ることが出来るＣｌａｓｓ　Ｉ群病原体と、従来型ワクチンや病原体感染歴では十分な防御免疫を獲得出来ないＣｌａｓｓ　ＩＩ群病原体とに大別される。Ｃｌａｓｓ　ＩＩ群病原体の防御が難しい理由として、それらが有する巧妙な免疫逃避機構が指摘されている（非特許文献１５）。ＨＳＶはＣｌａｓｓ　ＩＩ群病原体に分類されるが、これはＨＳＶが免疫逃避機構を有し、宿主の免疫反応を巧妙にくぐり抜けているからであると考えられている。ＨＳＶワクチン開発に関しては、これまで弱毒生ワクチンやアジュバント不活化ワクチンを用いた検討が試みられてきたが、いずれもＴ細胞免疫、及びＢ細胞免疫共に応答が不十分であり、自然感染後に得られる不十分な免疫応答のレベルと大差無いものであった。
Roizman, B.ら、Herpes simplex viruses, p. 2501-2602. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), 「Fields Virology」, 5th ed. Lippincott Williams &Wilkins, Philadelphia, P.A. 2007 Hashido M1ら、An epidemiologic study of herpes simplex virus type 1 and 2 infection in Japan based on type-specific serological assays, Epidemiol Infect. 1998 Mar; 120(2):179-86 Decision Resources; Emerging Vaccines 2008 ウイルス 2010 第60巻第2号，pp.187-196 Herold, B. C.ら、Glycoprotein C-independent binding of herpes simplex virus to cells requires cell surface heparan sulphate and glycoprotein B. J Gen Virol 1994 75 (Pt 6):1211-22 Herold, B. C.ら、Glycoprotein C of herpes simplex virus type 1 plays a principal role in the adsorption of virus to cells and in infectivity. J Virol 1991 65:1090-8 Arii, J.ら、Non-muscle myosin IIA is a functional entry receptor for herpes simplex virus-1. Nature 2010 467:859-62 Satoh, T.ら、PILRalpha is a herpes simplex virus-1 entry coreceptor that associates with glycoprotein B. Cell 2008 132:935-44 Suenaga, T.ら、Myelin-associated glycoprotein mediates membrane fusion and entry of neurotropic herpesviruses. Proc Natl Acad Sci U S A 2010 107:866-71 Geraghty, R. J.ら、Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science 1998 280:1618-20 Montgomery, R. I.ら、Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell (1996)87:427-36 Shukla, D.,ら、A novel role for 3-O-sulfated heparan sulfate in herpes simplex virus 1 entry. Cell 1999 99:13-22 Eisenberg RJら、Herpes virus fusion and entry: a story with many characters. Viruses 2012 4:800-832 10.3390/v4050800 SCIENCE 2006 313, 14, 217-220 Vaccine 26 (2008) 6189-6199 The Journal of Immunology, 1997,159 279-289.
　上述したように、ＨＳＶの治療にはアシクロビル等の抗ウイルス薬が用いられている。しかし、これらの抗ウイルス薬は、ウイルスを完全に除去することはできず、また服用を中止するとウイルスが再活性化する。そのため、ＨＳＶの感染そのものを防御する予防用ワクチン或いは再発症状を軽減緩和する治療用ワクチンの開発が望まれるが、現在、有効なワクチンは存在せず、そのアンメットニーズは高い。
　本発明は、免疫誘導に際して、野生型ＨＳＶ　ｇＢに比べて、ＨＳＶ　ｇＢに対する高い中和活性を示す中和抗体の含有割合が高い抗体を誘導でき、ＨＳＶ感染症の予防及び／治療に利用し得る、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質及びこれを含むワクチンを提供することを課題とする。
　本発明者らは、ＨＳＶの主要な防御抗原の一つとして知られているｇＢタンパクに関して、網羅的なＢ細胞エピトープ解析を行い、防御活性発現において有益なエピトープ（中和エピトープ）と無益又は有害なエピトープ（非中和エピトープ）とに分類することを試みた。そして、無益又は有害なエピトープを脱エピトープ化し、有益なエピトープを免疫的に際立たせることによって、その中和抗体誘導能や感染防御能を増強させた改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質、及び当該改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質を含むワクチンを完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
（１）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ　ｇＢのドメインＩＶ及びドメインＩに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ（非中和エピトープ）のうち、少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（２）非中和エピトープは、野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５６７番目のアルギニン残基（Ｒ５６７）、６０２番目のアルギニン残基（Ｒ６０２）、６３１番目のセリン残基（Ｓ６３１）、又は１９９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ１９９）に相当するアミノ酸残基からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープである、（１）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（３）非中和エピトープは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７、Ｒ６０２、Ｓ６３１、又はＤ１９９に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、（１）又は（２）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（４）改変は、アミノ酸残基の置換、及び/又はアミノ酸残基の欠損によって行われる改変を含む、（１）～（３）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（５）改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む、（４）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（６）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、（１）～（５）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（７）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、（１）～（６）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（８）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、（７）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（９）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、（８）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１０）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含む、（７）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１１）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ６０２に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、（６）～（１０）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１２）糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔのアミノ酸残基置換によって行われる、（１１）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１３）改変はさらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、（５）～（１２）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１４）前記糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、及びＨ２０１Ｔのアミノ酸残基置換によって行われる、（１３）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１５）前記改変はさらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における６１３番目のアルギニン（Ｒ６１３）に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、（４）～（１４）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１６）（１）～（１５）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質を含む、ＨＳＶワクチン。
（１７）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５６７番目のアルギニン残基（Ｒ５６７）、６０２番目のアルギニン残基（Ｒ６０２）、６３１番目のセリン残基（Ｓ６３１）、又は１９９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ１９９）に相当するアミノ酸残基からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換又は欠失させた、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１８）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、（１７）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（１９）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、（１７）又は（１８）の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（２０）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における６１３番目のアルギニン（Ｒ６１３）に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、（１７）～（１９）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（２１）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、（１７）～（２０）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（２２）改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＳ６３１に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、（１７）～（２１）のいずれか改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
（２３）（１８）～（２２）のいずれかの改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質を含む、ＨＳＶワクチン。
　本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質及びこれを含むワクチンによって免疫誘導した場合、野生型ＨＳＶ　ｇＢで免疫誘導した場合に比べて、血清中に中和活性の高い中和抗体が相対的に多く含まれ得る。すなわち、本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質及びこれを含むワクチンはイムノ・リフォーカスを誘導し、ＨＳＶに対する強い防御効果をもたらすことが可能である。したがって、ＨＳＶ感染症に対して高い予防・治療効果が期待できる。
実施例２のｇＢとそのプロテアーゼ切断断片を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す図である。 実施例２の競合ＥＬＩＳＡにより取得した抗ｇＢ抗体を分類し得られた相関図である。 実施例３のアラニンスキャングによるｇＢ抗体のエピトープの同定結果のＭＯＥ図である。 実施例５の改変型ｇＢタンパク質の設計戦略のための模式図を示す図である。 実施例５の改変型ｇＢタンパク質の設計戦略のための結晶構造の簡略図を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ１９のマウス免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ５０のマウス免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ１９のマウス感染防御試験の生存率の結果を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ１９のマウス感染防御試験の症状スコアの結果を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ５０のマウス感染防御試験の生存率の結果を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ５０のマウス感染防御試験の症状スコアの結果を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ１９のイムノ・リフォーカスの解析結果を示す図である。 実施例５のｂｃｅｖ５０のイムノ・リフォーカスの解析結果を示す図である。 実施例５のゲル濾過クロマトグラフィーによるｂｃｅｖ１９、ｂｃｅｖ１９’、ｂｃｅｖ５０及びｂｃｅｖ５０’の性状解析の結果を示す図である。 実施例５のマウス免疫原性試験のｂｃｅｖ１９とｂｃｅｖ１９’の比較結果を示す図である。 実施例５のマウス免疫原性試験のｂｃｅｖ５０とｂｃｅｖ５０’の比較結果を示す図である。 ＨＳＶ－１由来ｇＢのアミノ酸配列（配列番号２）及びＨＳＶ－２由来ｇＢのアミノ酸配列（配列番号３）を多重整列した比較結果を示した図であり、斜体部はリーダー配列を示し、下線部はＨＳＶ－１由来ｇＢのドメインＩＩの３８３－３８８番目のアミノ酸残基（Ｉ３８３－Ｒ３８８）、及び、ＨＳＶ－２由来ｇＢのドメインＩＩの３８６－３９１番目のアミノ酸残基（Ｉ３８６－Ｒ３９１）を示す。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の改変タンパク質であって、野生型ｇＢのドメインＩＶ及びドメインＩに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ（非中和エピトープ）のうち、少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質である。
　本発明は、本発明者らが提案する仮説、ＨＳＶ　ｇＢ抗原において「デコイ領域」が存在することに基づくものである。「デコイ領域」は、英語の「Ｄｅｃｏｙ（おとり）」に由来し、病原体が宿主の免疫反応から逃れる免疫逃避機構の一つと考えられる。「デコイ領域」は、中和抗体活性の無い又は低い抗体を誘導する抗原領域であり、この欺瞞的刷り込み（Ｄｅｃｅｐｔｉｖｅ　Ｉｎｐｒｉｎｔｉｎｇ；「免疫偏向」ともいう）によって、中和抗体が産生しないよう、又は産生量が少ないように、病原体が宿主の免疫反応から逃れる機構であると考えられる。
　これまで、ＨＳＶにおいてデコイ領域の存在は確認されておらず、デコイ領域の概念すらなかった。本発明者らは、ヒト抗体ライブラリーを用いて実施した抗ＨＳＶ　ｇＢ抗体の網羅的探索によって得られた抗ｇＢモノクローナル抗体に対して、詳細なエピトープマッピング解析を行った。その結果、はじめてＨＳＶ　ｇＢのドメインＩＶ及びドメインＩは、無益又は有害なエピトープが集中しているデコイ領域であることを明らかにした。さらにこのデコイ領域において、非中和エピトープを脱エピトープ化することによって、有益なエピトープを免疫的に際立たせることによって、中和活性の高い抗体を誘導できる改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質を得るに到った。
　「野生型ＨＳＶ　ｇＢ」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＳＶ－１由来のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＨＳＶ－２由来のｇＢの全長を指し、両者を多重整列して比較した結果、その配列同一性は、約８７％である（図１７）。ｇＢの立体構造も解析されており、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン及びエクトドメインからなることは知られている。ＨＳＶ－１由来のｇＢの結晶構造は、例えばＳｃｉｅｎｃｅ　３１３：２１７－２２０（２００６）及びＪ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１２９２４－１２９３３（２０１０）によって報告されている。一方、ＨＳＶ－２由来のｇＢの結晶構造は、報告されていないが、上記ＨＳＶ－１由来のｇＢの結晶方法にしたがって、同様に解析することができる。「野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメイン」は、可溶性の、抗原性を有する、野生型ＨＳＶ　ｇＢの細胞外領域を意味する。野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメインの一例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＨＳＶ－２の３３３株由来の野生型ｇＢエクトドメイン１－７０５である。
　ｇＢの結晶構造においては、それぞれ上部（Ｃｒｏｗｎ）と下部（Ｂｏｔｔｏｍ）に位置するドメインＩＶ及びドメインＩは、中間部（Ｍｉｄｄｌｅ）に位置するドメインＩＩよりも「目立つ」ため、抗原提示性が高く、実際に血液中の抗体においても、本発明者らが調べたところ、ドメインＩＶ及びドメインＩに対する抗体の割合が高く、ドメインＩＩに対する抗体の割合が低い。しかし一方で、本発明者らの研究によれば、野生型ＨＳＶ　ｇＢドメインＩＩには、中和抗体を誘導するエピトープ（本明細書においては「中和エピトープ」という）しか存在しないのに対して、野生型ＨＳＶ　ｇＢのドメインＩＶ及びドメインＩには、中和エピトープと、非中和抗体を誘導するエピトープ（本明細書においては「非中和エピトープ」という）との両方が存在することがわかった。非中和抗体は、抗原（すなわち、ウイルス）と結合するものの、ウイルスの活性を抑えることができないため、特にワクチンの製造においては非中和抗体ではなく中和抗体の産生を誘導できることが重要とされている。
　本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質は、中和抗体の産生にあまり有益でない、「目立つ」ドメインＩＶ及びドメインＩを脱エピトープ化し「目立たなく」することで、中和エピトープを有するドメインＩＩを「目立たせる」ことにより、中和活性の高い抗体を誘導することができる。
　「改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質」（「ＨＳＶ　ｇＢの改変タンパク質」又は「改変体」ともいう。）とは、野生型ＨＳＶ　ｇＢに対して、少なくとも一つのアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠失又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されたタンパク質等の野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質は、野生型タンパク質よりも中和抗体誘導活性が高い。
　「中和抗体誘導活性」とは、抗原タンパク質の中和抗体を誘導できる能力をいい、抗原タンパク質を被検動物に接種することで得られる免疫血清中の中和抗体価（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｉｔｅｒ）で評価され得る。「中和抗体」とは、ウイルス粒子の感染性を失わせることができる抗体をいい、例えば被検ウイルスのプラーク数を５０％減少させるのに必要な抗体の濃度（ＮＴ５０）にてその抗体の中和活性の強度を評価する。
　「脱エピトープ化」とは、野生型ＨＳＶ　ｇＢにおいてエピトープとして抗体産生に寄与していた部位をエピトープとして機能しないように改変することをいう。脱エピトープ化の方法としては、エピトープの部位にあるアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へと置換する方法、エピトープの部位にあるアミノ酸残基を欠損（欠失）させる方法、及びエピトープの部位にあるアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖を導入する方法等が挙げられる。脱エピトープ化の方法としては、糖鎖を導入する方法、特にＮ型糖鎖（Ｎ－グリコシド結合糖鎖）を導入する方法が好ましい。これにより、糖鎖を導入した部分のみならず、その嵩高さによって周辺のエピトープをも同時にマスキング可能な点で有効である。ｇＢと相互作用する抗体やレセプター等のタンパク質とのサイズ比を考えると、数アミノ酸程度のごく狭い範囲で結合が形成されるような、点と点の相互作用による可能性が低いと予想される。ｇＢとレセプターとの結合においては、広範囲のアミノ酸が協調的に結合を形成するような面と面での相互作用網が形成されていると考えられる。糖鎖導入は、自身の嵩高さによって周辺残基を広範囲に隠し、同時に結合相手のアクセスを阻害するのに有効な脱エピトープ化の方法であると考えられる。また、糖鎖は抗糖鎖抗体が誘導され難いという報告もあり、改変による新たな免疫原性の出現可能性を低く抑えることが可能であると考えられる。
　野生型ｇＢのドメインＩＶ及びドメインＩに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ（非中和エピトープ）の一例としては、野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５６７番目のアルギニン残基（Ｒ５６７）、６０２番目のアルギニン残基（Ｒ６０２）、６３１番目のセリン残基（Ｓ６３１）、又は１９９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ１９９）に相当するアミノ酸残基からの距離が１．５ｎｍ以下の領域、さらに好ましくは当該アミノ酸残基からの距離が１ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。ここで「アミノ酸残基からの距離」とは、野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメインの結晶構造の表面の形状に関わらず、上記アミノ酸残基からの直線距離をいう。非中和エピトープは無益又は有害の抗体の産生を誘導し、中和抗原の産生に有益でないため、これらの脱エピトープ化は、無益又は有害の抗体の産生を低減し、また、有益なエピトープを際立たせることで、中和抗体の産生を増加できる。結晶方法は特に限定されないがＪ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１２９２４－１２９３３（２０１０）に記載の結晶方法が挙げられる。例えば、ｇＢの結晶を、１５％ＰＥＧ４０００－０．３Ｍ　ＮａＣｌ－０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いて成長させることができる。
　非中和エピトープとして、また配列番号１に記載のアミノ酸配列における５６７番目のアルギニン残基（Ｒ５６７）、６０２番目のアルギニン残基（Ｒ６０２）、６３１番目のセリン残基（Ｓ６３１）、又は１９９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ１９９）に相当するアミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。これらのエピトープが非中和エピトープであることが本発明者らによって証明されているため、これらのエピトープの脱エピトープ化は、防御活性発現において無益又は有害の抗体の産生を低減できる。また、これらのエピトープの脱エピトープ化は、有益なエピトープを際立たせることで、中和抗体の産生割合を増加させることができる。
　脱エピトープのための改変は、アミノ酸残基の置換、アミノ酸残基の欠損、及び／又はアミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む。
　上記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における１９９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ１９９）、５６７番目のアルギニン残基（Ｒ５６７）、６０２番目のアルギニン残基（Ｒ６０２）、及び６３１番目のセリン残基（Ｓ６３１）に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含むことが好ましい。配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含むことが好ましく、該糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、及びＱ６３３Ｔのアミノ酸残基置換によって行われることが好ましい。配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含むことがさらに好ましい。改変はさらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ６０２に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含むことが好ましく、該糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔのアミノ酸残基置換によって行われることが好ましい。改変はさらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含むことが好ましく、該糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、及びＨ２０１Ｔのアミノ酸残基置換によって行われることが好ましい。
　糖鎖の導入方法は、通常の方法であればよく特に限定されないが、たとえば、Ｎ型糖鎖を導入する場合、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１５１１８．1、配列番号４）をテンプレートとし、Ｎ型糖鎖を導入する目的部位の３つの連続したアミノ酸配列が、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）となるように、プライマーを設計し、ＰＣＲによって変異を導入する。糖鎖導入のための変異は、たとえば、配列番号１に記載のアミノ酸配列における以下の変異が挙げられる：（Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ）、（Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ）、（Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ａ、Ｑ６３３Ｔ）、及び（Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔ）。目的の改変型ｇＢタンパク質の核酸配列、さらに必要あれば６×Ｈｉｓ等のタグを連結した核酸配列を適切なベクターにクローニングし、発現させることによってｇＢ改変体を得ることができる。そして、ｇＢ改変体の目的部位のアスパラギンに通常の方法によってＮ型糖鎖を付加する。
　非中和エピトープの改変はさらに、エピトープである荷電アミノ酸残基を特徴のないアミノ酸残基、たとえばアラニン残基への置換を含んでもよい。この方法はＮ型糖鎖の導入とは異なり、ピンポイントで脱エピトープ化することができる利点がある。たとえば、アラニン置換として、配列番号１に記載のアミノ酸配列における６１３番目のアルギニン（Ｒ６１３）に相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換を含むことが好ましい。
　改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質として、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれに糖鎖導入され、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における６１３番目のアルギニン（Ｒ６１３）に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換された、ｇＢタンパク質が好ましい。改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質の別の例としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれに糖鎖導入され、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における６１３番目のアルギニン（Ｒ６１３）に相当するアミノ酸残基がアラニンに置換された、ｇＢタンパク質がより好ましい。
　本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質は、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、目的の変異を導入するためのプライマーを設計して、ＰＣＲによって変異が導入された核酸を得て、発現プロモータと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。また、糖鎖導入による改変体の場合は、上述のとおりに得ることができる。
　作製された改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。
　ＨＳＶ感染症は、ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２による感染症を含み、例えば、口唇ヘルペス、角膜ヘルペス、性器ヘルペス、全身性の新生児ヘルペス、並びに、ＨＳＶに起因する口内炎、皮膚疾患、脳炎、髄膜炎、及び脊髄炎が挙げられる。
　本発明のＨＳＶワクチンは、本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質を含む。
　本実施形態のＨＳＶワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。
　本実施形態のＨＳＶワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、等が、更に適宜配合されてもよい。
　本実施形態のＨＳＶワクチンの免疫原性をさらに高めるために、アジュバントを更に含むことも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント（ＡＳ０３、ＭＦ５９等）、ＣｐＧ及び３－Ｏ－脱アシル化－４’－モノホスホリル　ｌｉｐｉｄ　Ａ（ＭＰＬ）等のＴｏｌｌ様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ－グルタミン酸等のポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリン等の多糖類が挙げられる。
　本実施形態のＨＳＶワクチンは、本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質と、必要に応じて、担体、アジュバント等とを混合することにより得ることができる。アジュバントは、用時に混合するものであってもよい。
　本実施形態のＨＳＶワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。
　本実施形態のＨＳＶワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、スプレーによって投与する方法であってもよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１　抗ｇＢ抗体の単離
　ＨＳＶ－２の３３３株に由来するｇＢのエクトドメイン１－７０５ａａ（ｇＢ１－７０５）のｃＤＮＡ（配列番号４）をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。ｇＢのＣ末端にはＳｔｒｅｐ　ＴａｇＩＩが付加されるようにデザインした。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジー社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。ｇＢを含む培養上清は、培地中に含まれるビオチンを除くためにＵＦ膜で濃縮した。濃縮した培養上清は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラムを使った精製を行い、精製ｇＢ２を取得した。ｇＢの３７０から４５７ａａまでのアミノ酸をコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅し、ｐＥＴ４３．１ｂ（＋）にクローニングし、ｇＢ３７０－４５７発現プラスミドを構築した。このプラスミドには精製を容易にするため、Ｎｕｓ－Ｔａｇ遺伝子とＨｉｓ－Ｔａｇ遺伝子が付加されている。プラスミドをＲｏｓｅｔｔａ２（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。ＬＢ培地中で３７℃にて対数増殖期中期まで培養した後、１ｍＭ　ＩＰＴＧで発現誘導し、２５℃オーバーナイトで培養した。可溶性タンパクの抽出にはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　ｍｉｘを用いた。得られたタンパクは、Ｎｉ　ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
　扁桃腺や脾臓由来のヒトＢ細胞由来のｍＲＮＡからヒトＶＨ及びＶＬ　ｃＤＮＡを使用して調製されたｓｃＦｖ－ｐｈａｇｅディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによって、ＨＳＶ－２のｇＢへの反応性を有するｓｃＦｖクローンを４４クローン単離した。単離したｓｃＦｖ遺伝子のＶＨ鎖及びＶＬ鎖遺伝子のＤＮＡ塩基配列をＢｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。いずれのクローンも独立した配列を有しており、そのエピトープにバリエーションがあることが期待された。４４クローン以外にも複数ｓｃＦｖクローンが取得されたが、その殆どが、Ｄ１又はＤ２に似た配列を有していた（データは示さず）。Ｄ１及びＤ２はＶＨ５ファミリーであり、生体内の抗体のポピュレーションとしては、少ないものである。
実施例２　抗ｇＢ抗体の分類
＜抗体断片ｓｃＦｖ－ｈＦｃの調製＞
　単離したｓｃＦｖ遺伝子の可変領域をヒトＦｃ遺伝子と連結し、ｐＣＡＧベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ－ｈＦｃ発現プラスミドを構築した。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。培養上清は、Ａｂ　Ｒａｐｉｄ　ＰｕＲｅ　１０（プロテノバ）を用いてｓｃＦｖ－ｈＦｃの精製を行った。また、各ｓｃＦｖ遺伝子がクローニングされているファージミドベクターを有する大腸菌ＴＧ１株を２×ＹＴＣＧ培地（３７℃）で培養し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージをｍｏｉ＝２０で感染させた後、２×ＹＴＣＫ培地（２５℃）、オーバーナイトでファージの発現を行った。得られたｓｃＦｖ－ｐｈａｇｅは２０％－ＰＥＧ－２．５Ｍ　ＮａＣｌによる濃縮を行った。
　取得したｓｃＦｖ－ｐｈａｇｅ及びｓｃＦｖ－ｈＦｃの結合活性はＥＬＩＳＡによって評価した。ｇＢ１－７０５をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ　ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に５０μＬ入れ、４℃でオーバーナイトもしくは室温で１～２時間インキュベートすることによって組換えｇＢを固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、取得したｓｃＦｖ－ｐｈａｇｅ、ＩｇＧをプレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ－Ｍ１３／ＨＲＰ（ＧＥヘルスケア）、もしくはａｎｔｉ－ｈＦｃ／ＨＲＰ（コスモバイオ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス）で吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した（データ示さず）。
＜ｇＢとそのプロテアーゼ切断断片を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇによる抗ｇＢ抗体の分類＞
　得られた抗ｇＢ抗体４４クローンをグルーピングするために、材料としてｇＢ１－７０５をトリプシン又はキモトリプシンで消化したｇＢ断片、ｇＢ１－７０５及びその切断変異体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇを実施した。
　５００ｎｇの変性又は未変性のｇＢ１－７０５を８－１６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥへＬｏａｄし電気泳動した。変性状態のｇＢ１－７０５は、ｇＢ１－７０５に２％　２－メルカプトエタノールを加え、９６℃で５分間煮沸することで得た。非変性状態のｇＢ１－７０５はこれらの操作を行わず、直接Ｌｏａｄした。トリプシン又はキモトリプシンで消化したｇＢ断片は、以下のように得た。０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に５００ｎｇのｇＢ１－７０５とトリプシン１ｎｇ、５ｎｇ若しくは１０００ｎｇ、又はキモトリプシン１ｎｇを加え、３７℃、１時間又は３時間静置し酵素処理し、２％２－メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）を添加したＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファーを加え、９６℃で５分間煮沸することで反応を停止させた。各検体を８－１６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥへＬｏａｄし電気泳動し、ゲルをニトロセルロース膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）へ転写し、２％スキムミルク／ＰＢＳ－Ｔを用いてＢｌｏｃｋｉｎｇした。ＰＢＳ－Ｔによる洗浄の後、各ｓｃＦｖ－ｈＦｃを１μｇ／ｍＬ　２％スキムミルク－ＰＢＳ－Ｔで室温、３０分反応させた。再度の洗浄の後、２％スキムミルク－ＰＢＳ－Ｔ中ａｎｔｉ－ｈＦｃ／ＨＲＰを反応させ、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅｇｅｎｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で発色させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンドの検出には、銀染色を行った。
　結果を図１に示す。図１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇの各レーンの検体は以下のとおりである。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、レーン１：非還元未変性ｇＢ１－７０５、レーン２：煮沸のみのｇＢ１－７０５、レーン３：煮沸かつ変性剤で変性させたｇＢ１－７０５、レーン４：煮沸かつ変性剤で変性させたｇＢ３７０－４５７、レーン５：３７℃で１時間１ｎｇ（１：５００）のトリプシンで処理して煮沸かつ変性剤で変性させたｇＢ１－７０５、レーン６：３７℃で３時間５ｎｇ（１：１００）のトリプシンで処理したｇＢ１－７０５、レーン７：３７℃で３時間１００ｎｇ（１：５）のトリプシンで処理して煮沸かつ変性剤で変性させたｇＢ１－７０５、レーン８：３７℃で１時間１ｎｇ（１：５００）のキモトリプシンで処理して煮沸かつ変性剤で変性させたｇＢ１－７０５、レーンＭ：ＢｅｎｃｈＭａｒｋ　ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　Ｌａｄｄｅｒ、及びレーンＭ´：Ｍａｇｉｃ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｓｔａｎｄａｒｄとしている。
　ｇＢ１－７０５を非還元で煮沸なしでＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析すると、約３００ｋＤａ付近にバンドを検出した（レーン１）。一方、ｇＢ１－７０５を煮沸することで、約１００ｋＤａ付近にバンドを検出した（レーン２）。これは、それぞれｇＢの３量体と単量体を意味しており、煮沸することで３量体から単量体になることから、Ｓ－Ｓ結合を介して３量体を形成しているのではないことが示唆された。
　トリプシン又はキモトリプシンによる処理によって、ｇＢはそれぞれ断片化した。これらのｇＢと抗体Ｅ７　ｓｃＦｖ－ｈＦｃの反応性をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇで検出した。Ｅ７　ｓｃＦｖ－ｈＦｃは、非還元で煮沸していないｇＢ１－７０５（レーン１）、煮沸したｇＢ１－７０５（レーン２）、還元で煮沸したｇＢ１－７０５（レーン３）及びプロテアーゼ処理したｇＢ断片（レーン５、６、７）に反応性を示した（図１）。同様の反応パターンは抗体Ｅ１７及びＥ３１で観察された（表１）。これらのことは抗体Ｅ７、Ｅ１７及びＥ３１　ｓｃＦｖ－ｈＦｃが連続エピトープであることを示唆している。抗体Ａ１７、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ３７、Ｄ４８及びＥ１５　ｓｃＦｖ－ｈＦｃは、非還元で煮沸していないｇＢ１－７０５、煮沸したｇＢ１－７０５、還元で煮沸したｇＢ１－７０５及びプロテアーゼ処理したｇＢ断片に反応性を示したが、それらのｇＢ断片との反応性はＥ７、Ｅ１７、Ｅ３１とは異なるパターンを示した（表１）。Ｄ１及びＤ２間の反応パターン、Ｄ３及びＤ３７間の反応パターンが同じであり、それぞれ同一又は近傍のエピトープを認識していることが示唆される。
　ｇＢ断片の反応性のパターンから６つのグループに分類できた。Ｅ４１、Ｆ１３、Ｆ１８、Ｆ１９、Ｆ２２、Ｆ３０及びＦ７８　ｓｃＦｖ－ｈＦｃは、非還元で煮沸していないｇＢ１－７０５のみに反応性を示した（表１）。これらの抗体クローンは、３量体特異的であり、不連続エピトープであることが示唆される。Ｆ７、Ｆ１１、Ｆ１２、Ｆ３３、Ｆ５２、Ｆ６５、Ｆ６７、Ｆ６８、Ｆ６９、Ｆ７６、Ｆ８０、Ｆ８７、Ｇ３９、Ｇ６４、Ｇ７６、Ｈ１５、Ｈ３４、Ｈ５７、Ｈ６１、Ｈ６５、Ｇ１０、Ｇ２５及びＧ６５は、非還元で煮沸していないｇＢ１－７０５だけでなく煮沸したｇＢ１－７０５への反応性を示した（表１）。これらの抗体クローンは、３量体特異的ではないが、ある程度の立体構造を認識する不連続エピトープであることが示唆される。Ｅ８、Ｅ３５、Ｅ８２及びＥ８８は、非還元で煮沸していないｇＢ１－７０５、煮沸したｇＢ１－７０５及び還元で煮沸したｇＢ１－７０５への反応性を示したが、プロテアーゼによる切断断片への反応性は確認できなかった（表１）。これらの抗体クローンは、完全に変性状態のｇＢとの反応性を有することから連続エピトープであることが示唆されるが、その領域はプロテアーゼによる影響を受けやすいのかもしれない。以上のｇＢ及びｇＢ断片を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇによる解析により、取得した抗ｇＢ抗体４４クローンは９つのグループに分類されることがわかった。このうち、３０クローンが不連続エピトープ、１４クローンが連続エピトープであることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜競合ＥＬＩＳＡによる取得抗体の分類＞
　さらに取得抗体４４クローンのグルーピングを行うために、各抗ｇＢクローンのｓｃＦｖ－ｐｈａｇｅ及びｓｃＦｖ－ｈＦｃを用いた競合ＥＬＩＳＡを実施した。
　取得したｓｃＦｖ－ｐｈａｇｅとｓｃＦｖ－ｈＦｃ間の競合をＥＬＩＳＡによって評価した。ｇＢ１－７０５をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ　ｐｌａｔｅに５０μＬ入れ、４℃、オーバーナイトでインキュベートすることによってｇＢ１－７０５を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、取得したｓｃＦｖ－ｈＦｃをプレートのウェルに５０μＬ加え、２５℃でインキュベーションした。１時間後、ｓｃＦｖ－ｐｈａｇｅをプレートのウェルに５０μＬ加え、２５℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ－Ｍ１３／ＨＲＰをプレートのウェルに１００μＬ加え、２５℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
　その結果に基づき、抗体の相関図を作成した（図２）。抗体Ｅ４１、Ｆ１８、Ｆ１９、Ｆ１３、Ｆ７８、Ｆ２２及びＦ３０が含まれるグループは、非還元で煮沸していないｇＢ１－７０５のみに反応性を示すグループであるが、他のグループとは異なり、競合ＥＬＩＳＡの結果から抗体Ｅ４１、Ｆ１８、Ｆ１９、Ｆ１３及びＦ７８のグループとＦ２２及びＦ３０のグループに分類されることが確認された。一方、他のグループは上述したグループからさらに細分化されることはなかった。よって、抗ｇＢクローンは、計１０グループに分類された。またＤ４８はｇＢ３７０－４５７との反応性を有していたことからｇＢの３７０ａａから４５７ａａの中にエピトープが存在することが示唆された。
実施例３　アラニンスキャングによるｇＢ抗体のエピトープの同定
　ｇＢのエクトドメインである１－７０５ａａ中の荷電アミノ酸残基（１８７箇所）をそれぞれアラニンに改変した遺伝子をＰＣＲによって構築し、ｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。取得したｇＢアラニン置換体の発現量と、アラニン置換体と抗体断片との結合活性をＥＬＩＳＡによって評価した。
　ｇＢアラニン置換体を含む培養上清をＭａｘｉＳｏｒｐ　ｐｌａｔｅに入れ、室温で１時間インキュベートすることによってｇＢアラニン置換体を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ／ＨＲＰ（ＩＢＡ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ　硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定し、発現量を求めた。
　一方、ｇＢアラニン置換体を含む培養上清をＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎを固定化したＭａｘｉＳｏｒｐ　ｐｌａｔｅに入れ、室温で１時間インキュベートすることによってｇＢアラニン置換体を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、抗体断片をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｆｃ／ＨＲＰ（コスモバイオ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ　硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定し、結合活性を求めた。アラニン置換していない野生型ｇＢ１－７０５と比較して発現量あたりの反応性が変化しているかどうかでエピトープ候補を選出した。さらに、精査が必要な抗体の場合には、ｇＢアラニン置換体の精製品を用いたＥＬＩＳＡでエピトープ候補の絞りこみを行った。
　アラニン置換体と抗体断片との結合活性に基づき、それぞれの抗体のエピトープを予測し、その結果を表２に示す。ｇＢ３量体のＣｒｏｗｎ部分を形成するドメインＩＶに対する抗体が２８クローン存在し、最も数が多かった。続いて、Ｂｏｔｔｏｍ部分を形成するドメインＩに対する抗体が８クローン存在しており、Ｍｉｄｄｌｅ部分を形成するドメインＩＩに対する抗体が１クローンしか存在しなかった。エピトープを同定できた抗体の中には、アミノ酸配列上、離れた位置であるものが多い。ＭＯＥ（図３）でＨＳＶ１のｇＢをテンプレートとして、ＨＳＶ２のｇＢをモデリングし、その位置を確認したが、構造上近接したアミノ酸同士であった（データ示さず）。唯一ドメインＩＩを認識するＤ４８は、Ｒ３９１とＤ３６２が同定されたが、Ｄ４８がｇＢ３７－４５７と反応していることをから、Ｒ３９１がエピトープのキーである可能性が高い。また４４クローン中７クローン（Ｅ８２、Ｅ８８、Ｆ７、Ｆ６５、Ｆ８０、Ｇ１０、Ｇ７６）のエピトープは同定に至らなかったが、これまでの競合ＥＬＩＳＡ等のグルーピングによって同グループにエピトープを同定できたクローンが存在するため、その近傍のアミノ酸残基がエピトープである可能性が高い。例えば、Ｅ８２及びＥ８８のエピトープは同定できなかったが、Ｅ８及びＥ３５のエピトープは、Ｒ５３２、Ｒ６１３、Ｈ６３２であることがわかっている。Ｅ８２及びＥ８８は、Ｅ８及びＥ３５と競合ＥＬＩＳＡで競合するため、Ｅ８２及びＥ８８のエピトープは、Ｒ５３２、Ｒ６１３、Ｈ６３２の近傍であることが予想される。エピトープを同定できなかった抗体は、今回の解析が荷電アミノ酸残基に限定しているという意味で荷電アミノ酸以外のアミノ酸残基がエピトープの可能性が高いと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４　中和試験によるｇＢのＣｒｏｗｎ部分とＢｏｔｔｏｍ部分に中和エピトープと非中和エピトープの存在の解析
＜細胞とウイルス＞
　ウイルスの培養、感染価測定、中和抗体価測定にはＶｅｒｏ細胞（ＣＣＬ．８１）をＡＴＣＣから購入して使用した。中和試験及び感染防御能解析にはＨｕｍａｎ　ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　２（ＨＳＶ－２）ＭＳ株［ＶＲ－５４０］を使用した。ＨＳＶ－１はＡＴＣＣからＫＯＳ株（ＶＲ－１４９３）を購入し使用した。Ｖｅｒｏ細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地でフルシートになるまで培養し、ＨＳＶ－２　ＭＳ株及びＨＳＶ－１　ＫＯＳ株をｍ．ｏ．ｉ＝０．０１～１で接種し、２－３日間２％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地で培養後、３回の凍結融解により細胞内のウイルスを培地中に放出させた。遠心後、上清を回収し、ＨＳＶ－２ウイルスバンク及びＨＳＶ－１ウイルスバンクとした。
＜ウイルス中和試験＞
　取得した抗ｇＢ　クローンの中和活性をウイルス中和試験により評価した。中和試験はプラーク数減少活性（プラークリダクション活性）測定とｃｅｌｌ　ｔｏ　ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性測定の２種類の方法を用いて行った。対象とするウイルスはＨＳＶ－２　ＭＳ株とＨＳＶ－１　ＫＯＳ株の２種を用いた。プラークリダクション活性測定は、被験抗体を所定の濃度になるように調製し約１００ＰＦＵのＨＳＶ－２　ＭＳ株又はＨＳＶ－１　ＫＯＳ株と混合後、３７℃１時間反応させた。４８ウェルプレートにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に反応液を播種し、３０℃で１時間吸着後に１％メチルセルロース含有培地で２４時間培養後、メタノールとエタノールを1対１で混合した５０％メタノール／５０％エタノール（－２０℃）で、－２０℃で３０分間不活化及び固定を行った。その後、抗ＨＳＶ　ｇＢモノクローナル抗体を３７℃で１時間反応させ、抗ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｄａｋｏ　Ｐ０４４７）とＴＭＢＨ（ＭＯＳ　ＴＭＢＨ－１０００）で免疫染色し、ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラーク数をカウントした。
　Ｃｅｌｌ　ｔｏ　Ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性測定は、４８ウェルプレートにフルシートになったＶｅｒｏ細胞に約１００ＰＦＵのＨＳＶ－２　ＭＳ株又はＨＳＶ－１　ＫＯＳ株を接種し、３０℃で１時間吸着後、所定濃度の被験抗体を含有した１％メチルセルロース培地（抗体濃度は５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ及び１２５μｇ／ｍＬ）を添加し、ＨＳＶ－２　ＭＳ株は約４０時間、ＨＳＶ－１　ＫＯＳ株は約４８時間培養後、５０％メタノール／５０％エタノール（－２０℃）で、－２０℃で３０分間不活化及び固定を行った。その後、抗ＨＳＶ　ｇＢモノクローナル抗体を３７℃で１時間反応させ、抗ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｄａｋｏ　Ｐ０４４７）とＴＭＢＨで免疫染色し、ＥＬＩＳＰＯＴアナライザーで各ウェルの画像を取り込み、解析ソフトでプラークサイズの平均値を解析した。
　結果を表３に示す。取得した４４クローンは、中和抗体と非中和抗体の２つに大別され、中和抗体の中には、ＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の両方を中和するクローン、どちらか一方のみを中和する型特異的なクローン、プラーク数減少活性は強いがｃｅｌｌ　ｔｏ　ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性は無い（弱い）クローン、プラーク数減少活性もｃｅｌｌ　ｔｏ　ｃｅｌｌ感染拡大抑制活性も共に強いクローン等が存在していた。また、この中和のパターンは、これまでのグルーピングの結果と連動していることが確認された（表３、図２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　プラーク数減少活性は、５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ及び１２５μｇ／ｍＬで解析し、５μｇ／ｍＬ以下まで中和能が認められるものを「＋＋」、２５μｇ／ｍＬ以下まで中和能が認められるものを「＋」、１２５μｇ／ｍＬ以下で中和能が認められるものを「±」とした。Ｃｅｌｌ　ｔｏ　Ｃｅｌｌ感染拡大抑制は、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ及び２０μｇ／ｍＬで解析を行い、５μｇ／ｍＬ以下まで中和能が認められるものを「＋＋」、１０μｇ／ｍＬ以下まで中和能が認められるものを「＋」、２０μｇ／ｍＬ以下まで中和能が認められるものを「±」とした。測定は全てｄｕｐｌｉｃａｔｅで実施した。
　表２から、ｇＢ２抗原上のドメインＩＶ及びドメインＩに対する抗体が全体の抗体に占める割合が大きかったが、ドメインＩＶ及びドメインＩに対する抗体は、一部中和活性を有するものの、大部分が中和活性を示さなかった非中和抗体であった（表３）。これに対して、ドメインＩＩに対する抗体が全体の抗体に占める割合が小さかったものの、中和抗体であった。各ｇＢ抗体のエピトープの同定結果のＭＯＥ図（図３）には、これらのエピトープの位置を図示している。これらの結果から、ドメインＩＶ及びドメインＩには中和エピトープと非中和エピトープ、ドメインＩＩに中和エピトープが存在しており、また、ドメインＩＶ及びドメインＩには、「目立つ」抗原エピトープが多く存在することが分かった。
実施例５　ワクチン抗原の設計と評価
＜改変型ｇＢ抗原設計の戦略＞
　抗ＨＳＶ２－ｇＢ抗体の網羅的取得、並びにそれらのエピトープマッピング及び機能分類を行った結果、ｇＢ２抗原上のドメインＩＶ及びドメインＩに中和エピトープと非中和エピトープ、ドメインＩＩに中和エピトープが存在することが分かった。防御活性発現の観点から、中和エピトープを有益なエピトープとし、非中和エピトープを無益又は有害なエピトープとし、ｇＢドメインＩ及びドメインＩＶに存在する非中和エピトープを脱エピトープ化することによる改変型ｇＢ抗原を設計した。ベースとなる野生型ｇＢはエクトドメインｇＢ１－７０５であり、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ精製用にＣ末端側にＳｔｒｅｐｔａｇＩＩを付加している（図４（Ａ））。
　まずは、Ｎ型糖鎖付加によるｇＢの改変である。Ｎ型糖鎖はＯ型糖鎖と異なり、コンセンサス配列であるＮＸＴ又はＮＸＳ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）の配列に付与される。糖ペプチドに対しては一般的に抗体ができにくく、糖鎖の嵩高さによって、その周辺にも抗体ができにくくなる（非特許文献１６）。ＨＳＶ２－ｇＢのドメインＩＶは、レセプターとの結合に重要な領域と考えられているが、ウイルス膜表面から最も遠い位置にあり、表面に露呈しているため抗体が結合しやすい。実際、前述の結果のようにヒト血清中には、ドメインＩＶを認識する抗体が多く含まれていることが示唆されている。そこでドメインＩＶの非中和エピトープ３カ所にＮ型糖鎖を導入することとした（図４（Ｂ）及び図５）。一方、ドメインＩは、ｇＢの根元に位置しており、宿主細胞との融合に重要な領域であるが、エクトドメインのみを発現させた場合には、本来ウイルス膜表面と接触していた領域が表面に露呈する。また、ワクチンの製造に際して、ｇＢのエクトドメインのみを用いたワクチン抗原デザインを想定している。従って、ウイルス膜と接している領域が新たに露呈してくる可能性があり、その非中和エピトープ領域１カ所にＮ型糖鎖を導入することとした（図４（Ｂ）及び図５）。野生型のｇＢに元々付加されている糖鎖は、ＨＳＶ－１　ｇＢ（ＰＤＢ　Ｎｏ．３ＮＷＦ）を参考に、Ｎ１１５、Ｎ３７１、Ｎ６４９に位置すると思われる（図４（Ｂ））。新たに糖鎖導入の位置として、Ｄ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、Ｓ６３１が選定された。
　次は、アラニン置換によるｇＢの改変である。抗体のエピトープとして荷電アミノ酸残基が含まれることが多い。そこで、荷電アミノ酸残基を特徴のないアミノ酸残基へ置換する、脱エピトープ化の方法がとられることがある。この方法はＮ型糖鎖の導入とは異なり、ピンポイントで脱エピトープ化することができる利点がある。ドメインＩＶは非中和エピトープ以外にも中和エピトープも存在しており、１カ所アラニン置換（Ｒ６１３Ａ）を行うこととした（図４（Ｂ）及び図５）。
＜改変型ｇＢ１－７０５の調製＞
　野生型ＨＳＶ－２の３３３株に由来するｇＢのエクトドメイン（１－７０５ａａ）のｃＤＮＡ（配列番号４）をｐＣＡＧＧＳ１－ｄｈｆｒ－ｎｅｏにクローニングした。ｇＢのＣ末端にはＳｔｒｅｐ　ＴａｇＩＩが付加されるようにデザインした。この配列をテンプレートに、以下の変異を導入した改変体を設計した。
改変体ｂｃｅｖ１－３：Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ
改変体ｂｃｅｇ１３：Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ
改変体ｂｃｅｖ１１：Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ、Ｒ６１３Ａ
改変体ｂｃｅｖ１２：Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｒ６１３Ａ
改変体ｂｃｅｖ１３：Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｒ６１３Ａ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ａ、Ｑ６３３Ｔ
改変体ｂｃｅｖ１９：Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｒ６１３Ａ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔ
改変体ｂｃｅｖ１９’：Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｒ６１３Ａ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔ
改変体ｂｃｅｖ５０：Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｒ６１３Ａ、Ｒ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔ
改変体ｂｃｅｖ５０’：Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｒ６１３Ａ、Ｒ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔ
　発現には、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３又はＥｘｐｉ２９３発現システムを用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４～６日で培養上清を回収した。ｇＢを含む培養上清は、培地中に含まれるｂｉｏｔｉｎの影響を抑えるためにＵＦ膜で濃縮した。濃縮した培養上清は、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラムを使った精製を行い、精製ｇＢを取得した。
　取得した精製ｇＢ１－７０５の性状は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びゲル濾過クロマトグラフィーによって、多量体状態を確認した。ゲル濾過クロマトグラフィーについては、カラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ２００　Ｉｎｃｒｅａｓｅ　５／１５０　ＧＬ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、濃度１００μｇ／ｍＬの各改変型ｇＢ精製品をアプライした。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎで泳動ＢｕｆｆｅｒはＤ－ＰＢＳを使用し、Ａ２８０を検出した。
　６種類の改変型ｇＢの改変部位及びその特徴を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔの改変を加えたｂｃｅｖ１－３は、ドメインＩに糖鎖を導入する変異を付加したもので、その発現量が野生型のｇＢ１－７０５と比較して約２倍に向上している。本来この領域はウイルス膜表面と接触している状態で安定化していると考えられる。野生型ｇＢ１－７０５は、分泌発現させたことにより本来溶媒接触していないこの領域が露呈されたため、不安定化し、そこに糖鎖が付加されることでｂｃｅｖ１－３は安定化し、結果として発現量が増したと推測される。
　ｂｃｅｇ１３は、ドメインＩＶのＲ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓの改変を加えたｇＢである。ｂｃｅｖ１－３とは逆に野生型ｇＢ１－７０５と比較して、発現量が０．３倍になっている。野生型と同様の３量体構造は維持しているため、構造を維持するためにクリティカルな変異ではないが、野生型と比較して、単鎖の構造変化やフォールディングの速さが遅くなっているのかもしれない。
　ｂｃｅｖ１１は、ｂｃｅｖ１－３のＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔの変異に加えて、ドメインＩＶに位置するＲ６１３Ａを導入した改変体である。ｂｃｅｖ１１の発現量は、野生型ｇＢ１－７０５と同等であった。
　ｂｃｅｖ１－３の変異は発現量を向上させていたことを考えるとＲ６１３Ａの変異は、逆に発現量を低下もしくは、野生型と同等にさせる変異なのかもしれない。
　ｂｃｅｖ１１の性状も野生型と同等であり、３量体を形成していた。
　ｂｃｅｖ１２は、ｂｃｅｖ１１にさらにＲ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓの改変を加えたｇＢである。ｂｃｅｇ１３の結果を踏まえると、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓの変異を加えることで発現量が低下するはずであるが、予想外に発現量が野生型と比較して２倍に向上していた。これはＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔの改変を加えたのみのｂｃｅｖ１－３と同等の発現量である。Ｒ６１３Ａの変異も発現量低下に寄与するが、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓも加えることでドメインＩＶの構造やフォールディング速度がｂｃｅｖ１－３に近づいたのかもしれない。
　ｂｃｅｖ１９は、ｂｃｅｖ１２にＳ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔの変異を導入したｇＢ改変体である。ｂｃｅｖ１９の発現量は野生型と比較して０．６倍であり、３量体のみならず、微量のｍｕｌｔｉｍｅｒが含まれていた。Ｓ６３１、Ｈ６３２、Ｑ６３３への別の変異又は、６３１－６３３ａａ以外となる近傍の場所への糖鎖付加も検討したが、性状への大きな改善効果は認められなかった（データ示せず）。
　ｂｃｅｖ５０は、ｂｃｅｖ１９のドメインＩＶにＲ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔの変異を導入したｇＢ改変体である。その発現量はｂｃｅｖ１９よりもさらに低下し、野生型と比較して０．３倍であった。性状もｂｃｅｖ１９と同様に３量体は含まれるが、ｍｕｌｔｉｍｅｒも含んでいた。
＜改変型ｇＢ１－７０５の結合活性試験＞
　目的である、非中和抗体との反応性が低下又は無くなっていることを確認するため、作製した改変体ｂｃｅｖ１－３、ｂｃｅｇ１３、ｂｃｅｖ１２、ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０の、４４クローンの抗ｇＢ２モノクローナル抗体に対する反応性を、ＥＬＩＳＡによって評価した。コントロールとして、野生型ｇＢ１－７０５を用いた。ｇＢ１－７０５をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ　ｐｌａｔｅに５０μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによってｇＢ１－７０５を固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、取得した抗体をプレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｆｃ／ＨＲＰ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ）をプレートのウェルに１００μＬ加え、３７℃でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢをプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ　硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで吸光度（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。
　結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ｂｃｅｖ１－３は、Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔの変異を導入することにより、Ｄ２００、Ｈ２０１をエピトープとするＦ１３、Ｆ１９、Ｆ７８との反応性がなくなり、ｂｃｅｇ１３はＲ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓの変異を導入することにより、Ｒ５６７をエピトープとするＦ７６、Ｇ２５との反応性がなくなっていた。
　また、ｂｃｅｖ１－３の改変、ｂｃｅｇ１３の改変及びＲ６１３Ａを導入したｂｃｅｖ１２では、各変異箇所をエピトープとする抗体との反応性がほぼ無くなっていた。
　ｂｃｅｖ１２にＳ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ａ、Ｑ６３３Ｔの変異を導入したｂｃｅｖ１９は、中和抗体２２種類との反応を維持していた一方で、非中和抗体との反応は低下していた。
　非中和抗体の２１種類のうち、ドメインＩＶを認識するＦ７、Ｆ６５、Ｆ６８、Ｆ８０、Ｇ７６、ドメインＩを認識するＦ１８、Ｆ１９、Ｆ７８の計８種類は反応性が残っていた。
　ｂｃｅｖ１９にＲ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔの変異を導入したｂｃｅｖ５０は、全ての非中和抗体２１種類との反応性がなくなっていた。一方、中和抗体２３種類のうち、１４種類とは反応性を維持していたが、９種類とは反応が低下していた。
　これらのことはｂｃｅｖ５０を免疫することで、非中和抗体は誘導されにくいが、中和抗体もやや誘導されにくくなっている可能性を意味する。ｂｃｅｖ１９とｂｃｅｖ５０の差はドメインＩＶにＲ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔの変異があるかないかである。それにもかかわらずドメインＩに対する抗体との反応性に差が生じている。ドメインＩＶを改変することで、３量体は維持しているが、ドメインＩの構造が変化していたのかもしれない。総じて、ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０は、野生型抗原であるｇＢ１－７０５と比較して、非中和抗体はできにくくなっており、理想的な免疫応答を誘導し得る新規ワクチン抗原として期待できる。
＜ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０のマウス免疫原性試験＞
　作製した改変型ｇＢ抗原ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０のマウス免疫原性試験を別々に実施した。いずれの実験も抗原量が０．３μｇ／匹及び１μｇ／匹にて２週間間隔で３回皮下免疫した。各群の動物例数はいずれもｎ＝４として実験を行なった。
　野生型ｇＢ抗原ｇＢ１－７０５（ｇＢ　ＷＴ）を陽性対照、ｓａｌｉｎｅを陰性対照として、改変型ｇＢ抗原の免疫原性試験を実施した。所定量の抗原を注射用生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）に溶解し、ＭＰＬＡ（１０μｇ／匹）及びＣｐＧ（１μｇ／匹）と共に、１匹あたり２００μＬ／匹の容量で、ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、メス）に２週間間隔で合計３回、背部皮下に免疫した。最終免疫（３回目）から２週間後に、個体毎に採血し血清を調製した。調製した血清を段階希釈し、野生型ｇＢ抗原に対する結合抗体価（ａｎｔｉ－ｇＢ　ＥＬＩＳＡ）及びＨＳＶ－２に対する中和抗体価（プラーク数５０％減少活性）を評価した。
　ｂｃｅｖ１９の結果を図６に、ｂｃｅｖ５０の結果を図７に示す。グラフ中、ｎ＝４の平均値をプロットし、±ＳＥエラーバーを付記してある。最終免疫から２週間後に採取した血清を用いて、野生型ｇＢ抗原に対する結合抗体誘導活性（ａｎｔｉ－ｇＢ　ＥＬＩＳＡ）及びＨＳＶ－２に対する中和抗体誘導活性（プラーク数減少率）を評価した結果、ｂｃｅｖ１９、ｂｃｅｖ５０共に、いずれの投与量においても野生型ｇＢ抗原（ｇＢ１－７０５）よりも少ない結合抗体活性でより高い中和抗体活性を誘導していることが確認された。
　本結果は、野生型ｇＢ抗原上の非中和エピトープ（有害・無益なエピトープ）をＮ型糖鎖付加及びアラニン置換の手法によって脱エピトープ化することによって、残存している中和エピトープ（有益なエピトープ）に対する免疫応答をより効率的・効果的に誘導することが出来た結果であると考えられる。言い換えれば、野生型ｇＢ抗原に対する偏った免疫応答（免疫偏向）を、本発明者らによるイムノ・リフォーカス（ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｆｏｃｕｓｉｎｇ）戦略によって理想的な形に矯正（免疫矯正）することが出来たものと言える。
＜ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０のマウス感染防御試験＞
　マウス性器ヘルペス感染モデルを用いて、改変型ｇＢ抗原ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０の予防的投与における感染防御能を別々に評価した。いずれの実験も陽性対照として野生型ｇＢ１－７０５（ｇＢＷＴ）を用いた。抗原は全て、０．０３μｇ／匹、０．１μｇ／匹、０．３μｇ／匹、１μｇ／匹にて２週間間隔で３回皮下免疫した。最終免疫（３回目）から２週間後に行うウイルス接種時の感染効率を向上させるために、ウイルス接種６日前にＤｅｐｏ－Ｐｒｏｖｅｒａを２ｍｇ／匹で皮下接種した。麻酔下で５×１０５ＰＦＵ／２０μＬ／匹のＨＳＶ－２　ＭＳ株を経腟接種し、２１日間経過観察を行った。生存日数（生存率）及び症状スコアを指標に感染防御能を評価した。症状スコアは、膣病変症状及び全身症状の程度により分類し、それぞれ３段階と２段階のスコアを設定した。次に示す膣病変と全身症状のスコアを合算したものを症状スコアとした。膣病変に対するスコア（０：変化なし、１：部分的な紅斑・腫脹、２：広範囲の腫脹・浮腫、３：潰瘍・出血）。全身症状に対するスコア（０：変化なし、１：立毛、２：後肢麻痺）。また、死亡又は犠牲死させたものはスコア６とした。各群の動物例数をｎ＝１０として実験を行ない、グラフ中にはそれらの平均値をプロットした。
　ｂｃｅｖ１９の結果は、表６（生存日数）、図８（生存率）及び図９（症状スコア）に示す。ｇＢ　ＷＴ、ｂｃｅｖ１９共に設定した全ての投与量（０．０３～１μｇ／匹）において、陰性対照群（ｓａｌｉｎｅ投与群）に比して有意な生存日数延長効果を示したが、ｇＢ　ＷＴ投与群の生存日数中央値（ＭＳＴ）は明確な用量依存性を示さず、ｓａｌｉｎｅ投与群に対するＭＳＴ比率はいずれの投与量においても２未満にとどまっていたのに対し、ｂｃｅｖ１９投与群のＭＳＴはほぼ用量依存性を示しＭＳＴ比率も０．１μｇ／匹以上の３用量において＞２．８であり、明確な生存率の改善が認められた（表６、図８）。症状スコアについても、ｇＢ　ＷＴ投与群では明確な用量依存性が認められず、最高用量である１μｇ／匹でもシビアな症状を伴っていたが、ｂｃｅｖ１９投与群の方は用量依存的かつ顕著な改善効果が認められた（図９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ｂｃｅｖ５０の結果は、表７（生存日数）、図１０（生存率）及び図１１（症状スコア）に示す。ｂｃｅｖ１９と同様にｂｃｅｖ５０もｇＢ　ＷＴに比して、生存日数、生存率、症状スコアのいずれの指標においても、明確な優越性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜イムノ・リフォーカスの解析＞
　マウス免疫原性試験及びマウス感染防御試験において野生型ｇＢ（ｇＢ１－７０５）に比して優越性が認められた改変型ｇＢ抗原ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０の免疫血清について、イムノ・リフォーカスが誘導されているか否かをそれぞれｇＢ１－４５７及びｇＢ１１１－４５７を固相化したＥＬＩＳＡにより解析した。
　ｂｃｅｖ１９の解析結果を図１２に、ｂｃｅｖ５０の解析結果を図１３に示す。野生型ｇＢ免疫血清と比較して、ｂｃｅｖ１９免疫血清及びｂｃｅｖ５０免疫血清はいずれもｇＢ１－４５７及びｇＢ１１１－４５７に対する結合抗体活性が上昇していることが確認された。本結果は、野生型ｇＢ抗原上のデコイ領域であると考えられるドメインＩＶ上に主に存在する非中和エピトープをＮ型糖鎖付加及びアラニン置換の手法により脱エピトープ化することによって、ドメインＩ及びＩＩ上に多く残存している中和エピトープ（有益なエピトープ）に対する免疫応答をより効率的・効果的に誘導することが出来た結果であると考えられる。言い換えれば、野生型ｇＢ抗原上のデコイ領域に対する偏った免疫応答（免疫偏向）を、イムノ・リフォーカス戦略によって理想的な形に矯正（免疫矯正）することが出来たものと考えられる。
＜ｇＢドメインＩに導入したＮ型糖鎖の効果＞
　ｇＢ改変体であるｂｃｅｖ１９は、ドメインＩにＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ、ドメインＩＶにＲ６１３Ａ、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔの改変を導入している。またｂｃｅｖ５０は、ドメインＩにＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ、ドメインＩＶにＲ６１３Ａ、Ｒ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、Ｑ６３３Ｔ、Ｒ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔの改変を導入している。我々はｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０に導入した改変の効果をさらに調べるために、ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０に含まれるドメインＩの改変Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔのみを原体のアミノ酸配列に戻した改変体、それぞれｂｃｅｖ１９’及びｂｃｅｖ５０’を作出した。
　Ｅｘｐｉ２９３発現システムを用いた一過性発現を実施し、その発現量を比較した（表８）。その結果、ｂｃｅｖ１９、ｂｃｅｖ１９’、ｂｃｅｖ５０、ｂｃｅｖ５０’の発現量は、それぞれ１０．８１μｇ／ｍＬ、１．２８μｇ／ｍＬ、６．２９μｇ／ｍＬ、４．３６μｇ／ｍＬであった。ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ１９’の発現量を比較するとｂｃｅｖ１９の方がｂｃｅｖ１９’よりも８．４５倍高く、またｂｃｅｖ５０及びｂｃｅｖ５０’の発現量を比較するとｂｃｅｖ５０の方がｂｃｅｖ５０’よりも１．４４倍高かった。このことはｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０におけるＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔが発現量の向上に寄与する変異であることを意味する。またｇＢ１－７０５にＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ　の改変を導入したｂｃｅｇ１－３においても同様の結果が得られており、このことを支持している（表４）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　更に、ゲル濾過クロマトグラフィーによるｂｃｅｖ１９、ｂｃｅｖ１９’、ｂｃｅｖ５０及びｂｃｅｖ５０’の性状解析を行った。その結果を図１４に示す。ｂｃｅｖ１９の方がｂｃｅｖ１９’よりもネーティブな３量体含量が高く（図１４（Ａ））、またｂｃｅｖ５０の方がｂｃｅｖ５０’よりも３量体含量が高かった（図１４（Ｂ））。このことは、ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０におけるＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔが性状改善に寄与する変異であることを意味する。
　次に、マウス免疫原性試験において、ｂｃｅｖ１９とｂｃｅｖ１９’、ｂｃｅｖ５０とｂｃｅｖ５０’をそれぞれ比較した。抗原量はいずれも０．３μｇ／匹及び１μｇ／匹にて２週間間隔で３回皮下免疫した。各群の動物例数はいずれもｎ＝４として実験を行なった。ｂｃｅｖ１９とｂｃｅｖ１９’の比較を図１５に、ｂｃｅｖ５０とｂｃｅｖ５０’の比較を図１６にそれぞれ示した（グラフ中にはｎ＝４の平均値をプロットし±ＳＥエラーバーを付記）。最終免疫から２週間後に採取した血清を用いて、野生型ｇＢ抗原に対する結合抗体誘導活性（ａｎｔｉ－ｇＢ　ＥＬＩＳＡ）及びＨＳＶ－２に対する中和抗体誘導活性（プラーク数減少率）を評価した結果、どちらの指標においてもｂｃｅｖ１９’よりもｂｃｅｖ１９の方が、またｂｃｅｖ５０’よりもｂｃｅｖ５０の方が高い抗体誘導能を示す傾向があることが分かった。
　以上の結果から、改変体ｂｃｅｖ１９及びｂｃｅｖ５０に導入した変異のうち、ドメインＩのＮ型糖鎖（Ｄ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｈ２０１Ｔ）は中和抗体誘導能の増強のみならずタンパク発現量の向上及び性状改善にも寄与する変異であることが分かった。
　本発明の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質は、ＨＳＶ感染症の予防及び治療に効果的なワクチンの作製に使用できる。

Claims (23)

  1. 　単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ　ｇＢのドメインＩＶ及びドメインＩに存在する非中和抗体を誘導するエピトープ（非中和エピトープ）のうち、少なくとも１つがエピトープとして機能しないように改変された、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  2. 　前記非中和エピトープは、野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５６７番目のアルギニン残基（Ｒ５６７）、６０２番目のアルギニン残基（Ｒ６０２）、６３１番目のセリン残基（Ｓ６３１）、又は１９９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ１９９）に相当するアミノ酸残基からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープである、請求項１に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  3. 　前記非中和エピトープは、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７、Ｒ６０２、Ｓ６３１、又はＤ１９９に相当するアミノ酸残基を含むエピトープである、請求項１又は２に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  4. 　前記改変は、アミノ酸残基の置換、及び/又はアミノ酸残基の欠損によって行われる改変を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  5. 　前記改変は、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されることによって行われる改変を含む、請求項４に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  6. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  7. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも２つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  8. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項７に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  9. 　前記糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７Ｎ、Ｐ５６８Ｓ、Ｇ５６９Ｓ、Ｓ６３１Ｎ、Ｈ６３２Ｔ、及びＱ６３３Ｔのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項８に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  10. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基のそれぞれの位置への糖鎖導入するための改変を含む、請求項７に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  11. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ６０２に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  12. 　前記糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ６０２Ｎ、Ｄ６０３Ａ、Ａ６０４Ｔのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項１１に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  13. 　前記改変はさらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項５～１２のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  14. 　前記糖鎖導入は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９Ｎ、Ｄ２００Ａ、及びＨ２０１Ｔのアミノ酸残基置換によって行われる、請求項１３に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  15. 　前記改変はさらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列における６１３番目のアルギニン（Ｒ６１３）に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、請求項４～１４のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  16. 　請求項１～１５のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質を含む、ＨＳＶワクチン。
  17. 　単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）の改変タンパク質（改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質）であって、野生型ＨＳＶ　ｇＢのエクトドメインの結晶構造の表面において、配列番号１に記載のアミノ酸配列における５６７番目のアルギニン残基（Ｒ５６７）、６０２番目のアルギニン残基（Ｒ６０２）、６３１番目のセリン残基（Ｓ６３１）、又は１９９番目のアスパラギン酸残基（Ｄ１９９）に相当するアミノ酸残基からの距離が１．５ｎｍ以下の領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換又は欠失させた、改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  18. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９、Ｒ５６７、Ｒ６０２、及びＳ６３１に相当するアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項１７に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  19. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＤ１９９に相当するアミノ酸残基の位置に糖鎖導入するための改変を含む、請求項１７又は１８に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  20. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における６１３番目のアルギニン（Ｒ６１３）に相当するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  21. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＲ５６７に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  22. 　前記改変は、配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＳ６３１に相当するアミノ酸残基の位置への糖鎖導入をするための改変を含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質。
  23. 　請求項１８～２２のいずれか一項に記載の改変型ＨＳＶ　ｇＢタンパク質を含む、ＨＳＶワクチン。
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