TWI653049B - 合成多肽、包含該合成多肽之疫苗組合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容是關於一種多肽，其包含與序列編號：1之序列具有至少85%相似度的胺基酸序列。本揭示內容亦提供一種包含本發明多肽及佐劑的疫苗組合物。本發明疫苗組合物可用以預防一個體遭受DENV感染及/或減緩一個體體內與DENV感染相關之病徵。

Description

合成多肽、包含該合成多肽之疫苗組合物及其用途
本揭示內容是關於預防病毒感染的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種合成多肽及其於預防及/或治療登革熱病毒(dengue virus, DENV)感染的應用。
DENV是一種經由蚊蟲傳播的正股RNA病毒，分類上屬於黃熱病毒科(Flaviviridae)之黃熱病毒屬(Flavivirus)。DENV具有套膜(envelope)，病毒顆粒大小約為40-60奈米，包含約25-30奈米之對稱核酸蛋白殼體(nucleocapsid)及約10.7 kb之線性正股RNA基因組。DENV具有5種血清型(登革熱病毒1-5型，於2013年發現第5型)，基因遺傳上與諸如黃熱病毒(yellow fever virus)及蜱傳腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus)等黃病毒相關。DENV感染會造成危及生命的出血性登革熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)及登革熱休克症候群(dengue shock syndrome, DSS)。即使在臨床試驗上已有多種候選疫苗，疫苗引發的抗體相關效應(antibody-dependent effect, ADE)卻可能導致更嚴重的疾病，進而限制了登革熱疫苗的發展。近期，由 Sanofi Pasteur研發的登革熱疫苗已獲得上巿許可，唯其對抗各種血清型之DENV的功效仍有待評估。一般認為DENV之非結構蛋白1 (nonstructural protein 1, NS1)可增加血管的通透性，進而造成DHF。基於抗-NS1抗體不會導致ADE，目前推測對個體投予NS1蛋白使其主動產生免疫反應(即主動免疫化(active immunization))將可保護個體免於罹患登革熱疾病。然而，NS1的分子擬態(molecular mimicry)會誘發數種對抗宿主蛋白的自體抗體，而影響與NS1相關之疫苗發展。
有鑑於此，相關領域亟需一種新穎的疫苗，可有效保護個體抵抗不同血清型之DENV的感染。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以預防或治療一個體之DENV感染的合成多肽。依據本揭示內容之實施方式，該合成多肽包含一第一多肽，其胺基酸序列與序列編號：1之序列具有至少85%的相似度。依據一特定實施例，該第一多肽具有序列編號：1之胺基酸序列。非必要性地，該合成多肽的N端具有乙醯化修飾(acetylated)及/或該合成多肽的C端具有醯胺化修飾(amidated)，據以增加該合成多肽的穩定性。依據一特定實施方式，該合成多肽更包含一第二多肽，其係位於該第一多肽的N或C端，其中該第二多肽是選自由卵白蛋白(ovalbumin, OVA)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin, KLH)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin, TGB)、熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)及其組合所成組成的群組。
本揭示內容的第二態樣是關於一種用以預防一個體之DENV感染疫苗組合物。依據本揭示內容之實施方式，該疫苗組合物包含本發明合成多肽及一藥學上可接受之佐劑。依據一實施方式，該藥學上可接受之佐劑是選自由脂肪醇聚氧乙烯醚-D (Emulsigen-D)、氫氧化鋁(aluminum hydroxide)、弗氏不完全佐劑(incomplete Fruend's adjuvant, IFA)、弗氏完全佐劑(complete Fruend's adjuvant, CFA)、與內毒素相關之佐劑(endotoxin based adjuvant)、礦物油(mineral oil)、礦物油及界面活性劑(mineral oil and surfactant)、Ribi佐劑、Titer-max佐劑、syntax佐劑製劑(syntax adjuvant formulation, SAF)、鋁鹽佐劑(aluminium salt adjuvant)、硝化纖維素吸附抗原(nitrocellulose adsorbed antigen)、免疫刺激複合物(immune stimulating complex)、Gebru佐劑、超載體(super carrier)、乙烯及乙酸乙烯酯之共聚物(elvax 40w)、L-酪胺酸(L-tyrosine)、油基乳劑(montanide)、Adju prime佐劑、鯊烯(Squalene)、鄰苯二甲酸鈉脂多醣(sodium phthalyl lipopolysaccharide, SPLPS)、磷酸鈣(calcium phosphate)、皂素(saponin)及胞壁醯二肽(muramyl dipeptide, MDP)所組成之群組。如上所述，本發明組合物之合成多肽包含一第一多肽，其胺基酸序列與序列編號：1之序列具有至少85%的相似度，以及一非必要的第二多肽，其係位於該第一多肽的N或C端。依據預防/治療目的之不同，該第二多肽可以是OVA、BSA、KLH、β-半乳糖苷酶、TGB、HSP或其組合。
本揭示內容的第三態樣是關於一種用以預防一個體免於遭受DENV感染的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本發明疫苗組合物，藉以免疫接種(vaccinate)該個體，使其產生對抗DENV的免疫反應。依據一實施方式，該疫苗組合物約可產生每劑每公斤個體體重0.8微克到80毫克的多肽(0.8微克到80毫克/公斤/每劑)；較佳地，8微克到8毫克/公斤/每劑；更佳地，80到800微克/公斤/每劑。依據另一實施方式，在一免疫接種的過程中，是對該個體投予至少2次之疫苗組合物。較佳地，在一免疫接種的過程中，是對該個體投予3-5次之疫苗組合物。可藉由適當的路徑對個體投予本發明疫苗組合物，例如經黏膜(transmucosal)、皮下(subcutaneous)、皮內(intradermal)、肌肉內(intramuscular)、靜脈內(intravenous)或腹腔內(intraperitoneal)注射。
依據本揭示內容某些實施方式，本發明方法可用以保護一個體抵抗第1、2、3或4血清型之DENV的感染。
依據本揭示內容實施方式，該個體為一哺乳動物。較佳地，該個體為一人類。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
1. 定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「多肽」(polypeptide)一詞在本揭示內容是指一不論聚合長度之胺基酸聚合物；因此，「胜肽」(peptides)、「寡多肽」(oligopeptides)及「蛋白」(proteins)皆屬多肽之定義範疇，其於本說明書為可互換的詞彙。即使特定實施方式包含或不包含對該些多肽進行化學或表現後修飾，該詞彙亦無明定或排除對本發明多肽進行化學或表現後修飾。因此，舉例來說，多肽一詞明確包含對其進行諸如共價鍵結醣基團、乙醯基團、磷酸基團及脂質基團等修飾。此外，具有該些修飾之多肽可作為本發明包含或不包含之特別物種。在本揭示內容中，多肽之胺基酸殘基的位置是由該多肽之N端開始計算。除非本揭示內容指明為特定異構物，否則當未指明胺基酸為D-或L-形式之胺基酸時，該胺基酸可為L-胺基酸，或可為D-或L-胺基酸。此外，本揭示內容是使用本發明所屬技術領域中具有通常知識者所慣用的縮寫來標示各多肽的胺基酸殘基。
在本揭示內容中，「合成多肽」(synthetic polypeptide)一詞是指一不包含完整天然蛋白分子的多肽。可利用諸如化學合成、重組基因技術或碎裂完整抗原等人為操作來製備「合成」(synthetic)多肽。
在本揭示內容中，「疫苗」(vaccine)一詞是指一種組合物，其在投予至一動物體內後，具有刺激該動物體之免疫反應(例如對抗原專一之抗體)的功效，該免疫反應可完全或部分保護該動物體抵抗一疾病(例如DENV感染)及其病狀。疫苗一詞包含預防性及治療性疫苗。一組合性疫苗是指包含二或三種疫苗之組合物。
在本揭示內容中，除非另有所指，否則「佐劑」(adjuvant)一詞是指任何可增強、增加、提升、多樣化或有利於一抗原之免疫反應(例如荷爾蒙性(humoral)或細胞性(cellular)免疫反應)的物質或物質的混合物。
除非另有所指，否則「抗原」(antigen)一詞在本揭示內容是指當導入一免疫健全之人類或動物體內後，可刺激一荷爾蒙性及/或細胞性免疫反應的物質。抗原可以是一純物質、一包含不同物質之混合物，或是特定材料(包含細胞、細胞片段或源自細胞之片段)或一活的有機體或病毒(通常為減毒形式)。例示性之適當的抗原包含，但不限於，蛋白、醣蛋白、脂蛋白、多肽、胜肽、碳水化合物/多醣、脂多醣、毒素、病毒、細菌、真菌及寄生蟲。
「抗體」(antibody)一詞在本揭示內容是指一免疫球蛋白分子，其可專一結合至一抗原之特定表位(epitope)。抗體可以是天然或重組的完整免疫球蛋白，或是完整免疫球蛋白之免疫活性片段。抗體通常為免疫球蛋白分子的四聚合物。本揭示內容之抗體可以不同的形式存在，舉例來說，多株抗體(polyclonal antibodies, pAb)、單株抗體(monoclonal antibodies, mAb)、Fv、Fab、F(ab)2 、單鏈抗體及人源化抗體等形式。
在本揭示內容中，「治療」(treatment)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及/或處理DENV感染之相關病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition)，其中是藉由誘發對DENV具有專一性的免疫反應(例如，對DENV具有專一性之抗體) 來使罹患或疑似患有相關病徵、疾病或症狀之個體獲得效益。「治療」(treatment)一詞於本說明書中亦指對一個體應用或投予本揭示內容之多肽或疫苗組合物，該個體係患有DENV感染之相關病徵、次要病徵或症狀，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及/或降低一或多個DENV感染之相關病徵、症狀、或次要病徵的發生。DENV感染之相關病徵、次要病徵及/或症狀包含，但不侷限於，發燒、據烈頭痛、眼後疼痛、肌肉及關節疼痛、噁心、嘔吐、腺體腫大、紅疹、據烈腹痛、呼吸急促、牙齦出血、疲倦、躁動及嘔吐物帶血。在此「治療」(treatment)亦可以是施用至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降低該個體發展與DENV相關之病徵、次要病徵及/或症狀的風險。當一治療可減少一或多種病症或臨床標記時，則該治療為「有效的」(effective)。或者是，當一治療可降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展時，則該治療為「有效的」(effective)。
在本揭示內容中，「預防」(prevention或prophylaxis)一詞是指對一個體投予預防性治療，其中該個體具有罹患與DENV感染相關之病徵、次要病徵或症狀的風險，藉以降低該個發展與DENV相關之病徵、次要病徵及/或症狀的機率。具體來說，「預防」(prevention或prophylaxis)一詞是指抑制與DENV感染相關之病徵、次要病徵或症狀的發生；意即，減少病徵、次要病徵或症狀發生的機率或頻率。在使用一多肽、一包含該多肽之組合物及/或方法來進行「預防」(prevention或prophylaxis)時，是指該多肽、包含該多肽之組合物及/或方法可抑制該病徵、次要病徵或症狀的發生，及減少該病徵、次要病徵或症狀發生的機率及/或頻率，而非指示或暗示使用該多肽、包含該多肽之組合物及/或方法後，保證該病徵、次要病徵或症狀不會再次發生。
「有效量」(effective amount)一詞於此是指一種足以產生一期望治療反應的成份的使用量。一有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。具體的有效量取決於多種因素，如所欲治療的特定狀況、患者的生理條件(如，患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動物或動物種類、治療持續時間、目前療法(如果有的話)的本質以及所用的具體配方。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克、毫克或微克為單位)或表示成藥物重量與體重之比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。亦或是，有效量可以醫藥組合物中活性成份(例如本揭示內容之合成多肽)的濃度來表示，例如莫耳濃度(molar concentration)、重量濃度(mass concentration)、體積濃度(volume concentration)、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例(mixing ratio)。具體來說，「治療有效量」(therapeutically effective amount)一詞在本說明書是指足以減緩或改善個體體內與DENV感染相關之症狀的合成多肽劑量。習知技藝可基於動物模式得到劑量來計算人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝人士可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
「個體」(subject)一詞是指包含人類的動物，其係能接受本揭示方法的治療。除非特定指出，否則「個體」(subject)一詞同時意指男性及女性。
2. 實施方式
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以預防或治療一個體之DENV感染的多肽，其包含一與序列“YKDWSEWGKAC”(序列編號：1)具有至少85%相似度的胺基酸序列；意即，本發明多肽包含的胺基酸序列可以與序列編號：1之序列具有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的相似度。依據一實施方式，本發多肽具有與序列編號：1之序列至少85%相似度的的胺基酸序列。依據一操作實施例，本發明多肽具有序列編號：1的胺基酸序列。
非必要性地，本發明多肽的N端具有乙醯化修飾。此外或或是，本發明多肽的C端具有醯胺化修飾。
非必要性地，本發明多肽的N或C端是與一載體分子鍵結，藉以增加多肽的免疫刺激性(immunogenicity)。例示性之載體分子包含，但不限於，OVA、BSA、KLH、β-半乳糖苷酶、TGB、HSP或其組合。依據本揭示內容一操作實施方式，載體分子是KLH。
可利用諸如以t-BOC或FMOC保護α胺基等慣常方法來製備本發明之合成多肽。二種方法皆逐步合成多肽，其中是由多肽的C端起始，於各步驟加入單一個胺基酸。亦可以習知之固相胜肽合成法來合成本發明多肽。或者是，將用以編碼本發明多肽之核酸轉染至宿主細胞(例如HEK293細胞)中，藉由該宿主細胞來製備本發明合成多肽。
依據本揭示內容一實施方式, 本發明多肽具有免疫刺激性，可刺激產生免疫反應(即產生抗體)，抵抗四種血清型(血清型1-4)的DENV (以下分別簡稱為DENV 1、DENV 2、DENV 3及DENV 4)。因此，本揭示內容的第二態樣是關於一種疫苗組合物，其包含任一種本揭示內容所述之多肽，以及一藥學上可接受之佐劑。
如習知技藝人士所知，佐劑是一種可增強對抗特定抗原(例如本發明多肽)之免疫反應的物質。適當之可用以增強本發明多肽之免疫刺激性的佐劑包含，但不限於，脂肪醇聚氧乙烯醚-D、氫氧化鋁、IFA、CFA、與內毒素相關之佐劑、礦物油、礦物油及界面活性劑、Ribi佐劑、Titer-max佐劑、syntax佐劑製劑、鋁鹽佐劑、硝化纖維素吸附抗原、免疫刺激複合物、Gebru佐劑、超載體、乙烯及乙酸乙烯酯之共聚物、L-酪胺酸、油基乳劑、Adju prime佐劑、鯊烯、鄰苯二甲酸鈉脂多醣、磷酸鈣、皂素及胞壁醯二肽。依據一實施方式，該佐劑為CFA。依據另一實施方式，該佐劑為IFA。
為製備一抗體(例如一mAb或一pAb)，先以本發明多肽或疫苗組合物免疫化諸如小鼠、大鼠或兔子等宿主動物體，使其產生相關免疫反應。可依據慣常免疫接種流程來使宿主動物產生免疫反應。抗原注射的時間間隔並無特定限定。抗原注射的間隔時間可為數天至數週(較佳為一週)，共注射2-10次，直到產生特定的抗體效價。
依據某些實施方式，是以皮下或皮內注射方式，每週對宿主動物投予本發明疫苗組合物，持續投予3-5週，藉以使其產生免疫反應。注射後採取宿主動物之血液檢體，並進行離心以分離血清。可利用任何適合的方法來檢測所得血清中的抗體效價，例如酵素免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay, EIA)或放射免疫分析(radio immunoassay, RIA)。在一較佳的實施例中，是利用ELISA來測定抗體之效價。之後，對該些具有高抗體效價的動物投予最終次本發明多肽。
抽取該些經免疫化之動物的血液，以離心、硫酸胺或聚乙二醇沉澱及色層分析(例如凝膠過濾色層分析、離子交換色層分析或親和力色層分析)等慣常方法來進行分析及純化，據以製備多株抗血清(polyclonal antiserum)形式之可辨識本發明多肽的pAb。
依據本揭示內容之實施方式，本發明多肽或疫苗組合物可誘發一免疫反應(例如產生pAb)來抵抗DENV。依據本揭示內容一實施方式，製得的抗體對本發明多肽具有結合親和力及專一性。依據本揭示內容另一實施方式，製得的抗體可結合及/或中和DENV (包含DENV 1、DENV 2、DENV 3及DENV 4)。
本揭示內容的第三態樣是關於一種用以預防一個體免於遭受DENV感染的方法。該方法包含對該個體投予一有效量之本發明疫苗組合物，藉以免疫接種該個體，使其產生抵抗DENV的免疫反應。
一般來說，疫苗組合物中活性成分(即本發明多肽)的有效量會隨著不同因素而有所改變，例如病患的生理狀況(例如病患的體重、年齡或性別)、欲接種疫苗的個體，以及活性成分的免疫刺激性。
在一實施方式中，個體為一小鼠。為對小鼠產生免疫接種之功效，本發明多肽是以每劑每公斤個體體重約為0.01到1,000毫克的劑量投予至小鼠體內；舉例來說，每劑每公斤個體體重0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000毫克。較佳地，每劑每公斤個體體重0.1到100毫克。更佳地，每劑每公斤個體體重1到20毫克。依據一操作實施例，每劑每公斤個體體重2-2.5毫克之本發明多肽即足以誘發個體產生免疫反應(例如產生抗體)。
習知技藝人士可基於由動物模式得到的數據來計算本發明多肽之人體等效計量(human equivalent dose, HED)。據此，本發明多肽的有效HED約為每劑每公斤個體體重0.8微克到80毫克；換言之，本發明多肽的有效HED可以是每劑每公斤個體體重0.8、0.9、1 、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900或950微克，或是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80毫克。較佳地，每劑每公斤個體體重8微克到8毫克。更佳地，每劑每公斤個體體重80到800微克。在一較佳實施例中，本發明多肽的有效HED約為每劑160到200微克。
依據本揭示內容之實施方式，在一免疫接種的過程中，是對個體投予至少2次本發明多肽或疫苗組合物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多次。為產生特定功效，可對個體投予2-10次之疫苗組合物，每次間隔時間可為數天到數年。
依據一實施例，個體為一小鼠；在該實施例中，是對小鼠投予4-5次之本發明疫苗組合物，藉以誘發其產生對多肽具有專一性的免疫反應。依據本揭示內容之實施方式，是對個體初次接種(prime)包含一有效量之本發明多肽及CFA的疫苗組合物，之後再對該個體後續接種(boost) 3-4次之包含一有效量之本發明多肽及IFA的疫苗組合物。
可藉由適當的路徑對個體投予本發明疫苗組合物，例如經黏膜、皮下、皮內、肌肉內、靜脈內或腹腔內注射。依據一特定實施方式，是以腹腔注射方式對個體投予本發明疫苗組合物。
當可想見，本發明方法可單獨投予至個體體內，或是與其他對治療DENV感染具有助益功效的療法合併投予至個體體內。依據治療目的之不同，本發明方法可在投予其他療法之前、期間或之後投予至個體體內。
依據本揭示內容一實施方式，本發明方法可保護個體抵抗DENV (包含DENV 1、DENV 2、DENV 3及DENV 4)感染。在一實施方式中，免疫接種可減緩個體產生與DENV相關的病症或症狀，例如病毒血症、局部出血、紅血球外滲(red blood cell (RBC) extravasation)及出血時間延長。依據另一實施方式，由本發明方法製備的抗體/多株抗血清可誘發一對抗　DENV的補體相關胞解反應，據以減少接受疫苗接種之個體體內的病毒效價。依據另一實施方式，由本發明方法製備的抗體/多株抗血清不會與個體的內皮細胞及血小板產生交叉反應。
依據本揭示內容一操作實施例，本發明方法可延長經DENV感染之個體的存活時間。
基本上，可接受本發明方法治療的個體為一哺乳動物；舉例來說，人類、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、狗、貓、牛、山羊、綿羊、猴子及馬。較佳地，該個體為人類。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實施例
細胞株及病毒原液
由日本研究生物資源中心(Japanese Collection of Research Bioresources, Japan)及美國菌種中心(American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, Virginia)購買人類肝癌細胞株Huh-7、幼倉鼠腎臟細胞株BHK-21及白線斑蚊細胞株C6/36，並將該些細胞株培養於包含10%經熱去活化之胎牛血清(FBS, HyClone, Logan, UT)的DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)細胞培養液中。由台灣生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)購買人類臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)，並培養於包含10% FBS及SingleQuots™ 套組(Lonza, Walkersville, MD)的EMB-2 (endothelial Basal Medium-2, Lonza, Walkersville, MD)細胞培養液中。除了將C6/36培養於28°C的環境外，所有細胞皆係培養於包含5% CO2 之37°C環境中。
利用C6/36細胞來增殖4種血清型DENV，包含DENV 1 (台灣本地病毒株 8700828)、DENV 2 (16681及台灣本地病毒株454009 A)、DENV 3 (台灣本地病毒株8700829)及DENV 4 (台灣本地病毒株59201818)。為製備高效價的DENV，利用Macrosep® Advance Centrifugal Devices (截止分子量為30 kDa; Pall Corp., Port Washington, NY)於4°C以6000 ×g的轉速濃縮不含細胞的上清液，並將產物保存於-70°C以待後續分析使用。
病毒效價及螢光病毒群落測定
利用螢光病毒群落測定來分析病毒效價。簡單來說，收集包含感染病毒的上清液，並將其保存於-70°C。連續稀釋上清液後，加入BHK-21細胞，並於37°C作用2小時。以包含2% FBS及1%甲基纖維素的DMEM覆蓋單細胞層，於37°C培養2-3天。以抗-NS1抗體及與Alexa 488鍵結之山羊抗-小鼠IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA)來染色病毒群落，再利用螢光顯微鏡(Leica Geosystems AG, St. Gallen, Switzerland)進行觀察。
連結酶免疫吸收測定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
將50微升之溶於PBS (pH 7.3)之NS1、BSA、與胜肽鍵結之BSA或抗體(每毫升2微克)塗覆於96孔洞之ELISA盤，放置於4°C至隔日。以1%溶於PBS之BSA阻斷1小時後，加入小鼠或人類血清(1:50稀釋)，於37°C反應1小時。之後，加入與山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase, HRP)鍵結之山羊抗-兔子、抗-小鼠IgG (Leadgene Biomedical, Taiwan)、抗-人類IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)或小鼠抗-M13 (Zymed Laboratories, California, USA)二級抗體(1:10,000稀釋)，再於37°C反應1小時。
接著，以PBST洗滌細胞培養盤後，加入四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine (TMB), Clinical Science Products, Mansfield, MA)作為受質，進行呈色反應。加入中止溶液(2 N H2 SO4 )後，利用 VersaMax微盤讀取器(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)分析於OD450 奈米的吸光值。
由補體媒介之胞解反應及LDH釋放測定
為分析補體對感染細胞產生的胞解反應，先以DENV (病毒感染劑量為10)感染HUVEC (8 × 103 ) 48小時。以PBS洗滌細胞後，加入經56°C熱去活化之抗體，於4°C反應1小時。以PBS洗滌細胞後，加入包含2% FBS EMB-2細胞培養液之Low-Tox-M兔子補體(1:20稀釋)(Cedarlane Laboratories Ltd, Ontario, Canada)，繼續反應4小時。接著，收集50微升的上清液，與50微升之CytoTox 96®受質試劑(Promega, Madison, Wis.)混合後，加入各孔洞中。避光反應30分鐘，加入50微升之中止溶液。最後，以VersaMax微盤讀取器分析各孔洞於波長為490奈米的吸光值。
小鼠疾病及致死感染模式
以C3H/HeN野生型小鼠作為DENV誘發疾病的小鼠模式。為進行主動免疫，將與KLH鍵結之修飾NS1-WD多肽(序列編號：1; 50微克; ChinaPeptides, Shanghai, China)或對照蛋白(KLH)與CFA或IFA進行乳化反應。將1劑CFA-乳化劑以腹腔注射方式投予至6週大的小鼠體內；2週後，再對該免疫化小鼠接續投予3劑IFA-乳化劑，每劑間隔時間為1週(每劑包含50微克之與KLH鍵結之修飾NS1-WD多肽，或是KLH對照蛋白)。投予最後1劑之3天後，將濃縮的DENV (每隻小鼠2*108 PFU)或濃縮的C6/36細胞培養液(作為對照組)皮內注射入小鼠上背部4個不同位置。
以5到6週大的STAT1−/− 小鼠作為致死感染小鼠模式。將DENV 2致死株(454009 A)(每隻小鼠4 × 107 PFU)或C6/36細胞培養液(作為對照組)靜脈注射至STAT1−/− 小鼠體內。收集免疫化小鼠的血清，並於感染DENV一天前，腹腔注射至小鼠體內。二天後，收集經DENV感染之小鼠的血清，以螢光病毒群落測定及定量NS1 ELISA來分析病毒血症及NS1的分泌量。持續觀測小鼠體重及存活率14天。
蘇木精及伊紅染色(Hematoxylin and eosin staining, H&E staining)及免疫組織化學染色(Immunohistochemistry, IHC)
利用4%福馬林固定新鮮的小鼠皮膚後，以石蠟包埋之。為進行組織病理分析，以H&E染色組織切片。為進行IHC染色，依照使用者操作說明(BIOTnA biotech)阻斷組織切片後，加入抗-NS3抗體(GTX124252, GeneTex, Inc, Irvine, CA)，於4°C反應至隔日。以PBS洗滌後，加入經HRP標記的二級抗體，並於室溫反應30分鐘。之後，加入3,3′-二氨基聯苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)或HRP綠色混合試劑，反應1-5分鐘。複染(counterstain) 蘇木精2分鐘。以ImageJ軟體定量分析DAB染色結果。
定量分析皮膚出血
以Photoshop®處理，並以ImageJ軟體數值化分析小鼠皮膚出血的程度。簡單來說，收集小鼠的皮膚檢體後，調整至相同的影像大小。之後，分離出血區域，並以Photoshop 6.0 (Adobe, San Jose, CA)進行分析。為定量出血部位，利用ImageJ軟體處理分析影像，並將其轉換為16位元的影像。將所有影像轉為黑白形式後，利用Prism軟體計算及分析總出血體積。
統計分析
以Prism軟體(GraphPad Software Inc., CA)進行所有的統計分析。利用不成對Student’s t-檢定或單向ANOVA檢定來分析結果，分別比對二獨立試驗組或二組以上的比對分析。每一結果皆由三組獨立試驗而得，且表示為平均值±標準差。以Log-rank Mantel-Cox檢定來分析存活率。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，且ns表示95%雙尾信賴區間無顯著性。
實施例1　修飾NS1-WD多肽於活體外對DENV感染的保護功效
為評估本發明多肽(即修飾NS1-WD多肽)的生物活性，分別由經特定抗原(包含全長NS1蛋白、與KLH鍵結之修飾NS1-WD多肽，以及KLH對照蛋白)免疫化之小鼠分離其血清，與經DENV感染之細胞、DENV NS1蛋白、HUVEC細胞及人類血小板反應後，利用流式細胞儀及ELISA測定進行分析。結果分別闡述於第1-4圖。
1.1 修飾NS1-WD多肽誘發對DENV具有專一性的免疫反應
有鑑於HUVEC細胞上 DENV NS1-WD及LYRIC蛋白(序列編號：3)之間具有高度保留的同源性，先確認 KXWG模組中離胺酸(lysine, K)是否於病毒的致病機制中扮演著關鍵的角色。對NS1-WD的胺基酸進行修飾後，流式細胞儀及ELISA的分析結果分別指出，修飾NS1-WD可誘發抗體，該抗體對經4種血清型之DENV感染的細胞(第1A圖)及DENV NS1蛋白(第1B圖)具有結合親和力。
已知數種抗-NS1抗體與宿主宿白具有分子擬態，因此會與血小板、內皮細胞及凝血因子產生交叉反應，進而造成血小板無法正常作用、內皮細胞損傷及出血。據此，本揭示內容亦檢測由修飾NS1-WD誘發產生的抗體與內皮細胞及血小板之間的結合親和力。第2A及2B 圖分別證實，由野生型NS1-WD多肽(第2A圖)及全長NS1蛋白(第2B圖)誘發產生的抗體對內皮細胞及血小板具有結合親和力，而由修飾NS1-WD誘發產生的抗體(以下稱為「修飾NS1-WD pAb」)則不會與人類內皮細胞及血小板產生交叉反應。
1.2　修飾NS1-WD pAb對4種血清型之DENV具有抑制功效
利用LDH釋放測定來檢測修飾NS1-WD pAb對細胞的保護功效。第3圖的結果指出，修飾NS1-WD pAb會活化補體，進一步誘發經DENV感染之HUVEC釋放顯著的LDH，而不會影響未經DENV感染之HUVEC，其中抗-NS1 2E8 mAb及KLH多株抗體(以下稱為「KLH pAb」)分別作為本實驗的正及負對照抗體。
進一步以螢光病毒群落測定來分析第3圖上清液的病毒效價。與LDH釋放測定結果一致，相較於KLH pAb或PBS對照組，修飾NS1-WD pAb在具有補體的情況下，會顯著地減少經4種血清型DENV感染之細胞中病毒的效價(第4A圖)。除了一般的補體相關反應，本實驗亦發現修飾NS1-WD pAb可在不包含補體的情況下，直接減少 經4種血清型DENV感染之細胞中病毒的效價(第4B圖)。
該些結果指出，修飾NS1-WD pAb可透過由補體媒介之胞解感染細胞的方式，以及不經由補體作用的方式來降低病毒複製。
實施例2　主動免疫產生之修飾NS1-WD pAb對DENV感染的保護功效
本實施例進一步檢測修飾NS1-WD pAb是否可用以保護個體抵抗DENV感染。第5-9圖分別闡述該些結果。
2.1　以修飾NS1-WD多肽進行主動免疫可降低DENV引發的出血及凝血病變(coagulopathy)
在接續投予3-4劑之修飾NS1-WD多肽後，將DENV皮內注射至小鼠背部的皮膚。3天後，測量小鼠尾靜脈的出血時間。第5A-5D圖分別指出，相較於投予KLH，投予修飾NS1-WD多肽可顯著降低小鼠因DENV (包含DENV 1、DENV 2、DENV 3及DENV 4)所造成的出血時間延長。
相似地，相較於投予KLH，以修飾NS1-WD多肽免疫化小鼠，刺激其產生免疫反應，亦可顯著降低由DENV (包含DENV 1、DENV 2、DENV 3及DENV 4)所造成的出血(第6A-6B圖)。
接著，利用H&E染色皮膚的真皮組織，藉以分析紅血球外滲的情況。第7圖之數據指出，以修飾NS1-WD多肽免疫化小鼠，使其產生免疫反應，可降低由DENV 2所引發的紅血球外滲。
進一步以抗-NS3抗體(NS3為一種DENV複製的標誌)進行IHC染色，據以評估修飾NS1-WD多肽對DENV複製的作用。相較於投予KLH，以修飾NS1-WD多肽免疫化小鼠，可減少其皮膚真皮中至少2倍的NS3表現量(第8A及8B圖)。
該些數據指出，由修飾NS1-WD多肽刺激的免疫反應可抑制DENV的複製，且對由DENV誘發之局部出血及紅血球外滲具有治療的功效。
2.2　由修飾NS1-WD誘發產生的pAb可保護小鼠抵抗致死性DENV感染
有鑑於免疫缺陷小鼠較易遭受DENV感染，本實驗利用STAT1-缺陷小鼠(STAT1-/- 小鼠)作為致死感染小鼠模式，據以分析修飾NS1-WD pAb對致恐性DENV 2感染的預防功效。非小鼠適應DENV 2病毒株454009 A可於STAT1−/− 小鼠體內進行複製，於感染2-3天後，該些小鼠血清中的病毒血症可達每毫升103 -104 PFU (結果未顯示)。此外，小鼠在接受DENV感染後，會於2週內陸續死亡(結果未顯示)。投予抗-NS1-WD pAb可顯著降低STAT1−/− 小鼠體內由DENV所引發的病毒血症、NS1分泌量及死亡率(第9A-9C圖)。
總結上述，本揭示內容證實修飾NS1-WD多肽可刺激動物體產生免疫反應，抵抗包含DENV 1、DENV 2、DENV 3及DENV 4等DENV的感染。因此，本發明包含該修飾NS1-WD多肽及佐劑的疫苗組合物可用以有效預防一個體免於遭受DENV感染。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1A圖為依據本揭示內容一實施方式所繪示之結果，其闡述了經修飾NS1翼部(modified NS1 wing domain, NS1-WD)多肽免疫化後，小鼠免疫血清(immune sera)與經不同血清型之DENV感染之HuH-7細胞的結合。以DENV 1-4或對照組感染HuH-7細胞後，利用特定小鼠免疫血清(1:100稀釋)染色細胞，並以流式細胞儀進行分析：KLH-免疫血清(即由以KLH對照蛋白免疫化之小鼠所分離的血清)、NS1-免疫血清(即由以全長NS1蛋白免疫化之小鼠所分離的血清)、修飾NS1-WD-免疫血清(即由以修飾NS1-WD多肽(序列編號：1)免疫化之小鼠所分離的血清)，以及2°抗體(僅以二級抗體染色，作為實驗的負對照組)。 第1B圖為依據本揭示內容一實施方式所繪示之線性圖，其闡述了由修飾NS1-WD多肽免疫化之小鼠血清所分離的純化多株抗體(polyclonal antibody, pAb)對NS1多肽、與修飾NS1-WD多肽鍵結的BSA或BSA的結合。 第2A圖為依據本揭示內容另一實施方式所繪示的柱狀圖，其闡述了不同濃度之由KLH對照蛋白、野生型NS1-WD多肽(序列編號：2)、修飾NS1-WD多肽免疫血清分離的純化pAb對HUVEC的結合親和力。位移比(shift ratio, %)表示相較於對照組(抗-小鼠IgG Alexa 488)的結合百分比。所有的數據皆由至少三組獨立試驗所得到，並表示為平均值±標準差(mean ± S.D)。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。 第2B圖為依據本揭示內容另一實施方式所繪示之柱狀圖，其係關於不同濃度之由KLH對照組、全長NS1、修飾NS1-WD多肽免疫血清所分離的純化pAb對人類血小板的結合親和力。 第3圖為依據本揭示內容一實施方式所繪示之柱狀圖，其分別闡述了抗修飾NS1-WD多肽之抗體可藉由與補體相關之胞解反應(complement dependent cytolysis, CDC)，對經DENV感染之細胞造成細胞毒殺。以特定DENV (第A-D圖分別為血清型1-4；病毒感染劑量(multiplicity of infection)為10)或對照組感染HUVEC 48小時後，與磷酸緩衝生理食鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)、由KLH或修飾NS1-WD-胜肽免疫血清分離之純化pAb (每毫升50微克)於4°C作用1小時。再將細胞培養於包含或不包含補體(1:20)的細胞培養液中，於37°C反應4小時。以材料及方法所述之方法來分析乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)的釋放量。以抗-NS1抗體2E8作為正對照組。**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。 第4A及4B圖分別為依據本揭示內容一實施方式所繪示之柱狀圖，其係關於抗修飾NS1-WD多肽之抗體可藉由補體對DENV感染細胞造成的胞解反應來抑制病毒增殖，以及不經由補體的作用直接減少病毒複製。以DENV (血清型1-4，病毒感染劑量為10)或對照組感染HUVEC 48小時後，以PBS、由KLH或修飾NS1-WD多肽-免疫小鼠血清分離之純化pAb (每毫升50微克)或抗-NS1單株抗體(monoclonal antibody, mAb) 2E8 (每毫升50微克)於4°C處理細胞1小時，再將細胞培養於包含(第4A圖)或不包含(第4B圖)補體(C’) (1:20)的細胞培養液中，於37°C反應4小時。重新加入新鮮培養液再培養24小時後，以材料及方法所述之螢光病毒群落測定(fluorescent focus assay, FFA)來分析上清液中感染病毒的效價。所有的數據皆由至少三組獨立試驗所得到，並表示為平均值±標準差。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，ns表示無顯著性。 第5A-5D圖為依據本揭示內容另一實施方式所繪示之點狀圖，其分別闡述對小鼠投予修飾NS1-WD多肽使其主動產生免疫反應，可保護小鼠抵抗由DENV 1、DENV 2、DENV 3或DENV 4造成的出血時間延長。*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001。 第6A-6B圖為依據本揭示內容另一實施方式所闡述之照片及柱狀圖，其分別顯示對小鼠投予修飾NS1-WD多肽使其主動產生免疫反應，可保護小鼠抵抗特定DENV造成的出血。第6A圖：接受特定治療之小鼠的代表性皮膚照片。第6B圖：投予DENV 1 (第A圖)、DENV 2 (第B圖)、DENV 3 (第C圖)或DENV 4 (第D圖)後，小鼠的出血量化結果。以ImageJ定量出血的臨床分數，並將其表示為數值化之出血嚴重度。箭頭所指為皮膚的出血部位。*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。 第7圖為依據本揭示內容另一實施方式所闡述之結果，其係關於對小鼠投予修飾NS1-WD多肽使其主動產生免疫反應，可保護小鼠抵抗由DENV 2所引發的出血。利用蘇木精及伊紅(Hematoxylin and eosin, H&E)染色來分析皮膚的局部性出血。箭頭所指為完整的血管。比例尺為40微米。 第8A及8B圖為依據本揭示內容再另一實施方式所闡述之照片及柱狀圖，其分別顯示對小鼠投予修飾NS1-WD多肽使其產生主動免疫反應，可減少小鼠體內NS3的表現量。以免疫組織化學染色(Immunohistochemistry staining, IHC staining)來分析DENV NS3的表現。箭頭所指為局部DENV NS3的表現。比例尺為40微米。***P ＜ 0.001，ns表示無顯著性。 第9A-9C圖為依據本揭示內容一實施方式所繪示之點狀圖及線狀圖，其闡述了由修飾NS1-WD多肽免疫產生的抗體可保護STAT1−/− 小鼠抵抗DENV感染。第9A圖：感染2天後，STAT1−/− 小鼠2的病毒血症(viremia)。第9B圖：感染2天後，NS1於STAT1−/− 小鼠血清中的表現量。第9C圖：投予特定治療之小鼠的存活率。**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。
 序列表<110> 國立成功大學 <120> 合成多肽、包含該多肽之疫苗組合物及其用途<130> P2968-TW<150> US62411493<151> 2016-10-21<160> 3<170> BiSSAP 1.3<210> 1<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 1Tyr Lys Asp Trp Ser Glu Trp Gly Lys Ala Cys 1 5 10 <210> 2<211> 14<212> PRT<213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 2Met Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Cys 1 5 10 <210> 3<211> 11<212> PRT<213> 人工序列<220> <223> 合成<400> 3Asn Thr Asn Gly Lys Asp Trp Gly Arg Ser Cys 1 5 10

Claims (14)

  1. 一種用以預防或治療一個體之登革熱病毒感染的合成多肽，包含一第一多肽，其具有序列編號：1之胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述之合成多肽，其中該合成多肽的N端具有乙醯化修飾及/或該合成多肽的C端具有醯胺化修飾。
  3. 如請求項1所述之合成多肽，更包含一第二多肽，其係位於該第一多肽的N或C端，其中該第二多肽是選自由卵白蛋白、牛血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、熱休克蛋白及其組合所成組成的群組。
  4. 一種用以預防一個體免於遭受登革熱病毒感染之疫苗組合物，包含請求項1所述之合成多肽及一藥學上可接受之佐劑。
  5. 如請求項4所述之疫苗組合物，其中該藥學上可接受之佐劑是選自由脂肪醇聚氧乙烯醚-D、氫氧化鋁、弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑、與內毒素相關之佐劑、礦物油、礦物油及界面活性劑、Ribi佐劑、Titer-max佐劑、syntax佐劑製劑、鋁鹽佐劑、硝化纖維素吸附抗原、免疫刺激複合物、Gebru佐劑、超載體、乙烯及乙酸乙烯酯之共聚物、L-酪胺酸、油基乳劑、Adju prime佐劑、鯊烯、鄰苯二甲酸鈉脂多醣、磷酸鈣、皂素及胞壁醯二肽所組成的群組。
  6. 如請求項4所述之疫苗組合物，其中該合成多肽更包含一第二多肽，其係位於該第一多肽的N或C端，其中該第二多肽是選自由卵白蛋白、牛血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、β-半乳糖苷酶、甲狀腺球蛋白、熱休克蛋白及其組合所成組成的群組。
  7. 一種如請求項1所述之合成多肽於製備一藥物的用途，其中該藥物可用以預防或治療一個體之登革熱病毒感染。
  8. 如請求項7所述之用途，其中該合成多肽是以每劑每公斤個體體重0.8微克到80毫克的劑量投予至個體體內。
  9. 如請求項8所述之用途，其中該合成多肽是以每劑每公斤個體體重8微克到8毫克的劑量投予至個體體內。
  10. 如請求項9所述之用途，其中該合成多肽是以每劑每公斤個體體重80到800微克的劑量投予至個體體內。
  11. 如請求項7所述之用途，其中在一免疫接種的過程中，是對該個體投予至少2次之該合成多肽。
  12. 如請求項11所述之用途，其中在一免疫接種的過程中，是對該個體投予3-5次之該合成多肽。
  13. 如請求項7所述之用途，其中該登革熱病毒是第1、2、3或4血清型登革熱病毒。
  14. 如請求項7所述之用途，其中該個體為一人類。
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